Biologia Molecular da Célula - Bruce Alberts - 6a Edição - Resumo

Catalogação na publicação Poliana Sanchez de Araujo CRB102094 B615 Biologia molecular da célula recurso eletrônico Bruce Alberts et al tradução Ardala Elisa Breda Andrade et al revisão técnica Ardala Elisa Breda Andrade Cristiano Valim Bizarro Gaby Renard 6 ed Porto Alegre Artmed 2017 Editado como livro impresso em 2017 ISBN 9788582714232 1 Biologia molecular Célula I Alberts Bruce CDU 57725763 Tradução Ardala Elisa Breda Andrade Caps 3 21 Research scientist Texas AM University Mestre e Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande Sul PUCRS Carlos Alexandre Sanchez Ferreira Cap 7 Professor adjunto da Faculdade de Biociências da PUCRS Mestre em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Doutor em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Carlos Termignoni Cap 2 Professor titular do Departamento de Bioquímica e pesquisador do Centro de Biotecnologia da UFRGS Doutor em Biologia Molecular pela Universidade Federal de São Paulo UNIFESP Cláudia Paiva Nunes Caps 12 17 18 Índice Pesquisadora do Laboratório de Genética Humana e Molecular da PUCRS Mestre e Doutora em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Cristiano Valim Bizarro Caps 7 14 Professor adjunto da PUCRS Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS Daiana Renck Cap 20 Pesquisadora do Instituto de Pesquisas Biomédicas IPB da PUCRS Mestre e Doutora em Biologia Celular e Molecular pela PUCRS Denise Cantarelli Machado Caps 10 19 24 Professora titular da Escola de Medicina da PUCRS Pesquisadora do Instituto de Pesquisas Biomédicas da PUCRS Especialista em Biotecnologia pela UFRGS Mestre em Genética pela UFRGS Doutora em Imunologia Molecular pela University of Sheffield UK PósDoutora em Imunologia Molecular pelo National Institutes of Health NIH USA Diógenes Santiago Santos Caps 20 e 23 Professor titular e coordenador do INCT em Tuberculose e do CPBMFIPB da PUCRS Doutor em Microbiologia e Imunologia pela UNIFESP Gaby Renard Iniciais Caps 8 9 Glossário Pesquisadora sênior do Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional da PUCRS Mestre e Doutora em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Heique Marlis Bogdawa Cap 1 Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFRGS Doutora em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS Jacqueline Moraes Cardone Cap 13 Mestre e Doutora em Genética e Biologia Molecular pela UFRGS PósDoutora pelo Centro de Biotecnologia da UFRGS José Artur B Chies Caps 6 11 16 Professor titular do Departamento de Genética da UFRGS Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFRGS Doutor em Sciences de La Vie Specialité en Immunologie pela Université de Paris VI Pierre et Marie Curie Paula Eichler Caps 1 13 Índice Mestre em Ciências Biológicas Fisiologia pela UFRGS Doutora em Ciências Biológicas Fisiologia Humana pela Universidade de São Paulo USP PósDoutora em Bioquímica pela UFRGS Pós Doutora em Biologia Celular e Molecular pela PUCRS Rosane Machado Scheibe Caps 4 5 Doutora em Biologia Molecular pela University of Sheffield Inglaterra Rui Fernando Felix Lopes Cap 22 Professor titular do Departamento de Ciências Morfológicas no Instituto de Ciências Básicas da Saúde da UFRGS Mestre em Medicina Veterinária pela UFRGS Doutor em Zootecnia pela UFRGS Sandra Estrazulas Farias Cap 15 Professora associada do Departamento de Fisiologia e pesquisadora do Centro de Biotecnologia da UFRGS Doutora em Bioquímica e Biologia Molecular pela UNIFESP Valnês da Silva Rodrigues Junior Cap 23 Pesquisador do Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional da PUCRS Mestre em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS Doutor em Farmacologia Bioquímica e Molecular pela PUCRS Revisão técnica Ardala Elisa Breda Andrade Research scientist Texas AM University Mestre e Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande Sul PUCRS Cristiano Valim Bizarro Professor adjunto da PUCRS Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Gaby Renard Pesquisadora sênior do Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional da PUCRS Mestre e Doutora em Ciências Biológicas Bioquímica pela UFRGS 2017 Versão impressa desta obra 2017 Reservados todos os direitos de publicação em língua portuguesa à ARTMED EDITORA LTDA uma empresa do GRUPO A EDUCAÇÃO SA Av Jerônimo de Ornelas 670 Santana 90040340 Porto Alegre RS Fone 51 30277000 Fax 51 30277070 Unidade São Paulo Rua Doutor Cesário Mota Jr 63 Vila Buarque 01221020 São Paulo SP Fone 11 32219033 SAC 0800 7033444 wwwgrupoacombr É proibida a duplicação ou reprodução deste volume no todo ou em parte sob quaisquer formas ou por quaisquer meios eletrônico mecânico gravação fotocópia distribuição na Web e outros sem permissão expressa da Editora IMPRESSO NO BRASIL PRINTED IN BRAZIL Obra originalmente publicada sob o título Molecular biology of the cell 6th edition ISBN 9780815344322 All Rights Reserved Copyright 2017 Authorized translation from English language edition published by Garland Science part of Taylor Francis Group LLC Gerente editorial Biociências Letícia Bispo de Lima Colaboraram nesta edição Coordenador editorial Alberto Schwanke Preparação de originais Débora Benke de Bittencourt e Heloísa Stefan Leitura final Sandra da Câmara Godoy Arte sobre capa original Kaéle Finalizando Ideias Editoração Techbooks Capa A biologia celular não trata apenas da estrutura e função das múltiplas moléculas que compõem a célula mas também sobre como esta química complexa é controlada A compreensão dessas complexas redes de retroalimentação reguladoras necessita de abordagens quantitativas é esta nova realidade que a capa reproduz Nota As ciências biológicas estão em constante evolução À medida que novas pesquisas e a própria experiência ampliam o nosso conhecimento novas descobertas são realizadas Os autores desta obra consultaram as fontes consideradas confiáveis num esforço para oferecer informações completas e geralmente de acordo com os padrões aceitos à época da sua publicação Bruce Alberts é PhD pela Harvard University e ocupa a posição de Chancellors Le adership Chair em bioquímica e biofísica para ciências e educação na University of California San Francisco Foi editorchefe da revista Science entre 20082013 e por 12 anos atuou como Presidente da US National Academy of Sciences 19932005 Ale xander Johnson é PhD pela Harvard University e Professor de microbiologia e imu nologia na University of California San Francisco Julian Lewis 19462014 foi DPhil pela University of Oxford e Cientista Emérito no London Research Institute of Cancer Research UK David Morgan é PhD pela University of California San Francisco onde também é Professor no Department of Physiology e atua como Diretor do Programa de Graduação em Bioquímica Biologia Celular Genética e Biologia do Desenvolvimento Martin Raff é MD pela McGill University e Professor Emérito de biologia na Medical Research Council Laboratory for Molecular Cell Biology and Cell Biology Unit do Uni versity College London Keith Roberts é PhD pela University of Cambridge e ocupou a posição de Deputy Director no John Innes Centre Norwich Atualmente é Professor Emérito na University of East Anglia Peter Walter é PhD pela Rockefeller University em New York Professor no Department of Biochemistry and Biophysics na University of California San Francisco e pesquisador do Howard Hughes Medical Institute John Wilson é PhD pelo California Institute of Technology e continuou seu trabalho de pós doutorado na Stanford University Ocupa a posição de Distinguished Service Professor of Biochemistry and Molecular Biology no Baylor College of Medicine em Houston Tim Hunt é PhD pela University of Cambridge onde ensinou bioquímica e biologia celular por mais de 20 anos Trabalhou no Cancer Research UK até se aposentar em 2010 Com partilhou o Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina com Lee Hartwell e Paul Nurse Questões elaboradas por John Wilson e Tim Hunt Autores Esta página foi deixada em branco intencionalmente Julian Hart Lewis 12 de agosto de 1946 30 de abril de 2014 Esta página foi deixada em branco intencionalmente Ao escrever este livro fomos beneficiados por conselhos de vários biólogos e bioquímicos Gostaríamos de agradecer às se guintes pessoas por suas sugestões na preparação desta edição assim como àqueles que nos ajudaram a preparar a 1ª 2ª 3ª 4ª e 5ª edições Os que ajudaram nesta edição estão listados primeiro a seguir estão aqueles que ajudaram nas edições anteriores Geral Steven Cook Imperial College London Jose A Costoya Universidade de Santiago de Compostela Arshad Desai University of California San Diego Susan K Dutcher Wa shington University St Louis Michael Elowitz California Institute of Technology Benjamin S Glick University of Chicago Gregory Hannon Cold Spring Harbor Labora tories Rebecca Heald University of California Berkeley Stefan Kanzok Loyola University Chicago Doug Kellogg University of California Santa Cruz David Kimelman Uni versity of Washington Seattle Maria Krasilnikova Pennsyl vania State University Werner Kühlbrandt Max Planck Institute of Biophysics Lewis Lanier University of Califor nia San Francisco Annette MüllerTaubenberger Ludwig Maximilians University Sandra Schmid University of Texas Southwestern Ronald D Vale University of California San Francisco D Eric Walters Chicago Medical School Kars ten Weis Swiss Federal Institute of Technology Capítulo 2 H Lill VU University Capítulo 3 David S Eisenberg University of California Los Angeles F Ulrich Hartl Max Planck Institute of Biochemis try Louise Johnson University of Oxford H Lill VU Uni versity Jonathan Weissman University of California San Francisco Capítulo 4 Bradley E Bernstein Harvard Medical School Wendy Bickmore MRC Human Genetics Unit Edinburgh Jason Brickner Northwestern University Gary Felsenfeld NIH Susan M Gasser University of Basel Shiv Grewal National Cancer Institute Gary Karpen University of Ca lifornia Berkeley Eugene V Koonin NCBI NLM NIH Hiten Madhani University of California San Francisco Tom Misteli National Cancer Institute Geeta Narlikar Universi ty of California San Francisco Maynard Olson University of Washington Seattle Stephen Scherer University of Toronto Rolf Sternglanz Stony Brook University Chris L Woodcock University of Massachusetts Amherst Johanna Wysocka e membros do laboratório Stanford School of Medicine Capítulo 5 Oscar Aparicio University of Southern Califor nia Julie P Cooper National Cancer Institute Neil Hunter Howard Hughes Medical Institute Karim Labib Universi ty of Manchester Joachim Li University of California San Francisco Stephen West Cancer Research UK Richard D Wood University of Pittsburgh Cancer Institute Capítulo 6 Briana Burton Harvard University Richard H Ebright Rutgers University Daniel Finley Harvard Medi cal School Michael R Green University of Massachusetts Medical School Christine Guthrie University of California San Francisco Art Horwich Yale School of Medicine Har ry Noller University of California Santa Cruz David Toller vey University of Edinburgh Alexander J Varshavsky Cali fornia Institute of Technology Capítulo 7 Adrian Bird The Wellcome Trust Centre UK Neil Brockdorff University of Oxford Christine Guthrie University of California San Francisco Jeannie Lee Har vard Medical School Michael Levine University of Cali fornia Berkeley Hiten Madhani University of California San Francisco Duncan Odom Cancer Research UK Kevin Struhl Harvard Medical School Jesper Svejstrup Cancer Research UK Capítulo 8 Hana ElSamad contribuição principal Univer sity of California San Francisco Karen Hopkin contribuição principal Donita Brady Duke University David Kashatus University of Virginia Melanie McGill University of To ronto Alex Mogilner University of California Davis Ri chard Morris John Innes Centre UK Prasanth Potluri The Childrens Hospital of Philadelphia Research Institute Da nielle Vidaurre University of Toronto Carmen Warren Uni versity of California Los Angeles Ian Woods Ithaca College Capítulo 9 Douglas J Briant University of Victoria Werner Kühlbrandt Max Planck Institute of Biophysics Jeffrey Li chtman Harvard University Jennifer LippincottSchwartz NIH Albert Pan Georgia Regents University Peter Shaw John Innes Centre UK Robert H Singer Albert Einstein School of Medicine Kurt Thorn University of California San Francisco Capítulo 10 Ari Helenius Swiss Federal Institute of Techno logy Werner Kühlbrandt Max Planck Institute of Biophy sics H Lill VU University Satyajit Mayor National Cen tre for Biological Sciences India Kai Simons Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Gunnar von Heijne Stockholm University Tobias Walther Harvard University Capítulo 11 Graeme Davis University of California San Francisco Robert Edwards University of California San Francisco Bertil Hille University of Washington Seattle Lindsay Hinck University of California Santa Cruz Werner Kühlbrandt Max Planck Institute of Biophysics H Lill VU University Roger Nicoll University of California San Fran cisco Poul Nissen Aarhus University Robert Stroud Uni versity of California San Francisco Karel Svoboda Howard Hughes Medical Institute Robert Tampé GoetheUniversity Frankfurt Agradecimentos x Agradecimentos Capítulo 12 John Aitchison Institute for System Biology Seattle Amber English University of Colorado at Boulder Ralf Erdmann Ruhr University of Bochum Larry Gerace The Scripps Research Institute La Jolla Ramanujan Heg de MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge UK Martin W Hetzer The Salk Institute Lindsay Hinck Uni versity of California Santa Cruz James A McNew Rice University Nikolaus Pfanner University of Freiberg Peter Rehling University of Göttingen Michael Rout The Rocke feller University Danny J Schnell University of Massachu setts Amherst Sebastian Schuck University of Heidelberg Suresh Subramani University of California San Diego Gia Voeltz University of Colorado Boulder Susan R Wente Vanderbilt University School of Medicine Capítulo 13 Douglas J Briant University of Victoria Cana da Scott D Emr Cornell University Susan FerroNovick University of California San Diego Benjamin S Glick Uni versity of Chicago Ari Helenius Swiss Federal Institute of Technology Lindsay Hinck University of California Santa Cruz Reinhard Jahn Max Planck Institute for Biophysical Chemistry Ira Mellman Genentech Peter Novick Univer sity of California San Diego Hugh Pelham MRC Labora tory of Molecular Biology Cambridge UK Graham Warren Max F Perutz Laboratories Vienna Marino Zerial Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Capítulo 14 Werner Kühlbrandt contribuição principal Max Planck Institute of Biophysics Thomas D Fox Cor nell University Cynthia Kenyon University of California San Francisco NilsGöran Larsson Max Planck Institute for Biology of Aging Jodi Nunnari University of California Davis Patrick OFarrell University of California San Fran cisco Alastair Stewart The Victor Chang Cardiac Research Institute Australia Daniela Stock The Victor Chang Car diac Research Institute Australia Michael P Yaffe Califor nia Institute for Regenerative Medicine Capítulo 15 Henry R Bourne University of California San Francisco Dennis Bray University of Cambridge Douglas J Briant University of Victoria Canada James Briscoe MRC National Institute for Medical Research UK James Ferrell Stanford University Matthew Freeman MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge UK Alan Hall Memorial Sloan Kettering Cancer Center CarlHenrik Heldin Uppsa la University James A McNew Rice University Roel Nusse Stanford University Julie Pitcher University College London Capítulo 16 Rebecca Heald contribuição principal Uni versity of California Berkeley Anna Akhmanova Utrecht University Arshad Desai University of California San Die go Velia Fowler The Scripps Research Institute La Jolla Vladimir Gelfand Northwestern University Robert Gold man Northwestern University Alan Rick Horwitz Univer sity of Virginia Wallace Marshall University of California San Francisco J Richard McIntosh University of Colorado Boulder Maxence Nachury Stanford School of Medicine Eva Nogales University of California Berkeley Samara ReckPeterson Harvard Medical School Ronald D Vale University of California San Francisco Richard B Vallee Columbia University Michael Way Cancer Research UK Orion Weiner University of California San Francisco Mat thew Welch University of California Berkeley Capítulo 17 Douglas J Briant University of Victoria Cana da Lindsay Hinck University of California Santa Cruz Ja mes A McNew Rice University Capítulo 18 Emily D Crawford University of California San Francisco James A McNew Rice University Shigekazu Nagata Kyoto University Jim Wells University of Califor nia San Francisco Capítulo 19 Jeffrey Axelrod Stanford University School of Medicine John Couchman University of Copenhagen Johan de Rooij The Hubrecht Institute Utrecht Benjamin Geiger Weizmann Institute of Science Israel Andrew P Gilmore University of Manchester Tony Harris University of Toronto Martin Humphries University of Manchester Andreas Prokop University of Manchester Charles Streu li University of Manchester Masatoshi Takeichi RIKEN Center for Developmental Biology Japan Barry Thompson Cancer Research UK Kenneth M Yamada NIH Alpha Yap The University of Queensland Australia Capítulo 20 Anton Berns Netherlands Cancer Institute J Michael Bishop University of California San Francisco Trever Bivona University of California San Francisco Fred Bunz Johns Hopkins University Paul Edwards University of Cambridge Ira Mellman Genentech Caetano Reis e Sousa Cancer Research UK Marc Shuman University of California San Francisco Mike Stratton Wellcome Trust Sanger Institute UK Ian Tomlinson Cancer Research UK Capítulo 21 Alex Schier contribuição principal Harvard University Markus Affolter University of Basel Victor Am bros University of Massachusetts Worcester James Briscoe MRC National Institute for Medical Research UK Donald Brown Carnegie Institution for Science Baltimore Steven Burden New York University School of Medicine Moses Chao New York University School of Medicine Caroline Dean John Innes Centre UK Chris Doe University of Ore gon Eugene Uwe Drescher Kings College London Gor don Fishell New York University School of Medicine Brigid Hogan Duke University Phil Ingham Institute of Molecu lar and Cell Biology Singapore Laura Johnston Colum bia University David Kingsley Stanford University Tom Kornberg University of California San Francisco Richard Mann Columbia University Andy McMahon University of Southern California Marek Mlodzik Mount Sinai Hos pital New York Patrick OFarrell University of California San Francisco Duojia Pan Johns Hopkins Medical School Olivier Pourquie Harvard Medical School Erez Raz Uni versity of Muenster Chris Rushlow New York University Stephen Small New York University Marc TessierLavigne Rockefeller University Capítulo 22 Simon Hughes Kings College London Rudolf Jaenisch Massachusetts Institute of Technology Arnold Kriegstein University of California San Francisco Doug Melton Harvard University Stuart Orkin Harvard Uni versity Thomas A Reh University of Washington Seattle Amy Wagers Harvard University Fiona M Watt Wellcome Trust Centre for Stem Cell Research UK Douglas J Winton Cancer Research UK Shinya Yamanaka Kyoto University Capítulo 23 Matthew Welch contribuição principal Uni versity of California Berkeley Ari Helenius Swiss Federal Institute of Technology Dan Portnoy University of Califor Agradecimentos xi nia Berkeley David Sibley Washington University St Lou is Michael Way Cancer Research UK Capítulo 24 Lewis Lanier University of California San Francisco Leitores Najla Arshad Indian Institute of Science Venice Chiueh University of California Berkeley Quyen Huynh University of Toronto Rachel Kooistra Loyola Universi ty Chicago Wes Lewis University of Alabama Eric Nam University of Toronto Vladislav Ryvkin Stony Brook Uni versity Laasya Samhita Indian Institute of Science John Senderak Jefferson Medical College Phillipa Simons Im perial College UK Anna Constance Vind University of Copenhagen Steve Wellard Pennsylvania State Univer sity Evan Whitehead University of California Berkeley Carrie Wilczewski Loyola University Chicago Anna Wing Pennsylvania State University John Wright University of Alabama Edições anteriores Jerry Adams The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research Australia Ralf Adams London Research Institu te David Agard University of California San Francisco Julie Ahringer The Gurdon Institute UK Michael Akam University of Cambridge David Allis The Rockefeller University Wolfhard Almers Oregon Health and Science University Fred Alt CBR Institute for Biomedical Rese arch Boston Linda Amos MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge Raul Andino University of California San Francisco Clay Armstrong University of Pennsylva nia Martha Arnaud University of California San Francis co Spyros ArtavanisTsakonas Harvard Medical School Michael Ashburner University of Cambridge Jonathan Ashmore University College London Laura Attardi Stan ford University Tayna Awabdy University of California San Francisco Jeffrey Axelrod Stanford University Medi cal Center Peter Baker falecido David Baldwin Stanford University Michael Banda University of California San Francisco Cornelia Bargmann The Rockefeller University Ben Barres Stanford University David Bartel Massachu setts Institute of Technology Konrad Basler University of Zurich Wolfgang Baumeister Max Planck Institute of Bio chemistry Michael Bennett Albert Einstein College of Me dicine Darwin Berg University of California San Diego Anton Berns Netherlands Cancer Institute Merton Bern field Harvard Medical School Michael Berridge The Ba braham Institute Cambridge UK Walter Birchmeier Max Delbrück Center for Molecular Medicine Germany Adrian Bird Wellcome Trust Centre UK David Birk UMDNJRo bert Wood Johnson Medical School Michael Bishop Uni versity of California San Francisco Elizabeth Blackburn University of California San Francisco Tim Bliss National Institute for Medical Research London Hans Bode Uni versity of California Irvine Piet Borst Jan Swammerdam Institute University of Amsterdam Henry Bourne Uni versity of California San Francisco Alan Boyde University College London Martin Brand University of Cambridge Carl Branden falecido Andre Brandli Swiss Federal Ins titute of Technology Zurich Dennis Bray University of Cambridge Mark Bretscher MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge James Briscoe National Institute for Medical Research UK Marianne BronnerFraser Califor nia Institute of Technology Robert Brooks Kings College London Barry Brown Kings College London Michael Brown University of Oxford Michael Bulger University of Rochester Medical Center Fred Bunz Johns Hopkins Uni versity Steve Burden New York University School of Medi cine Max Burger University of Basel Stephen Burley SGX Pharmaceuticals Keith Burridge University of North Caro lina Chapel Hill John Cairns Radcliffe Infirmary Oxford Patricia Calarco University of California San Francisco Za cheus Cande University of California Berkeley Lewis Can tley Harvard Medical School Charles Cantor Columbia University Roderick Capaldi University of Oregon Mario Capecchi University of Utah Michael Carey University of California Los Angeles Adelaide Carpenter University of California San Diego John Carroll University College Lon don Tom CavalierSmith Kings College London Pierre Chambon University of Strasbourg Hans Clevers Hubrecht Institute The Netherlands Enrico Coen John Innes Institute Norwi ch UK Philip Cohen University of Dundee Scotland Ro bert Cohen University of California San Francisco Ste phen Cohen EMBL Heidelberg Germany Roger Cooke University of California San Francisco John Cooper Wa shington University School of Medicine St Louis Michael Cox University of Wisconsin Madison Nancy Craig Johns Hopkins University James Crow University of Wisconsin Madison Stuart Cull Candy University College London Leslie Dale University College London Caroline Damsky University of California San Francisco Johann De Bono The Institute of Cancer Research UK Anthony DeFranco University of California San Francisco Abby Dernburg University of California Berkeley Arshad Desai University of California San Diego Michael Dexter The Wellcome Trust UK John Dick University of Toronto Canada Chris topher Dobson University of Cambridge Russell Doolittle University of California San Diego W Ford Doolittle Da lhousie University Canada Julian Downward Cancer Re search UK Keith Dudley Kings College London Graham Dunn MRC Cell Biophysics Unit London Jim Dunwell John Innes Institute Norwich UK Bruce Edgar Fred Hu tchinson Cancer Research Center Seattle Paul Edwards University of Cambridge Robert Edwards University of California San Francisco David Eisenberg University of California Los Angeles Sarah Elgin Washington Universi ty St Louis Ruth Ellman Institute of Cancer Research Sut ton UK Beverly Emerson The Salk Institute Charles Emerson University of Virginia Scott D Emr Cornell Uni versity Sharyn Endow Duke University Lynn Enquist Princeton University Tariq Enver Institute of Cancer Rese arch London David Epel Stanford University Gerard Evan University of California Comprehensive Cancer Cen ter Ray Evert University of Wisconsin Madison Matthias Falk Lehigh University Stanley Falkow Stanford Universi ty Douglas Fearon University of Cambridge Gary Felsen feld NIH Stuart Ferguson University of Oxford James Ferrell Stanford University Christine Field Harvard Medi cal School Daniel Finley Harvard University Gary Firesto xii Agradecimentos ne University of California Berkeley Gerald Fischbach Columbia University Robert Fletterick University of Cali fornia San Francisco Harvey Florman Tufts University Judah Folkman Harvard Medical School Larry Fowke University of Saskatchewan Canada Jennifer Frazier Ex ploratorium San Francisco Matthew Freeman Laboratory of Molecular Biology UK Daniel Friend University of Cali fornia San Francisco Elaine Fuchs University of Chicago Joseph Gall Carnegie Institution of Washington Richard Gardner University of Oxford Anthony GardnerMedwin University College London Peter Garland Institute of Cancer Research London David Garrod University of Manchester UK Susan M Gasser University of Basel Wal ter Gehring Biozentrum University of Basel Benny Geiger Weizmann Institute of Science Rehovot Israel Larry Gera ce The Scripps Research Institute Holger Gerhardt Lon don Research Institute John Gerhart University of Califor nia Berkeley Günther Gerisch Max Planck Institute of Biochemistry Frank Gertler Massachusetts Institute of Te chnology Sankar Ghosh Yale University School of Medici ne Alfred Gilman The University of Texas Southwestern Medical Center Reid Gilmore University of Massachusetts Amherst Bernie Gilula falecido Charles Gilvarg Prince ton University Benjamin S Glick University of Chicago Michael Glotzer University of Chicago Larry Goldstein University of California San Diego Bastien Gomperts University College Hospital Medical School London Da niel Goodenough Harvard Medical School Jim Goodrich University of Colorado Boulder Jeffrey Gordon Washing ton University St Louis Peter Gould Middlesex Hospital Medical School London Alan Grafen University of Oxford Walter Gratzer Kings College London Michael Gray Dalhousie University Douglas Green St Jude Childrens Hospital Howard Green Harvard University Michael Green University of Massachusetts Amherst Les lie Grivell University of Amsterdam Carol Gross Universi ty of California San Francisco Frank Grosveld Erasmus Universiteit The Netherlands Michael Grunstein Univer sity of California Los Angeles Barry Gumbiner Memorial Sloan Kettering Cancer Center Brian Gunning Australian National University Canberra Christine Guthrie Universi ty of California San Francisco James Haber Brandeis Uni versity Ernst Hafen Universitat Zurich David Haig Har vard University Andrew Halestrap University of Bristol UK Alan Hall Memorial Sloan Kettering Cancer Center Jeffrey Hall Brandeis University John Hall University of Southampton UK Zach Hall University of California San Francisco Douglas Hanahan University of California San Francisco David Hanke University of Cambridge Nicho las Harberd University of Oxford Graham Hardie Univer sity of Dundee Scotland Richard Harland University of California Berkeley Adrian Harris Cancer Research UK John Harris University of Otago New Zealand Stephen Harrison Harvard University Leland Hartwell University of Washington Seattle Adrian Harwood MRC Laboratory for Molecular Cell Biology and Cell Biology Unit London Scott Hawley Stowers Institute for Medical Research Kansas City Rebecca Heald University of California Berkeley John Heath University of Birmingham UK Ramanujan Hegde NIH CarlHenrik Heldin Uppsala University Ari Helenius Swiss Federal Institute of Technology Richard Henderson MRC Laboratory of Molecular Biology Cam bridge UK Glenn Herrick University of Utah Ira Hersko witz falecido Bertil Hille University of Washington Seat tle Alan Hinnebusch NIH Bethesda Brigid Hogan Duke University Nancy Hollingsworth State University of New York Stony Brook Frank Holstege University Medical Cen ter The Netherlands Leroy Hood Institute for Systems Bio logy Seattle John Hopfield Princeton University Robert Horvitz Massachusetts Institute of Technology Art Horwi ch Yale University School of Medicine David Housman Massachusetts Institute of Technology Joe Howard Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Jo nathan Howard University of Washington Seattle James Hudspeth The Rockefeller University Simon Hughes Kings College London Martin Humphries University of Manchester UK Tim Hunt Cancer Research UK Neil Hunter University of California Davis Laurence Hurst University of Bath UK Jeremy Hyams University College London Tony Hyman Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Richard Hynes Massachusetts Institute of Technology Philip Ingham University of She ffield UK Kenneth Irvine Rutgers University Robin Irvine University of Cambridge Norman Iscove Ontario Cancer Institute Toronto David IshHorowicz Cancer Research UK Lily Jan University of California San Francisco Char les Janeway falecido Tom Jessell Columbia University Arthur Johnson Texas AM University Louise Johnson fa lecida Andy Johnston John Innes Institute Norwich UK EG Jordan Queen Elizabeth College London Ron Kaback University of California Los Angeles Michael Karin Uni versity of California San Diego Eric Karsenti European Molecular Biology Laboratory Germany Ken Keegstra Mi chigan State University Ray Keller University of California Berkeley Douglas Kellogg University of California Santa Cruz Regis Kelly University of California San Francisco John KendrickJones MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge Cynthia Kenyon University of California San Francisco Roger Keynes University of Cambridge Judith Kimble University of Wisconsin Madison Robert Kingston Massachusetts General Hospital Marc Kirschner Harvard University Richard Klausner NIH Nancy Kleckner Har vard University Mike Klymkowsky University of Colorado Boulder Kelly Komachi University of California San Fran cisco Eugene Koonin NIH Juan Korenbrot University of California San Francisco Roger Kornberg Stanford Uni versity Tom Kornberg University of California San Fran cisco Stuart Kornfeld Washington University St Louis Daniel Koshland University of California Berkeley Dou glas Koshland Carnegie Institution of Washington Baltimo re Marilyn Kozak University of Pittsburgh Mark Krasnow Stanford University Werner Kühlbrandt Max Planck Insti tute for Biophysics John Kuriyan University of California Berkeley Robert Kypta MRC Laboratory for Molecular Cell Biology London Peter Lachmann MRC Centre Cambrid ge Ulrich Laemmli University of Geneva Switzerland Trevor Lamb University of Cambridge Hartmut Land Cancer Research UK David Lane University of Dundee Agradecimentos xiii Scotland Jane Langdale University of Oxford Lewis La nier University of California San Francisco Jay Lash Uni versity of Pennsylvania Peter Lawrence MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge Paul Lazarow Mount Sinai School of Medicine Robert J Lefkowitz Duke University Michael Levine University of California Berkeley Warren Levinson University of California San Francisco Alex Le vitzki Hebrew University Israel Ottoline Leyser University of York UK Joachim Li University of California San Fran cisco Tomas Lindahl Cancer Research UK Vishu Linga ppa University of California San Francisco Jennifer Lip pincottSchwartz NIH Joseph Lipsick Stanford University School of Medicine Dan Littman New York University School of Medicine Clive Lloyd John Innes Institute Norwich UK Richard Locksley University of California San Francisco Richard Losick Harvard University Daniel Louvard Institut Curie France Robin LovellBadge Natio nal Institute for Medical Research London Scott Lowe Cold Spring Harbor Laboratory Shirley Lowe University of California San Francisco Reinhard Lührman Max Planck Institute of Biophysical Chemistry Michael Lynch Indiana University Laura Machesky University of Birmingham UK Hiten Madhani University of California San Francis co James Maller University of Colorado Medical School Tom Maniatis Harvard University Colin Manoil Harvard Medical School Elliott Margulies NIH Philippa Marrack National Jewish Medical and Research Center Denver Mark Marsh Institute of Cancer Research London Wallace Marshall University of California San Francisco Gail Mar tin University of California San Francisco Paul Martin University College London Joan Massagué Memorial Slo an Kettering Cancer Center Christopher Mathews Oregon State University Brian McCarthy University of California Irvine Richard McCarty Cornell University William Mc Ginnis University of California San Diego Anne McLaren WellcomeCancer Research Campaign Institute Cambrid ge Frank McNally University of California Davis Freideri ck Meins Freiderich Miescher Institut Basel Stephanie Mel University of California San Diego Ira Mellman Ge nentech Barbara Meyer University of California Berkeley Elliot Meyerowitz California Institute of Technology Chris Miller Brandeis University Robert Mishell University of Birmingham UK Avrion Mitchison University College London NA Mitchison University College London Ti mothy Mitchison Harvard Medical School Quinn Mitrovi ch University of California San Francisco Peter Momba erts The Rockefeller University Mark Mooseker Yale University David Morgan University of California San Francisco Michelle Moritz University of California San Francisco Montrose Moses Duke University Keith Mos tov University of California San Francisco Anne Mudge University College London Hans MüllerEberhard Scri pps Clinic and Research Institute Alan Munro University of Cambridge J Murdoch Mitchison Harvard University Ri chard Myers Stanford University Diana Myles University of California Davis Andrew Murray Harvard University Shigekazu Nagata Kyoto University Japan Geeta Narlikar University of California San Francisco Kim Nasmyth Uni versity of Oxford Mark E Nelson University of Illinois Ur banaChampaign Michael Neuberger falecido Walter Neupert University of Munich Germany David Nicholls University of Dundee Scotland Roger Nicoll University of California San Francisco Suzanne Noble University of Ca lifornia San Francisco Harry Noller University of Califor nia Santa Cruz Jodi Nunnari University of California Da vis Paul Nurse Francis Crick Institute Roel Nusse Stanford University Michael Nussenzweig Rockefeller University Duncan ODell falecido Patrick OFarrell Uni versity of California San Francisco Bjorn Olsen Harvard Medical School Maynard Olson University of Washington Seattle Stuart Orkin Harvard University Terry OrrWeaver Massachusetts Institute of Technology Erin OShea Har vard University Dieter Osterhelt Max Planck Institute of Biochemistry William Otto Cancer Research UK John Owen University of Birmingham UK Dale Oxender Uni versity of Michigan George Palade falecido Barbara Pan ning University of California San Francisco Roy Parker University of Arizona Tucson William W Parson Univer sity of Washington Seattle Terence Partridge MRC Clinical Sciences Centre London William E Paul NIH Tony Paw son falecido Hugh Pelham MRC UK Robert Perry Insti tute of Cancer Research Philadelphia Gordon Peters Can cer Research UK Greg Petsko Brandeis University Nikolaus Pfanner University of Freiburg Germany David Phillips The Rockefeller University Jeremy PickettHeaps The University of Melbourne Australia Jonathan Pines Gurdon Institute Cambridge Julie Pitcher University Col lege London Jeffrey Pollard Albert Einstein College of Me dicine Tom Pollard Yale University Bruce Ponder Uni versity of Cambridge Daniel Portnoy University of California Berkeley James Priess University of Washing ton Seattle Darwin Prockop Tulane University Mark Ptashne Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dale Purves Duke University Efraim Racker Cornell Universi ty Jordan Raff University of Oxford Klaus Rajewsky Max Delbrück Center for Molecular Medicine Germany George Ratcliffe University of Oxford Elio Raviola Harvard Medi cal School Martin Rechsteiner University of Utah Salt Lake City David Rees National Institute for Medical Research London Thomas A Reh University of Washington Seat tle Louis Reichardt University of California San Francis co Renee Reijo University of California San Francisco Caetano Reis e Sousa Cancer Research UK Fred Richards Yale University Conly Rieder Wadsworth Center Albany Phillips Robbins Massachusetts Institute of Technology Elizabeth Robertson The Wellcome Trust Centre for Human Genetics UK Elaine Robson University of Reading UK Robert Roeder The Rockefeller University Joel Rosenbaum Yale University Janet Rossant Mount Sinai Hospital To ronto Jesse Roth NIH Jim Rothman Memorial Sloan Ket tering Cancer Center Rodney Rothstein Columbia Univer sity Erkki Ruoslahti La Jolla Cancer Research Foundation Gary Ruvkun Massachusetts General Hospital David Saba tini New York University Alan Sachs University of Califor nia Berkeley Edward Salmon University of North Carolina Chapel Hill Aziz Sancar University of North Carolina Cha pel Hill Joshua Sanes Harvard University Peter Sarnow Stanford University Lisa Satterwhite Duke University Me xiv Agradecimentos dical School Robert Sauer Massachusetts Institute of Tech nology Ken Sawin The Wellcome Trust Centre for Cell Bio logy UK Howard Schachman University of California Berkeley Gerald Schatten Pittsburgh Development Cen ter Gottfried Schatz Biozentrum University of Basel Ran dy Schekman University of California Berkeley Richard Scheller Stanford University Giampietro Schiavo Cancer Research UK Ueli Schibler University of Geneva Switzer land Joseph Schlessinger New York University Medical Center Danny J Schnell University of Massachusetts Amherst Michael Schramm Hebrew University Israel Robert Schreiber Washington University School of Medici ne James Schwartz Columbia University Ronald Schwartz NIH François Schweisguth Institut Pasteur France John Scott University of Manchester UK John Sedat University of California San Francisco Peter Selby Cancer Research UK Zvi Sellinger Hebrew University Israel Gregg Semen za Johns Hopkins University Philippe Sengel University of Grenoble France Peter Shaw John Innes Institute Norwi ch UK Michael Sheetz Columbia University Morgan Sheng Massachusetts Institute of Technology Charles Sherr St Jude Childrens Hospital David Shima Cancer Research UK Samuel Silverstein Columbia University Melvin I Simon California Institute of Technology Kai Si mons Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Jonathan Slack Cancer Research UK Alison Smith John Innes Institute Norfolk UK Austin Smith Uni versity of Edinburgh UK Jim Smith The Gurdon Institute UK John Maynard Smith University of Sussex UK Mi tchell Sogin Woods Hole Institute Frank Solomon Massa chusetts Institute of Technology Michael Solursh Universi ty of Iowa Bruce Spiegelman Harvard Medical School Timothy Springer Harvard Medical School Mathias Sprinzl University of Bayreuth Germany Scott Stachel University of California Berkeley Andrew Staehelin University of Co lorado Boulder David Standring University of California San Francisco Margaret Stanley University of Cambridge Martha Stark University of California San Francisco Wil fred Stein Hebrew University Israel Malcolm Steinberg Princeton University Ralph Steinman falecido Len Ste phens The Babraham Institute UK Paul Sternberg Cali fornia Institute of Technology Chuck Stevens The Salk Ins titute Murray Stewart MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge Bruce Stillman Cold Spring Harbor Laboratory Charles Streuli University of Manchester UK Monroe Strickberger University of Missouri St Louis Ro bert Stroud University of California San Francisco Michael Stryker University of California San Francisco William Sullivan University of California Santa Cruz Azim Surani The Gurdon Institute University of Cambridge Daniel Szollosi Institut National de la Recherche Agronomique France Jack Szostak Harvard Medical School Clifford Ta bin Harvard Medical School Masatoshi Takeichi RIKEN Center for Developmental Biology Japan Nicolas Tapon London Research Institute Diethard Tautz University of Cologne Germany Julie Theriot Stanford University Ro ger Thomas University of Bristol UK Craig Thompson Memorial Sloan Kettering Cancer Center Janet Thornton European Bioinformatics Institute UK Vernon Thornton Kings College London Cheryll Tickle University of Dun dee Scotland Jim Till Ontario Cancer Institute Toronto Lewis Tilney University of Pennsylvania David Tollervey University of Edinburgh UK Ian Tomlinson Cancer Rese arch UK Nick Tonks Cold Spring Harbor Laboratory Alain Townsend Institute of Molecular Medicine John Radcliffe Hospital Oxford Paul Travers Scottish Institute for Rege neration Medicine Robert Trelstad UMDNJRobert Wood Johnson Medical School Anthony Trewavas Edinburgh University Scotland Nigel Unwin MRC Laboratory of Mo lecular Biology Cambridge Victor Vacquier University of California San Diego Ronald D Vale University of Califor nia San Francisco Tom Vanaman University of Kentucky Harry van der Westen Wageningen The Netherlands Ha rold Varmus National Cancer Institute United States Ale xander J Varshavsky California Institute of Technology Donald Voet University of Pennsylvania Harald von Boeh mer Harvard Medical School Madhu Wahi University of California San Francisco Virginia Walbot Stanford Univer sity Frank Walsh GlaxoSmithKline UK Trevor Wang John Innes Institute Norwich UK Xiaodong Wang The University of Texas Southwestern Medical School YuLie Wang Worcester Foundation for Biomedical Research MA Gary Ward University of Vermont Anne Warner University College London Graham Warren Yale University School of Medicine Paul Wassarman Mount Sinai School of Medici ne Clare WatermanStorer The Scripps Research Institute Fiona Watt Cancer Research UK John Watts John Innes Institute Norwich UK Klaus Weber Max Planck Institute for Biophysical Chemistry Martin Weigert Institute of Can cer Research Philadelphia Robert Weinberg Massachuset ts Institute of Technology Harold Weintraub falecido Karsten Weis Swiss Federal Institute of Technology Irving Weissman Stanford University Jonathan Weissman Uni versity of California San Francisco Susan R Wente Van derbilt University School of Medicine Norman Wessells University of Oregon Eugene Stephen West Cancer Rese arch UK Judy White University of Virginia William Wick ner Dartmouth College Michael Wilcox falecido Lewis T Williams Chiron Corporation Patrick Williamson Univer sity of Massachusetts Amherst Keith Willison Chester Be atty Laboratories London John Wilson Baylor University Alan Wolffe falecido Richard Wolfenden University of North Carolina Chapel Hill Sandra Wolin Yale University School of Medicine Lewis Wolpert University College Lon don Richard D Wood University of Pittsburgh Cancer Ins titute Abraham Worcel University of Rochester Nick Wri ght Cancer Research UK John Wyke Beatson Institute for Cancer Research Glasgow Michael P Yaffe California Ins titute for Regenerative Medicine Kenneth M Yamada NIH Keith Yamamoto University of California San Fran cisco Charles Yocum University of Michigan Ann Arbor Peter Yurchenco UMDNJRobert Wood Johnson Medical School Rosalind Zalin University College London Patri cia Zambryski University of California Berkeley Marino Zerial Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics Estrutura do livro Embora os capítulos deste livro possam ser lidos de forma independente estão organi zados em uma sequência lógica de cinco partes Os três primeiros capítulos da Parte I tratam dos princípios elementares e da bioquímica básica Eles podem servir como uma introdução aos leitores que não estudaram bioquímica ou para relembrar os que já a es tudaram A Parte II aborda o armazenamento expressão e transmissão de informações genéticas A Parte III apresenta os fundamentos dos principais métodos experimentais de investigação e análise celular aqui uma nova seção intitulada Análise matemática das funções celulares no Capítulo 8 fornece uma dimensão extra para nossa compreen são sobre regulação e função celular A Parte IV discute a organização interna da célula A Parte V aborda o comportamento celular nos sistemas multicelulares iniciando com o desenvolvimento de organismos multicelulares e concluindo com capítulos sobre pató genos e infecção e sobre os sistemas imune inato e adaptativo Teste seu conhecimento Uma seleção de questões escritas por John Wilson e Tim Hunt aparece no final de cada capítulo As questões para os quatro últimos capítulos sobre organismos multicelulares são novas nesta edição As soluções completas para todas as questões podem ser encon tradas na página do livro em nosso site lojagrupoacombr Referências Uma lista concisa de referências selecionadas foi incluída no final de cada capítulo Elas estão organizadas em ordem alfabética dentro dos principais subtítulos Essas referên cias às vezes incluem os artigos originais em que descobertas importantes foram noticia das pela primeira vez Termos do glossário Ao longo do livro quando um termo merece destaque ele aparece em negrito indican do que ali é abordado em mais detalhes Itálico é utilizado para destacar termos também importantes porém com menos ênfase No final do livro encontrase o glossário expan dido abrangendo termos técnicos que são parte da terminologia da biologia celular ele é indicado como o primeiro recurso para o leitor ao encontrar termos com os quais não está familiarizado Nomenclatura para genes e proteínas Cada espécie possui suas próprias convenções para nomear genes a única característica em comum é que eles são sempre marcados em itálico Em algumas espécies como os humanos os nomes dos genes são escritos todos em letras maiúsculas em outras es pécies como o peixezebra todas as letras são minúsculas em outras ainda a maioria dos genes de camundongos com a primeira letra maiúscula e as letras seguintes em minúsculo ou como na Drosophila com diferentes combinações de letras maiúsculas e minúsculas dependendo se o primeiro alelo mutante que foi descoberto produz um fenótipo dominante ou recessivo As convenções para o nome de produtos de proteínas são igualmente variadas Essa variedade enorme de padrões preocupa a todos como fazer para não regis trar informações equivocadas Não podemos de forma independente definir uma nova convenção para cada uma das próximas milhões de espécies cujos genes desejarmos estudar Além disso há muitas ocasiões especialmente em um livro como este em que precisamos nos referir a um gene de forma genérica sem especificar a versão do camun dongo do humano da galinha ou do hipopótamo pois são todos equivalentes para o propósito da discussão Que convenção então devemos usar Nota ao leitor xvi Nota ao leitor Decidimos neste livro deixar de lado as convenções para as espécies individuais e seguir uma única regra escrevemos todos os nomes de genes como os nomes de pes soas e lugares com a primeira letra maiúscula e letras seguintes minúsculas mas todas em itálico deste modo Apc Bazooka Cdc2 Dishevelled Egl1 A proteína corresponden te se possuir seu nome originado a partir do gene será então escrita igualmente mas não com as letras em itálico Apc Bazooka Cdc2 Dishevelled Egl1 Quando é necessário especificar o organismo podese usar um prefixo para o nome do gene Para completar listamos outros detalhes das regras de nomenclatura que segui mos Em alguns exemplos uma letra adicionada no nome do gene é tradicionalmente usada para distinguir entre genes relacionados quanto à função ou evolução para esses genes colocamos a letra em maiúsculo se for comum fazêlo LacZ RecA HoxA4 Não usamos hífen para separar as letras ou números adicionados do restante do nome As proteínas são mais um problema Muitas delas têm nomes particulares designados an tes do gene ser nomeado Tais nomes de proteínas têm muitas formas embora a maio ria deles tradicionalmente inicie com letra minúscula actina hemoglobina catalase como nomes de substâncias comuns queijo náilon a menos que eles sejam abrevia dos como GFP para Green Fluorescent Protein ou BMP4 para Bone Morphogenetic Protein 4 Determinar todos os nomes de proteínas em um estilo uniforme para esta belecer convenções seria algo extremo então optamos por utilizar a forma tradicional actina GFP etc Para os nomes dos genes correspondentes em todos estes casos no entanto seguimos a nossa regra padrão Actina Hemoglobina Catalase Bmp4 Gfp Oca sionalmente precisamos destacar o nome de uma proteína colocandoo em itálico para enfatizar a finalidade geralmente ficará evidente no contexto Para aqueles que desejarem conhecer a tabela abaixo mostra algumas convenções oficiais para espécies individuais convenções que na maioria das vezes violamos nes te livro conforme explicado até aqui Organismo Convenção espécieespecífica Convenção especial usada neste livro Gene Proteína Gene Proteína Camundongo Hoxa4 Hoxa4 HoxA4 HoxA4 Bmp4 BMP4 Bmp4 BMP4 integrina a1 Itga1 integrina a1 Integrina a1 Itga1 integrina a1 Humano HOXA4 HOXA4 HoxA4 HoxA4 Peixezebra cyclops cyc Cyclops Cyc Cyclops Cyc Cyclops Cyc Caenorhabditis unc6 UNC6 Unc6 Unc6 Drosophila sevenless sev letra minúscula devido ao fenótipo recessivo Sevenless SEV Sevenless Sev Sevenless Sev Deformed Dfd letra maiúscula devido ao fenótipo dominante mutante Deformed DFD Deformed Dfd Deformed Dfd Levedura Saccharomyces cerevisae levedura em brotamento CDC28 Cdc28 Cdc28p Cdc28 Cdc28 Schizosaccharomyces pombe levedura em divisão Cdc2 Cdc2 Cdc2p Cdc2 Cdc2 Arabidopsis GAI GAI Gai GAI E coli uvrA UvrA UvrA UvrA Recursos de aprendizagem estão disponíveis online na pá gina do Biologia molecular da célula em inglês localizada em wwwgarlandsciencecomMBOC6students Chama das para as Animações estão destacadas em cor e negrito ao longo do livro direcionando o leitor e complementando o conteúdo de cada capítulo Lâminas para exploração da cé lula ensinam a morfologia celular por meio de micrografias interativas que destacam estruturas celulares importantes O glossário completo assim como um conjunto de flashcards também estão disponíveis na mesma página Esperamos que esses recursos estimulem o aprendizado dos estudantes e torne mais fácil a preparação de aulas dinâmicas e atividades de classe para os professores A manutenção e a disponibilização da página são de responsabili dade da Garland Science Taylor Francis Group LLC ÁREA DO PROFESSOR Professores podem fazer download do material complemen tar exclusivo em português Acesse nosso site lojagrupoa combr cadastrese gratuitamente como professor encontre a página do livro por meio do campo de busca e clique no link Material do Professor Recursos didáticos Esta página foi deixada em branco intencionalmente Prefácio Desde a última edição deste livro mais de cinco milhões de artigos científicos foram pu blicados Houve um aumento correspondente na quantidade de informações digitais sur giram novos dados sobre sequências genômicas interações de proteínas estruturas mo leculares e expressão gênica todos armazenados em vastos bancos de dados O desafio para cientistas e autores de livros acadêmicos é converter essa quantidade impressionante de informação em uma explicação acessível e atual de como as células funcionam O aumento no número de artigos de revisão que têm como objetivo tornar o conteúdo original mais fácil de ser compreendido nos auxilia nessa tarefa embora a maioria dessas re visões ainda seja bastante específica Além disso uma coleção cada vez maior de fontes onli ne tenta nos convencer que a compreensão está apenas a alguns clicks do mouse Em algumas áreas essa mudança no acesso ao conhecimento teve muito sucesso como na descoberta do que há de mais atual sobre nossos próprios problemas médicos Contudo para compreender um pouco sobre a beleza e a complexidade de como as células vivas funcionam é necessário mais do que apenas um wikiisso ou wikiaquilo é extremamente difícil identificar as pe dras preciosas neste aterro confuso Uma narrativa cuidadosamente elaborada que conduz o leitor de forma lógica e progressiva por meio de ideias componentes e experimentos é muito mais eficaz já que o leitor poderá construir para si mesmo uma estrutura conceitual da biologia celular memorável que permitirá avaliar criticamente toda a nova ciência e o mais importante compreendêla Foi isso que tentamos fazer neste Biologia molecular da célula Na preparação desta nova edição inevitavelmente tivemos que tomar algumas decisões difíceis Para incluir novas e estimulantes descobertas e manter o livro portátil muito teve que ser retirado Adicionamos novas seções como aquelas sobre as novas funções do RNA avanços na biologia das célulastronco novos métodos para estudar proteínas e genes e obter imagens de células avanços na genética e tratamento do cân cer e no controle do crescimento e morfogênese do desenvolvimento A química das células é extremamente complexa e toda lista de partes celulares e suas interações não importando o quão completa deixaria grandes lacunas na nossa compreensão Percebemos que para produzir explicações convincentes sobre o compor tamento celular necessitaremos de informações quantitativas sobre as células as quais es tão vinculadas a abordagens matemáticascomputacionais sofisticadas algumas ainda nem inventadas Como consequência os biólogos celulares estão procurando transformar seus estudos em uma descrição mais quantitativa e com dedução matemática Destaca mos essa abordagem e alguns de seus métodos em uma nova seção no final do Capítulo 8 Frente à imensidão do que aprendemos sobre biologia celular pode parecer ten tador para um estudante imaginar que ainda resta pouco a descobrir Na verdade quan to mais descobrimos sobre as células mais questões surgem Para enfatizar que nossa compreensão sobre biologia celular está incompleta destacamos as principais lacunas no nosso conhecimento ao inserirmos a lista O que não sabemos no final de cada capí tulo Essa breve lista inclui apenas uma pequena amostra de questões importantes não respondidas e dos desafios para a próxima geração de cientistas Aliás ficamos muito satisfeitos em saber que alguns de nossos leitores encontrarão respostas no futuro As mais de 1500 ilustrações foram planejadas para criar uma narrativa paralela mas intimamente interligada ao texto Aumentamos a harmonia entre os capítulos par ticularmente no uso das cores e de ícones comuns canais e bombas de membrana são um bom exemplo Para evitar interrupções no texto parte do conteúdo foi movida para novos Painéis A maioria das estruturas proteicas importantes descritas foi redesenhada e colorida agora em cada caso fornecemos o código no PDB Protein Data Bank cor respondente para a proteína que pode ser utilizado para acessar ferramentas online que fornecem mais informações sobre ela como aquelas no website RCSB PDB wwwrcsb org Essas conexões permitem aos leitores explorar de forma mais completa as proteí nas que estão no centro da biologia celular xx Prefácio John Wilson e Tim Hunt novamente contribuíram com suas questões peculiares e criativas proporcionando aos estudantes uma compreensão mais ativa do texto As ques tões enfatizam abordagens quantitativas e encorajam o raciocínio crítico sobre os experi mentos publicados elas estão agora presentes no final de todos os capítulos As respostas para as questões estão disponíveis na página do livro em nosso site lojagrupoacombr Vivemos em um mundo que nos apresenta vários assuntos complexos relaciona dos à biologia celular biodiversidade mudança climática segurança alimentar degra dação ambiental esgotamento de fontes de recursos e doenças Esperamos que nosso li vro ajude o leitor a compreender melhor e possivelmente contribuir para resolver esses desafios Conhecimento e compreensão trazem o poder para intervir Temos uma dívida de gratidão com um grande número de cientistas cuja ajuda ge nerosa é mencionada separadamente no texto Agradecimentos p ix a xiv Aqui precisa mos mencionar algumas contribuições particularmente importantes Para o Capítulo 8 Hana ElSamad forneceu o cerne da seção Análise matemática das funções celulares e Karen Hopkin fez contribuições valiosas para a seção Estudo da expressão e da função de genes Werner Kuhlbrandt ajudou a reorganizar e rescrever o Capítulo 14 Conversão de energia mitocôndrias e cloroplastos Rebecca Heald fez o mesmo para o Capítulo 16 O citoesqueleto assim como Alexander Schier fez para o Capítulo 21 Desenvolvimento de organismos multicelulares e Matt Welch para o Capítulo 23 Patógenos e infecção Lewis Lanier ajudou a escrever o Capítulo 24 Os sistemas imunes inato e adaptativo Hossein Amiri gerou um enorme banco online de questões para professores Antes de iniciar o ciclo de revisão para esta edição convidamos vários cientistas que utilizaram a última edição para ensinar biologia celular a nos encontrar e sugerir melhorias Eles nos ofereceram sugestões úteis que ajudaram a aperfeiçoar a nova edi ção Também tivemos o auxílio valioso de grupos de estudantes que leram as provas da maioria dos capítulos Muitas pessoas e muitos esforços são necessários para converter um longo origi nal e uma grande pilha de rascunhos em um livrotexto finalizado A equipe da Garland Science que gerenciou essa conversão foi espetacular Denise Schanck gerindo a operação demonstrou paciência perspicácia tato e energia durante a jornada ela nos guiou com segurança competentemente auxiliada por Allie Bochicchio e Janette Scobie Nigel Orme supervisionou nosso programa renovado de ilustrações finalizou toda a arte e novamen te enriqueceu a contracapa com seu talento gráfico Tiago Barros nos ajudou a renovar as apresentações sobre estruturas proteicas Matthew McClements criou o projeto gráfico do livro e sua capa Emma Jeffcock novamente editorou as páginas finais gerenciando ciclos infinitos de provas e alterações de último minuto com destreza e paciência notáveis com ajuda de Georgina Lucas Michael Morales auxiliado por Leah Christians produziu e mon tou a complexa rede de vídeos animações e outros materiais que formam a base dos re cursos online que acompanham este livro Adam Sendroff ofereceu um feedback valioso sobre os usuários do livro pelo mundo o que qualificou nosso ciclo de revisão Lançando olhares especializados sobre o original Elizabeth Zayatz e Sherry Granum Lewis atuaram como editores de desenvolvimento Jo Clayton como preparadora de originais e Sally Huish como revisora de provas Bill Johncocks compilou o índice Em Londres Emily Preece nos alimentou enquanto a ajuda habilidade e energia da equipe da Garland juntamente com sua amizade nos nutriram de várias formas durante a revisão tornando todo o processo prazeroso Os autores têm muita sorte por terem sido amparados com tanta generosidade Agradecemos aos nossos cônjuges familiares amigos e colegas por seu apoio con tínuo o que mais uma vez tornou possível a nova edição deste livro Quando estávamos completando esta edição Julian Lewis nosso coautor amigo e colega finalmente sucumbiu ao câncer contra o qual lutou tão bravamente por dez anos Iniciando em 1979 Julian fez contribuições importantes para as seis edições e como nosso mais elegante sábio com as palavras elevou e melhorou o estilo e o tom de todos os capítulos que tocou Conhecido por seu cuidadoso enfoque erudito a clareza e a sim plicidade estavam no coração de seu texto Julian é insubstituível e todos sentiremos muito a falta de sua amizade e colaboração Dedicamos a 6ª edição à sua memória Os autores Mais de 1800 questões adicionais estão disponíveis no livro Molecular biology of the cell The problems book PARTE I INTRODUÇÃO À CÉLULA 1 Capítulo 1 Células e genomas 1 Capítulo 2 Bioenergética e química celular 43 Painel 21 Ligações e grupos químicos normalmente observados nas moléculas biológicas 90 Painel 22 A água e sua influência sobre o comportamento das moléculas biológicas 92 Painel 23 Os principais tipos de ligações não covalentes fracas que mantêm as macromoléculas unidas 94 Painel 24 Esquema de alguns dos tipos de açúcares encontrados nas células 96 Painel 25 Ácidos graxos e outros lipídeos 98 Painel 26 Um resumo sobre os nucleotídeos 100 Painel 27 Energia livre e reações biológicas 102 Painel 28 Detalhes das 10 etapas da glicólise 104 Painel 29 O ciclo do ácido cítrico completo 106 Capítulo 3 Proteínas 109 Painel 31 Os 20 aminoácidos encontrados nas proteínas 112 Painel 32 Alguns dos métodos utilizados no estudo das enzimas 142 PARTE II MECANISMOS GENÉTICOS BÁSICOS 173 Capítulo 4 DNA cromossomos e genomas 173 Capítulo 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 237 Capítulo 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 299 Capítulo 7 Controle da expressão gênica 369 Painel 71 Motivos estruturais comuns em reguladores da transcrição 376 PARTE III FORMAS DE TRABALHAR COM CÉLULAS 439 Capítulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 439 Painel 81 Métodos de sequenciamento de DNA 478 Painel 82 Revisão da genética clássica 486 Capítulo 9 Visualização de células 529 PARTE IV ORGANIZAÇÃO INTERNA DA CÉLULA 565 Capítulo 10 Estrutura da membrana 565 Capítulo 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 597 Painel 111 A derivação da equação de Nernst 616 Sumário resumido xxii Sumário resumido Capítulo 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 641 Capítulo 13 Tráfego intracelular de vesículas 695 Capítulo 14 Conversão de energia mitocôndrias e cloroplastos 753 Painel 141 Potenciais redox 765 Capítulo 15 Sinalização celular 813 Capítulo 16 Citoesqueleto 889 Painel 161 Os três principais tipos de filamentos proteicos que formam o citoesqueleto 891 Painel 162 A polimerização de actina e tubulina 902 Painel 163 Filamentos de actina 906 Painel 164 Microtúbulos 933 Capítulo 17 Ciclo celular 963 Painel 171 Os principais estágios da fase M mitose e citocinese em uma célula animal 980 Capítulo 18 Morte celular 1021 PARTE V AS CÉLULAS EM SEU CONTEXTO SOCIAL 1035 Capítulo 19 Junções celulares e matriz extracelular 1035 Capítulo 20 Câncer 1091 Capítulo 21 Desenvolvimento de organismos multicelulares 1145 Capítulo 22 Célulastronco e renovação de tecidos 1217 Capítulo 23 Patógenos e infecção 1263 Capítulo 24 Os sistemas imunes inato e adaptativo 1297 Glossário 1343 Índice 1377 Capítulo 1 Células e genomas 1 CARACTERÍSTICAS UNIVERSAIS DAS CÉLULAS NA TERRA 2 Todas as células armazenam sua informação hereditária no mesmo código químico linear o DNA 2 Todas as células replicam sua informação hereditária por polimerização a partir de um molde 3 Todas as células transcrevem partes de sua informação hereditária em uma mesma forma intermediária o RNA 4 Todas as células utilizam proteínas como catalisadores 5 Todas as células traduzem o RNA em proteínas da mesma maneira 6 Cada proteína é codificada por um gene específico 7 A vida requer energia livre 8 Todas as células funcionam como fábricas bioquímicas que utilizam as mesmas unidades moleculares fundamentais básicas 8 Todas as células são envoltas por uma membrana plasmática através da qual os nutrientes e materiais residuais devem passar 8 Uma célula viva pode sobreviver com menos de 500 genes 9 A DIVERSIDADE DOS GENOMAS E A ÁRVORE DA VIDA 10 As células podem ser alimentadas por variadas fontes de energia livre 10 Algumas células fixam nitrogênio e dióxido de carbono para outras 12 As células procarióticas exibem a maior diversidade bioquímica existente 13 A árvore da vida possui três ramos principais bactérias arqueias e eucariotos 14 Alguns genes evoluem de forma rápida outros são altamente conservados 15 A maioria das bactérias e das arqueias tem entre 1000 e 6000 genes 16 Novos genes são gerados a partir de genes preexistentes 16 Duplicações gênicas originam famílias de genes relacionados em uma única célula 17 Os genes podem ser transferidos entre organismos tanto no laboratório quanto na natureza 18 O sexo resulta em trocas horizontais da informação genética em uma mesma espécie 19 A função de um gene frequentemente pode ser deduzida a partir de sua sequência 20 Mais de 200 famílias de genes são comuns a todos os três ramos primários da árvore da vida 20 As mutações revelam as funções dos genes 21 A biologia molecular iniciou com as suas atenções voltadas à E coli 22 A INFORMAÇÃO GENÉTICA EM EUCARIOTOS 23 As células eucarióticas podem ter surgido como predadoras 24 As células eucarióticas contemporâneas evoluíram de uma simbiose 25 Os eucariotos possuem genomas híbridos 27 Os genomas eucarióticos são grandes 28 Os genomas eucarióticos são ricos em DNA regulador 29 O genoma define o programa de desenvolvimento multicelular 29 Muitos eucariotos vivem como células solitárias 30 Uma levedura serve como um modelo mínimo de eucarioto 30 Os níveis de expressão de todos os genes de um organismo podem ser monitorados simultaneamente 32 A Arabidopsis foi escolhida dentre 300 mil espécies como uma plantamodelo 32 O mundo das células animais é representado por um verme uma mosca um peixe um camundongo e um humano 33 Os estudos com Drosophila proporcionam entendimento sobre o desenvolvimento dos vertebrados 33 O genoma dos vertebrados é um produto de duplicações repetidas 34 A rã e o peixezebra proporcionam modelos acessíveis para o desenvolvimento dos vertebrados 35 O camundongo é o organismomodelo predominante de mamíferos 35 Os humanos relatam suas próprias peculiaridades 37 Somos todos diferentes nos detalhes 38 Para entender as células e os organismos será necessário matemática computadores e informação quantitativa 38 Capítulo 2 Bioenergética e química celular 43 COMPONENTES QUÍMICOS DA CÉLULA 43 A água é mantida coesa por ligações de hidrogênio 44 Quatro tipos de interações não covalentes contribuem para manter a associação entre as moléculas em uma célula 44 Algumas moléculas polares formam ácidos e bases em água 45 As células são formadas por compostos de carbono 46 As células contêm quatro famílias principais de moléculas orgânicas pequenas 47 A química das células é dominada por macromoléculas com propriedades extraordinárias 47 Ligações não covalentes determinam tanto a forma precisa das macromoléculas como a forma com que se ligam a outras moléculas 49 CATÁLISE E O USO DE ENERGIA PELAS CÉLULAS 51 As enzimas organizam o metabolismo celular 51 A liberação de energia térmica pelas células possibilita a ordem biológica 52 As células obtêm energia pela oxidação de moléculas orgânicas 54 A oxidação e a redução envolvem a transferência de elétrons 55 As enzimas diminuem as barreiras da energia de ativação que impedem reações químicas 57 As enzimas podem conduzir moléculas de substrato por vias de reações específicas 58 Como as enzimas encontram seus substratos a enorme rapidez dos movimentos das moléculas 59 A variação na energia livre da reação G determina se ela pode ocorrer espontaneamente 60 As concentrações dos reagentes influenciam a variação de energia livre e a direção da reação 61 A variação da energia livre padrão G permite comparar a energética de reações diferentes 61 A constante de equilíbrio e o G podem ser facilmente derivados um do outro 62 As variações de energia livre de reações acopladas são aditivas 63 Moléculas carreadoras ativadas são essenciais para a biossíntese 63 A formação de um carreador ativado está acoplada a uma reação energeticamente favorável 64 O ATP é a molécula carreadora ativada mais amplamente utilizada 65 A energia armazenada no ATP geralmente é utilizada para promover a ligação de duas moléculas 65 NADH e NADPH são importantes carreadores de elétrons 67 Existem muitas outras moléculas de carreadores ativados nas células 69 A síntese dos polímeros biológicos é impulsionada pela hidrólise de ATP 70 COMO AS CÉLULAS OBTÊM ENERGIA DOS ALIMENTOS 73 A glicólise é uma via central na produção de ATP 74 A fermentação produz ATP na ausência de oxigênio 75 A glicólise ilustra como as enzimas acoplam oxidação ao armazenamento de energia 76 Os organismos armazenam moléculas de alimento em compartimentos especiais 78 A maioria das células animais obtém dos ácidos graxos a energia para os períodos entre as refeições 81 Os açúcares e as gorduras são degradados a acetilCoA nas mitocôndrias 81 O ciclo do ácido cítrico gera NADH pela oxidação de grupos acetila a CO2 82 Na maioria das células o transporte de elétrons promove a síntese da maior parte do ATP 84 Os aminoácidos e os nucleotídeos fazem parte do ciclo do nitrogênio 85 O metabolismo é altamente organizado e regulado 87 Sumário xxiv Sumário Capítulo 3 Proteínas 109 FORMA E ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS 109 A forma de uma proteína é especificada pela sua sequência de aminoácidos 109 As proteínas se enovelam na conformação de menor energia 114 As ahélices e as folhas b são motivos comuns de enovelamento 115 Os domínios proteicos são unidades modulares a partir das quais as proteínas maiores são construídas 117 Apenas algumas das muitas cadeias polipeptídicas possíveis serão úteis para as células 118 As proteínas podem ser classificadas em diversas famílias 119 Alguns domínios proteicos são encontrados em várias proteínas diferentes 121 Pares específicos de domínios são encontrados juntos em muitas proteínas 122 O genoma humano codifica um conjunto complexo de proteínas revelando que muita informação ainda é desconhecida 122 As grandes moléculas proteicas geralmente contêm mais de uma cadeia polipeptídica 123 Algumas proteínas globulares formam longos filamentos helicoidais 123 Diversas moléculas proteicas apresentam formas alongadas e fibrosas 124 As proteínas contêm uma quantidade surpreendentemente alta de segmentos de cadeia polipeptídica intrinsecamente desordenada 125 Ligações cruzadas covalentes estabilizam proteínas extracelulares 126 Moléculas proteicas frequentemente servem como subunidades na formação de grandes estruturas 127 Diversas estruturas celulares são capazes de associação espontânea 128 Fatores de associação frequentemente auxiliam na formação de estruturas biológicas complexas 129 Fibrilas amiloides podem ser formadas por diversas proteínas 130 As estruturas amiloides podem desempenhar funções úteis nas células 131 Diversas proteínas apresentam regiões de baixa complexidade capazes de formar estruturas amiloides reversíveis 132 FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS 134 Todas as proteínas ligamse a outras moléculas 134 A conformação da superfície de uma proteína determina a sua química 135 Comparações entre as sequências de proteínas pertencentes a uma mesma família destacam sítios cruciais de ligação a ligantes 136 As proteínas ligamse umas às outras por diversos tipos de interfaces 137 Os sítios de ligação dos anticorpos são especialmente versáteis 138 A constante de equilíbrio mede a força de ligação 138 As enzimas são catalisadores poderosos e altamente específicos 140 A ligação do substrato é a primeira etapa na catálise enzimática 141 As enzimas aceleram reações pela estabilização seletiva dos estados de transição 141 As enzimas podem utilizar simultaneamente a catálise ácida e a básica 144 A lisozima ilustra como uma enzima funciona 144 Pequenas moléculas que se ligam fortemente às proteínas conferem a elas novas funções 146 Complexos multienzimáticos ajudam a aumentar a taxa de metabolismo celular 148 A célula regula as atividades catalíticas de suas enzimas 149 As enzimas alostéricas possuem dois ou mais sítios de ligação interativos 151 Dois ligantes cujos sítios de ligação estão acoplados devem afetar reciprocamente a ligação um do outro 151 Agregados proteicos simétricos geram transições alostéricas cooperativas 152 Diversas alterações nas proteínas são induzidas por fosforilação 153 Uma célula eucariótica contém uma ampla coleção de proteínascinase e proteínasfosfatase 154 A regulação da proteínacinase Src revela como uma proteína pode atuar como um microprocessador 155 Proteínas que ligam e hidrolisam GTP são reguladores celulares onipresentes 156 As proteínas reguladoras GAP e GEF controlam a atividade de proteínas de ligação ao GTP por determinar se uma molécula de GTP ou de GDP está ligada 157 Proteínas podem ser reguladas pela adição covalente de outras proteínas 157 Um sistema complexo de conjugação de ubiquitinas é utilizado para marcar proteínas 158 Complexos proteicos com partes intercambiáveis aumentam a eficiência da informação genética 159 Uma proteína de ligação ao GTP ilustra como grandes movimentos proteicos podem ser originados 160 As proteínas motoras geram grandes movimentos nas células 161 Os transportadores ligados à membrana utilizam energia para bombear moléculas através das membranas 163 As proteínas frequentemente formam complexos grandes que funcionam como máquinas proteicas 164 Proteínas de suporte concentram conjuntos de proteínas que interagem entre si 164 Várias proteínas são controladas por modificações covalentes que as mantêm em locais específicos no interior da célula 165 Uma complexa rede de interações de proteínas é a base da função celular 166 Capítulo 4 DNA cromossomos e genomas 173 ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA 175 A molécula de DNA consiste em duas cadeias de nucleotídeos complementares 175 A estrutura do DNA fornece um mecanismo para a hereditariedade 176 Em eucariotos o DNA é limitado ao núcleo celular 178 O DNA CROMOSSÔMICO E SUA COMPACTAÇÃO NA FIBRA DE CROMATINA 179 O DNA eucariótico é compactado em um conjunto de cromossomos 180 Os cromossomos contêm longas sequências de genes 182 A sequência nucleotídica do genoma humano mostra como nossos genes são organizados 183 Cada molécula de DNA que forma um cromossomo linear deve conter um centrômero dois telômeros e origens de replicação 185 As moléculas de DNA estão extremamente condensadas nos cromossomos 187 Os nucleossomos são as unidades básicas da estrutura dos cromossomos eucarióticos 187 A estrutura da partícula do cerne do nucleossomo revela como o DNA é compactado 188 Os nucleossomos possuem uma estrutura dinâmica e frequentemente estão sujeitos a alterações catalisadas pelos complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP 190 Normalmente os nucleossomos são condensados para formar uma fibra de cromatina compacta 191 ESTRUTURA E FUNÇÃO DA CROMATINA 194 A heterocromatina é altamente organizada e restringe a expressão gênica 194 O estado da heterocromatina é autopropagável 194 As histonas do cerne são modificadas covalentemente em vários sítios diferentes 196 A cromatina adquire mais variedade pela inserção sítioespecífica de um pequeno conjunto de variantes de histonas 198 Modificações covalentes e variantes de histonas atuam em conjunto no controle das funções dos cromossomos 198 Um complexo de proteínas de leitura e escrita marcação pode propagar modificações específicas da cromatina ao longo do cromossomo 199 Sequências de DNA de barreira bloqueiam a propagação dos complexos de leitura e escrita e portanto separam domínios de cromatina adjacentes 202 A cromatina nos centrômeros revela como as variantes de histonas podem criar estruturas especiais 203 Algumas estruturas da cromatina podem ser herdadas diretamente 204 Experimentos com embriões de rã sugerem que estruturas da cromatina de ativação e de repressão podem ser herdadas epigeneticamente 205 As estruturas da cromatina são importantes para a função dos cromossomos eucarióticos 206 A ESTRUTURA GLOBAL DOS CROMOSSOMOS 207 Os cromossomos são dobrados em grandes alças de cromatina 207 Os cromossomos politênicos são únicos na capacidade de permitir a visualização de estruturas de cromatina 208 Sumário xxv Existem múltiplas formas de cromatina 210 As alças de cromatina são descondensadas quando os genes nelas contidos são expressos 211 A cromatina pode se mover para sítios específicos dentro do núcleo para alterar a expressão gênica 212 Redes de macromoléculas formam um conjunto de ambientes bioquímicos distintos dentro do núcleo 213 Cromossomos mitóticos são especialmente supercondensados 214 COMO OS GENOMAS EVOLUEM 216 A comparação genômica revela sequências de DNA funcionais através de sua conservação durante a evolução 217 Alterações no genoma são causadas por falhas nos mecanismos normais que copiam e mantêm o DNA e por elementos de DNA transponíveis 217 As sequências genômicas de duas espécies diferem na mesma proporção do período de tempo de sua separação evolutiva 218 Árvores filogenéticas construídas a partir de comparações de sequências de DNA indicam as relações entre todos os organismos 219 Uma comparação entre cromossomos humanos e de camundongos revela como a estrutura dos genomas diverge 221 O tamanho do genoma de um vertebrado reflete as taxas relativas de adição e perda de DNA em uma linhagem 222 A sequência de alguns genomas primitivos pode ser deduzida 223 Comparações entre sequências multiespécies identificam sequências de DNA conservadas com função desconhecida 224 Alterações em sequências previamente conservadas podem auxiliar a decifrar etapas críticas na evolução 226 As mutações nas sequências de DNA que controlam a expressão gênica impulsionaram muitas das alterações evolutivas em vertebrados 227 A duplicação gênica também fornece uma fonte importante de novidades genéticas durante a evolução 227 Genes duplicados sofrem divergência 228 A evolução da família de genes da globina mostra como as duplicações de DNA contribuem para a evolução dos organismos 229 Genes que codificam novas proteínas podem ser criados pela recombinação de éxons 230 Mutações neutras geralmente se difundem e tornamse fixas em uma população e sua probabilidade depende do tamanho da população 230 Muito pode ser aprendido pelas análises da variação entre os humanos 232 Capítulo 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 237 MANUTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE DNA 237 As taxas de mutação são extremamente baixas 237 Taxas de mutação baixas são necessárias à vida que conhecemos 238 MECANISMOS DE REPLICAÇÃO DO DNA 239 O pareamento de bases fundamenta a replicação e o reparo do DNA 239 A forquilha de replicação de DNA é assimétrica 240 A alta fidelidade da replicação do DNA requer diversos mecanismos de correção 242 Apenas a replicação do DNA na direção 53 permite correção eficiente de erros 244 Uma enzima especial de polimerização de nucleotídeos sintetiza pequenas moléculas de iniciadores de RNA na fita retardada 245 Proteínas especiais auxiliam na abertura da duplahélice de DNA à frente da forquilha de replicação 246 Uma cinta deslizante mantém a DNApolimerase em movimento sobre o DNA 247 Na forquilha de replicação as proteínas cooperam para formar uma maquinaria de replicação 249 Um sistema de reparo de pareamento incorreto remove erros de replicação que escapam da maquinaria de replicação 250 As DNAtopoisomerases evitam o emaranhamento do DNA durante a replicação 251 A replicação do DNA é fundamentalmente semelhante em eucariotos e em bactérias 253 INÍCIO E TÉRMINO DA REPLICAÇÃO DO DNA NOS CROMOSSOMOS 254 A síntese de DNA inicia na origem de replicação 254 Os cromossomos bacterianos geralmente têm uma única origem de replicação do DNA 255 Os cromossomos eucarióticos contêm múltiplas origens de replicação 256 A replicação de DNA em eucariotos ocorre apenas durante uma etapa do ciclo celular 258 Regiões diferentes no mesmo cromossomo replicam em tempos distintos na fase S 258 Um grande complexo de múltiplas subunidades ligase às origens de replicação de eucariotos 259 As características do genoma humano que determinam as origens de replicação ainda precisam ser descobertas 260 Novos nucleossomos são formados atrás da forquilha de replicação 261 A telomerase replica as extremidades dos cromossomos 262 Telômeros são empacotados em estruturas especializadas que protegem as extremidades cromossômicas 263 O comprimento dos telômeros é regulado pelas células e pelos organismos 264 REPARO DO DNA 266 Sem o reparo do DNA as lesões espontâneas rapidamente modificariam as sequências de DNA 267 A duplahélice de DNA é corrigida imediatamente 268 Uma lesão no DNA pode ser removida por mais de uma via 269 O acoplamento do reparo por excisão de nucleotídeos à transcrição garante que o DNA mais importante da célula seja corrigido de maneira eficiente 271 A química das bases do DNA facilita a detecção das lesões 271 DNApolimerases translesão especiais são usadas em emergências 273 Quebras na fita dupla são corrigidas de maneira eficiente 273 As lesões no DNA retardam a progressão do ciclo celular 275 RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA 276 A recombinação homóloga possui características comuns em todas as células 277 A recombinação homóloga é dirigida pelas interações de pareamento de bases do DNA 277 A recombinação homóloga pode reparar corretamente as quebras na fita dupla de DNA 278 A troca de fitas é realizada pela proteína RecARad51 279 A recombinação homóloga pode resgatar forquilhas de replicação com DNA danificado 280 As células controlam cuidadosamente o uso da recombinação homóloga no reparo do DNA 280 A recombinação homóloga é essencial para a meiose 282 A recombinação meiótica inicia com uma quebra programada de fita dupla 282 Junções de Holliday são formadas durante a meiose 284 A recombinação homóloga produz tanto entrecruzamentos quanto não entrecruzamentos durante a meiose 284 A recombinação homóloga normalmente resulta em conversão gênica 285 TRANSPOSIÇÃO E RECOMBINAÇÃO SÍTIOESPECÍFICA CONSERVATIVA 287 Pela transposição os elementos genéticos móveis podem se inserir em qualquer sequência de DNA 288 Transpósons exclusivamente de DNA podem se mover por um mecanismo de corte e colagem 288 Alguns vírus utilizam o mecanismo de transposição para moveremse para dentro dos cromossomos das células hospedeiras 290 Os retrotranspósons semelhantes a retrovírus são parecidos com os retrovírus porém não possuem a capa proteica 291 Uma grande parte do genoma humano é composta de retrotranspósons não retrovirais 291 Diferentes elementos transponíveis predominam em diferentes organismos 292 As sequências genômicas revelam o número aproximado de vezes que os elementos transponíveis foram movidos 292 A recombinação sítioespecífica conservativa pode rearranjar o DNA de modo reversível 292 A recombinação sítioespecífica conservativa pode ser utilizada para ativar ou inativar genes 294 xxvi Sumário Recombinases sítioespecíficas conservativas bacterianas tornaramse valiosas ferramentas para a biologia celular e de desenvolvimento 294 Capítulo 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 299 DO DNA AO RNA 301 As moléculas de RNA são fitas simples 302 A transcrição produz uma molécula de RNA complementar a uma das fitas do DNA 302 RNApolimerases realizam a transcrição 303 As células produzem diferentes categorias de moléculas de RNA 305 Sinais codificados no DNA indicam à RNApolimerase onde iniciar e onde terminar a transcrição 306 Os sinais de início e término da transcrição na sequência nucleotídica são heterogêneos 307 A iniciação da transcrição nos eucariotos requer várias proteínas 309 A RNApolimerase II requer um conjunto de fatores gerais de transcrição 310 A polimerase II também requer proteínas ativadoras mediadoras e modificadoras de cromatina 312 O alongamento da transcrição nos eucariotos requer proteínas acessórias 313 A transcrição cria tensão superhelicoidal 314 O alongamento da transcrição em eucariotos está fortemente associado ao processamento de RNA 315 O capeamento do RNA é a primeira modificação dos prémRNAs eucarióticos 316 O splicing do RNA remove as sequências de íntrons de prémRNAs recentemente transcritos 317 As sequências nucleotídicas sinalizam onde ocorre o splicing 319 O splicing do RNA é realizado pelo spliceossomo 319 O spliceossomo usa hidrólise de ATP para produzir uma série complexa de rearranjos RNARNA 320 Outras propriedades do prémRNA e da sua síntese ajudam a explicar a escolha dos sítios adequados de splicing 321 A estrutura da cromatina afeta o splicing do RNA 322 O splicing de RNA possui uma plasticidade extraordinária 323 O splicing do RNA catalisado pelo spliceossomo provavelmente evoluiu a partir de mecanismos de autosplicing 324 As enzimas de processamento do RNA geram a extremidade 3 dos mRNAs de eucariotos 324 mRNAs eucarióticos maduros são seletivamente exportados do núcleo 325 RNAs não codificadores também são sintetizados e processados no núcleo 327 O nucléolo é uma fábrica produtora de ribossomos 329 O núcleo contém uma variedade de agregados subnucleares 331 DO RNA À PROTEÍNA 333 Uma sequência de mRNA é decodificada em conjuntos de três nucleotídeos 334 As moléculas de tRNA transportam aminoácidos para os códons no mRNA 334 Os tRNAs são covalentemente modificados antes de saírem do núcleo 336 Enzimas específicas acoplam cada aminoácido à sua molécula de tRNA adequada 336 A edição por tRNAsintetases assegura a exatidão 338 Os aminoácidos são adicionados à extremidade Cterminal de uma cadeia polipeptídica em crescimento 339 A mensagem de RNA é decodificada nos ribossomos 340 Os fatores de alongamento promovem a tradução e aumentam a exatidão do processo 343 Diversos processos biológicos superam as limitações inerentes ao pareamento de bases complementares 344 A exatidão na tradução requer um gasto de energia livre 345 O ribossomo é uma ribozima 346 As sequências nucleotídicas no mRNA sinalizam onde iniciar a síntese proteica 347 Os códons de terminação marcam o final da tradução 348 As proteínas são produzidas nos polirribossomos 349 Existem pequenas variações no código genético padrão 349 Inibidores da síntese de proteínas em procariotos são úteis como antibióticos 351 Mecanismos de controle de qualidade impedem a tradução de mRNAs danificados 351 Algumas proteínas iniciam o seu enovelamento ainda durante a síntese 353 As chaperonas moleculares auxiliam no enovelamento da maioria das proteínas 354 As células utilizam diversos tipos de chaperonas 355 As regiões hidrofóbicas expostas fornecem sinais essenciais para o controle de qualidade da proteína 357 O proteassomo é uma protease compartimentalizada com sítios ativos sequestrados 357 Muitas proteínas são reguladas por destruição controlada 359 Existem muitas etapas do DNA à proteína 361 O MUNDO DE RNA E A ORIGEM DA VIDA 362 As moléculas de RNA de fita simples podem se enovelar em estruturas altamente complexas 363 O RNA pode armazenar informações e catalisar reações químicas 364 Como ocorreu a evolução da síntese de proteínas 365 Todas as células atuais usam DNA como material hereditário 365 Capítulo 7 Controle da expressão gênica 369 UMA VISÃO GERAL DO CONTROLE GÊNICO 369 Os diferentes tipos celulares de um organismo multicelular contêm o mesmo DNA 369 Diferentes tipos celulares sintetizam diferentes conjuntos de RNAs e proteínas 370 Sinais externos podem induzir uma célula a alterar a expressão de seus genes 371 A expressão gênica pode ser regulada em muitas etapas no caminho que vai do DNA ao RNA e até a proteína 372 CONTROLE DA TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 373 A sequência de nucleotídeos da duplahélice de DNA pode ser lida por proteínas 373 Reguladores da transcrição contêm motivos estruturais que podem ler sequências de DNA 374 A dimerização de reguladores da transcrição aumenta a afinidade e a especificidade deles por DNA 375 Reguladores da transcrição ligamse cooperativamente ao DNA 378 A estrutura nucleossômica promove ligação cooperativa de reguladores da transcrição 379 REGULADORES DA TRANSCRIÇÃO ATIVAM E INATIVAM OS GENES 380 O repressor do triptofano inativa os genes 380 Repressores inativam e ativam os genes 381 Um ativador e um repressor controlam o óperon Lac 382 A formação de alças no DNA pode ocorrer durante a regulação gênica bacteriana 383 Comutadores complexos controlam a transcrição gênica em eucariotos 384 Uma região de controle gênico eucariótica consiste em um promotor e muitas sequências reguladoras cisatuantes 384 Reguladores da transcrição eucarióticos atuam em grupos 385 Proteínas ativadoras promovem a associação da RNApolimerase no sítio de início de transcrição 386 Ativadores da transcrição eucarióticos dirigem a modificação da estrutura local da cromatina 386 Ativadores da transcrição podem promover a transcrição liberando a RNApolimerase dos promotores 388 Ativadores transcricionais atuam sinergicamente 388 Repressores transcricionais eucarióticos podem inibir a transcrição de diferentes formas 390 Sequências de DNA isoladoras impedem que reguladores da transcrição eucarióticos influenciem genes distantes 391 MECANISMOS GENÉTICOMOLECULARES QUE CRIAM E MANTÊM TIPOS CELULARES ESPECIALIZADOS 392 Os comutadores genéticos complexos que regulam o desenvolvimento na Drosophila são formados a partir de moléculas menores 392 O gene Eve da Drosophila é regulado por controles combinatórios 394 Reguladores da transcrição são postos em cena por sinais extracelulares 395 O controle gênico combinatório cria muitos tipos celulares diferentes 396 Sumário xxvii Tipos celulares especializados podem ser reprogramados experimentalmente para se tornarem célulastronco pluripotentes 398 Combinações de reguladores mestres da transcrição especificam tipos celulares por meio do controle da expressão de muitos genes 398 Células especializadas devem ativar e inativar conjuntos de genes rapidamente 399 Células diferenciadas mantêm sua identidade 400 Circuitos de transcrição permitem que a célula realize operações lógicas 402 MECANISMOS QUE REFORÇAM A MEMÓRIA CELULAR EM PLANTAS E ANIMAIS 404 Padrões de metilação do DNA podem ser herdados quando as células de vertebrados se dividem 404 As ilhas ricas em CG estão associadas a muitos genes em mamíferos 405 O imprinting genômico necessita da metilação do DNA 407 As grandes alterações cromossômicas na estrutura da cromatina podem ser herdadas 409 Mecanismos epigenéticos garantem que padrões estáveis de expressão gênica possam ser transmitidos para as célulasfilha 411 CONTROLES PÓSTRANSCRICIONAIS 413 A atenuação da transcrição produz a terminação prematura de algumas moléculas de RNA 413 Ribocontroladores provavelmente representam formas ancestrais de controle gênico 414 O splicing alternativo do RNA pode produzir diferentes formas de uma proteína a partir do mesmo gene 415 A definição de gene foi modificada desde a descoberta do splicing alternativo do RNA 416 Uma mudança no sítio de clivagem no transcrito de RNA e de adição de poliA pode alterar a extremidade Cterminal de uma proteína 417 A edição do RNA pode alterar o significado da mensagem do RNA 418 O transporte do RNA a partir do núcleo pode ser regulado 419 Alguns mRNAs estão restritos a regiões específicas do citosol 421 As regiões 5 e 3 não traduzidas dos mRNAs controlam a sua tradução 422 A fosforilação de um fator de iniciação regula a síntese proteica de maneira global 423 A iniciação em códons AUG a montante do início da tradução pode regular o início da tradução eucariótica 424 Sítios internos de entrada no ribossomo fornecem oportunidades para o controle traducional 425 A expressão gênica pode ser controlada por mudanças na estabilidade do mRNA 426 A regulação da estabilidade do mRNA envolve corpos P e grânulos de estresse 428 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR RNAS NÃO CODIFICADORES 429 Transcritos de RNAs não codificadores pequenos regulam muitos genes de animais e plantas por meio da interferência de RNA 429 miRNAs regulam a tradução e a estabilidade de mRNAs 429 A interferência de RNA também é usada como um mecanismo de defesa celular 431 A interferência de RNA pode direcionar a formação de heterocromatina 432 piRNAs protegem as linhagens germinativas dos elementos transponíveis 433 A interferência de RNA tornouse uma poderosa ferramenta experimental 433 Bactérias usam RNAs não codificadores pequenos para se protegerem de vírus 434 RNAs não codificadores longos possuem diversas funções na célula 435 Capítulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 439 ISOLAMENTO DE CÉLULAS E SEU CRESCIMENTO EM CULTURA 439 Células podem ser isoladas a partir de tecidos 440 Células podem ser cultivadas em meio de cultura 440 Linhagens de células eucarióticas são uma fonte amplamente utilizada de células homogêneas 442 Linhagens celulares de hibridomas são fábricas que produzem anticorpos monoclonais 444 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 445 Células podem ser divididas em seus componentes 445 Extratos de células fornecem sistemas acessíveis para o estudo da função celular 447 Proteínas podem ser separadas por cromatografia 448 A imunoprecipitação é um método rápido de purificação por afinidade 449 Marcadores produzidos por engenharia genética fornecem uma maneira fácil de purificar proteínas 450 Sistemas purificados livres de células são necessários à dissecação precisa das funções moleculares 451 ANÁLISE DE PROTEÍNAS 452 As proteínas podem ser separadas por eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS 452 A eletroforese bidimensional em gel permite uma maior separação das proteínas 453 Proteínas específicas podem ser detectadas por marcação com anticorpos 454 Medidas hidrodinâmicas revelam o tamanho e a forma de um complexo proteico 455 A espectrometria de massa fornece um método altamente sensível para identificar proteínas desconhecidas 455 Grupos de proteínas que interagem podem ser identificados por métodos bioquímicos 457 Métodos ópticos podem monitorar as interações entre proteínas 458 A função proteica pode ser interrompida seletivamente com pequenas moléculas 459 A estrutura proteica pode ser determinada pelo uso de difração de raios X 460 A RMN pode ser utilizada para determinar a estrutura de proteínas em solução 461 A sequência da proteína e sua estrutura fornecem informações sobre a função proteica 462 ANÁLISE E MANIPULAÇÃO DE DNA 463 Nucleases de restrição cortam grandes moléculas de DNA em fragmentos específicos 464 A eletroforese em gel separa moléculas de DNA de diferentes tamanhos 465 As moléculas de DNA purificadas podem ser marcadas especificamente in vitro com radioisótopos ou com marcadores químicos 467 Os genes podem ser clonados usandose bactérias 467 Um genoma inteiro pode estar representado em uma biblioteca de DNA 469 Bibliotecas genômicas e de cDNA possuem diferentes vantagens e desvantagens 471 A hibridização fornece uma maneira simples mas poderosa para detectar sequências específicas de nucleotídeos 472 Genes podem ser clonados in vitro utilizando PCR 473 A PCR também é utilizada para diagnóstico e aplicações forenses 474 Tanto o DNA como o RNA podem ser rapidamente sequenciados 477 Para serem úteis sequências genômicas devem ser anotadas 477 A clonagem do DNA permite que qualquer proteína seja produzida em grandes quantidades 483 ESTUDO DA EXPRESSÃO E DA FUNÇÃO DE GENES 485 A genética clássica inicia com a interrupção de um processo celular por mutagênese aleatória 485 Os rastreamentos genéticos identificam mutantes com anormalidades específicas 488 Mutações podem causar a perda ou o ganho da função proteica 489 Testes de complementação revelam se dois mutantes estão no mesmo gene ou em genes diferentes 490 Os produtos dos genes podem ser ordenados em vias por análise de epistasia 490 Mutações responsáveis por um fenótipo podem ser identificadas pela análise do DNA 491 O sequenciamento de DNA rápido e barato tem revolucionado os estudos genéticos humanos 491 Blocos ligados de polimorfismos têm sido passados adiante a partir de nossos ancestrais 492 Polimorfismos podem ajudar a identificar mutações associadas a doenças 493 A genômica está acelerando a descoberta de mutações raras que nos predispõem a sérias doenças 493 A genética reversa começa com um gene conhecido e determina quais processos celulares requerem sua função 494 Animais e plantas podem ser geneticamente modificados 495 xxviii Sumário O sistema bacteriano CRISPR foi adaptado para editar genomas em uma ampla variedade de espécies 497 Grandes coleções de mutações feitas por engenharia genética fornecem uma ferramenta para examinar a função de cada gene em um organismo 498 A interferência de RNA é uma maneira simples e rápida de testar a função do gene 499 Genesrepórter revelam quando e onde um gene é expresso 501 A hibridização in situ pode revelar a localização dos mRNAs e RNAs não codificadores 502 A expressão de genes individuais pode ser medida usandose RTPCR quantitativa 502 Análises de mRNAs por microarranjo ou RNAseq fornecem informações sobre a expressão em um momento específico 503 A imunoprecipitação da cromatina genômica ampla identifica sítios no genoma ocupados por reguladores da transcrição 505 O perfil de ribossomos revela quais mRNAs estão sendo traduzidos na célula 505 Métodos de DNA recombinante revolucionaram a saúde humana 506 As plantas transgênicas são importantes para a agricultura 507 ANÁLISE MATEMÁTICA DAS FUNÇÕES CELULARES 509 Redes reguladoras dependem de interações moleculares 509 Equações diferenciais nos ajudam a predizer o comportamento transitório 512 A atividade do promotor e a degradação proteica afetam a taxa de alteração da concentração proteica 513 O tempo necessário para alcançar o estado estacionário depende do tempo de vida da proteína 514 Os métodos quantitativos para repressores e ativadores da transcrição são similares 514 A retroalimentação negativa é uma estratégia poderosa de regulação celular 515 A retroalimentação negativa com retardo pode induzir oscilações 516 A ligação ao DNA por um repressor ou um ativador pode ser cooperativa 516 A retroalimentação positiva é importante para respostas tudo ou nada e biestabilidade 518 A robustez é uma característica importante das redes biológicas 520 Dois reguladores da transcrição que se ligam ao mesmo promotor gênico podem exercer controle combinatório 520 Uma interação de estimulação intermitente incoerente gera pulsos 521 Uma interação de estimulação intermitente coerente detecta estímulos persistentes 522 A mesma rede pode se comportar de formas diferentes em células diferentes devido aos efeitos estocásticos 523 Várias abordagens computacionais podem ser usadas para modelar as reações nas células 524 Métodos estatísticos são cruciais para a análise de dados biológicos 524 Capítulo 9 Visualização de células 529 VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS AO MICROSCÓPIO ÓPTICO 529 O microscópio óptico pode resolver detalhes com distâncias de 02 m 530 O ruído fotônico cria limites adicionais para resolução quando os níveis de luz são baixos 532 As células vivas são vistas claramente em um microscópio de contraste de fase ou em um microscópio de contraste de interferência diferencial 533 As imagens podem ser intensificadas e analisadas por técnicas digitais 534 Tecidos intactos normalmente são fixados e cortados antes da microscopia 535 As moléculas específicas podem ser localizadas nas células por microscopia de fluorescência 536 Os anticorpos podem ser utilizados para detectar moléculas específicas 539 É possível obter imagens de objetos tridimensionais complexos com o microscópio óptico 540 O microscópio confocal produz secções ópticas excluindo a luz fora de foco 540 Proteínas individuais podem ser marcadas fluorescentemente nas células e nos organismos vivos 542 A dinâmica das proteínas pode ser acompanhada em células vivas 543 Indicadores emissores de luz podem medir alterações rápidas nas concentrações intracelulares de íons 546 Moléculas individuais podem ser visualizadas com a microscopia de fluorescência de reflexão total interna 547 Moléculas individuais podem ser tocadas visualizadas e movidas utilizando a microscopia de força atômica 548 Técnicas de fluorescência de superresolução podem ultrapassar a resolução limitada por difração 549 A superresolução também pode ser obtida usando métodos de localização de moléculas individuais 551 VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS E MOLÉCULAS AO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 554 O microscópio eletrônico resolve os detalhes estruturais da célula 554 Amostras biológicas exigem preparação especial para microscopia eletrônica 555 Macromoléculas específicas podem ser localizadas por microscopia eletrônica de imunolocalização com ouro 556 Imagens diferentes de um único objeto podem ser combinadas para produzir reconstruções tridimensionais 557 Imagens de superfícies podem ser obtidas por microscopia eletrônica de varredura 558 A coloração negativa e a microscopia crioeletrônica permitem que as macromoléculas sejam visualizadas com alta resolução 559 Imagens múltiplas podem ser combinadas para aumentar a resolução 561 Capítulo 10 Estrutura da membrana 565 BICAMADA LIPÍDICA 566 Fosfoglicerídeos esfingolipídeos e esterois são os principais lipídeos das membranas celulares 566 Os fosfolipídeos formam bicamadas espontaneamente 568 A bicamada lipídica é um fluido bidimensional 569 A fluidez de uma bicamada lipídica depende de sua composição 571 Apesar de sua fluidez as bicamadas lipídicas podem formar domínios de composições distintas 572 As gotas lipídicas são circundadas por uma monocamada fosfolipídica 573 A assimetria da bicamada lipídica é funcionalmente importante 573 Os glicolipídeos são encontrados na superfície de todas as membranas plasmáticas eucarióticas 575 PROTEÍNAS DE MEMBRANA 576 As proteínas de membrana podem se associar à bicamada lipídica de várias maneiras 576 As âncoras lipídicas controlam a localização de algumas proteínas de sinalização na membrana 577 A cadeia polipeptídica cruza a bicamada lipídica em uma conformação de ahélice na maioria das proteínas transmembrana 579 As ahélices transmembrana frequentemente interagem umas com as outras 580 Alguns barris b formam grandes canais 580 Muitas proteínas de membrana são glicosiladas 582 As proteínas de membrana podem ser solubilizadas e purificadas em detergentes 583 A bacteriorrodopsina é uma bomba de prótons H dirigida por luz que atravessa a bicamada lipídica como sete ahélices 586 As proteínas de membrana frequentemente atuam como grandes complexos 588 Muitas proteínas de membrana difundemse no plano da membrana 588 As células podem confinar proteínas e lipídeos em domínios específicos em uma membrana 590 O citoesqueleto cortical proporciona força mecânica e restringe a difusão das proteínas de membrana 591 As proteínas de curvatura da membrana deformam as bicamadas 593 Capítulo 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 597 PRINCÍPIOS DO TRANSPORTE DE MEMBRANA 597 As bicamadas lipídicas livres de proteínas são impermeáveis a íons 598 Existem duas classes principais de proteínas de transporte de membrana transportadoras e de canal 598 Sumário xxix O transporte ativo é mediado por proteínas transportadoras acopladas a uma fonte de energia 599 PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS E O TRANSPORTE ATIVO DE MEMBRANA 600 O transporte ativo pode ser dirigido por gradientes de concentração de íons 602 As proteínas transportadoras na membrana plasmática regulam o pH citosólico 604 Uma distribuição assimétrica de proteínas transportadoras nas células epiteliais está por trás do transporte transcelular de solutos 605 Existem três classes de bombas dirigidas por ATP 606 Uma bomba ATPase tipo P bombeia Ca 2 para o interior do retículo sarcoplasmático em células musculares 606 A bomba de Na K da membrana plasmática estabelece gradientes de Na e K através da membrana plasmática 608 Os transportadores ABC constituem a maior família de proteínas de transporte de membrana 609 PROTEÍNAS DE CANAL E AS PROPRIEDADES ELÉTRICAS DAS MEMBRANAS 611 As aquaporinas são permeáveis à água mas impermeáveis a íons 612 Os canais iônicos são íonseletivos e alternam entre os estados aberto e fechado 613 O potencial de membrana em células animais depende principalmente dos canais de escape de K e do gradiente de K através da membrana plasmática 615 O potencial de repouso decai lentamente quando a bomba de Na K é interrompida 615 A estrutura tridimensional de um canal de K bacteriano mostra como um canal iônico pode funcionar 617 Canais mecanossensíveis protegem as células de bactérias contra pressões osmóticas extremas 619 A função de uma célula nervosa depende de sua estrutura alongada 620 Os canais de cátion controlados por voltagem geram potenciais de ação em células eletricamente excitáveis 621 O uso de canalrodopsinas revolucionou o estudo dos circuitos neurais 623 A mielinização aumenta a velocidade e a eficácia da propagação do potencial de ação em células nervosas 625 O registro de patchclamp indica que os canais iônicos individuais abrem de maneira tudo ou nada 626 Os canais de cátion controlados por voltagem são evolutiva e estruturalmente relacionados 627 Diferentes tipos de neurônios apresentam propriedades de disparo características e estáveis 627 Os canais iônicos controlados por transmissor convertem sinais químicos em sinais elétricos nas sinapses químicas 628 As sinapses químicas podem ser excitatórias ou inibitórias 629 Os receptores de acetilcolina na junção neuromuscular são canais de cátion controlados por transmissores excitatórios 630 Os neurônios contêm muitos tipos de canais controlados por transmissores 631 Muitos fármacos psicoativos atuam nas sinapses 632 A transmissão neuromuscular envolve a ativação sequencial de cinco conjuntos diferentes de canais iônicos 632 Neurônios individuais são dispositivos computacionais complexos 633 A computação neuronal requer uma combinação de pelo menos três tipos de canais de K 634 A potencialização de longo prazo LTP no hipocampo de mamíferos depende da entrada de Ca 2 pelos canais receptores NMDA 636 Capítulo 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 641 COMPARTIMENTALIZAÇÃO DAS CÉLULAS 641 Todas as células eucarióticas têm o mesmo conjunto básico de organelas envoltas por membranas 641 A origem evolutiva pode ajudar a explicar a relação topológica das organelas 643 As proteínas podem moverse entre os compartimentos de diferentes maneiras 645 As sequênciassinal e os receptores de endereçamento direcionam proteínas aos destinos celulares corretos 647 A maioria das organelas não pode ser construída de novo elas necessitam de informações presentes na própria organela 648 TRANSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE O NÚCLEO E O CITOSOL 649 Os complexos do poro nuclear perfuram o envelope nuclear 649 Sinais de localização nuclear direcionam as proteínas nucleares ao núcleo 650 Os receptores de importação nuclear ligamse tanto a sinais de localização nuclear quanto a proteínas NPC 652 A exportação nuclear funciona como a importação nuclear mas de modo inverso 652 A GTPase Ran impõe a direcionalidade no transporte através dos NPCs 653 O transporte através de NPCs pode ser regulado pelo controle do acesso à maquinaria de transporte 654 Durante a mitose o envelope nuclear é desmontado 656 TRANSPORTE DE PROTEÍNAS PARA MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS 658 A translocação para dentro da mitocôndria depende de sequências sinal e de translocadores de proteína 659 As proteínas precursoras mitocondriais são importadas como cadeias polipeptídicas desenoveladas 660 A hidrólise de ATP e um potencial de membrana dirigem a importação de proteínas para o espaço da matriz 661 Bactérias e mitocôndrias usam mecanismos similares para inserir porinas em suas membranas externas 662 O transporte para a membrana mitocondrial interna e para o espaço intermembrana ocorre por meio de diversas vias 663 Duas sequênciassinal direcionam proteínas para a membrana tilacoide em cloroplastos 664 PEROXISSOMOS 666 Os peroxissomos utilizam oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio para realizar reações oxidativas 666 Uma sequênciasinal curta direciona a importação de proteínas aos peroxissomos 667 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO 669 O RE é estrutural e funcionalmente diverso 670 As sequênciassinal foram descobertas primeiro em proteínas importadas para o RE rugoso 672 Uma partícula de reconhecimento de sinal SRP direciona a sequência sinal do RE para um receptor específico na membrana do RE rugoso 673 A cadeia polipeptídica atravessa um canal aquoso no translocador 675 A translocação através da membrana do RE nem sempre necessita do alongamento da cadeia polipeptídica em andamento 677 Em proteínas transmembrana de passagem única somente uma sequênciasinal interna do RE permanece na bicamada lipídica como uma ahélice que atravessa a membrana 677 As combinações de sinais de início e de parada da transferência determinam a topologia das proteínas transmembrana de passagem múltipla 679 Proteínas ancoradas pela cauda são integradas na membrana do RE por um mecanismo especial 682 As cadeias polipeptídicas transportadas enovelamse e são montadas no lúmen do RE rugoso 682 A maioria das proteínas sintetizadas no RE rugoso é glicosilada pela adição de um oligossacarídeo comum ligado ao N 683 Os oligossacarídeos são utilizados como rótulos para marcar o estado de enovelamento da proteína 685 As proteínas enoveladas inadequadamente são exportadas do RE e degradadas no citosol 685 As proteínas mal enoveladas no RE ativam uma resposta à proteína desenovelada 686 Algumas proteínas de membrana adquirem uma âncora de glicosilfosfatidilinositol GPI ligada covalentemente 688 A maioria das bicamadas lipídicas é montada no RE 689 Capítulo 13 Tráfego intracelular de vesículas 695 MECANISMOS MOLECULARES DO TRANSPORTE DE MEMBRANA E MANUTENÇÃO DA DIVERSIDADE DE COMPARTIMENTOS 697 Existem vários tipos de vesículas revestidas 697 A montagem do revestimento de clatrina direciona a formação de vesículas 697 xxx Sumário Proteínas adaptadoras selecionam a carga para as vesículas revestidas por clatrina 698 Os fosfoinositídeos marcam organelas e domínios de membrana 700 Proteínas de curvatura da membrana ajudam a deformar a membrana durante a formação da vesícula 701 Proteínas citoplasmáticas regulam a liberação e a remoção do revestimento das vesículas 701 GTPases monoméricas controlam a montagem do revestimento 703 Nem todas as vesículas de transporte são esféricas 704 As proteínas Rab guiam as vesículas de transporte para suas membranasalvo 705 Cascatas de Rab podem alterar a identidade de uma organela 707 SNAREs são mediadoras da fusão de membranas 707 SNAREs atuantes precisam ser afastadas antes que possam funcionar novamente 709 TRANSPORTE DO RE ATRAVÉS DO APARELHO DE GOLGI 710 Proteínas deixam o RE em vesículas de transporte revestidas por COPII 711 Apenas as proteínas que são enoveladas e montadas adequadamente podem deixar o RE 712 Agrupamentos tubulares de vesículas são mediadores do transporte do RE para o aparelho de Golgi 712 A via de recuperação para o RE utiliza sinais de seleção 713 Muitas proteínas são seletivamente retidas nos compartimentos onde atuam 714 O aparelho de Golgi consiste em uma série ordenada de compartimentos 715 Cadeias de oligossacarídeos são processadas no aparelho de Golgi 716 Os proteoglicanos são montados no aparelho de Golgi 718 Qual é o propósito da glicosilação 719 O transporte através do aparelho de Golgi pode ocorrer pela maturação das cisternas 720 Proteínas da matriz do Golgi ajudam a organizar a pilha 721 TRANSPORTE DA REDE TRANS DE GOLGI PARA OS LISOSSOMOS 722 Os lisossomos são os principais sítios de digestão intracelular 722 Os lisossomos são heterogêneos 723 Os vacúolos de vegetais e de fungos são lisossomos surpreendentemente versáteis 724 Múltiplas vias entregam materiais para os lisossomos 725 A autofagia degrada proteínas e organelas indesejadas 726 Um receptor de manose6fosfato seleciona hidrolases lisossômicas na rede trans de Golgi 727 Defeitos na GlcNAcfosfotransferase causam uma doença de depósito lisossômico em humanos 728 Alguns lisossomos e corpos multivesiculares sofrem exocitose 729 TRANSPORTE DA MEMBRANA PLASMÁTICA PARA DENTRO DA CÉLULA ENDOCITOSE 730 As vesículas pinocíticas se formam a partir de fossas revestidas na membrana plasmática 731 Nem todas as vesículas pinocíticas são revestidas por clatrina 731 As células utilizam endocitose mediada por receptores para importar macromoléculas extracelulares selecionadas 732 Proteínas específicas são recuperadas dos endossomos primários e devolvidas para a membrana plasmática 734 Receptores de sinalização na membrana plasmática são regulados negativamente pela degradação nos lisossomos 735 Endossomos primários amadurecem até endossomos tardios 735 Os complexos proteicos ESCRT são mediadores da formação de vesículas intraluminais nos corpos multivesiculares 736 Endossomos de reciclagem regulam a composição da membrana plasmática 737 Células fagocíticas especializadas podem ingerir grandes partículas 738 TRANSPORTE DA REDE TRANS DE GOLGI PARA O EXTERIOR DA CÉLULA EXOCITOSE 741 Muitas proteínas e lipídeos são automaticamente carregados da rede trans de Golgi TGN para a superfície celular 741 Vesículas secretoras brotam da rede trans de Golgi 742 Precursores de proteínas secretoras são proteoliticamente processados durante a formação das vesículas secretoras 743 As vesículas secretoras esperam próximo à membrana plasmática até que sejam sinalizadas para liberar os seus conteúdos 744 Para a exocitose rápida as vesículas sinápticas são aprontadas na membrana plasmática présináptica 744 Vesículas sinápticas podem se formar diretamente a partir de vesículas endocíticas 746 Os componentes de membrana das vesículas secretoras são rapidamente removidos da membrana plasmática 746 Alguns eventos de exocitose regulada servem para aumentar a membrana plasmática 748 Células polarizadas direcionam proteínas da rede trans de Golgi para o domínio apropriado da membrana plasmática 748 Capítulo 14 Conversão de energia mitocôndrias e cloroplastos 753 MITOCÔNDRIA 755 A mitocôndria tem uma membrana externa e uma membrana interna 757 As cristas da membrana interna contêm a maquinaria para o transporte de elétrons e a síntese de ATP 758 O ciclo do ácido cítrico na matriz produz NADH 758 As mitocôndrias têm muitos papéis essenciais no metabolismo celular 759 Um processo quimiosmótico acopla energia de oxidação à produção de ATP 761 A energia derivada da oxidação é armazenada como um gradiente eletroquímico 762 BOMBAS DE PRÓTONS DA CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS 763 O potencial redox é uma medida das afinidades eletrônicas 763 As transferências de elétrons liberam grandes quantidades de energia 764 Íons metálicos de transição e quinonas aceitam e liberam elétrons prontamente 764 O NADH transfere seus elétrons para o oxigênio molecular por meio de grandes complexos enzimáticos embebidos na membrana interna 766 O complexo da NADHdesidrogenase contém módulos separados para transporte de elétrons e bombeamento de prótons 768 A citocromo c redutase captura prótons e os libera no lado oposto da membrana das cristas desse modo bombeando prótons 768 O complexo da citocromo c oxidase bombeia prótons e reduz O2 usando um centro ferrocobre catalítico 770 A cadeia respiratória forma um supercomplexo na membrana da crista 771 Prótons podem moverse rapidamente ao longo de caminhos predefinidos 772 PRODUÇÃO DE ATP NAS MITOCÔNDRIAS 773 O alto valor negativo de DG para a hidrólise do ATP torna o ATP útil para a célula 774 A ATPsintase é uma nanomáquina que produz ATP por catálise rotatória 775 Turbinas impulsionadas por prótons são de origem muito antiga 776 As cristas mitocondriais ajudam a tornar a síntese de ATP eficiente 778 Proteínas transportadoras especiais trocam ATP e ADP através da membrana interna 778 Mecanismos quimiosmóticos surgiram primeiro nas bactérias 779 CLOROPLASTOS E FOTOSSÍNTESE 782 Os cloroplastos assemelhamse às mitocôndrias mas possuem um compartimento tilacoide separado 782 Os cloroplastos capturam energia da luz solar e a utilizam para fixar carbono 782 A fixação de carbono usa ATP e NADPH para converter CO2 em açúcares 784 Açúcares gerados pela fixação de carbono podem ser armazenados como amido ou consumidos para produzir ATP 785 As membranas tilacoides dos cloroplastos contêm os complexos proteicos necessários para a fotossíntese e a geração de ATP 785 Complexos clorofilaproteína podem transferir energia excitatória ou elétrons 786 Um fotossistema consiste em um complexo antena e um centro de reação 788 A membrana tilacoide contém dois fotossistemas diferentes trabalhando em série 788 O fotossistema II usa um grupo do manganês para retirar os elétrons da água 789 O complexo citocromo b6f conecta o fotossistema II ao fotossistema I 790 O fotossistema I executa a segunda etapa de separação de carga no esquema Z 791 Sumário xxxi A ATPsintase de cloroplasto utiliza o gradiente de prótons gerado pelas reações fotossintetizantes luminosas para produzir ATP 792 Todos os centros de reação fotossintéticos evoluíram a partir de um ancestral comum 793 A força prótonmotriz para a produção de ATP nas mitocôndrias e nos cloroplastos é essencialmente a mesma 793 Os mecanismos quimiosmóticos evoluíram em estágios 794 Ao proporcionar uma fonte inesgotável de força redutora as bactérias fotossintetizantes superaram um grande obstáculo na evolução 795 As cadeias transportadoras de elétrons fotossintetizantes das cianobactérias produziram o oxigênio atmosférico e permitiram novas formas de vida 796 SISTEMAS GENÉTICOS DE MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS 798 Os sistemas genéticos de mitocôndrias e cloroplastos assemelhamse àqueles dos procariotos 800 Com o tempo as mitocôndrias e os cloroplastos exportaram a maioria dos seus genes para o núcleo por transferência gênica 800 A fissão e a fusão de mitocôndrias são processos topologicamente complexos 801 As mitocôndrias animais possuem o mais simples sistema genético conhecido 803 As mitocôndrias fazem uso flexível dos códons e podem ter um código genético variante 804 Cloroplastos e bactérias compartilham muitas semelhanças impressionantes 805 Os genes das organelas são herdados por herança materna em animais e plantas 807 Mutações no DNA mitocondrial podem causar doenças hereditárias graves 807 O acúmulo de mutações no DNA mitocondrial é um contribuinte para o envelhecimento 808 Por que as mitocôndrias e os cloroplastos mantêm um sistema separado dispendioso para a transcrição e tradução do DNA 808 Capítulo 15 Sinalização celular 813 PRINCÍPIOS DA SINALIZAÇÃO CELULAR 813 Os sinais extracelulares podem atuar em distâncias curtas ou longas 814 As moléculas de sinalização extracelular se ligam a receptores específicos 815 Cada célula está programada para responder a combinações específicas de sinais extracelulares 816 Existem três classes principais de proteínas receptoras de superfície celular 818 Os receptores de superfície celular transmitem os sinais através de moléculas sinalizadoras intracelulares 819 Os sinais intracelulares devem ser precisos e específicos em um citoplasma repleto de moléculas sinalizadoras 820 Os complexos de sinalização intracelular formamse em receptores ativados 822 As interações entre as proteínas de sinalização intracelular são mediadas por domínios de interação modulares 822 A relação entre o sinal e a resposta varia nas diferentes vias de sinalização 824 A velocidade de uma resposta depende da reposição das moléculas sinalizadoras 825 As células podem responder de forma abrupta a um sinal que aumenta gradualmente 827 A retroalimentação positiva pode gerar uma resposta tudo ou nada 828 A retroalimentação negativa é um motivo comum nos sistemas de sinalização 829 As células podem ajustar sua sensibilidade ao sinal 830 SINALIZAÇÃO POR MEIO DE RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA G 832 As proteínas G triméricas transmitem os sinais a partir dos receptores associados à proteína G 832 Algumas proteínas G regulam a produção de AMP cíclico 833 A proteínacinase dependente de AMP cíclico PKA medeia a maioria dos efeitos do AMP cíclico 834 Algumas proteínas G transmitem sinais através de fosfolipídeos 836 O Ca 21 funciona como um mediador intracelular ubíquo 838 A retroalimentação gera ondas e oscilações de Ca 21 838 As proteínascinase dependentes de Ca 21calmodulina fazem a mediação de muitas respostas aos sinais de Ca 21 840 Algumas proteínas G regulam canais iônicos diretamente 843 O olfato e a visão dependem de receptores associados à proteína G que regulam canais iônicos 843 O óxido nítrico é um mediador de sinalização gasoso que passa entre as células 846 Os segundos mensageiros e as cascatas enzimáticas amplificam os sinais 848 A dessensibilização dos receptores associados à proteína G depende da fosforilação do receptor 848 SINALIZAÇÃO POR MEIO DE RECEPTORES ACOPLADOS A ENZIMAS 850 Os receptores tirosinascinase ativados se autofosforilam 850 As tirosinas fosforiladas nos RTKs servem como sítios de ancoragem para proteínas de sinalização intracelular 852 As proteínas com domínios SH2 se ligam às tirosinas fosforiladas 852 A GTPase Ras medeia a sinalização da maior parte dos RTKs 854 Ras ativa um módulo de sinalização de MAPcinase 855 Proteínas de suporte ajudam a prevenir erros de sinalização entre módulos paralelos de MAPcinases 857 GTPases da família Rho acoplam funcionalmente os receptores de superfície celular ao citoesqueleto 858 A PI 3cinase produz sítios lipídicos de ancoragem na membrana plasmática 859 A via de sinalização PI 3cinaseAkt estimula a sobrevivência e o crescimento das células animais 860 Os RTKs e os GPCRs ativam vias de sinalização que se sobrepõem 861 Alguns receptores acoplados a enzimas interagem com tirosinascinase citoplasmáticas 862 Receptores de citocinas ativam a via de sinalização JAKSTAT 863 As proteínas tirosinasfosfatase revertem as fosforilações das tirosinas 864 As proteínas sinalizadoras da superfamília TGFb atuam por meio de receptores serinatreoninacinase e Smads 865 VIAS ALTERNATIVAS DE SINALIZAÇÃO NA REGULAÇÃO GÊNICA 867 O receptor Notch é uma proteína reguladora latente da transcrição 867 As proteínas Wnt interagem com os receptores Frizzled e inibem a degradação de bcatenina 868 As proteínas Hedgehog se ligam a Patched liberando a inibição mediada por Smoothened 871 Múltiplos estímulos estressantes e inflamatórios atuam por meio de uma via de sinalização dependente de NFkB 873 Os receptores nucleares são reguladores de transcrição modulados por ligantes 874 Os relógios circadianos contêm ciclos de retroalimentação negativa que controlam a expressão gênica 876 Três proteínas em um tubo de ensaio podem reconstituir um relógio circadiano de cianobactérias 878 SINALIZAÇÃO EM PLANTAS 880 A multicelularidade e a comunicação celular evoluíram de modo independente em plantas e animais 880 A classe dos receptores serinatreoninacinase é a maior entre os receptores de superfície celular nas plantas 881 O etileno bloqueia a degradação de proteínas específicas reguladoras de transcrição no núcleo 881 A distribuição controlada dos transportadores de auxina afeta o crescimento das plantas 882 Os fitocromos detectam a luz vermelha e os criptocromos detectam a luz azul 883 Capítulo 16 Citoesqueleto 889 FUNÇÃO E ORIGEM DO CITOESQUELETO 889 Filamentos do citoesqueleto adaptamse para formar estruturas estáveis ou dinâmicas 890 O citoesqueleto determina a organização e a polaridade celular 892 Filamentos são polimerizados a partir de subunidades proteicas que lhes conferem propriedades físicas e dinâmicas específicas 893 Proteínas acessórias e motoras regulam os filamentos do citoesqueleto 894 A organização e a divisão da célula bacteriana dependem de proteínas homólogas às proteínas do citoesqueleto eucarióticas 896 xxxii Sumário ACTINA E PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO À ACTINA 898 Subunidades de actina se associam em um arranjo tipo cabeçacauda para criar filamentos polares flexíveis 898 A nucleação é a etapa limitante na formação dos filamentos de actina 899 Os filamentos de actina possuem duas extremidades distintas com diferentes taxas de crescimento 900 A hidrólise de ATP nos filamentos de actina induz o comportamento de rolamento em estado estacionário 901 As funções dos filamentos de actina são inibidas por químicos tanto estabilizadores quanto desestabilizadores do polímero 904 Proteínas de ligação à actina influenciam a dinâmica e a organização dos filamentos 905 A disponibilidade de monômeros controla a polimerização dos filamentos de actina 905 Fatores de nucleação de actina aceleram a polimerização e geram filamentos lineares ou ramificados 905 Proteínas de ligação ao filamento de actina alteram a dinâmica do filamento 909 Proteínas de clivagem regulam a despolimerização do filamento de actina 910 Arranjos de filamentos de actina de alta complexidade influenciam as propriedades mecânicas celulares e a sinalização 911 As bactérias podem sequestrar o citoesqueleto de actina do hospedeiro 914 MIOSINA E ACTINA 915 Proteínas motoras baseadas em actina são membros da superfamília da miosina 915 A miosina gera força pelo acoplamento da hidrólise de ATP a alterações conformacionais 916 O deslizamento da miosina II ao longo dos filamentos de actina provoca a contração muscular 918 A contração muscular é iniciada por uma súbita elevação da concentração citosólica de Ca 21 920 O músculo cardíaco é uma delicada peça de engenharia 923 A actina e a miosina desempenham uma série de funções em células não musculares 923 MICROTÚBULOS 925 Os microtúbulos são tubos ocos compostos a partir de protofilamentos 926 Microtúbulos sofrem instabilidade dinâmica 927 As funções dos microtúbulos são inibidas por fármacos estabilizadores e desestabilizadores dos polímeros 928 Um complexo proteico contendo gtubulina promove a nucleação dos microtúbulos 928 Os microtúbulos irradiam a partir do centrossomo nas células animais 930 Proteínas de ligação aos microtúbulos modulam a dinâmica e a organização dos filamentos 932 Proteínas de ligação à extremidade mais 1 do microtúbulo modulam as conexões e a dinâmica dos microtúbulos 934 Proteínas de sequestro da tubulina e proteínas de quebra ou fissão dos microtúbulos desestabilizam os microtúbulos 936 Dois tipos de proteínas motoras movemse sobre os microtúbulos 936 Microtúbulos e motores movem organelas e vesículas 939 A polimerização dos arranjos complexos de microtúbulos requer microtúbulos dinâmicos e proteínas motoras 941 Cílios e flagelos motrizes são compostos por microtúbulos e dineínas 941 Os cílios primários desempenham funções importantes de sinalização nas células animais 943 FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS E SEPTINAS 944 A estrutura dos filamentos intermediários depende do empacotamento lateral e do enrolamento da superhélice 945 Filamentos intermediários conferem estabilidade mecânica às células animais 946 Proteínas de ligação conectam os filamentos do citoesqueleto e o envelope nuclear 948 Septinas formam filamentos que regulam a polaridade celular 949 POLARIZAÇÃO E MIGRAÇÃO CELULAR 950 Diversas células podem deslizar sobre um substrato sólido 951 A polimerização da actina promove a protrusão da membrana plasmática 952 Os lamelipódios contêm toda a maquinaria necessária à locomoção celular 953 A contração da miosina e a adesão celular permitem que as células se impulsionem para frente 954 A polarização celular é controlada por membros da família das proteínas Rho 955 Sinais extracelulares podem ativar os três membros da família da proteína Rho 958 Sinais externos podem definir a direção da migração celular 958 A comunicação entre os elementos do citoesqueleto coordena a polarização geral e a locomoção da célula 959 Capítulo 17 Ciclo celular 963 VISÃO GERAL DO CICLO CELULAR 963 O ciclo celular eucariótico geralmente é composto por quatro fases 964 O controle do ciclo celular é similar em todos os eucariotos 965 A progressão do ciclo celular pode ser estudada de várias maneiras 966 SISTEMA DE CONTROLE DO CICLO CELULAR 967 O sistema de controle do ciclo celular desencadeia os principais eventos do ciclo celular 967 O sistema de controle do ciclo celular depende de proteínascinase dependentes de ciclinas Cdks ciclicamente ativadas 968 Atividade de Cdk pode ser suprimida pela fosforilação inibitória e por proteínas inibidoras Cdk CKIs 970 Proteólise regulada desencadeia a transição metáfaseanáfase 970 O controle do ciclo celular também depende de regulação transcricional 971 O sistema de controle do ciclo celular funciona como uma rede de interruptores bioquímicos 972 FASE S 974 A SCdk inicia a replicação do DNA uma vez por ciclo 974 A duplicação cromossômica requer a duplicação da estrutura da cromatina 975 As coesinas mantêm as cromátidesirmãs unidas 977 MITOSE 978 A MCdk promove o início da mitose 978 A desfosforilação ativa a MCdk no início da mitose 978 A condensina ajuda a configurar os cromossomos duplicados para a separação 979 O fuso mitótico é uma máquina com base em microtúbulos 982 As proteínas motoras dependentes de microtúbulos controlam a formação e a função do fuso 983 Múltiplos mecanismos colaboram para a formação do fuso mitótico bipolar 984 A duplicação do centrossomo ocorre no início do ciclo celular 984 A MCdk inicia a formação do fuso na prófase 985 A conclusão da formação do fuso em células animais requer a fragmentação do envelope nuclear 985 A instabilidade dos microtúbulos aumenta muito na mitose 986 Os cromossomos mitóticos promovem a formação do fuso bipolar 986 Os cinetocoros ligam as cromátidesirmãs ao fuso 987 A biorientação é obtida por tentativa e erro 988 Múltiplas forças atuam em cromosomos no fuso 990 O APCC provoca a separação da cromátideirmã e a conclusão da mitose 992 Cromossomos não ligados bloqueiam a separação das cromátidesirmãs ponto de verificação da formação do fuso 993 Os cromossomos são segregados na anáfase A e B 994 Os cromossomos segregados são empacotados em núcleosfilhos na telófase 995 CITOCINESE 996 A actina e a miosina II do anel contrátil geram força para a citocinese 996 A ativação local da RhoA desencadeia a formação e a contração do anel contrátil 997 Os microtúbulos do fuso mitótico determinam o plano de divisão da célula animal 997 O fragmoplasto orienta a citocinese nas plantas superiores 1000 Organelas delimitadas por membrana devem ser distribuídas entre as célulasfilhas durante a citocinese 1001 Algumas células reposicionam seu fuso para se dividirem de forma assimétrica 1001 A mitose pode ocorrer sem citocinese 1002 A fase G1 é um estado estável de inatividade das Cdks 1002 MEIOSE 1004 Sumário xxxiii A meiose inclui dois ciclos de segregação cromossômica 1004 Par de homólogos duplicados durante a prófase meiótica 1006 O pareamento dos homólogos culmina na formação de um complexo sinaptonêmico 1006 A segregação homóloga depende de muitas características únicas da meiose I 1008 A recombinação por entrecruzamento é altamente regulada 1009 A meiose frequentemente funciona mal 1010 CONTROLE DA DIVISÃO E DO CRESCIMENTO CELULAR 1010 Os mitógenos estimulam a divisão celular 1011 As células podem entrar em um estado especializado de não divisão 1012 Os mitógenos estimulam as atividades de G1Cdk e G1SCdk 1012 Danos no DNA impedem a divisão celular a resposta a danos no DNA 1014 Muitas células humanas têm um limite intrínseco do número de vezes que podem se dividir 1016 Sinais de proliferação anormal ocasionam a interrupção do ciclo celular ou a apoptose exceto em células cancerosas 1016 A proliferação celular é acompanhada por crescimento celular 1016 Células em proliferação geralmente coordenam o crescimento com a divisão 1018 Capítulo 18 Morte celular 1021 Apoptose elimina células indesejadas 1021 A apoptose depende de uma cascata proteolítica intracelular mediada por caspases 1022 Receptores de morte na superfície celular ativam a via extrínseca da apoptose 1024 A via intrínseca da apoptose depende da mitocôndria 1025 Proteínas Bcl2 regulam a via intrínseca da apoptose 1025 IAPs ajudam no controle das caspases 1028 Fatores de sobrevivência extracelulares inibem a apoptose de vários modos 1029 Fagócitos removem células apoptóticas 1030 Apoptose excessiva ou insuficiente pode contribuir para doenças 1031 Capítulo 19 Junções celulares e matriz extracelular 1035 JUNÇÕES CÉLULACÉLULA 1038 As caderinas formam uma família distinta de moléculas de adesão 1038 As caderinas medeiam a adesão homofílica 1038 A adesão célulacélula dependente de caderina coordena a organização dos tecidos em desenvolvimento 1040 As transições epitéliomesenquimais dependem do controle das caderinas 1042 As cateninas ligam as caderinas clássicas ao citoesqueleto de actina 1042 As junções aderentes respondem às forças geradas pelo citoesqueleto de actina 1042 A remodelagem dos tecidos depende da coordenação da contração mediada pela actina com a adesão célulacélula 1043 Os desmossomos fornecem força mecânica ao epitélio 1045 As junções compactas formam uma barreira entre as células e um obstáculo entre os domínios de membrana plasmática 1046 As junções compactas contêm feixes de proteínas de adesão transmembrana 1047 As proteínas de suporte organizam os complexos de proteínas juncionais 1049 As junções do tipo fenda ligam as células de forma elétrica e metabólica 1050 Um conéxon da junção do tipo fenda é constituído por seis subunidades de conexinas transmembrana 1051 Nas plantas os plasmodesmos realizam muitas das funções das junções do tipo fenda 1053 As selectinas medeiam as adesões transitórias célulacélula na corrente sanguínea 1054 Membros da superfamília de imunoglobulinas fazem a mediação da adesão célulacélula independente de Ca 21 1055 A MATRIZ EXTRACELULAR DOS ANIMAIS 1057 A matriz extracelular é produzida e orientada pelas células 1057 As cadeias de glicosaminoglicanos GAGs ocupam grande parte do espaço e formam géis hidratados 1058 A hialuronana atua como um preenchedor de espaços durante a morfogênese e o reparo 1059 Os proteoglicanos são compostos de cadeias de GAGs covalentemente ligadas a um núcleo proteico 1059 Os colágenos são as principais proteínas da matriz extracelular 1061 Os colágenos secretados associados a fibrilas ajudam a organizálas 1063 As células auxiliam na organização das fibrilas de colágeno que secretam exercendo tensão na matriz 1064 A elastina confere elasticidade aos tecidos 1065 A fibronectina e outras glicoproteínas multidomínios auxiliam na organização da matriz 1066 A fibronectina se liga a integrinas 1067 A tensão exercida pelas células regula a reunião das fibrilas de fibronectina 1068 A lâmina basal é uma forma de matriz extracelular especializada 1068 A laminina e o colágeno tipo IV são os principais componentes da lâmina basal 1069 As lâminas basais realizam diversas funções 1071 As células devem ser capazes de degradar e produzir matriz 1072 As glicoproteínas e os proteoglicanos da matriz regulam as atividades das proteínas secretadas 1073 JUNÇÕES CÉLULAMATRIZ 1074 As integrinas são heterodímeros transmembrana que ligam a matriz extracelular ao citoesqueleto 1075 Defeitos na integrina são responsáveis por muitas doenças genéticas 1076 As integrinas podem mudar de uma conformação ativa para uma conformação inativa 1077 As integrinas se agregam para formar adesões fortes 1079 A ligação à matriz extracelular através das integrinas controla a proliferação e a sobrevivência celular 1079 As integrinas recrutam proteínas sinalizadoras intracelulares para os locais de adesão célulamatriz 1079 As adesões célulamatriz respondem a forças mecânicas 1080 A PAREDE CELULAR DAS PLANTAS 1081 A composição da parede celular depende do tipo celular 1082 A força tensora da parede celular permite que as células vegetais desenvolvam pressão de turgescência 1083 A parede celular primária é constituída por microfibrilas de celulose entrelaçadas com uma rede de polissacarídeos pectínicos 1083 A deposição orientada da parece celular controla o crescimento da planta 1085 Os microtúbulos orientam a deposição da parede celular 1086 Capítulo 20 Câncer 1091 O CÂNCER COMO UM PROCESSO MICROEVOLUTIVO 1091 As células cancerosas ignoram os controles normais de proliferação e colonizam outros tecidos 1092 Muitos cânceres originamse de uma única célula anormal 1093 As células cancerosas possuem mutações somáticas 1094 Uma única mutação não é suficiente para transformar uma célula normal em uma célula cancerosa 1094 Os cânceres se desenvolvem gradualmente pelo aumento de células aberrantes 1095 A progressão dos tumores envolve sucessivos ciclos de mutação hereditária aleatória e de seleção natural 1096 As células cancerosas humanas são geneticamente instáveis 1097 As células cancerosas apresentam um controle de crescimento alterado 1098 As células cancerosas possuem o metabolismo de açúcar alterado 1098 As células cancerosas possuem uma capacidade anormal de sobreviver ao estresse e ao dano ao DNA 1099 As células cancerosas humanas escapam do limite interno de proliferação celular 1100 O microambiente tumoral influencia o desenvolvimento do câncer 1101 As células cancerosas devem sobreviver e proliferar em um ambiente inóspito 1101 Diversas propriedades contribuem para o crescimento canceroso 1103 GENES CRÍTICOS PARA O CÂNCER COMO SÃO ENCONTRADOS E O QUE FAZEM 1104 A identificação de mutações cancerosas para ganho e perda de função precisou de métodos diferentes 1104 xxxiv Sumário Os retrovírus podem agir como vetores de oncogenes que alteram o comportamento celular 1105 Diferentes buscas por oncogenes convergem para o mesmo gene Ras 1106 Os genes mutados no câncer podem se tornar hiperativos de várias maneiras 1106 Estudos de síndromes cancerosas hereditárias raras identificaram genes supressores de tumores 1107 Os genes supressores de tumores podem ser inativados por mecanismos genéticos e epigenéticos 1108 O sequenciamento sistemático do genoma de células cancerosas transformou nosso entendimento sobre a doença 1109 Muitos cânceres possuem um genoma extraordinariamente interrompido 1111 Muitas mutações em células tumorais são meras passageiras 1111 Em torno de 1 dos genes no genoma humano são críticos para o câncer 1112 Interrupções em algumas vias importantes são comuns em vários cânceres 1113 Mutações na via PI3KAktmTOR estimulam o crescimento das células cancerosas 1114 Mutações na via p53 permitem que as células cancerosas sobrevivam e proliferem apesar do estresse e do dano ao DNA 1115 A instabilidade genômica possui diferentes formas em diferentes cânceres 1116 Cânceres de tecidos especializados utilizam diferentes rotas para atingir as vias centrais comuns do câncer 1117 Estudos utilizando camundongos ajudam a definir as funções dos genes críticos para o câncer 1117 Os cânceres se tornam cada vez mais heterogêneos à medida que progridem 1118 As alterações nas células tumorais que levam à metástase ainda são um grande mistério 1119 Uma pequena população de célulastronco tumorais pode manter diversos tumores 1120 O fenômeno das célulastronco tumorais aumenta a dificuldade de cura do câncer 1121 Os cânceres colorretais se desenvolvem lentamente mediante uma sucessão de alterações visíveis 1122 Algumas lesões genéticas chave são comuns a uma ampla parcela de cânceres colorretais 1123 Alguns cânceres colorretais possuem defeitos na maquinaria de reparo de pareamento incorreto de DNA 1124 As etapas da progressão tumoral frequentemente podem ser correlacionadas a mutações específicas 1125 TRATAMENTO E PREVENÇÃO DO CÂNCER PRESENTE E FUTURO 1127 A epidemiologia revela que muitos casos de câncer podem ser prevenidos 1127 Ensaios sensíveis podem detectar agentes causadores de câncer que danificam o DNA 1127 Cinquenta por cento dos cânceres podem ser evitados por mudanças no estilo de vida 1128 Vírus e outras infecções contribuem para uma proporção significativa de cânceres humanos 1129 Cânceres de colo do útero podem ser evitados por vacinação contra o papilomavírus humano 1131 Agentes infecciosos podem gerar câncer de diversas maneiras 1131 A busca para a cura do câncer é difícil mas não impossível 1132 As terapias tradicionais exploram a instabilidade genética e a perda da resposta dos pontos de verificação do ciclo celular em células cancerosas 1132 Novos fármacos podem matar células cancerosas seletivamente atingindo mutações específicas 1133 Inibidores de PARP matam células cancerosas que possuem defeitos nos genes Brca1 ou Brca2 1133 Pequenas moléculas podem ser desenvolvidas para inibir proteínas oncogênicas específicas 1135 Muitos cânceres podem ser tratados pelo aumento da resposta imune contra um tumor específico 1137 Os cânceres desenvolvem resistência às terapias 1139 Terapias combinadas podem ter sucesso onde tratamentos com um fármaco de cada vez falham 1139 Agora temos as ferramentas para gerar terapias combinadas adaptadas a cada paciente 1140 Capítulo 21 Desenvolvimento de organismos multicelulares 1145 VISÃO GERAL DO DESENVOLVIMENTO 1146 Mecanismos conservados estabelecem o plano corporal básico 1147 O potencial de desenvolvimento das células se torna progressivamente restrito 1148 A memória celular é responsável pelo processo de tomada de decisões da célula 1148 Diversos organismosmodelo foram essenciais para a compreensão do desenvolvimento 1148 Genes envolvidos na comunicação entre as células e no controle da transcrição são especialmente importantes para o desenvolvimento animal 1149 O DNA regulador parece ser o principal responsável pelas diferenças entre as espécies animais 1149 Um pequeno número de vias de sinalização célulacélula conservadas coordena a formação de padrões espaciais 1150 Sinais simples dão origem a padrões complexos por meio do controle combinatório e da memória celular 1150 Morfógenos são sinais indutivos de longo alcance que exercem efeitos gradativos 1151 A inibição lateral pode originar padrões de diferentes tipos celulares 1151 A ativação de curto alcance e a inibição de longo alcance podem originar padrões celulares complexos 1152 A divisão celular assimétrica também pode gerar diversidade 1153 Enquanto o embrião cresce os padrões iniciais são estabelecidos em pequenos grupos de células e refinados por indução sequencial 1153 A biologia do desenvolvimento fornece evidências sobre doenças e manutenção de tecidos 1154 MECANISMOS DE FORMAÇÃO DE PADRÕES 1155 Diferentes animais utilizam diferentes mecanismos para estabelecer seu eixo primário de polarização 1155 Estudos em Drosophila revelaram os mecanismos de controle genético responsáveis pelo desenvolvimento 1157 Genes de polaridade do ovo codificam macromoléculas depositadas no ovo para organizar os eixos do embrião primordial de Drosophila 1158 Três grupos de genes controlam a segmentação de Drosophila ao longo do eixo AP 1159 A hierarquia das interações reguladoras genéticas promove a subdivisão do embrião de Drosophila 1159 Genes de polaridade do ovo gap e regra dos pares geram padrões transitórios que são fixados pelos genes de polaridade de segmentos e genes Hox 1160 Genes Hox estabelecem padrões permanentes no eixo AP 1162 Proteínas Hox conferem individualidade a cada segmento 1163 Os genes Hox são expressos de acordo com a sua ordem no complexo Hox 1163 Proteínas do grupo Trithorax e Polycomb permitem que os complexos Hox mantenham um registro permanente da informação posicional 1164 Os genes de sinalização DV estabelecem o gradiente do regulador da transcrição Dorsal 1164 Uma hierarquia de interações indutoras promove a subdivisão do embrião dos vertebrados 1166 Uma competição entre proteínas de sinalização secretadas induz a formação de padrões nos embriões de vertebrados 1168 O eixo dorsoventral dos insetos corresponde ao eixo ventraldorsal dos vertebrados 1169 Os genes Hox controlam o eixo AP nos vertebrados 1169 Alguns reguladores da transcrição podem ativar vias que definem um tipo celular ou dão origem a um órgão inteiro 1170 A inibição lateral mediada por Notch refina os padrões de espaçamento celular 1171 Divisões celulares assimétricas diferenciam célulasirmãs 1173 Diferenças no DNA regulador explicam diferenças morfológicas 1174 CONTROLE TEMPORAL DO DESENVOLVIMENTO 1176 Sumário xxxv O tempo de vida molecular desempenha um papel crítico no controle temporal do desenvolvimento 1176 Um oscilador baseado em expressão gênica atua como um temporizador para controlar a segmentação em vertebrados 1177 Programas intracelulares de desenvolvimento ajudam a determinar o curso ao longo do tempo do desenvolvimento celular 1179 As células raramente contam as divisões celulares para marcar o tempo do seu desenvolvimento 1180 MicroRNAs frequentemente regulam as transições do desenvolvimento 1180 Sinais hormonais coordenam o controle temporal das transições de desenvolvimento 1182 Sinais ambientais determinam o momento de florescimento 1183 MORFOGÊNESE 1184 A migração celular é controlada por sinais presentes no ambiente da célula 1185 A distribuição das células migrantes depende de fatores de sobrevivência 1186 A alteração do padrão de moléculas de adesão celular força a formação de novos arranjos de células 1187 Interações de repulsão ajudam a delimitar os tecidos 1188 Conjuntos de células semelhantes podem realizar rearranjos coletivos notáveis 1188 A polaridade celular planar ajuda a orientar a estrutura e o movimento celular no epitélio em desenvolvimento 1189 Interações entre um epitélio e um mesênquima geram estruturas tubulares ramificadas 1190 Um epitélio pode se curvar durante o desenvolvimento para dar origem a um tubo ou vesícula 1192 CRESCIMENTO 1193 A proliferação a morte e o tamanho das células determinam o tamanho dos órgãos 1194 Animais e órgãos são capazes de acessar e regular a massa celular total 1194 Sinais extracelulares estimulam ou inibem o crescimento 1196 DESENVOLVIMENTO NEURAL 1198 Os neurônios assumem diferentes características de acordo com o momento e o local da sua origem 1199 O cone de crescimento direciona o axônio ao longo de rotas específicas em direção aos seus alvos 1201 Uma variedade de sinais extracelulares guiam os axônios até seus alvos 1202 A formação de mapas neurais ordenados depende da especificidade neuronal 1204 Dendritos e axônios originados de um mesmo neurônio se evitam 1206 Os tecidosalvo liberam fatores neurotróficos que controlam o crescimento e a sobrevivência das células nervosas 1208 A formação de sinapses depende da comunicação bidirecional entre os neurônios e suas célulasalvo 1209 A poda sináptica depende da atividade elétrica e da sinalização sináptica 1211 Neurônios que disparam juntos permanecem conectados 1211 Capítulo 22 Célulastronco e renovação de tecidos 1217 CÉLULASTRONCO E RENOVAÇÃO DE TECIDOS EPITELIAIS 1217 O revestimento do intestino delgado é renovado continuamente por meio da proliferação celular nas criptas 1218 As célulastronco do intestino delgado encontramse na base ou próximas à base de cada cripta 1219 As duas célulasfilhas de uma célulatronco enfrentam uma escolha 1219 A sinalização Wnt mantém o compartimento de célulastronco do intestino 1220 As célulastronco na base da cripta são multipotentes originando a gama completa de tipos celulares intestinais diferenciados 1220 As duas célulasfilhas de uma célulatronco não têm sempre que se tornar diferentes 1222 As células de Paneth criam o nicho de célulatronco 1222 Uma única célula que expressa Lgr5 em cultura pode produzir todo um sistema criptavilosidade organizado 1223 A sinalização efrinaEph dirige a segregação dos diferentes tipos celulares do intestino 1224 A sinalização Notch controla a diversificação celular do intestino e ajuda a manter o estado de célulatronco 1224 O sistema de célulatronco epidérmico mantém uma barreira à prova dágua autorrenovável 1225 A renovação de tecidos que não depende de célulastronco células que secretam insulina no pâncreas e hepatócitos no fígado 1226 Alguns tecidos carecem de célulastronco e não são renováveis 1227 FIBROBLASTOS E SUAS TRANSFORMAÇÕES A FAMÍLIA DE CÉLULAS DO TECIDO CONECTIVO 1228 Os fibroblastos mudam suas características em resposta aos sinais químicos e físicos 1228 Os osteoblastos produzem matriz óssea 1229 O osso é remodelado continuamente pelas células em seu interior 1230 Os osteoclastos são controlados por sinais de osteoblastos 1232 ORIGEM E REGENERAÇÃO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO 1232 Os mioblastos fundemse para formar novas fibras musculares esqueléticas 1233 Alguns mioblastos continuam como célulastronco quiescentes inativas no adulto 1234 VASOS SANGUÍNEOS LINFÁTICOS E CÉLULAS ENDOTELIAIS 1235 As células endoteliais revestem todos os vasos sanguíneos e linfáticos 1235 As células endoteliais das extremidades abrem caminho para a angiogênese 1236 Tecidos que necessitam de um suprimento sanguíneo liberam VEGF 1237 Sinais das células endoteliais controlam o recrutamento de pericitos e células musculares lisas para formar a parede do vaso 1238 UM SISTEMA DE CÉLULASTRONCO HIERÁRQUICO FORMAÇÃO DE CÉLULAS DO SANGUE 1239 Os eritrócitos são todos iguais os leucócitos podem ser agrupados em três classes principais 1239 A produção de cada tipo de célula sanguínea na medula óssea é controlada individualmente 1240 A medula óssea contém célulastronco hematopoiéticas multipotentes capazes de originar todas as categorias de células sanguíneas 1241 O comprometimento é um processo de etapas sucessivas 1243 As divisões das células progenitoras comprometidas amplifica o número de células sanguíneas especializadas 1243 As célulastronco dependem dos sinais de contato de células do estroma 1244 Os fatores que regulam a hematopoiese podem ser analisados em cultivo 1244 A eritropoiese depende do hormônio eritropoietina 1244 Múltiplos CSFs influenciam a produção de neutrófilos e macrófagos 1245 O comportamento de uma célula hematopoiética depende em parte do acaso 1245 A regulação da sobrevivência celular é tão importante quanto a regulação da proliferação celular 1246 REGENERAÇÃO E REPARO 1247 Planárias contêm célulastronco que podem regenerar um corpo novo inteiro 1248 Alguns vertebrados podem regenerar órgãos inteiros 1249 As célulastronco podem ser usadas artificialmente para substituir células doentes ou perdidas terapia para sangue e epiderme 1249 As célulastronco neurais podem ser manipuladas em cultivo e utilizadas para repovoar o sistema nervoso central 1250 REPROGRAMAÇÃO CELULAR E CÉLULASTRONCO PLURIPOTENTES 1251 Núcleos podem ser reprogramados por transferência ou transplante para dentro de um citoplasma alheio 1252 A reprogramação de um núcleo transferido envolve mudanças epigenéticas drásticas 1252 As célulastronco embrionárias ES podem produzir qualquer parte do corpo 1253 Um conjunto central de reguladores da transcrição define e mantém o estado de célula ES 1254 Os fibroblastos podem ser reprogramados para criar célulastronco pluripotentes induzidas células iPS 1254 A reprogramação envolve uma enorme perturbação do sistema de controle de genes 1255 xxxvi Sumário Uma manipulação experimental de fatores que modificam a cromatina pode aumentar a eficiência da reprogramação 1256 Células ES e iPS podem ser orientadas a gerar tipos celulares adultos específicos e até mesmo órgãos inteiros 1257 Células de um tipo especializado podem ser forçadas a se transdiferenciarem diretamente em outro tipo 1258 Células ES e iPS são úteis para a descoberta de fármacos e análise de doenças 1258 Capítulo 23 Patógenos e infecção 1263 INTRODUÇÃO AOS PATÓGENOS E À MICROBIOTA HUMANA 1263 A microbiota humana é um sistema ecológico complexo importante para o nosso desenvolvimento e saúde 1264 Os patógenos interagem com os seus hospedeiros de diferentes maneiras 1264 Os patógenos podem contribuir para o câncer doenças cardiovasculares e outras doenças crônicas 1265 Os patógenos podem ser vírus bactérias ou eucariotos 1266 As bactérias são diversas e ocupam uma variedade notável de nichos ecológicos 1267 As bactérias patogênicas possuem genes de virulência especializados 1268 Genes de virulência bacterianos codificam proteínas efetoras e sistemas de secreção para liberar proteínas efetoras para células hospedeiras 1269 Os fungos e os parasitas protozoários têm um ciclo de vida complexo envolvendo múltiplas formas 1271 Todos os aspectos da propagação viral dependem da maquinaria da célula hospedeira 1273 BIOLOGIA CELULAR DA INFECÇÃO 1276 Os patógenos superam barreiras epiteliais para infectar o hospedeiro 1276 Os patógenos que colonizam o epitélio devem superar os seus mecanismos de proteção 1276 Os patógenos extracelulares perturbam as células hospedeiras sem entrar nelas 1277 Os patógenos intracelulares possuem mecanismos tanto para a penetração quanto para a saída das células hospedeiras 1278 Os vírus ligamse a receptores virais na superfície da célula hospedeira 1279 Os vírus penetram as células hospedeiras por fusão de membrana formação de poros ou rompimento da membrana 1280 As bactérias penetram as células hospedeiras por fagocitose 1281 Os parasitas eucarióticos intracelulares invadem de forma ativa a célula hospedeira 1282 Alguns patógenos intracelulares escapam do fagossomo para o citosol 1284 Muitos patógenos alteram o tráfego de membrana da célula hospedeira para sobreviver e se replicar 1284 Os vírus e as bactérias utilizam o citoesqueleto da célula hospedeira para seus movimentos intracelulares 1286 Os vírus podem assumir o controle do metabolismo da célula hospedeira 1288 Os patógenos podem evoluir rapidamente por variação antigênica 1289 A replicação propensa a erros dominou a evolução viral 1291 Os patógenos resistentes a fármacos são um problema crescente 1292 Capítulo 24 Os sistemas imunes inato e adaptativo 1297 O SISTEMA IMUNE INATO 1298 As superfícies epiteliais atuam como barreiras contra a infecção 1298 Os receptores de reconhecimento de padrões PRRs reconhecem as características conservadas dos patógenos 1298 Existem múltiplas classes de PRRs 1299 Os PRRs ativados desencadeiam uma resposta inflamatória no local da infecção 1300 As células fagocíticas caçam englobam e destroem os patógenos 1301 A ativação do complemento marca os patógenos para fagocitose ou para lise 1302 As células infectadas por vírus desenvolvem medidas drásticas para evitar a replicação viral 1303 As células matadoras naturais NK induzem as células infectadas por vírus a cometer suicídio 1304 As células dendríticas fornecem a conexão entre os sistemas imunes inato e adaptivo 1305 VISÃO GERAL DO SISTEMA IMUNE ADAPTATIVO 1307 As células B desenvolvemse na medula óssea e as células T desenvolvemse no timo 1308 A memória imunológica depende tanto da expansão clonal quanto da diferenciação de linfócitos 1309 Os linfócitos recirculam continuamente através dos órgãos linfoides periféricos 1311 A autotolerância imunológica assegura que as células B e T não ataquem as células e moléculas normais do hospedeiro 1313 CÉLULAS B E IMUNOGLOBULINAS 1315 As células B produzem imunoglobulinas Igs que atuam tanto como receptores de antígenos da superfície celular quanto como anticorpos secretados 1315 Os mamíferos produzem cinco classes de Igs 1316 As cadeias leves e pesadas das Igs são compostas por regiões constantes e variáveis 1318 Os genes que codificam Igs são combinados a partir de segmentos de genes separados durante o desenvolvimento da célula B 1319 As hipermutações somáticas dirigidas por antígenos são responsáveis pelo ajuste fino nas respostas dos anticorpos 1321 As células B podem trocar a classe das Igs que produzem 1322 CÉLULAS T E PROTEÍNAS DO MHC 1324 Os receptores de células T TCRs são heterodímeros semelhantes a imunoglobulinas 1325 As células dendríticas ativadas ativam as células T virgens 1326 As células T reconhecem peptídeos estranhos ligados às proteínas do MHC 1327 As proteínas do MHC são as proteínas humanas mais polimórficas já conhecidas 1330 Os correceptores CD4 e CD8 nas células T ligamse a porções invariáveis das proteínas do MHC 1331 Os timócitos em desenvolvimento sofrem seleção positiva e negativa 1332 As células T citotóxicas induzem as célulasalvo infectadas a cometerem suicídio 1333 As células T auxiliares efetoras ajudam na ativação de outras células dos sistemas imunes inato e adaptativo 1335 As células T auxiliares virgens podem se diferenciar em distintos tipos de células T efetoras 1335 As células B e T necessitam de múltiplos sinais extracelulares para sua ativação 1336 Muitas proteínas de superfíce celular pertencem à superfamília de Igs 1338 PARTE I II III IV V CAPíTulo 1 NESTE CAPíTulo CARACTERÍSTICAS UNIVERSAIS DAS CÉLULAS NA TERRA A DIVERSIDADE DOS GENOMAS E A ÁRVORE DA VIDA A INFORMAÇÃO GENÉTICA EM EUCARIOTOS Células e genomas INTRODUÇÃO À CÉLULA A superfície do nosso planeta está povoada por seres vivos interessantes fábricas quí micas intrincadamente organizadas que absorvem substâncias de seus arredores e as utilizam como matériasprimas para gerar cópias de si mesmas Esses organismos vivos parecem extraordinariamente diversos O que poderia ser mais diferente do que um ti gre e uma alga marinha ou uma bactéria e uma árvore No entanto nossos ancestrais sem conhecer nada de células ou de DNA notaram que todos esses organismos tinham algo em comum Esse algo eles chamaram de vida maravilharamse com ela tiveram dificuldade em definila e tentaram explicar o que ela era e como funcionava em relação à matéria não viva As descobertas do século passado não diminuíram o encantamento pelo contrá rio mas removeram o mistério central em relação à natureza da vida Agora podemos ver que todos os seres vivos são compostos por células pequenas unidades delimitadas por membrana preenchidas com uma solução aquosa concentrada de produtos químicos e dotadas de extraordinária habilidade de criar cópias de si mesmas por meio de seu cres cimento e então da divisão em duas Devido às células serem as unidades fundamentais da vida é na biologia celular o estudo da estrutura função e comportamento das células que devemos procurar por respostas às questões sobre o que a vida é e como funciona Com um entendimento mais profundo das células e de sua evolução podemos começar a lidar com os grandes pro blemas históricos da vida na Terra suas origens misteriosas sua diversidade fascinante e sua invasão de cada hábitat concebível De fato como enfatizado há muito tempo pelo pioneiro em biologia celular E B Wilson a chave para cada problema biológico deve finalmente ser procurada na célula para cada organismo vivo há ou houve em algum momento uma célula Apesar de sua aparente diversidade os seres vivos são fundamentalmente pareci dos no seu interior Toda a biologia é desse modo um contraponto entre dois temas a admirável variedade em particularidades individuais e a admirável constância nos me canismos fundamentais Neste primeiro capítulo começaremos por destacar as carac terísticas universais comuns a toda a vida em nosso planeta Iremos então examinar brevemente a diversidade das células Veremos como graças ao código molecular co mum no qual as especificações de todos os organismos vivos estão escritas é possível ler medir e decifrar essas especificações para nos ajudar a alcançar um entendimento coerente sobre todas as formas de vida desde as menores até as maiores CAPíTulo 1 Células e genomas 3 zenam informações e estimase que venham evoluindo e diversificandose por mais de 35 bilhões de anos Dificilmente esperaríamos que todas elas armazenassem suas informações da mesma forma ou que os arquivos de um tipo de célula pudessem ser lidos pelo sistema de processamento de outra célula Contudo é assim que acontece Todas as células vivas da Terra armazenam suas informações hereditárias na forma de moléculas de DNA de fita dupla longas cadeias poliméricas pareadas não ramifica das formadas sempre pelos mesmos quatro tipos de monômeros Esses monômeros compostos químicos conhecidos como nucleotídeos são nomeados a partir de um alfabeto de quatro letras A T C e G e estão ligados um ao outro em uma longa sequência linear que codifica a informação genética assim como as sequências de 1s e 0s que codificam as informações em um arquivo de computador Nós podemos pegar um pedaço de DNA de uma célula humana e inserilo em uma bactéria ou um pedaço de DNA bacteriano e inserilo em uma célula humana e as informações serão lidas interpretadas e copiadas com sucesso Usando métodos químicos os cientistas apren deram como ler a sequência completa dos monômeros em qualquer molécula de DNA estendendose por muitos milhões de nucleotídeos e desse modo decifrar toda a informação hereditária que cada organismo contém Todas as células replicam sua informação hereditária por polimerização a partir de um molde Os mecanismos que tornam a vida possível dependem da estrutura da fita dupla da mo lécula de DNA Cada monômero em uma cadeia simples de DNA ou seja cada nucleo tídeo consiste em duas partes um açúcar desoxirribose com um grupo fosfato liga do a ele e uma base que pode ser adenina A guanina G citosina C ou timina T Figura 12 Cada açúcar está ligado ao próximo pelo grupo fosfato criando uma cadeia de polímero composta por uma cadeia principal repetitiva de açúcar e fosfato com sé ries de bases projetandose dela O polímero de DNA se estende pela adição de monô meros em uma das extremidades Para uma fita simples isolada essas bases podem ser em princípio adicionadas em qualquer ordem pois cada uma se liga à próxima da mes ma maneira por meio da parte da molécula que é igual para todas elas Na célula viva entretanto o DNA não é sintetizado como uma fita livre isolada mas a partir de um mol de formado por uma fita de DNA preexistente As bases que se projetam da fita existente ligamse às bases da fita que estão sendo sintetizadas de acordo com uma regra rigorosa Figura 12 O DNA e suas unidades funda mentais A O DNA é formado a partir de su bunidades simples chamadas de nucleotídeos e cada uma consiste em uma molécula de açúcarfosfato com uma cadeia lateral nitro genada ou base ligada a ela As bases são de quatro tipos adenina guanina citosina e timina correspondendo a quatro nucleotídeos distintos nomeados A G C e T B Uma cadeia simples de DNA consiste em nucleotídeos conectados por ligações de açúcarfosfato Observe que as unidades de açúcarfosfato são assimétricas dando à cadeia principal uma clara orientação ou polaridade Essa orientação guia os processos moleculares pelos quais a in formação no DNA é interpretada e copiada nas células a informação é sempre lida em uma ordem consistente exatamente como um texto em português é lido da esquerda para a direita C Pela polimerização a partir de um molde a sequência de nucleotídeos em uma fita de DNA existente controla a sequência na qual os nucleotídeos são polimerizados em uma nova fita de DNA o T em uma fita pareia com o A da outra e o G de uma fita com o C da outra A nova fita tem uma sequência de nucleotídeos complementar à fita molde e uma cadeia principal com direção oposta correspondente ao GTAA na fita original há o TTAC D Uma molécula típica de DNA consiste em duas dessas fitas complementares Os nucleotídeos de cada fita são unidos por ligações químicas fortes covalentes os nucleotídeos comple mentares nas fitas opostas são mantidos juntos de forma mais fraca através de ligações de hidrogênio E As duas fitas se torcem ao redor de si mesmas formando uma duplahélice uma estrutura robusta que pode acomodar qualquer sequência de nucleotídeos sem alterar sua estrutura básica ver Animação 41 G G G G G C C C C C A A A A A T T T T T Unidades fundamentais do DNA A DNA de fita dupla D DNA duplahélice E Fita de DNA B Açúcar fosfato Base Nucleotídeo Fosfato Açúcar Polimerização de nova fita a partir de um molde C Monômeros de nucleotídeos Cadeia principal de açúcarfosfato Pares de bases ligados por hidrogênio G G A A C C A G T G G T A A C C A G T G G T T T A A C C C C T G G C C C C A A A A A T T G G G G G 4 PARTE I Introdução à célula definida pelas estruturas complementares das bases A ligase a T e C ligase a G Esse pareamento de bases mantém os novos monômeros no lugar e desse modo controla a seleção de qual dos quatro monômeros deverá ser o próximo adicionado à fita crescente Dessa forma uma estrutura de fita dupla é criada composta por duas sequências exata mente complementares de As Cs Ts e Gs Essas duas fitas se torcem entre si formando um DNA duplahélice Figura 12E As ligações entre os pares de bases são fracas em comparação às ligações açúcar fosfato e isso permite que as duas fitas de DNA sejam separadas sem danificar suas cadeias principais Cada fita pode então servir de molde pela maneira recémdescrita para a síntese de uma nova fita de DNA complementar a si mesma isto é uma nova có pia da informação hereditária Figura 13 Em diferentes tipos de células esse processo de replicação de DNA ocorre com diferentes velocidades com diferentes controles para iniciálo ou interrompêlo e diferentes moléculas auxiliares para ajudar durante o pro cesso Contudo os princípios básicos são universais o DNA é o depósito das informa ções para hereditariedade e a polimerização a partir de um molde é a maneira pela qual essas informações são copiadas em todo o mundo vivo Todas as células transcrevem partes de sua informação hereditária em uma mesma forma intermediária o RNA Para cumprir sua função de armazenamento de informação o DNA deve fazer mais do que copiar a si mesmo Ele também deve expressar sua informação permitindo que ela guie a síntese de outras moléculas na célula Essa expressão ocorre através de um meca nismo que é o mesmo em todos os organismos vivos levando primeiro e antes de tudo à produção de duas outras classeschave de polímeros RNAs e proteínas O processo discutido em detalhe nos Capítulos 6 e 7 inicia com uma polimerização a partir de um molde chamada de transcrição na qual segmentos da sequência de DNA são usados como moldes para a síntese de moléculas menores desses polímeros muito semelhan tes de ácido ribonucleico ou RNA Depois no processo mais complexo de tradução muitas dessas moléculas de RNA controlam a síntese de polímeros pertencentes a uma classe química radicalmente diferente as proteínas Figura 14 No RNA a cadeia principal é formada por um açúcar ligeiramente diferente do açúcar do DNA a ribose em vez da desoxirribose e uma das quatro bases é ligeira mente diferente a uracila U no lugar da timina T Mas as outras três bases A C e G são as mesmas e todas as quatro bases pareiam com suas contrapartes complemen tares no DNA os A U C e G do RNA com os T A G e C do DNA Durante a transcrição os monômeros de RNA são alinhados e selecionados para a polimerização a partir de uma fitamolde de DNA assim como os monômeros de DNA são selecionados durante a replicação O resultado é uma molécula de polímero cuja sequência de nucleotídeos re presenta fielmente uma porção da informação genética da célula embora esteja escrita em um alfabeto ligeiramente diferente que consiste em monômeros de RNA em vez de monômeros de DNA O mesmo segmento de DNA pode ser utilizado repetidamente para guiar a síntese de muitas moléculas de RNA idênticas Assim enquanto o arquivo de informação genéti ca da célula na forma de DNA é fixo e inviolável esses transcritos de RNA são produzidos em massa e descartáveis Figura 15 Como poderemos ver esses transcritos funcionam Figura 13 O processo de cópia da informação genética pela replicação do DNA Nesse processo as duas fitas de uma duplahélice de DNA são separadas e cada uma serve como um molde para a síntese de uma nova fita complementar DNA duplahélice parental Fita molde Fita molde Fita nova Fita nova PROTEÍNA RNA DNA DNA Síntese de proteína TRADUÇÃO Síntese de RNA TRANSCRIÇÃO Nucleotídeos Síntese de DNA REPLICAÇÃO Aminoácidos Figura 14 Do DNA à proteína A informa ção genética é lida e executada em um proces so de duas etapas Primeiro na transcrição os segmentos de uma sequência de DNA são usa dos para guiar a síntese de moléculas de RNA Depois na tradução as moléculas de RNA são usadas para guiar a síntese de moléculas de proteínas CAPíTulo 1 Células e genomas 5 como intermediários na transferência da informação genética Mais notavelmente eles servem como moléculas de RNA mensageiro mRNA que guiam a síntese de proteínas de acordo com as instruções genéticas armazenadas no DNA As moléculas de RNA possuem estruturas distintas que também podem conferir lhes outras características químicas especializadas Sendo de fita simples sua cadeia principal é flexível podendo dobrarse sobre si para permitir que uma parte da molé cula forme ligações fracas com outra parte da mesma molécula Isso acontece quando segmentos da sequência são localmente complementares um segmento GGGG por exemplo tenderá a se associar a um segmento CCCC Esses tipos de associações internas podem fazer uma cadeia de RNA se dobrar em uma forma específica imposta por sua sequência Figura 16 A forma da molécula de RNA por sua vez pode habili tála a reconhecer outras moléculas ao ligarse a elas seletivamente e ainda em alguns casos catalisar alterações químicas nas moléculas que estão ligadas De fato algumas reações químicas catalisadas por moléculas de RNA são cruciais para muitos dos mais antigos e fundamentais processos nas células vivas e foi sugerido que uma extensiva catálise por RNA desempenhou papel central nas etapas iniciais da evolução da vida discutido no Capítulo 6 Todas as células utilizam proteínas como catalisadores As moléculas de proteína como as moléculas de DNA e de RNA são cadeias poliméri cas longas não ramificadas formadas pela ligação sequencial de unidades fundamentais monoméricas oriundas de um conjuntopadrão que é o mesmo para todas as células vivas Como o DNA e o RNA as proteínas carregam informações em uma forma de se quência linear de símbolos da mesma maneira que uma mensagem humana é escrita em um código alfabético Existem muitas moléculas diferentes de proteína em cada cé lula e exceto pela água elas formam a maior parte da massa da célula Figura 15 Como a informação gené tica é transmitida para uso no interior da célula Cada célula contém um conjun to fixo de moléculas de DNA seu arquivo de informação genética Um determinado segmento desse DNA guia a síntese de vários transcritos de RNA idênticos que servem como cópias de trabalho da infor mação armazenada no arquivo Muitos conjuntos diferentes de moléculas de RNA podem ser produzidos pela transcrição de diferentes partes de sequências do DNA de uma célula permitindo que diferentes tipos de células utilizem o mesmo arquivo de informação de forma diferente DNA DE FITA DUPLA COMO ARQUIVO DE INFORMAÇÃO Fita utilizada como molde para orientar a síntese de RNA Muitos transcritos de RNA idênticos TRANSCRIÇÃO MOLÉCULAS DE RNA COMO PORTADORAS DE INFORMAÇÃO DESCARTÁVEIS Figura 16 Conformação de uma molécula de RNA A O pareamento de nucleotídeos entre diferentes regiões da mesma cadeia de polímero de RNA leva a molécula a adotar uma forma distinta B Estrutura tridimensional de uma molé cula de RNA real produzida pelo vírus da hepatite delta este RNA pode catalisar a clivagem da fita de RNA A faixa em azul representa a cadeia principal de açúcar fosfato as barras representam os pares de bases ver Animação 61 B baseada em AR FerréDAmaré K Zhou e JA Doudna Nature 395567574 1998 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd G G GA C C C U A G C U U A A A U C G A A UU U A U G C A U UA C G U A A A A UU U U A U G A U A C G C A U G C G C AU G C A B 6 PARTE I Introdução à célula Os monômeros de uma proteína os aminoácidos são bem diferentes daqueles do DNA e RNA e há 20 tipos em vez de 4 Cada aminoácido é constituído pela mesma estrutura básica pela qual pode ser ligado de forma padronizada a qualquer outro ami noácido ligada a essa estrutura básica existe um grupo lateral que atribui a cada amino ácido uma característica química diferente Cada uma das moléculas de proteína é um polipeptídeo criado pela ligação de seus aminoácidos em uma sequência específica Através de bilhões de anos de evolução essa sequência foi selecionada para conferir à proteína uma função útil Assim por dobrarse em uma forma tridimensional precisa com sítios reativos na sua superfície Figura 17A esses polímeros de aminoácidos po dem se ligar com alta especificidade a outras moléculas e podem agir como enzimas que catalisam as reações que formam ou rompem ligações covalentes Dessa maneira eles realizam a grande maioria dos processos químicos nas células Figura 17B As proteínas também possuem muitas outras funções manutenção de estruturas geração de movimentos percepção de sinais entre outras cada molécula de proteína desempenhando uma função específica de acordo com sua própria sequência de ami noácidos determinada geneticamente As proteínas são sobretudo as principais molé culas que colocam em ação a informação genética da célula Assim os polinucleotídeos especificam a sequência de aminoácidos das proteínas As proteínas por sua vez catalisam diversas reações químicas incluindo aquelas pelas quais as novas moléculas de DNA são sintetizadas Do ponto de vista mais fundamen tal uma célula viva é uma coleção autorreplicadora de catalisadores que interiorizam alimentos processam os alimentos para gerar as unidades fundamentais e a energia ne cessária para fazer mais catalisadores e descarta os materiais que sobram como resíduo Figura 18A Um ciclo de retroalimentação que conecta proteínas e polinucleotídeos forma a base para esse comportamento autocatalítico e autorreprodutor dos organismos vivos Figura 18B Todas as células traduzem o RNA em proteínas da mesma maneira A forma como a informação no DNA determina a produção de proteínas era um completo mistério nos anos de 1950 quando a estrutura de fita dupla do DNA foi revelada pela pri meira vez como a base da hereditariedade Nos anos seguintes no entanto os cientistas descobriram os elegantes mecanismos envolvidos A tradução da informação genética do alfabeto de quatro letras dos polinucleotídeos para as 20 letras do alfabeto das proteínas é um processo complexo As regras dessa tradução em alguns aspectos parecem ser cla ras e racionais mas em outros parecem estranhamente arbitrárias considerandose que são idênticas com poucas exceções em todos os organismos vivos Acreditase que essas características arbitrárias reflitam eventos aleatórios que ocorreram no início da história da vida Eles resultam de propriedades aleatórias dos primeiros organismos que foram passadas por hereditariedade tornandose tão profundamente enraizados na constituição de todas as células vivas e que não podem ser alterados sem efeitos desastrosos A Lisozima Molécula de polissacarídeos Molécula de lisozima B Sítio catalítico Figura 17 Como uma molécula de proteína atua como catalisador de uma reação química A Em uma molécula de proteína a cadeia polimérica dobrase em uma forma específica definida por sua sequência de aminoácidos Um sulco na superfície desta molécula específica dobrada a enzima lisozima forma um sítio cata lítico B Uma molécula de polissacarídeo vermelho uma cadeia polimérica de monômeros de açúcar ligase ao sítio catalítico da lisozima e é fragmentada como resultado do rompimento da ligação covalente catalisada pelos aminoácidos alinhados no sulco Ver Animação 39 Código no PDB 1LYD CAPíTulo 1 Células e genomas 7 Acontece que a informação contida na sequência de uma molécula de mRNA é lida em grupos de três nucleotídeos por vez cada trinca de nucleotídeo ou códon es pecifica codifica um único aminoácido na proteína correspondente Uma vez que o número de trincas diferentes que podem ser formadas a partir de quatro nucleotídeos é 4 3 há 64 códons possíveis todos os quais ocorrem na natureza Entretanto há apenas 20 aminoácidos de ocorrência natural Isso significa que há necessariamente muitos casos nos quais vários códons correspondem ao mesmo aminoácido Esse código ge nético é lido por uma classe especial de pequenas moléculas de RNA os RNAs trans portadores tRNAs Cada tipo de tRNA ligase por uma extremidade a um aminoáci do específico e em sua outra extremidade apresenta uma sequência específica de três nucleotídeos um anticódon que possibilita o reconhecimento por pareamento de bases de um códon ou um grupo de códons específicos no mRNA A química intrinca da que permite que esses tRNAs traduzam uma sequência específica de nucleotídeos A C G e U de uma molécula de mRNA de uma sequência específica de aminoácidos em uma molécula de proteína ocorre no ribossomo uma máquina multimolecular compos ta por proteína e RNA ribossômico Todos esses processos estão descritos em detalhes no Capítulo 6 Cada proteína é codificada por um gene específico Via de regra as moléculas de DNA são muito grandes contendo as especificações para milhares de proteínas Sequências especiais no DNA servem como pontuação definindo onde a informação para cada proteína começa e termina e segmentos individuais da longa sequência de DNA são transcritos em moléculas de mRNA codificando diferentes proteínas Cada um desses segmentos de DNA representa um gene Existe uma com plexidade na qual as moléculas de RNA transcritas a partir de um mesmo segmento de DNA podem frequentemente ser processadas em mais de uma forma originando des se modo um grupo de versões alternativas de uma proteína especialmente em células mais complexas como as de plantas e animais Além disso alguns segmentos de DNA um número menor são transcritos em moléculas de RNA que não são traduzidas mas têm funções catalíticas reguladoras ou estruturais tais segmentos de DNA também são considerados genes Um gene portanto é definido como um segmento da sequência de DNA correspondente a uma única proteína ou grupo de variantes proteicas alternativas ou uma única molécula de RNA catalítica reguladora ou estrutural Em todas as células a expressão de genes individuais é regulada em vez de fabricar todo seu repertório de possíveis proteínas a toda potência o tempo todo a célula ajusta a taxa de transcrição e de tradução dos diferentes genes independentemente de acordo com a necessidade Segmentos de DNA regulador são intercalados com os segmentos que codificam as proteínas e essas regiões não codificadoras ligamse a moléculas especiais de proteínas que controlam a taxa local de transcrição A quantidade e a organização dos DNAs reguladores variam muito de uma classe de organismos para outra mas a estra tégia básica é universal Dessa maneira o genoma de uma célula isto é toda a sua in formação genética contida em sua sequência completa de DNA prediz não somente a natureza das proteínas da célula mas também quando e onde elas devem ser produzidas Figura 18 A vida como um processo autocatalítico A A célula como um conjunto de catalisadores autorreplicantes B Os polinucleotídeos ácidos nuclei cos DNA e RNA que são polímeros de nucleotídeos fornecem a informação da sequência enquanto as proteínas polímeros de aminoácidos fornecem a maioria das funções catalíticas que servem por meio de um conjunto complexo de reações químicas para realizar a síntese de mais polinucleotídeos e proteínas dos mesmos tipos Polinucleotídeos Nucleotídeos Proteínas Aminoácidos ENTRADA DE ALIMENTO A B Unidades fundamentais Energia SAÍDA DE RESÍDUOS Função catalítica Informação da sequência O CONJUNTO DE CATALISADORES DA CÉLULA COLABORA PARA REPRODUZIR O CONJUNTO INTEIRO ANTES QUE UMA CÉLULA SE DIVIDA Conjunto de catalisadores da célula 8 PARTE I Introdução à célula A vida requer energia livre Uma célula viva é um sistema químico dinâmico operando distante do seu equilíbrio quí mico Para uma célula crescer ou dar origem a uma nova célula à sua própria imagem ela deve adquirir energia livre do ambiente assim como matériasprimas para realizar as rea ções sintéticas necessárias Esse consumo de energia livre é fundamental para a vida Quan do este processo é interrompido a célula declina para o equilíbrio químico e logo morre A informação genética também é fundamental para a vida e energia livre é ne cessária para a propagação dessa informação Por exemplo a especificação de uma in formação isto é uma escolha de sim ou não entre duas alternativas igualmente prová veis custa uma quantidade definida de energia livre que pode ser calculada A relação quantitativa envolve um entendimento árduo e depende de uma definição precisa do termo energia livre como explicado no Capítulo 2 A ideia básica entretanto não é di fícil de se entender intuitivamente Imagine as moléculas de uma célula como uma multidão de objetos dotados de energia térmica movendose violentamente ao acaso sendo fustigados por colidirem uns com os outros Para especificar a informação genética na forma de uma sequência de DNA por exemplo as moléculas dessa multidão selvagem devem ser capturadas dispostas em uma ordem definida por algum molde preexistente e unidas de maneira estável As ligações que mantêm as moléculas em seu devido lugar no molde e as unem devem ser fortes o suficiente para resistir ao efeito de desordem da termodinâmica O processo é conduzido pelo consumo de energia livre que é necessária para assegurar que as ligações corretas sejam formadas de forma robusta No caso mais simples as mo léculas podem ser comparadas a uma armadilha de molas preparada pronta para desar mar assumindo uma conformação mais estável e de menor energia quando encontra os seus parceiros apropriados quando elas assumem a conformação ligada a sua energia disponível sua energia livre assim como a energia na mola da armadilha é liberada e dissipada como calor Em uma célula os processos químicos que correspondem à trans ferência de informação são mais complexos mas o mesmo princípio básico é aplicado a energia livre deve ser utilizada na criação de ordem Para replicar a sua informação genética de maneira fiel e realmente produzir todas as suas moléculas complexas de acordo com as especificações corretas a célula requer portanto energia livre que deve ser importada dos arredores de alguma maneira Como veremos no Capítulo 2 a energia livre necessária para as células animais é derivada de ligações químicas das moléculas de alimento que os animais ingerem enquanto as plan tas obtêm a sua energia livre da luz solar Todas as células funcionam como fábricas bioquímicas que utilizam as mesmas unidades moleculares fundamentais básicas Devido ao fato de todas as células fabricarem DNA RNA e proteínas todas devem con ter e manipular um conjunto semelhante de pequenas moléculas incluindo açúcares simples nucleotídeos e aminoácidos assim como outras substâncias que são universal mente necessárias Todas as células por exemplo necessitam do nucleotídeo fosforilado ATP adenosina trifosfato não apenas como uma unidade fundamental para a síntese de DNA e RNA mas também como carreador da energia livre necessária para realizar um grande número de reações químicas na célula Embora todas as células funcionem como fábricas bioquímicas de um tipo mui to semelhante muitos dos detalhes da sua transação de moléculas pequenas diferem Alguns organismos como as plantas necessitam apenas o mínimo de nutrientes e utili zam a energia da luz solar para fabricar todas as suas próprias pequenas moléculas orgâ nicas Outros organismos como os animais alimentamse de seres vivos e precisam obter muitas das suas moléculas orgânicas já prontas Retornaremos a este ponto mais tarde Todas as células são envoltas por uma membrana plasmática através da qual os nutrientes e materiais residuais devem passar Uma outra característica universal é que cada célula está envolta por uma membrana a membrana plasmática Esse revestimento atua como uma barreira seletiva que possi CAPíTulo 1 Células e genomas 9 bilita que a célula concentre nutrientes adquiridos do seu meio e retenha os produtos que sintetiza para uso próprio enquanto excreta produtos residuais Sem a membrana plasmática a célula não poderia manter sua integridade como um sistema químico co ordenado As moléculas que formam uma membrana possuem a simples propriedade físico química de serem anfifílicas isto é consistem em uma parte hidrofóbica insolúvel em água e outra parte que é hidrofílica solúvel em água Tais moléculas colocadas na água agregamse espontaneamente arranjando as suas porções hidrofóbicas de forma a ficarem em contato uma com a outra o máximo possível para protegêlas da água enquanto man têm a porção hidrofílica exposta As moléculas anfifílicas de formato apropriado como as moléculas de fosfolipídeos que compõem a maior parte da membrana plasmática agre gamse espontaneamente na água para formar uma bicamada que forma pequenas vesí culas fechadas Figura 19 O fenômeno pode ser demonstrado em um tubo de ensaio simplesmente misturandose fosfolipídeos e água sob condições apropriadas ocorre a for mação de pequenas vesículas cujo conteúdo aquoso é isolado do meio externo Embora os detalhes químicos variem as caudas hidrofóbicas das moléculas pre dominantes nas membranas de todas as células são polímeros de hidrocarbonetos CH2CH2CH2 e a sua associação espontânea em vesículas formadas por bicamadas é apenas um dos muitos exemplos de um importante princípio geral as células produ zem moléculas cujas propriedades químicas as levam a se autoorganizarem em estru turas de que as células precisam O envoltório da célula não pode ser totalmente impermeável Se uma célula pre cisa crescer e se reproduzir ela deve ser capaz de importar matériaprima e exportar resíduo através de sua membrana plasmática Por essa razão todas as células possuem proteínas especializadas inseridas em sua membrana que transportam moléculas espe cíficas de um lado a outro Algumas dessas proteínas transportadoras de membrana as sim como algumas das proteínas que catalisam as reações fundamentais com pequenas moléculas no interior da célula foram tão bem conservadas durante o curso da evolu ção que podemos reconhecer entre elas uma semelhança familiar mesmo em compara ções com grupos de organismos vivos mais distantemente relacionados As proteínas transportadoras na membrana determinam principalmente quais moléculas entram ou saem da célula e as proteínas catalíticas no interior da célula deter minam as reações que essas moléculas sofrem Dessa maneira especificando as proteínas que a célula produzirá a informação genética gravada na sequência do DNA ditará toda a química da célula e não apenas a sua química mas também sua forma e seu compor tamento pois esses dois são principalmente determinados e controlados pelas proteínas celulares Uma célula viva pode sobreviver com menos de 500 genes Os princípios básicos da transmissão da informação genética são bastante simples mas o quanto são complexas as células vivas reais Em especial quais são os requisitos míni mos Podemos ter uma indicação aproximada se considerarmos a espécie que tem um dos menores genomas conhecidos a bactéria Mycoplasma genitalium Figura 110 Esse organismo vive como um parasita em mamíferos e seu ambiente o supre de mui tas de suas pequenas moléculas prontas para o uso Todavia ele ainda precisa sintetizar todas as moléculas grandes DNA RNA e proteínas necessárias para os processos bá sicos da hereditariedade Esse organismo possui cerca de 530 genes aproximadamente 400 dos quais são essenciais O seu genoma composto por 580070 pares de nucleotídeos representa 145018 bytes de informação praticamente o necessário para gravar o texto de um capítulo deste livro A biologia celular pode ser complicada mas não é impossível Provavelmente o número mínimo de genes para uma célula viável no ambiente atual é de não menos do que 300 embora existam apenas cerca de 60 genes no conjunto essencial que é compartilhado por todas as espécies vivas Figura 19 Formação de uma membrana por moléculas fosfolipídicas anfifílicas Os fosfolipídeos pos suem uma cabeça hidrofílica afinidade por água fosfato e uma cauda hidrofóbica evitam água hidrocarbone to Na interface entre o óleo e a água as moléculas se arranjam como uma camada simples com suas cabeças voltadas para a água e suas caudas para o óleo Mas quando imersas em água elas se agregam em forma de bicamadas contendo compartimentos aquosos como indicado ÓLEO Monocamada fosfolipídica ÁGUA Bicamada fosfolipídica CAPíTulo 1 Células e genomas 11 quirem essa energia livre alimentandose de outros organismos vivos ou dos compostos orgânicos que eles produzem tais organismos são chamados de organotróficos da pa lavra grega trophe que significa alimento Outros obtêm sua energia diretamente do mundo não vivo Esses conversores primários de energia ocorrem em duas classes aque les que capturam energia da luz solar e aqueles que capturam sua energia de sistemas químicos inorgânicos ricos em energia no ambiente sistemas químicos que estão longe do equilíbrio químico Os organismos da primeira classe são chamados de fototróficos alimentamse da luz solar os da segunda são chamados de litotróficos alimentamse de rochas Os organismos organotróficos não poderiam existir sem esses conversores primários de energia que são a forma de vida mais abundante Os organismos fototróficos incluem vários tipos de bactérias assim como algas e plantas dos quais nós e praticamente todos os organismos vivos que normalmente ve mos ao nosso redor dependemos Os organismos fototróficos mudaram toda a química de nosso ambiente o oxigênio na atmosfera da Terra é um produto secundário de suas atividades biossintéticas Os organismos litotróficos não são elementos tão óbvios em nosso mundo pois são microscópicos e vivem principalmente em hábitats que os humanos não frequentam nos abismos oceânicos enterrados na crosta terrestre ou em vários outros ambientes inóspitos Contudo eles constituem grande parte do mundo vivo e são especialmente importantes em qualquer aspecto da história da vida na Terra Alguns litotróficos adquirem a energia de reações aeróbicas que usam oxigênio molecular do ambiente uma vez que o O2 atmosférico é o produto final de muitos or ganismos vivos esses litotróficos aeróbios estão de certa maneira alimentandose de produtos de uma vida passada Entretanto há outros litotróficos que vivem anaerobi camente em lugares onde pouco ou nenhum oxigênio molecular está presente Essas são circunstâncias semelhantes àquelas que existiram nos dias iniciais da vida na Terra antes que o oxigênio se acumulasse Os mais dramáticos desses lugares são as quentes fendas hidrotermais no assoalho dos oceanos Pacífico e Atlântico Elas estão localizadas onde o assoalho oceânico se ex pande como novas porções da crosta da Terra que se formam por ressurgência gradual da matéria do interior da Terra Figura 111 A água do mar que se desloca para o fundo é aquecida e direcionada de volta à superfície como um gêiser submarino carregando junto uma corrente de compostos químicos das rochas quentes que estão embaixo Um coquetel típico pode incluir H2S H2 CO Mn 2 Fe 2 Ni 2 CH4 NH4 e compostos conten Figura 111 A geologia de uma fenda hidrotermal quente no assoalho do oceano Conforme indicado a água escoa para o fundo em direção à rocha derretida que extravasa do interior da Terra e é aque cida e enviada de volta à superfície carre gando minerais lixiviados da rocha quente Um gradiente de temperatura é formado de mais de 350 ºC próximo do centro da fenda até 2 a 3 ºC no oceano circunvizi nho Os minerais precipitam da água à medida que ela resfria formando uma chaminé Diferentes classes de organismos adaptados a diferentes temperaturas vi vem em locais diferentes da chaminé Uma chaminé típica pode ter poucos metros de altura expelindo água quente rica em minerais a um fluxo de 1 a 2 m 3s 23 ºC MAR Chaminé composta por sulfetos de metal precipitados Região adjacente a 350 ºC Assoalho oceânico Comunidade de animais invertebrados Bactérias litotróficas anaeróbicas Fenda hidrotermal Nuvem escura de água quente rica em minerais Escoamento da água do mar Solução mineral quente Basalto quente 12 PARTE I Introdução à célula do fósforo Uma densa população de micróbios vive nas vizinhanças das fendas prospe rando com essa rígida dieta e adquirindo energia livre das reações entre os compostos químicos disponíveis Outros organismos moluscos mexilhões e vermes marinhos gigantes por sua vez vivem dos micróbios na fenda formando todo um ecossistema análogo para o mundo das plantas e dos animais ao qual nós pertencemos porém im pulsionado por energia geoquímica em vez de luz Figura 112 Algumas células fixam nitrogênio e dióxido de carbono para outras Para formar uma célula viva é preciso matéria assim como energia livre DNA RNA e proteína são compostos por apenas seis elementos químicos hidrogênio carbono ni trogênio oxigênio enxofre e fósforo Estes são abundantes no ambiente não vivo nas ro chas água e atmosfera da Terra Entretanto eles não estão presentes em formas químicas que permitam fácil incorporação em moléculas biológicas O N2 e o CO2 atmosféricos em particular são extremamente não reativos Uma grande quantidade de energia livre é necessária para conduzir as reações que utilizam essas moléculas inorgânicas para pro duzir os compostos orgânicos necessários à biossíntese isto é para fixar nitrogênio e dióxido de carbono tornando as moléculas de N e de C disponíveis para os organismos vivos Muitos tipos de células vivas não possuem a maquinaria bioquímica para realizar a fixação em vez disso necessitam de outras classes de células para realizar essa tarefa por elas Nós animais dependemos das plantas para nosso suprimento de compostos orgânicos de carbono e nitrogênio As plantas por sua vez embora possam fixar o dióxi do de carbono da atmosfera não possuem a habilidade de fixar o nitrogênio atmosférico elas dependem em parte de bactérias fixadoras de nitrogênio para suprir sua necessida de de compostos nitrogenados As plantas da família das ervilhas por exemplo abrigam bactérias simbióticas fixadoras de nitrogênio em nódulos de suas raízes Como consequência as células vivas diferem muito em alguns dos aspectos mais básicos de sua bioquímica Não é surpresa que as células com necessidades e capaci dades complementares tenham desenvolvido associações próximas Algumas dessas associações como veremos a seguir evoluíram a tal ponto que os parceiros perderam completamente a sua identidade individual eles uniram forças para formar uma única célula composta Figura 112 Organismos que vivem a uma profundidade de 2500 metros próximo a uma fenda no assoalho oce ânico Perto da fenda a temperaturas de cerca de 120ºC vivem várias espécies lito tróficas de bactérias e de arqueias arque obactérias diretamente alimentadas por energia geoquímica Um pouco afastados onde a temperatura é mais baixa vários animais invertebrados vivem alimentando se desses microrganismos Os mais notá veis são estes vermes tubulares gigantes 2 m Riftia pachyptila que ao invés de se alimentarem de células litotróficas vivem em simbiose com elas órgãos especiali zados nesses vermes abrigam um grande número de bactérias simbióticas oxidantes de enxofre Essas bactérias utilizam ener gia geoquímica e fornecem alimento a seus hospedeiros que não possuem boca intestino ou ânus Acreditase que os ver mes tubulares tenham evoluído de animais mais convencionais e que adaptaramse secundariamente à vida nas fendas hi drotermais Cortesia de Monika Bright University of Vienna Áustria 1 m Bactérias Energia geoquímica e matériaprima inorgânica Animais multicelulares p ex vermes tubulares CAPíTulo 1 Células e genomas 15 uma bactéria ancestral ver Figura 123 Portanto o mundo vivo de hoje é considera do como consistindo em três grandes grupos ou domínios bactérias arqueias e euca riotos Figura 117 As arqueias geralmente são encontradas habitando ambientes que nós humanos evitamos como pântanos estações de tratamento de esgotos profundezas oceânicas salinas e fontes ácidas quentes apesar de elas também se distribuírem amplamente em ambientes menos extremos e mais familiares de solos e lagos ao estômago de gado Na aparência externa não são facilmente distinguidas das bactérias Em nível molecular as arqueias parecem mais semelhantes aos eucariotos em relação à maquinaria de mani pulação da informação genética replicação transcrição e tradução entretanto são mais semelhantes às bactérias em relação ao metabolismo e à conversão de energia Discuti remos a seguir como isso pode ser explicado Alguns genes evoluem de forma rápida outros são altamente conservados Tanto no armazenamento como na cópia da informação genética acidentes e erros alea tórios ocorrem alterando a sequência de nucleotídeos isto é criando mutações Con sequentemente quando uma célula se divide suas duas célulasfilhas muitas vezes não são idênticas umas às outras ou à célula parental Em raras ocasiões o erro pode repre sentar uma mudança para melhor mais provavelmente não causará diferença significa tiva nas perspectivas da célula No entanto em muitos casos o erro causará sério dano por exemplo rompendo a sequência codificadora de uma proteínachave As mudanças que ocorrem devido a erros do primeiro tipo tenderão a ser perpetuadas pois a célula alterada tem probabilidade aumentada de se reproduzir As mudanças ocorridas devido a erros do segundo tipo mudanças seletivamente neutras podem ser perpetuadas ou não na competição por recursos limitados é uma questão de sorte a célula alterada ou suas primas terem sucesso Porém as mudanças que causam sérios danos não levam a lugar nenhum as células que sofrem tais mudanças morrem não deixando progênie Por meio de intermináveis repetições desse ciclo de tentativas e erros de mutação e seleção natural os organismos evoluem suas especificações genéticas mudam pro porcionando a eles novas maneiras para explorar o ambiente de forma mais efetiva para sobreviver em competições com outros e para se reproduzir com sucesso Algumas partes do genoma mudarão com mais facilidade do que outras no curso da evolução Um segmento de DNA que não codifica proteínas e que não tem papel regu lador significativo está livre para sofrer mudanças limitadas apenas pela frequência alea tória dos erros Em contraste um gene que codifica uma proteína essencial altamente es pecializada ou uma molécula de RNA não pode se alterar com tanta facilidade quando ocorrem erros as células defeituosas são quase sempre eliminadas Os genes desse tipo são portanto altamente conservados Ao longo de 35 bilhões de anos ou mais de história evolutiva muitas características do genoma mudaram muito além do reconhecimento mas a maioria dos genes altamente conservados permanece perfeitamente reconhecível em todas as espécies vivas AR QU EIA S B A C T É RI AS EU CA RI O T O S Célula ancestral comum Aquifex Thermotoga Cianobactérias Bacillus E coli Aeropyrum Sulfolobus Haloferax Methano thermobacter Methanococcus Paramecium Dictyostelium Euglena Trypanosoma Milho Levedura Humanos 1 mudança10 nucleotídeos Primeiro eucarioto Giardia Trichomonas Figura 117 As três principais divisões domínios do mundo vivo Observe que o nome bactérias foi originalmente usado como referência para os procariotos em geral porém mais recentemente foi redefinido para referirse às eubactérias especificamente A árvore genealógica mostrada aqui está baseada nas compa rações da sequência nucleotídica de uma das subunidades do RNA ribossômico rRNA em diferentes espécies e as dis tâncias no diagrama representam uma estimativa do número de mudanças evo lutivas que ocorreram nesta molécula em cada linhagem ver Figura 118 As partes da árvore evolutiva destacadas em cinza representam incertezas sobre detalhes do verdadeiro padrão de divergência das espécies ao longo da evolução as compa rações nas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos de outras moléculas que não o rRNA assim como outros argumentos podem resultar em árvores genealógicas diferentes Como indicado agora se acre dita que o núcleo da célula eucariótica tenha emergido de um subramo dentro das arqueias de forma que no início a árvore da vida tinha apenas dois ramos bactérias e arqueias 16 PARTE I Introdução à célula Os genes altamente conservados são os únicos que devem ser examinados quando desejamos traçar as relações familiares entre os organismos relacionados mais distante mente na árvore da vida Os estudos iniciais que levaram à classificação do mundo vivo em três domínios bactérias arqueias e eucariotos têm como base sobretudo a análise de um dos componentes do rRNA do ribossomo Como o processo de tradução do RNA em proteína é fundamental a todos os organismos vivos esse componente do ribossomo tem sido muito bem conservado desde o início da história da vida na Terra Figura 118 A maioria das bactérias e das arqueias tem entre 1000 e 6000 genes A seleção natural em geral favoreceu as células procarióticas capazes de se reproduzir com mais rapidez captando matériasprimas de seu ambiente e replicandose de ma neira mais eficiente a uma taxa máxima permitida pelo suprimento alimentar disponí vel O tamanho pequeno implica uma alta razão entre a área superficial e o volume fa cilitando dessa forma a maximização da aquisição de nutrientes através da membrana plasmática acelerando a taxa de reprodução celular Presumivelmente por essas razões a maioria das células procarióticas possui muito pouco material supérfluo os seus genomas são pequenos com genes localiza dos muito próximos uns dos outros e com quantidades mínimas de DNA regulador entre eles O tamanho pequeno do genoma tornou fácil usar técnicas modernas de sequencia mento de DNA para determinar sequências genômicas completas Atualmente temos essa informação para milhares de espécies de bactérias e de arqueias assim como de centenas de espécies de eucariotos A maioria dos genomas de bactérias e de arqueias contém entre 10 6 e 10 7 pares de nucleotídeos codificando de 1000 a 6000 genes Uma sequência completa de DNA revela os genes que um organismo possui e aqueles que faltam Quando comparamos os três domínios dos organismos vivos po demos começar a ver quais genes são comuns a todos e que devem portanto ter esta do presentes na célula que foi ancestral a todos os seres vivos atuais e quais genes são peculiares a um único ramo da árvore da vida Para explicar as descobertas no entanto devemos considerar mais atentamente como novos genes surgem e como os genomas evoluem Novos genes são gerados a partir de genes preexistentes A matériaprima para a evolução é a sequência de DNA existente não há mecanismo natural para fabricar longas sequências a partir de novas sequências aleatórias Nesse sentido nenhum gene é totalmente novo Entretanto a inovação pode ocorrer de várias maneiras Figura 119 1 Mutação intragênica um gene existente pode ser modificado aleatoriamente por mudanças em sua sequência de DNA causadas por vários tipos de erros que ocor rem principalmente durante o processo de replicação do DNA 2 Duplicação gênica um gene existente pode ser duplicado acidentalmente criando um par de genes inicialmente idênticos dentro de uma célula esses dois genes podem desse modo divergir ao longo do curso da evolução 3 Embaralhamento de segmento de DNA dois ou mais genes existentes podem ser clivados e ligados novamente formando um gene híbrido que consiste em seg mentos de DNA que originalmente pertenceram a genes separados 4 Transferência horizontal intercelular uma porção de DNA pode ser transferida do genoma de uma célula para o genoma de outra até mesmo para uma de outra espécie Esse processo contrasta com a habitual transferência vertical de informa ção genética que ocorre dos pais à progênie Figura 118 Informações genéticas conservadas desde a existência do último ancestral comum a todos os seres vivos Uma parte do gene do menor dos dois componentes principais do rRNA dos ribossomos é mostrada A molécula completa é de cerca de 1500 a 1900 nucleotídeos dependendo da espécie Segmentos correspondentes da sequência de nucleotídeos de uma arqueia Methanococcus jannaschii uma bactéria Escherichia coli e um eucarioto Homo sapiens estão alinhados Os sítios onde os nucleotídeos são idênticos entre as espécies estão indicados por uma linha vertical a sequência humana está repetida embaixo do alinhamento de maneira que as três comparações podem ser vistas par a par Um ponto na metade da sequência de E coli denota uma posição em que um nucleotídeo ou foi removido da linhagem bacteriana durante o curso da evolução ou inserido nas outras duas linhagens Observe que as sequências desses três organismos representantes dos três do mínios do mundo vivo ainda guardam semelhanças indiscutíveis Methanococcus Humano Humano E coli CAPíTulo 1 Células e genomas 17 Cada um desses tipos de mudança deixa um traço característico na sequência de DNA do organismo e existe clara evidência de que todos os quatro processos ocorreram com frequência Em capítulos posteriores discutiremos os mecanismos básicos mas no momento nos concentraremos nas consequências Duplicações gênicas originam famílias de genes relacionados em uma única célula Uma célula duplica todo seu genoma cada vez que se divide em duas célulasfilhas Entretanto acidentes ocasionalmente resultam em duplicação inapropriada de apenas parte do genoma com retenção de segmentos originais e duplicados em uma única célula Uma vez que um gene tenha sido duplicado dessa forma uma das duas cópias gênicas estará livre para sofrer mutações e tornarse especializada para realizar fun ções diferentes dentro da mesma célula Repetições desse processo de duplicação e de divergência por muitos milhões de anos possibilitaram que um gene formasse famí lias gênicas que podem ser encontradas em um único genoma A análise da sequência de DNA dos genomas procarióticos revela vários exemplos de tais famílias gênicas na bactéria Bacillus subtilis por exemplo 47 dos genes possuem um ou mais genes relacionados óbvios Figura 120 Quando os genes duplicam e divergem dessa maneira os indivíduos de uma es pécie tornamse dotados de múltiplas variantes de um gene primordial Esse processo evolutivo deve ser distinguido da divergência genética que ocorre quando uma espécie de organismo se divide em duas linhas separadas de descendentes em um determinado ponto do ramo da árvore genealógica quando a linhagem humana de ancestrais se tor nou separada da linhagem dos chimpanzés por exemplo Ali os genes gradualmente se tornaram diferentes no curso da evolução mas provavelmente continuam a ter funções correspondentes nas duas espécies irmãs Os genes que estão relacionados por descen dência dessa maneira isto é genes de duas espécies diferentes que derivam do mesmo gene ancestral do último ancestral comum dessas duas espécies são denominados or tólogos Os genes relacionados que resultaram de um evento de duplicação gênica em Figura 119 Quatro modos de ino vação genética e seus efeitos sobre a sequência de DNA de um organis mo Uma forma especial de transferência horizontal ocorre quando dois tipos dife rentes de células iniciam uma associação simbiótica permanente Os genes de uma das células podem então ser transferidos ao genoma da outra como veremos a seguir na discussão sobre mitocôndrias e cloroplastos 1 Gene MUTAÇÃO INTRAGÊNICA GENOMA ORIGINAL INOVAÇÃO GENÉTICA 2 DUPLICAÇÃO GÊNICA 3 4 EMBARALHAMENTO DE SEGMENTO DE DNA TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL Gene A Gene B Organismo B Organismo B com o gene novo Organismo A Mutação 18 PARTE I Introdução à célula um único genoma e que provavelmente divergiram na sua função são denominados parálogos Os genes que estão relacionados por descendência de alguma das duas ma neiras são chamados de homólogos um termo geral usado para abranger os dois tipos de relação Figura 121 Os genes podem ser transferidos entre organismos tanto no laboratório quanto na natureza Os procariotos fornecem bons exemplos da transferência horizontal de genes de uma espécie de célula para outra Os sinais reveladores mais óbvios são sequências reconhe cidas como derivadas de vírus chamados bacteriófagos que infectam bactérias Figura 122 Os vírus são pequenos pacotes de material genético que evoluíram como parasi tas na maquinaria reprodutiva e biossintética das células hospedeiras Embora eles pró prios não sejam células vivas podem frequentemente servir como vetores para transfe rência genética Um vírus irá replicar em uma célula emergir dela com um envoltório protetor e então penetrará e infectará outra célula que pode ser da mesma espécie ou de espécie diferente Frequentemente a célula infectada será morta pela proliferação massiva de partículas virais em seu interior algumas vezes contudo o DNA viral em vez de gerar diretamente essas partículas poderá persistir no seu hospedeiro por muitas gerações celulares como um passageiro relativamente inócuo tanto como um fragmen to de DNA intracelular individualizado conhecido como plasmídeo quanto como uma sequência inserida no genoma habitual da célula Nessas transferências os vírus podem acidentalmente trazer fragmentos do DNA genômico de uma célula hospedeira e trans portálos para outra célula Tais transferências de material genético são muito comuns em procariotos As transferências horizontais de genes entre células eucarióticas de diferentes espé cies são muito raras e não parece que tenham tido papel significativo na evolução eucari ótica embora transferências massivas de genomas bacterianos para eucarióticos tenham ocorrido na evolução de mitocôndrias e cloroplastos como discutiremos a seguir Em contrapartida as transferências horizontais de genes ocorrem mais frequentemente entre Figura 120 Famílias de genes relacio nados evolutivamente no genoma de Bacillus subtilis A maior família de genes dessa bactéria consiste em 77 genes que codificam variedades de transportadores ABC uma classe de proteínas transporta doras de membrana encontrada em todos os três domínios do mundo vivo Adap tada de F Kunst et al Nature 390249 256 1997 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd 283 genes em famílias com 3877 genes associados 2126 genes em famílias sem genes associados 764 genes em famílias com 419 genes associados 568 genes em famílias com 2 genes associados 273 genes em famílias com 3 genes associados Figura 121 Genes parálogos e genes ortólogos os dois tipos de homologia de genes com base em caminhos evolutivos diferentes A Ortólogos B Parálogos Gene GA Gene G Gene GB Gene G1 Gene G2 ESPECIAÇÃO DANDO ORIGEM A DUAS ESPÉCIES DISTINTAS DUPLICAÇÃO GÊNICA E DIVERGÊNCIA Organismo ancestral Gene G Organismo ancestral Organismo derivado Espécie A Espécie B Genes GA e GB são ortólogos A Genes G1 e G2 são parálogos B CAPíTulo 1 Células e genomas 19 diferentes espécies de procariotos Muitos procariotos têm uma notável capacidade de captar até mesmo moléculas de DNA não viral de sua vizinhança e desse modo capturar a informação genética que essas moléculas carregam Dessa forma ou pela transferên cia mediada por vírus as bactérias e arqueias na natureza podem adquirir genes de suas células vizinhas de maneira relativamente fácil Os genes que conferem resistência a um antibiótico ou capacidade de produzir uma toxina por exemplo podem ser transferidos de espécie para espécie fornecendo à bactéria receptora uma vantagem seletiva Desse modo a evolução de novas e algumas vezes perigosas linhagens de bactérias foi obser vada em ecossistemas bacterianos em hospitais ou em diversos nichos do corpo humano Por exemplo a transferência horizontal de gene é a responsável pela propagação ao lon go dos últimos 40 anos de linhagens resistentes à penicilina de Neisseria gonorrhoeae a bactéria que causa gonorreia Em uma escala de tempo mais longa os resultados podem ser ainda mais profundos estimase que pelo menos 18 de todos os genes presentes no genoma atual de E coli tenham sido adquiridos por transferência horizontal de outras espécies nos últimos cem milhões de anos O sexo resulta em trocas horizontais da informação genética em uma mesma espécie A transferência horizontal de genes entre procariotos possui paralelo em um fenômeno familiar a todos nós o sexo Além da usual transferência vertical do material genético dos pais à progênie a reprodução sexual promove uma transferência horizontal de in formação genética em grande escala entre duas linhagens celulares inicialmente distin tas as do pai e as da mãe Uma característicachave do sexo obviamente é que a troca genética normalmente ocorre somente entre indivíduos da mesma espécie Não importa se ocorre dentro de uma espécie ou entre espécies a transferência horizontal de genes deixa uma marca característica ela resulta em indivíduos que estão mais relacionados a um conjunto de parentes no que diz respeito a alguns genes e mais relacionados a outro conjunto de parentes para outros genes Comparandose as sequências de DNA de geno Figura 122 Transferência viral de DNA para uma célula A Micrografia eletrôni ca de partículas de um vírus bacteriano o bacteriófago T4 A cabeça do vírus contém o DNA viral a cauda contém o aparato para injetar o DNA em uma bactéria hos pedeira B Corte transversal de E coli com um bacteriófago de T4 aderido à sua superfície Os grandes objetos escuros dentro da bactéria são as novas partículas de T4 durante a sua montagem Quando eles estiverem maduros a bactéria se rom perá para liberálos CE Processo de inje ção do DNA na bactéria como visualizado por criomicroscopia eletrônica de amostras congeladas e não marcadas C Início da ligação D Estado ligado durante a inje ção de DNA E A cabeça do vírus trans feriu todo o seu DNA para o interior da bactéria A cortesia de James Paulson B cortesia de Jonathan King e Erika Hartwig de G Karp Cell and Molecular Biology 2 a ed Nova York John Wiley Sons 1999 Com permissão de John Wiley Sons CE cortesia de Ian Molineux University of Texas at Austin e Jun Liu University of Texas Health Science Center Houston A C D E B 100 nm 100 nm 100 nm 20 PARTE I Introdução à célula mas humanos individuais um visitante inteligente de outro planeta poderia deduzir que os humanos se reproduzem de forma sexuada mesmo se ele não soubesse nada sobre o comportamento humano A reprodução sexual é comum embora não universal em especial entre os euca riotos Até mesmo as bactérias realizam de tempos em tempos trocas sexuais controla das de DNA com outros membros de sua própria espécie A seleção natural claramente favoreceu os organismos que podem se reproduzir de forma sexuada embora os teóricos evolutivos ainda discutam qual seria essa vantagem seletiva A função de um gene frequentemente pode ser deduzida a partir de sua sequência As relações familiares entre os genes são importantes não apenas pelo seu interesse his tórico mas também porque simplificam a tarefa de decifrar as funções gênicas Uma vez que a sequência de um gene recémdescoberto tenha sido determinada um cientista pode utilizando um computador pesquisar por genes relacionados no banco de dados inteiro de sequências gênicas conhecidas Em muitos casos a função de um ou mais des ses homólogos já terá sido determinada experimentalmente Como a sequência do gene determina a sua função podese frequentemente fazer um bom palpite sobre a função do novo gene é provável que seja semelhante à dos homólogos já conhecidos Desse modo é possível decifrar grande parte da biologia de um organismo sim plesmente analisando a sequência de DNA do seu genoma e usando as informações que já temos sobre as funções dos genes em outros organismos que foram mais intensamen te estudados Mais de 200 famílias de genes são comuns a todos os três ramos primários da árvore da vida Dada a sequência gênica completa de organismos representativos de todos os três do mínios arqueias bactérias e eucariotos podemos pesquisar de forma sistemática as homologias que se estendem por essa enorme divisão evolutiva Dessa forma podemos começar a fazer um levantamento da herança comum de todos os seres vivos Existem dificuldades consideráveis nessa iniciativa Por exemplo espécies individuais com fre quência perderam alguns dos genes ancestrais outros genes provavelmente foram ad quiridos por transferência horizontal de outras espécies e portanto não são verdadei ramente ancestrais mesmo que compartilhados De fato as comparações de genomas sugerem fortemente que tanto a perda de genes de linhagens específicas quanto a trans ferência horizontal de genes em alguns casos entre espécies evolutivamente distantes têm sido os principais fatores da evolução pelo menos entre os procariotos Finalmente no curso de 2 ou 3 bilhões de anos alguns genes que inicialmente eram compartilhados terão mudado de forma irreconhecível por meio de mutações Devido a todos esses caprichos do processo evolutivo parece que somente uma pequena proporção de famílias gênicas ancestrais mantevese universalmente reconhe cível Assim das 4873 famílias gênicas codificadoras de proteínas definidas por com paração dos genomas de 50 bactérias 13 arqueias e 3 eucariotos unicelulares somente 63 são verdadeiramente ubíquas ou seja representadas em todos os genomas analisa dos A grande maioria dessas famílias universais inclui componentes dos sistemas de tradução e de transcrição Não é provável que isso seja uma aproximação realista de um conjunto genético ancestral Uma ideia melhor embora ainda não concluída desse conjunto genético ancestral pode ser obtida comparandose as famílias de genes que possuem representantes em múltiplas espécies mas não necessariamente em todas dos três principais domínios Tal análise revela 264 famílias ancestrais conservadas A cada família pode ser atribuída uma função pelo menos em termos de atividade bio química geral mas geralmente com mais precisão Como mostrado na Tabela 11 o maior número de famílias de genes compartilhados é dos envolvidos na tradução e no metabolismo e transporte de aminoácidos Entretanto esse conjunto de famílias de ge nes altamente conservados representa somente um esboço muito grosseiro da herança comum de toda a vida moderna Esperase que uma reconstrução mais precisa do com 22 PARTE I Introdução à célula como cada uma das partes da molécula determinada geneticamente contribui para seu comportamento químico Os biólogos celulares podem analisar o comportamento das células que são manipuladas para expressar uma versão mutante do gene Não há entretanto uma receita simples para se descobrir a função de um gene e nem critério universal simples para descrevêla Nós podemos descobrir por exem plo que o produto de determinado gene catalisa uma certa reação química e mesmo assim não termos ideia de como ou por que tal reação é importante para o organismo A caracterização funcional de cada nova família de produtos gênicos diferentemente da descrição das sequências gênicas apresenta um novo desafio para a criatividade dos biólogos Além disso nunca entenderemos completamente a função de um gene até que aprendamos seu papel na vida do organismo como um todo Para estabelecer de forma definitiva o sentido da função gênica portanto temos que estudar todo o organismo não somente moléculas ou células A biologia molecular iniciou com as suas atenções voltadas à E coli Como os organismos vivos são muito complexos quanto mais aprendemos sobre qual quer espécie em particular mais atrativa ela se torna como objeto de estudos adicio nais Cada descoberta levanta novas questões e fornece novas ferramentas com as quais podemos abordar questões gerais no contexto do organismo escolhido Por essa razão grandes comunidades de biólogos têm se dedicado a estudar diferentes aspectos do mesmo organismomodelo No princípio da biologia molecular as atenções foram dedicadas intensamente a apenas uma espécie a bactéria Escherichia coli ou E coli ver Figuras 113 e 114 Essa pequena célula bacteriana em forma de bastão normalmente vive no intestino de huma nos e de outros vertebrados mas ela facilmente pode ser cultivada em um meio simples de nutrientes em um frasco de cultura Ela se adapta a condições químicas variáveis e se reproduz de forma rápida podendo evoluir por meio de mutação e de seleção a uma velocidade extraordinária Como em outras bactérias diferentes linhagens de E coli embora classificadas como membros de uma mesma espécie diferemse geneticamente em um grau muito maior do que variedades diferentes de organismos que se reprodu zem de forma sexuada como plantas ou animais Uma linhagem de E coli pode possuir centenas de genes que estão ausentes em outra e as duas linhagens podem ter apenas 50 de seus genes em comum A cepapadrão de laboratório E coli K12 tem um geno ma de aproximadamente 46 milhões de pares de nucleotídeos contidos em uma úni ca molécula de DNA circular que codifica cerca de 4300 tipos diferentes de proteínas Figura 124 Em termos moleculares sabemos mais sobre a E coli do que sobre qualquer outro organismo vivo Grande parte do que entendemos sobre os mecanismos fundamentais da vida por exemplo como as células replicam o seu DNA ou como elas decodificam as instruções representadas no DNA para controlar a síntese de proteínas específicas veio inicialmente de estudos com E coli Os mecanismos genéticos básicos foram al tamente conservados ao longo da evolução esses mecanismos são essencialmente os mesmos em nossas próprias células assim como na E coli Resumo Os procariotos células sem um núcleo distinto são os organismos bioquimicamente mais diversos incluindo espécies que podem obter toda a sua energia e os seus nutrientes de fon tes químicas inorgânicas como misturas reativas de minerais liberados em fendas hidro termais no fundo do mar o tipo de dieta que pode ter nutrido as primeiras células vivas há 35 bilhões de anos Comparações de sequências de DNA revelam o relacionamento familiar de organismos vivos e mostram que os procariotos se dividem em dois grupos que divergiram cedo no curso da evolução as bactérias eubactérias e as arqueias Juntamen te com os eucariotos células com um núcleo envolvido por membrana constituem os três ramos principais da árvore da vida CAPíTulo 1 Células e genomas 23 A maioria das bactérias e arqueias são organismos unicelulares pequenos com ge nomas compactos compreendendo de 1000 a 6000 genes Vários dos genes dentro de um único organismo mostram grande semelhança em suas sequências de DNA sugerindo que tenham se originado do mesmo gene ancestral por duplicação e divergência gênica As se melhanças nas famílias de genes homologias também são claras quando sequências gênicas são comparadas entre diferentes espécies e mais de 200 famílias de genes foram tão altamente conservadas que podem ser reconhecidas como comuns à maioria das es pécies dos três domínios do mundo vivo Portanto dada uma sequência de DNA de um gene novo descoberto frequentemente é possível deduzir a sua função a partir da função conhecida para um gene homólogo em um organismo modelo intensivamente estudado como a bactéria E coli A INFORMAÇÃO GENÉTICA EM EUCARIOTOS Em geral as células eucarióticas são maiores e mais complexas que as células proca rióticas e seus genomas também são maiores e mais complexos O tamanho maior é acompanhado por diferenças radicais nas estruturas e nas funções celulares Além disso muitas classes de células eucarióticas formam organismos multicelulares que atingem níveis de complexidade inalcançáveis pelos procariotos Por serem tão complexos os eucariotos confrontam os biólogos moleculares com desafios especiais nos quais passaremos a nos concentrar ao longo deste livro Cada vez A 4639221 pares de nucleotídeos Escherichia coli K12 Origem de replicação Término da replicação B Figura 124 O genoma da E coli A Um grupo de células de E coli B Um diagrama do genoma de E coli linhagem K12 O diagrama é circular porque o DNA de E coli como o de outros procariotos forma um único círculo fechado Os genes codificadores de proteínas são mostrados como barras amarelas ou laranjas dependendo da fita de DNA a partir da qual são transcritos os genes que codificam somente moléculas de RNA são indicados com setas verdes Alguns genes são transcritos a partir de uma das fitas de DNA de duplahélice na direção horária deste diagrama outros a partir da outra fita no sentido antihorário A cortesia do Dr Tony Brain e David ParkerPhoto Researchers B adaptada de FR Blattner et al Science 27714531462 1997 26 PARTE I Introdução à célula proporcionaram aos seus hospedeiros Acreditase que essa parceria entre uma célula predadora anaeróbica primitiva e uma célula bacteriana aeróbica foi estabelecida há aproximadamente 15 bilhão de anos quando a atmosfera da Terra se tornou rica em oxigênio pela primeira vez Como indicado na Figura 129 análises genômicas recentes sugerem que a pri meira célula eucariótica se formou depois que uma célula de arqueia engolfou uma bactéria aeróbica Isso explicaria por que todas as células eucarióticas atuais incluindo aquelas que vivem estritamente como anaeróbicas mostram clara evidência de que al guma vez possuíram mitocôndrias Muitas células eucarióticas especialmente as de plantas e algas também con têm outra classe de pequenas organelas delimitadas por membrana um tanto parecidas com as mitocôndrias os cloroplastos Figura 130 Os cloroplastos realizam a fotos síntese usando a energia da luz solar para sintetizar carboidratos a partir de dióxido de carbono atmosférico e água e liberam os produtos para a célula hospedeira na forma de alimento Como as mitocôndrias os cloroplastos têm seu próprio genoma Eles quase certamente se originaram como bactérias fotossintetizantes simbióticas adquiridas pe las células eucarióticas que já possuíam mitocôndrias Figura 131 Uma célula eucariótica equipada com cloroplastos não tem necessidade de buscar outras células como presa ela é nutrida pelos cloroplastos cativos que herdou de seus ancestrais De forma correspondente as células vegetais apesar de possuírem o cito esqueleto para movimento perderam a capacidade de alterar sua forma rapidamente e de englobar outras células por fagocitose Ao contrário elas criam ao seu redor uma rígida parede celular protetora Se as primeiras células eucarióticas fossem predadoras de outros organismos poderíamos ver as células vegetais como células que fizeram a transição da caça para a lavoura Os fungos representam ainda outro modo de vida eucariótica As células fúngi cas assim como as células animais possuem mitocôndrias mas não cloroplastos no entanto ao contrário das células animais e dos protozoários elas possuem uma parede externa rígida que limita sua capacidade de se mover de forma rápida ou de engolfar Figura 128 Mitocôndria A Corte transversal de microscopia eletrônica B Ilustração de uma mitocôndria com uma parte cortada para mostrar a estrutu ra tridimensional Animação 12 C Um esquema da célula eucariótica com o espaço interno de uma mitocôn dria contendo o DNA e os ribossomos mi tocondriais colorido Observe a membra na externa lisa e a membrana interna com circunvoluções que abriga as proteínas que geram ATP a partir da oxidação de moléculas do alimento A cortesia de Daniel S Friend A 100 nm B C 28 PARTE I Introdução à célula Muitos dos genes que estão ausentes nas mitocôndrias e nos cloroplastos não foram perdidos ao contrário eles moveramse do genoma simbionte para o DNA no núcleo da célula hospedeira O DNA nuclear dos humanos contém muitos genes que codificam proteínas com funções essenciais dentro da mitocôndria nas plantas o DNA nuclear também contém muitos genes especificando proteínas necessárias nos cloroplastos Em ambos casos as sequências de DNA desses genes nucleares mos tram clara evidência de sua origem a partir do ancestral bacteriano das respectivas organelas Os genomas eucarióticos são grandes A seleção natural evidentemente favoreceu as mitocôndrias com genomas pequenos Em contraste os genomas nucleares da maioria dos eucariotos teve a possibilidade de aumentar Talvez o modo de vida eucariótico tenha feito do grande tamanho uma van tagem os predadores geralmente precisam ser maiores do que suas presas e o tamanho celular normalmente aumenta em proporção ao tamanho do genoma Seja qual for a ra zão auxiliados por um acúmulo massivo de segmentos de DNA derivados de elementos transponíveis parasitários discutido no Capítulo 5 os genomas da maioria dos eucario tos se tornaram ordens de magnitudes maiores que aqueles das bactérias e das arqueias Figura 132 A liberdade de ser pródigo com o DNA teve implicações profundas Os eucariotos não só possuem mais genes do que os procariotos eles também têm muito mais DNA que não codifica proteína O genoma humano contém mil vezes mais pares de nucleo tídeos que o genoma de uma bactéria típica talvez dez vezes mais genes e muito mais Bactéria fotossintetizante Célula eucariótica inicial Célula eucariótica capaz de realizar fotossíntese Cloroplastos Figura 131 Origem dos cloroplas tos Uma célula eucariótica inicial que já possuía uma mitocôndria engolfou uma bactéria fotossintetizante uma cianobac téria e a reteve em simbiose Acreditase que os cloroplastos de hoje tracem sua an cestralidade até a única espécie de ciano bactéria que foi adotada como simbionte interno um endossimbionte há mais de 1 bilhão de anos 106 105 107 108 109 1010 1011 1012 Pares de nucleotídeos por genoma haploide MAMÍFEROS AVES RÉPTEIS ANFÍBIOS PEIXES CRUSTÁCEOS INSETOS PLANTAS ALGAS VERMES NEMATÓDEOS FUNGOS PROTOZOÁRIOS BACTÉRIAS ARQUEIAS Humano Rã Tritão Drosophila Caenorhabditis Camarão Parasita da malária Ameba Arabidopsis Trigo Levedura E coli Peixezebra Fugu Lírio Mycoplasma Figura 132 Comparação dos tama nhos de genomas O tamanho genômico é medido em pares de nucleotídeos de DNA por genoma haploide isto é por cópia simples do genoma As células de organismos que se reproduzem sexuada mente como os dos humanos geralmente são diploides elas contêm duas cópias do genoma uma herdada da mãe e outra do pai Organismos intimamente relaciona dos podem apresentar grande variedade quanto à quantidade de DNA em seus genomas ainda que contenham números semelhantes de genes funcionalmente distintos Dados de WH Li Molecular Evolution p 380383 Sunderland MA Sinauer 1997 30 PARTE I Introdução à célula Um grande número de genes no genoma eucariótico codifica proteínas que ser vem para regular a atividade de outros genes A maioria desses reguladores de transcri ção atua ligandose direta ou indiretamente ao DNA regulador adjacente aos genes que devem ser controlados ou interferindo com a capacidade de se ligar ao DNA de outras proteínas O genoma expandido dos eucariotos portanto não somente especifica o hardware da célula mas também armazena o software que controla como esse hardware é utilizado Figura 134 As células não recebem sinais apenas de forma passiva pelo contrário elas trocam ativamente sinais com sua vizinhança Assim em um organismo multicelular em desen volvimento o mesmo sistema de controle governa cada célula mas com consequências diferentes dependendo das mensagens trocadas Espantosamente o resultado é um ar ranjo preciso de células em diferentes condições cada qual apresentando uma caracte rística apropriada para sua posição na estrutura multicelular Muitos eucariotos vivem como células solitárias Muitas espécies de células eucarióticas levam uma vida solitária algumas como ca çadoras protozoários algumas como fotossintetizantes algas unicelulares e algumas como organismos que se alimentam de restos de alimentos fungos unicelulares ou le veduras A Figura 135 ilustra parte da variedade surpreendente de eucariotos unice lulares A anatomia dos protozoários em especial com frequência é elaborada e inclui estruturas como cerdas sensoriais fotorreceptores cílios que se movimentam de forma sinuosa apêndices que se parecem com pernas partes de boca dardos urticantes e feixes contráteis parecidos com músculo Embora sejam unicelulares os protozoários podem ser tão elaborados tão versáteis e tão complexos em seu comportamento como muitos organismos multicelulares ver Figura 127 Animações 14 e 15 Em termos de sua ancestralidade e suas sequências de DNA os eucariotos unice lulares são muito mais diversos do que os animais multicelulares as plantas e os fungos que se originaram como três ramos comparativamente tardios da linhagem eucariótica ver Figura 117 Assim como para os procariotos os humanos tendem a negligenciá los por serem microscópicos Somente agora com a ajuda de análises genômicas esta mos começando a entender suas posições na árvore da vida e a colocar em contexto os índicios que essas estranhas criaturas podem nos oferecer a respeito de nosso distante passado evolutivo Uma levedura serve como um modelo mínimo de eucarioto A complexidade genética e molecular dos eucariotos é assustadora Mais até do que para os procariotos os biólogos precisam concentrar seus recursos limitados nos poucos or ganismosmodelo selecionados para revelar essa complexidade Figura 134 Controle genético do programa de desenvolvimento multi celular O papel de um gene regulador é demonstrado na ervabezerra Antirrhinum Neste exemplo uma mutação em um úni co gene que codifica uma proteína regula dora leva ao desenvolvimento de folhas no lugar de flores por causa de uma proteína reguladora alterada as células adotam características que seriam apropriadas para uma localização diferente na planta normal O mutante está à esquerda e a planta normal está à direita Cortesia de Enrico Coen e Rosemary Carpenter 32 PARTE I Introdução à célula cies decifraram muitos processos cruciais incluindo o ciclo de divisão celular eucarió tica a cadeia crítica de eventos pelos quais o núcleo e todos os outros componentes de uma célula são duplicados e separados para dar origem a duas célulasfilhas a partir de uma O sistema de controle que governa esse processo tem sido tão bem conservado ao longo do curso da evolução que muitos de seus componentes podem funcionar de ma neira intercambiável em leveduras e em células humanas se uma levedura mutante na qual falta um gene essencial do ciclo de divisão celular da levedura é suprida com uma cópia do gene homólogo do ciclo de divisão celular de um humano a levedura é curada do seu defeito e se torna apta a se dividir normalmente Os níveis de expressão de todos os genes de um organismo podem ser monitorados simultaneamente A sequência genômica completa de S cerevisiae determinada em 1997 consiste em aproximadamente 13117000 pares de nucleotídeos incluindo a pequena contribuição 78520 pares de nucleotídeos do DNA mitocondrial Esse total representa somente cer ca de 25 vezes mais DNA do que há em E coli e codifica apenas 15 vez mais proteínas diferentes aproximadamente 6600 no total O modo de vida da S cerevisiae é seme lhante em muitos pontos ao de uma bactéria e parece que essa levedura também tem sido objeto de pressões seletivas que mantiveram o seu genoma compacto O conhecimento da sequência genômica completa de qualquer organismo seja uma levedura ou um humano abre novas perspectivas sobre o funcionamento da cé lula algo que antes parecia extremamente complexo agora parece estar ao nosso alcan ce Usando técnicas descritas no Capítulo 8 agora é possível por exemplo monitorar de forma simultânea a quantidade de mRNA transcrito que cada gene produz no genoma da levedura sob qualquer condição escolhida e verificar como esse padrão na atividade gênica muda quando as condições mudam A análise pode ser repetida com o mRNA pre parado de células mutantes sem um gene específico qualquer gene que quiséssemos testar A princípio essa metodologia fornece um caminho para revelar todo o sistema do controle das relações que governam a expressão gênica não somente em células de le vedura mas também em qualquer organismo cuja sequência genômica seja conhecida A Arabidopsis foi escolhida dentre 300 mil espécies como uma plantamodelo Os maiores organismos multicelulares que vemos ao nosso redor as flores as árvores e os animais parecem fantasticamente variados mas são mais próximos uns dos ou tros em suas origens evolutivas e mais similares em sua biologia celular básica do que o maior hospedeiro dos organismos unicelulares microscópicos Portanto enquanto as bactérias e as arqueias estão separadas por talvez 35 bilhões de anos de evolução os vertebrados e os insetos estão separados por aproximadamente 700 milhões de anos os peixes e os mamíferos por aproximadamente 450 milhões de anos e as diferentes es pécies de plantas fanerógamas por somente 150 milhões de anos Devido à relação evolutiva próxima entre todas as plantas fanerógamas podemos novamente ter uma ideia da biologia celular e molecular de toda essa classe de orga nismos concentrandonos somente em uma ou algumas poucas espécies para análises detalhadas Entre as várias centenas de milhares de espécies de plantas fanerógamas existentes hoje na Terra os biólogos moleculares escolheram concentrar os seus esfor ços em uma pequena erva a Arabidopsis thaliana Figura 138 que pode ser cultivada Figura 137 Ciclos reprodutivos da levedura S cerevisiae Dependendo das condições ambientais e de detalhes do genótipo as células dessa espécie podem existir tanto em um estado diploide 2n com um conjunto duplo de cromosso mos quanto em um estado haploide n com um único conjunto cromossômico A forma diploide pode proliferar por ciclos de divisão celular usuais ou sofrer meiose para produzir células haploides A forma haploide pode proliferar por ciclos de divisão celular usuais ou sofrer fusão sexual com uma outra célula ha ploide para tornarse diploide A meiose é ativada por privação alimentar e origi na esporos células haploides em um estado dormente resistentes a condições ambientais extremas 2n 2n 2n 2n n n n n n n Proliferação de células diploides Meiose e esporulação desencadeada por privação alimentar Eclosão do esporo Proliferação de células haploides CICLO CELULAR DA LEVEDURA EM BROTAMENTO Cruzamento geralmente logo em seguida da eclosão do esporo n n CAPíTulo 1 Células e genomas 33 em ambientes fechados em grandes quantidades e produzir milhares de descendentes por planta após 8 a 10 semanas A Arabidopsis tem um genoma com tamanho total de aproximadamente 220 milhões de pares de nucleotídeos cerca de 17 vezes maior que o da levedura ver Tabela 12 O mundo das células animais é representado por um verme uma mosca um peixe um camundongo e um humano Os animais multicelulares correspondem à maior parte de todas as espécies conhecidas de organismos vivos e pela maior parte dos esforços da pesquisa biológica Cinco espé cies emergiram como os principais organismosmodelo para os estudos de genética mo lecular Em ordem crescente de tamanho eles são o verme nematódeo Caenorhabditis elegans a mosca Drosophila melanogaster o peixezebra Danio rerio o camundongo Mus musculus e o humano Homo sapiens Cada um teve seu genoma sequenciado O C elegans Figura 139 é um verme pequeno e inofensivo parente dos vermes cilíndricos que atacam plantações Com um ciclo de vida de apenas poucos dias uma capacidade de sobreviver no congelador indefinidamente em um estado de vida laten te um plano corporal simples e um ciclo de vida incomum que é adequado para es tudos genéticos descrito no Capítulo 21 é um organismomodelo ideal O C elegans desenvolvese com precisão a partir de um óvulo fertilizado até o verme adulto com exatamente 959 células corporais mais um número variável de célulasovo e de esper matozoides um grau incomum de regularidade para um animal Temos agora uma descrição minuciosa da sequência de eventos pela qual isso ocorre como as células se dividem movemse e alteram suas características de acordo com regras exatas e previ síveis O genoma de 130 milhões de pares de nucleotídeos codifica aproximadamente 21 mil proteínas e muitos mutantes e outras ferramentas estão disponíveis para testar as funções gênicas Embora o verme tenha um plano corporal muito diferente do nosso a conservação de mecanismos biológicos tem sido suficiente para que o verme seja um ótimo modelo para muitos dos processos de desenvolvimento e da biologia da célula que ocorrem no corpo humano Assim por exemplo estudos com o verme têm sido cru ciais para nos ajudar a entender os programas de divisão celular e morte celular que determinam o número de células do corpo um tópico de grande importância para a biologia do desenvolvimento e a pesquisa sobre câncer Os estudos com Drosophila proporcionam entendimento sobre o desenvolvimento dos vertebrados A moscadasfrutas D melanogaster Figura 140 tem sido utilizada como um organis mo genético modelo por mais tempo do que qualquer outro de fato os fundamentos da genética clássica foram construídos em grande parte com estudos sobre esse inseto Há mais de 80 anos ela forneceu por exemplo a prova definitiva de que os genes as unidades abstratas da informação hereditária são transportados nos cromossomos objetos físicos concretos cujo comportamento foi bem acompanhado nas células eucarióticas ao micros cópio óptico mas cuja função era inicialmente desconhecida A comprovação dependeu de uma das muitas características que tornam a Drosophila particularmente conveniente para a genética os cromossomos gigantes com a característica aparência de bandas que são 1 cm Figura 138 Arabidopsis thaliana a planta escolhida como modelo primá rio para o estudo da genética molecu lar de plantas Cortesia de Toni Hayden e John Innes Foundation 02 mm Figura 139 Caenorhabditis elegans o primeiro organismo multicelular que teve sua sequência genô mica completa determinada Este pequeno nematódeo de aproximadamente 1 mm de comprimento vive no solo A maioria dos indivíduos é hermafrodita produzindo tanto óvulos como espermatozoides Cortesia de Maria Gallegos University of Wisconsin Madison CAPíTulo 1 Células e genomas 35 que já foram idênticos divergiram várias das cópias gênicas foram perdidas por muta ções disruptivas alguns sofreram rodadas adicionais de duplicação local e o genoma em cada ramo da árvore genealógica dos vertebrados sofreu repetidos rearranjos alte rando a maioria das disposições originais dos genes A comparação da disposição gênica em dois organismos relacionados como o humano e o camundongo revela que na escala de tempo da evolução dos vertebrados os cromossomos frequentemente se fun dem e se fragmentam para mover grandes blocos de sequências de DNA De fato é mais possível como discutido no Capítulo 4 que a presente situação de acontecimentos seja o resultado de muitas duplicações independentes de fragmentos do genoma do que a duplicação do genoma como um todo Entretanto não há dúvidas de que tais duplicações do genoma inteiro ocorram de tempos em tempos na evolução pois podemos encontrar exemplos recentes nos quais grupos duplicados de cromossomos ainda são claramente identificáveis como tais O gê nero de rã Xenopus por exemplo compreende um grupo de espécies muito semelhantes relacionadas umas às outras por repetições duplas ou triplas de todo o genoma Entre essas rãs estão a X tropicalis com o genoma diploide original a espécie comum de la boratório X laevis com um genoma duplicado e duas vezes mais DNA por célula e o X ruwenzoriensis com o genoma original duplicado seis vezes e seis vezes mais DNA por célula p ex 108 cromossomos comparado com 36 em X laevis Estimase que essas espécies tenham divergido uma da outra nos últimos 120 milhões de anos Figura 142 A rã e o peixezebra proporcionam modelos acessíveis para o desenvolvimento dos vertebrados As rãs têm sido usadas há muito tempo para estudar os estágios iniciais do desenvolvi mento embrionário dos vertebrados pois seus ovos são grandes fáceis de manipular e são fertilizados fora do animal de forma que o desenvolvimento subsequente é facil mente observado Figura 143 A rã Xenopus laevis em particular continua a ser um organismomodelo importante mesmo que seja pouco adequado para análises genéti cas Animação 16 e 211 O peixezebra D rerio possui vantagens similares mas sem esse inconveniente Seu genoma é compacto somente a metade do genoma de camundongo ou humano e tem um tempo de geração de apenas três meses Muitos mutantes são conhecidos e a engenharia genética é relativamente fácil O peixezebra tem a característica adicional de ser transparente nas primeiras duas semanas de sua vida de forma que é possível ob servar o comportamento de células individuais no organismo vivo ver Animação 212 Tudo isso o tornou um modelo de vertebrado cada vez mais importante Figura 144 O camundongo é o organismomodelo predominante de mamíferos Os mamíferos geralmente têm duas vezes mais genes do que a Drosophila um genoma que é 16 vezes maior e que tem milhões ou bilhões de vezes mais células em seu corpo adulto Em termos de tamanho e de função de genoma de biologia celular e de mecanismos mole culares os mamíferos são contudo um grupo altamente uniforme de organismos Até ana tomicamente as diferenças entre os mamíferos são principalmente uma questão de tama nho e de proporções é difícil pensar em uma parte do corpo humano que não possua uma contraparte em elefantes e em camundongos e viceversa A evolução brinca livremente com traços quantitativos mas ela não muda prontamente a lógica da estrutura Para uma medida mais exata de quanto as espécies de mamíferos assemelham se geneticamente uma com a outra podemos comparar as sequências de nucleotídeos de genes correspondentes ortólogos ou as sequências de aminoácidos das proteínas Figura 142 Duas espécies de rãs do gênero Xenopus A X tropicalis em cima apresenta o genoma diploide original o X laevis embaixo tem duas vezes mais DNA por célula A partir dos padrões de bandeamento de seus cromossomos e o arranjo dos genes ao longo deles assim como de comparações das sequências gênicas é claro que as espécies com genoma maior evoluíram por meio de duplicações de todo o genoma Acreditase que essas duplicações ocorreram como consequência de cruzamentos entre rãs de espécies ligeiramente divergentes de Xenopus Cortesia de E Amaya M Offield e R Grainger Trends Genet 14253255 1998 Com permissão da Elsevier 36 PARTE I Introdução à célula Horas 0 6 16 34 67 96 284 1 mm Zigoto Mórula Blástula Gástrula Nêurula Broto caudal Girino Figura 143 Estágios do desenvolvimento normal de uma rã As ilustrações mostram o desenvolvimento de um girino de Rana pipiens a partir de um ovo fertilizado Todo o processo ocorre fora da mãe tornando os mecanismos envolvidos prontamente acessíveis para estudos experimentais De W Shumway Anat Rec 78139147 1940 que esses genes codificam Os resultados para cada gene e proteína variam bastante No entanto em geral se alinharmos a sequência de aminoácidos de uma proteína humana com a de uma proteína ortóloga digamos de um elefante aproximadamente 85 dos aminoácidos serão idênticos Uma comparação parecida entre humano e ave mostra uma identidade de aminoácidos de aproximadamente 70 duas vezes mais diferenças pois as linhagens de ave e de mamíferos tiveram duas vezes mais tempo para divergir do que as de elefante e de humano Figura 145 O camundongo sendo pequeno robusto e um reprodutor rápido tornouse o organismomodelo preferido para os estudos experimentais de genética molecular de vertebrados Muitas mutações de ocorrência natural são conhecidas em geral mimetizando os efeitos de mutações correspondentes em humanos Figura 146 Além disso foram desenvolvidos métodos para testar a função de qualquer gene escolhido de camundongo ou de qualquer região não codificadora do genoma do camundongo por criar artificialmente mutações como explicaremos mais adiante neste livro Figura 144 O peixezebra como modelo para estudos do desenvolvimento de vertebrados Estes pequenos e resistentes peixes tropicais são convenientes para estudos genéticos Além disso eles têm embriões transparentes que se desenvolvem fora da mãe de forma que podemse observar claramente as células movendose e mudando seu caráter no organismo vivo durante o seu desenvolvimento A Peixe adulto B Um embrião 24 horas após a fertilização A com permissão de Steve Baskauf B de M Rhinn et al Neural Dev 412 2009 A 1 cm B 150 μm CAPÍTULO 1 Células e genomas 37 Figura 145 Tempos de divergência de diferentes vertebrados A escala do lado esquerdo mostra a data estimada e a era geológica do último ancestral comum para cada par de animais especificado Cada tempo estimado está baseado em comparações das sequências de aminoácidos de proteínas ortólogas quanto mais tempo os animais de um par tiveram para evoluir independentemente menor o percentual de aminoácidos que se manteve idêntico A escala de tempo foi calibrada para corresponder com a evidência fóssil mostrando que o último ancestral comum de mamíferos e aves viveu há 310 milhões de anos Os números do lado direito mostram os dados da divergência de uma sequência para uma proteína específica a cadeia α da hemoglobina Observe que embora haja uma tendência geral da divergência aumentar com o aumento do tempo para essa proteína há irregularidades que supostamente refletem a ação da seleção natural levando a mudanças especialmente rápidas na sequência da hemoglobina quando os organismos experimentaram demandas fisiológicas especiais Algumas proteínas sujeitas a limitações funcionais mais extremas evoluem muito mais lentamente do que a hemoglobina outras até cinco vezes mais rápido Tudo isso leva a consideráveis incertezas na estimativa dos tempos de divergência e alguns especialistas acreditam que os principais grupos de mamíferos divergiram uns dos outros até 60 milhões de anos mais recentemente do que é mostrado aqui Adaptada de S Kumar e SB Hedges Nature 392917920 1998 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Apenas um camundongo mutante feito sob encomenda pode fornecer valiosas informações para os biólogos celulares Ele revela os efeitos de uma mutação escolhida em uma variedade de contextos diferentes testando simultaneamente a ação do gene em todos os tipos diferentes de células no corpo que podem em princípio ser afetadas Os humanos relatam suas próprias peculiaridades Como humanos temos um interesse especial no nosso genoma Queremos conhecer todo o conjunto de partes das quais somos feitos e descobrir como elas funcionam Mas até mesmo se você fosse um camundongo preocupado com a biologia molecular dos camundongos os humanos seriam atrativos como modelo genético de organismos devido a uma propriedade especial por meio de exames médicos e de autorrelatos catalogamos nossas próprias doenças genéticas e outras A população humana é enorme hoje constituída por cerca de 7 bilhões de indivíduos e essa propriedade de autodocumentação significa que existe uma enorme base de dados de informação para mutações humanas A sequência do genoma humano de mais de 3 bilhões de pares de nucleotídeos foi determinada para Figura 146 Humano e camundongo genes e desenvolvimento parecidos O bebê humano e o camundongo mostrados aqui possuem manchas brancas similares nas suas testas porque ambos têm mutações no mesmo gene chamado de Kit necessário para o desenvolvimento e a manutenção das células pigmentares Cortesia de RA Fleischman 38 PARTE I Introdução à célula milhares de pessoas diferentes tornando mais fácil do que nunca identificar em nível mo lecular a mudança genética precisa para qualquer fenótipo mutante humano Reunindose as pistas a partir de humanos camundongos peixes moscas ver mes leveduras plantas e bactérias utilizando as semelhanças das sequências gênicas para mapear as correspondências entre um organismo modelo e outro estamos enri quecendo nosso entendimento sobre todos eles Somos todos diferentes nos detalhes O que exatamente queremos afirmar quando falamos sobre o genoma humano Geno ma de quem Em média quaisquer duas pessoas escolhidas ao acaso diferem em apro ximadamente 1 ou 2 a cada 1000 pares de nucleotídeos em sua sequência de DNA O genoma da espécie humana é propriamente falando uma estrutura muito complexa abrangendo o conjunto completo de variantes gênicas encontradas na população hu mana O reconhecimento dessa variação está nos ajudando a entender por exemplo por que algumas pessoas são propensas a uma doença e outras pessoas a outras doenças por que algumas respondem bem a um fármaco e outras mal Também está fornecen do pistas da nossa história os deslocamentos e interações das populações dos nossos ancestrais as infecções que eles sofreram e as dietas que comeram Todos esses fatores deixaram traços nas formas variantes dos genes que sobrevivem hoje nas comunidades humanas que habitam o globo Para entender as células e os organismos será necessário matemática computadores e informação quantitativa Impulsionados pelo conhecimento das sequências genômicas completas podemos listar os genes as proteínas e as moléculas de RNA em uma célula e temos os métodos que nos permitem começar a descrever a complexa rede de interações entre eles No entanto como iremos transformar toda essa informação em entendimento de como as células funcionam Mesmo para um único tipo celular pertencente a uma única espécie de organismo a atual avalanche de dados parece impressionante O tipo de raciocínio informal no qual os bió logos geralmente se baseiam parece totalmente inadequado em face de tal complexidade De fato a dificuldade é maior do que apenas uma questão de sobrecarga de infor mação Os sistemas biológicos por exemplo apresentam diversos sistemas de retroali mentação e até o comportamento do mais simples dos sistemas com retroalimentação é difícil de prever apenas por intuição Figura 147 pequenas mudanças nos parâmetros podem causar mudanças radicais no resultado Para ir de um diagrama de circuito para predição do comportamento de um sistema nós precisamos de informação quantitativa detalhada e para fazer deduções a partir dessa informação necessitamos da matemática e de computadores Tais ferramentas para o raciocínio quantitativo são essenciais mas outros dados são necessários Você pode pensar que sabendo como cada proteína influencia uma outra proteína e como a expressão de cada gene é regulada pelos produtos de outros genes logo seríamos capazes de calcular como a célula irá se comportar como um todo assim como um astrônomo consegue calcular as órbitas dos planetas ou um engenheiro químico pode calcular os fluxos através de uma fábrica de produtos químicos Contudo qualquer tenta tiva de realizar essa façanha para qualquer sistema semelhante a uma célula viva inteira rapidamente revela os limites do nosso conhecimento atual As informações que temos abundantes como são estão repletas de lacunas e incertezas Além disso são muito mais qualitativas do que quantitativas Frequentemente os biólogos celulares que estudam os sistemas de controle celular resumem o seu conhecimento em diagramas esquemáticos simples este livro está cheio deles em vez de números gráficos e equações diferenciais Progredir de descrições qualitativas e raciocínio intuitivo para descrições quantita tivas e deduções matemáticas é um dos maiores desafios da biologia celular contempo rânea Até o momento apenas o desafio de alguns fragmentos simples da maquinaria das células vivas foi alcançado subsistemas envolvendo pequenos conjuntos de proteínas ou dois ou três genes de regulação cruzada em que dados teóricos e experimentais são complementares Discutimos alguns desses exemplos mais adiante no livro e dedicamos a seção final do Capítulo 8 para o papel da quantificação na biologia celular DNA regulador Região codificadora do gene mRNA Proteína reguladora de transcrição Figura 147 Um circuito de regulação muito simples um único gene regulando sua própria expressão pela ligação de seu produto proteico ao seu próprio DNA regu lador Diagramas esquemáticos simples como este são encontrados ao longo deste livro Eles geralmente são usados para resumir o que nós sabemos mas eles deixam muitas questões sem resposta Quando a proteína se liga ela inibe ou estimula a transcrição do gene Qual é a relação entre a taxa de transcrição e a concen tração da proteína Quanto tempo em média uma molécula de proteína permanece ligada ao DNA Quanto tempo leva para sintetizar cada molécula de mRNA ou proteína e quão rápido cada tipo de molécula é degradada Como explicado no Capítulo 8 a modelagem mate mática mostra que precisamos de respostas quantitativas para todas estas e outras questões antes de podermos predizer o comportamento até mesmo desse sistema de um único gene Para valores de parâmetros diferentes o sis tema pode acomodarse a um único estado de equilíbrio ou pode comportarse como um interruptor capaz de existir em um ou outro de um grupo de estados alternativos ou pode oscilar ou pode apresentar grandes flutuações aleatórias CAPíTulo 1 Células e genomas 39 O conhecimento e o entendimento proporcionam poder de interferir nos humanos para evitar ou prevenir doenças nas plantas para criar cultivares melhores nas bactérias para alterálas para nosso próprio uso Todas essas iniciativas biológicas estão ligadas por que a informação genética de todos os organismos vivos está escrita na mesma linguagem A nova habilidade encontrada pelos biólogos moleculares para ler e decifrar essa lingua gem já começou a transformar nosso relacionamento com o mundo vivo O conteúdo de biologia celular nos capítulos subsequentes irá esperamos preparar o leitor para enten der e possivelmente contribuir para a grande aventura científica do século XXI Resumo As células eucarióticas por definição mantêm seu DNA em um compartimento separado por uma membrana o núcleo Além disso elas têm um citoesqueleto para suporte e movimento compartimentos intracelulares elaborados para a digestão e a secreção a capacidade em muitas espécies de englobar outras células e um metabolismo que depende da oxidação de moléculas orgânicas pela mitocôndria Essas propriedades sugerem que os eucariotos pos sam ter se originado como predadores de outras células As mitocôndrias e em plantas os cloroplastos contêm seu próprio material genético e evidentemente evoluíram de bactérias que foram assimiladas no citoplasma de células ancestrais e sobreviveram como simbiontes As células eucarióticas geralmente têm de 3 a 30 vezes mais genes que os procariotos e com frequência milhares de vezes mais DNA não codificador O DNA não codificador permite grande complexidade na regulação da expressão gênica como necessário para a construção de organismos multicelulares complexos Muitos eucariotos entretanto são unicelulares entre eles a levedura S cerevisiae que serve como um modelo simples de organismo para a biologia da célula eucariótica revelando a base molecular de muitos processos fundamentais que foram altamente conservados durante 1 bilhão de anos de evolução Um pequeno número de outros organismos também foi escolhido para estudo intensivo um verme uma mosca um peixe e um camundongo servem como organismos modelo para animais multicelulares e uma pequena erva fanerógama serve como mo delo para plantas Novas tecnologias como o sequenciamento genômico estão produzindo avanços surpreendentes sobre nosso conhecimento dos seres humanos e estão nos ajudando a avançar no nosso entendimento sobre a saúde e a doença humanas Mas os sistemas vivos são incrivelmente complexos e os genomas dos mamíferos contêm múltiplos homólogos semelhantes para a maioria dos genes Essa redundância genética permitiu a diversifica ção e a especialização de genes para novos propósitos mas também torna os mecanismos biológicos mais difíceis de decifrar Por essa razão modelos de organismos mais simples tiveram papel fundamental em revelar mecanismos genéticos universais do desenvolvi mento animal e a pesquisa utilizando esses sistemas permanece essencial para conduzir avanços científicos e médicos o QuE NÃo SABEMoS Que novas abordagens podem propor cionar uma visão mais clara da arqueia anaeróbica que se acredita ter forma do o núcleo da primeira célula euca riótica Como sua simbiose com uma bactéria aeróbica levou à mitocôndria Em algum lugar na Terra estarão essas células ainda não identificadas que po derão completar os detalhes de como as células eucarióticas se originaram O sequenciamento de DNA revelou um mundo rico e previamente desco nhecido de células microbianas cuja grande maioria não pode ser cultiva da em laboratório Como essas células poderiam ser mais acessíveis para es tudos detalhados Que novas células ou novos organis mosmodelo deveriam ser desenvolvi dos para os cientistas estudarem Por que o foco concentrado nesses mode los poderia acelerar o progresso em di reção ao entendimento de um aspecto crítico da função celular que é pouco entendido Como as primeiras membranas celula res se originaram TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 11 Cada membro da família do gene da hemoglobina hu mana que consiste em sete genes arranjados em dois con juntos em diferentes cromossomos é um ortólogo para to dos os outros membros 12 A transferência genética horizontal é mais prevalente em organismos unicelulares do que em organismos multi celulares 13 A maioria das sequências de DNA em um genoma bac teriano codifica proteínas enquanto a maioria das sequên cias no genoma humano não Discuta as questões a seguir 14 Desde que foi decifrado há quatro décadas alguns alegam que o código genético seja um evento acidental enquanto outros têm afirmado que ele foi moldado por se leção natural Uma característica notável do código gené tico é sua resistência inerente aos efeitos de mutações Por exemplo uma mudança na terceira posição de um códon geralmente especifica o mesmo aminoácido ou outro com propriedades químicas semelhantes O código natural re siste à mutação com mais eficiência é menos suscetível ao erro do que a maioria das outras versões possíveis como ilustrado na Figura Q11 Apenas 1 entre 1 milhão de códi gos gerados ao acaso pelo computador é mais resistente ao erro do que o código genético natural A extraordinária resistência do código genético a mutações corrobora a sua origem como um evento incidental ou como resultado da seleção natural Explique seu raciocínio 40 PARTE I Introdução à célula Número de códigos milhares 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 Suscetibilidade a mutações Código natural Figura Q11 Suscetibilidade a mutações do código natural mostrada em relação aos milhões de códigos alternativos gerados por computador A suscetibilidade mede a mudança média nas propriedades dos aminoácidos causadas pelas mutações ao acaso em um código genético Um valor pe queno indica que as mutações tendem a causar mudanças menores Dados cortesia de Steve Freeland 15 Você começou a caracterizar uma amostra obtida das profundezas do oceano de Europa uma das luas de Júpiter Para sua surpresa a amostra contém uma forma de vida que cresce bem em um meio de cultura rico A sua análise preliminar mostra que ela é celular e contém DNA RNA e proteína Quando você mostra seus resultados a uma colega ela sugere que a sua amostra foi contaminada com um orga nismo da Terra Quais abordagens você poderia tentar para distinguir entre a contaminação e uma nova forma de vida celular baseada em DNA RNA e proteína 16 Não é tão difícil imaginar o que significa se alimentar de moléculas orgânicas que os organismos vivos produzem Isso é afinal de contas o que fazemos Mas o que significa alimentarse da luz solar como os organismos fototrófi cos fazem Ou até mais estranho alimentarse de rochas como os organismos litotróficos fazem Onde está o ali mento por exemplo na mistura química H2S H2 CO Mn Fe 2 Ni 2 CH4 e NH4 expelida de uma fenda termal 17 Quantas árvores diferentes possíveis padrões de ra mificação podem em teoria ser desenhadas para mostrar a evolução das bactérias arqueias e eucariotos assumindo que todos eles se originaram de um ancestral comum 18 Os genes para RNA ribossômico são altamente conser vados relativamente poucas mudanças na sequência em todos os organismos na Terra assim eles evoluíram muito lentamente ao longo do tempo Os genes de RNA ribossômi co nasceram perfeitos 19 Os genes participantes de processos informacionais como replicação transcrição e tradução são transferidos entre espécies com muito menos frequência do que genes envolvi dos no metabolismo A base para essa desigualdade não está clara no momento mas uma sugestão é de que ela esteja re lacionada à complexidade fundamental dos dois tipos de pro cessos Os processos informacionais tendem a envolver gran des complexos de diferentes produtos gênicos enquanto as reações metabólicas são geralmente catalisadas por enzimas compostas por uma só proteína Por que a complexidade do processo fundamental informacional ou metabólico teria algum efeito sobre a taxa de transferência horizontal de genes 110 As células animais não têm parede celular e nem clo roplastos enquanto as plantas têm ambos As células fúngi cas estão entre esses dois extremos elas têm paredes celula res mas não têm cloroplastos As células fúngicas são mais provavelmente células animais que ganharam a habilidade de sintetizar paredes celulares ou células de plantas que perderam seus cloroplastos Essa questão representou uma dificuldade para os primeiros investigadores que procura ram atribuir as relações evolutivas baseandose somente nas características e morfologia celulares Como você supõe que essa questão foi decidida Cevada Chlamydomonas Paramecium Nematódeo Molusco Inseto Minhoca Peixe dourado Rã Salamandra CobraGalinha CoelhoBaleia Gato Humano Vaca Lótus Alfafa Feijão VERTEBRADOS INVERTEBRADOS PROTOZOÁRIOS PLANTAS Figura Q12 A árvore filogenética dos genes de hemoglobina de uma varie dade de espécies Os legumes estão destacados em verde Os comprimentos das linhas que conectam as espécies atuais representam as distâncias evoluti vas que as separam 111 Quando os genes de hemoglobina das plantas foram descobertos pela primeira vez em legumes foi tão surpreen dente encontrar um gene típico do sangue animal que se sugeriu que o gene em plantas surgiu por transferência ho rizontal de um animal Agora mais genes de hemoglobina foram sequenciados e uma árvore filogenética com base em algumas dessas sequências é mostrada na Figura Q12 A Essa árvore suporta ou refuta a hipótese de que a hemo globina da planta originouse por transferência horizontal de gene B Supondo que os genes da hemoglobina de planta sejam originalmente derivados de um parasita nematódeo por exemplo como você poderia esperar que a árvore filogené tica se parecesse 112 As taxas de evolução parecem variar em diferentes li nhagens Por exemplo a taxa de evolução na linhagem do rato é significativamente maior do que na linhagem humana Essas diferenças na taxa são aparentes se forem observadas mudan ças em sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e que estão sujeitas à pressão de seleção ou as mudanças nas sequências de nucleotídeos não codificadores que não estão sob pressão de seleção evidente Você pode fornecer uma ou mais explicações para a taxa de modificações evolutivas ser mais lenta na linhagem humana do que na linhagem do rato CAPíTulo 1 Células e genomas 41 REFERÊNCIAS Gerais Alberts B Bray D Hopkin K et al 2014 Essential Cell Biology 4th ed New York Garland Science Barton NH Briggs DEG Eisen JA et al 2007 Evolution Cold Spring Harbor NY Cold Spring Harbor Laboratory Press Darwin C 1859 On the Origin of Species London Murray Graur D Li WH 1999 Fundamentals of Molecular Evolution 2nd ed Sunderland MA Sinauer Associates Madigan MT Martinko JM Stahl D et al 2010 Brock Biology 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formas seu comportamento com aparente propósito e a habilidade de crescer e se reproduzir parecem colocar os organismos vivos à parte do mundo dos sólidos dos líquidos e dos gases normalmente descritos pela química Realmente até o século XIX foi amplamente aceito que os animais tinham uma força vital um animus que seria responsável pelas suas propriedades características Sabese agora que não há nada nos organismos vivos que desobedeça às leis da química ou da física Mesmo assim a química da vida é especial Primeiro ela está ba seada fundamentalmente em compostos de carbono cujo estudo é chamado de química orgânica Segundo as células são constituídas por 70 de água e a vida depende quase exclusivamente de reações químicas que ocorrem em soluções aquosas Terceiro e mais importante a química das células é bastante complexa mesmo a mais simples delas tem uma química muito mais complicada do que qualquer outro sistema químico conheci do Particularmente embora as células possuam uma grande variedade de moléculas pequenas contendo carbono a maior parte dos átomos de carbono presente nas células está incorporada em grandes moléculas poliméricas cadeias formadas por subunida des químicas ligadas pelas extremidades das subunidades As propriedades únicas des sas macromoléculas permitem que as células e os organismos cresçam reproduzamse e desempenhem todas as demais atividades peculiares à vida COMPONENTES QUÍMICOS DA CÉLULA Os organismos vivos são compostos por somente uma pequena seleção dos 92 elemen tos que ocorrem naturalmente sendo que apenas quatro deles carbono C hidro gênio H nitrogênio N e oxigênio O perfazem 965 do peso de um organismo Figura 21 Os átomos desses elementos são ligados um ao outro por ligações covalen tes formando moléculas ver Painel 21 p 9091 Uma vez que as ligações covalentes geralmente são cem vezes mais fortes que a energia térmica presente nas células os áto mos não são separados por essa excitação térmica e as ligações são rompidas apenas em reações específicas com outros átomos ou moléculas Duas moléculas diferentes também podem se manter juntas por meio de ligações não covalentes que são muito mais fracas Figura 22 Posteriormente será visto que as ligações não covalentes são importantes em muitas situações nas quais as moléculas devem se associar e dissociar prontamente para desempenharem suas funções biológicas Figura 21 Os principais elementos das células destacados na tabela perió dica Quando os elementos são colocados de acordo com os seus números atômicos e organizados dessa maneira eles se agrupam em colunas verticais que indicam propriedades semelhantes Os átomos de uma mesma coluna vertical devem ganhar ou perder o mesmo número de elétrons para preencherem sua camada mais ex terna e assim comportamse de maneira semelhante na formação de íons ou de ligações Dessa forma por exemplo Mg e Ca tendem a perder dois elétrons de suas camadas mais externas C N e O situam se na mesma linha horizontal e tendem a completar suas segundas camadas com partilhando elétrons Os quatro elementos destacados em vermelho constituem 99 do número total de átomos no corpo humano Os sete elementos destacados em azul em conjunto representam 09 do total Os elementos destacados em verde são necessários em quantidadestraço pelo ho mem Permanece incerto se os elementos mostrados em amarelo são essenciais para o homem Parece que a química da vida é portanto predominantemente a química dos elementos mais leves Os pesos atô micos mostrados são os do isótopo mais comum de cada um dos elementos Na 23 11 K 39 19 Mg 24 12 Ca 40 20 Rb Cs Fr Sr Ba Ra Y Sc Ti Li Be La Ac Zr Hf Rf Nb Ta Db W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Ga Al Ge As Br Kr Ar Ne He Te Xe At Rn Mn 55 Fe 56 26 Co 59 27 Ni 59 28 Cu 64 29 Zn 65 30 B 11 5 C 12 6 Si 28 14 N 14 7 O 16 8 Se 79 34 25 I 127 53 Cr 52 24 V 51 23 Mo 96 42 H 1 1 Número atômico Massa atômica F 19 9 P 31 15 S 32 16 Cl 35 17 44 PARTE I Introdução à célula A água é mantida coesa por ligações de hidrogênio As reações ocorrem no interior das células em um ambiente aquoso A vida na Terra começou nos oceanos e as condições daquele ambiente primitivo imprimiram caracte rísticas indeléveis na química dos seres vivos Assim a vida depende das propriedades químicas da água Essas propriedades estão revistas no Painel 22 p 9293 Em cada molécula de água H2O os dois átomos de H ligamse ao átomo de O por ligações covalentes As duas ligações são altamente polares porque o O atrai for temente elétrons enquanto o H os atrai apenas fracamente Como consequência há uma distribuição não equitativa de elétrons na molécula de água com predominância de carga positiva nos dois átomos de H e de carga negativa no O Quando uma região da molécula de água carregada positivamente ie um dos dois átomos de H se aproxima de uma região carregada negativamente ie do O de uma segunda molécula de água a atração elétrica entre elas pode resultar em uma ligação de hidrogênio Essas ligações são muito mais fracas do que as ligações covalentes e são facilmente rompidas pelo movimento cinético aleatório que reflete a energia térmica das moléculas Entretanto o efeito combinado de um grande número de ligações fracas pode ser muito grande Por exemplo cada molécula de água pode formar ligações de hidrogênio através de seus dois átomos de H com duas outras moléculas de água formando uma rede na qual ligações de hidrogênio são rompidas e formadas de modo contínuo A água é um líquido à temperatura ambiente com alto ponto de ebulição e alta tensão superficial e não um gás exatamente porque as moléculas são mantidas unidas devido a ligações de hidrogênio Moléculas como os álcoois que possuem ligações covalentes polares e que po dem formar ligações de hidrogênio com a água dissolvemse facilmente em água Da mesma maneira moléculas que possuem cargas íons interagem favoravelmente com a água Essas moléculas são denominadas hidrofílicas para indicar que gostam de água Muitas das moléculas presentes no ambiente aquoso das células incluindo os açúcares o DNA o RNA e a maioria das proteínas forçosamente pertencem a essa categoria Contrariamente moléculas hidrofóbicas moléculas que não gostam de água não possuem carga elétrica e formam poucas ligações de hidrogênio ou ne nhuma de modo que não se dissolvem em água Os hidrocarbonetos são um exemplo importante Nessas moléculas todos os átomos de H estão ligados de modo covalente a átomos de C por ligações apolares e dessa forma eles não podem formar ligações polares com outras moléculas ver Painel 21 p 90 Isso faz os hidrocarbonetos serem totalmente hidrofóbicos propriedade que é aproveitada pelas células cujas membra nas como será visto no Capítulo 10 são formadas por moléculas que possuem longas caudas hidrocarbonadas Quatro tipos de interações não covalentes contribuem para manter a associação entre as moléculas em uma célula Grande parte da biologia depende de ligações específicas entre diferentes moléculas formadas por três tipos de ligações não covalentes atrações eletrostáticas ligações iô nicas ligações de hidrogênio e atrações ou força de van der Waals Há ainda um quarto fator que promove a atração das moléculas a força hidrofóbica As propriedades desses quatro tipos de atrações estão mostradas no Painel 23 p 9495 Embora indi vidualmente cada atração não covalente possa ser muito fraca para ser eficiente diante da energia térmica das moléculas a soma de suas energias pode criar uma força inten Figura 22 Algumas formas de ener gia importantes para as células Uma propriedade essencial de qualquer ligação covalente ou não covalente é sua força A força de uma ligação é medida pela quantidade de energia necessária para romper a ligação expressa tanto em unidades de quilojoules por mol kJmol ou quilocalorias por mol kcalmol As sim se for necessário o fornecimento de 100 kJ de energia para romper 6 x 10 23 ligações de um tipo específico ie 1 mol dessas ligações a força dessa ligação será 100 kJmol Observe que nesse diagrama as energias estão comparadas em uma escala logarítmica Os comprimentos e as forças de ligação das principais classes de ligações químicas estão mostrados na Tabela 21 Um 1 joule J é a quantidade de energia necessária para mover um objeto por 1 metro contra uma força de 1 Newton Essa medida de energia é derivada das uni dades SI Système Internationale dUnités sistema que é usado universalmente pelos físicos Uma segunda unidade de energia geralmente usada pelos biólogos celulares é a quilocaloria kcal 1 caloria é a quantidade de energia necessária para elevar a tempe ratura de 1 grama de água em 1C 1 kJ é igual a 0239 kcal 1 kcal 418 kJ Energia térmica média Hidrólise de ATP nas células Quebra de ligação CC Conteúdo energético kJmol Luz verde Oxidação completa da glicose Quebra de uma ligação não covalente em água 1 10 100 1000 10000 kJ CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 45 sa entre duas moléculas que estejam separadas Dessa maneira conjuntos de atrações não covalentes permitem que as superfícies complementares de duas moléculas mante nham essas duas macromoléculas associadas entre si Figura 23 A Tabela 21 compara as forças de ligações não covalentes com a força típica de uma ligação covalente na presença e na ausência de água Observe que a água por for mar interações que competem com as moléculas envolvidas reduz muito a força tanto das atrações eletrostáticas como das ligações de hidrogênio A estrutura de uma ligação de hidrogênio típica está ilustrada na Figura 24 Es sas ligações correspondem a uma forma especial de interação polar na qual um átomo de hidrogênio que é eletropositivo é compartilhado por dois átomos eletronegativos Seus átomos de hidrogênio podem ser vistos como se fossem um próton que se dissociou apenas parcialmente de um átomo doador e portanto pode ser compartilhado por um segundo átomo aceptor Ao contrário de uma interação eletrostática típica essa ligação é altamente direcional sendo mais intensa quando uma linha reta pode ser desenhada ligando todos os três átomos nela envolvidos O quarto efeito que normalmente une moléculas quando estão em presença de água estritamente falando não é propriamente uma ligação Uma força hidrofóbica muito importante é formada pela expulsão de superfícies não polares da rede de água mantida por ligações de hidrogênio de modo que essas superfícies não polares já não interferem fisicamente nas interações altamente favoráveis que ocorrem entre as mo léculas de água Manter essas superfícies não polares unidas reduz o contato delas com a água Nesse sentido a força é inespecífica Entretanto como está mostrado no Capítulo 3 as forças hidrofóbicas são fundamentais para o enovelamento adequado das proteínas Algumas moléculas polares formam ácidos e bases em água Um dos tipos de reação química mais simples e que tem grande importância para as células ocorre quando uma molécula que possui alguma ligação covalente altamente polar entre um hidrogênio e outro átomo dissolvese em água Em tais moléculas o áto mo de hidrogênio doa seu elétron quase totalmente para o átomo parceiro e portanto existe como um núcleo de hidrogênio carregado positivamente e praticamente despro vido de elétron em outras palavras um próton H Quando uma molécula polar fica rodeada por moléculas de água o próton é atraído pela carga parcialmente negativa do átomo de O de uma molécula de água adjacente Esse próton pode se dissociar facilmen te do seu parceiro original e se associar ao átomo de oxigênio de uma molécula de água gerando um íon hidrônio H3O Figura 25A A reação inversa também ocorre muito Figura 23 Esquema mostrando como duas macromoléculas com superfícies complementares podem se ligar firmemente uma à outra através de ligações não covalentes Ligações químicas não covalentes tem 120 da força de uma ligação covalente Elas são capazes de produzir uma ligação forte somente quando muitas delas se formarem simultaneamente Embora apenas atrações eletrostáticas estejam represen tadas no esquema geralmente todas as quatro forças não covalentes contribuem para que duas macromoléculas se mantenham ligadas Animação 21 TABELA 21 Ligações químicas covalentes e não covalentes Tipo de ligação Comprimento nm Força kJ mol No vácuo Na água Covalente 015 377 90 377 90 Não covalente Iônica 025 335 80 126 3 Hidrogênio 030 167 4 42 1 Força de van der Waals por átomo 035 04 01 04 01 A ligação iônica é uma atração eletrostática entre dois átomos completamente carregados Os valores em parênteses estão em kcalmol 1 kJ 0239 kcal e 1 kcal 418 kJ O Comprimento da ligação covalente 01 nm Comprimento da ligação de hidrogênio 03 nm A B O O H O O H O N H N O H N O H N N H Átomo doador Átomo receptor Átomo doador Átomo receptor N H Figura 24 Ligações de hidrogênio A Modelo de esfera e bastão de uma ligação de hidrogênio típica A distância entre o átomo de hidrogênio e o átomo de oxigênio é menor do que a soma dos seus raios de van der Waals o que indica haver compartilhamento parcial de elétrons B As ligações de hidrogênio mais comuns encontradas nas células 46 PARTE I Introdução à célula Figura 25 Os prótons se movem facilmente em soluções aquosas A Reação que ocorre quando uma molécula de ácido acético dissolvese em água Em pH 7 praticamente todo o ácido acético está presente na forma de íon acetato B As moléculas de água estão continuamente trocando prótons umas com as outras formando íons hidrônio e hidroxila Por sua vez esses íons rapidamente recombinamse formando moléculas de água CH3 C O H H 3 C C H O O H H A Ácido acético Água Íon acetato Íon hidrônio H O H O H O H H Ô H B Os prótons movemse de uma molécula para outra Íon hidrônio Íon hidroxila rapidamente de modo que em uma solução aquosa os prótons estão constantemente passando de uma molécula de água para outra As substâncias que liberam prótons quando dissolvidas em água formando assim H3O são denominadas ácido Quanto maior a concentração de H3O mais ácida é a solução H3O está presente mesmo na água pura na concentração de 107 M como result ado do movimento dos prótons de uma molécula de água para outra Figura 25B Por convenção a concentração de H3O normalmente é chamada de concentração de H mesmo que a maior parte dos prótons presentes na solução estejam na forma H3O Para evitar o uso de números incômodos de manusear a concentração de H3O é expressa usando uma escala logarítmica denominada escala de pH A água pura tem pH 70 e é considerada neutra isto é nem ácida pH 7 e nem básica pH 7 Os ácidos são classificados como fortes ou fracos dependendo da sua tendência a doar prótons para a água Os ácidos fortes como o ácido clorídrico HCl liberam prótons com facilidade O ácido acético por outro lado é um ácido fraco porque ele mantém seus prótons mais firmemente quando dissolvido em água Muitos ácidos importantes para as células como as moléculas que contêm um grupo carboxila COOH são ácidos fracos ver Painel 22 p 9293 Uma vez que os prótons de um íon hidrônio podem ser transferidos facilmente para muitos dos tipos de moléculas presentes nas células a concentração de H3O dentro das células a acidez deve ser rigidamente regulada Os ácidos especialmente os ácidos fracos doam prótons mais facilmente quando a concentração de H3O da solução for baixa e tenderão a receber os prótons de volta quando a concentração de H3O for alta A base é o oposto de ácido Qualquer molécula capaz de aceitar um próton de uma molécula de água é denominada base O hidróxido de sódio NaOH é uma base os termos álcal i ou alcalino também são usados porque ele se dissocia facilmente em soluções aquosas formando íons Na e OH Devido a essa propriedade o NaOH é denominado base forte Para as células entretanto as bases fracas aquelas que têm uma tendência fraca a aceitar reversivelmente um próton da água são mais importantes Muitas moléculas de importância biológica contêm um grupo amino NH2 Esse grupo é uma base fraca que pode gerar OH ao aceitar um próton da água NH2 H2O NH3 OH ver Painel 22 p 9293 Uma vez que o íon OH se combina com um íon H3O para formar moléculas de água um aumento na concentração de OH força uma diminuição na concentração de H3O e viceversa Uma solução de água pura contém concentrações 107 M iguais dos dois íons fazendo ela ser neutra O interior das células também é mantido próximo da neutralidade pela presença de ácidos e bases fracos tampões que podem liberar ou receber prótons próximos do pH 7 o que mantém o ambiente celular relativamente constante sob uma grande variedade de condições As células são formadas por compostos de carbono Após serem revisadas as maneiras pelas quais os átomos de carbono combinamse para formar moléculas e os seus comportamentos em ambiente aquoso agora serão examinadas as principais classes de moléculas pequenas presentes nas células Será visto que CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 47 um pequeno número de categorias de moléculas compostas por um pequeno número de elementos diferentes originam toda a extraordinária riqueza de formas e de compor tamentos apresentada pelos seres vivos Desconsiderando a água e os íons inorgânicos como por exemplo o potássio praticamente todas as moléculas de uma célula têm o carbono como base Em compa ração com todos os demais elementos o carbono é inigualável na sua capacidade de formar moléculas grandes O silício vem em segundo lugar porém muito atrás Devido ao seu pequeno tamanho e ao fato de possuir quatro elétrons e quatro vacâncias na úl tima camada o átomo de carbono pode formar quatro ligações covalentes com outros átomos Mais importante ainda um átomo de carbono pode ligarse com outros átomos de carbono por meio da ligação CC que é altamente estável de modo a formar cadeias e anéis e assim formar moléculas grandes e complexas não havendo mesmo um limite imaginável para o tamanho das moléculas que podem ser formadas Os compostos de carbono formados pelas células são denominados moléculas orgânicas Por outro lado todas as demais moléculas inclusive a água são denominadas moléculas inorgânicas Certas combinações de átomos como as dos grupos metila CH3 hidroxila OH carboxila COOH carbonila CO fosfato PO3 2 sulfidrila SH e ami no NH2 ocorrem repetidamente nas moléculas feitas por células Cada um desses grupos químicos tem propriedades químicas e físicas distintas que influenciam o com portamento das moléculas que contêm esses grupos Os grupos químicos mais comuns e algumas de suas propriedades estão resumidos no Painel 21 p 9091 As células contêm quatro famílias principais de moléculas orgânicas pequenas As moléculas orgânicas pequenas das células são compostos baseados no carbono e têm peso molecular na faixa entre 100 e 1000 contendo cerca de 30 átomos de carbono Elas geralmente são encontradas livres em solução e têm vários destinos Algumas são utiliza das como subunidades monômeros para compor gigantescas macromoléculas polimé ricas proteínas ácidos nucleicos e os grandes polissacarídeos Outras atuam como fonte de energia e são degradadas e transformadas em outras moléculas pequenas pela rede complexa de vias metabólicas intracelulares Muitas dessas moléculas pequenas têm mais de um papel na célula por exemplo determinada molécula pode servir como subunidade de alguma macromolécula ou como fonte de energia As moléculas orgânicas pequenas são muito menos abundantes que as macromoléculas orgânicas e perfazem somente cerca de um décimo do total da massa de matéria orgânica de uma célula Em uma célula típica podem existir aproximadamente milhares de tipos diferentes de moléculas pequenas Todas as moléculas orgânicas são sintetizadas a partir de e degradadas até um mesmo conjunto de compostos simples Consequentemente os compostos presentes nas células são quimicamente relacionados entre si e podem ser classificados dentro de um pequeno grupo de famílias distintas De modo geral as células contêm quatro famílias principais de moléculas orgânicas pequenas os açúcares os ácidos graxos os nucleotídeos e os aminoácidos Figura 26 Embora muitos dos compostos presentes nas células não se enquadrem nessas categorias as quatro famílias de moléculas orgâ nicas pequenas juntamente com as macromoléculas formadas por suas ligações em longas cadeias correspondem a uma enorme proporção da massa celular Os aminoácidos e as proteínas que são formadas por eles serão objeto do Capí tulo 3 Resumos das propriedades das três famílias restantes açúcares ácidos graxos e nucleotídeos podem ser encontrados respectivamente nos Painéis 24 25 e 26 ver p 96101 A química das células é dominada por macromoléculas com propriedades extraordinárias Em termos de peso as macromoléculas são sem dúvida as mais abundantes entre todas as moléculas que contêm carbono presentes nas células vivas Figura 27 Elas constituem as principais unidades fundamentais que formam as células e também os 48 PARTE I Introdução à célula Grandes unidades das células Unidades fundamentais das células AÇÚCARES UM AÇÚCAR UM ÁCIDO GRAXO UM NUCLEOTÍDEO UM AMINOÁCIDO ÁCIDOS GRAXOS AMINOÁCIDOS NUCLEOTÍDEOS POLISSACARÍDEOS GORDURAS LIPÍDEOS MEMBRANAS PROTEÍNAS ÁCIDOS NUCLEICOS CH2OH H HO O OH OH H OH H H H C C C C C CH3 H C COO H3N O O C C O O O P O O P O O O O P O O CH2 N N N N NH2 OH OH H H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H C H H componentes que conferem as características mais distintivas dos seres vivos Nas célu las as macromoléculas são polímeros construídos simplesmente por ligações covalentes entre pequenas moléculas orgânicas chamadas de monômeros formando cadeias lon gas Figura 28 Essas macromoléculas possuem muitas propriedades extraordinárias que não podem ser previstas com base em seus constituintes As proteínas são abundantes e incrivelmente versáteis Elas desempenham milha res de funções diferentes nas células Muitas proteínas funcionam como enzimas ca talisadores que facilitam o enorme número de reações que formam e que rompem as ligações covalentes necessárias para as células Todas as reações pelas quais as células extraem energia das moléculas dos alimentos são catalisadas por proteínas que funcio nam como enzimas p ex a enzima denominada ribulose bisfosfato carboxilase con verte nos organismos fotossintéticos o CO2 em açúcares produzindo a maior parte da matéria orgânica necessária para a vida na Terra Outras proteínas são utilizadas para construir componentes estruturais como a tubulina uma proteína que se autoagrega de maneira organizada para formar os longos microtúbulos das células ou as histonas proteínas que compactam o DNA nos cromossomos Além disso outras proteínas atuam como motores moleculares que produzem força e movimento como é o caso da miosina Figura 26 As quatro principais famílias de moléculas orgânicas pequenas encontradas nas células Essas moléculas pequenas são as unidades fundamen tais monoméricas ou subunidades da maioria das macromoléculas e de outros agregados celulares Alguns deles como os açúcares e os ácidos graxos também são fontes de energia Suas estruturas estão representadas aqui e são mostradas com maiores detalhes nos painéis ao final deste capítulo e no Capítulo 3 30 substâncias químicas 70 água Moléculas pequenas 3 Íons inorgânicos 1 Fosfolipídeos 2 DNA 1 RNA 6 Proteínas 15 Polissacarídeos 2 Célula bacteriana MACROMOLÉCULAS VOLUME DA CÉLULA 2 1012 cm3 Figura 27 Distribuição das moléculas nas células Composição aproximada de uma célula bacteriana em massa A composição de uma célula animal é semelhante mesmo que o volume seja aproximadamente 1000 vezes maior Observe que as macromoléculas predominam Os principais íons inorgânicos incluem Na K Mg 2 Ca 2 e Cl CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 49 nos músculos As proteínas podem ter uma ampla variedade de outras funções Mais adiante neste livro as bases moleculares de muitas proteínas serão examinadas Embora as reações químicas que adicionam subunidades a cada polímero proteí nas ácidos nucleicos e polissacarídeos tenham detalhes diferentes elas compartilham características comuns importantes O crescimento dos polímeros ocorre pela adição de um monômero à extremidade da cadeia polimérica que está crescendo por meio de uma reação de condensação na qual uma molécula de água é perdida cada vez que uma subunidade é adicionada Figura 29 A polimerização pela adição de monômeros um a um para formar cadeias longas é a maneira mais simples de construir uma molécula grande e complexa pois as subunidades são adicionadas por uma mesma reação que é repetida muitas e muitas vezes pelo mesmo conjunto de enzimas Deixando de lado alguns dos polissacarídeos a maior parte das macromoléculas é formada a partir de um conjunto limitado de monômeros com pequenas diferenças entre si como os 20 ami noácidos que participam da composição das proteínas Para a vida é fundamental que as cadeias de polímeros não sejam feitas pela adição das subunidades aleatoriamente Ao contrário as subunidades são adicionadas segundo uma ordem bem definida ou sequência Os mecanismos sofisticados que permitem que as enzimas desempenhem essa função estão descritos nos Capítulos 5 e 6 Ligações não covalentes determinam tanto a forma precisa das macromoléculas como a forma com que se ligam a outras moléculas A maior parte das ligações covalentes das macromoléculas permite que átomos que par ticipam da ligação girem de modo que as cadeias de polímeros possuam grande flexi bilidade Em princípio isso possibilita que a macromolécula adote um número prati camente ilimitado de formas ou conformações devido a torções e giros induzidos pela energia térmica que é aleatória Entretanto as formas específicas da maior parte das macromoléculas são altamente condicionadas pelas muitas ligações não covalentes fra cas formadas entre diferentes partes da própria molécula Caso essas ligações não cova lentes sejam formadas em número suficiente a cadeia do polímero pode ter preferência por uma dada conformação que é determinada pela sequência linear dos monômeros na cadeia Devido a isso praticamente todas as moléculas de proteína e também muitas das pequenas moléculas de RNA encontradas nas células organizamse em uma confor mação preferencial Figura 210 Os quatro tipos de interações não covalentes que são importantes para as molé culas biológicas foram apresentados previamente neste capítulo e são mais bem discu tidos no Painel 23 p 9495 Além de fazer as macromoléculas biológicas terem suas formas características essas ligações também criam atrações fortes entre duas ou mais moléculas diferentes ver Figura 23 Essas formas de interações moleculares possibi litam uma grande especificidade porque os contatos múltiplos necessários para uma associação forte permitem que uma macromolécula selecione por meio da associação apenas um entre os muitos milhares de outros tipos de moléculas presentes nas células Além disso uma vez que a intensidade da associação depende do número de ligações não covalentes formadas é possível que ocorram interações com praticamente qual quer grau de afinidade permitindo assim que se dissociem de forma rápida quando for apropriado MACROMOLÉCULA Polissacarídeo SUBUNIDADE Açúcar Proteína Aminoácido Ácido nucleico Nucleotídeo Figura 28 Três famílias de macromolécu las Cada uma delas é um polímero formado por moléculas pequenas denominadas monô meros ligadas entre si por ligações covalentes A B A B H HO A B H HO CONDENSAÇÃO HIDRÓLISE H2O H2O Energeticamente desfavorável Energeticamente favorável Figura 29 A condensação e a hidrólise são reações opostas As macromoléculas das células são polímeros formados por subunidades ou monômeros por meio de reações de condensação e são degradadas por reações de hidrólise Energeticamente as reações de condensação são desfavoráveis e portanto a formação de políme ros requer um suprimento de energia como será descrito adiante no texto 50 PARTE I Introdução à célula Como discutiremos a seguir associações desse tipo constituem a base de todas as catálises biológicas tornando possível que as proteínas funcionem como enzimas Além disso interações não covalentes possibilitam que as macromoléculas sejam utilizadas como unidades fundamentais na formação de estruturas maiores de modo a formar má quinas intrincadas com muitas partes móveis que desempenham funções complexas como a replicação do DNA e a síntese de proteínas Figura 211 Resumo Os organismos vivos são sistemas químicos autônomos que se autopropagam Eles são formados por um conjunto restrito e determinado de pequenas moléculas baseadas em carbono que essencialmente são as mesmas em todas as espécies de seres vivos Cada uma dessas pequenas moléculas é formada por um pequeno conjunto de átomos ligados entre si por ligações covalentes em uma configuração precisa As principais categorias são os açúcares os ácidos graxos os aminoácidos e os nucleotídeos Os açúcares constituem a fonte primária de energia química das células e podem ser incorporados em polissacarí deos para o armazenamento de energia Os ácidos graxos também são importantes como reserva de energia mas sua função fundamental é a formação das membranas biológicas Cadeias longas de aminoácidos formam as macromoléculas notavelmente diversas e ver sáteis conhecidas como proteínas Os nucleotídeos têm um papel central nas transferên cias de energia e também são subunidades que participam na formação das macromolé culas informacionais RNA e DNA A maior parte da massa seca de uma célula consiste em macromoléculas que são polímeros lineares de aminoácidos proteínas ou de nucleotídeos DNA e RNA ligados entre si covalentemente segundo uma ordem exata A maioria das moléculas de proteínas e muitas das moléculas de RNA enovelamse em uma conformação única que é determi nada pela sequência de suas subunidades Esse processo de enovelamento cria superfícies Diversas conformações instáveis Uma conformação estável enovelada Figura 210 Enovelamento das molé culas de proteína e de RNA em formas tridimensionais especialmente está veis ou conformações Se as ligações não covalentes que mantêm a conforma ção estável forem rompidas a molécula passa a ser uma cadeia flexível e perde sua atividade biológica ESTRUTURAS MACROMOLECULARES MACROMOLÉCULAS p ex proteínas globulares e RNA SUBUNIDADES p ex açúcares aminoácidos e nucleotídeos Ligações covalentes Ligações não covalentes 30 nm p ex ribossomo Figura 211 Pequenas moléculas ligamse covalentemente formando macromoléculas que por sua vez formam grandes complexos através de ligações não covalentes As pequenas moléculas as proteínas e o ribossomo estão ilustrados aproximadamente em escalaOs ribossomos são parte central da ma quinaria que as células utilizam para fazer as proteínas cada ribossomo é um complexo de aproximadamente 90 macromoléculas moléculas de proteínas e de RNA CATÁLISE E O USO DE ENERGIA PELAS CÉLULAS Uma propriedade dos seres vivos mais do que qualquer outra os faz parecerem quase miraculosamente diferentes da matéria não viva eles criam e mantêm ordem em um universo que está sempre tendendo a uma maior desordem Figura 212 Para criar essa ordem as células dos organismos vivos devem executar um fluxo interminável de reações químicas Em algumas dessas reações as moléculas pequenas aminoácidos açúcares nucleotídeos e lipídeos são diretamente usadas ou modificadas para suprir as células com todas as outras moléculas pequenas de que elas necessitam Em outras reações moléculas pequenas são usadas para construir a enorme e diversificada gama de proteínas de ácidos nucleicos e de outras macromoléculas que conferem as propriedades características dos sistemas vivos Cada célula pode ser vista como se fosse uma pequena indústria química executando milhões de reações a cada segundo As enzimas organizam o metabolismo celular Sem enzimas as reações químicas que as células executam normalmente ocorreriam apenas em temperaturas muito mais altas do que a temperatura do interior das células Em função disso cada reação requer um potenciador específico das reatividades químicas Essa necessidade é crucial porque ela possibilita que a célula controle sua própria química O controle é exercido por meio de catalisadores biológicos especializados Quase sempre eles são proteínas denominadas enzimas embora também existam RNAs catalisadores denominados ribozimas Cada enzima acelera ou catalisa apenas um dos muitos tipos possíveis de reações que uma determinada molécula pode sofrer As reações catalisadas por enzimas são conectadas em série de modo que o produto de uma reação tornase o material de partida ou substrato da reação seguinte Figura 213 As vias de reações são lineares e longas e ainda interligadas umas às outras formando uma rede de reações interconectadas É isso que permite às células sobreviverem crescerem e se reproduzirem Dois fluxos opostos de reações ocorrem nas células 1 as vias catabólicas degradam os alimentos em moléculas menores e geram tanto energia em uma forma utilizável pelas células como também geram as pequenas moléculas que as células necessitam como unidades fundamentais e 2 as vias anabólicas ou biossintéticas que usam 52 PARTE I Introdução à célula as moléculas pequenas e a energia liberada pelo catabolismo de maneira controlada para a síntese de todas as demais moléculas que formam as células O conjunto desses dois grupos de reações constitui o metabolismo celular Figura 214 Os pormenores do metabolismo celular são o assunto tradicional da bioquímica e a maioria deles não diz respeito ao assunto aqui abordado Entretanto os princípios gerais pelos quais a célula obtém energia a partir do ambiente e a utiliza para criar ordem é um ponto central da biologia celular Inicialmente será discutido por que é necessário haver um suprimento constante de energia para que todas as coisas vivas se sustentem A liberação de energia térmica pelas células possibilita a ordem biológica A tendência universal das coisas tornaremse desordenadas é uma lei fundamental da física a segunda lei da termodinâmica Ela estabelece que no universo ou em qualquer sistema isolado um conjunto de matéria completamente isolado do resto do universo o grau de desordem sempre aumenta Essa lei tem implicações tão profundas para a vida que merece ser abordada de várias maneiras Por exemplo podese apresentar a segunda lei em termos de probabilidades esta belecendo que o sistema mudará de forma espontânea para a organização mais prová vel Considerando uma caixa contendo 100 moedas com o lado cara virado para cima uma sequência de acidentes que perturbem a caixa fará o arranjo se alterar para uma mistura com 50 moedas com a cara para cima e 50 com a coroa para cima A razão é simples existe um enorme número de arranjos possíveis na mistura nos quais cada moeda individualmente pode chegar a um resultado de 5050 mas existe somente um arranjo que mantém todas as moedas orientadas com a cara para cima Devido ao fato de que a mistura 5050 é a mais provável dizemos que ela é mais desordenada Pela mesma razão é muito frequente que as casas das pessoas tornemse cada vez mais de sordenadas caso não seja feito algum esforço deliberado O movimento na direção da desordem é um processo espontâneo sendo necessário um esforço periódico para rever têlo Figura 215 A quantidade de desordem de um sistema pode ser quantificada e é expressa como a entropia do sistema quanto maior a desordem maior a entropia Uma terceira manei ra de expressar a segunda lei da termodinâmica é dizer que o sistema mudará esponta neamente para o estado de organização que tiver a maior entropia As células vivas por sobreviverem crescerem e formarem organismos complexos estão continuamente gerando ordem e assim pode parecer que desafiam a segunda lei da termodinâmica Como então isso é possível A resposta é que a célula não constitui um sistema isolado Ela toma energia do ambiente na forma de alimento ou como fó tons do sol ou mesmo como ocorre em certas bactérias quimiossintéticas apenas de moléculas inorgânicas Então ela usa essa energia para gerar ordem para si própria O calor é liberado no ambiente onde as células se encontram tornandoo mais desorga nizado Como resultado a entropia total a da célula mais a dos seus arredores aumen ta exatamente como a segunda lei da termodinâmica estabelece Para se entender os princípios que governam essas conversões de energia é conve niente considerar as células como unidades envoltas em um mar de matéria representan do o resto do universo À medida que as células vivem e crescem elas criam uma ordem interna Mas também liberam permanentemente energia na forma de calor quando sin tetizam moléculas e as organizam em estruturas celulares Calor é energia na sua forma mais desordenada a colisão aleatória de moléculas Quando as células liberam calor para A B C D E F ABREVIAÇÃO Molécula Molécula Catalisado pela enzima 1 Molécula Catalisado pela enzima 2 Molécula Catalisado pela enzima 3 Molécula Catalisado pela enzima 4 Molécula Catalisado pela enzima 5 Figura 213 Como um conjunto de reações catalisadas por enzimas origina uma via metabólica Cada uma das enzimas catalisa uma determinada reação química sendo que a enzima permanece inalterada após a reação Nesse exemplo um conjunto de enzimas atua em série para converter a molécula A na molécula F formando uma via metabólica Um diagrama das muitas reações que ocorrem nas células humanas usando a abreviação acima é mostrado na Figura 263 Moléculas de alimento As diversas moléculas que formam a célula Formas úteis de energia Calor perdido As diversas unidades fundamentais usadas para biossíntese VIAS CATABÓLICAS VIAS ANABÓLICAS Figura 214 Representação esquemática das relações entre as vias catabólicas e anabólicas do metabolismo O diagrama su gere que a maior parte da energia armazenada nas ligações químicas das moléculas de alimen to é dissipada em forma de calor Além disso a massa de nutrientes que um determinado or ganismo gasta para o seu catabolismo é muito maior do que a massa das moléculas que esse mesmo organismo produz no seu anabolismo CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 53 o mar de matéria esse calor produz um aumento na intensidade do movimento molecular nesse mar energia cinética e assim há aumento da aleatoriedade ou da desordem do mar A segunda lei da termodinâmica é obedecida porque o aumento de ordem no interior das células é sempre mais do que compensado pelo enorme decréscimo na ordem au mento da entropia no mar de matéria nas vizinhanças da célula Figura 216 De onde então vem o calor que as células liberam Aqui aparece outra lei im portante da termodinâmica A primeira lei da termodinâmica estabelece que a energia pode ser convertida de uma forma em outra mas não pode ser criada ou destruída Al gumas das formas de interconversão entre diferentes formas de energia estão ilustradas na Figura 217 A quantidade de energia nas diferentes formas poderá mudar como re sultado das reações químicas que ocorrem dentro das células mas a primeira lei da ter modinâmica estabelece que a quantidade total de energia deve ser sempre a mesma Por exemplo uma célula animal consome um alimento e converte parte da energia presente nas ligações químicas entre os átomos das moléculas desse alimento energia de ligação química em movimento térmico aleatório de moléculas energia cinética As células não podem tirar qualquer benefício da energia cinética ou calor que liberam a menos que as reações que geram calor no seu interior estejam diretamente ligadas aos processos que geram ordem molecular É o acoplamento íntimo entre a pro dução de calor e o aumento na ordem que distingue o metabolismo de uma célula do desperdício que ocorre na queima de combustíveis no fogo Posteriormente será mos trado como ocorre esse acoplamento Por ora é suficiente reconhecer que é necessário haver uma associação direta entre a queima controlada das moléculas dos alimentos e Figura 215 Ilustração cotidiana sobre a tendência espontânea para a desordem Reverter essa tendência para a desordem requer um esforço intencional e gasto de energia isso não é espontâneo Conforme a segunda lei da termodinâ mica é certo que a intervenção humana necessária para repor a ordem irá liberar para o ambiente mais do que a energia térmica necessária para compensar o reor denamento dos objetos no quarto REAÇÃO ESPONTÂNEA à medida que o tempo passa O ESFORÇO PARA ORGANIZAR REQUER O FORNECIMENTO DE ENERGIA Figura 216 Análise termodinâmica sim plificada de uma célula viva No diagrama ao lado as moléculas tanto da célula como do restante do universo o mar de matéria estão em um estado de relativa desordem No diagrama da direita observase que a célu la obteve energia das moléculas dos alimentos e desprendeu calor através das reações que ordenaram as moléculas da célula O calor liberado aumenta a desordem do ambiente dos arredores da célula representado pelas setas com ângulos e moléculas distorcidas que indicam aumento dos movimentos das moléculas causado pelo calor Desse modo a segunda lei da termodinâmica que estabelece que a quantidade de desordem do universo sempre aumenta é satisfeita enquanto a célula cresce e se divide Uma discussão por menorizada está apresentada no Painel 27 p 102103 Mar de matéria Célula Aumento na desordem Aumento na ordem CALOR 54 PARTE I Introdução à célula a geração de ordem biológica para que as células tenham capacidade de criar e manter ilhas de ordem em um universo que tende para o caos As células obtêm energia pela oxidação de moléculas orgânicas Todas as células animais e vegetais são mantidas pela energia armazenada nas ligações químicas presentes em moléculas orgânicas independentemente de serem açúcares sintetizados pelas plantas para nutrirem a si mesmas ou de serem ligações químicas de moléculas grandes ou pequenas que os animais tiverem ingerido Para que essa energia seja utilizada para que vivam cresçam e se reproduzam os organismos de vem extraíla de uma forma utilizável Tanto nas plantas como nos animais a energia é extraída das moléculas dos alimentos por um processo de oxidação gradual ou pela queima controlada A atmosfera terrestre contém uma grande quantidade de oxigênio e na presença dele a forma de carbono energeticamente mais estável é o CO2 e a forma energetica mente mais estável do hidrogênio é a água Dessa maneira a célula é capaz de obter energia de açúcares e de outras moléculas orgânicas pela combinação dos átomos de Figura 217 Algumas interconversões entre diferentes formas de energia Todas as formas de energia em princípio são interconversíveis Em todos processos desse tipo a quantidade total de ener gia mantémse conservada Assim por exemplo a partir da altura e do peso do tijolo em 1 podese predizer exatamente quanto calor será liberado quando o tijolo atingir o chão Observe em 2 que uma grande quantidade de energia de ligação química liberada quando há formação de água é inicialmente convertida na energia cinética do movimento muito rápido das duas novas moléculas de água Entre tanto as colisões com outras moléculas fazem essa energia cinética distribuirse instantaneamente e por igual no ambiente transferência de calor fazendo as novas moléculas serem indistinguíveis de todas as demais Energia potencial devido à posição Energia cinética Energia térmica Energia de ligação química Energia elétrica Energia cinética Energia eletromagnética luz Energia de ligação química Elétrons com alta energia Energia da ligação química no H2 e no O2 Movimentação rápida na H2O Energia térmica Um tijolo suspenso tem energia potencial devido à força da gravidade Um tijolo caindo tem energia cinética Há liberação de calor quando o tijolo atinge o solo Duas moléculas de gás hidrogênio Molécula de gás oxigênio Calor dissipado nos arredores Vibração rápida e rotação das duas moléculas de água recémformadas Bateria Motor do ventilador Fios Ventilador Luz do sol Molécula de clorofila Molécula de clorofila no estado excitado Fotossíntese 1 2 3 4 CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 55 carbono e de hidrogênio com oxigênio para produzir CO2 e H2O respectivamente em um processo chamado de respiração aeróbica A fotossíntese discutida em detalhes no Capítulo 14 e a respiração são proces sos complementares Figura 218 Isso significa que as interações entre as plantas e os animais não ocorrem em uma única direção As plantas os animais e os microrga nismos convivem neste planeta há tanto tempo que uns tornaramse parte essencial do ambiente dos outros Durante a respiração aeróbica o oxigênio liberado pela fotos síntese é consumido na combustão de moléculas orgânicas Algumas das moléculas de CO2 que hoje estejam fixadas nas moléculas orgânicas de uma folha verde pela fotos síntese podem ter sido liberadas ontem na atmosfera pela respiração de um animal ou pela respiração de um fungo ou uma bactéria que esteja decompondo matéria or gânica morta Dessa forma vêse que a utilização do carbono forma um grande ciclo que envolve toda a biosfera todos os seres vivos da Terra Figura 219 De maneira similar os átomos de nitrogênio de fósforo e de enxofre transitam entre os mundos dos seres vivos e dos não vivos em ciclos que envolvem as plantas os animais os fungos e as bactérias A oxidação e a redução envolvem a transferência de elétrons As células não oxidam as moléculas orgânicas em apenas uma etapa como acontece quando uma molécula orgânica é queimada no fogo Utilizando catalisadores enzimáti cos o metabolismo processa essas moléculas por meio de um grande número de reações que muito raramente envolvem a adição direta de oxigênio Antes de examinar algumas dessas reações e suas finalidades é conveniente discutir o que se entende por processo de oxidação A oxidação referese a mais do que à adição de átomos de oxigênio O termo se aplica de maneira geral a qualquer reação na qual haja transferência de elétrons de um Figura 218 Fotossíntese e respiração são processos complementares do mundo vivo A fotossíntese converte a energia eletromagnética do sol em ener gia de ligação química dos açúcares e de outras moléculas As plantas as algas e as cianobactérias obtêm os átomos de carbo no que necessitam para a fotossíntese do CO2 atmosférico e o hidrogênio da água liberando o gás O2 como produto residual Por sua vez as moléculas orgânicas produ zidas pela fotossíntese servem de alimento para outros organismos Muitos desses organismos fazem respiração aeróbica processo que utiliza O2 para formar CO2 a partir dos mesmos átomos de carbono que foram tomados na forma de CO2 e conver tidos em açúcares pela fotossíntese Nesse processo os organismos que respiram aproveitam a energia de ligação química para obter a energia de que necessitam para sobreviver Sabese que as primeiras células da face da Terra não eram capazes de realizar fotossíntese nem respiração discutido no Capítulo 14 Entretanto na evolução da Terra a fotossíntese deve ter antecedido a respiração pois há evidências de que se riam necessários bilhões de anos de fotos síntese antes que tivesse sido liberado O2 em quantidade suficiente para criar uma atmosfera rica nesse gás Atualmente a atmosfera terrestre contém 20 de O2 FOTOSSÍNTESE PLANTAS ALGAS ALGUMAS BACTÉRIAS AÇÚCARES E OUTRAS MOLÉCULAS ORGÂNICAS CO2 H2O O2 AÇÚCARES O2 H2O H2O CO2 ENERGIA DA LUZ SOLAR RESPIRAÇÃO CELULAR A MAIORIA DOS ORGANISMOS VIVOS AÇÚCARES O2 H2O CO2 O2 CO2 ENERGIA DE LIGAÇÃO QUÍMICA ÚTIL HÚMUS E MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA SEDIMENTOS E COMBUSTÍVEIS FÓSSEIS RESPIRAÇÃO FOTOSSÍNTESE CADEIA ALIMENTAR CO2 NA ATMOSFERA E NA ÁGUA PLANTAS ALGAS BACTÉRIAS ANIMAIS Figura 219 O ciclo do carbono Átomos individuais de carbono são incorporados em moléculas orgânicas do mundo vivo pela atividade fotossintética de bactérias algas e plantas Eles passam por animais microrganismos e materiais orgânicos do solo e dos oceanos em ciclos sucessivos O CO2 é reposto na atmosfera quando as mo léculas orgânicas são oxidadas pelas células ou queimadas pelo homem na forma de combustíveis átomoa outro Nesse sentido a oxidação se refere a remoção de elétrons e a redução o contrário da oxidação significa adição de elétrons Desse modo o Fe2 é oxidado quando perde um elétron tornandose Fe3 e o átomo de cloro é reduzido caso ganhe um elétron para tornarse Cl Uma vez que em uma reação química o número de elétrons é conservado sem perda ou ganho a oxidação e a redução sempre ocorrem simultaneamente isto é se uma molécula ganha um elétron na reação redução uma segunda molécula perderá um elétron oxidação Quando uma molécula de açúcar é oxidada em CO2 e H2O por exemplo a molécula de O2 envolvida na formação de H2O ganha elétrons e assim dizse que ela foi reduzida Os termos oxidação e redução são aplicados mesmo quando ocorre apenas uma troca parcial de elétrons entre átomos ligados por uma ligação covalente Figura 220 Quando um átomo de carbono ligase de modo covalente a um átomo que tenha grande afinidade por elétrons como os átomos de oxigênio cloro e enxofre por exemplo ele doa mais elétrons do que existiria em um compartilhamento equitativo e forma uma ligação covalente polar Devido ao fato de que a carga positiva do núcleo do átomo de carbono passa agora a ser maior do que a carga negativa dos seus elétrons o átomo adquire uma carga parcial positiva e se diz que foi oxidado De maneira equivalente o átomo de carbono de uma ligação CH tem um pouco mais do que apenas os seus próprios elétrons emparelhados dizse então que ele está reduzido Quando uma molécula presente em uma célula ganha um elétron e geralmente ela também ganha um próton H prótons estão totalmente disponíveis na água Nesse caso o efeito líquido é a adição de um átomo de hidrogênio à molécula A e H AH Mesmo quando há envolvimento de um próton e de um elétron em vez de apenas um elétron como no caso das reações de hidrogenação há redução e a reação inversa desidrogenação é uma reação de oxidação É muito fácil determinar quando uma molécula orgânica é oxidada ou reduzida ocorre redução quando o número de ligações CH na molécula aumenta e oxidação quando o número de ligações CH na molécula diminui ver Figura 220B As células utilizam enzimas para catalisar a oxidação de moléculas orgânicas em pequenas etapas através de sequências de reações que permitem que a energia utilizável seja aproveitada A seguir será explicado o modo como as enzimas trabalham e também algumas das limitações sob as quais elas operam Figura 220 Oxidação e redução A Quando dois átomos formam uma ligação covalente polar dizse que o átomo que fica com o maior número de elétrons tornase reduzido enquanto sobre o outro átomo que passa a ter um número menor de elétrons dizse que foi oxidado O átomo reduzido adquire uma carga negativa parcial δ uma vez que a carga positiva do núcleo atômico é agora mais do que equilibrada pela carga dos elétrons que o rodeiam Em compensação o átomo oxidado adquire uma carga positiva parcial δ B O único átomo de carbono do metano pode ser convertido em um átomo de dióxido de carbono pela substituição sucessiva de seus átomos de hidrogênio que estão ligados de forma covalente a átomos de oxigênio Em cada etapa os elétrons são removidos do carbono indicado pelo sombreado em azul e o átomo de carbono tornase progressivamente mais oxidado Nas condições presentes no interior das células cada uma dessas etapas é energeticamente favorável CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 57 As enzimas diminuem as barreiras da energia de ativação que impedem reações químicas Considere a reação papel O2 n fumaça cinzas calor CO2 H2O Após a ignição o papel queima facilmente dissipando para a atomosfera a energia como calor e água e o dióxido de carbono como gás A reação é irreversível porque a fumaça e as cinzas nunca vão recuperar espontaneamente água e dióxido de carbono da atmosfera aquecida e se reconstituírem novamente em papel Quan do o papel queima a sua energia química é dissipada como calor Não é perdida do universo porque a energia não pode ser criada ou destruída mas sim irremediavel mente dispersa na caótica movimentação cinética das moléculas Ao mesmo tempo os átomos e as moléculas do papel ficam dispersos e desordenados Na linguagem da termodinâmica há uma perda de energia livre isto é a energia pode ser aproveitada para fazer trabalho ou para fazer ligações químicas Essa perda reflete a redução da organização com que a energia e as moléculas estavam armazenadas no papel Mais detalhes da energia livre serão discutidos brevemente mas o princípio ge ral é suficientemente claro para ser intuitivo as reações químicas ocorrem somente na direção que leve a uma perda de energia livre Em outras palavras a espontaneidade da direção de qualquer reação é a direção que leva morro abaixo sendo que uma reação morro abaixo é aquela que é energeticamente favorável Embora a forma energeticamente mais favorável do carbono seja CO2 e a do hi drogênio H2O os organismos vivos não desaparecem subitamente em uma nuvem de fumaça nem este livro se consome repentinamente em chamas Isso se deve ao fato de que as moléculas tanto as dos seres vivos como as do livro estão em estados relati vamente estáveis e não podem passar ao estado de energia mínima sem que recebam certa dose de energia Em outras palavras uma molécula necessita de uma energia de ativação um estímulo para poder ultrapassar uma barreira energética antes de sofrer uma reação química que a leve a um estado mais favorável Figura 221 No caso da queima do livro a energia de ativação pode ser fornecida pelo calor de um palito de fósforo aceso Para moléculas que estejam em solução aquosa no interior das células esse salto energético é obtido por colisões energéticas aleatórias que tenham um grau de energia incomum colisões que se tornam cada vez mais violentas conforme a tem peratura aumenta A química das células vivas é estritamente controlada porque o salto sobre a bar reira energética é enormemente facilitado por uma classe de proteínas especializadas as enzimas Cada enzima ligase com alta afinidade a uma ou mais moléculas denomina das substratos e os mantêm em uma conformação que reduz em muito a energia de ati vação da reação química que as moléculas de substrato ligadas podem sofrer Qualquer substância que diminua a energia de ativação de uma reação é denominada catalisador Os catalisadores aumentam a velocidade das reações químicas porque facilitam a ocor rência de uma proporção muito maior de colisões ao acaso entre as moléculas ao seu re dor e os substratos com energias que ultrapassam a barreira de energia da reação como Figura 221 O importante princípio da energia de ativação A O compos to Y reagente é relativamente estável sendo necessário haver adição de energia para que seja convertido no composto X produto mesmo que X tenha um nível energético menor do que Y Entretanto essa conversão não ocorrerá a menos que o composto Y possa adquirir energia de ativação energia a menos energia b suficiente dos arredores para permitir que a reação o converta no composto X Essa energia pode ser fornecida por meio de uma colisão inusitadamente rica em energia com outra molécula Para a reação inversa X n Y a energia de ativação será muito maior energia a menos energia c Portanto essa reação ocorrerá muito mais raramente Energias de ativação são sempre positivas observe entretanto que o total de mudança de energia para uma reação energeticamente favorável Y n X é energia c menos energia b um número negativo B Barreiras energéticas para reações específicas podem ser diminuídas por um catalisador indicado pela linha marcada com d As enzimas são catalisa dores especialmente eficazes por reduzi rem enormemente a energia de ativação das reações que elas executam Energia de ativação para a reação Y X Via da reação não catalisada Energia total Y X a b A enzima diminui a energia de ativação para a reação catalisada Y X Via da reação catalisada por uma enzima Energia total Y X d b c c Reagente Produto Reagente Produto A B 58 PARTE I Introdução à célula ilustrado na Figura 222 As enzimas estão incluídas entre os catalisadores conhecidos mais eficazes algumas são capazes de acelerar as reações por fatores de até 10 14 ou mais Elas permitem assim que reações que não poderiam ocorrer por outros meios ocorram rapidamente em temperaturas normais As enzimas podem conduzir moléculas de substrato por vias de reações específicas Uma enzima não muda o ponto de equilíbrio de uma reação a razão é simples quando uma enzima ou qualquer outro catalisador diminui a energia de ativação da reação Y n X ela também diminui a energia de reação de X n Y exatamente pelo mesmo valor ver Figura 221 Assim as enzimas aceleram as reações direta e reversa pelo mesmo fator e o ponto de equilíbrio da reação não se modifica Figura 223 Portanto não im porta o quanto uma enzima acelere a reação ela não poderá mudar a direção da reação Apesar da limitação acima as enzimas conduzem todas as reações das células através de sequências ou vias específicas da reação Isso ocorre porque as enzimas são ao mesmo tempo altamente seletivas e muito precisas Elas geralmente catali sam apenas uma determinada reação Em outras palavras elas baixam seletivamente a energia de ativação de apenas uma das várias reações químicas que os substratos ligados a elas podem sofrer Dessa maneira conjuntos de enzimas podem direcionar cada uma das diferentes moléculas de uma célula por uma determinada via de reação Figura 224 O sucesso dos seres vivos é atribuído à capacidade que as células têm de produ zirem muitos tipos de enzimas cada uma com propriedades muito específicas Cada enzima tem uma forma única que contém um sítio ativo um bolsão ou uma fenda no qual apenas um determinado substrato pode se ligar Figura 225 Assim como todos os outros catalisadores as moléculas enzimáticas permanecem inalteradas após participarem de uma reação de modo que podem atuar novamente por muitos Figura 222 A diminuição da energia de ativação aumenta muito a probabi lidade de ocorrência de uma reação A cada momento uma população de mo léculas idênticas de determinado substrato distribuise em uma faixa de energia con forme mostrado no gráfico Essas varia ções de energia decorrem de colisões com moléculas das proximidades que fazem as moléculas oscilarem vibrarem e girarem A energia de uma molécula que sofre reação química deve exceder a barreira da energia de ativação da reação linhas tracejadas Na maioria das reações biológicas isso quase nunca é atingido sem que haja catálise Mesmo na catálise enzimática as moléculas de substrato devem sofrer uma colisão com determinada energia para reagirem área sombreada em vermelho Um aumento de temperatura aumenta o número de moléculas com energia sufi ciente para superar a energia de ativação necessária para a reação Entretanto ao contrário do que ocorre na catálise enzi mática esse efeito não é seletivo e todas as reações são aceleradas Animação 22 Energia necessária para que ocorra uma reação química catalisada por enzima Energia necessária para que ocorra uma reação química não catalisada Moléculas com energia média Energia por molécula Número de moléculas X Y X Y REAÇÃO NÃO CATALISADA NO EQUILÍBRIO A B REAÇÃO CATALISADA POR ENZIMA NO EQUILÍBRIO Figura 223 As enzimas não mudam o ponto de equilíbrio das reações As enzimas assim como qualquer catalisador aceleram a velocidade das reações tanto no sentido direto como no sentido inverso pelo mesmo fator Consequentemente tanto para a reação catalisada quanto para a reação não catalisada mostradas aqui o número de moléculas que sofrem transição X n Y é igual ao número de moléculas que sofrem a transição Y n X quando a relação entre o número de moléculas de Y e de X for de 3 para 1 Em outras palavras as duas reações atingem o equilíbrio exatamente no mesmo ponto CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 59 e muitos ciclos No Capítulo 3 o funcionamento das enzimas será discutido em mais detalhes Como as enzimas encontram seus substratos a enorme rapidez dos movimentos das moléculas Uma enzima normalmente catalisa uma reação por cerca de mil moléculas do substra to a cada segundo Isso significa que ela deve ser capaz de ligar uma nova molécula de substrato em frações de milissegundo Entretanto tanto as enzimas como os seus subs tratos estão presentes nas células em um número relativamente pequeno Como então enzima e substratos se encontram tão rapidamente A rapidez da associação é possível porque no nível molecular o movimento causado pela energia cinética é muito veloz Essa movimentação molecular pode ser classificada em três tipos 1 o movimento de uma molécula de um lugar a outro movimento de translação 2 o rápido movimento para a frente e para trás de átomos que estejam ligados de forma covalente um em re lação ao outro vibração e 3 rotações Todos esses movimentos são importantes para que as superfícies das moléculas que interagem fiquem unidas As velocidades desses movimentos moleculares podem ser medidas por diversas técnicas espectroscópicas Uma molécula de uma proteína globular grande cai constan temente girando ao redor do seu próprio eixo cerca de 1 milhão de vezes por segundo As moléculas também estão em constante movimento translacional o que faz elas ex plorarem o espaço intracelular com muita eficiência pois ficam vagando pelo interior da célula esse processo é denominado difusão Dessa maneira a cada segundo cada uma das moléculas de uma célula colide com um número enorme de outras moléculas Uma vez que as moléculas presentes em um líquido colidem umas com as outras e rico cheteiam seus percursos terminam por ser uma trajetória aleatória Figura 226 Nessa trajetória a distância média que cada molécula viaja como uma mosca zanzando a partir de seu ponto de partida é proporcional à raiz quadrada do tempo envolvido Isto é se uma molécula leva 1 segundo para se deslocar uma média de 1 μm leva 4 segundos para se deslocar 2 μm 100 segundos para se deslocar 10 μm e assim por diante O interior das células é bastante congestionado Figura 227 Mesmo assim expe rimentos nos quais marcadores fluorescentes e outras moléculas marcadas foram injeta dos em células mostram que as moléculas orgânicas pequenas difundemse através do gel aquoso do citosol praticamente tão rápido quanto na água Uma molécula orgânica pequena por exemplo leva apenas cerca de um quinto de segundo em média para di fundirse a uma distância de 10 μm A difusão é portanto uma maneira eficiente que as moléculas pequenas têm para se moverem a distâncias limitadas no interior das células uma típica célula animal tem um diâmetro de 15 μm Figura 224 A catálise enzimática direciona moléculas de substrato através de uma via específica de reações Uma molécula de substrato esfera verde em uma célula é convertida em uma molécula diferente esfera azul através de uma série de reações catalisadas por enzimas Como está indicado quadros amarelos em cada etapa várias reações são energeticamente favoráveis e cada reação é catalisada por uma enzima diferente Assim conjuntos de enzimas determinam com precisão a via de reação tomada pelas moléculas presentes no interior das células Energia Molécula A substrato Molécula B produto Complexo enzimasubstrato Complexo enzimaproduto CATÁLISE Enzima Enzima Sítio ativo Figura 225 Como as enzimas funcionam Cada enzima tem um sítio ativo ao qual se ligam uma ou mais moléculas de substrato formando um complexo enzimasubstrato A reação ocorre no sítio ativo e produz um complexo enzimaproduto O produto é então liberado possibilitando que a enzima se ligue a novas moléculas de substrato 60 PARTE I Introdução à célula Uma vez que em uma célula as enzimas movemse mais vagarosamente do que os substratos podese considerar que elas estejam paradas A proporção de encontros de cada molécula de enzima com seus substratos depende da concentração de molécu las do substrato nas células Por exemplo alguns dos substratos mais abundantes estão presentes em concentrações de 05 mM Como a concentração da água pura é 555 M há apenas uma dessas moléculas de substrato nas células para cada 10 5 moléculas de água Mesmo assim o sítio ativo de uma molécula de enzima que liga o substrato será bombar deado com cerca de 500 mil colisões aleatórias desse substrato por segundo Para uma concentração de substrato dez vezes menor o número de colisões diminui para 50 mil e assim por diante Uma colisão aleatória entre o sítio ativo de uma enzima e a superfície correspondente de uma molécula que seja seu substrato em geral leva à formação de um complexo enzimasubstrato imediatamente Assim uma reação pela qual uma ligação covalente é formada ou rompida pode ocorrer com extrema rapidez Quando se percebe o quão rapidamente as moléculas movimentamse e reagem as velocidades das reações enzimáticas não parecem tão impressionantes assim Duas moléculas que podem se manter unidas por ligações não covalentes também podem se dissociar As muitas ligações não covalentes que essas moléculas formam en tre si persistem até que a energia cinética aleatória faz elas se separarem Geralmente quanto mais forte for a ligação da enzima com seu substrato menor será sua constante de dissociação Ao contrário quando duas moléculas em colisão tiverem superfícies que se encaixam mal elas formarão poucas ligações não covalentes e a energia total de asso ciação será desprezível em comparação com a energia cinética Nesse caso as duas mo léculas dissociamse tão rapidamente quanto se associam É isso que evita associações incorretas e indesejadas entre moléculas que não se encaixam como ocorre entre uma enzima e um substrato errado A variação na energia livre da reação G determina se ela pode ocorrer espontaneamente Embora as enzimas acelerem as reações elas por si mesmas não podem fazer reações des favoráveis ocorrerem Fazendo uma analogia com a água as enzimas por si mesmas não podem fazer a água correr morro acima As células entretanto devem fazer exatamente isso para crescer e se dividir pois devem construir a partir de moléculas simples moléculas altamente organizadas e energeticamente ricas Veremos que isso é feito por meio de enzi mas que acoplam diretamente reações energeticamente favoráveis que liberam energia e produzem calor a reações energeticamente desfavoráveis que produzem ordem biológica O que significa para um biólogo celular o termo energeticamente favorável e como é que isso pode ser quantificado De acordo com a segunda lei da termodinâmica o universo tende para a desordem máxima maior entropia ou maior probabilidade As sim uma reação química só pode ocorrer de forma espontânea se produzir um aumento líquido da desordem do universo ver Figura 216 A desordem do universo pode ser ex plicada mais convenientemente em termos de energia livre de um sistema Esse conceito foi visto anteriormente Energia livre G é uma expressão da energia disponível para realizar um trabalho por exemplo o trabalho que impele uma reação química O valor de G interessa somente quando os sistemas passam por alguma variação que recebe a notação G delta G A variação de G é crucial porque como está explicado no Painel 27 p 102103 G é uma medida direta da quantidade de desordem criada no universo quando a reação ocorre As reações energeticamente favoráveis por definição são aquelas que diminuem a energia livre ou em outras palavras têm um G negativo e aumentam a desordem do universo Figura 228 Distância final percorrida Figura 226 Trajetória aleatória Em uma solução as moléculas movemse de maneira aleatória devido às constantes colisões com outras moléculas Esse mo vimento como descrito no texto permite que as moléculas pequenas difundamse rapidamente de uma parte à outra da cé lula Animação 23 Figura 227 A estrutura do citoplasma A ilustração foi feita em uma escala apro ximada para enfatizar o quanto o citoplasma é congestionado Estão mostradas ape nas as macromoléculas RNA em azul ribossomos em verde e proteínas em vermelho As enzimas e as outras macromoléculas difundemse no citoplasma com relativa lentidão devido em parte ao fato de interagirem com um grande número de outras macromoléculas As moléculas pequenas no entanto difundemse tão rapidamente quanto o fazem em água Animação 24 Adaptada de DS Goodsell Trends Bio chem Sci 16203206 1991 Com permissão de Elsevier 100 nm CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 61 Um exemplo em escala macroscópica de uma reação energeticamente favorável é a reação pela qual uma mola que esteja comprimida relaxa até um estado expandido liberando no ambiente em forma de calor a energia elástica que estava armazenada Um exemplo em escala microscópica é a dissolução do sal em água Consequentemente as reações energeticamente desfavoráveis com G positivo como aquelas nas quais dois aminoácidos são ligados para formar uma ligação peptídica criam por si mesmas ordem no universo Por conseguinte essas reações só podem ocorrer se estiverem acopladas a uma segunda reação que tenha um G negativo suficientemente grande para que o G de todo o processo seja negativo Figura 229 As concentrações dos reagentes influenciam a variação de energia livre e a direção da reação Como recémdescrito a reação Y fn X irá na direção Y n X quando a mudança de energia livre G associada à reação for negativa exatamente do mesmo modo que uma mola tencionada deixada por si própria relaxa perdendo a energia que tinha armazenada na forma de calor para o ambiente Nas reações químicas entretanto G depende não so mente da energia armazenada em cada uma das moléculas mas também da concentra ção de moléculas na mistura de reação Observe que o G reflete o grau pelo qual uma reação cria mais desordem dito em outras palavras leva a um estado do universo que é mais provável Retomando a analogia com a moeda é muito mais provável que uma moeda mude da posição cara para a coroa se o cesto de embaralhar moedas tiver 90 moedas na posição cara e 10 na posição coroa Por outro lado esse evento será muito menos provável se o cesto tiver 10 moedas na posição cara e 90 na posição coroa O mesmo é verdadeiro para as reações químicas Na reação reversível Y fn X um grande excesso de Y em relação a X impelirá a reação na direção Y n X Desse modo quanto maior for a relação entre Y e X mais G tornase negativo para a transição Y n X e mais positivo para a transição X n Y O quanto deve ser a diferença de concentração necessária para compensar um determinado decréscimo na energia de ligação química e a liberação de calor que a acompanha não é intuitivamente óbvio Essa relação foi determinada no final do século XIX pela análise termodinâmica que possibilitou separar os componentes da variação de energia livre que dependem da concentração dos componentes que não dependem da concentração como descrito a seguir A variação da energia livre padrão G permite comparar a energética de reações diferentes Devido ao fato de em determinado instante G depender da concentração das molécu las presentes na mistura de reação ele não é útil para comparar entre si as energias de diferentes tipos de reações Para colocar as reações em bases comparáveis é necessário que se utilize a variação da energia livre padrão da reação G O G é a variação de energia livre sob uma condiçãopadrão definida como aquela na qual as concentrações de todos os reagentes são 1 molL Definida dessa maneira o G depende apenas das propriedades intrínsecas das moléculas reagentes Para a reação simples Y n X a 37 C G se relaciona com G do seguinte modo onde G é expresso em quilojoule por mol Y e X indicam as concentrações de Y e X em molL ln é o logaritmo natural e RT é o produto da constante dos gases R pela temperatura absoluta T A 37 C RT 258 J mol 1 1 mol equivale a 6 10 23 moléculas de substância O acúmulo de um grande volume de dados termodinâmicos possibilitou determi nar a variação de energia livre padrão G das reações metabólicas importantes para as células Com esses valores de G combinados com informações sobre a concentração dos metabólitos e as vias de reações é possível predizer de forma quantitativa o curso da maioria das reações biológicas Y X A energia livre de Y é maior do que a energia livre de X Portanto G 0 e a desordem do universo aumenta quando a reação Y n X ocorre Essa reação ocorre espontaneamente REAÇÃO ENERGETICAMENTE FAVORÁVEL Y X Essa reação poderá ocorrer apenas se estiver acoplada a uma segunda reação energeticamente favorável REAÇÃO ENERGETICAMENTE DESFAVORÁVEL Se a reação X n Y ocorresse G seria 0 e o universo ficaria mais ordenado Figura 228 Distinção entre reações ener geticamente favoráveis e energeticamente desfavoráveis G positivo G negativo A reação energeticamente desfavorável X n Y é impulsionada pela reação energeticamente favorável C n D porque a variação de energia livre do par de reações acopladas é menor que zero D Y X C Figura 229 Como o acoplamento de rea ções é utilizado para fazer reações energe ticamente desfavoráveis ocorrerem PARA A REAÇÃO ENERGETICAMENTE FAVORÁVEL Y X Figura 230 Equilíbrio químico Quando uma reação atinge o equilíbrio os fluxos de moléculas reagentes nos dois sentidos da reação são iguais e opostos ASSIM PARA CADA MOLÉCULA INDIVIDUALMENTE POR FIM haverá um excesso de X em relação a Y grande o suficiente para compensar a baixa velocidade de X Y de tal forma que a cada segundo o número de moléculas de Y sendo convertidas em X é exatamente igual ao número de moléculas de Y sendo convertidas em X Nesse ponto a reação estará em equilíbrio NO EQUILÍBRIO não há mudança líquida na relação entre Y e X e o ΔG tanto para a reação direta como para a reação inversa é zero A constante de equilíbrio e o ΔG podem ser facilmente derivados um do outro A equação anterior mostra que o valor de ΔG é igual ao valor de ΔG quando as concentrações de Y e X são iguais Mas à medida que uma reação favorável continua ocorrendo as concentrações dos produtos aumentam e as concentrações dos substratos diminuem Essa mudança nas concentrações relativas leva a um aumento gradativo de XY tornando o ΔG inicialmente favorável cada vez menos negativo o logaritmo de um número x é positivo se x 1 negativo se x 1 e zero se x 1 Por fim quando ΔG 0 o equilíbrio químico é atingido Agora não há mudança líquida na variação de energia livre para impelir a reação em uma das direções enquanto o efeito da concentração balanceia o empurrão que ΔG dá para a reação O resultado é que em uma situação de equilíbrio químico a relação entre produto e substrato atinge um valor constante Figura 230 Podese definir a constante de equilíbrio K para a reação Y X como onde X é a concentração do produto e Y é a concentração do reagente no equilíbrio Recordando que ΔG ΔG RT ln XY e que ΔG 0 no equilíbrio observase que ΔG RT ln XY RT ln K A 37 C onde RT 258 o equilíbrio da equação é então ΔG 258 ln K CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 63 Convertendo essa equação do logaritmo natural ln para o mais usado logaritmo de base 10 obtémse G 594 log K A equação supracitada mostra como a razão de equilíbrio X para Y expressa como constante de equilíbrio K depende de propriedades intrínsecas das moléculas expressa em termos de G em quilojoules por mol Observe que a 37C para cada 594 kJmol de diferença na energia livre a constante de equilíbrio é alterada por um fa tor de 10 Tabela 22 Portanto quanto mais energeticamente favorável for uma reação mais produto se acumulará se a reação se dirigir para o equilíbrio Geralmente para uma reação que tem vários reagentes e produtos como A B C D As concentrações dos dois reagentes e dos dois produtos são multiplicadas porque a velocidade da reação direta depende de colisões entre A e B e a velocidade da reação inversa depende de colisões entre C e D Assim a 37C onde G é expresso em quilojoule por mol e A B C e D indicam as concentrações dos reagentes e produtos em mollitro As variações de energia livre de reações acopladas são aditivas Foi ressaltado que reações desfavoráveis podem se acoplar a reações favoráveis para pro mover reações não favoráveis ver Figura 229 Isso é possível em termos termodinâ micos porque a variação de energia livre total de um conjunto de reações acopladas é a soma das variações de energia livre de cada uma das etapas Considerando como um simples exemplo duas reações em sequência X n Y e Y n Z onde os valores de G são 5 e 13 kJmol respectivamente Se essas duas reações ocorrerem sequencialmente o G para a reação acoplada será 8 kJmol Isso significa que em condições apropriadas a reação desfavorável Y n Y pode ser impulsionada pela reação favorável Y n Z desde que essa segunda reação ocorra depois da primeira Por exemplo muitas reações da longa via que converte açúcares em CO2 e H2O tem valores de G positivos Porém mesmo assim a via ocorre porque o G total para toda a série de reações em sequência tem um enorme valor negativo Para muitas finalidades a formação de uma via sequencial não é adequada Fre quentemente a via desejada é apenas X n Y sem a conversão posterior de Y em outro produto Afortunadamente existem outras maneiras de uso de enzimas para acoplar reações Essas maneiras geralmente envolvem a ativação de moléculas carreadoras como será discutido a seguir Moléculas carreadoras ativadas são essenciais para a biossíntese A energia liberada pela oxidação das moléculas dos alimentos deve ser armazenada tem porariamente antes que possa ser canalizada para a síntese das várias outras moléculas de que a célula necessita Em muitos casos a energia é armazenada como energia de ligação química em um pequeno número de moléculas carreadoras as quais contêm uma ou mais ligações covalentes ricas em energia Essas moléculas difundemse de for ma rápida pela célula carregando assim energias de ligação dos locais de geração de energia para locais onde a energia será utilizada para a biossíntese e outras atividades necessárias para as células Figura 231 Esses carreadores ativados armazenam energia de uma forma facilmente inter cambiável tanto como grupos químicos facilmente transferíveis como carreadores de elétrons em um estado de alto nível energético e eles podem desempenhar um duplo TABELA 22 Relação entre a variação de energia livre padrão G e a constante de equilíbrio Constante de equilíbrio K Energia livre de X menos energia livre de Y kJmol kcalmol 10 5 297 71 10 4 238 57 10 3 178 43 10 2 119 28 10 1 59 14 1 0 0 10 1 59 14 10 2 119 28 10 3 178 43 10 4 238 57 10 5 297 71 Os valores das constantes de equilíbrio foram calculados para uma reação química simples Y fn X usando a equação apresentada no texto G o está indicado em quilojoules por mol a 37ºC e em quilocalorias por mol entre parênteses Um quilojoule kJ é igual a 0239 quilocalorias kcal 1 kcal 418 kJ Como está explicado no texto G representa a di ferença de energia livre sob condiçõespadrão onde todos os componentes estão presentes na concentração de 10 mollitro A partir dessa tabela podese verificar que se há uma variação de energia livre padrão G de 178 kJmol 43 kcalmol favorável para a tran sição Y n X haverá no equilíbrio mil vezes mais moléculas no estado X do que no estado Y K 1000 64 PARTE I Introdução à célula papel como fonte tanto de energia quanto de grupos químicos para as reações biossin téticas Devido a razões históricas essas moléculas muitas vezes são chamadas de co enzimas As mais importantes dessas moléculas carreadoras ativadas são o ATP e duas moléculas intimamente relacionadas entre si o NADH e o NADPH As células usam car readores de moléculas ativadas como se fossem uma forma de dinheiro para pagar por reações que de outra forma não poderiam ocorrer A formação de um carreador ativado está acoplada a uma reação energeticamente favorável Os mecanismos de acoplamento requerem de enzimas e são fundamentais para todas as transferências de energia das células A natureza das reações acopladas está ilustra da na Figura 232 por meio de uma analogia mecânica na qual uma reação química favorável é representada por pedras que despencam de um penhasco A energia das pe dras que caem seria totalmente desperdiçada na forma de calor gerado pela fricção das pedras ao atingirem o solo ver diagrama do tijolo caindo na Figura 217 Por meio de um sistema cuidadosamente montado entretanto parte dessa energia pode ser usada para movimentar uma pá giratória que levanta um balde Figura 232B Como agora as pedras só podem atingir o solo depois de acionar a pá podese dizer que a reação energeticamente favorável da queda das pedras foi acoplada diretamente à reação ener geticamente desfavorável de levantar o balde de água Observe ainda que como parte da energia foi usada para realizar um trabalho na Figura 232B as pedras chegam ao solo com uma velocidade menor do que na Figura 232A e assim uma energia proporcional mente menor é dissipada como calor Figura 231 Transferência de energia e o papel dos carreadores ativados no metabolismo Por atuarem como doadores e receptores de energia essas moléculas carreadoras de energia desem penham sua função como intermediárias que acoplam a degradação das moléculas dos alimentos e a liberação de energia catabolismo à biossíntese que requer de energia de moléculas orgânicas pequenas e grandes anabolismo Molécula de alimento Molécula de alimento oxidada ENERGIA ENERGIA CATABOLISMO ANABOLISMO Molécula de que a célula necessita Molécula disponível na célula Molécula de carreador ativado ENERGIA Reação energeticamente favorável Reação energeticamente desfavorável TRABALHO ÚTIL Calor Calor A B C Mecanismo hidráulico A energia cinética das pedras despencando é transformada apenas em energia térmica Parte da energia cinética é utilizada para levantar um balde de água e uma quantidade de energia proporcionalmente menor é transformada em calor A energia cinética potencial armazenada no balde de água levantado pode ser usada para impulsionar um mecanismo hidráulico que execute um trabalho útil Figura 232 Modelo mecânico que ilustra o princípio de acoplamento de reações químicas A reação espontânea mostrada em A serve de analogia para a oxidação direta de glicose a CO2 e H2O que produz apenas calor Em B a mesma reação está acoplada a uma segunda reação Essa segunda reação pode servir como uma analogia da síntese de molé culas carreadoras ativadas A energia que é produzida em B está em uma forma muito mais útil do que a produzida em A podendo ser utilizada para que ocorra uma variedade de reações que de outra maneira seriam energeticamente desfa voráveis C CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 65 Um processo semelhante ocorre nas células onde as enzimas fazem o papel da pá giratória Por meio de mecanismos que serão discutidos posteriormente neste capítulo as enzimas acoplam reações energeticamente favoráveis como a oxidação dos alimen tos com reações energeticamente desfavoráveis como a geração de moléculas carrea doras ativadas Nesse exemplo a quantidade de calor liberado nas reações de oxidação é diminuída por um valor exatamente igual à quantidade de energia armazenada nas ligações covalentes ricas em energia das moléculas carreadoras ativadas E a molécula carreadora ativada recebe uma quantidade de energia que é suficiente para que uma reação química possa ocorrer em outro lugar da célula O ATP é a molécula carreadora ativada mais amplamente utilizada A molécula carreadora ativada mais importante e versátil que as células possuem é o ATP adenosina trifosfato Exatamente da mesma maneira que a energia armazenada pela ele vação do balde de água na Figura 232B pode ser usada para movimentar mecanismos hi dráulicos dos mais diversos o ATP funciona como um depósito conveniente e versátil uma forma de moeda corrente de energia usado para que uma grande variedade de reações químicas possa ocorrer nas células O ATP é sintetizado em uma reação de fosforilação al tamente desfavorável do ponto de vista energético na qual um grupo fosfato é adicionado à ADP adenosina difosfato Quando necessário o ATP doa certa quantidade de energia por meio de sua hidrólise energeticamente muito favorável formando ADP e fosfato inorgâni co Figura 233 O ADP regenerado fica então disponível para ser utilizado em outro ciclo de reação de fosforilação que forma ATP novamente A reação energeticamente favorável da hidrólise do ATP é acoplada a muitas outras reações que sem esse acoplamento seriam desfavoráveis nas quais são sintetizadas outras moléculas Muitas dessas reações acopladas envolvem a transferência do fosfato terminal do ATP para alguma outra molécula como ilustrado na reação de fosforilação mostrada na Figura 234 Por ser o carreador ativado de energia mais abundante nas células o ATP é a prin cipal moeda corrente Dando apenas dois exemplos o ATP fornece energia para muitas das bombas que transportam substâncias para dentro e para fora das células discutido no Capítulo 11 e ele dá energia para os motores moleculares que possibilitam que as células musculares contraiamse e as células nervosas transportem materiais de uma a outra das extremidades dos seus longos axônios discutido no Capítulo 16 A energia armazenada no ATP geralmente é utilizada para promover a ligação de duas moléculas Discutimos anteriormente a maneira pela qual reações energeticamente favoráveis podem ser acopladas a uma reação desfavorável X n Y possibilitando assim que ela ocorra Nessa reação uma segunda enzima catalisa a reação energeticamente favorável Y n Z levando todo o X a ser transformado em Y Entretanto esse mecanismo não terá utilidade quando o produto necessário for Y e não Z Figura 233 Hidrólise de ATP a ADP e fosfato inorgânico Os dois fosfatos mais externos do ATP são mantidos ligados ao resto da molécula por ligações fosfoani drido anidrido fosfórico de alta energia e que podem ser facilmente transferidas Como indicado a adição de água ao ATP pode formar ADP e fosfato inorgânico Pi A hidrólise do fosfato terminal do ATP produz entre 46 e 54 kJmol de energia utilizável dependendo das condições intracelulares O grande valor negativo do G dessa reação provém de vários fatores a liberação do grupo fosfato terminal remove a repulsão desfavorável entre car gas negativas adjacentes e o íon fosfato inorgânico Pi liberado é estabilizado por ressonância e pela formação favorável de ligações de hidrogênio com água H O P O O P O CH2 ADENINA RIBOSE O O O P O O O O P O O P O CH2 ADENINA RIBOSE O O O P O OH O O Fosfato inorgânico Pi Ligações fosfoanidrido H2O ATP ADP 66 PARTE I Introdução à célula Geralmente uma reação de biossíntese típica é aquela na qual duas moléculas A e B são ligadas produzindo AB por meio de uma reação de condensação altamente desfavorável AH BOH n AB H2O Existe uma via indireta que permite que AH e BOH formem AB na qual o aco plamento da reação de hidrólise do ATP possibilita que a reação ocorra Nesse caso a energia da hidrólise do ATP é inicialmente utilizada para converter BOH em um com posto intermediário rico em energia que então reage diretamente com AH resultando em AB O mecanismo mais simples envolve a transferência de um fosfato do ATP para BOH produzindo BOPO3 Nesse caso a via terá apenas duas etapas 1 BOH ATP n BOPO3 ADP 2 AH BOPO3 n AB Pi Resultado líquido BOH ATP AH n AB ADP Pi A reação de condensação que é energeticamente desfavorável é forçada a ocorrer porque está diretamente acoplada à hidrólise do ATP em uma via de reações catalisadas por enzimas Figura 235A Figura 234 Exemplo de reação de transferência de grupo fosfato Essa reação é energeticamente favorável e então possui um valor muito negativo de G porque a ligação rica em energia da ligação fosfoanidrido do ATP é convertida em ligação fosfoéster Reações desse tipo estão envolvidas na síntese dos fosfolipí deos e nas etapas iniciais do catabolismo dos açúcares O P O O P O CH2 ADENINA RIBOSE O O O P O O O O P O O P O CH2 ADENINA RIBOSE O O O P O O O O Ligação fosfoanidrido Ligação fosfoéster C C C C HO TRANSFERÊNCIA DE FOSFATO Grupo hidroxila em outra molécula ADP ATP ADP ΔG 0 Figura 235 Exemplo de uma reação biossintética energeticamente des favorável facilitada pela hidrólise de ATP A Ilustração esquemática da formação de AB pela reação de conden sação descrita no texto B Biossíntese do aminoácido glutamina a partir do ácido glutâmico e de amônia Inicialmente o ácido glutâmico é convertido em um intermediário fosforilado rico em energia correspondendo ao composto BOPO3 descrito no texto que então reage com a amônia corresponde a AH formando glutamina Nesse exemplo as duas etapas ocorrem na superfície da mesma enzima glutamina sintetase As ligações ricas em energia estão marcadas em vermelho aqui como ocorre ao longo de todo este livro o símbolo Pi HPO4 2 e P dentro de um círculo amarelo indica PO3 2 O O C CH2 CH H3N COO CH2 O OH C CH2 CH H3N COO CH2 NH3 Amônia NH2 Intermediário de alta energia Intermediário de alta energia Ácido glutâmico O C CH2 CH COO CH2 Glutamina A B OH B B B O A A H Produtos da hidrólise do ATP Produtos da hidrólise do ATP ETAPA DE ATIVAÇÃO ETAPA DE ATIVAÇÃO ETAPA DE CONDENSAÇÃO ETAPA DE CONDENSAÇÃO ADP H3N ATP ATP ADP ADP P Pi Pi P CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 67 Uma reação biossintética exatamente desse tipo é usada para sintetizar o amino ácido glutamina Figura 235B Adiante será visto que mecanismos muito similares porém mais complexos são usados na produção de quase todas as moléculas grandes das células NADH e NADPH são importantes carreadores de elétrons Outras moléculas carreadoras ativadas são importantes participantes de reações de oxidaçãoredução e geralmente também participam de reações celulares acopladas Esses carreadores ativados são especializados no transporte de elétrons com alto nível energético também denominados elétrons de alta energia e átomos de hidrogênio Os mais importantes desses carreadores de elétrons são o NAD nicotinamida adenina dinucleotídeo e a molécula intimamente relacionada NADP fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo Cada um deles aceita um pacote de energia correspondendo a dois elétrons mais um próton H convertendoos em NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido e NADPH fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo redu zido respectivamente Figura 236 Por isso essas moléculas podem ser vistas como carreadores de íons hidreto o H mais dois elétrons ou H Assim como o ATP o NADPH é um carreador ativado que participa de muitas rea ções biossintéticas importantes que de outra maneira seriam energeticamente desfa voráveis O NADPH é produzido segundo o esquema geral mostrado na Figura 236A Dois átomos de hidrogênio são removidos da molécula do substrato em determinadas reações catabólicas que geram energia Em um conjunto especial de reações catabólicas que produzem energia dois elétrons e apenas um próton ie um íon hidreto H são adicionados ao anel nicotinamida do NADP formando assim NADPH o segundo pró H C C H O OH ADENINA RIBOSE O O RIBOSE O N H O C NH2 ADENINA RIBOSE O RIBOSE O N H O C NH2 H H Anel da nicotinamida A C B O Este grupo fosfato não está presente no NAD e no NADH oxidado reduzido C C C C H H Redução da molécula 2 Oxidação da molécula 1 NADP NADPH NADPH NADP P P P P P P Figura 236 NADPH um carreador de elétrons importante A NADPH é produzido em reações do tipo geral mostradas no lado esquerdo nas quais há remoção de dois átomos de hidrogênio de um substrato A forma oxida da da molécula carreadora NADP recebe um átomo de hidrogênio e um elétron um íon hidreto o próton H de um outro átomo de H é liberado para a solução Uma vez que NADPH mantém o íon hidreto por meio de uma ligação rica em energia esse íon pode ser facilmente transferido para outras moléculas como é mostrado no lado direito da figura B e C estruturas do NADP e do NADPH A parte da molécula de NADP conhecida como anel da nicotinamida aceita o íon hidreto H formando dessa forma NADPH As moléculas de NAD e NADH têm estrutura idêntica a NADP e NADPH res pectivamente exceto pela ausência do grupo fosfato indicado 68 PARTE I Introdução à célula ton H é liberado na solução Essa é uma reação de oxidaçãoredução típica na qual o substrato é oxidado e o NADP é reduzido O íon hidreto carregado pelo NADPH é doado rapidamente por meio de uma reação de oxidaçãoredução subsequente pois sem o íon hidreto o anel fica com um arranjo de elétrons mais estável Nessas reações subsequentes que regeneram o NADP é o NADPH que se torna oxidado e o substrato fica reduzido O NADPH é um doador efetivo de íon hidreto para outras moléculas pela mesma razão pela qual o ATP transfere fosfatos com facilidade Em ambos os casos a transferência é acompanhada por uma grande variação negativa na energia livre Um exemplo do uso do NADPH na biossíntese é mostrado na Figura 237 O grupo fosfato extra não tem efeito nas propriedades de transferência de elétrons do NADPH em relação ao NADH por localizarse distante da região que participa da transferência de elétrons ver Figura 236C Ele entretanto deixa a molécula de NADPH com uma forma levemente diferente da forma do NADH de modo que o NADPH e o NADH ligamse como substratos a diferentes grupos de enzimas Assim os dois tipos de carreadores são usados para transferir elétrons ou íons hidreto entre diferentes conjun tos de moléculas Por que existe essa divisão de trabalho A resposta baseiase na necessidade da re gulação independentemente de dois conjuntos de reações de transferência de elétrons O NADPH se liga principalmente a enzimas que catalisam reações anabólicas provendo os elétrons ricos em energia que são necessários para a síntese de moléculas biológicas ricas em energia O NADH ao contrário tem um papel específico como intermediário no sistema de reações catabólicas que geram ATP pela oxidação das moléculas dos alimen tos como será discutido brevemente A geração do NADH a partir do NAD e a geração do NADPH a partir do NADP ocorre por vias diferentes que são reguladas de forma independente de maneira que as células podem ajustar o suprimento de elétrons para esses dois propósitos antagônicos de maneira independente uma da outra No interior das células a proporção entre NAD e NADH é mantida alta enquanto a proporção entre NADP e NADPH é mantida baixa Isso assegura uma enorme disponibilidade de NAD para funcionar como agente oxidante e NADPH em abundância para agir como agente redutor Figura 237B assim essas funções específicas atendem às exigências do cata bolismo e do anabolismo respectivamente H HO H C C HO H C C H H 7desidroxicolesterol Colesterol NADP NADPH A NADH NADPH NADP NAD Agente redutor para o anabolismo Agente oxidante para o catabolismo B Figura 237 NADPH como agente redutor A Estágio final da via da biossíntese de colesterol Assim como em muitas outras reações biossintéticas a redução da ligação CC é feita pela transferência de um íon hidreto proveniente da molécula de NADPH e de um próton H da solução B A manutenção de NADPH em níveis al tos e de NADH em níveis baixos altera as suas afinidades por elétrons ver Painel 141 p 765 Isso faz o NADPH ser um doador de elétrons muito mais forte agente redutor do que o NADH e portanto NAD é um aceptor de elétrons agente oxidante melhor que o NADP conforme indicado CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 69 Existem muitas outras moléculas de carreadores ativados nas células Outros carreadores ativados também aceitam e transportam grupos químicos que po dem ser facilmente transferidos na forma de ligações ricas em energia Por exemplo a coenzima A carrega por meio de uma ligação tioéster um grupo acetila facilmente trans ferível que nessa forma ativada é conhecido como acetilCoA acetilcoenzima A A acetilCoA Figura 238 é usada para adicionar unidades de dois carbonos em pro cessos de biossíntese de moléculas grandes Na acetilCoA assim como outras moléculas carreadoras os grupos transferíveis constituem apenas uma pequena parte da molécula O restante consiste em uma grande porção orgânica que serve como um portador conveniente que facilita o reconhecimen to da molécula carreadora por enzimas específicas Assim como no caso da acetilCoA em outras moléculas geralmente essa porção portadora também contém um nucleotídeo em geral adenosina difosfato Esse fato curioso talvez seja uma relíquia do princípio da evolução Atualmente considerase que o principal catalisador das primeiras formas de vida antes do DNA ou das proteínas foram moléculas de RNA ou moléculas relaciona das como descrito no Capítulo 6 É tentador especular se as diversas moléculas carreado ras de hoje foram realmente originadas nesse mundo primitivo de RNA em que as porções nucleotídicas poderiam ter utilidade para ligálas a enzimas de RNA ribozimas TABELA 23 Algumas moléculas carreadoras ativadas utilizadas amplamente no metabolismo Carreador ativado Grupo carreado na ligação rica em energia ATP Fosfato NADH NADPH FADH2 Elétrons e átomos de hidrogênio AcetilCoA Grupo acetila Biotina carboxilada Grupo carboxila Sadenosilmetionina Grupo metila Uridina difosfato glicose Glicose Figura 238 Estrutura da acetilCoA importante molécula carreadora ativa da Acima da estrutura está mostrado o seu modelo na forma de esfera e bastão O átomo de enxofre amarelo forma uma ligação tioéster com o acetato Uma vez que a molécula de acetato pode ser facil mente transferida para outra molécula a molécula de acetato pode ser facilmente transferida para outras moléculas porque essa ligação rica em energia libera grande quantidade de energia livre ao ser hidro lisada H H C H H C H N C O H H C H H C H N C O H OH C CH3 C CH3 H H C O O P O O O P O O CH2 ADENINA RIBOSE C O H3C S Grupo acetila Coenzima A CoA Nucleotídeo O O O O P Ligação de alta energia Grupo acetila O O CH2 H2C O ADENINA RIBOSE H C C C C H C C C C N NH C C N N CH3 CH3 O CH2 C H OH C H OH C H OH 2H 2e FADH2 FAD FADH2 P P H H A B Figura 239 FADH2 é um carreador de hidrogênio e de elétrons de alta energia da mesma forma que NADH e NADPH A estrutura do FADH2 com os átomos carreadores de hidrogênio em amarelo B Formação de FADH2 a partir de FAD 70 PARTE I Introdução à célula Assim o ATP transfere fosfato o NADPH transfere elétrons e hidrogênio e a acetil CoA transfere o grupos acetila unidade de dois carbonos O FADH2 flavina adenina dinucleotídeo reduzido é utilizado da mesma forma que o NADH na transferência de elétrons e prótons Figura 239 As reações de outras moléculas carreadores ativadas envolvem a transferência de grupos metila carboxila ou glicose para a biossíntese de vá rias moléculas Tabela 23 Esses carreadores ativados são produzidos em reações nas quais há acoplamento com a hidrólise de ATP mostrado no exemplo da Figura 240 Desse modo a energia que possibilita a utilização desses grupos em biossínteses vem de reações catabólicas que produzem ATP Um processo semelhante ocorre nas sínteses das grandes moléculas das células os ácidos nucleicos as proteínas e os polissacarídeos assunto que será discutido posteriormente A síntese dos polímeros biológicos é impulsionada pela hidrólise de ATP Como discutido anteriormente as macromoléculas constituem a maior parte da massa das células ver Figura 27 Essas moléculas são constituídas por subunidades ou mo nômeros ligadas por reações de condensação nas quais os constituintes de uma mo lécula de água um OH e um H são removidos dos dois reagentes Consequentemente a reação inversa a degradação dos três tipos de polímeros ocorre pela adição de água em reações catalisadas por enzimas hidrólise Essas reações de hidrólise são energeti camente favoráveis ao passo que as reações biossintéticas requerem adição de energia e são muito mais complexas ver Figura 29 Os ácidos nucleicos DNA e RNA as proteínas e os polissacarídeos são polímeros produzidos pela adição repetitiva de subunidades também chamadas de monômeros a uma das extremidades da cadeia em crescimento As reações de síntese desses três tipos de macromoléculas estão esquematizadas na Figura 241 Como indicado a etapa de condensação em cada um dos casos depende da energia proveniente da hidrólise de um nucleosídeo trifosfato Ainda exceto no caso dos ácidos nucleicos nenhum grupo CH2 ADENINA ATIVAÇÃO DO GRUPO CARBOXILA TRANSFERÊNCIA DE GRUPO CARBOXILA S N H N O O ENZIMA ENZIMA S N H HN O OH O Biotina carboxilada Ligação de alta energia C O O C C CH2 O O O O O C C O O O RIBOSE CH2 ADENINA Biotina Bicarbonato Piruvato carboxilase O RIBOSE Oxalacetato C CH3 O O O C Piruvato ATP ADP P P P P P Pi Figura 240 Reação de transferência do grupo carboxila utilizando uma molécula carreadora ativada A enzima piruvato carboxilase utiliza biotina car boxilada para transferir um grupo carboxila na produção de oxalacetato uma molécula necessária para o ciclo do ácido cítrico A molécula aceptora dessa reação de transferência de grupo é o piruvato Outras enzimas utilizam biotina uma vitamina do complexo B para transferir grupos carboxila para outras moléculas aceptoras Observe que a síntese de biotina carboxilada requer energia oriunda do ATP uma característica geral de muitos dos carreadores ativados CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 71 fosfato é adicionado às moléculas que são produto final dessas reações De que maneira as reações que liberam energia por hidrólise de ATP acoplamse à síntese dos polímeros Para cada um dos tipos de macromolécula existe uma via catalisada por enzimas semelhante à via discutida previamente para a síntese do aminoácido glutamina ver Fi gura 235 O princípio é exatamente o mesmo pois o grupo OH que será removido na reação de condensação é inicialmente ativado pelo envolvimento em uma ligação rica em energia com uma segunda molécula Entretanto o mecanismo realmente utilizado para acoplar a hidrólise de ATP à síntese das proteínas e de polissacarídeos é mais complexo do que o utilizado na síntese de glutamina pois há necessidade de uma série de interme diários ricos em energia para produzir a ligação rica em energia que finalmente é quebra da na etapa de condensação discutido no Capítulo 6 no que se refere à síntese proteica Existem limitações na capacidade de cada carreador ativado impulsionar uma rea ção biossintética O G para a hidrólise de ATP produzindo ADP e fosfato inorgânico Pi depende das concentrações de todos os reagentes mas nas concentrações geralmente encontradas nas células ele situase entre 46 e 54 kJmol Em princípio essa reação de hidrólise pode ser usada para que ocorra uma reação desfavorável com um G de talvez 40 kJmol desde que exista uma via de reações adequadas Para algumas reações bios sintéticas mesmo 50 kJmol pode não ser suficiente para fornecer energia como força motriz Nesses casos a via de hidrólise do ATP pode ser alterada de tal maneira que ela primeiro produza AMP e pirofosfato PPi que por sua vez é hidrolisado em uma etapa subsequente Figura 242 Esse processo como um todo disponibiliza uma variação to tal de energia livre de cerca de 100 kJmol Uma reação biossintética importante que é Figura 241 Síntese de polissacarídeos proteínas e ácidos nucleicos A síntese de cada um dos tipos de polímeros biológicos envolve a perda de água em reações de condensação O consumo de nucleosídeos trifosfato ricos em energia necessários para ativar cada monômero previamente à sua adição não é mostrado A reação inversa a degradação de todos os três tipos de polímeros ocorre pela simples adição de água hidrólise CH2OH O HO OH OH CH2OH O HO OH OH CH2OH O OH OH O O CH2OH O OH OH CH2OH O OH OH O O CH2OH O OH OH O HO OH A POLISSACARÍDEOS Glicose Glicogênio Glicogênio H2O Energia da hidrólise de nucleosídeo trifosfato H C R O C N H H C R C O OH H H R H C C N O OH H C R O C N H H C R C R H C C N O OH H O Proteína Aminoácido Proteína C PROTEÍNAS A O CH2 OH O O O O P O C O CH2 OH OH OH O P O G O OH OH CH2 O A O CH2 OH O O O O P O C O CH2 OH O O P O G O OH OH CH2 O H2O B ÁCIDOS NUCLEICOS RNA Nucleotídeo H2O Energia da hidrólise de nucleosídeo trifosfato Energia da hidrólise de nucleosídeo trifosfato RNA 72 PARTE I Introdução à célula impulsionada dessa maneira é a síntese de ácidos nucleicos polinucleotídeos ilustrada no lado direito da Figura 243 É interessante observar que as reações de polimerização que produzem macro moléculas podem ser orientadas de duas maneiras com a molécula crescendo pela po limerização dos monômeros na cabeça ou na cauda do polímero Na polimerização pela cabeça a ligação ativada necessária para a reação de condensação fica na extremidade final do polímero em crescimento e então deve ser regenerada a cada vez que uma nova Figura 242 Via alternativa para a hidrólise de ATP na qual inicialmente há formação de pirofosfato que de pois é hidrolisado Essa via libera em torno de duas vezes mais energia livre aproximadamente 100 kJmol do que a reação mostrada anteriormente na Figura 233 e forma AMP no lugar de ADP A Nas duas reações sucessivas de hidró lise os átomos de oxigênio das moléculas de água que participam da reação são retidos nos produtos como mostrado enquanto os átomos de hidrogênio dissociamse formando íons de hidrogênio livres H não mostrado B Resumo da reação total Açúcar Base 3 Base 3 Base 1 Base 2 Base 3 O Açúcar O Açúcar O Açúcar O O Açúcar H2O Intermediário de alta energia Cadeia polinucleotídica contendo dois nucleotídeos Cadeia polinucleotídica contendo três nucleotídeos 2 2 Nucleosídeo monofosfato Base 1 Base 2 Açúcar O OH O Açúcar 2 Produtos da hidrólise do ATP OH OH OH ATP ADP P P P P P P P P P P Pi Pi Figura 243 A síntese de um polinucleotídeo RNA ou DNA é um processo de muitas etapas impelido pela hidrólise de ATP Na primeira etapa um nucleosídeo monofosfato é ativado pela transferência sequencial de dois grupos fosfato terminais de duas moléculas de ATP O intermediário rico em energia que é formado um nucleosídeo trifosfato permanece livre na solução até que reaja com a extremidade da cadeia de RNA ou de DNA que está crescendo liberando então pirofosfato A hidrólise desse último fosfato inorgânico é altamente favorável e contribui para fazer a reação como um todo seguir na direção da síntese do polinucleotídeo Para mais detalhes ver Capítulo 5 O P O P O CH2 ADENINA RIBOSE Adenosina trifosfato ATP Adenosina monofosfato AMP Pirofosfato O O P O O O P O CH2 ADENINA RIBOSE O O O O O O P O P O O O O P O OH O O H2O H2O Fosfato P O OH O O O Fosfato H2O H2O A B ATP P Pi Pi Pi AMP CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 73 unidade do monômero seja adicionada Nesse caso cada monômero carrega a ligação reativa que será usada na adição do monômero seguinte Ao contrário na polimerização pela cauda a ligação ativada é carregada pelos monômeros sendo usada imediatamente na adição do próprio monômero Figura 244 Em capítulos posteriores veremos que os dois tipos de polimerização são usados A síntese de polinucleotídeos e de alguns polissacarídeos simples ocorre por polimeri zação pela cauda enquanto a síntese das proteínas ocorre por um processo de polime rização pela cabeça Resumo As células vivas precisam criar e manter a ordem por si mesmas para que possam sobre viver e crescer Isso é termodinamicamente possível somente porque há um fornecimento contínuo de energia que é liberada pelas células para o ambiente como calor que desor dena os arredores da célula As únicas reações químicas possíveis de ocorrer são aquelas que aumentam a quantidade total de desordem do universo A variação de energia livre de uma reação ΔG é uma medida dessa desordem e ela deve ser menor do que zero para que a reação ocorra espontaneamente Esse ΔG depende tanto das propriedades intrínse cas das moléculas reagentes como também das suas concentrações e pode ser calculado a partir dessas concentrações caso tanto a constante de equilíbrio K da reação como a variação de energia livre padrão ΔG forem conhecidas A energia necessária à vida vem em última análise da radiação eletromagnética do sol que possibilita a formação de moléculas orgânicas pelos organismos fotossintéti cos como as plantas Os animais obtêm energia alimentandose de moléculas orgânicas e oxidandoas em uma série de reações catalisadas por enzimas e que estão acopladas à formação de ATP a moeda corrente de energia de todas as células A contínua geração de ordem nas células é possível devido ao acoplamento da reação de hidrólise de ATP energeticamente favorável a reações energeticamente desfa voráveis Na biossíntese das macromoléculas o ATP é usado para formar intermediários fosforilados reativos Como as reações energeticamente desfavoráveis da biossíntese pas sam a energeticamente favoráveis dizse que a hidrólise do ATP impulsiona essas reações As moléculas poliméricas como as proteínas os ácidos nucleicos e os polissacarídeos são sintetizadas a partir de pequenas moléculas precursoras ativadas por reações de conden sação repetitivas que são impelidas por esse mecanismo Outras moléculas reativas cha madas de carreadores ativados ou coenzimas transferem outros grupos químicos durante a biossíntese Por exemplo o NADPH transfere hidrogênio na forma de um próton e dois elétrons um íon hidreto enquanto a acetilCoA transfere um grupo acetila COMO AS CÉLULAS OBTÊM ENERGIA DOS ALIMENTOS O suprimento constante de energia que as células necessitam para gerar e manter a or dem biológica que as mantém vivas vem da energia das ligações químicas das moléculas dos alimentos As proteínas os lipídeos e os polissacarídeos os constituintes da maior parte dos alimentos que comemos devem ser degradados em moléculas pequenas antes que nos sas células possam usálos tanto como fonte de energia ou como unidades fundamen tais para outras moléculas A digestão enzimática degrada as grandes moléculas polimé Figura 244 Orientação dos interme diários em reações de condensação repetidas que formam polímeros biológicos O crescimento pela cabeça é comparado com sua alternativa o cresci mento pela cauda Como indicado esses dois mecanismos são utilizados para pro duzir diferentes tipos de macromoléculas biológicas 6 7 7 6 Cada monômero carrega uma ligação rica em energia que será usada para a adição do monômero seguinte POLIMERIZAÇÃO PELA CABEÇA p ex proteínas ácidos graxos 7 7 Cada monômero carrega uma ligação rica em energia que será usada para sua própria adição POLIMERIZAÇÃO PELA CAUDA p ex DNA RNA polissacarídeos 1 1 74 PARTE I Introdução à célula ricas dos alimentos até suas subunidades monoméricas as proteínas em aminoácidos os polissacarídeos em açúcares e as gorduras em ácidos graxos e glicerol Após a diges tão as pequenas moléculas orgânicas derivadas dos alimentos entram no citosol das cé lulas onde sua oxidação gradual inicia Os açúcares são moléculas combustíveis especialmente importantes Eles são oxi dados em várias etapas controladamente até dióxido de carbono CO2 e água Figura 245 Nesta seção serão examinadas as principais etapas na degradação ou no cata bolismo dos açúcares e será mostrado como nas células animais eles produzem ATP NADH e outras moléculas carreadoras ativadas Uma via muito semelhante ocorre nas plantas nos fungos e em muitas bactérias Veremos também que a oxidação dos ácidos graxos é igualmente importante Outras moléculas como as proteínas quando canaliza das por vias enzimáticas apropriadas também servem como fonte de energia A glicólise é uma via central na produção de ATP O principal processo de oxidação dos açúcares é a sequência de reações conhecida como glicólise do grego glukus doce e lusis ruptura A glicólise produz ATP sem a participação de oxigênio molecular O2 gasoso Ela ocorre no citosol da maioria das células inclusive nos organismos anaeróbios A glicólise provavelmente apareceu cedo na história da vida antes que os organismos fotossintéticos introduzissem oxigênio na atmosfera Durante a glicólise uma molécula de glicose com seis átomos de carbono é convertida em duas moléculas de piruvato cada uma das quais contém três átomos de carbono Para cada molécula de glicose duas moléculas de ATP são hidrolisadas para fornecer energia para impulsionar as etapas iniciais e quatro moléculas de ATP são pro duzidas nas etapas finais Ao final da glicólise portanto há um ganho líquido de duas moléculas de ATP para cada molécula de glicose que é degradada Também são produzi das duas moléculas do carreador ativado NADH A via glicolítica está esboçada na Figura 246 e mostrada em mais detalhes no Pai nel 28 p 104105 e na Animação 25 A glicólise envolve uma sequência de 10 reações individuais cada uma produzindo um açúcar intermediário diferente e catalisada por uma enzima diferente Do mesmo modo que a maioria das enzimas elas têm os nomes com a terminação ase como isomerase e desidrogenase para indicar o tipo de reação que catalisam Embora o oxigênio molecular não seja usado na glicólise ocorre oxidação elétrons dos carbonos derivados da molécula de glicose são removidos por NAD produzindo NADH A natureza em etapas do processo libera a energia da oxidação em pequenas quantidades de maneira que boa parte dessa energia pode ser armazenada em molé culas de carreadores ativados em vez de ser liberada como calor ver Figura 245 Desse modo parte da energia liberada pela oxidação impulsiona diretamente a síntese de mo léculas de ATP a partir de ADP e Pi e parte permanece com os elétrons no carreador de elétrons rico em energia NADH Figura 245 Representação esquemáti ca da oxidação em etapas controladas dos açúcares nas células comparada à queima normal A Caso o açúcar seja oxidado gerando CO2 e H2O em uma úni ca etapa ele liberará uma quantidade de energia maior do que aquela que pode ser capturada para propósitos úteis B Nas células as enzimas catalisam oxidações por meio de uma série de pequenas eta pas nas quais a energia livre é transferida em pacotes de tamanho conveniente para moléculas carreadoras frequentemente ATP e NADH Em cada etapa uma enzima controla a reação reduzindo a barreira de energia de ativação que deve ser suplanta da para que a reação possa ocorrer O to tal de energia livre liberado é exatamente o mesmo em A e em B AÇÚCAR O2 AÇÚCAR O2 CO2 H2O CO2 H2O Pequenas energias de ativação suplantadas por enzimas que funcionam à temperatura do corpo Alta energia de ativação suplantada pelo calor de uma chama Toda a energia livre é liberada em forma de calor nada é armazenado B OXIDAÇÃO DE AÇÚCAR EM ETAPAS NAS CÉLULAS A QUEIMA DIRETA DE AÇÚCAR EM SISTEMAS NÃO VIVOS Um pouco da mesma energia livre armazenada em moléculas carreadoras ativadas Energia livre CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 75 Durante a glicólise são formadas duas moléculas de NADH para cada molécula de glicose Nos organismos aeróbios essas moléculas de NADH doam seus elétrons para a cadeia transportadora de elétrons descrita no Capítulo 14 e o NAD formado a partir do NADH é usado novamente para a glicólise ver etapa 6 do Painel 28 p 104105 A fermentação produz ATP na ausência de oxigênio Na maioria dos animais e das plantas a glicólise é apenas o prelúdio das etapas finais da degradação das moléculas dos alimentos Nessas células o piruvato formado pela glicólise é rapidamente transportado para a mitocôndria na qual é convertido em CO2 e acetilCoA cujo grupo acetila é então completamente oxidado em CO2 e H2O Em contrapartida em muitos organismos anaeróbios organismos que não uti lizam oxigênio molecular e podem crescer e se dividir na ausência de oxigênio a gli cólise é a principal fonte de ATP para as células Certos tecidos animais como o mús culo esquelético podem continuar funcionando mesmo quando o oxigênio molecular é limitado No caso dessas condições anaeróbicas o piruvato e os elétrons do NADH permanecem no citosol O piruvato é convertido em produtos que são excretados pe las células como etanol e CO2 no caso das leveduras usadas na fabricação de cerveja e de pão ou lactato no caso do músculo Nesses processos o NADH doa seus elétrons e é reconvertido em NAD A regeneração do NAD é necessária para a manutenção das reações da glicólise Figura 247 Vias como essa que produzem energia nas quais as moléculas orgânicas tanto doam como aceitam elétrons que são geralmente como nesses casos anaeróbicas Figura 246 Esquema da glicólise Cada uma das 10 etapas é catalisada por uma enzima diferente Observe que a etapa 4 cliva um açúcar de seis carbonos em dois açúcares de três carbonos de modo que o número de moléculas nas etapas que seguem é duplicado Como indicado a etapa 6 inicia a fase de geração de energia da glicólise Uma vez que duas moléculas de ATP são hidrolisadas na primeira fase a fase de investimento de energia a glicólise leva à produção líquida de duas moléculas de ATP e duas moléculas de NADH por mol de glicose ver também o Painel 28 OH OH OH HO CH2OH CH2O CH2O OH2C O O ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 5 ETAPA 6 ETAPA 7 ETAPA 8 ETAPA 9 ETAPA 10 OH CHO COO C CH3 CHOH CH2O CHO CHOH OH HO O COO C CH3 O Investimento de energia para ser recuperado posteriormente Clivagem do açúcar de seis carbonos em dois açúcares de três carbonos Geração de energia Uma molécula de glicose Frutose 16bisfosfato Duas moléculas de gliceraldeído 3fosfato Duas moléculas de piruvato ATP ATP ATP ATP ATP ATP NADH NADH P P P P 76 PARTE I Introdução à célula são denominadas fermentações Os estudos sobre fermentações comercialmente im portantes realizadas por leveduras foram inspiradores nos primórdios da bioquímica Os estudos conduzidos no século XIX levaram ao reconhecimento em 1896 de que esses processos podem ser estudados fora de um organismo vivo ou seja em extratos celulares Essa descoberta revolucionária possibilitou dissecar e estudar externamente cada uma das reações do processo de fermentação A elucidação completa de todas as peças da via glicolítica que ocorreu na década de 1930 constituiuse um dos principais triunfos da bioquímica e foi rapidamente seguida pelo reconhecimento do papel central do ATP nos processos celulares A glicólise ilustra como as enzimas acoplam oxidação ao armazenamento de energia A formação de ATP durante a glicólise demonstra claramente como as enzimas acoplam reações energeticamente desfavoráveis a reações energeticamente favoráveis possibili tando dessa forma que as muitas reações que possibilitam a vida possam ocorrer As duas reações centrais da glicólise etapas 6 e 7 convertem o açúcar intermediário de três carbo nos gliceraldeído3fosfato um aldeído em 3fosfoglicerato um ácido carboxílico ver o Painel 28 p 104105 oxidando assim um grupo aldeído a um grupo ácido carboxílico A reação total libera energia livre suficiente para converter uma molécula de ADP em ATP e para transferir dois elétrons e um próton do aldeído para o NAD formando NADH restando ainda energia suficiente para liberar calor para o meio de modo a tornar a reação total energeticamente favorável o G para a reação total é 125 kJmol A Figura 248 apresenta um esboço dessa impressionante façanha de coleta de energia As reações químicas são conduzidas com precisão por duas enzimas às quais os açúcares intermediários estão ligados com alta afinidade Como mostrado em deta Figura 247 Duas vias para a degra dação anaeróbica do piruvato A Quando o suprimento de oxigênio é insu ficiente como em uma célula muscular em contração vigorosa o piruvato produzido pela glicólise é convertido em lactato como mostrado Essa reação regenera o NAD consumido na etapa 6 da glicólise e a via total rende muito menos energia do que a oxidação completa B Em alguns organismos aqueles que podem crescer de forma anaeróbica como as leveduras o piruvato é convertido via acetaldeído em dióxido de carbono e etanol Nova mente essa via regenera o NAD a partir de NADH que é necessário para permitir que a glicólise continue Tanto A quanto B são exemplos de fermentação HC CH3 O Acetaldeído Glicose Piruvato Lactato A FERMENTAÇÃO LEVANDO À EXCREÇÃO DE LACTATO B FERMENTAÇÃO LEVANDO À EXCREÇÃO DE ETANOL E CO2 Glicólise H Regeneração de NAD Regeneração de NAD O O C C CH3 O O O C C CH3 OH H Piruvato Etanol Glicólise H H O O C C CH3 O CH3 H2C OH CO2 Glicose ATP ADP NADH NAD NAD ATP ADP NADH NAD NAD CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 77 Figura 248 Energia armazenada nas etapas 6 e 7 da glicólise A Na etapa 6 a enzima gliceraldeído3fosfato desidrogenase acopla a oxidação ener geticamente favorável de um aldeído à reação energeticamente desfavorável da formação de uma ligação fosfato de alta energia possibilitando ao mesmo tempo o armazenamento de energia na forma de NADH A formação da ligação fosfato de alta energia é impulsionada pela reação de oxidação e a enzima atua como se fos se o acoplador da pá giratória mostrado na Figura 232B Na etapa 7 a ligação fosfato de alta energia recémformada no 13bisfosfoglicerato é transferida ao ADP formando uma molécula de ATP e deixando no açúcar oxidado um grupo carboxila livre A porção da molécula que sofre essas modificações está sombreada em azul o resto da molécula permanece sem modificações ao longo de todas essas reações B Resumo da alteração química produzida pelas reações 6 e 7 H H C O H C OH C OH CH2O HO C O H C O H C OH CH2O H C OH CH2O C ENZIMA ENZIMA ENZIMA HS S S H C OH CH2O H O O C H C OH A CH2O O HO C O Gliceraldeído 3fosfato Ligação tioéster de alta energia Ligação fosfato de alta energia Fosfato inorgânico 13bisfosfoglicerato 3fosfoglicerato ETAPA 6 Gliceraldeído3fosfato desidrogenase Fosfogliceratocinase ETAPA 7 A ETAPAS 6 E 7 DA GLICÓLISE B Aldeído Ácido carboxílico RESUMO DAS ETAPAS 6 E 7 NAD P P P P P P P P A P P P Pi ATP ADP ATP NADH Uma ligação covalente de curta duração é formada entre o gliceraldeído3fosfato e um grupo SH da cadeia lateral de uma cisteína da enzima gliceraldeído3fosfato desidrogenase A enzima também se liga de forma não covalente a NAD O gliceraldeído3fosfato é oxidado pela remoção do átomo de hidrogênio amarelo pela enzima e o transfere junto com um elétron para o NAD formando NADH ver Figura 237 Parte da energia liberada pela oxidação do aldeído é então armazenada no NADH e parte é armazenada na ligação tioéster que liga o gliceraldeído3fosfato à enzima Uma molécula de fosfato inorgânico desloca a ligação tioéster de alta energia para criar 13bisfosfoglicerato que contém uma ligação fosfato de alta energia A oxidação de um aldeído a ácido carboxílico libera energia grande parte dessa energia é capturada nos carreadores ativados ATP e NADH A ligação fosfato de alta energia é transferida para o ADP formando ATP NADH 78 PARTE I Introdução à célula lhes na Figura 248 a primeira enzima gliceraldeído3fosfato desidrogenase forma uma ligação covalente de vida curta com o aldeído por meio do grupo SH reativo da enzima catalisando a oxidação desse aldeído pelo NAD ainda quando ligado à enzima A ligação enzimasubstrato é então deslocada por um íon fosfato inorgânico para formar o açúcarfosfato intermediário rico em energia que então é liberado da enzima Esse intermediário ligase a uma segunda enzima fosfogliceratocinase Essa enzima catali sa a transferência energicamente favorável do fosfato de alta energia recémsintetizado para o ADP formando ATP e completando o processo de oxidação de aldeído a ácido carboxílico Observe que a energia da oxidação da ligação CH na etapa 6 impulsiona a formação tanto de NADH como também de uma ligação fosfato de alta energia Assim a quebra da ligação rica em energia impulsiona a formação de ATP Essa oxidação específica foi examinada em detalhes porque é um claro exemplo de armazenamento de energia mediado por enzimas acoplando reações Figura 249 As reações das etapas 6 e 7 são as únicas na glicólise que criam uma ligação fosfato rica em energia diretamente a partir de fosfato inorgânico Desse modo elas são responsá veis pelo rendimento líquido de duas moléculas de ATP e duas moléculas de NADH por molécula de glicose ver Painel 28 p104105 Como foi recémvisto o ATP pode ser formado rapidamente a partir de ADP quan do ocorre uma reação intermediária com ligações fosfato com energia mais alta do que a energias presente na ligação fosfato terminal do ATP As ligações de fosfato podem ser ordenadas segundo o nível de energia comparandose a variação de energia livre pa drão G da quebra por hidrólise de cada ligação A Figura 250 compara as ligações fosfoanidrido ricas em energia do ATP com outras ligações fosfato algumas delas forma das durante a glicólise Os organismos armazenam moléculas de alimento em compartimentos especiais Todos os organismos precisam manter uma relação ATPADP alta para manter a or dem biológica em suas células No entanto o acesso dos animais aos alimentos é perió dico e as plantas devem sobreviver ao período noturno quando ficam impossibilita das de produzir açúcares pela fotossíntese Por isso tanto os animais quanto as plantas convertem açúcares e gorduras em formas que são armazenadas para uso posterior Figura 251 Para compensar longos períodos de jejum os animais armazenam ácidos graxos na forma de gotículas de gordura insolúveis em água os triacilgliceróis também chama dos de triglicerídeos Nos animais os triacilgliceróis são armazenados principalmente no citoplasma de células gordurosas especializadas denominadas adipócitos No caso Figura 249 Visão esquemática das reações acopladas que formam NADH e ATP nas etapas 6 e 7 da glicólise A oxidação da ligação CH impulsiona a formação tanto de NADH como de liga ções fosfato ricas em energia A quebra da ligação rica em energia permite a forma ção de ATP O C H O C HO O C O Oxidação da ligação CH Energia livre A VARIAÇÃO TOTAL DE ENERGIA na etapa 6 seguida da etapa 7 é favorável em 125 kJmol Formação de ligação de alta energia Hidrólise de ligação de alta energia ETAPA 6 ETAPA 7 ATP ADP NADH NAD P O C O P 13bisfosfoglicerato Gliceraldeído 3fosfato 3fosfoglicerato CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 79 de armazenamento de curto prazo os açúcares são armazenados como subunidades de glicose no glicogênio um polissacarídeo grande e ramificado presente na forma de grânulos no citoplasma de muitas células inclusive no fígado e no músculo A síntese e a degradação do glicogênio são prontamente reguladas de acordo com a necessidade Quando as células precisam de uma quantidade de ATP maior do que aquela que pode ser gerada a partir das moléculas de alimento captadas da corrente sanguínea essas cé lulas degradam glicogênio por meio de uma reação que produz glicose1fosfato a qual é rapidamente convertida em glicose6fosfato para a glicólise Figura 252 Do ponto de vista quantitativo a gordura é uma forma de armazenamento muito mais importante para os animais do que o glicogênio provavelmente porque proporcio na uma armazenagem mais eficiente A oxidação de um grama de gordura libera cerca de duas vezes mais energia que a oxidação de um grama de glicogênio Ademais o gli cogênio diferenciase das gorduras por incorporar uma grande quantidade de água Isso leva a uma diferença de massa de maneira que para armazenar a mesma quantidade de energia a massa do glicogênio deve ser seis vezes maior do que a massa de gordura Em média um homem adulto armazena glicogênio suficiente para apenas cerca de um dia de atividades normais mas armazena uma quantidade de gordura que poderia durar Figura 250 Ligações fosfato têm energias diferentes Exemplos de diferentes tipos de ligação fosfato com os sítios de hidrólise mostrados nas moléculas representadas à esquerda Aquelas que começam com um átomo de carbono em cinza mostram apenas parte da molécula Exemplos de moléculas contendo essas ligações estão mostrados no lado direito com a variação de energia livre padrão para a hidrólise em quilojoules A transferência de um grupo fosfato de uma molécula para outra é energeticamente favo rável se a variação de energia livre G para a hidrólise da ligação fosfato na primeira molécula for mais negativa do que a hidrólise da ligação fosfato na segunda molécula Assim em condiçõespadrão um grupo fosfato é prontamente transferido de 13bifosfo glicerato a ADP formando ATP Condiçõespadrão geralmente não se aplicam às células vivas onde as concentrações relativas dos reagentes e produtos influenciam a real mudança na variação de energia livre Observe que a reação de hidrólise pode ser vista como a transferência de um grupo fosfato para a água O P O O O P O O C C H H C H H ΔG o PARA HIDRÓLISE O O O C C P O O O O O H2C H2O O O O C P O O C H2O O C P O O N N H2O NH2 CH3 H2O O P O O O C O O P O O C H2O H Ligação enolfosfato Ligação anidrido ao átomo de carbono Ligação fosfato na creatina fosfato Ligação anidrido ao fosfato ligação fosfoanidrido Ligação fosfoéster Fosfoenolpiruvato ver o Painel 28 p104105 p ex 13bisfosfoglicerato ver Painel 28 Creatina fosfato carreador ativado que armazena energia no músculo p ex ATP hidrolisado a ADP p ex glicose6fosfato ver Painel 28 490 kJ 619 kJ 430 kJ 306 kJ 175 kJ 0 20 40 60 Exemplos específicos mostrando a variação de energia livre padrão ΔGº para a hidrólise de ligação fosfato Tipo de ligações fosfato CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 81 por uma membrana que é impermeável a esses dois carreadores ativados Além disso as plantas contêm muitos tipos de células como as das raízes que não possuem clo roplastos e portanto não podem produzir seus próprios açúcares Assim os açúcares são exportados dos cloroplastos para as mitocôndrias que estão presentes em todas as células da planta A maior parte do ATP necessário para o metabolismo da célula vegetal é sintetizado na mitocôndria utilizando exatamente as mesmas vias oxidativas de degra dação de açúcares que ocorrem nos organismos não fotossintéticos Esse ATP então é transferido para o resto da célula ver Figura 1442 Durante o dia nos períodos de excesso de capacidade fotossintética os cloroplas tos convertem parte dos açúcares que produzem em gordura e em amido um polímero de glicose análogo ao glicogênio dos animais As gorduras das plantas são triacilgliceróis triglicerídeos da mesma forma que a gordura dos animais com diferenças apenas nos tipos de ácidos graxos que predominam Tanto as gorduras como o amido são armazena dos no interior dos cloroplastos até que sejam necessários para produção de energia por oxidação durante os períodos de escuridão ver Figura 251C Os embriões presentes nas sementes dos vegetais devem viver por um longo pe ríodo apenas das fontes de energia armazenadas isto é até que germinem e produzam folhas que possam captar a energia solar Por essa razão as sementes das plantas geral mente contêm grandes quantidades de gordura e de amido o que as torna uma fonte importante de alimento para os animais incluindo o homem Figura 253 A maioria das células animais obtém dos ácidos graxos a energia para os períodos entre as refeições Logo após as refeições a maior parte da energia de que os animais necessitam vem dos açúcares obtidos dos alimentos O excesso de açúcares se houver é usado para repor as reservas de glicogênio que foram consumidas ou para sintetizar gordura como reserva alimentar Entretanto assim que a gordura é armazenada no tecido adiposo ela é utili zada No início da manhã após uma noite de jejum a oxidação dos ácidos graxos gera a maior parte do ATP necessário para o homem Baixos níveis sanguíneos de glicose levam à degradação de ácidos graxos para a produção de energia Como ilustrado na Figura 254 os triacilgliceróis armazenados nas gotículas de gordura nos adipócitos são hidrolisados produzindo ácidos graxos e glice rol Os ácidos graxos são liberados e transferidos para as células do organismo através da corrente sanguínea Embora os animais convertam facilmente açúcares em gorduras eles não são capazes de converter gordura em açúcares em vez disso os ácidos graxos são oxidados diretamente Os açúcares e as gorduras são degradados a acetilCoA nas mitocôndrias No metabolismo aeróbio o piruvato produzido no citosol pela glicólise a partir dos açú cares é transportado para a mitocôndria das células eucarióticas Aí ele é rapidamente descarboxilado por um complexo gigantesco de três enzimas denominado complexo da piruvato desidrogenase Os produtos da descarboxilação do piruvato são uma molécula Figura 253 Algumas sementes que servem como alimentos importantes para o homem Milho nozes e ervilha contêm ricas reservas de amido e gordura que fornecem ao jovem embrião da planta a energia e as unidades fundamentais para a biossíntese Cortesia da John Innes Foundation 82 PARTE I Introdução à célula de CO2 um produto de descarte uma molécula de NADH e uma molécula de acetil CoA ver Painel 29 Os ácidos graxos importados da corrente sanguínea são levados para as mitocôn drias onde ocorre toda a oxidação Figura 255 Cada molécula de ácido graxo na for ma da molécula ativada acilgraxoCoA é completamente degradada por um ciclo de reações que remove dois carbonos de cada vez a partir do grupo carboxila terminal ge rando uma molécula de acetilCoA em cada volta do ciclo Uma molécula de NADH e uma molécula de FADH2 também são geradas nesse processo Figura 256 Os açúcares e as gorduras constituem as principais fontes de energia para a maio ria dos organismos que não fazem fotossíntese incluindo o ser humano Entretanto a maior parte da energia útil que pode ser extraída da oxidação de ambos os tipos de alimento permanece armazenada nas moléculas de acetilCoA produzidas pelos dois tipos de reações recémdescritas As reações do ciclo do ácido cítrico nas quais o grupo acetila COCH3 da acetilCoA é oxidado a CO2 e H2O é portanto central para o meta bolismo energético dos organismos aeróbios Nos eucariotos todas essas reações ocor rem nas mitocôndrias Não surpreende portanto a descoberta de que a mitocôndria é o local das células animais onde a maior parte do ATP é produzido Por outro lado nas bactérias aeróbicas todas essas reações incluindo o ciclo do ácido cítrico ocorrem no único compartimento que possuem o citosol O ciclo do ácido cítrico gera NADH pela oxidação de grupos acetila a CO2 No século XIX os biólogos observaram que na ausência de ar as células produzem áci do lático p ex no músculo ou etanol p ex em leveduras enquanto na presença de ar elas consomem O2 e produzem CO2 e H2O Os esforços feitos para definir as vias do metabolismo aeróbio focados na oxidação do piruvato levaram à descoberta em 1937 do ciclo do ácido cítrico também conhecido como ciclo do ácido tricarboxílico ou ain da ciclo de Krebs O ciclo do ácido cítrico é responsável por cerca de dois terços do total da oxidação de carbonos que ocorre na maioria das células Os principais produtos dessa Figura 254 Como as gorduras estocadas são mobilizadas para a produção de ener gia nos animais Níveis baixos de glicose no sangue desencadeiam a hidrólise de moléculas de triacilglicerol das gotículas de gordura para ácidos graxos livres e glicerol Esses ácidos graxos entram na corrente sanguínea onde se ligam a uma proteína abundante do sangue denominada albumina sérica Os transporta dores especiais de ácidos graxos na membrana plasmática das células que oxidam os ácidos graxos como as células musculares transpor tam então esses ácidos graxos para o citosol a partir do qual são movidos para as mitocôn drias para a produção de energia Gordura armazenada Hidrólise Glicerol Ácidos graxos Ácidos graxos Corrente sanguínea CÉLULA MUSCULAR ADIPÓCITO Oxidação na mitocôndria CO2 ATP Figura 255 Vias de produção de acetil CoA a partir de açúcares e gorduras Nas células eucarióticas a mitocôndria é o local onde a acetilCoA é produzida a par tir desses dois tipos principais de moléculas de alimento Portanto é o local onde ocor re a maior parte das reações de oxidação celulares e onde a maior parte do ATP é produzida Os aminoácidos não mostrado também podem entrar na mitocôndria não mostrado e serem convertidos em acetilCoA ou em algum outro interme diário do ciclo do ácido cítrico A estrutura e o papel da mitocôndria estão discutidos detalhadamente no Capítulo 14 Açúcares e polissacarídeos Açúcares Piruvato Piruvato Gorduras Ácidos graxos Ácidos graxos Glicose AcetilCoA MITOCÔNDRIA Membrana plasmática CITOSOL Ácidos graxos CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 83 via são CO2 e elétrons ricos em energia na forma de NADH O CO2 é liberado como um produto de descarte enquanto os elétrons ricos em energia do NADH passam por uma cadeia transportadora de elétrons ligada à membrana discutido no Capítulo 14 e final mente combinamse com O2 produzindo H2O O ciclo do ácido cítrico por si mesmo não utiliza gás O2 ele usa átomos de oxigênio para gerar água Entretanto para que o ciclo possa ter continuidade há necessidade de O2 para as reações que ocorrem a seguir Isso porque não há nenhuma outra maneira eficiente para que o NADH perca seus elé trons regenerando assim o NAD que é necessário Nas células eucarióticas o ciclo do ácido cítrico ocorre dentro das mitocôndrias Isso leva à oxidação completa dos átomos de carbono dos grupos acetila da acetilCoA que são convertidos em CO2 Entretanto o grupo acetila não é oxidado diretamente Em vez disso ele é transferido da acetilCoA para uma molécula maior de quatro car bonos o oxalacetato formando o ácido tricarboxílico de seis carbonos o ácido cítrico que dá origem ao nome do ciclo de reações A molécula de ácido cítrico é então oxidada gradativamente possibilitando que a energia dessa oxidação seja acoplada à produção de moléculas ativadas carreadoras ricas em energia A sequência de oito reações forma um ciclo porque ao final há regeneração do oxalacetato que então entra novamente no ciclo conforme esquematizado na Figura 257 Até agora foi discutido apenas um dos três tipos de moléculas produzidas no ci clo do ácido cítrico que atuam como carreadores ativados NADH a forma reduzida do sistema carreador de elétrons NAD NADH ver Figura 236 Além das três moléculas de NADH cada volta do ciclo também produz uma molécula de FADH2 flavina adenina dinucleotídeo reduzido a partir do FAD ver Figura 239 e uma molécula do ribonucle otídeo trifosfato GTP a partir do GDP A Figura 258 mostra uma ilustração da estrutura do GTP O GTP é um parente muito próximo do ATP sendo que a transferência do seu grupo fosfato terminal para o ADP produz uma molécula de ATP a cada repetição do ciclo Resumidamente podese considerar que a energia armazenada nos elétrons ricos em energia altamente transferíveis do NADH e do FADH2 é a seguir utilizada para a produção de ATP pelo processo de fosforilação oxidativa a única etapa do catabolismo oxidativo dos nutrientes que requer oxigênio gasoso O2 diretamente da atmosfera Triacilglicerol Gota lipídica CH2 O O C Cauda hidrocarbonada CH O O C Cauda hidrocarbonada CH2 O O C Cauda hidrocarbonada 1 µm A C Ligação éster CH2 CH2 R C CH2 O SCoA SCoA SCoA SCoA SCoA SCoA CH2 R C O C CH3 O C CH2 R C CH2 O O HSCoA C CH2 R C O C H H H CH CH2 R C O CH H2O H AcetilCoA O ciclo se repete até que o ácido graxo seja totalmente degradado AcilgraxoCoA AcilgraxoCoA encurtado em dois carbonos Ácido graxo ativado entra no ciclo OH Resto da cauda hidrocarbonada B FAD NADH FADH2 NAD Figura 256 Oxidação dos ácidos graxos a acetilCoA A Microscopia ele trônica de uma gota lipídica no citosol B Estrutura das gorduras As gorduras são triacilgliceróis A porção do glicerol à qual são ligados três ácidos graxos por ligações éster está mostrada em azul As gorduras são insolúveis em água e formam gotas no interior das células de gordura adipó citos que são células especializadas em armazenar gordura C Ciclo de oxidação dos ácidos graxos O ciclo é catalisado por uma série de quatro enzimas e ocorre na mitocôndria Cada volta do ciclo encurta a cadeia de ácido graxo em dois carbonos mostrados em vermelho gerando uma molécula de acetilCoA uma molécula de NADH e uma molécula de FADH2 A cor tesia de Daniel S Friend 84 PARTE I Introdução à célula O Painel 29 p 106107 e a Animação 26 apresentam o ciclo do ácido cítrico completo Os demais átomos de oxigênio necessários para produzir CO2 a partir dos gru pos acetila que entram no ciclo do ácido cítrico não são supridos pelo oxigênio molecu lar mas pela água Como ilustrado no painel três moléculas de água são quebradas a cada ciclo de modo que no final átomos de oxigênio de algumas dessas moléculas de água são utilizados para a síntese de CO2 Além do piruvato e dos ácidos graxos alguns aminoácidos passam do citosol para a mitocôndria onde também são convertidos em acetilCoA ou em algum outro inter mediário do ciclo do ácido cítrico Assim nas células eucarióticas as mitocôndrias são o centro de todos os processos que produzem energia independentemente de eles come çarem a partir de açúcares gorduras ou proteínas Tanto o ciclo do ácido cítrico quanto a glicólise funcionam como ponto de início de reações biossintéticas importantes por produzir intermediários contendo carbono e que são de importância vital como oxalacetato e acetoglutarato Algumas dessas substân cias produzidas pelo catabolismo são transferidas da mitocôndria de volta para o citosol onde servem como precursores de reações anabólicas de síntese de muitas moléculas essenciais como os aminoácidos Figura 259 Na maioria das células o transporte de elétrons promove a síntese da maior parte do ATP A maior parte da energia das moléculas dos alimentos é liberada no último estágio da degradação das moléculas utilizadas como alimento Nesse processo final NADH e FADH2 transferem os elétrons que receberam ao oxidar as moléculas orgânicas deriva das dos alimentos para a cadeia transportadora de elétrons que se localiza na mem brana interna da mitocôndria ver Figura 1410 À medida que os elétrons passam por essa longa cadeia de moléculas especializadas em receber e doar elétrons eles passam sucessivamente a estados de menor energia A energia que os elétrons liberam nesse processo bombeia íons H prótons através da membrana do compartimento interno da mitocôndria a matriz para o espaço entre as membranas e daí para o citosol geran do um gradiente de íons H Figura 260 Esse gradiente serve como importante fonte de energia para as células armazenada de maneira semelhante a uma bateria e que é usada em uma grande variedade de reações que requerem energia A fosforilação de ADP formando ATP é a mais proeminente dessas reações Ao final dessa série de transferências de elétrons eles passam para moléculas de oxigênio O2 que se difundiram para a mitocôndria e que se combinam com os prótons Figura 257 Visão geral do ciclo do ácido cítrico A reação da acetilCoA com o oxalacetato inicia o ciclo produzindo citrato ácido cítrico Em cada volta do ciclo duas moléculas de CO2 são produ zidas como produtos de descarte e ainda são produzidas três moléculas de NADH uma molécula de GTP e uma molécula de FADH2 O número de átomos de carbono de cada intermediário é mostrado nos quadros amarelos Ver Painel 29 p 106 107 para mais detalhes ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 5 ETAPA 6 ETAPA 7 ETAPA 8 C H3C O 6C 2C 6C C O2 C O2 5C 4C 4C 4C 4C 4C H H H Oxalacetato Citrato AcetilCoA SCoA RESULTADO LÍQUIDO CADA VOLTA DO CICLO PRODUZ TRÊS MOLÉCULAS DE NADH UMA MOLÉCULA DE GTP E UMA MOLÉCULA DE FADH2 E LIBERA DUAS MOLÉCULAS DE CO2 GTP FADH2 NADH NADH NADH 86 PARTE I Introdução à célula Embora o nitrogênio molecular seja abundante na atmosfera da Terra ele é um gás quimicamente inerte Somente poucas espécies de seres vivos têm capacidade de incorporálo em moléculas orgânicas um processo denominado fixação de nitrogênio A fixação de nitrogênio ocorre em alguns microrganismos e em alguns processos geofísi cos como as descargas de raios durante as tempestades A fixação de nitrogênio é essen cial para toda a biosfera sem ela não haveria vida na Terra Apenas uma pequena parte de todos os compostos nitrogenados presentes nos organismos vivendo hoje é oriunda de produtos formados por nitrogênio recémfixado da atmosfera A maior parte do nitro gênio está circulando entre os organismos há muito tempo passando de um ser vivo para outro Assim podemos considerar que as reações de fixação de nitrogênio que ocorrem atualmente têm a função de completar a disponibilidade total de nitrogênio existente Os vertebrados recebem praticamente todo seu nitrogênio pela ingestão de uma dieta contendo proteínas e ácidos nucleicos No organismo essas macromoléculas são degradadas até aminoácidos e nos componentes dos nucleotídeos O nitrogênio que elas contêm é utilizado para produzir novas proteínas e novos ácidos nucleicos ou outras moléculas Cerca de metade dos 20 aminoácidos encontrados nas proteínas são aminoá cidos essenciais para os vertebrados Figura 262 isto é não podem ser sintetizados a partir dos demais componentes da dieta Os outros aminoácidos podem ser sintetiza dos utilizandose vários materiais inclusive os intermediários do ciclo do ácido cítrico Os aminoácidos essenciais são sintetizados pelas plantas e por organismos invertebra dos geralmente utilizando vias metabólicas longas com alto dispêndio de energia e que foram perdidas durante a evolução dos vertebrados Os nucleotídeos necessários para a síntese de RNA e de DNA podem ser sintetiza dos por vias biossintéticas especializadas Todos os nitrogênios assim como alguns dos átomos de carbono das bases púricas e pirimídicas provêm dos aminoácidos glutamina ácido aspártico e glicina que são abundantes Por outro lado os açúcares ribose e deso xirribose são derivados da glicose Não existem nucleotídeos essenciais que devam ser fornecidos pela dieta Os aminoácidos que não são utilizados em vias biossintéticas podem ser oxidados para a geração de energia metabólica A maior parte dos seus átomos de carbono e hi drogênio forma CO2 e H2O enquanto os seus átomos de nitrogênio são transferidos de uma molécula a outra de várias formas até comporem a ureia que é então excretada Cada aminoácido é processado de uma maneira diferente e existe toda uma constelação de reações enzimáticas para catabolizálos O enxofre é abundante na Terra na sua forma mais oxidada sulfato SO4 2 Para se rem úteis para vida o sulfato deve ser reduzido a sulfito S 2 o estado de oxidação do en xofre que é necessário para a síntese de moléculas biológicas inclusive os aminoácidos metionina e cisteína a coenzima A ver Figura 239 e os centros ferroenxofre essenciais para o transporte de elétrons ver Figura 1416 Os processos de redução do enxofre co meçam em bactérias fungos e plantas nos quais um grupo especializado de enzimas utiliza ATP e poder redutor formando a via de assimilação de enxofre Os seres humanos e os demais animais não podem reduzir sulfato e portanto devem adquirir o enxofre que necessitam para seus metabolismos dos alimentos que consomem A C Elétron em estado de alta energia B Proteína de membrana Membrana e A C B e A C B e H H H Elétron em estado de baixa energia Figura 260 As reações de transporte de elétrons geram um gradiente de H entre as duas faces da membrana Um elétron em um estado de alta energia proveniente p ex da oxidação de um metabólito passa sequencial mente pelos carreadores A B e C até um estado de menor energia Neste diagrama o carreador B está localizado na membrana de tal maneira que durante o transporte de um elétron ele capta H de uma das faces da membrana e o libera na face oposta Isso leva a um gradiente de H Como está discutido no Capítulo 14 esse gradiente é uma importante forma de energia que é acoplada por outras proteínas da mem brana para impulsionar a formação de ATP para um exemplo real ver a Figura 1421 Figura 261 Estágios finais da oxidação das moléculas de alimentos As moléculas de NADH e FADH2 FADH2 não está mostrado são produzidas pelo ciclo do ácido cítrico Esses carreadores ativados doam elétrons de alta energia que serão usados para reduzir oxigênio gasoso formando água A maior parte da energia liberada durante essas transferências de elétrons que ocorrem ao longo da cadeia transportadora de elétrons na membrana inter na da mitocôndria ou na membrana plasmá tica de bactérias é acoplada à síntese de ATP daí o nome fosforilação oxidativa discutido no Capítulo 14 CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO FOSFORILAÇÃO 2 AcetilCoA CoA CO2 O2 Piruvato proveniente da glicólise H2O OXIDATIVA MITOCÔNDRIA Piruvato NADH da glicólise ATP ADP NADH NAD Pi e CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 87 O metabolismo é altamente organizado e regulado É possível ter uma ideia de como é complexa a maquinaria química das células obser vando as relações entre a glicólise o ciclo do ácido cítrico e as outras vias metabólicas representadas na Figura 263 Essa figura mostra apenas algumas das vias enzimáticas de uma célula humana É óbvio que nossa discussão sobre o metabolismo celular será restrita a apenas uma pequena parte do amplo campo da química celular Todas essas reações ocorrem em células que têm menos de 01 mm de diâmetro sendo que cada uma dessas reações requer uma enzima diferente Como a Figura 263 deixa claro frequentemente a mesma molécula pode fazer parte de mais de uma via O piruvato por exemplo é substrato para mais de meia dúzia de enzimas diferentes cada uma delas o modifica quimicamente de uma maneira distinta Uma enzima con verte piruvato em acetilCoA outra em oxalacetato uma terceira no aminoácido alani na uma quarta em lactato e assim por diante Todas essas vias competem pela mesma molécula de piruvato Simultaneamente ocorrem milhares de competições semelhantes por outras moléculas pequenas A situação é ainda mais complicada nos organismos multicelulares Em geral dife rentes tipos de células possuem um conjunto diferente de enzimas Além disso diferen tes tecidos contribuem de forma distinta para a química do organismo como um todo Além das diferenças quanto a produtos especializados como hormônios e anticorpos existem diferenças significativas nas vias metabólicas comuns entre os vários tipos de células presentes em um mesmo organismo Embora praticamente todas as células contenham as enzimas da glicólise do ci clo do ácido cítrico da síntese e da degradação de lipídeos e do metabolismo dos ami noácidos os níveis com que cada um desses processos são necessários em cada um dos diferentes tecidos não são os mesmos Por exemplo a célula nervosa a célula que mais trabalha no organismo praticamente não mantém nenhuma reserva de glicogênio ou de ácido graxo e depende quase totalmente do fornecimento de glicose pela corrente san AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS TREONINA METIONINA LISINA VALINA LEUCINA ISOLEUCINA HISTIDINA FENILALANINA TRIPTOFANO Figura 262 Os nove aminoácidos es senciais Esses aminoácidos não podem ser sintetizados por células humanas e portanto devem ser supridos pela dieta Piruvato AcetilCoA Glicose6fosfato Figura 263 A glicólise e o ciclo do ácido cítrico estão no centro de um conjunto complexo de vias metabólicas nas células humanas Cerca de 2 mil reações metabólicas estão representadas esquematicamente com as reações da glicólise e do ácido cítrico em vermelho Diversas outras reações também levam a essa via central fornecendo moléculas pequenas para serem catabolizadas com a consequente produção de energia ou desviadas para suprirem a biossíntese com compostos de carbono Adaptada com permissão de Kanehisa Laboratories 88 PARTE I Introdução à célula guínea De maneira oposta as células do fígado fornecem glicose para as células mus culares que estiverem em contração e reciclam o ácido lático produzido pelas células do músculo novamente em glicose Todos os tipos de células têm vias metabólicas caracte rísticas e devem cooperar tanto para o estado de normalidade como para a resposta a um estresse ou ao jejum Podese pensar que o sistema como um todo deve ser equilibrado com tal grau de precisão que qualquer distúrbio por menor que seja como uma mudan ça temporária na ingestão de alimento pode ser desastroso Na realidade o equilíbrio metabólico das células é espantosamente estável Inde pendentemente de como o equilíbrio é perturbado as células reagem no sentido de res tabelecer o estado inicial As células podem adaptarse e continuar a funcionar durante o jejum ou doença Muitos tipos de mutações podem prejudicar ou mesmo eliminar de terminadas vias e mesmo assim certas necessidades mínimas são satisfeitas de modo que a célula sobrevive Isso acontece porque uma rede elaborada de mecanismos de con trole regula e coordena as velocidades de todas essas reações Esses controles apoiamse fundamentalmente na capacidade impressionante que as proteínas têm de modificarem suas conformações e suas químicas em resposta a alterações no ambiente em que este jam Os princípios que regem o modo como as grandes moléculas como as proteínas são sintetizadas e a química de sua regulação são abordados a seguir Resumo A glicose e as outras moléculas dos alimentos são degradadas através de etapas de oxidação controladas para fornecer energia química na forma de ATP e de NADH Existem três conjun tos de reações que agem em sequência sendo que os produtos finais de uma são o material inicial para a próxima a glicólise que ocorre no citosol o ciclo do ácido cítrico na matriz da mitocôndria e a fosforilação oxidativa na membrana interna da mitocôndria Os produtos intermediários da glicólise e os do ciclo do ácido cítrico são utilizados como fonte de energia metabólica e também para produzir muitas das moléculas pequenas usadas como matéria prima para as vias de biossíntese As células armazenam moléculas de açúcar na forma de glicogênio nos animais e na forma de amido nas plantas Tanto os animais como as plantas usam intensamente as gorduras como reserva de alimento Esses materiais de reserva por sua vez servem como a principal fonte de alimento para o homem em conjunto com as proteínas que compõem a maior parte do peso seco das células nos alimentos que ingerimos O QUE NÃO SABEMOS A quimiosmose veio antes da fermen tação como fonte de energia metabó lica ou alguma forma de fermentação veio antes como tem sido aceito por vários anos Qual será o número mínimo de com ponentes que são necessários para compor uma célula viva Como é que se pode descobrir isso É possível a existência de outras for mas de vida além daquela que co nhecemos na Terra e que foi descrita neste capítulo Quais seriam o tipo de assinaturas químicas que se deveria procurar para se investigar a presença de vida em outros planetas A química que é compartilhada pelas células de todos os seres vivos pode ser uma pista para se decifrar como era o ambiente onde as primeiras célu las se originaram Por exemplo o que se pode concluir da constância univer sal da relação K Na do pH neutro e do papel central do fosfato TESTE SEU CONHECIMENTO Quais das afirmativas abaixo estão corretas Justifique 21 Uma solução 10 8 M de HCl tem pH 8 22 A maioria das interações entre macromoléculas pode ser mediada tanto por ligações covalentes como por ligações não covalentes 23 Animais e plantas utilizam oxidação para extrair ener gia das moléculas dos alimentos 24 Caso ocorra oxidação em uma reação também ocorre rá uma redução 25 O acoplamento da reação energeticamente desfavorá vel A n B a uma segunda reação B n C que seja favorável deslocará a constante de equilíbrio da primeira reação 26 O critério que define que uma reação ocorre esponta neamente é G e não G porque G leva em consideração as concentrações dos reagentes e dos produtos 27 O oxigênio consumido durante a oxidação da glicose nas células animais retorna para a atmosfera na forma de CO2 Discuta as questões a seguir 28 Dizse que a química orgânica das células vivas é espe cial por duas razões ocorre em um ambiente aquoso e realiza reações muito complexas Você concorda que ela é realmente tão diferente da química orgânica executada nos principais laboratórios do mundo Justifique sua resposta 29 O peso molecular do etanol CH3CH2OH é 46 e a den sidade é 0789 gcm 3 A Qual é a molaridade do etanol na cerveja que tem 5 de etanol em volume O conteúdo alcoólico da cerveja varia entre 4 cervejas fracas e 8 cervejas fortes B O limite legal do conteúdo alcoólico no sangue varia conforme o país mas 80 mg de etanol por 100 mL de sangue geralmente considerado como um nível de álcool no san gue de 008 é o mais comum Qual é a molaridade do etanol em uma pessoa nesse limite legal C Quantas garrafas de cerveja a 5 de etanol de 355 mL uma pessoa de 70 kg pode beber e ainda permanecer no limite legal Uma pessoa de 70 kg contém cerca de 40 L de água Ignore o metabolismo do etanol e suponha que o con teúdo de água da pessoa permaneça constante D O etanol é metabolizado a uma velocidade de cerca de 120 mg por hora por kg de peso independentemente de sua concentração Se uma pessoa de 70 kg tiver duas vezes CAPÍTULO 2 Bioenergética e química celular 89 o limite legal de álcool no sangue 160 mg100 mL quanto tempo levará para que o limite de álcool no sangue diminua até o limite legal 210 Sabese que a cadeia lateral da histidina tem um pa pel importante no mecanismo catalítico de determinada en zima Entretanto não está claro se a histidina é necessária no estado protonado carregada ou não protonado não carre gada Para responder a essa questão a atividade da enzima deve ser medida em um amplo espectro de pH Os resulta dos estão mostrados na Figura Q21 Qual a forma de histi dina necessária para a atividade enzimática Atividade do máximo 7 6 5 4 8 9 10 0 100 pH Figura Q21 Atividade enzi mática em função do pH 211 As três moléculas mostradas na Figura Q22 contêm os sete grupos reativos mais comuns que ocorrem na biolo gia A maioria das moléculas que formam as células é com posta por esses grupos funcionais Indique e dê o nome dos grupos funcionais dessas moléculas C O O O P CH CH2 HO O O P 13bisfosfoglicerato C O SH CH2 CH NH3 Cisteína O C O C CH3 Piruvato O O O O O O Figura Q22 Três moléculas que ilustram os sete grupos mais comuns em biologia O 13bifosfoglicerato e o piruvato são intermediários da glicólise e a cisteína é um aminoácido 212 A difusão pode parecer vagarosa na vida cotidiana mas em uma escala celular ela é muito rápida A velocidade instantânea média de uma partícula em solução isto é a ve locidade entre as colisões muito frequentes é v kTm ½ em que k 138 10 16 g cm 2K s 2 T temperatura em K 37 C 310 K e m massa em gmolécula Calcule a velocidade instantânea de uma molécu la de água massa molecular 18 dáltons de uma molécula de glicose massa molecular 180 dáltons e de uma molécu la de mioglobina massa molecular 15000 dáltons a 37 C Apenas por diversão converta esses números em kmh An tes de iniciar os cálculos tente imaginar se essas moléculas estão se movendo como um nadador lento 1 kmh como uma pessoa em caminhada leve 5 kmh ou como um velo cista 40 kmh 213 A polimerização das unidades de tubulina forman do microtúbulos ocorre com aumento no ordenamento das subunidades Mesmo assim na polimerização da tubulina há aumento na entropia diminuição da ordem Como isso pode ser possível 214 Uma pessoa adulta normal de 70 kg pode conseguir toda a energia de que precisa para passar um dia comendo 3 mols de glicose 540 g Isso não é recomendado Cada molécula de glicose gera 30 moléculas de ATP quando oxidada a CO2 A concentração de ATP celular é mantida em cerca de 2 mM e um adulto de 70 kg tem cerca de 25 L de lí quido intracelular Uma vez que o ATP permanece constante nas células calcule quantas vezes por dia em média cada molécula de ATP do corpo é hidrolisada e ressintetizada 215 Supondo que existem 5 10 13 células no corpo huma no e que a reciclagem turnover do ATP é de 10 9 ATP por mi nuto em cada célula calcule quantos watts o corpo humano consome 1 watt é 1 joule por segundo Considere que a hidrólise do ATP produz 50 kJmol 216 Uma barra de cereal de 65 g 1360 kJ pode suprir energia suficiente para escalar o monte Zermatt 1660 m de altitude nos Alpes até o topo do pico Matterhorn 4478 m de altitude Figura Q23 ou se deve fazer uma pausa na ca bana Hörnli 3260 m de altitude para comer mais uma bar ra Imagine que o alpinista e seu equipamento tenham uma massa de 75 kg e que todo o esforço seja feito contra a gravi dade ie uma escalada diretamente vertical Relembrando as aulas de física trabalho J massa kg g ms 2 altura ganha m onde g é a aceleração da gravidade 98 ms 2 Um 1 joule é 1 kg m 2s 2 Qual das suposições consideradas no enunciado torna a necessidade de comer enormemente subestimada Figura Q23 O Matterhorn Cortesia de Zermatt Tourism 217 Na ausência de oxigênio as células consomem glico se a uma velocidade alta e constante A adição de oxigênio faz o consumo de glicose diminuir abruptamente e perma necer em um nível mais baixo Por que a glicose é consumida em alta velocidade na ausência de oxigênio e em baixa velo cidade na presença de oxigênio 90 PAINEL 21 Ligações e grupos químicos normalmente observados nas moléculas biológicas Há formação de uma ligação covalente quando dois átomos estiverem muito próximos e compartilharem entre si um ou mais átomos Em uma ligação simples há compartilhamento de 1 elétron de cada átomo Em uma ligação dupla o total de átomos compartilhados é 4 Cada átomo forma um número fixo de ligações covalentes em um arranjo espacial determinado Por exemplo o carbono forma quatro ligações simples em um arranjo tetraédrico enquanto o nitrogênio forma três ligações simples e o oxigênio forma duas ligações simples arranjadas conforme abaixo CADEIAS PRINCIPAIS DE CARBONO C C C C C C C C C C C C C C C C C C Também representadas por O carbono tem um papel único nas células devido à sua capacidade de formar ligações covalentes com outros átomos de carbono Os átomos de carbono podem se unir para formar C C C C C C Também representadas por C N O C N O Ligações duplas têm arranjos espaciais diferentes LIGAÇÕES COVALENTES C H H H H C H H H H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C H2C CH2 H3C CH2 Metano Grupo metila HIDROCARBONETOS C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C H H H H H H H H H H H H Geralmente representado como LIGAÇÕES DUPLAS ALTERNADAS Benzeno Anéis Árvores ramificadas Cadeias Também representados por Átomos ligados por duas ou mais ligações covalentes não podem girar livremente ao redor do eixo da ligação Essa restrição tem grande influência na forma tridimensional de diversas macromoléculas As cadeias de carbono podem conter ligações duplas Caso essas ligações sejam formadas em átomos de carbono alternados os elétrons das ligações se moverão na molécula estabilizando sua estrutura devido a um fenômeno conhecido como ressonância Ligações duplas alternadas em um anel podem gerar uma estrutura muito estável A realidade é uma conformação intermediária entre essas duas estruturas Átomos de carbono e hidrogênio combinamse formando compostos estáveis ou grupos químicos denominados hidrocarbonetos Eles são apolares não formam ligações de hidrogêno e geralmente são insolúveis em água Parte da cauda hidrocarbonada de uma molécula de ácido graxo 91 GRUPOS QUÍMICOS COO H H C OH C H O C O C OH O C C OH O HO C C O C O H2O Ésteres Ácido carboxílico Cetona Aldeído Álcool Ácido Álcool Éster C C C GRUPOS QUÍMICOS CON Citosina uma pirimidina C N H H H C N H H H C OH O C H2N C C N O H H2O C C C N O H H H N NH2 Ácido Amida Amina FOSFATOS P O O HO O C OH P O HO O C P O O O O O C O H2O Também representado como C OH O P O HO O O C O P O O O O C O O Também representado como P O OH O P O O O O HO P O O O P O O O O Também representado como O H2O H2O H2O H2O SH C SH C S S C C GRUPO SULFIDRILA P P P P Pi Vários compostos biológicos contêm um átomo de carbono ligado a um átomo de hidrogênio Por exemplo O grupo OOH é denominado grupo hidroxila CPO é denominado grupo carbonila OCOOH é denominado grupo carboxila Em água ele perde um íon H tornandose OCOO Os ésteres são formados pela reação de condensação entre um ácido e um álcool As aminas e as amidas são dois exemplos importantes de compostos que contêm um átomo de carbono ligado a um átomo de nitrogênio As aminas em solução aquosa combinamse com um íon H e ficam carregadas positivamente As amidas são formadas pela combinação de um ácido e de uma amina Ao contrário das aminas as amidas não têm carga quando em solução aquosa Um exemplo é a ligação peptídica que nas proteínas liga os aminoácidos entre si O nitrogênio também ocorre em muitos compostos em anel incluindo os importantes componentes dos ácidos nucleicos purinas e pirimidinas é denominado grupo sulfidrila No aminoácido cisteína o grupo sulfidrila pode existir na forma reduzida ou mais raramente na forma oxidada formando ligações cruzadas O fosfato inorgânico é um íon estável formado pelo ácido fosfórico H3PO4 Ele também é representado como Entre um grupo fosfato e um grupo hidroxila livre pode ser formado um éster de fosfato Grupos fosfato ligamse a proteínas da seguinte maneira A combinação de um grupo fosfato e de um grupo carboxila ou entre dois ou mais grupos fosfato origina um ácido anidrido Devido ao fato de esses compostos serem hidrolisados facilmente nas células dizse que eles contêm uma ligação rica em energia Ligação acilfosfato de alta energia ácido anidrido carboxílico fosfórico presente em alguns metabólitos Ligação fosfoanidrido de alta energia presente em moléculas como o ATP 93 A ÁGUA COMO SOLVENTE Molécula de água Cristal de açúcar Molécula de açúcar Dissolução do açúcar ÁCIDOS Observe que essa é uma reação reversível HCl Ácido clorídrico ácido forte H Íon hidrogênio Cl Íon cloreto H Ácido fraco C O OH C O O TROCA DE ÍON HIDROGÊNIO Geralmente representado por Íon hidrônio a água agindo como base fraca Íon hidroxila a água agindo como ácido fraco H2O H OH Íon hidrogênio Íon hidroxila H H H H O H H O O H O H 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 10 10 10 11 10 12 10 13 10 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 pH Concentração de H molsL ALCALINO ÁCIDO pH log10H Para água pura H 10 7 molsL pH BASES H Íon hidrogênio NH3 Amônia NH4 Íon amônio OH Na NaOH NH2 H NH3 Hidróxido de sódio base forte Íon sódio Íon hidroxila Várias substâncias como o açúcar de cozinha dissolvemse em água Isto é essas moléculas se separam umas das outras e cada uma delas é solvatada pela água Quando uma substância se dissolve em um líquido a mistura é denominada solução A substância dissolvida nesse caso o açúcar é o soluto e o líquido que o dissolve nesse caso a água é o solvente A água é um excelente solvente para muitas substâncias devido às suas ligações polares As substâncias que liberam íons hidrogênio na solução são denominadas ácidos Muitos dos ácidos que são importantes para as células se dissociam apenas parcialmente e por isso são denominados ácidos fracos Por exemplo o grupo carboxila OCOOH que se dissocia liberando um íon hidrogênio para a solução Os íons hidrogênio carregados positivamente H podem se mover de forma espontânea de uma molécula de água a outra criando desse modo duas espécies iônicas Uma vez que esse processo é rapidamente reversível os íons hidrogênio são continuamente transportados entre as moléculas de água A água pura contém uma concentração constante de íons hidrogênio e íons hidroxila ambos 107 M A acidez de uma solução é definida pela concentração de íons H que ela possui Por conveniência usase a escala de pH onde As substâncias que reduzem o número de íons hidrogênio na solução são chamadas de bases Algumas bases como a amônia combinamse diretamente com íons hidrogênio Outras bases como o hidróxido de sódio reduzem o número de íons H indiretamente porque os íons OH combinamse diretamente com íons H formando H2O Muitas das bases presentes nas células estão parcialmente associadas aos íons H e são denominadas bases fracas Isso é verdadeiro para compostos que possuem um grupo amino NH2 o qual tem uma tendência fraca a aceitar reversivelmente um íon H da água aumentando dessa forma a quantidade de íons OH livres 94 PAINEL 23 Os principais tipos de ligações não covalentes fracas que mantêm as macromoléculas unidas ATRAÇÕES DE VAN DER WAALS Raio de 02 nm Raio de 012 nm Raio de 015 nm Raio de 014 nm O N C H LIGAÇÕES QUÍMICAS NÃO COVALENTES FRACAS Ligação não covalente fraca LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO O H O N H O C C C C N N H H O N H O C C N N C C N C N H H N H H H LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ÁGUA C C C O N H O H H O H H C C C O N H C C C O N H C C C O N H 2H2O 2H2O Ligação peptídica 04 nm Dois átomos de carbono não ligados 015 nm Átomos de carbono ligados por ligação simples 013 nm Átomos de carbono ligados por ligação dupla R C H C O R C H C O H N H H C R N As moléculas orgânicas podem interagir com outras moléculas por meio de três tipos de forças de atração de curta distância conhecidas como ligações não covalentes atrações de van der Waals atrações eletrostáticas e ligação de hidrogênio A repulsão entre os grupos hidrofóbicos e a água é também importante para a conformação final das macromoléculas biológicas As ligações químicas não covalentes fracas possuem menos de 120 da força de uma ligação covalente forte Elas somente são fortes o suficiente para possibilitarem uma ligação de alta afinidade quando muitas delas se formarem simultaneamente Caso dois átomos estejam perto demais um do outro eles irão se repelir mutuamente de maneira muito forte Devido a essa razão um átomo pode ser tratado como uma esfera com um raio fixo O tamanho característico de cada átomo é especificado pelo seu raio de van der Waals característico A distância no contato entre quaisquer dos dois átomos unidos de modo não covalente é a soma dos seus respectivos raios de van der Waals Em distâncias muito curtas dois átomos apresentam uma interação de ligação fraca devido a flutuações nas suas cargas elétricas Devido a isso os dois átomos serão atraídos um ao outro até que a distância entre seus núcleos seja aproximadamente igual à soma dos seus raios de van der Waals Embora as atrações de van der Waals sejam individualmente muito fracas elas podem se tornar importantes quando as superfícies de duas macromoléculas se encaixarem perfeitamente entre si devido ao envolvimento de vários átomos Observe que quando dois átomos formarem uma ligação covalente os seus centros os núcleos dos átomos estarão muito mais próximos do que a soma dos dois raios de van der Waals Como descrito anteriormente para a água ver o Painel 22 as ligações de hidrogênio são formadas quando um átomo de hidrogênio se encontra entre dois átomos que atraem elétrons geralmente oxigênio ou nitrogênio As ligações de hidrogênio são mais fortes quando os três átomos estiverem alinhados em uma reta Exemplos em macromoléculas Os aminoácidos de uma cadeia polipeptídica podem estar ligados entre si por ligações de hidrogênio Elas estabilizam a estrutura da proteína enovelada Na duplahélice do DNA duas bases G e C estão ligadas por ligações de hidrogênio Quaisquer moléculas que possam formar ligações de hidrogênio entre si podem alternativamente formar ligações de hidrogênio com moléculas de água Devido a essa competição com moléculas de água as ligações de hidrogênio formadas entre duas moléculas que estejam dissolvidas em água são relativamente fracas 96 PAINEL 24 Esquema de alguns dos tipos de açúcares encontrados nas células MONOSSACARÍDEOS C O C O H FORMAÇÃO DE ANÉIS ISÔMEROS C H CH2OH CH2OH OH C H OH C HO H C H H H H H H H H H H H HO OH OH OH OH OH OH OH C O O CH2OH C H CH2OH OH C H OH C H OH 1 2 3 4 4 4 5 5 6 3 3 2 2 1 CH2OH H H H H H HO OH OH OH O 1 5 1 2 3 4 5 6 Glicose CH2OH H H H H H HO OH OH OH O Manose CH2OH H H H H H HO OH OH OH Galactose O O Glicose Ribose H C O C C H H HO OH C H OH C H OH C H H OH C H H HO OH C H H OH C H OH C H H OH C H OH C H OH C H OH C H H OH C H OH C H H OH 3 carbonos TRIOSES 5 carbonos PENTOSES 6 carbonos HEXOSES ALDOSES CETOSES C O H C O H C O H Gliceraldeído Ribose Glicose Frutose H H OH C H OH C H OH C H H OH Ribulose H H OH C H H OH Dihidroxiacetona O C C O C C O C C Geralmente os monossacarídeos têm a fórmula geral CH2On onde n pode ser 3 4 5 6 7 ou 8 e possuem dois ou mais grupos hidroxila Eles podem ter um grupo aldeído sendo então denominados aldoses ou um grupo cetona e desse modo serem denominados cetoses Em soluções aquosas o grupo aldeído ou a cetona de uma molécula de açúcar tendem a reagir com um grupo hidroxila da própria molécula fechando assim a molécula em forma de anel Observe que os átomos de carbono são numerados Muitos monossacarídeos distinguemse apenas quanto ao arranjo espacial dos átomos isto é eles são isômeros Por exemplo a glicose a galactose e a manose têm a mesma fórmula C6H12O6 mas diferem no que se refere ao arranjo dos grupos ao redor dos átomos de um ou dois carbonos Essas pequenas diferenças levam a alterações muito pequenas nas propriedades dos açúcares Entretanto eles são reconhecidos por enzimas e outras proteínas e os efeitos biológicos portanto podem ser importantes 98 PAINEL 25 Ácidos graxos e outros lipídeos H2C O C O HC O C O H2C O C O H2C OH HC OH H2C OH Glicerol TRIACILGLICERÓIS COOH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 COOH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 Ácido esteárico C18 Ácido palmítico C16 Ácido oleicoC18 ÁCIDOS GRAXOS COMUNS O O C Ácido esteárico O GRUPO CARBOXILA O O C O O C N O C C H Quando livre o grupo carboxila de um ácido graxo estará ionizado Entretanto geralmente ele está ligado a outros grupos formando ésteres ou amidas FOSFOLIPÍDEOS CH2 CH CH2 P O O O O Caudas hidrofóbicas de ácidos graxos Estrutura geral de um fosfolipídeo O O C Ácido oleico Modelo de preenchimento espacial Cabeça hidrofílica Colina Modelo de preenchimento espacial do fosfolipídeo fosfatidilcolina Os fosfolipídeos são os principais componentes das membranas celulares INSATURADO SATURADO São ácidos carboxílicos com caudas hidrocarbonadas longas Existem centenas de tipos diferentes de ácidos graxos Alguns possuem uma ou mais ligações duplas na cadeia hidrocarbonada e são chamados de insaturados Ácidos graxos sem ligação dupla são chamados de saturados Esta ligação dupla é rígida e cria uma dobra na cadeia O resto da cadeia é livre para girar ao redor das outras ligações COC Cadeia principal de carbono O ácidos graxos são armazenados como reserva de energia gorduras e óleos através de uma ligação éster com o glicerol formando dessa forma triacilgliceróis também conhecidos como triglicerídeos Nos fosfolipídeos dois grupos OOH do glicerol estão ligados a ácidos graxos enquanto um terceiro grupo OOH está ligado a um ácido fosfórico O fosfato ainda está ligado a um de uma série de pequenos grupos polares como a colina 99 GLICOLIPÍDEOS C C C C CH2 H H NH OH H O C O Açúcar Um glicolipídeo simples H ESTEROIDES HO O OH Colesterol encontrado em muitas membranas Testosterona hormônio esteroide masculino Os esteroides têm uma estrutura em anel em comum OUTROS LIPÍDEOS CH3 C CH CH2 CH2 Isopreno AGREGADOS DE LIPÍDEOS Os seus derivados podem formar grandes agregados mantidos coesos por forças hidrofóbicas 200 nm ou mais 4 nm Micela POLIISOPRENOIDES Polímeros de longas cadeias de isopreno O O O O P Galactose Os ácidos graxos têm uma cabeça hidrofílica e uma cauda hidrofóbica Em água eles podem formar um filme na superfície ou pequenas micelas Os triacilgliceróis triglicerídeos podem formar grandes gotas lipídicas esféricas no interior do citoplasma das células Os fosfolipídeos e os glicolipídeos formam bicamadas lipídicas autosselantes que constituem a base das membranas celulares Os lipídeos são definidos como moléculas insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos Os esteroides e os poliisoprenoides são outros dois tipos comuns de lipídeos Ambos são formados por unidades de isopreno Assim como os fosfolipídeos esses compostos são formados por uma região hidrofóbica contendo duas caudas hidrocarbonadas longas e uma região polar que contém um ou mais açúcares ao contrário dos fosfolipídeos eles não contêm fosfato Dolicol fosfato usado para transportar açúcares ativados na síntese associada à membrana de glicoproteínas e alguns polissacarídeos 101 NOMENCLATURA Os nucleosídeos e os nucleotídeos são denominados de acordo com sua base nitrogenada BASE Adenina Guanina Citosina Uracila Timina NUCLEOSÍDEO Adenosina Guanosina Citidina Uridina Timidina ABREVIAÇÃO A G C U T AMP adenosina monofosfato dAMP desoxiadenosina monofosfato UDP uridina monofosfato ATP adenosina trifosfato Açúcar Base Açúcar Base BASE AÇÚCAR NUCLEOSÍDEO BASE AÇÚCAR FOSFATO NUCLEOTÍDEO ÁCIDOS NUCLEICOS O OH Açúcar Base CH2 O O O P O O OH Açúcar Base CH2 H2O O O O P O O Açúcar Base CH2 O O O P O O Açúcar Base CH2 P O O O O 5 OH 3 Extremidade 3 da cadeia 3 5 Ligação fosfodiéster Extremidade 5 da cadeia Exemplo DNA O O O P O O P O O O O P O OS NUCLEOTÍDEOS POSSUEM MUITAS OUTRAS FUNÇÕES O CH2 N N N N NH2 OH OH 1 Eles carregam energia química em suas ligações fosfoanidrido facilmente hidrolisáveis O O O P O CH2 N N N N NH2 OH 2 Eles se combinam com outros grupos para formar coenzimas O O P O O C C C C N C C C N C C HS O O H H H H H H H H H H H H H HO CH3 Exemplo coenzima A CoA CH3 3 Eles são utilizados como moléculas de sinalização específicas nas células O O O P O CH2 N N N N NH2 O OH Exemplo AMP cíclico cAMP Ligações fosfoanidrido Exemplo ADP ou O P O O O ATP P A abreviação com uma letra é usada indistintamente para 1 a base sozinha 2 o nucleosídeo e 3 o nucleotídeo completo Normalmente o contexto deixa claro qual o significado entre as três possibilidades Quando o contexto não é suficiente adicionase os termos base nucleosídeoou nucleotídeo ou como no exemplo a seguir utilizase o código de três letras para os nucleotídeos Para formar os ácidos nucleicos os nucleotídeos são ligados entre si por ligação fosfodiéster entre os átomos de carbono 5e 3 A sequência linear de nucleotídeos em uma cadeia de ácido nucleico é abreviada usandose o código de uma letra como AGCTTACA com a extremidade 5 da cadeia no lado esquerdo 103 ENTROPIA S S R In pB pA Smar c T ENERGIA LIVRE DE GIBBS G G H TS G H TS G c TS então GT cT S GT Smar Scaixa Suniverso A segunda lei mas não a primeira lei permite predizer a direção de uma determinada reação Entretanto para que possa servir a essa finalidade é preciso se ter um modo conveniente de medir a probabilidade ou de forma equivalente o grau de desordem de um estado A entropia S é essa medida Ela é uma função logarítmica da probabilidade de modo que a variação na entropia S que ocorre quando a reação A B converte 1 mol de A em 1 mol de B é onde pA e pB são as probabilidades dos estados A e B R é a constante dos gases 831 J K1 mol 1 e S é medida em unidades de entropia ue No exemplo inicial das mil moedas a probabilidade relativa de todas com cara para cima estado A versus metade das moedas com cara e metade com coroa para cima estado B é igual à relação entre o número de diferentes maneiras pelas quais os dois resultados podem ser alcançados Podese calcular que pA 1 e pB 1000500 x 500 10299 Portanto a variação de entropia para a reorientação das moedas quando a caixa é sacudida vigorosamente e se obtém uma mistura com metade das moedas em cada orientação é R In 10298 ou cerca de 1370 ue por mol de cada caixa dessas 6 x 1023 caixas Então já que ΔS foi definido antes como positivo para a transição do estado A para o estado B pB pA 1 reações com grande aumento em S ie nas quais S 0 são favorecidas e ocorrerão espontaneamente Como discutido no Capítulo 2 a energia térmica produz uma agitação aleatória nas moléculas A sua entropia é aumentada devido ao fato de que a transferência de calor de um sistema fechado para os seus arredores aumenta o número de diferentes arranjos que as moléculas podem ter no mundo externo Pode ser observado que a liberação de uma quantidade fixa de energia térmica tem um maior efeito desorganizador a temperaturas baixas do que a altas temperaturas e que o valor de ΔS dos arredores como definido anteriormente Smar é precisamente igual à c a quantidade de calor transferida do sistema para os arredores dividida pela temperatura absoluta T Ao lidar com um sistema biológico fechado devese ter uma maneira simples de predizer se determinada reação ocorrerá de forma espontânea ou não Foi visto que a questão crucial para determinar se a reação ocorrerá é saber se a variação de energia livre para o universo é positiva ou não No sistema que foi idealizado anteriormente uma célula dentro de uma caixa existem dois componentes referentes à variação de energia livre do universo a variação de entropia do sistema interno da caixa e a variação de entropia dos arredores o mar e ambos devem ser considerados em conjunto antes que qualquer predição possa ser feita Por exemplo é possível que a reação absorva calor e dessa forma diminua a entropia do mar Smar 0 e ao mesmo tempo provoque um grande grau de desordenamento dentro da caixa Scaixa 0 de modo que o total Suniverso Smar Scaixa seja maior do que 0 Nesse caso a reação ocorrerá espontaneamente mesmo que provoque aumento no calor da caixa durante a reação Um exemplo de uma reação dessas é a dissolução de cloreto de sódio em um becker com água a caixa que é um processo espontâneo ainda que a temperatura da água diminua com a adição do sal na solução Os químicos descobriram que é prático definir novas funções compostas para descrever combinações de propriedades físicas de um sistema As propriedades que podem ser combinadas incluem temperatura T pressão P volume V energia E e entropia S A entalpia H é uma dessas funções compostas Porém de longe a função composta mais útil para os biólogos é a energia livre de Gibbs G Ela serve como uma ferramenta de contabilidade que permite que se deduza a variação de entalpia no universo devido a uma reação química que ocorre na caixa e ao mesmo tempo evita considerar separadamente a variação de entropia no mar A definição de G é onde o volume da caixa é V H é a entalpia supracitada E PV T é a temperatura absoluta e S é a entropia Todas essas grandezas se aplicam apenas à caixa A variação na energia livre durante a reação na caixa G dos produtos menos G dos materiais iniciais é notada como G e como será demonstrado agora ela é uma medida direta da quantidade de desordem que é criada no universo pela ocorrência da reação Em temperatura constante a variação de energia livre G durante a reação é igual a H TS Lembrando que H c o calor absorvido do mar temos Como cT é igual à variação de entropia do mar Smar e o S da equação acima é Scaixa temos Disso se conclui que a variação de energia livre é uma medida direta da variação de entropia do universo Uma reação ocorrerá na direção que produzir uma variação na energia livre G menor do que zero porque nesse caso haverá uma variação positiva na entropia do universo devido à ocorrência da reação No caso de um conjunto complexo de reações acopladas envolvendo muitas moléculas diferentes a variação total de energia livre pode ser calculada simplesmente pela soma das energias livres de todas as diferentes espécies moleculares após a ocorrência da reação e comparar esse valor com a soma das energias livres de antes da reação Para as substâncias mais comuns esses valores de energia livre podem ser encontrados em tabelas que estão disponíveis em várias publicações Dessa maneira por exemplo a partir dos valores observados para a magnitude do gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndria e os valores de G para a hidrólise de ATP dentro da mitocôndria se tem certeza que a síntese de ATP requer a passagem de mais do que um próton para cada molécula de ATP que é sintetizada O valor de G de uma reação é uma medida direta do quanto a reação está distante do equilíbrio O alto valor negativo para a hidrólise do ATP em uma célula reflete meramente o fato de que as células mantêm as reações de hidrólise de ATP distantes do equilíbrio em até 10 ordens de magnitude Se a reação atinge o equilíbrio G 0 ela ocorrerá exatamente na mesma velocidade tanto na direção direta como na direção reversa Para a hidrólise do ATP o equilíbrio é alcançado quando a maior parte do ATP tiver sido hidrolisado como ocorre em uma célula morta 104 PAINEL 28 Detalhes das 10 etapas da glicólise CH2OH O OH OH OH HO Glicose CH2O H O OH OH OH HO Glicose6fosfato Hexocinase CH2O O OH OH OH HO Glicose6fosfato Frutose6fosfato Forma em anel Forma em anel Forma em cadeia aberta 1 1 2 2 3 4 5 6 6 O H C C H OH C HO H C H OH C H OH CH2O 3 4 5 Forma em cadeia aberta 1 1 2 2 6 C C HO H C H OH C H OH CH2O CH2OH 3 3 4 4 5 5 Fosfoglicose isomerase OH2C CH2OH O HO OH OH 6 H Fosfofrutocinase OH2C CH2OH O HO OH OH OH2C O HO OH OH A glicose é fosforilada pelo ATP formando um açúcarfosfato A carga negativa do fosfato evita a passagem dos açúcaresfosfato através da membrana plasmática retendo a glicose dentro da célula O açúcar de seis carbonos é clivado produzindo duas moléculas com três carbonos cada uma Apenas o gliceraldeído3fosfato pode seguir imediatamente na glicólise O outro produto da etapa 4 dihidroxiacetona fosfato é isomerizado formando gliceraldeído3fosfato Um rearranjo da estrutura química facilmente reversível isomerização muda o oxigênio da carbonila do carbono 1 para o carbono 2 formando uma cetose a partir de um açúcar aldose Ver Painel 24 p 96 O novo grupo hidroxila no carbono 1 é fosforilado por ATP preparando para a formação de dois açúcaresfosfato de três carbonos cada um A entrada dos açúcares na glicólise é controlada nesta etapa pela regulação da enzima fosfofrutocinase Frutose6fosfato Frutose16bisfosfato Forma em anel O H C C H OH Aldolase Forma em cadeia aberta C C HO H C H OH C H OH CH2O CH2O O C C HO H H CH2O CH2O O OH2C CH2O O HO OH OH Frutoses16bisfosfato Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldeído 3fosfato O C CH2O CH2OH Triose fosfato isomerase O H C C H OH CH2O Gliceraldeído3fosfato Dihidroxiacetona fosfato O Em cada etapa a parte da molécula que foi alterada está marcada em azul e o nome da enzima que catalisa a reação está destacada em amarelo ATP ATP ADP ADP P P P P P P P P P P P P P P P P CH2O ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 5 105 Enolase Fosfoglicerato mutase O O C C H OH CH2O 3fosfoglicerato O O C C H O CH2OH 2fosfoglicerato O O C C H O CH2OH 2fosfoglicerato O O C C O CH2 H2O Fosfoenolpiruvato O O C C O CH2 Fosfoenolpiruvato O O C C O CH3 Piruvato O O C C O CH3 O O C C O CH3 Fosfoglicerato cinase O C C H OH CH2O 13bisfosfoglicerato O O C C H OH CH2O 3fosfoglicerato Oxidação das duas moléculas de gliceraldeído3fosfato Tem início a fase de geração de energia da glicólise com a formação de NADH e de uma nova ligação anidrido ligado a fosfato rica em energia ver Figura 246 H Gliceraldeído3fosfato desidrogenase O H C C H OH CH2O Gliceraldeído3fosfato O O C C H OH CH2O 13bisfosfoglicerato H A transferência para o ADP do grupo fosfato de alta energia que foi formado na etapa 6 forma ATP A ligação éster fosfato remanescente no 3fosfoglicerato cuja hidrólise tem uma energia livre relativamente baixa é movida do carbono 3 para o carbono 2 formando 2fosfoglicerato A remoção de água do 2fosfoglicerato cria uma ligação enolfosfato rica em energia A transferência para o ADP do grupo fosfato de alta energia gerado na etapa 9 forma ATP e completa a glicólise RESULTADO LÍQUIDO DA GLICÓLISE Piruvatocinase CH2OH O OH OH OH HO Glicose Duas moléculas de piruvato Além do piruvato os produtos são duas moléculas de ATP e duas moléculas de NADH 1 2 3 ATP ADP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP NADH NADH NADH NAD Pi P P P P P P P P P P P O ETAPA 6 ETAPA 7 ETAPA 8 ETAPA 9 ETAPA 10 106 PAINEL 29 O ciclo do ácido cítrico completo Depois que a enzima remove um próton do grupo CH3 da acetilCoA o CH2 carregado negativamente forma uma carbonila a partir do oxalacetato A perda subsequente da coenzima A HSOCoA por hidrólise força enormemente a reação para a frente Uma reação de isomerização na qual primeiro há remoção de água que então é novamente adicionada move o grupo hidroxila de um átomo de carbono para o átomo adjacente COO COO COO HO H H H H C C C COO COO COO HO H H H H C C C COO COO COO H H H C C C Citrato Intermediário cisaconitato Isocitrato Aconitase H2O H2O H2O H2O AcetilCoA Intermediário ScitrilaCoA Citrato Oxalacetato COO COO O O C C S CoA Citrato sintase CH3 CH2 H2O O C S CoA CH2 COO COO C HO CH2 HS H CoA CH2 COO COO COO C HO CH2 Detalhes dessas oito etapas estão mostrados a seguir Nesta parte do painel em cada etapa a parte da molécula que sofre mudança está sombreada em azul e o nome da enzima que catalisa a reação está destacado em amarelo CH2 COO COO COO C HO CH2 H2O H2O H2O CH2 CO2 CO2 CO2 COO COO COO HC CH HO CH2 COO COO C O CH2 CH2 COO COO CH2 CH COO COO CH H OH C COO COO CH2 COO C O CH2 S CoA O CH3 S CoA AcetilCoA Coenzima A HS CoA HS CoA HS CoA HS CoA CH2 O C COO COO CH2 O O C COO COO COO CH2 CH3 C Ciclo seguinte ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 6 ETAPA 7 ETAPA 8 ETAPA 5 Citrato 6C Isocitrato 6C SuccinilCoA 4C Succinato 4C Fumarato 4c Malato 4C Oxalacetato 4C Oxalacetato 4C Piruvato αcetoglutarato 5C H H H H 2C CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO Visão geral do ciclo do ácido cítrico completo Os dois carbonos da acetilCoA que entram nessa volta do ciclo marcados em vermelho são convertidos em CO2 nas voltas seguintes do ciclo Os dois carbonos que são convertidos a CO2 neste ciclo estão sombreados em azul C GTP GDP NADH NADH NADH NADH NAD NAD NAD NAD Pi FAD FADH2 ETAPA 1 ETAPA 2 107 Na primeira das quatro etapas de oxidação do ciclo o carbono que carrega o grupo hidroxila é convertido em grupo carbonila O produto imediato é instável e perde CO2 enquanto ainda está ligado à enzima O complexo da αcetoglutarato desidrogenase assemelhase muito com o grande complexo enzimático que converte piruvato em acetilCoA o complexo piruvato desidrogenase da Figura 354DE Ele da mesma forma catalisa uma oxidação que produz NADH CO2 e um tioéster de alta energia ligado à coenzima A CoA Uma molécula de fosfato da solução desloca a CoA formando uma ligação fosfato de alta energia com o succinato Esse fosfato então é transferido ao GDP para formar a GTP Nas bactérias e nas plantas em vez de GTP é formado ATP Na terceira etapa de oxidação do ciclo o FAD recebe dois átomos de hidrogênio do succinato A adição de água ao fumarato coloca um grupo hidroxila próximo ao carbono carbonila Nesta última das quatro etapas de oxidação do ciclo o carbono carregando o grupo hidroxila é convertido em um grupo carbonila regenerando o oxalacetato necessário para a etapa 1 COO COO HO H H H H C C C Isocitrato Isocitrato desidrogenase CO2 COO COO COO H H H O C C C Intermediário oxalosuccinato COO H H COO COO H H H H O C C C αcetoglutarato Succinato desidrogenase COO COO H H H H C C Succinato COO COO H H C C Fumarato Fumarase COO COO HO H H H C C Malato COO COO H H C C Fumarato H2O Complexo da αcetoglutarato desidrogenase CO2 H COO COO H H H H O C C C αcetoglutarato COO H H H H O C C C SuccinilCoA HS CoA S CoA H2O COO H H H H O C C C SuccinilCoA S CoA COO COO H H H H C C Succinato HS CoA SuccinilCoAsintetase Malato desidrogenase H COO COO HO H H H C C Malato COO COO O C Oxalacetato CH2 GTP GDP FAD NADH FADH2 NAD NADH NAD NADH NAD Pi ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 5 ETAPA 6 ETAPA 7 ETAPA 8 108 PARTE I Introdução à célula REFERÊNCIAS Gerais Berg JM Tymoczko JL Stryer L 2011 Biochemistry 7th ed New York WH Freeman Garrett RH Grisham CM 2012 Biochemistry 5th ed Philadelphia Thomson BrooksCole Moran LA Horton HR Scrimgeour G Perry M 2011 Principles of Biochemistry 5th ed Upper Saddle River NJ Prentice Hall Nelson DL Cox MM 2012 Lehninger Principles of Biochemistry 6th ed New York Worth 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para a catálise de diversas reações químicas Proteínas embebidas na mem brana plasmática formam canais e bombas que controlam a passagem de pequenas moléculas para dentro e para fora da célula Outras proteínas transportam mensagens de uma célula para outra ou atuam como integradores de sinais que ativam cascatas de sinais no interior da célula da membrana plasmática para o núcleo Outras proteínas atuam ainda como pequenas máquinas moleculares com partes móveis a cinesina por exemplo age na propulsão de organelas através do citoplasma a topoisomerase pode se parar moléculas de DNA emaranhadas Algumas proteínas especializadas podem atuar como anticorpos toxinas hormônios moléculas anticongelantes fibras elásticas fibras de sustentação ou fontes de bioluminescência Antes de compreender como os genes funcionam como os músculos se contraem como as células nervosas conduzem eletri cidade como os embriões se desenvolvem ou como nossos corpos funcionam devemos ter conhecimento profundo acerca das proteínas FORMA E ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS Do ponto de vista químico as proteínas são as moléculas estruturalmente mais comple xas e funcionalmente mais sofisticadas que conhecemos Isso talvez não seja surpreen dente uma vez que se compreenda que a estrutura e a química de cada proteína foram desenvolvidas e ajustadas por bilhões de anos de história evolutiva Cálculos teóricos de pesquisadores especialistas em genética de populações revelam que ao longo de períodos evolutivos uma vantagem seletiva surpreendentemente pequena é suficiente para que uma proteína com uma alteração espontânea se espalhe em uma população de organismos Mesmo para especialistas a notável versatilidade das proteínas pode pare cer realmente fantástica Nesta seção consideraremos como a localização de cada aminoácido em uma lon ga cadeia de aminoácidos que compõe uma proteína determina sua estrutura tridimen sional Mais adiante no capítulo utilizaremos esse conhecimento da estrutura proteica em nível atômico para descrever como a forma precisa de cada molécula proteica deter mina sua função em uma célula A forma de uma proteína é especificada pela sua sequência de aminoácidos Existem 20 aminoácidos nas proteínas que são codificadas diretamente no DNA de um organismo cada um com propriedades químicas diferentes Uma molécula de proteína consiste em uma longa cadeia não ramificada desses aminoácidos e cada um está ligado aos aminoácidos adjacentes por ligações peptídicas covalentes As proteínas são por isso também chamadas de polipeptídeos Cada tipo de proteína tem uma sequência exclusiva de aminoácido e existem milhares de proteínas diferentes em uma célula A sequência repetitiva dos átomos ao longo do centro da cadeia polipeptídica é denominada cadeia principal polipeptídica Ligadas a essa cadeia repetitiva estão as porções dos aminoácidos que não estão envolvidas na formação da ligação peptídica e que conferem a cada aminoácido suas propriedades únicas as 20 diferentes cadeias laterais dos aminoácidos Figura 31 Algumas dessas cadeias laterais são apolares e 110 PARTE I Introdução à célula hidrofóbicas têm medo de água outras são carregadas negativa ou positivamente algumas formam ligações covalentes de forma rápida e assim por diante O Painel 31 p 112113 mostra suas estruturas atômicas e a Figura 32 lista as suas abreviações Como discutido no Capítulo 2 os átomos comportamse como se fossem esferas rígidas com um raio definido seu raio de van der Waals A regra de que dois átomos não ocupam o mesmo espaço e outras restrições limitam o número de ângulos de liga ção possíveis em uma cadeia polipeptídica Figura 33 restringindo enormemente o número de estruturas ou conformações tridimensionais possíveis de átomos Todavia uma longa cadeia flexível como a de uma proteína pode ainda enovelarse de várias maneiras O enovelamento de uma cadeia polipeptídica também é determinado por dife rentes conjuntos de ligações não covalentes fracas que se formam entre uma parte e outra da cadeia Essas ligações envolvem tanto átomos da cadeia principal polipeptí dica quanto átomos da cadeia lateral dos aminoácidos Existem três tipos de ligações fracas ligações de hidrogênio atrações eletrostáticas e atrações de van der Waals como explicado no Capítulo 2 ver p 44 As ligações não covalentes são 30 a 300 vezes mais fracas que as ligações covalentes típicas que formam as moléculas biológicas No en tanto muitas ligações fracas agindo em paralelo podem manter duas regiões de uma cadeia polipeptídica fortemente unidas Dessa forma a força combinada de um grande número dessas ligações não covalentes determina a estabilidade de cada forma enove lada Figura 34 Figura 31 Os componentes de uma proteína As proteínas consistem em uma cadeia principal polipeptídica com grupos laterais ligados a ela Cada tipo de proteína difere em sua sequência e em seu número de aminoácidos portanto é a sequência de cadeias laterais quimica mente distintas que torna cada proteína diferente As duas extremidades da cadeia polipeptídica são quimicamente distintas a extremidade que apresenta um grupo amino livre NH3 também representado como NH2 é a terminação aminoterminal ou Nterminal e a que apresenta o grupo carboxila livre COO também representa do como COOH é a terminação carboxil terminal ou Cterminal A sequência de aminoácidos de uma proteína é sempre apresentada na direção N para Cterminal lendose da esquerda para a direita H N C C N C C N C C N C H H H H H H H CH2 CH2 S CH3 O O CH2 C CH2 CH3 H3C CH C O O CH2 OH O H H O O Cadeias laterais Cadeias laterais Cadeia principal polipeptídica Terminação amino Nterminal Terminação carboxila Cterminal Ligações peptídicas Ligações peptídicas Ácido aspártico Asp Leucina Leu Tirosina Tyr Metionina Met Ácido aspártico Ácido glutâmico Arginina Lisina Histidina Asparagina Glutamina Serina Treonina Tirosina Asp Glu Arg Lys His Asn Gln Ser Thr Tyr D E R K H N Q S T Y Negativa Negativa Positiva Positiva Positiva Polar não carregada Polar não carregada Polar não carregada Polar não carregada Polar não carregada Alanina Glicina Valina Leucina Isoleucina Prolina Fenilalanina Metionina Triptofano Cisteína Ala Gly Val Leu Ile Pro Phe Met Trp Cys A G V L I P F M W C Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar Apolar AMINOÁCIDO CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO CADEIA LATERAL AMINOÁCIDOS POLARES AMINOÁCIDOS APOLARES Figura 32 Os 20 aminoácidos mais encontrados nas proteínas Cada aminoácido possui uma abreviação de três letras e de uma letra Existe um número igual de cadeias laterais polares e apolares no entanto algumas cadeias laterais listadas aqui como polares são grandes o suficiente para apresentarem algumas propriedades apolares p ex Tyr Thr Arg Lys Para estru turas atômicas ver Painel 31 p 112113 113 CADEIAS LATERAIS ÁCIDAS H C C O N H CH2 Ácido aspártico Asp ou D C O O H C C O N H CH2 Ácido glutâmico Glu ou E C O O CH2 CADEIAS LATERAIS POLARES NÃO CARREGADAS H C C O N H CH2 Asparagina Asn ou N C O NH2 H C C O N H CH2 Glutamina Gln ou Q C O CH2 NH2 Apesar de este átomo de N da amida não ser carregado em pH neutro ele é polar H C C O N H CH2 Serina Ser ou S OH H C C O N H CH Treonina Thr ou T OH H C C O N H CH2 Tirosina Tyr ou Y CH3 OH O grupo OOH é polar CADEIAS LATERAIS APOLARES Glicina Gly ou G H C C O N H H H C C O N H Alanina Ala ou A CH3 H C C O N H Valina Val ou V CH3 CH3 CH H C C O N H Leucina Leu ou L CH2 CH CH3 CH3 H C C O N H CH2 CH3 CH CH3 H C C O N H Fenilalanina Phe ou F CH2 H C C O N H Metionina Met ou M CH2 CH2 S CH3 H C C O N Prolina Pro ou P CH2 CH2 CH2 na verdade um iminoácido H C C O N H Cisteína Cys ou C CH2 SH Ligações dissulfeto podem se formar entre as cadeias laterais de duas cisteínas nas proteínas S S CH2 CH2 H C C O N H Triptofano Trp ou W N H CH2 Isoleucina Ile ou I 114 PARTE I Introdução à célula gota Isso permite que elas evitem o contato com a água que as cerca no interior de uma célula Ao contrário as cadeias laterais polares como aquelas pertencentes à arginina à glutamina e à histidina tendem a se posicionar na superfície da molécula onde podem formar ligações de hidrogênio com a água e com outras moléculas polares Figura 35 Aminoácidos polares localizados no interior da proteína geralmente formam ligações de hidrogênio com outros aminoácidos polares ou com a cadeia principal polipeptídica As proteínas se enovelam na conformação de menor energia Como resultado de todas essas interações a maioria das proteínas tem uma estrutura tridimensional particular que é determinada pela sequência dos aminoácidos na sua cadeia A estrutura final enovelada ou conformação de qualquer cadeia polipeptídica geralmente é aquela que minimiza a sua energia livre Biólogos têm estudado o enove lamento em tubos de ensaio utilizando proteínas altamente purificadas Tratamentos com certos solventes que rompem as interações não covalentes que mantêm unida a cadeia enovelada desenovelam ou desnaturam a proteína Esse tratamento converte a proteína em uma cadeia polipeptídica flexível que perdeu a sua forma natural Quando o solvente desnaturante é removido a proteína geralmente reenovela espontaneamente ou renatura na sua conformação original Isso indica que a sequência de aminoácidos contêm toda a informação necessária para a especificação da forma tridimensional de uma proteína um ponto fundamental para a compreensão da biologia celular A maioria das proteínas enovelase em uma única conformação estável Entretan to essa conformação em geral varia levemente quando a proteína interage com outras moléculas dentro da célula Essa variação na forma normalmente é crucial para a função da proteína como veremos adiante Embora a cadeia proteica possa enovelarse na sua conformação correta sem aju da externa nas células vivas proteínas especiais denominadas chaperonas moleculares geralmente auxiliam o processo de enovelamento proteico As chaperonas moleculares ligamse às cadeias polipeptídicas parcialmente enoveladas e conduzem o processo de enovelamento pela via mais favorável energeticamente Nas condições de alta concen tração proteica do citoplasma as chaperonas precisam evitar que as regiões hidrofóbi cas das cadeias polipeptídicas recentemente sintetizadas temporariamente expostas associemse entre si formando agregados proteicos ver p 355 No entanto a forma tridimensional final de uma proteína ainda é especificada pela sua sequência de ami noácidos as chaperonas apenas tornam o processo de enovelamento mais confiável As proteínas apresentam uma ampla variedade de formas e a maioria têm entre 50 e 2000 aminoácidos As proteínas grandes normalmente são constituídas por diver sos domínios proteicos distintos unidades estruturais que se enovelam de forma mais ou menos independente umas das outras como será discutido adiante Mesmo os pe quenos domínios apresentam estruturas complexas e para mais clareza diversas repre sentações distintas são utilizadas por convenção cada uma enfatizando propriedades Figura 35 Como uma proteína se eno vela em uma formação compacta As cadeias laterais de aminoácidos polares tendem a se agrupar na parte externa da proteína onde elas podem interagir com a água as cadeias laterais de aminoácidos apolares se concentram no interior para formar um centro hidrofóbico compacto de átomos que evitam a água Neste es quema a proteína contém apenas cerca de 17 aminoácidos Cadeias laterais polares Cadeias laterais apolares Polipeptídeo não enovelado A região central hidrofóbica contém cadeias laterais apolares Cadeias laterais polares na face externa da molécula podem formar ligações de hidrogênio com a água Conformação enovelada em um ambiente aquoso Cadeia principal polipeptídica CAPÍTULO 3 Proteínas 115 diferentes A Figura 36 ilustra como exemplo quatro representações de um domínio proteico denominado SH2 uma estrutura presente em diversas proteínas distintas nas células eucarióticas e envolvida na sinalização celular ver Figura 1546 A descrição das estruturas de proteínas é facilitada pelo fato de as proteínas serem compostas por combinações de diversos motivos estruturais comuns conforme discu tido a seguir As ahélices e as folhas b são motivos comuns de enovelamento Quando comparamos as estruturas tridimensionais de diversas moléculas de proteínas diferentes tornase claro que embora a conformação final de cada proteína seja única dois padrões de enovelamento são frequentemente encontrados dentro delas Ambos os padrões foram descobertos há mais de 60 anos em estudos com o cabelo e a seda O primeiro padrão estrutural de enovelamento a ser descoberto chamado de ahélice foi encontrado na proteína chamada aqueratina que é abundante na pele e nos seus tecidos derivados como cabelo unha e chifres Menos de um ano após a descoberta da ahélice um segundo padrão de enovelamento chamado de folha b foi descoberto na proteína fibroína o principal componente da seda Esses dois padrões estruturais são particularmente comuns pois resultam da formação de ligações de hidrogênio entre os grupos NH e CO na cadeia principal polipeptídica sem envolver as cadeias laterais dos aminoácidos Assim esses motivos estruturais podem ser compostos por diferen tes sequências de aminoácidos embora algumas cadeias laterais de aminoácidos não sejam compatíveis com essas formas de enovelamento Em cada caso a cadeia proteica assume uma conformação regular e repetitiva A Figura 37 ilustra os detalhes das estru turas dessas duas importantes conformações que no modelo de fitas são representadas como uma fita helicoidal e como um conjunto de setas alinhadas respectivamente A porção central de muitas proteínas contém extensas regiões de folhas b Confor me ilustrado na Figura 38 essas folhas b podem se formar entre segmentos adjacentes de uma cadeia principal polipeptídica em uma mesma orientação cadeias paralelas ou a partir de uma cadeia principal polipeptídica que se dobra para frente e para trás sobre Figura 36 Quatro representações da estrutura de um pequeno domínio proteico Composto por uma cadeia de 100 aminoácidos o domínio SH2 está pre sente em diversas proteínas distintas ver p ex a Figura 363 Aqui a estrutura do domínio SH2 é ilustrada como A um modelo de cadeia principal polipeptídica B um modelo de fitas C cadeia prin cipal polipeptídica que inclui as cadeias laterais dos aminoácidos e D um modelo de preenchimento espacial Animação 31 Estas imagens foram coloridas de modo que é possível identificar o sentido da cadeia da sua região Nterminal roxo até a região Cterminal vermelho Código PDB 1SHA 116 PARTE I Introdução à célula si mesma onde cada seção apresenta direção oposta aos seus segmentos adjacentes ca deias antiparalelas Ambos os tipos de folhas b produzem estruturas bastante rígidas mantidas por ligações de hidrogênio que interligam as ligações peptídicas de cadeias vizinhas ver Figura 37C Uma hélice a é formada quando uma única cadeia polipeptídica enrolase sobre si mesma para formar um cilindro rígido Uma ligação de hidrogênio é formada a cada quatro ligações peptídicas ligando o CO de uma ligação peptídica ao NH de outra ver Figura 37A Isso dá origem a uma hélice regular com voltas completas a cada 36 resíduos de aminoácidos O domínio proteico SH2 ilustrado na Figura 36 contém duas ahélices bem como uma folha b formada por três fitas antiparalelas As regiões de ahélice são abundantes em proteínas localizadas nas membranas ce lulares como proteínas transportadoras e receptores Como discutiremos no Capítulo 10 essas porções de uma proteína transmembrana que atravessam a bicamada lipídica em ge ral o fazem como ahélices compostas principalmente por aminoácidos com cadeias late rais apolares A cadeia principal polipeptídica que é hidrofílica faz ligações de hidrogênio com ela mesma formando uma ahélice protegida do ambiente lipídico e hidrofóbico da membrana pelas suas cadeias laterais apolares protuberantes ver também Figura 1019 Em outras proteínas as ahélices enrolamse umas sobre as outras para formar uma estrutura particularmente estável conhecida como superhélice em inglês coiled coil Essa estrutura se forma quando duas ou em alguns casos três ou quatro ahélices apresentam a maioria de suas cadeias laterais apolares hidrofóbicas de um só lado de modo que podem enrolarse uma sobre a outra com essas cadeias laterais voltadas para o interior Figura 39 Longas superhélices em forma de bastão fornecem a base estru tural para muitas proteínas alongadas Exemplos são a aqueratina que forma as fibras intracelulares que reforçam a camada externa da pele e seus apêndices e as moléculas de miosina responsáveis pela contração muscular R R R R R R R R R Cadeia lateral de aminoácido Oxigênio Carbono Ligação de hidrogênio Hidrogênio Nitrogênio A 054 nm Carbono Nitrogênio B R R R R R R R R R R R R R R R Ligação de hidrogênio Hidrogênio Cadeia lateral de aminoácido Nitrogênio Carbono Carbono Ligação peptídica Oxigênio C D 07 nm Figura 37 Conformação regular da cadeia principal polipeptídica na ahélice e na folha b A ahélice está representada em A e B O NH de todas as ligações peptídicas forma uma ligação de hidrogênio com o CO de outra ligação peptídica localizada a quatro resíduos de aminoácidos de distância na mesma cadeia Observe que todos os grupos NH apontam para cima no diagrama e que todos os grupos CO apontam para baixo em direção ao Cterminal essa disposição confere a orientação da hélice com o Cterminal apresentan do carga parcial negativa e o Nterminal apresentando carga parcial positiva Animação 32 A folha b está representada em C e D Neste exemplo as cadeias peptídicas adjacentes têm orientações em direções opostas antiparalelas Ligações de hidrogênio entre as ligações peptídicas localizadas em diferentes fitas mantêm as cadeias polipeptídicas individuais fitas unidas em uma folha b e as cadeias laterais de aminoácidos em cada fita se projetam alternadamente acima e abaixo do plano da folha b Animação 33 A e C mostram todos os átomos da cadeia principal polipeptídica mas as cadeias laterais dos aminoácidos estão representadas pelo radical R As ilustrações B e D mostram apenas os átomos de carbono e nitrogênio da cadeia principal CAPÍTULO 3 Proteínas 117 Os domínios proteicos são unidades modulares a partir das quais as proteínas maiores são construídas Mesmo uma pequena molécula de proteína é constituída por milhares de átomos in terligados por ligações covalentes e não covalentes precisamente orientadas Biólogos são auxiliados na visualização dessas estruturas extremamente complicadas por vários métodos computacionais tridimensionais de visualização gráfica O website com infor mações extras para estudantes que acompanha este livro contém imagens geradas por computador de proteínas selecionadas as quais podem ser apresentadas na tela e rota das em uma variedade de formatos Os cientistas distinguem quatro níveis de organização na estrutura de uma pro teína A sequência de aminoácidos é conhecida como estrutura primária Os trechos da cadeia polipeptídica que formam ahélices e folhas b constituem a estrutura secundá ria da proteína A conformação tridimensional completa da cadeia polipeptídica algu mas vezes é chamada de estrutura terciária e se uma proteína em particular é formada por um complexo de mais de uma cadeia polipeptídica a estrutura completa é designa da estrutura quaternária Estudos da conformação da função e da evolução das proteínas revelaram a impor tância de um nível de organização estrutural distinto daqueles descritos anteriormente Esse é o domínio proteico uma subestrutura gerada em qualquer parte da cadeia poli peptídica e que pode se enovelar independentemente do resto da proteína em uma es trutura compacta e estável Um domínio proteico geralmente contém entre 40 e 350 ami noácidos sendo a unidade modular da qual muitas proteínas maiores são construídas Os diferentes domínios de uma proteína geralmente estão associados a diferentes funções A Figura 310 mostra um exemplo a proteínacinase Src que atua na via de transmissão de sinais no interior de células de vertebrados Src é pronunciado sarc em inglês Considerase que essa proteína possua três domínios os domínios SH2 e SH3 apresentam atividade reguladora enquanto o domínio Cterminal é responsável pela atividade cinase catalítica Posteriormente neste capítulo retornaremos a essa proteína a fim de explicar como as proteínas podem formar interruptores moleculares que trans mitem informação por todas as partes da célula A B Figura 38 Dois tipos de estruturas de folhas b A Folha b antiparalela ver Figura 37C B Folha b paralela Ambos os tipos de estruturas são comuns em proteínas Figura 39 Superhélice A Uma única ahélice com a sequência de sete unidades repetidas de cadeias laterais dos aminoácidos marcadas como abcdefg de baixo para cima Os aminoácidos a e d nessa sequência ficam próximos um do outro na superfície do cilindro formando uma faixa em verde que se enrola lentamente ao redor da ahélice As proteínas que formam superhélices apresentam aminoácidos apolares nas posições a e d Consequentemente como mostrado em B duas ahélices podem se enrolar uma sobre a outra com as cadeias laterais apolares de uma ahélice interagindo com as cadeias laterais apo lares da outra C A estrutura atômica de uma superhélice determinada por cristalografia de raios X A cadeia principal da ahélice está repre sentada em vermelho e as cadeias laterais apo lares estão representadas em verde enquanto as cadeias laterais mais hidrofílicas representadas em cinza ficam expostas ao ambiente aquoso Animação 34 Código PDB 3NMD a a a a a d d e e g d g c d g d c g NH2 NH2 NH2 HOOC COOH As hélices se enrolam uma sobre a outra para minimizar a exposição dos aminoácidos hidrofóbicos ao ambiente aquoso 05 nm A B C 11 nm Faixa de aminoácidos hidrofóbicos a e d 118 PARTE I Introdução à célula A Figura 311 mostra modelos de fita de três domínios proteicos organizados de maneiras distintas Como ilustrado pelo exemplo a parte central de um domínio pode ser composta por ahélices folhas b e por diversas combinações desses dois elementos fundamentais de enovelamento As menores proteínas contêm apenas um único domínio enquanto as proteínas maiores podem conter várias dezenas de domínios frequentemente conectados uns aos outros por segmentos curtos não estruturados da cadeia polipeptídica que atuam como dobradiças flexíveis entre os domínios Apenas algumas das muitas cadeias polipeptídicas possíveis serão úteis para as células Uma vez que cada um dos 20 aminoácidos é quimicamente distinto podendo em prin cípio ocorrer em qualquer posição de uma cadeia de proteínas existem 20 20 20 20 160000 possíveis cadeias polipeptídicas compostas por quatro aminoácidos ou ainda 20 n possibilidades de haver uma proteína com n aminoácidos de comprimento Para o comprimento típico das proteínas com cerca de 300 aminoácidos uma célula pode teoricamente produzir mais de 10 390 20 300 diferentes cadeias polipeptídicas Esse é um número tão grande que para produzir apenas uma molécula de cada tipo seriam necessários mais átomos do que os existentes no universo Apenas uma pequena fração desse vasto conjunto de cadeias polipeptídicas teó ricas vai adotar uma conformação tridimensional estável segundo algumas estimati vas menos de 1 em 1 bilhão Ainda assim a maioria das proteínas presentes em uma célula adota conformações únicas e estáveis Como isso é possível A resposta se baseia na seleção natural Uma proteína com estrutura e atividade bioquímica imprevisíveis e variáveis tem poucas probabilidades de colaborar com a sobrevivência da célula que a Figura 310 Proteína composta por múltiplos domínios Na proteína Src mostrada um domínio Cterminal com dois lóbulos amarelo e laranja forma a proteínacinase enquanto os domínios SH2 e SH3 desempenham funções regula doras A Modelo de fitas com o substrato ATP em vermelho B Modelo de preenchi mento espacial com o substrato ATP em vermelho Observe que o sítio de ligação de ATP está posicionado na interface dos dois lóbulos que formam a cinase A estru tura do domínio SH2 está representada na Figura 36 Código PDB 2SRC Domínio SH3 ATP Domínio SH2 A B Figura 311 Modelos de fitas de três diferentes domínios proteicos A Cito cromo b562 proteína com apenas um do mínio envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria Essa proteína é composta quase exclusivamente por ahélices B Domínio de ligação de NAD da enzima lactato desidrogenase que é composta por uma mistura de bhélices e de folhas b paralelas C Domínio variável da cadeia leve de uma imunoglobulina anticorpo formado por um sanduíche de duas folhas b antiparalelas Nesses exemplos as bhélices são mostradas em verde en quanto as fitas organizadas como folhas b são indicadas como setas vermelhas Observe que a cadeia polipeptídica ge ralmente se estende ao longo de todo o domínio com dobras acentuadas apenas na superfície da proteína Animação 35 As regiões de alça protraídas em amarelo frequentemente formam sítios de ligação para outras moléculas Adaptada de ilus trações cortesia de Jane Richardson A B C CAPÍTULO 3 Proteínas 119 contém Tais proteínas teriam sido portanto eliminadas por seleção natural no curso do longo processo de tentativa e erro no qual se baseia a evolução biológica Como a evolução atuou na seleção das funções proteicas nos organismos vivos a sequência de aminoácidos da maioria das proteínas atuais corresponde a uma única conformação estável Além disso essa conformação tem suas propriedades químicas re finadas para permitir que a proteína desempenhe uma atividade catalítica ou uma fun ção estrutural particular na célula As proteínas são organizadas com tamanha precisão que alterações de mesmo alguns poucos átomos em um aminoácido podem em alguns casos afetar a estrutura de toda a molécula de tal forma que toda a sua função é perdida Conforme discutido nas próximas seções deste capítulo quando raros eventos de eno velamento incorreto de proteínas ocorrem os resultados podem ser desastrosos para o organismo que as contêm As proteínas podem ser classificadas em diversas famílias Uma vez que uma proteína tenha evoluído para assumir uma conformação estável com propriedades úteis sua estrutura pode ter sido modificada ao longo da evolução para permitirlhe desempenhar novas funções Esse processo foi bastante acelerado por meca nismos genéticos que possibilitam a duplicação ocasional de genes permitindo que uma das cópias evolua de forma independente para desempenhar uma nova função confor me discutido no Capítulo 4 Esse tipo de evento ocorreu com alguma frequência no pas sado e como resultado muitas das proteínas atuais podem ser agrupadas em famílias de proteínas onde cada membro de uma família apresenta uma sequência de aminoácidos e uma conformação tridimensional similar a todos os outros membros da família Considere por exemplo as serinasprotease uma grande família de enzimas que hidrolisam proteínas proteolíticas que incluem as enzimas digestivas quimiotripsina tripsina e elastase além de algumas das proteinases envolvidas na coagulação sanguí nea Quando as porções protease de duas dessas enzimas são comparadas partes de suas sequências de aminoácidos mostramse quase idênticas A semelhança de suas conformações tridimensionais é ainda mais impressionante a maioria das dobras e das voltas de suas cadeias polipeptídicas que têm algumas centenas de aminoácidos de comprimento é praticamente idêntica Figura 312 As várias serinasprotease apre sentam no entanto atividades enzimáticas diferentes cada qual clivando proteínas dife rentes ou ligações peptídicas entre diferentes tipos de aminoácidos Cada uma portanto desempenha uma função distinta no organismo A história que contamos sobre as serinasprotease poderia ser repetida para centenas de outras famílias de proteínas Em geral a estrutura dos diferentes membros de uma famí lia de proteínas é mais conservada do que as suas sequências de aminoácidos Em muitos casos as sequências de aminoácidos divergiram de tal forma que não é possível determinar as relações entre duas proteínas de uma família sem a determinação de suas estruturas tri dimensionais A proteína a2 de levedura e a proteína engrailed da Drosophila por exemplo Figura 312 Comparação das confor mações de duas serinasprotease As conformações da cadeia principal da elastase e da quimiotripsina Apesar de somente os aminoácidos da cadeia polipeptídica mostrados em verde serem os mesmos nas duas proteínas ambas as conformações são muito similares entre si em todos os pontos da cadeia O sítio ativo de cada enzima está delimitado em vermelho é ali que as ligações peptídicas das proteínas que servem como substrato são posicionadas e clivadas por hidrólise As serinasprotease têm o seu nome de rivado do aminoácido serina cuja cadeia lateral faz parte do sítio ativo de cada enzima participando diretamente na reação de clivagem Os pontos pretos no lado direito da molécula de quimiotripsina indicam as duas terminações criadas quan do essa enzima cliva a sua própria cadeia principal NH2 NH2 Elastase Quimiotripsina HOOC HOOC 120 PARTE I Introdução à célula são proteínas de regulação gênica da família de homeodomínio discutido no Capítulo 7 Como essas duas proteínas apresentam apenas 17 aminoácidos conservados entre os 60 aminoácidos que compõem o homeodomínio sua relação só foi estabelecida com certeza após a determinação de suas estruturas tridimensionais Figura 313 Muitos exemplos si milares mostram que duas proteínas com mais de 25 de identidade entre as suas sequên cias de aminoácidos frequentemente compartilham a mesma estrutura geral Os diversos membros de uma grande família de proteínas geralmente têm funções distintas Algumas mudanças de aminoácidos que tornam os membros de uma família distintos foram sem dúvida selecionadas no curso da evolução pois resultam em va riações úteis para a atividade biológica fornecendo aos membros individuais da famí lia as diferentes propriedades funcionais que eles têm hoje Entretanto muitas outras variações nos aminoácidos são efetivamente neutras não tendo nem efeito benéfico ou danoso na estrutura básica e na função da proteína Além disso visto que a mutação é um processo aleatório deve ter havido muitas mudanças deletérias que alteraram a estrutura tridimensional dessas proteínas o suficiente para danificálas Tais proteínas defeituosas teriam sido perdidas sempre que os organismos individuais que as produ ziam ficavam em desvantagem e foram eliminadas pela seleção natural As famílias de proteínas são prontamente reconhecidas quando o genoma de qual quer organismo é sequenciado por exemplo a determinação da sequência de DNA com pleta do genoma humano revelou que ele contém cerca de 21 mil genes que codificam proteínas Observe no entanto que como resultado do splicing alternativo do RNA as células humanas podem produzir muito mais do que 21 mil proteínas diferentes confor me será explicado no Capítulo 6 Pela comparação de sequências é possível determinar o produto de cerca de 40 dos genes que codificam proteínas e relacionálos a estrutu ras conhecidas de proteínas pertencentes a mais de 500 famílias diferentes de proteínas Muitas das proteínas em cada família evoluíram para desempenhar funções levemente distintas como as enzimas elastase e a quimiotripsina ilustradas anteriormente na Figura 312 Conforme explicado no Capítulo 1 ver Figura 121 essas proteínas são em alguns casos chamadas parálogas para distinguilas das proteínas equivalentes observadas em diferentes organismos ortólogas como a elastase humana e de camundongos Conforme descrito no Capítulo 8 como resultado de técnicas poderosas como a cristalografia por difração de raios X e a ressonância magnética nuclear RMN agora co nhecemos as estruturas tridimensionais ou conformações de mais de 100 mil proteínas Por meio da comparação cuidadosa das conformações dessas proteínas biólogos estrutu rais ou seja especialistas na estrutura de moléculas biológicas concluíram que existe um número limitado de conformações adotadas pelos domínios proteicos na natureza talvez B A Hélice 3 COOH Hélice 1 Hélice 2 NH2 G R H T R A F F T S K S E E N O V L R A I R L L E K S R W E F F A N K E N N I E N P R Y Y L L D T T E K R G R L R E Q N Q L L M S K S N E T L S G L L S N R E I A Q Q I I K K N I W W V F S Q N N R K R R R A K K E I K K T K I S COOH H2N Levedura Drosophila C Figura 313 Comparação de uma classe de domínios de ligação ao DNA denominados homeodomínios em um par de proteínas de dois organismos separados por mais de 1 bilhão de anos de evolução A Modelo de fita da estrutura comum de ambas as proteínas B Representação esquemática mostrando as po sições dos carbonos a As estruturas tridimensionais mostradas foram determinadas por cristalografia por difração de raios X para a proteína a2 de levedura verde e para a proteína engrailed de Drosophila vermelho C Uma comparação da sequência de aminoácidos das regiões das proteínas mostradas em A e B Os pontos pretos mar cam os locais com aminoácidos idênticos Os pontos em laranja indicam a posição da inserção de três aminoácidos na proteína a2 Adaptada de C Wolberger et al Cell 67517528 1991 Com permissão de Elsevier CAPÍTULO 3 Proteínas 121 um número de apenas 2 mil se considerarmos todos os organismos Estruturas represen tativas já foram determinadas para a maior parte desses motivos estruturais de proteínas Os bancos de dados atuais das sequências conhecidas de proteínas contêm mais de 20 milhões de entradas e estão aumentando muito rapidamente conforme mais e mais genomas são sequenciados revelando um grande número de novos genes que codificam proteínas Os polipeptídeos codificados apresentam grande variação de tama nho de seis aminoácidos até proteínas gigantescas compostas por 33 mil aminoácidos Comparações de proteínas são importantes pois estruturas parecidas geralmente impli cam funções parecidas Muitos anos de experimentos podem ser evitados pela desco berta de que uma nova proteína tem uma sequência de aminoácidos similar a outra pro teína de função conhecida Essas relações entre as sequências por exemplo indicaram inicialmente que certos genes que fazem células de mamíferos tornaremse cancerosas codificam proteínascinase discutido no Capítulo 20 Alguns domínios proteicos são encontrados em várias proteínas diferentes Como previamente estabelecido a maioria das proteínas é composta por uma série de domínios proteicos nos quais regiões diferentes da cadeia polipeptídica são enoveladas independentemente para formar estruturas compactas Acreditase que tais proteínas com multidomínios originaramse pela junção acidental de sequências de DNA que codificam cada domínio criando um novo gene No processo evolutivo denominado embaralhamento de domínios muitas proteínas grandes evoluíram pela junção de do mínios já existentes em novas combinações Figura 314 Novas superfícies de contato foram criadas na justaposição de domínios e muitos sítios funcionais onde as proteínas se ligam a pequenas moléculas são localizados nessas justaposições de domínios Um subconjunto de domínios proteicos tem sido especialmente lábil durante a evolução apresentam estruturas particularmente versáteis e são referidos algumas vezes como módulos proteicos A estrutura de um deles o domínio SH2 foi ilustrada na Figura 36 Três outros domínios proteicos de alta ocorrência são ilustrados na Figura 315 Cada um dos domínios mostrados tem um núcleo de estrutura estável formado por fitas da folha b a partir das quais se estendem alças menos ordenadas da cadeia po lipeptídica As alças estão estrategicamente localizadas para formar sítios de ligação para outras moléculas como demonstrado mais claramente pelo enovelamento da imuno globulina que forma a base para as moléculas de anticorpos Esses domínios compostos por folhas b parecem ter atingido seu sucesso evolutivo por fornecerem uma estrutura conveniente para o estabelecimento de novos sítios de ligação para outras moléculas requerendo apenas pequenas alterações nas alças expostas ver Figura 342 Um segundo aspecto desses domínios proteicos que explica sua utilidade é a faci lidade com que podem ser integrados em outras proteínas Dois dos três módulos pro teicos ilustrados na Figura 315 têm suas regiões Nterminal e Cterminal em lados opos tos do domínio Quando o DNA que codifica um desses domínios sofre duplicação em tandem o que não é incomum na evolução dos genomas discutido no Capítulo 4 os UROCINASE QUIMIOTRIPSINA EGF FATOR IX PLASMINOGÊNIO COOH H2N COOH H2N COOH H2N COOH H2N COOH H2N Figura 314 Embaralhamento de domínios Um embaralhamento extensivo de blocos de sequências de proteínas domínios proteicos ocorreu durante a evolução das proteínas As porções da proteína representadas pela mesma forma e cor neste diagrama são evo lutivamente relacionadas As serinasprotease como a quimiotripsina são formadas por dois domínios marrom Nas três outras proteases mostradas que são altamente reguladas e mais especializadas esses dois domínios da protea se são conectados a um ou mais domínios similares aos domínios encontrados no fator de crescimento epidérmico EGF epidermal growth factor verde na proteína ligadora de cálcio amarelo ou no domínio kringle azul A quimiotripsina é ilustrada na Figura 312 Figura 315 Estruturas tridimensionais de três domínios geralmente presentes em proteínas Nestes diagramas no modelo de fitas as fitas das folhas b estão representadas como setas e as regiões N e Cterminais são in dicadas por esferas vermelhas Existem diversos outros desses módulos na natureza Adapta da de M Baron DG Norman e ID Campbell Trends Biochem Sci 161317 1991 com per missão de Elsevier e DJ Leahy et al Science 258987991 1992 com permissão de AAAS Módulo tipo 3 da fibronectina Módulo kringle 1 nm Módulo da imunoglobulina 122 PARTE I Introdução à célula domínios duplicados com esse arranjo em linha podem ser prontamente conectados em série para formar estruturas estendidas com eles próprios ou com outros domínios em linha Figura 316 Estruturas estendidas rígidas compostas por uma série de do mínios são especialmente comuns em moléculas da matriz extracelular e em porções extracelulares de proteínas receptoras da superfície celular Outros domínios utilizados com frequência incluindo o domínio kringle ilustrado na Figura 315 e o domínio SH2 são domínios do tipo encaixe com suas porções N e Cterminais próximas uma da outra Após rearranjos genômicos tais domínios geralmente são acomodados como uma inserção em uma região de alças de uma segunda proteína Uma comparação da frequência relativa da utilização dos domínios em diferen tes eucariotos revelou que para muitos domínios comuns como as proteínascinase essa frequência é similar em organismos tão diversos como leveduras plantas vermes moscas e humanos Mas existem algumas exceções notáveis como o domínio de reco nhecimento de antígenos do complexo de histocompatibilidade principal MHC major histocompatibility complex ver Figura 2436 presente em 57 cópias em humanos mas ausente nos outros quatro organismos citados Domínios como o MHC apresentam fun ções especializadas que não são compartilhadas com os outros eucariotos acreditase que tenham passado por uma forte seleção durante eventos recentes da evolução para dar origem às múltiplas cópias observadas De modo similar os domínios SH2 estão pre sentes em número aumentado nos eucariotos superiores assumese que esses domínios sejam especialmente importantes para o estabelecimento da multicelularidade Pares específicos de domínios são encontrados juntos em muitas proteínas Podemos construir uma grande tabela mostrando o uso de domínios em cada organis mo cuja sequência genômica é conhecida Por exemplo o genoma humano contém as sequências de DNA de aproximadamente 1000 domínios de imunoglobulinas 500 do mínios de proteínascinase 250 homeodomínios de ligação ao DNA 300 domínios SH3 e 120 domínios SH2 Além disso descobrimos que mais de dois terços de todas as proteínas consistem em dois ou mais domínios e que os mesmos pares de domínios ocorrem repe tidamente nos mesmos arranjos relativos em uma proteína Apesar de metade de todas as famílias de domínios serem comuns entre arquebactérias bactérias e eucariotos ape nas 5 das combinações equivalentes de dois domínios são compartilhadas Esse padrão sugere que a maior parte das proteínas contendo combinações úteis de dois domínios surgiu pelo embaralhamento de domínios em etapas relativamente tardias da evolução O genoma humano codifica um conjunto complexo de proteínas revelando que muita informação ainda é desconhecida O resultado do sequenciamento do genoma humano foi surpreendente ao revelar que nossos cromossomos contêm apenas cerca de 21 mil genes que codificam proteínas Considerandose apenas o número de genes parecemos não ser mais complexos que a pequena erva de mostarda Arabidopsis e apenas cerca de 13 vez mais complexos que um verme nematódeo As sequências dos genomas também revelam que os vertebrados herdaram aproximadamente todos os domínios proteicos dos invertebrados com so mente 7 dos domínios humanos identificados sendo específicos de vertebrados Entretanto cada uma das nossas proteínas é relativamente mais complicada Figura 317 Um processo de embaralhamento de domínios durante a evolução dos vertebrados deu origem a muitas combinações novas de domínios proteicos resultando em quase duas vezes mais combinações de domínios em proteínas humanas que em um verme ou em uma mosca Dessa forma por exemplo o domínio da serinaprotease similar à tripsina está liga do a pelo menos 18 outros tipos de domínios proteicos em proteínas humanas enquanto é Figura 316 Estrutura alongada formada por uma série de domínios protei cos Quatro domínios de fibronectina tipo 3 ver Figura 315 da molécula de fibro nectina da matriz extracelular estão ilustrados em A modelo de fitas e em B modelo de preenchimento espacial Adaptada de DJ Leahy I Aukhil e HP Erickson Cell 84155164 1996 Com permissão de Elsevier B A Ep1 Ep2 Br Znf PHD PHD Ep1 Ep2 PHD PHD Ep1 Ep2 PHD PHD BMB Levedura Verme Homem Br Figura 317 Estrutura de domínio de um grupo de proteínas relacionadas evolutiva mente consideradas como tendo funções similares Em geral existe a tendência de as proteínas em organismos mais complexos como em humanos conterem domínios adicio nais como no caso da proteína de ligação ao DNA aqui comparada 124 PARTE I Introdução à célula Iremos encontrar diversas estruturas helicoidais ao longo deste livro Por que a hélice é uma estrutura tão comum na biologia Como vimos as estruturas biológicas geralmente são formadas pela ligação de subunidades similares em cadeias longas e re petitivas Se todas as subunidades são idênticas as subunidades adjacentes na cadeia geralmente podem manterse unidas de uma única maneira ajustando suas posições relativas para minimizar a energia livre do contato entre elas Como resultado cada su bunidade está posicionada exatamente da mesma maneira em relação à próxima de for ma que a subunidade 3 ajustase à subunidade 2 da mesma maneira que a subunidade 2 ajustase à subunidade 1 e assim sucessivamente Como é muito raro que as subuni dades se unam em uma linha reta esse arranjo geralmente resulta em uma hélice uma estrutura regular que se assemelha a uma escada em espiral como ilustrado na Figura 322 Dependendo da torção da escada dizse que a orientação da hélice é dextrógira para a direita ou levógira para a esquerda ver Figura 322E A direção não é afetada ao virar a hélice de cabeça para baixo mas é revertida se a hélice for refletida no espelho A observação de que as hélices são normalmente encontradas em estruturas biológi cas permanece verdadeira sejam as subunidades pequenas moléculas unidas por ligações covalentes p ex os aminoácidos em uma ahélice sejam grandes moléculas de proteínas unidas por forças não covalentes p ex moléculas de actina nos filamentos de actina Isso não é surpreendente Uma hélice é uma estrutura comum sendo gerada simplesmente co locandose subunidades similares próximas umas às outras cada uma com exatamente a mesma relação com a antecedente repetidamente ou seja com uma rotação fixa seguida por uma translação ao longo do eixo da hélice como uma escada em espiral Diversas moléculas proteicas apresentam formas alongadas e fibrosas As enzimas tendem a ser proteínas globulares mesmo que muitas sejam grandes e com plicadas com múltiplas subunidades a maioria tem uma forma geral arredondada Vimos na Figura 321 que proteínas globulares podem se associar formando longos filamentos Mas existem funções que requerem que as unidades individuais de uma molécula proteica se estendam por longas distâncias Essas proteínas em geral têm uma estrutura tridimen sional alongada relativamente simples e são geralmente chamadas de proteínas fibrosas Uma grande família de proteínas fibrosas intracelulares consiste em aqueratina apresentada anteriormente quando discutimos as ahélices e proteínas relacionadas Os filamentos de queratina são extremamente estáveis e são os principais componen tes em estruturas duradouras como os cabelos os chifres e as unhas Uma molécula de aqueratina é um dímero de duas subunidades idênticas com as longas ahélices de cada subunidade formando uma superhélice ver Figura 39 As regiões de superhé lice são cobertas em cada extremidade por domínios globulares que contêm os sítios de ligação Isso permite a essa classe de proteínas juntarse em uma forma de corda de filamentos intermediários um componente importante do citoesqueleto que cria o ar cabouço estrutural interno da célula ver Figura 1667 As proteínas fibrosas são especialmente abundantes no meio extracelular onde são o principal componente da matriz extracelular gelatinosa que ajuda a manter unidos conjuntos de células que formam os tecidos As células secretam as proteínas da ma triz extracelular nas suas imediações onde estas moléculas frequentemente se associam formando camadas ou longas fibras O colágeno é a mais abundante dessas proteínas nos tecidos animais Uma molécula de colágeno consiste em três longas cadeias poli peptídicas cada uma contendo um aminoácido glicina apolar a cada três posições Essa estrutura regular permite que as três cadeias se enovelem uma sobre a outra para gerar uma longa hélice tripla regular Figura 323A Muitas moléculas de colágeno então ligamse umas às outras lado a lado e de ponta a ponta para criar longos feixes sobre Subunidades livres A Subunidades associadas Dímero Sitio de ligação Sítios de ligação Sítios de ligação Anel Hélice B C Figura 320 Montagens de proteínas A Uma proteína com apenas um sítio de ligação pode formar um dímero com outra proteína idêntica B Proteínas idênticas com dois sítios de ligação diferentes frequentemente formam longos filamentos helicoidais C Se os dois sítios de ligação estiverem dispostos apropriadamente um em relação ao outro as subunidades proteicas podem formar um anel fechado em vez de uma hélice Para um exemplo de A ver Figura 318 para um exemplo de B ver Figura 321 para exemplos de C ver Figuras 514 e 1431 A 37 nm Extremidade mais Extremidade menos Molécula de actina B 50 nm Figura 321 Filamentos de actina A Micro grafia eletrônica de transmissão de filamentos de actina marcados negativamente B Arranjo helicoidal de moléculas de actina em um fila mento de actina A cortesia de Roger Craig CAPÍTULO 3 Proteínas 125 postos dessa maneira formam uma fibra de colágeno extremamente forte que confere a resistência elástica aos tecidos conectivos conforme descrito no Capítulo 19 As proteínas contêm uma quantidade surpreendentemente alta de segmentos de cadeia polipeptídica intrinsecamente desordenada Sabese há bastante tempo que em contraste com o colágeno outra proteína abundante na matriz extracelular a elastina é formada por polipeptídeos altamente desordenados Essa desordem é essencial às funções da elastina Suas cadeias polipeptídicas relativa mente frouxas e não estruturadas apresentam ligações covalentes cruzadas produzindo uma rede elástica como borracha que pode ser espichada de forma reversível de uma conformação à outra conforme ilustrado na Figura 323B As fibras elásticas formadas pela elastina permitem que a pele e outros tecidos como as artérias e os pulmões ex pandamse e retraiamse sem se romper As regiões intrinsecamente desordenadas em proteínas são frequentes na natureza e possuem importantes funções no interior das células Conforme já vimos proteínas Figura 322 Algumas propriedades de uma hélice AD Uma hélice se forma quando várias subunidades ligamse umas às outras de uma maneira regular A parte inferior da imagem mostra a vista superior de cada uma dessas hélices parecendo ser compostas por duas A três B ou seis C e D subunidades por volta Observe que a hélice em D apresenta um espa çamento maior do que a hélice em C mas o mesmo número de subunidades por volta E Conforme mencionado no texto uma hélice pode ser orientada tanto para a direita quanto para a esquerda Como uma referência vale lembrar que os para fusos comuns são inseridos ou aparafusa dos quando girados no sentido horário e são orientados para a direita Observe que a hélice mantém a mesma direção mesmo quando é invertida de cabeça para baixo Código PDB 2DHB E A B C D Hélice levógira Hélice dextrógira Hélice tripla de colágeno 50 nm 15 nm Pequena seção da fibrila de colágeno Molécula de colágeno 300 nm 15 nm Fibra elástica TENSIONADA RELAXADA Ligação cruzada Moléculas individuais de elastina A B Figura 323 Colágeno e elastina A O colágeno é uma hélice tripla formada por três cadeias estendidas que se enrolam umas nas outras parte inferior Muitas das moléculas em forma de bastão do colágeno fazem ligações cruzadas no espaço extracelular para formar fibrilas inextensíveis acima com a força tênsil do aço O padrão de listras na fibrila de colágeno é consequência do arranjo regular repetido das moléculas de colágeno dentro da fibrila B As cadeias polipeptídicas da elastina apresentam ligações cruzadas entre si no espaço extracelular de modo a formar fibras de elastina semelhantes à borracha Cada molécula de elastina desenovelase para uma conformação mais distendida quando a fibra é tracionada e retorna a sua forma enovelada espontaneamente tão logo a força de tração seja relaxada As ligações cruzadas formadas no espaço extracelular dão origem a ligações covalentes entre cadeias laterais de lisina mas a estrutura química é diferente nas moléculas de colágeno e de elastina 126 PARTE I Introdução à célula frequentemente apresentam regiões de alças na sua cadeia polipeptídica se projetando a partir da região central de um domínio proteico para a ligação a outras moléculas Algu mas dessas regiões de alça se mantêm desordenadas até a sua ligação a uma molécula alvo adotando uma conformação enovelada apenas quando ligadas a essa molécula Também são conhecidas diversas moléculas com caudas intrinsecamente desordenadas presentes em uma das extremidades de um domínio estrutural ver p ex as histonas na Figura 424 A extensão dessas estruturas desordenadas só se tornou clara com o se quenciamento de genomas O sequenciamento de genomas permitiu o uso de ferramen tas de bioinformática para a análise de sequências de aminoácidos codificadas pelos ge nes procurando por regiões desordenadas baseada no seu baixo caráter hidrofóbico e relativa alta carga líquida Por meio da combinação desses resultados com outros dados acreditase que um quarto do total das proteínas eucarióticas adotem estruturas que são principalmente desordenadas com alterações rápidas entre diferentes conformações Diversas dessas regiões desordenadas contêm sequências repetidas de aminoácidos Qual é a função dessas regiões desordenadas Algumas funções conhecidas são ilustradas na Figura 324 Uma função predomi nante é a formação de sítios de ligação de alta especificidade para outras moléculas que po dem ser alterados rapidamente pela fosforilação ou defosforilação da proteína ou qualquer outra modificação covalente desencadeada por eventos de sinalização celular Figura 324A e B Veremos por exemplo que a enzima RNApolimerase de eucariotos que sintetiza mo léculas de mRNA contém uma longa cauda Cterminal desestruturada que é modificada de modo covalente conforme a síntese de RNA progride atraindo outras proteínas específicas para o complexo da transcrição em momentos determinados ver Figura 622 Essa cauda não estruturada interage com um tipo distinto de domínio de baixa especificidade quando a RNApolimerase é atraída a sítios específicos do DNA quando inicia a sua síntese Conforme ilustrado na Figura 324C uma região não estruturada também pode atuar como um elo que mantém dois domínios proteicos próximos e facilita a sua interação Por exemplo é essa função de elo que permite o deslocamento dos substratos entre os sítios ativos de grandes complexos multienzimáticos ver Figura 354 Uma função de conec tor semelhante permite que grandes proteínas de suporte com múltiplos sítios de ligação a proteínas concentrem conjuntos de proteínas interagindo entre si aumentando as taxas de reação e também confinando estas reações a locais específicos da célula ver Figura 378 Assim como a elastina outras proteínas apresentam funções que requerem sua permanência em um estado consideravelmente não estruturado Assim um grande nú mero de cadeias não ordenadas de proteínas e em proximidade podem originar micror regiões com consistência de gel no interior de células com difusão restrita Por exemplo as numerosas nucleoporinas que revestem a superfície interna do complexo do poro nuclear formam uma rede de enovelamento aleatório Figura 324 que é essencial para o transporte nuclear seletivo ver Figura 128 Ligações cruzadas covalentes estabilizam proteínas extracelulares Muitas moléculas de proteínas estão presas na face externa da membrana plasmática da célula ou são secretadas para formar parte da matriz extracelular Todas essas proteínas são diretamente expostas às condições extracelulares Para ajudar a manter suas estruturas as cadeias polipeptídicas dessas proteínas frequentemente são estabilizadas por ligações co Figura 324 Algumas funções importantes de sequências de proteínas intrinsecamente desordenadas A Regiões não ordenadas da cadeia polipeptídica com frequência formam sítios de ligação para outras proteínas Embora esses eventos de ligação sejam de alta afinidade frequentemente podem ser de baixa afinidade devido ao baixo custo energético do enovela mento do ligante normalmente não enovelado sendo portanto prontamente reversíveis B Regiões não estruturadas podem ser facil mente modificadas covalentemente alterando suas preferências de ligação e estão frequente mente envolvidas com processos de sinalização celular Nesta representação esquemática diversos sítios de fosforilação da proteína estão indicados C Regiões não estruturadas também podem atuar como prisões que mantêm próximos os domínios proteicos que devem interagir D Uma densa rede de proteínas não estruturadas pode compor uma barreira de difusão como as nucleoporinas presentes no poro nuclear P P P P P P LIGAÇÃO APRISIONAMENTO SINALIZAÇÃO BARREIRA DE DIFUSÃO A C B D CAPÍTULO 3 Proteínas 127 valentes Tais ligações podem ligar dois aminoácidos na mesma cadeia ou conectar diferen tes cadeias polipeptídicas em uma proteína multimérica Embora existam diversos tipos de ligação cruzada o mais comum são as ligações covalentes enxofreenxofre Essas ligações dissulfeto também chamadas de ligações SS ou pontes dissulfeto formamse enquanto as células preparam as proteínas recémsintetizadas para exportação Como descrito no Capí tulo 12 sua formação é catalisada no retículo endoplasmático por uma enzima que liga dois grupos SH de cadeias laterais de cisteínas adjacentes na proteína enovelada Figura 325 As ligações dissulfeto não mudam a conformação de uma proteína mas agem como gram pos atômicos que reforçam sua conformação mais favorável Por exemplo a lisozima uma enzima presente nas lágrimas que dissolve paredes celulares bacterianas mantém a sua atividade antibacteriana por um longo tempo por ser estabilizada por esse tipo de ligações As ligações dissulfeto geralmente não se formam no citoplasma onde uma alta concentração de agentes redutores converte ligações SS de volta a grupos SH das cis teínas Aparentemente as proteínas não requerem esse tipo de reforço em um ambiente relativamente ameno como o interior da célula Moléculas proteicas frequentemente servem como subunidades na formação de grandes estruturas Os mesmos princípios que permitem a associação de moléculas proteicas idênticas em anéis ou longos filamentos também atuam na formação de grandes estruturas compos tas por conjuntos de macromoléculas distintas como os complexos enzimáticos ribos somos vírus e membranas Esses grandes objetos não são formados por moléculas gi gantes únicas covalentemente ligadas Ao contrário são formados por associação não covalente de muitas moléculas produzidas separadamente que servem como subuni dades da estrutura final O uso de pequenas subunidades para formar grandes estruturas oferece várias vantagens 1 Uma grande estrutura construída com uma ou algumas subunidades menores re petidas requer somente uma pequena quantidade de informação genética 2 Tanto a associação quanto a dissociação podem ser facilmente controladas como processos reversíveis pois as subunidades se associam por meio de múltiplas liga ções de energia relativamente baixa 3 Os erros na síntese da proteína podem ser evitados mais facilmente já que os me canismos de correção podem operar durante o curso da montagem para excluir subunidades malformadas Algumas subunidades proteicas são montadas em camadas planas nas quais as subunidades são arranjadas em padrões hexagonais As proteínas de membrana espe cializadas em alguns casos são arranjadas desse modo em bicamadas lipídicas Com uma leve mudança na geometria das subunidades individuais uma folha hexagonal pode ser convertida em um tubo Figura 326 ou com mudanças adicionais em uma Figura 325 Ligações dissulfeto Ligações covalentes dissulfeto se formam entre cadeias laterais adjacentes de cis teínas Estas ligações cruzadas podem unir duas partes de uma mesma cadeia polipeptídica ou duas cadeias polipeptí dicas individuais Uma vez que a energia requerida para romper uma ligação co valente é muito maior do que a energia requerida para romper todo um conjunto de ligações não covalentes ver Tabela 21 p 45 uma ligação dissulfeto pode ter um efeito estabilizador maior em uma proteína Animação 37 C C C C C C C C CH2 CH2 S S CH2 CH2 S S CH2 SH CH2 SH CH2 SH CH2 SH OXIDAÇÃO REDUÇÃO Cisteína Ponte dissulfeto intracadeia Ponte dissulfeto intercadeia 128 PARTE I Introdução à célula esfera oca Os tubos e as esferas proteicas que se ligam a moléculas específicas de RNA e de DNA no seu interior formam o revestimento dos vírus A formação de estruturas fechadas como anéis tubos ou esferas provê uma estabili dade adicional devido ao aumento do número de ligações entre as subunidades proteicas Além disso como a estrutura é criada por interações cooperativas mutuamente dependen tes entre as subunidades uma alteração relativamente pequena que afete cada subunidade individualmente pode levar à montagem ou desmontagem da estrutura Esses princípios são ilustrados no revestimento proteico ou capsídeo de muitos vírus simples os quais to mam a forma de uma esfera oca com base em um icosaedro Figura 327 Os capsídeos frequentemente são formados por centenas de subunidades proteicas idênticas que envol vem e protegem o ácido nucleico viral Figura 328 A proteína nesse capsídeo deve ter uma estrutura particularmente adaptável deve não somente fazer vários tipos diferentes de contatos para criar a esfera como também mudar seu arranjo para liberar o ácido nu cleico para iniciar a replicação viral depois que o vírus tenha entrado em uma célula Diversas estruturas celulares são capazes de associação espontânea A informação para formar muitos dos complexos conjuntos de macromoléculas das cé lulas deve estar contida nas próprias subunidades pois as subunidades purificadas po dem se associar espontaneamente autoorganizar autoassociar na estrutura final sob condições apropriadas O primeiro grande agregado macromolecular que mostrou ser capaz de se associar espontaneamente a partir das suas partes constituintes foi o vírus do mosaico do tabaco TMV tobacco mosaic virus Esse vírus é um longo bastonete no qual um cilindro de proteína é arranjado em torno do centro helicoidal de RNA Figura 329 Se o RNA dissociado e as subunidades proteicas são misturados em solução eles se reas sociam para formar partículas de vírus completamente ativas O processo de associação é bastante complexo e inclui a formação de anéis duplos de proteínas que servem como intermediários que se adicionam ao invólucro viral em crescimento Outro agregado macromolecular complexo que pode se associar novamente a par tir de seus componentes é o ribossomo bacteriano Essa estrutura é composta por cerca de 55 moléculas de proteínas diferentes e três moléculas diferentes de RNA ribossômi co rRNA Incubando uma mistura dos componentes individuais sob condições apro priadas em um tubo de ensaio eles reconstroem espontaneamente a estrutura original Mais importante tais reconstituições ribossômicas são capazes de realizar a síntese de proteínas Como esperado a reassociação de ribossomos segue uma trajetória especí fica após certas proteínas terem se ligado ao RNA esse complexo é reconhecido por outras proteínas e assim por diante até a estrutura estar completa Ainda não está claro como alguns processos mais elaborados de associação espon tânea são regulados Muitas estruturas na célula por exemplo parecem ter um compri mento precisamente definido que muitas vezes é maior do que os seus componentes macromoleculares A determinação desse comprimento é em muitos casos um mis tério No caso mais simples uma longa proteína central ou outra macromolécula for nece o suporte que determina o comprimento da estrutura final Esse é o mecanismo que determina o comprimento da partícula de TMV em que a cadeia de RNA fornece o suporte De modo semelhante acreditase que uma proteína central que interage com os filamentos de actina determine a extensão desses filamentos nos músculos 20 nm Figura 327 Capsídeo proteico de um vírus A estrutura do capsídeo do vírus SV40 de ma cacos foi determinada por cristalografia de difração de raios X e assim como a estru tura do capsídeo de diversos outros vírus é conhecida em detalhes atômicos Cortesia de Robert Grant Stephan Crainic e James M Hogle Figura 326 Subunidades proteicas indi viduais formam complexos proteicos que apresentam múltiplos contatos proteína proteína Subunidades globulares de pro teínas com organização hexagonal ilustradas aqui podem formar camadas planas ou tubos Em geral essas grandes estruturas não são consideradas moléculas individuais Assim como o filamento de actina descrito anteriormente essas estruturas são considera das complexos formados por diversas molécu las diferentes Subunidade Camada de subunidades com organização hexagonal Tubo CAPÍTULO 3 Proteínas 129 Fatores de associação frequentemente auxiliam na formação de estruturas biológicas complexas Nem todas as estruturas celulares que se mantêm unidas por ligações não covalentes são capazes de se autoorganizar Um cílio ou uma miofibrila de uma célula muscular por exemplo não podem se formar espontaneamente a partir de uma solução de seus componentes macromoleculares Nesses casos parte da informação necessária para a Dímero RNA viral Três dímeros Dímeros livres Domínio de projeção Domínio de revestimento Braço conector Domínio de ligação ao RNA Partícula incompleta Dímeros livres Monômero proteico do capsídeo ilustrado no modelo de fitas Partícula viral intacta 90 dímeros 10 nm Figura 328 Estrutura de um vírus esférico Nos vírus diversas cópias de uma única subu nidade proteica se associam para dar origem a um revestimento esférico um capsídeo O capsídeo circunda o genoma viral composto por RNA ou DNA ver também Figura 327 Por razões geométricas não mais do que 60 subunidades idênticas podem se juntar de forma precisamente simétrica Se pequenas irregularidades são permitidas no entanto mais subunidades podem ser usadas para produzir um grande capsídeo que mantém a simetria icosaédrica O vírus bushy stunt do tomate TBSV tomato bushy stunt virus mos trado aqui por exemplo é um vírus esférico com cerca de 33 nm de diâmetro formado por 180 cópias idênticas de uma proteína de capsí deo com 386 aminoácidos mais o genoma de RNA de 4500 nucleotídeos Para formar esse grande capsídeo a proteína deve se encaixar em três agregados ligeiramente distintos Esse arranjo requer três conformações distintas como uma representada em cores diferentes na imagem A via de formação do capsídeo é mostrada a estrutura tridimensional precisa foi determinada por difração de raios X Cortesia de Steve Harrison A B 50 nm Figura 329 Estrutura do vírus do mosaico do tabaco TMV A Uma micrografia eletrônica de uma partícula viral composta por uma única molécula longa de RNA envolvida por um invólucro proteico cilíndrico formado por subunidades proteicas idênticas B Modelo mostrando parte da estrutura do TMV Uma molécula de RNA de fita simples de 6395 nucleotídeos é empacotada em um invólucro helicoidal de 2130 cópias de uma proteína de invólucro com 158 aminoácidos As partículas infecciosas de vírus podem se autoorganizar em um tubo de ensaio a partir do RNA e das moléculas proteicas purificadas A cortesia de Robley Williams B cortesia de Richard J Feldmann 130 PARTE I Introdução à célula associação do complexo é fornecida por enzimas especiais e outras proteínas que de sempenham a função de moldes e atuam como fatores de associação que guiam a cons trução mas não fazem parte da estrutura final organizada Até mesmo estruturas relativamente simples podem não apresentar alguns dos in gredientes necessários para sua própria associação Na formação de certos vírus bacte rianos por exemplo a cabeça que é composta de muitas cópias de uma única subunida de proteica é montada em um suporte temporário composto por uma segunda proteína que é produzida pelo vírus Pelo fato de a segunda proteína estar ausente da partícula final do vírus a estrutura da cabeça uma vez dissociada não pode associarse esponta neamente Outros exemplos são conhecidos em que a clivagem proteolítica é uma etapa essencial e irreversível no processo de associação normal É o caso de algumas pequenas associações de proteínas incluindo a proteína estrutural do colágeno e do hormônio in sulina Figura 330 A partir desses exemplos relativamente simples parece óbvio que a formação de uma estrutura tão complexa quanto um cílio envolverá o ordenamento temporal e espacial mediado por diversos outros componentes Fibrilas amiloides podem ser formadas por diversas proteínas Uma classe especial de estruturas proteicas utilizadas em algumas funções celulares nor mais também podem desencadear doenças humanas se não forem controladas Essas proteínas são agregados estáveis de folhas b capazes de se propagar chamadas fibrilas amiloides Essas fibrilas são constituídas por uma série de cadeias polipeptídicas idên ticas dispostas umas sobre as outras dando origem a uma camada contínua de folhas b com as fitas b apresentando orientação perpendicular ao eixo da fibrila compondo um filamento cruzado b Figura 331 Em geral centenas de monômeros irão se agregar for mando uma estrutura fibrosa não ramificada com diversos micrometros de comprimen to e 5 a 15 nm de largura Uma fração surpreendentemente alta de proteínas apresenta potencial para formar essas estruturas pois os curtos segmentos da cadeia polipeptídica que compõem a estrutura central da fibrila podem apresentar uma variedade de sequên cias de aminoácidos e podem seguir diferentes vias Figura 332 No entanto poucas proteínas irão de fato formar essas estruturas no interior das células Em organismos humanos normais os mecanismos de controle de qualidade de pro teínas passam por um declínio na sua atividade conforme o organismo envelhece permitin do ocasionalmente que proteínas normais formem agregados patológicos Os agregados de proteínas podem ser liberados de células mortas e se acumularem como amiloides na ma triz extracelular Em casos extremos o acúmulo dessas fibrilas amiloides no interior das cé lulas pode levar à morte celular e causar danos nos tecidos Como o cérebro é composto por um conjunto altamente organizado de células nervosas que não se regeneram ele se torna especialmente vulnerável a esse tipo de dano cumulativo Portanto embora as fibrilas ami loides possam se formar em diferentes tecidos e sejam conhecidas como a causa de diversas patologias em diferentes locais do corpo as patologias amiloides mais graves são as doenças neurodegenerativas Por exemplo acreditase que a formação anormal de fibrilas amiloides altamente estáveis desempenhe papel central no mal de Parkinson e de Alzheimer As doenças priônicas são um tipo especial entre estas patologias Essas patologias se tornaram notórias pois diferentes do mal de Parkinson e de Alzheimer as doenças cau sadas por príons podem se disseminar de um organismo a outro caso o segundo orga nismo se alimente de tecidos contendo agregados de proteína Um conjunto de doenças relacionadas scrapie em ovelhas doença CreutzfeldtJakob DCJ em humanos kuru em humanos e encefalopatia espongiforme bovina EEB no gado são todas causadas por agregados de uma forma mal enovelada de uma proteína específica denominada PrP pro teína priônica As PrPs estão normalmente localizadas na superfície externa da membra na plasmática principalmente nos neurônios e apresentam a propriedade indesejável de Figura 330 Clivagem proteolítica na associação da insulina O hormônio polipeptídico insulina não pode se formar novamente de maneira espontânea e eficaz se suas ligações dissulfeto forem destruídas Ele é sintetizado como uma grande proteína proinsulina que é clivada por uma proteína proteolítica após a cadeia proteica ter se enovelado em uma confor mação específica A remoção de parte da cadeia polipeptídica da proinsulina retira algumas das informações necessárias para que a proteína se enovele espontaneamente em sua confor mação normal Uma vez que a insulina tenha sido desnaturada e suas duas cadeias polipeptí dicas sejam separadas a sua habilidade de associação é perdida S S S S S S S S S S S S SH SH SH SH SH SH Proinsulina SH SH SH SH SH SH Organização estrutural específica estabilizada por ligações dissulfeto Remoção do peptídeo conector originando uma molécula completa de insulina composta por duas cadeias A redução separa as duas cadeias irreversivelmente Insulina CAPÍTULO 3 Proteínas 131 formar fibrilas amiloides que são infecciosas por sua capacidade de converter moléculas corretamente enoveladas de PrP na sua forma patológica Figura 333 Essa propriedade gera um ciclo de retroalimentação positiva que propaga a forma anormal de PrP chamada PrP e permite que a conformação patológica se espalhe rapidamente de uma célula a outra no cérebro provocando a morte Pode ser perigoso comer os tecidos de animais que contêm PrP como foi testemunhado recentemente pela disseminação da BSE popular mente chamada de doença da vaca louca do gado para seres humanos Felizmente na ausência de PrP é extraordinariamente difícil converter PrP em sua forma anormal Uma forma relacionada de hereditariedade unicamente proteica também foi ob servada em células de levedura A possibilidade de estudar infecções proteicas em leve dura permitiu a compreensão de outra característica impressionante dos príons Essas moléculas proteicas podem formar tipos distintos de fibrilas amiloides a partir de uma mesma cadeia polipeptídica Além disso cada tipo de agregado pode ser infeccioso for çando as moléculas proteicas normais a adotarem o mesmo tipo de estrutura anormal Assim várias linhagens diferentes de partículas infecciosas podem surgir a partir de uma mesma cadeia polipeptídica As estruturas amiloides podem desempenhar funções úteis nas células As fibrilas amiloides foram estudadas inicialmente por causarem doenças No entanto atualmente é sabido que o mesmo tipo de estrutura é empregado pelas células para fins úteis As células eucarióticas por exemplo armazenam diferentes tipos de peptídeos e hor Figura 331 Estrutura detalhada da porção central de uma fibrila amiloide A figura mostra a região central de uma fibrila amiloide cruzada b composta por um peptídeo de sete aminoácidos da proteína Sup35 um príon de leveduras estudado extensivamente O peptídeo é composto pela sequência glicinaasparaginaasparaginaglutaminaglutaminaasparaginatirosina GNNQQNY e sua estrutura foi determinada por cristalografia de difração de raios X Embora as regiões cruzadas beta de outras fibrilas amiloides sejam similares compostas por duas longas folhas b mantidas uni das por meio de zíperes estruturais detalhes estruturais distintos são observados dependendo da sequência de peptídeos que compõem essas estruturas A Metade dessa estrutura está representa da aqui Uma estrutura de folha b tradicional ver p 116 é mantida unida por um conjunto de liga ções de hidrogênio entre duas cadeias laterais e ligações de hidrogênio entre dois átomos da cadeia principal conforme ilustrado átomos de oxigênio em vermelho e átomos de nitrogênio em azul Observe que neste exemplo peptídeos adjacentes estão precisamente alinhados Embora apenas cinco camadas estejam representadas cada uma indicada por uma seta a estrutura real se estende por diversas dezenas de milhares de camadas em um mesmo plano B Estrutura cruzada beta com pleta Uma segunda folha b idêntica é pareada à primeira formando um motivo estrutural de duas folhas que percorre todo o comprimento da fibra C Visão superior da estrutura completa mostra da em B As cadeias laterais intercaladas formam uma junção de alta afinidade e sem moléculas de água chamadas de zíperes estruturais Cortesia de David Eisenberg e Michael Sawaya UCLA ba seado em R Nelson et al Nature 435773778 2005 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Ligação de H entre cadeias laterais A B C Ligações de H da cadeia principal Figura 332 A estrutura de uma fibrila amiloide A Diagrama esquemático da estrutura de uma fibrila amiloide formada pela agregação de uma proteína Apenas a estrutura central cruzada beta de uma fibrila amiloide lembra a estrutura mostra da na Figura 331 B Corte longitudinal da estrutura proposta de uma fibrila ami loide que pode ser formada em um tubo de ensaio pela enzima ribonuclease A mostrando como o centro da fibrila com posto por um curto segmento da cadeia peptídica está relacionado com o restan te da estrutura C Micrografia eletrônica de fibrilas amiloides A de L Esposito C Pedone e L Vitagliano Proc Natl Acad Sci USA 1031153311538 2006 B de S Sambashivan et al Nature 437266269 2005 C cortesia de David Eisenberg C A B 100 nm 2 nm Estrutura central cruzada β Estrutura central cruzada β Domínios periféricos relativamente indefinidos 132 PARTE I Introdução à célula mônios proteicos que serão secretados por grânulos de secreção especializados que es tocam altas concentrações de seu conteúdo em regiões densas e de estrutura regular ver Figura 1365 Sabese que essas regiões organizadas são compostas por fibrilas amiloi des que neste caso apresentam uma estrutura que induz a sua dissolução e liberação do seu conteúdo solúvel após a secreção pelo mecanismo de exocitose no exterior da célula Figura 334A Diversas bactérias utilizam estruturas amiloides de uma forma diferente secretando proteínas que formam longas fibrilas amiloides que se projetam na face externa da célula e se ligam às células adjacentes formando biofilmes Figura 334B Como esses biofilmes ajudam as bactérias a sobreviver em ambientes adversos incluindo organismos humanos tratados com antibióticos novos fármacos que rompem essas redes fibrosas compostas por proteínas amiloides de bactérias são bastante promissores para o tratamento de infecções em humanos Diversas proteínas apresentam regiões de baixa complexidade capazes de formar estruturas amiloides reversíveis Até recentemente acreditavase que essas estruturas amiloides com funções úteis esti vessem confinadas no interior de vesículas especializadas ou fossem expressas no espa ço extracelular como indicado na Figura 334 No entanto experimentos recentes reve laram que um grande conjunto de domínios de baixa complexidade pode formar fibrilas amiloides com papéis funcionais no núcleo e no citoplasma das células Esses domínios são normalmente não estruturados e são compostos por segmentos de sequências de até centenas de aminoácidos embora apresentem apenas um pequeno subconjunto dos 20 aminoácidos diferentes Diferentemente das fibrilas amiloides relacionadas a doenças mostradas na Figura 333 estas estruturas recémdescobertas são mantidas por ligações covalentes fracas e se dissociam rapidamente em resposta a sinais de onde deriva seu nome estruturas amiloides reversíveis Diversas proteínas com esses domínios também contêm um diferente conjunto de domínios que se ligam de modo específico a outas proteínas ou a moléculas de RNA Assim a sua agregação controlada em uma célula pode dar origem ao hidrogel que agru pa essas e outras moléculas em estruturas densas chamadas corpos intracelulares ou Figura 333 Um tipo especial de agregados proteicos pode causar doenças priônicas A Representação esquemática de um tipo de alteração conformacional de PrP proteína priônica que origina os componentes de uma fibrila amiloide B A natureza autoinfecciosa do agregado de proteínas é uma característica essencial das doenças priônicas A proteína PrP é bastante incomum pois sua versão enovelada de forma inadequada denominada PrP induz por meio do contato uma alteração conformacional na proteína PrP normal como ilustrado Heterodímero Homodímero Agregados de proteína na forma de uma fibrila amiloide Alteração conformacional muito rara A A proteína priônica pode adotar uma conformação anormal mal enovelada Proteínas mal enoveladas podem induzir a formação de agregados de proteínas Proteína PrP normal Forma priônica anormal da proteína PrP PrP Proteínas de enovelamento anormal convertem formas normais de PrP na conformação anormal A conversão de mais proteínas normais PrP na forma de enovelamento errôneo dá origem a uma fibrila amiloide estável B PrP PrP Figura 334 Duas funções normais das fibrilas amiloides A Nas células eucarióticas produtos proteicos podem ser armazenados em alta densidade em vesículas de secreção até que um sinal induza a liberação do produto ar mazenado por meio de exocitose Por exemplo proteínas e hormônios peptídicos do sistema endócrino como o glucagon e a calcitonina são armazenados de modo eficiente na forma de fibrilas amiloides curtas que se dissociam quando liberadas no espaço extracelular B Bactérias produzem fibrilas amiloides na sua superfície por meio da secreção de proteínas precursoras essas fibrilas dão origem a biofil mes que unem células bacterianas e ajudam a proteger um grande número de células bacte rianas individuais Subunidade molde Subunidade da fibrila Fusão Brotamento MEMBRANA PLASMÁTICA A fibrila amiloide secretada libera hormônios peptídicos solúveis Grânulo de secreção Hormônio peptídico processado Cisterna de Golgi Fibrila amiloide A B Camada de peptidoglicanos Membrana bacteriana Fibrila amiloide na superfície de uma bactéria CAPÍTULO 3 Proteínas 133 grânulos Moléculas específicas de mRNA podem ser concentradas nesses grânulos onde são armazenadas até que sejam disponibilizadas por meio da dissociação contro lada das estruturas amiloides centrais que mantém essas moléculas unidas Considere por exemplo a proteína FUS uma proteína nuclear essencial que atua na transcrição processamento e transporte de moléculas específicas de mRNA Mais de 80 dos domínios Cterminais dessas proteínas de 200 aminoácidos são compostos por apenas quatro aminoácidos glicina serina glutamina e tirosina Esse domínio de baixa comple xidade se liga a diversos outros domínios que se ligam a moléculas de RNA Em concentra ções altas o suficiente em tubos de ensaio essas proteínas formam um hidrogel que irá se associar com ele mesmo ou com os domínios de baixa complexidade de outras proteínas Conforme ilustrado no experimento descrito na Figura 335 embora domínios de baixa complexidade distintos possam se ligar uns aos outros as interações homotípicas pare cem ter maior afinidade e os domínios FUS de baixa complexidade se ligam com maior afinidade entre si Experimentos adicionais revelaram que tanto as ligações homotípicas quanto as heterotípicas são mediadas pela estrutura central de folha b das fibrilas amiloi des e que estas estruturas se ligam a outros tipos de sequências repetitivas conforme ilus trado na Figura 336 Várias dessas interações parecem ser controladas pela fosforilação da cadeia lateral do aminoácido serina em uma ou ambas as moléculas que interagem No entanto ainda há muito a aprender acerca destas estruturas recémdescobertas e os vários papéis que desempenham na biologia celular das células eucarióticas Proteína solúvel com marcador verde fluorescente Gel de proteínas FUS préformado PROTEÍNA SOLÚVEL SUBSTITUÍDA POR TAMPÃO A dissociação da proteína verde do gel é mensurada por microscopia de fluorescência ao longo do tempo A B FUS hnRNPA2 hnRNPA1 t2 ausência de dissociação t2 101 min t2 36 min 05 1 2 3 5 10 15 20 30 45 60 tempo após a lavagem Figura 335 Medida da associação entre estruturas amiloides reversíveis A Arranjo experimental Os domínios formadores de fibras das proteínas que contêm domínios de baixa complexidade são produzidos em grandes quantidades pela clonagem das sequências de DNA que as codificam em plasmídeos bacterianos de E coli permitindo a superprodução destes domínios ver p 483 Após a purificação destes domínios utilizando cromato grafia de afinidade uma pequena gota de solução concentrada de um dos domínios neste exemplo o domínio FUS de baixa complexidade é depositada em uma lamínula de microscopia e passa pelo processo de gelificação O gel é então coberto por uma solução diluída do domínio de baixa complexidade da mesma proteína ou de uma proteína diferente ligado a um marcador fluorescente tornando o gel também fluorescente Após a substituição da solução proteica diluída por tampão é possível medir a força relativa de ligação entre os vários domínios entre si pelo de créscimo de fluorescência conforme indicado B Resultados O domínio de baixa complexidade da proteína FUS se liga com maior afinidade a outras moléculas de FUS quando comparada à ligação das proteínas hnRPA1 e hnRPA2 Um experimento independente revelou que essas três proteínas diferentes de ligação ao RNA se associam por meio da formação de fibrilas amiloides mistas Adaptado de M Kato et al Cell 149 753767 2012 Figura 336 Um dos tipos de comple xo formado por estruturas amiloides reversíveis A estrutura representada se baseia em interações observadas entre a RNApolimerase e domínios de baixa com plexidade de uma proteína que regula a transcrição do DNA Adaptado de I Kwon et al Cell 15510491060 2013 Sítios de ligação para outras proteínas com sequências repetidas ou para moléculas de RNA Estrutura central cruzada beta fraca Proteína com domínios de baixa complexidade Proteína ligada 134 PARTE I Introdução à célula Resumo A sequência de aminoácidos de uma proteína define a sua conformação tridimensional Interações não covalentes entre partes distintas da cadeia polipeptídica estabilizam a es trutura enovelada Os aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas tendem a se agru par no interior da molécula e as ligações de hidrogênio locais entre ligações peptídicas adjacentes originam ahélices e folhas b Regiões das sequências de aminoácidos conhecidas como domínios são as unidades modulares que compõem muitas das proteínas Esses domínios geralmente contêm entre 40 e 350 aminoácidos frequentemente enovelados em uma estrutura globular As proteínas pequenas em geral contêm somente um domínio enquanto grandes proteínas são formadas por vários domínios ligados uns aos outros por segmentos de cadeia polipeptídica de extensão variada alguns relativamente desordenados Conforme as proteínas evoluíram os domínios foram modificados e combinados com outros domínios para formar diversas novas proteínas As proteínas são unidas em grandes estruturas pelas mesmas forças não covalentes que determinam seu enovelamento As proteínas com sítios de ligação para as suas próprias superfícies podem associarse em dímeros em anéis fechados em cápsulas esféricas ou em polímeros helicoidais A fibrila amiloide é uma longa estrutura não ramificada formada pela agregação repetida de folhas b Embora algumas misturas de proteínas e ácidos nuclei cos possam se associar de forma espontânea em estruturas complexas em um tubo de ensaio nem todas as estruturas de uma célula são capazes de se associarem espontaneamente após a dissociação de suas subunidades pois diversos processos de organização biológica envol vem fatores de associação que não estão presentes na estrutura final do complexo FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS Temos observado que cada tipo de proteína consiste em uma sequência de aminoácidos precisa que permite o seu enovelamento em uma forma ou conformação tridimensional particular Mas as proteínas não são rígidas Elas podem ter partes móveis cujos meca nismos de ação são acoplados a eventos químicos Essa combinação de propriedades químicas e movimento é o que confere às proteínas a extraordinária capacidade de sus tentar os processos dinâmicos das células vivas Nesta seção explicaremos como as proteínas se ligam a outras moléculas selecio nadas e como suas atividades dependem dessa ligação Mostraremos que a habilidade de uma molécula de se ligar a outras capacita as proteínas a agirem como catalisadoras receptoras de sinais ativadoras ou inibidoras proteínas motoras ou minúsculas bombas Os exemplos discutidos neste capítulo não esgotam as vastas propriedades funcionais das proteínas Você encontrará as funções especializadas de muitas proteínas em outros trechos deste livro com base em princípios similares Todas as proteínas ligamse a outras moléculas As propriedades biológicas de uma molécula proteica dependem de suas interações físi cas com outras moléculas Assim os anticorpos ligamse aos vírus ou às bactérias como um sinal para sua destruição a enzima hexocinase ligase à glicose e à adenosina trifos fato ATP para catalisar uma reação entre eles as moléculas de actina ligamse umas às outras para formar um filamento de actina e assim por diante Na verdade todas as proteínas grudamse ou ligamse a outras moléculas Em alguns casos essa ligação é muito forte em outros ela é fraca e muito breve No entanto a ligação sempre apresenta alta especificidade o que significa que cada molécula de proteína pode ligar apenas uma ou algumas poucas moléculas entre os muitos milhares de diferentes tipos de moléculas que ela encontra A substância que se liga a uma proteína seja ela um íon uma molécu la pequena ou uma macromolécula é chamada de ligante daquela proteína da palavra em latim ligare significando ligar A habilidade de uma proteína de se ligar seletivamente e com alta afinidade a um ligante depende da formação de um conjunto de ligações fracas não covalentes liga ções de hidrogênio atrações eletrostáticas e de van der Waals além das interações hi drofóbicas favoráveis ver Painel 23 p 9495 Devido ao fato de cada ligação individual ser fraca uma interação efetiva ocorre apenas quando muitas ligações fracas são forma CAPÍTULO 3 Proteínas 135 das simultaneamente Uma ligação somente é possível se a superfície de contorno da molécula do ligante se ajusta muito precisamente à proteína encaixandose nela como uma mão em uma luva Figura 337 A região de uma proteína que se associa com um ligante conhecida como sítio de ligação do ligante normalmente consiste em uma cavidade na superfície da proteína for mada por um arranjo particular de aminoácidos Esses aminoácidos podem pertencer a regiões diferentes da cadeia polipeptídica que são aproximadas quando a proteína se enovela Figura 338 Regiões independentes na superfície da proteína geralmente for mam sítios de ligação para diferentes ligantes permitindo que a atividade da proteína seja regulada como veremos adiante Outras partes da proteína podem servir como um me canismo para posicionar a proteína em uma localização particular na célula um exem plo é o domínio SH2 discutido anteriormente que frequentemente desloca a proteína que o contém para locais intracelulares particulares em resposta a sinais específicos Apesar de os átomos localizados no interior de uma proteína não terem contato di reto com o ligante eles formam a estrutura que fornece à superfície seu contorno e suas propriedades químicas mecânicas Até mesmo pequenas mudanças nos aminoácidos no interior de uma molécula de proteína podem mudar sua forma tridimensional o bas tante para destruir o seu sítio de ligação na superfície A conformação da superfície de uma proteína determina a sua química As impressionantes capacidades químicas das proteínas frequentemente requerem que grupos químicos presentes na sua superfície interajam para potencializar a reatividade química de uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos Essas interações pertencem a duas categorias principais Figura 337 Ligação seletiva de uma proteína a uma outra molécula Muitas ligações fracas são necessárias para possibilitar que uma proteína se ligue fortemente a uma segunda molécula ou ligante Um ligante deve portanto encai xarse precisamente ao sítio de ligação da proteína como uma mão em uma luva de modo que um grande número de ligações não covalentes se forme entre a proteína e o ligante A Representação esquemática B modelo de preenchimento espacial Código PDB 1G6N Ligante Sítio de ligação Proteína A B Ligações não covalentes Figura 338 Sítio de ligação de uma proteína A O enovelamento de uma cadeia polipeptídica em geral cria uma fenda ou uma cavidade na superfície da proteína Essa cavidade contém um con junto de cadeias laterais de aminoácidos dispostas de tal maneira que possam fazer ligações não covalentes somente com li gantes específicos B Uma visão detalhada de um sítio de ligação mostrando as liga ções de hidrogênio e as interações iônicas formadas entre a proteína e o seu ligante Neste exemplo o ligante é uma molécula de AMP cíclico N N N N O O O P O 5ʹ 3ʹ O H O N H H H H O CH2 C O CH C H H O CH2 C O CH2 C H H N H O CH2 C N H H H C C O CH23 NH C NH2 NH2 Ligação de hidrogênio AMP cíclico H3C ENOVELAMENTO Sítio de ligação Atração eletrostática Cadeias laterais de aminoácidos Proteína não enovelada Proteína enovelada A B Serina Treonina Ácido glutâmico Arginina Serina 136 PARTE I Introdução à célula Primeiro a interação de partes vizinhas da cadeia polipeptídica pode restringir o acesso de moléculas de água a um sítio de ligação de um ligante da proteína Como as ligações de hidrogênio formadas rapidamente com as moléculas de água podem compe tir com os ligantes nos sítios de ligação da superfície das proteínas um ligante irá formar ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas de maior afinidade com a proteína se as moléculas de água forem excluídas Pode ser difícil imaginar um mecanismo que ex clua uma molécula tão pequena como a água da superfície de uma proteína sem afetar o acesso do ligante a ela No entanto pela forte tendência que as moléculas de água têm de formar ligações de hidrogênio entre si elas estão presentes formando uma grande rede de ligações de hidrogênio ver Painel 22 p 9293 De fato uma proteína pode manter seu sítio de interação com um ligante sem moléculas de água por meio do aumento da reatividade deste sítio pois se torna energeticamente desfavorável para as moléculas de água se dissociar da sua rede ligações um requisito que deve ser cumprido para que ela interaja com a superfície de uma proteína Segundo o agrupamento de cadeias laterais de aminoácidos polares vizinhos pode alterar suas reatividades Se um número de cadeias laterais carregadas negativa mente é forçado contra suas repulsões mútuas pelo modo como as proteínas se enove lam por exemplo a afinidade do sítio por um íon carregado positivamente é bastante aumentada Além disso quando as cadeias laterais dos aminoácidos interagem umas com as outras por meio de ligações de hidrogênio normalmente os grupos laterais não reativos como o CH2OH na serina mostrado na Figura 339 podem se tornar reativos permitindo que sejam utilizados para formar ou romper ligações covalentes específicas A superfície de cada molécula de proteína tem desse modo uma reatividade quí mica única que depende não somente de quais cadeias laterais de aminoácidos estão expostas mas também de suas orientações exatas em relação umas às outras Por essa razão mesmo duas conformações um pouco diferentes da mesma molécula de proteína podem diferir muito em sua química Comparações entre as sequências de proteínas pertencentes a uma mesma família destacam sítios cruciais de ligação a ligantes Como descrito anteriormente as sequências genômicas nos permitiram agrupar muitos dos domínios proteicos em famílias de proteínas que mostram evidências claras da sua evolução a partir de um ancestral comum As estruturas tridimensionais de membros de uma mesma família de domínios são notavelmente similares Por exemplo mesmo quando a identidade da sequência de aminoácido diminui para 25 os átomos da ca deia principal em um domínio podem manter um enovelamento proteico comum a 02 nanômetro 2 Å de diferença entre eles Podemos utilizar um método chamado de traçado evolutivo para identificar aqueles sítios em um domínio de proteína que são mais cruciais para o funcionamento do domínio Os sítios que medeiam a ligação a outras moléculas têm maior probabi lidade de serem conservados sem alterações ao longo da evolução dos organismos Assim nesse método os aminoácidos que são inalterados ou quase inalterados em todos os membros conhecidos da família de proteínas são mapeados em um modelo da estrutura tridimensional de um membro da família Quando isso é feito as posições menos variáveis formam normalmente um ou mais agrupamentos na superfície da Figura 339 Aminoácido reativo incomum no sítio ativo de uma enzi ma Este exemplo é a tríade catalítica AspHisSer encontrada na quimiotripsina na elastase e em outras serinasprotease ver Figura 312 A cadeia lateral do ácido aspártico Asp induz a histidina His a remover o próton de uma serina Ser específica Isso leva a serina a formar uma ligação covalente com o substrato da enzi ma hidrolisando uma ligação peptídica As diversas superfícies da cadeia polipeptí dica foram omitidas aqui H O CH2 H C N N C C H H O C O His Asp Ser H O CH2 H C N N C C H H O C O Serina reativa Rearranjos das ligações de hidrogênio CAPÍTULO 3 Proteínas 137 proteína como ilustrado na Figura 340A para o domínio SH2 descrito anteriormen te ver Figura 36 Esses arranjos geralmente correspondem aos sítios de ligação dos ligantes O domínio SH2 atua como um elo de ligação entre duas proteínas mantendoas unidas Ele liga a proteína que o contém a uma segunda proteína contendo uma cadeia lateral de tirosina fosforilada em um contexto específico de sequência de aminoácidos como mostrado na Figura 340B Os aminoácidos localizados no sítio de ligação para o polipeptídeo fosforilado sofreram as mudanças mais lentas durante o longo processo evolutivo que produziu a grande família SH2 de domínios de reconhecimento de pep tídeos Mutações são um processo aleatório a sobrevivência não é Portanto a seleção natural mutações aleatórias seguidas pela sobrevivência não aleatória induz a conser vação de sequências pela eliminação dos organismos cujos domínios SH2 foram modifi cados de modo a inativar o sítio SH2 de ligação destruindo sua função O sequenciamento de genomas revelou um grande número de proteínas cujas fun ções são desconhecidas Uma vez que a estrutura tridimensional de um membro de uma família de proteínas tenha sido determinada a propriedade do traçado evolutivo permi te que os biólogos identifiquem os sítios de ligação dos membros da família provendo informações importantes para decifrar a função dessas proteínas As proteínas ligamse umas às outras por diversos tipos de interfaces As proteínas podem se ligar a outras proteínas de múltiplas maneiras Em muitos casos uma parte da superfície de uma proteína entra em contato com uma alça estendida da cadeia polipeptídica de uma segunda proteína Figura 341A Tais interações superfí ciecadeia por exemplo permitem ao domínio SH2 reconhecer uma alça de polipeptí deo fosforilado em uma segunda proteína como descrito anteriormente ou capacitar uma proteínacinase a reconhecer as proteínas que ela irá fosforilar ver a seguir Um segundo tipo de interface proteínaproteína é formado quando duas ahélices uma de cada proteína pareiamse para formar uma superhélice Figura 341B Esse tipo de interface proteica é encontrado em muitas famílias de proteínas reguladoras de genes como discutido no Capítulo 7 Figura 340 Método do traçado evolu tivo aplicado ao domínio SH2 A Visualização frontal e do verso do modelo de preenchimento espacial do domínio SH2 com os aminoácidos evo lutivamente conservados da superfície da proteína coloridos em amarelo e os aminoácidos mais internos coloridos em vermelho B A estrutura de um domínio SH2 específico com seu substrato polipep tídico ligado Aqui aqueles aminoácidos localizados a 04 nm do ligante associado à proteína estão coloridos em azul Os dois principais aminoácidos do ligante estão em amarelo e os demais estão em roxo Observe o alto grau de correspondência entre A e B Adaptada de O Lichtarge HR Bourne e FE Cohen J Mol Biol 257342358 1996 Com permissão de Elsevier Códigos PDB 1SPR 1SPS A B FRENTE VERSO FRENTE Polipeptídeo ligante Fosfotirosina Figura 341 Três maneiras pelas quais duas proteínas podem se ligar uma à outra Somente as regiões que interagem nas proteínas são mostradas A Uma superfície rígida de uma proteína pode se ligar a uma alça estendida da cadeia polipeptídica de uma segunda proteína B Duas ahélices podem se ligar para for mar uma superhélice C Duas superfícies rígidas complementares frequentemente ligam duas proteínas As interações de ligação também podem ocorrer pelo pareamento de duas fitas b ver p ex Figura 318 Superfície Alça da cadeia A SUPERFÍCIECADEIA B C SUPERFÍCIESUPERFÍCIE Superfície 1 Superfície 2 Hélice 2 Hélice 1 HÉLICEHÉLICE 138 PARTE I Introdução à célula A forma mais comum de as proteínas interagirem contudo dáse pela combina ção precisa de uma superfície rígida com outra Figura 341C Tais interações podem ser muito fortes uma vez que um grande número de ligações fracas pode se formar entre duas superfícies afins Pela mesma razão as interações superfíciesuperfície podem ser extremamente específicas capacitando uma proteína a selecionar apenas uma combi nação entre milhares de proteínas encontradas em uma célula Os sítios de ligação dos anticorpos são especialmente versáteis Todas as proteínas precisam se associar a ligantes específicos para efetuar as suas várias funções A família dos anticorpos é notável pela capacidade de formar ligações fortes altamente seletivas discutido em detalhes no Capítulo 24 Os anticorpos ou imunoglobulinas são proteínas produzidas pelo sistema imuno lógico em resposta a moléculas estranhas como aquelas presentes na superfície de mi crorganismos invasores Cada anticorpo ligase a uma moléculaalvo particular de manei ra extremamente forte inativando a moléculaalvo diretamente ou marcandoa para ser destruída Um anticorpo reconhece seu alvo chamado de antígeno com notável espe cificidade Como possivelmente existam bilhões de diferentes antígenos que os humanos podem encontrar temos que ser capazes de produzir bilhões de anticorpos diferentes Os anticorpos são moléculas em forma de Y com dois sítios de ligação idênticos complementares a uma pequena porção da superfície da molécula de antígeno Um exa me detalhado do sítio de ligação de antígeno nos anticorpos revela que eles são formados por diversas alças de cadeias polipeptídicas que sobressaem das extremidades de um par de domínios proteicos justapostos Figura 342 Diferentes anticorpos geram uma enor me diversidade de sítios de ligação de antígenos pela alteração apenas do comprimento e da sequência de aminoácidos nessas alças sem alterar a estrutura proteica básica As alças desse tipo são ideais para segurar outras moléculas Elas permitem que um grande número de grupos químicos envolva um ligante para que a proteína possa se ligar a esse ligante por meio de muitas ligações fracas Por essa razão as alças frequente mente formam sítios de ligação nas proteínas A constante de equilíbrio mede a força de ligação As moléculas na célula frequentemente se encontram devido aos seus contínuos movi mentos térmicos aleatórios Duas moléculas que colidem com superfícies fracamente complementares formam ligações não covalentes uma com a outra e as duas dissociam Figura 342 Uma molécula de anti corpo Uma molécula típica de anticorpo tem a forma de Y e dois sítios de liga ção idênticos para seu antígeno um em cada braço do Y Como explicado no Capítulo 24 a proteína é composta por quatro cadeias polipeptídicas duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves menores e também idênticas mantidas unidas por ligações dissulfeto Cada cadeia é composta por vários domínios diferen tes de imunoglobulinas aqui mostrados em azul ou cinza O sítio de ligação do antígeno é formado pela aproximação do domínio variável de uma cadeia pesada VH e do domínio variável de uma cadeia leve VL Esses são os domínios que mais diferem nas suas sequências e nas suas estruturas entre os diferentes anticorpos Na extremidade de cada um dos dois bra ços de uma molécula de anticorpo estes dois domínios formam alças de ligação aos antígenos ver Animação 245 Alças hipervariáveis Domínio variável da cadeia leve VL A B Domínio constante da cadeia leve CL Ligação dissulfeto COOH NH2 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S VL CL VL CL VH VH CH1 CH1 CH2 CH3 CH2 CH3 Cadeia pesada 140 PARTE I Introdução à célula do a concentração de ligante em litrosmol alcançar um valor igual a 1K A constante de equilíbrio é maior quanto maior for a força de ligação sendo uma medida direta da diferen ça de energia livre entre os estados ligado e livre Figura 344B Mesmo uma mudança de poucas ligações não covalentes pode ter um efeito profundo na interação de ligação como mostrado pelo exemplo na Figura 345 Observe que a constante de equilíbrio como defi nida aqui também é conhecida como constante de associação ou de afinidade Ka Usamos o caso de um anticorpo ligandose ao seu ligante para ilustrar o efeito da força de ligação no estado de equilíbrio mas os mesmos princípios se aplicam a qual quer proteína e seu ligante Muitas proteínas são enzimas que como discutiremos agora primeiramente ligamse aos seus ligantes e depois catalisam a quebra ou a formação de ligações covalentes nessas moléculas As enzimas são catalisadores poderosos e altamente específicos Muitas proteínas podem realizar suas funções simplesmente pela ligação a outra molécu la Uma molécula de actina por exemplo somente precisa se associar a outras moléculas de actina para formar um filamento Há outras proteínas contudo nas quais a ligação do ligante é somente a primeira etapa necessária nas suas funções Esse é o caso de uma grande e importante classe de proteínas chamadas de enzimas Como descrito no Capí tulo 2 as enzimas são moléculas extraordinárias que realizam as transformações quími cas que formam ou quebram ligações covalentes nas células Elas ligam um ou mais li gantes chamados de substratos e os convertem em um ou mais produtos quimicamente modificados fazendo isso muitas vezes com uma rapidez incrível As enzimas aceleram reações frequentemente por fatores de milhões de vezes ou mais sem que elas próprias sejam modificadas isto é elas agem como catalisadores que permitem às células fazer e desfazer ligações covalentes de forma controlada É a catálise por enzimas de conjuntos organizados de reações químicas que cria e mantém uma célula tornando a vida possível Podemos agrupar as enzimas em classes funcionais que realizam reações quí micas similares Tabela 31 Cada tipo de enzima dessas classes é altamente espe TABELA 31 Alguns tipos comuns de enzimas Enzima Reação catalisada Hidrolases Termo geral para enzimas que catalisam reações de clivagem hidrolítica nucleases e proteases são nomes mais específicos para subclasses dessas enzimas Nucleases Clivam de ácidos nucleicos pela hidrólise das ligações entre os nucleotídeos Endonucleases e exonucleases clivam ácidos nucleicos no interior e a partir das extremidades de cadeias polinucleotídicas respectivamente Proteases Clivam de proteínas pela hidrólise das ligações entre os aminoácidos Sintases Sintetizam moléculas em reações anabólicas pela condensação de duas moléculas menores Ligases Unem ligam duas moléculas em um processo dependente de energia A DNAligase p ex une duas moléculas de DNA por suas extremidades por ligações fosfodiéster Isomerases Catalisam o rearranjo das ligações de uma única molécula Polimerases Catalisam reações de polimerização como a síntese de DNA e RNA Cinases Catalisam a adição de grupos fosfato a moléculas Proteínascinase são um importante grupo de cinases que ligam grupos fosfato a proteínas Fosfatases Catalisam a remoção hidrolítica de grupos fosfatos de uma molécula Oxidorredutases Nome genérico para enzimas que catalisam reações em que uma molécula é oxidada enquanto outra é reduzida Enzimas desse tipo são frequentemente chamadas pelo nome mais específico de oxidases redutases ou desidrogenases ATPases Hidrolisam ATP Muitas proteínas com ampla gama de funções apresentam atividade de ATPase como parte de suas funções p ex proteínas motoras como miosina e proteínas de transporte da membrana como a bomba de sódio e potássio GTPases Hidrolisam GTP A grande família de proteínas de ligação ao GTP são GTPases com papéis essenciais na regulação de processos celulares Os nomes das enzimas tipicamente terminam com ase com exceção de algumas enzimas como pepsina tripsina trombina e lisozima que foram descober tas e nomeadas antes da convenção ser amplamente aceita no final do século XIX O nome comum de uma enzima em geral indica o seu substrato ou produto e a natureza da reação catalisada Por exemplo citrato sintase catalisa a síntese de citrato por uma reação entre acetilCoA e oxalacetato Considere que 1000 moléculas A e 1000 moléculas B estejam presentes em uma célula eucariótica A concentração de ambas é de aproximadamente109 M Se a constante de equilíbrio K para A B AB for igual a 1010 é possível calcular que no equilíbrio existam Se a constante de equilíbrio for um pouco mais fraca igual a 108 o que representa uma perda de 119 kJmol na energia de ligação do exemplo anterior ou 23 vezes menos ligações de hidrogênio existirão 270 moléculas A 270 moléculas B 730 moléculas AB 915 moléculas A 915 moléculas B 85 moléculas AB Figura 345 Pequenas alterações no número de ligações fracas podem ter efeitos drásticos na interação de ligação Este exemplo ilustra o efeito drástico da presença ou ausência de pou cas ligações não covalentes fracas em um contexto biológico CAPÍTULO 3 Proteínas 141 cífico catalisando apenas um único tipo de reação Assim a hexocinase adiciona um grupo fosfato à dglicose mas ignorará seu isômero óptico lglicose a enzima da coagulação sanguínea a trombina quebra a cadeia de apenas um tipo de proteína do sangue entre um resíduo particular de arginina e uma glicina adjacente e em ne nhum outro lugar Como discutido em detalhes no Capítulo 2 as enzimas trabalham em conjunto sendo que o produto de uma enzima é o substrato para a enzima seguin te O resultado disso é uma elaborada rede de vias metabólicas que suprem a célula com energia e geram as muitas moléculas grandes ou pequenas de que uma célula precisa ver Figura 263 A ligação do substrato é a primeira etapa na catálise enzimática Para uma proteína que catalisa uma reação química uma enzima a ligação de cada molécula de substrato à proteína é uma etapa essencial No caso mais simples se cha mamos a enzima de E o substrato de S e o produto de P o caminho básico da reação é E S ES EP E P Há um limite para a quantidade de substrato que uma única mo lécula de enzima pode processar em um dado tempo Embora o aumento da concentra ção de substrato aumente a velocidade com a qual o produto é formado essa velocidade raramente atinge seu valor máximo Figura 346 Nesse ponto a molécula da enzima está saturada com substrato e a velocidade da reação máxima Vmáx depende somente da rapidez da enzima em processar a molécula de substrato Essa razão máxima dividida pela concentração de enzima é chamada de número de turnover renovação O número de turnover geralmente é cerca de mil moléculas de substrato por segundo por molécula de enzima embora números de turnover entre 1 e 10 mil sejam conhecidos O outro parâmetro cinético frequentemente utilizado para caracterizar uma enzi ma é seu Km a concentração de substrato que permite que a reação chegue à metade de sua velocidade máxima 05 Vmáx ver Figura 346 Um valor baixo de Km significa que a enzima atinge sua velocidade catalítica máxima com uma baixa concentração de subs trato e geralmente indica que a enzima se liga fortemente ao substrato enquanto um va lor alto de Km corresponde a uma ligação fraca Os métodos utilizados para caracterizar enzimas são explicados no Painel 32 p 142143 As enzimas aceleram reações pela estabilização seletiva dos estados de transição As enzimas atingem velocidades de reação extremamente altas velocidades maiores que qualquer catalisador sintético Existem diversas razões para essa eficiência Em pri meiro lugar quando duas moléculas precisam reagir as enzimas aumentam significa tivamente a concentração local das moléculas de substrato no sítio catalítico manten do as duas moléculas na orientação correta para que a reação ocorra Mais importante no entanto é que parte da energia de ligação contribui diretamente para a catálise As moléculas de substrato passam por uma série de estados intermediários de geometria e de distribuição modificada de elétrons antes de formarem os produtos finais da reação A energia livre necessária para a formação do estado intermediário menos estável cha mado de estado de transição é denominada energia de ativação da reação e é a princi pal determinante da velocidade da reação As enzimas têm afinidade muito maior pelo estado de transição do substrato do que pela sua forma estável Como essa forte ligação Figura 346 Cinética enzimática A ve locidade da reação enzimática V aumen ta com o aumento da concentração do substrato até que um valor máximo Vmáx seja atingido Nesse ponto todos os sítios de ligação do substrato nas moléculas de enzima estão totalmente ocupados e a velocidade da reação é limitada pela velo cidade do processo catalítico na superfície da enzima Para a maioria das enzimas a concentração de substrato em que a velocidade de reação é a metade da velo cidade máxima Km fornece uma medida direta da força de ligação do substrato sendo que um valor alto de Km correspon de a uma ligação fraca Km Velocidade da reação Concentração de substrato Vmáx 05Vmáx 142 PAINEL 32 Alguns dos métodos utilizados no estudo das enzimas POR QUE ANALISAR A CINÉTICA DAS ENZIMAS CINÉTICA ENZIMÁTICA DE ESTADO ESTACIONÁRIO Muitas enzimas têm somente um substrato o qual elas ligam e então reagem para a produção do produto de acordo com o esquema da Figura 350A Nesse caso a reação é escrita como Aqui consideramos que a reação reversa na qual E P recombinam para formar EP e então ES ocorre tão raramente que podemos ignorála Nesse caso EP não precisa ser representado e podemos expressar a taxa da reação conhecida como sua velocidade V como onde ES é a concentração de complexos enzimasubstrato e kcat é o número de turnover uma constante de velocidade que tem valor igual ao número de moléculas de substrato processadas por moléculas de enzima a cada segundo Mas como o valor de ES se relaciona a concentrações que conhecemos diretamente que são a concentração total da enzima Eo e a concentração do substrato S Quando a enzima e o substrato são inicialmente misturados a concentração ES aumentará rapidamente a partir de zero até o chamado estado estacionário como ilustrado abaixo No estado de transição ES é quase constante ou seja ou já que a concentração de enzima livre E é igual à Eo ES Rearranjando e definindo a constante Km como temos ou lembrando que V kcat ES obtemos a famosa equação de MichaelisMenten À medida que S aumenta a níveis cada vez maiores essencialmente toda a enzima estará ligada ao substrato no estado de equilíbrio nesse ponto uma velocidade máxima de reação Vmáx será atingida onde V Vmáx kcat Eo Assim é conveniente reescrever a equação de MichaelisMenten como E S E P ES k1 k 1 kcat V kcat ES Taxa de associação de ES k1 ES Taxa de quebra de ES k1 ES kcat ES k1 k1 kcat ES ES Eo ES S k1 k1 kcat k1 k1 kcat Km S kcat EoS ES EoS Km S V Km S Vmáx S V Tempo 0 Estado préestacionário formação de ES Estado estacionário ES quase constante Concentrações E Eo ES S P As enzimas são os mais poderosos e seletivos catalisadores conhecidos Um entendimento detalhado de seus mecanismos provê uma ferramenta fundamental para o descobrimento de novas drogas para a síntese industrial em larga escala de produtos químicos úteis e para a compreensão da química das células e dos organismos Um estudo detalhado das velocidades das reações químicas que são catalisadas por uma enzima purificada mais especificamente como essas velocidades mudam com a alteração de condições tais como concentrações de substratos de produtos de inibidores e ligantes reguladores permite aos bioquímicos compreender exatamente como as enzimas trabalham Por exemplo essa foi a maneira pela qual as reações de produção de ATP na glicólise mostrada previamente na Figura 248 foram decifradas permitindo apreciar a lógica desta via enzimática crítica Neste Painel introduzimos a importante área de cinética enzimática que tem sido indispensável para se derivar muito do conhecimento detalhado que agora temos sobre a química celular 143 O GRÁFICO DUPLORECÍPROCO 1 2 3 4 5 6 7 8 20 0 0 2 4 6 8 40 60 80 S mmollitro V velocidade em estado estacionário da formação de produto µmols S 1 S 2 3 4 6 8 Um típico gráfico de V versus S para uma enzima que segue a cinética de MichaelisMenten é mostrado abaixo Desse gráfico os valores de Vmáx e Km não são obtidos diretamente ALGUMAS ENZIMAS SÃO LIMITADAS PELA DIFUSÃO Os valores de kcat Km e kcat Km de algumas enzimas selecionadas são mostrados abaixo Como uma enzima e seu substrato precisam colidir antes que possam reagir kcat Km êm um valor máximo possível que é limitado pela velocidade de colisões Se toda colisão forma um complexo enzimasubstrato é possível calcular a partir da teoria da difusão onde kcat Km estará entre 108 e 109 s1M1 no caso em que todas as etapas subsequentes ocorrem imediatamente Assim podese dizer que enzimas como a acetilcolinesterase e a fumarase são enzimas perfeitas onde cada enzima evoluiu ao ponto em que praticamente toda colisão com seu substrato o converte em produto Para se obter Vmáx e Km a partir desses dados um gráfico duplorecíproco é muitas vezes usado no qual a equação de MichaelisMenten foi rearranjada para que 1V possa ser apresentada em gráficos versus 1S 1V 1 Vmáx Km Vmáx S 1 025 0 025 05 075 10 05 1 Vmáx 1 S 1 S 1 Km 001 002 003 004 litrosmmol Inclinação da reta KM Vmáx Fumarase Fumarato 8102 5106 16108 Catalase H2O2 4107 1 4107 Acetilcolinesterase Acetilcolina 14104 9105 16108 Enzima Substrato kcat s1 kcatKm s1M1 Km M 1V sµmol A IMPORTÂNCIA DE Km kcat e kcat Km Como descrito no texto Km é uma medida aproximada da afinidade do substrato pela enzima é numericamente igual à concentração de S em V 05 Vmáx Em geral um valor baixo de Km significa forte ligação ao substrato De fato nos casos em que o kcat é muito menor que o k1 o Km será igual a Kd a constante de dissociação do substrato à enzima Kd 1Ka ver Figura 344 Vimos que k cat é o número de turnover para a enzima Em baixas concentrações de substrato onde S Km a maioria das enzimas está livre Assim podemos considerar E Eo para que a equação de MichaelisMenten venha a ser V kcatKm ES Portanto a proporção kcatKm é equivalente à constante de velocidade para a reação entre a enzima livre e o substrato livre Uma comparação de kcatKm para a mesma enzima com diferentes substratos ou para duas enzimas com seus diferentes substratos é muita usada como medida da efetividade da enzima Para simplificar neste Painel discutimos as enzimas que têm somente um substrato como a lisozima descrita no texto ver p 144 Várias enzimas têm dois substratos um dos quais é muitas vezes utilizado como molécula ativadora como NADH ou ATP Uma análise similar entretanto mais complexa é utilizada para determinar a cinética de tais enzimas permitindo que a ordem de ligação dos substratos e a presença de intermediários covalentes ao longo da reação possam ser identificadas CAPÍTULO 3 Proteínas 145 que a energia livre da cadeia intacta No entanto existe uma barreira de energia para essa reação e uma molécula de água só é capaz de romper a ligação entre duas moléculas de açúcar se a molécula polissacarídica estiver distorcida em uma conformação específica o estado de transição em que os átomos ao redor da ligação apresentem geometria e distribuição eletrônica alteradas Devido a esse requisito colisões aleatórias precisam fornecer uma quantidade de energia de ativação bastante alta para que a reação ocorra Em uma solução aquosa à temperatura ambiente a energia resultante de colisões mo leculares quase nunca excede a energia de ativação O polissacarídeo puro pode então ficar por anos dissolvido em água sem ser hidrolisado em um nível detectável Essa situação muda drasticamente quando o polissacarídeo se liga à lisozima O sítio ativo da lisozima uma vez que seu substrato é um polímero é um longo sulco que pode acomodar até seis açúcares ao mesmo tempo Tão logo o polissacarídeo se liga para formar o complexo enzimasubstrato a enzima cliva o polissacarídeo pela adição de uma molécula de água a uma das ligações açúcaraçúcar As duas novas cadeias re sultantes dissociamse da enzima rapidamente liberando a enzima para outros ciclos de reação Figura 350 Esse aumento impressionante da velocidade de hidrólise ocorre pelo estabeleci mento das condições necessárias no microambiente do sítio ativo da lisozima o que re duz de forma significativa a energia de ativação necessária para que ocorra a hidrólise Mais especificamente a lisozima distorce um dos dois açúcares da ligação que será rom pida alterando sua conformação normal e mais estável A ligação a ser rompida também é posicionada na proximidade de dois aminoácidos com cadeias laterais ácidas um áci do glutâmico e um ácido aspártico que participam diretamente na reação A Figura 351 mostra as três etapas principais dessa reação catalisada pela enzima que ocorre milhares de vezes mais rápido que a hidrólise não catalisada Outras enzimas utilizam mecanismos similares para reduzir a energia de ativação e acelerar as reações que elas catalisam Em reações que envolvem dois ou mais rea gentes o sítio ativo atua como um molde posicionando as moléculas de substrato na orientação apropriada para que a reação entre elas possa ocorrer Figura 352A Como vimos no caso da lisozima o sítio ativo de uma enzima contém átomos precisamente C O N H H C H H H O LENTO O N H H C H H H O RÁPIDO C O N H H C H H H H H O RÁPIDO O N H H C H MUITO RÁPIDO N H C O O O C O O N H Catálise ácida B A Ausência de catálise Catálise básica C Catálise ácida e catálise básica D C C Figura 349 Catálise ácida e catálise básica A O início de uma reação não catalisada de hidrólise de uma ligação peptídica com o sombreamento em azul indicando a distribuição de elétrons na água e nas ligações carbonila B Um ácido doa um próton H a outros áto mos Pelo pareamento com o oxigênio da carbonila um ácido desloca os elétrons para longe do carbono da carbonila tor nando esse átomo muito mais atrativo ao oxigênio eletronegativo de uma molécula de água C Uma base recebe H Pelo pareamento com o hidrogênio da molécu la de água uma base provoca o movimen to de elétrons em direção ao oxigênio da água tornandoo um grupo melhor para o ataque ao carbono da carbonila D Por ter átomos apropriadamente posicionados sob sua superfície uma enzima pode exe cutar as catálises ácida e básica ao mesmo tempo A S E ES EP E P B Figura 350 Reação catalisada pela lisozima A A enzima lisozima E catalisa a quebra de uma cadeia polissacarídica que é o seu substrato S A enzima inicialmente se liga à cadeia formando um complexo enzimasubstrato ES e então catalisa a clivagem de uma ligação covalente específica da cadeia princi pal do polissacarídeo formando um complexo enzimaproduto EP que rapidamente se dissocia A liberação da cadeia polissacarídica clivada os produtos P deixa a enzima livre para agir sobre outra molécula de substrato B Modelo de preenchimento espacial da molécula de lisozima ligada a uma cadeia polissaca rídica curta antes da clivagem Animação 38 B cortesia de Richard J Feldmann código PDB 3AB6 146 PARTE I Introdução à célula posicionados que aceleram a reação por intermédio de grupos carregados que alteram a distribuição de elétrons nos substratos Figura 352B Também já descrevemos como durante a ligação dos substratos à enzima as ligações do substrato são frequentemente distorcidas alterando a estrutura dele Essas alterações juntamente com forças mecâ nicas direcionam o substrato para um estado de transição específico Figura 352C Assim como a lisozima diversas enzimas fazem parte da reação que catalisam por meio da formação transitória de uma ligação covalente entre a molécula de substrato e uma cadeia lateral da enzima As etapas subsequentes da reação restauram a cadeia lateral de volta ao seu estado original de maneira que a enzima permanece inalterada ao final da reação ver também Figura 248 Pequenas moléculas que se ligam fortemente às proteínas conferem a elas novas funções Embora tenhamos enfatizado a versatilidade das enzimas e das proteínas em geral como cadeias de aminoácidos que desempenham funções notáveis existem diversas Figura 351 Eventos no sítio ativo da lisozima As imagens localizadas no canto superior esquerdo e direito representam o substrato e o produto livres respectiva mente enquanto as outras três imagens mostram a sequência de eventos no sítio ativo da enzima Observe a mudança na conformação do açúcar D no complexo enzimasubstrato essa mudança na con formação estabiliza o estado de transição tipo íon oxocarbênio necessário para a formação e a hidrólise do intermediário covalente mostrado no painel central Também é possível que um intermediário íon carbônio seja formado na etapa 2 mas o intermediário covalente mostrado no pai nel do meio foi detectado com substratos sintéticos Animação 39 Ver DJ Voca dlo et al Nature 412835838 2001 No complexo enzimasubstrato ES a enzima altera a conformação do açúcar D O aminoácido Glu35 da enzima está posicionado de modo a agir como um ácido que ataca a ligação açúcaraçúcar adjacente por meio da doação de um próton H ao açúcar E o aminoácido Asp52 está posicionado para interagir com o átomo de carbono C1 O aminoácido Asp52 forma uma ligação covalente entre a enzima e o átomo de carbono C1 do açúcar D O aminoácido Glu35 polariza uma molécula de água vermelho de modo que o seu átomo de oxigênio possa interagir rapidamente com o átomo de carbono C1 e romper a ligação com Asp52 A reação da molécula de água vermelho completa a hidrólise e restabelece as condições iniciais da enzima formando o complexo final enzimaproduto EP O O O O O CH2OH C C C H R R O O C C O O O O O CH2OH CH2OH R R O O O O CH2OH HOCH2 HOCH2 C C H H R R H O O O O O O O CH2OH C C C H R R H O O C C O O O O Glu35 SUBSTRATO Asp52 Glu35 Asp52 Glu35 Asp52 A F B C O O O H O CH2OH CH2OH R R H O O A D E F B C O H O H Este substrato é um oligossacarídeo composto por seis açúcares indicados pelas letras A a F Apenas os açúcares D e E estão representados em detalhes PRODUTOS Os produtos finais são um oligossacarídeo composto por quatro açúcares à esquerda e um dissacarídeo à direita produzidos pela reação de hidrólise Cadeia lateral do açúcar E Carbono C1 HOCH2 H ES EP O C C C O O D E D E D E D E Figura 352 Algumas estratégias ge rais da catálise enzimática A Substra tos mantidos juntos em um alinhamento preciso B Estabilização de cargas dos intermediários da reação C Aplicação de forças que distorcem as ligações do subs trato e aumentam a velocidade de uma reação específica A B C A enzima se liga a duas moléculas de substrato e as orienta de modo preciso para que ocorra a reação entre elas A ligação do substrato à enzima modifica a distribuição de elétrons no substrato criando cargas parciais positivas e negativas que favorecem a reação A enzima distorce a molécula ligada de substrato gerando o estado de transição que favorece a reação CAPÍTULO 3 Proteínas 147 ocasiões em que apenas os aminoácidos não são suficientes Assim como os homens empregam ferramentas para melhorar e estender a capacidade de suas mãos também as enzimas e proteínas frequentemente utilizam pequenas moléculas não proteicas no desempenho de funções que seriam difíceis ou impossíveis de serem executadas somen te com os aminoácidos Assim as enzimas muitas vezes possuem pequenas moléculas ou átomos de metal fortemente associados ao seu sítio ativo que auxiliam a função ca talítica A carboxipeptidase por exemplo uma enzima que cliva cadeias polipeptídicas possui um átomo de zinco fortemente ligado ao seu sítio ativo Durante a clivagem de uma ligação peptídica pela carboxipeptidase o íon de zinco forma uma ligação transitória com um dos átomos do substrato auxiliando a reação de hidrólise Em outras enzimas uma pequena molécula orgânica tem propósitos similares Estas moléculas são frequen temente denominadas coenzimas Um exemplo é a biotina encontrada em enzimas que transferem um grupo carboxilato COO 2 de uma molécula para outra ver Figura 240 A biotina participa dessas reações formando uma ligação covalente transitória com o gru po COO 2 a ser transferido sendo mais apropriada para essa função do que qualquer um dos aminoácidos utilizados para compor as proteínas Uma vez que não pode ser sinteti zada pelo homem e portanto deve ser suplementada em pequenas quantidades em nos sa dieta a biotina é uma vitamina Diversas outras coenzimas são vitaminas ou derivadas delas Tabela 32 Outras proteínas podem requerer a presença de pequenas moléculas acessórias para seu funcionamento adequado A proteína receptora de sinais rodopsina que é produzida por células fotorreceptoras da retina detecta luz por meio de uma molécula pequena o retinal que fica embebida na proteína Figura 353A O retinal que é deri vado da vitamina A muda de forma quando absorve um fóton de luz e essa mudança faz a proteína desencadear uma cascata de reações enzimáticas que no final culmina com um sinal elétrico enviado para o cérebro Outro exemplo de proteína com uma porção não proteica é a hemoglobina ver Figura 319 Cada molécula de hemoglobina carrega quatro grupos heme moléculas em forma de anel cada uma com um átomo de ferro no centro Figura 353B O heme TABELA 32 Muitos derivados de vitaminas são coenzimas fundamentais às células humanas Vitamina Coenzima Reações catalisadas por enzimas que requerem essas coenzimas Tiamina vitamina B1 Tiamina pirofosfato Ativação e transferência de aldeídos Riboflavina vitamina B2 FADH Oxidaçãoredução Niacina NADH NADPH Oxidaçãoredução Ácido pantotênico Coenzima A Ativação e transferência de grupos acil Piridoxina Piridoxal fosfato Ativação de aminoácidos e também fosforilação do glicogênio Biotina Biotina Ativação e transferência de CO2 Ácido lipoico Lipoamida Ativação de grupos acil oxidaçãoredução Ácido fólico Tetrahidrofolato Ativação e transferência de grupos carbono simples Vitamina B12 Coenzimas da cobalamina Isomerização e transferência de grupos metil CH3 CH3 CH3 CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH H3C H2C H C HC CH2 Fe N N N N CH3 CH3 CH3 H3C H3C A B CHO Figura 353 Retinal e heme A Estru tura do retinal a molécula sensível à luz ligada à rodopsina nos olhos A estrutura mostrada passa pelo processo de isomeri zação após a absorção de luz B Estrutura do grupo heme O anel de carbono que contém o heme é mostrado em vermelho e o átomo de ferro no centro é mostrado em laranja O grupo heme é fortemente ligado a cada uma das quatro cadeias polipeptídicas da hemoglobina a proteína transportadora de oxigênio cuja estrutura é mostrada na Figura 319 148 PARTE I Introdução à célula confere à hemoglobina e ao sangue a cor vermelha Por ligarse reversivelmente ao oxi gênio gasoso por meio do átomo de ferro o heme possibilita que a hemoglobina capture oxigênio nos pulmões e o libere nos tecidos Algumas vezes essas pequenas moléculas estão ligadas covalente e permanente mente às suas proteínas tornandose parte integrante da própria molécula proteica Ve remos no Capítulo 10 que as proteínas frequentemente se ancoram à membrana celular por intermédio de moléculas lipídicas covalentemente ligadas As proteínas de mem brana expostas na superfície da célula bem como proteínas secretadas pela célula com frequência são modificadas pela adição covalente de açúcares e de oligossacarídeos Complexos multienzimáticos ajudam a aumentar a taxa de metabolismo celular A eficiência das enzimas na aceleração de reações químicas é crucial para a manutenção da vida As células na verdade precisam combater o inevitável processo de deterioração que se deixado sem controle leva as macromoléculas a uma grande desordem Se a taxa de reações favoráveis não for maior que a taxa de reações colaterais reações desfavo ráveis a célula pode morrer rapidamente Uma ideia de como a taxa do metabolismo celular avança pode ser obtida pela medida da taxa de utilização de ATP Uma célula de mamífero típica renova ie realiza hidrólise e restauração por fosforilação todo seu ATP intracelular uma vez a cada 1 ou 2 minutos Para cada célula esse processo repre senta a utilização de mais de 10 7 moléculas de ATP por segundo ou para o corpo huma no cerca de 30 gramas de ATP a cada minuto As taxas de reações nas células são rápidas devido à eficiência da catálise enzimá tica Algumas enzimas se tornaram tão eficientes que não há como melhorálas O fator que limita a taxa de reação não é a velocidade intrínseca da ação enzimática mas a fre quência com que as enzimas formam complexos com seus substratos Tais reações são consideradas limitadas pela difusão ver Painel 32 p 142143 A quantidade de produto produzida por uma enzima irá depender da concentra ção da enzima e dos seus substratos Se uma sequência de reações deve ocorrer de ma neira extremamente rápida cada intermediário metabólico e enzima envolvida devem estar presentes em altas concentrações Entretanto dado o grande número de diferentes reações que ocorrem nas células há um limite para a concentração que pode ser alcan çado De fato a maioria dos metabólitos está presente em concentrações micromolares 10 6 M e a maioria das enzimas está presente em concentrações ainda mais baixas Como é possível desse modo manter a rápida taxa metabólica A resposta está na organização espacial dos componentes da célula A célula pode aumentar as taxas de reações sem acréscimo da concentração de substratos pela apro ximação das várias enzimas envolvidas em uma sequência de reações formando um grande conjunto de enzimas conhecido como complexo multienzimático Figura 354 Como esse conjunto é organizado de uma maneira que permite que o produto da en zima A passe diretamente para a enzima B e assim por diante a taxa de difusão não é limitante mesmo quando a concentração de substrato é bastante baixa na célula como um todo Assim talvez não seja surpreendente que tais complexos enzimáticos sejam tão comuns e estejam envolvidos em aproximadamente todos os aspectos do metabolismo incluindo os processos genéticos essenciais como o processamento do DNA do RNA e a síntese de proteínas De fato poucas enzimas das células eucarióticas se difundem livremente em solução em vez disso a maioria parece ter desenvolvido sítios de liga ção que as concentram junto a outras proteínas de funções parecidas em determinadas regiões da célula aumentando assim a taxa e a eficiência das reações que elas catalisam ver p 331 As células eucarióticas ainda possuem outra maneira de aumentar a taxa de rea ções metabólicas utilizando seu sistema de membranas intracelular Essas membranas podem segregar substratos específicos e enzimas que agem sobre eles dentro do mesmo compartimento delimitado como o retículo endoplasmático ou o núcleo celular Se por exemplo um compartimento ocupa um total de 10 do volume da célula a concentra ção de reagentes no compartimento pode ser aumentada 10 vezes comparada à mesma célula com o mesmo número de moléculas de enzima e de substrato mas não compar CAPÍTULO 3 Proteínas 149 timentada As reações que de outra forma seriam limitadas pela velocidade de difusão podem desse modo ser aceleradas por um fator igual a 10 A célula regula as atividades catalíticas de suas enzimas As células contêm milhares de enzimas muitas das quais operam simultaneamente no pequeno volume do citosol Por suas funções catalíticas as enzimas geram uma comple xa rede de vias metabólicas cada qual composta por uma sequência de reações quími cas na qual o produto de uma enzima tornase o substrato da próxima Nesse labirinto de vias existem muitos pontos de ramificação em que diferentes enzimas competem pelo mesmo substrato O sistema é complexo ver Figura 263 e são necessários controles elaborados para regular quando e em que velocidade cada reação deve ocorrer A regulação ocorre em vários níveis Em um nível a célula controla quantas molé culas de cada enzima ela sintetiza regulando a expressão do gene que codifica essa en TE 2 2 2 2 1 1 1 4 4 4 5 5 3 3 3 Domínios enzimáticos N A B C E D C Domínio de transferência de grupos acil Domínio de terminação TE etc COMPLEXO DA PIRUVATO DESIDROGENASE ÁCIDO GRAXO SINTASE 3 1 5 nm 20 nm Figura 354 Como as regiões não estruturadas de uma cadeia polipeptídica que atuam como elos de conexão permitem que intermediários de reação sejam transferidos de um sítio ativo ao outro em grandes complexos multienzimáticos AC A ácido graxo sintase em mamíferos A A locali zação dos sete domínios proteicos com diferentes atividades nesta proteína de 270 quilodáltons A numeração se refere à ordem em que cada um dos domínios enzimáticos atua para completar a etapa de adição de dois átomos de carbono Após diversos ciclos de adição de dois átomos de carbono o domínio de ter minação libera o produto final uma vez que o ácido graxo do tamanho desejado tenha sido sintetizado B A estrutura do dímero da enzima com a indicação da localização dos cinco sítios ativos em um dos monômeros C Como os elos flexíveis permitem que as moléculas de substrato que permanecem ligadas ao domínio transportador de grupos acil vermelho sejam transferidas de um sítio ativo ao outro em cada monômero alongando e modificando o intermediário de ácido graxo ligado amarelo As cinco etapas representadas se repetem até que o ácido graxo de extensão final tenha sido sintetizado Apenas as etapas 1 a 4 estão representadas na figura D Múltiplas subunidades associadas do complexo gigante da piruvato desidrogenase 9500 quilodáltons maior que um ribossomo que catalisa a conversão de piruvato em acetilCoA E Assim como na imagem C uma molécula de substrato ligada covalentemente a um dos elos de conexão esferas vermelhas com substrato amarelo é transferida entre os sítios ativos das subunidades numerados de 1 a 3 para dar origem aos produtos finais Aqui a subuni dade 1 catalisa a decarboxilação do piruvato e a acilação por redução do grupo lipoil ligado a uma das esferas vermelhas A subunidade 2 transfere esse grupo acetil a uma molécula de CoA formando acetilCoA e a subunidade 3 oxida novamente o grupo lipoil para o início do próximo ciclo de reação Apenas um décimo das subunidades 1 e 3 ligadas à região central da enzima composta pela subunidade 2 estão representadas na figura Essa importante reação ocorre na mitocôndria dos mamíferos e é parte da via que oxida moléculas de açúcar em CO2 e H2O ver p 82 AC adaptada de T Maier et al Quart Rev Biophys 43373422 2010 D de JLS Milne et al J Biol Chem 28143644370 2006 150 PARTE I Introdução à célula zima discutido no Capítulo 7 As células também controlam a atividade enzimática por meio confinamento de conjuntos específicos de enzimas em compartimentos subcelu lares seja pela localização em um compartimento delimitado por membrana discutido nos Capítulos 12 e 14 ou pela concentração dessas proteínas em uma estrutura maior ver Figura 377 Como será explicado mais adiante neste capítulo as enzimas também são modificadas covalentemente para controlar suas atividades A taxa de degradação de uma proteína pela sua marcação para proteólise representa outro mecanismo regulador importante ver Figura 686 No entanto o modo mais comum de ajustar as velocidades das reações opera por meio de uma alteração direta e reversível na atividade de uma en zima em resposta a pequenas moléculas específicas que se ligam à proteína O tipo mais comum de controle ocorre quando uma enzima liga uma molécula que não é um substrato a um sítio regulador especial fora do sítio ativo e dessa maneira altera a velocidade com que a enzima converte seu substrato em produto Na inibição por retroalimentação uma enzima atuando em uma etapa anterior em uma via meta bólica é inibida por um produto posterior da mesma via Assim toda vez que grandes quantidades do produto final começam a se acumular esse produto ligase à enzima diminuindo sua atividade catalítica e limitando assim o aporte de mais substratos na sequência de reações Figura 355 Nos pontos de bifurcação ou de intersecção de vias metabólicas geralmente existem múltiplos pontos de controle por diferentes produtos finais cada qual atuando para regular a sua própria síntese Figura 356 A inibição por retroalimentação pode funcionar de forma quase instantânea sendo rapidamente revertida quando o nível do produto diminui A inibição por retroalimentação é uma regulação negativa ela previne a atividade da enzima No entanto as enzimas também podem ser alvo de uma regulação positiva na qual a atividade enzimática é estimulada por uma molécula reguladora e não inibida A regulação positiva ocorre quando um produto de uma via da rede metabólica estimula X Y Z regulação negativa A B C Figura 355 Inibição por retroalimen tação de uma via biossintética simples O produto final Z inibe a primeira enzima que é fundamental na via de síntese con trolando o seu próprio nível na célula Esse é um exemplo de regulação negativa Figura 356 Inibição múltipla por retroalimentação Neste exemplo que mostra as vias biossintéticas de quatro diferentes aminoácidos em bactéria as linhas vermelhas indicam as posições nas quais os produtos inibem as enzimas por retroalimentação Cada aminoácido con trola a primeira enzima específica para sua própria síntese controlando assim o seu próprio nível e evitando o acúmulo desne cessário e até perigoso de intermediários Os produtos também podem inibir sepa radamente o conjunto inicial de reações comuns para todas as sínteses neste caso três diferentes enzimas catalisam a reação inicial cada qual sendo inibida por um produto diferente Treonina Isoleucina Metionina Homosserina Lisina Aspartato Aspartilfosfato Aspartato semialdeído CAPÍTULO 3 Proteínas 151 a atividade de uma enzima de uma outra via Como exemplo o acúmulo de adenosina difosfato ADP adenosine diphosphate ativa várias enzimas envolvidas com a oxidação de moléculas de açúcar estimulando assim a célula a converter mais ADP em ATP As enzimas alostéricas possuem dois ou mais sítios de ligação interativos Um aspecto intrigante da regulação por retroalimentação positiva e negativa é que a mo lécula reguladora com frequência tem uma forma totalmente diferente daquela do subs trato da enzima Por esse motivo essa forma de regulação é denominada alosteria do grego allos outro e stereos sólido ou tridimensional À medida que os biólogos aprenderam mais sobre a regulação eles reconheceram que as enzimas envolvidas de vem ter pelo menos dois sítios de ligação diferentes em sua superfície um sítio ativo que reconhece os substratos e um sítio regulador que reconhece uma molécula regula dora Esses dois sítios devem se comunicar de modo a permitir que os eventos catalíticos no sítio ativo sejam influenciados pela ligação da molécula reguladora ao seu próprio sítio na superfície da proteína A interação entre os diferentes sítios de uma molécula proteica depende de uma mudança conformacional da proteína a ocupação de um sítio faz a molécula passar de uma forma tridimensional para uma outra ligeiramente diferente Durante a inibição por retroalimentação por exemplo a ligação de um inibidor em um sítio da proteína faz ela mudar para uma conformação na qual seu sítio ativo localizado em outra parte da proteína tornese incapacitado Aparentemente a maioria das moléculas proteicas é alostérica Elas podem adotar duas ou mais conformações ligeiramente diferentes e a transição de uma para a outra induzida pela ligação de um ligante pode alterar sua atividade Isso vale não apenas para enzimas mas também para várias outras proteínas inclusive receptores proteínas es truturais e proteínas motoras Em todas as instâncias da regulação alostérica cada con formação da proteína apresenta diferenças nos contornos da superfície da molécula os seus sítios de ligação são alterados quando a forma da proteína é modificada Além disso como discutiremos a seguir cada ligante estabiliza a conformação à qual ele se liga mais fortemente e assim em concentrações suficientemente altas tenderá a induzir a mu dança da proteína para a sua conformação preferida Dois ligantes cujos sítios de ligação estão acoplados devem afetar reciprocamente a ligação um do outro O efeito da ligação de um ligante em uma proteína segue um princípio fundamental da química conhecido como ligação Suponha por exemplo que uma proteína que liga glicose também ligue outra molécula X em um sítio distante da sua superfície Se o sítio de ligação para X mudar de forma devido a uma mudança conformacional na proteína induzida pela ligação da glicose o sítio de ligação de X e o da glicose serão considerados acoplados Sempre que dois ligantes preferem se ligar à mesma conformação de uma proteína alostérica segundo os princípios básicos da termodinâmica cada ligante deve aumentar a afinidade da proteína pelo outro ligante Por exemplo se ocorre uma mu dança em uma proteína para uma conformação que melhor liga a glicose isso fará o sítio de ligação para X também ligar melhor a molécula X então a proteína ligará mais fortemente a glicose quando X estiver presente Em outras palavras X regula de modo positivo a ligação da proteína à glicose Figura 357 De modo oposto a ligação recíproca pode operar de forma negativa quando dois ligantes preferem ligarse a conformações diferentes de uma mesma proteína Nesse caso a ligação do primeiro ligante desencoraja a ligação do segundo ligante Assim se uma mudança de conformação induzida pela ligação da glicose diminui a afinidade de uma proteína pela molécula X a ligação de X também deve diminuir a afinidade da pro teína por glicose Figura 358 Essa relação é quantitativamente recíproca por exemplo se a glicose tem um grande efeito sobre a ligação de X X também terá um grande efeito sobre a ligação da glicose 152 PARTE I Introdução à célula As relações mostradas nas Figuras 357 e 358 se aplicam a todas as proteínas e fundamentam toda a biologia celular Esse princípio parece tão óbvio em retrospecto que é atualmente considerado senso comum Mas a descoberta da ligação recíproca a partir de estudos com algumas poucas enzimas em 1950 seguida por uma análise ex tensiva dos mecanismos da alosteria nas proteínas no início da década de 1960 foi re volucionária para nosso entendimento da biologia No exemplo das figuras a molécula X se liga a um local da enzima diferente do sítio onde a catálise ocorre e não precisa ter qualquer relação química com a molécula de substrato que se liga ao sítio ativo Como já vimos para enzimas que são reguladas dessa maneira a molécula X pode tornar a enzima ativa regulação positiva ou inativa regulação negativa Por meio desse meca nismo as proteínas alostéricas servem como chaves gerais que em princípio podem permitir que uma molécula em uma célula afete o destino de qualquer outra Agregados proteicos simétricos geram transições alostéricas cooperativas Uma única subunidade enzimática regulada por retroalimentação negativa pode ter uma diminuição na sua atividade de 90 para 10 em resposta a um aumento de cem vezes na concentração de um inibidor Figura 359 linha vermelha Aparentemen te respostas desse tipo não são suficientes para uma ótima regulação da célula e a maioria das enzimas é ligada ou desligada pela ligação de ligantes que consiste em associações simétricas de subunidades idênticas Com essa organização a ligação de uma molécula do ligante a um único sítio ativo de uma subunidade pode iniciar uma alteração alostérica em toda a associação proteica ajudando as subunidades adjacen tes a ligarem o mesmo ligante Como resultado ocorre uma transição alostérica coope rativa Figura 359 linha azul permitindo que uma alteração relativamente pequena na concentração do ligante na célula possa modificar a associação de proteínas como Figura 357 Regulação positiva causa da pelo acoplamento conformacional entre dois sítios de ligação separados Neste exemplo tanto a glicose quanto a molécula X se ligam melhor à confor mação fechada da proteína constituída por dois domínios Como tanto a glicose quanto a molécula X induzem uma alte ração conformacional da proteína para a forma fechada cada ligante ajuda o outro a se ligar Portanto é dito que a glicose e a molécula X se ligam cooperativamente à proteína 10 ativa 100 ativa Regulação positiva Glicose Molécula X Molécula X INATIVA ATIVA Figura 358 Regulação negativa causa da pelo acoplamento conformacional entre dois sítios de ligação separados O esquema mostrado parece com o an terior mas aqui a molécula X prefere a conformação aberta enquanto a glicose prefere a conformação fechada Como a glicose e a molécula X induzem altera ções conformacionais opostas na enzima fechada e aberta respectivamente a presença de um dos ligantes interfere na ligação do outro 100 ativa 10 ativa Molécula X Molécula X Glicose Regulação negativa ATIVA INATIVA CAPÍTULO 3 Proteínas 153 um todo de uma conformação ativa a uma conformação quase que totalmente inativa ou viceversa Os princípios envolvidos em uma transição cooperativa do tipo tudo ou nada são os mesmos para todas as proteínas sejam elas enzimas ou não Por exemplo eles são es senciais para a absorção e liberação de O2 pela hemoglobina no sangue Talvez eles sejam visualizados mais facilmente em uma enzima que forma um dímero simétrico No exemplo mostrado na Figura 360 a primeira molécula de um inibidor se liga com grande dificuldade pois sua ligação desarranja a interação energeticamente favorável entre os dois monômeros idênticos do dímero Entretanto uma segunda molécula do inibidor se liga mais facilmente pois sua ligação restaura o contato monômeromonô mero energeticamente favorável de um dímero simétrico e também inativa completa mente a enzima Como alternativa a esse modelo de encaixe induzido para a transição alostérica cooperativa podemos considerar a enzima simétrica como possuidora de duas con formações possíveis correspondendo às conformações da enzima ativa e da enzima inativa na Figura 360 Nesse modelo a ligação do ligante perturba o equilíbrio tudo ou nada entre esses dois estados alterando portanto a proporção de moléculas ativas Esses dois modelos ilustram modelos reais de conceitos úteis Diversas alterações nas proteínas são induzidas por fosforilação As proteínas são reguladas de outras formas além da ligação reversível de outras molécu las Um segundo método que as células eucarióticas utilizam extensivamente para regu lar a função de uma proteína é a adição covalente de uma ou mais pequenas moléculas à cadeia lateral de seus aminoácidos A modificação reguladora mais comum em euca riotos superiores é a adição de um grupo fosfato Utilizaremos portanto a fosforilação de proteínas para ilustrar alguns dos princípios gerais envolvidos no controle da função de proteínas pela modificação das cadeias laterais de aminoácidos O evento da fosforilação pode afetar a proteína modificada de três maneiras im portantes Primeiro pelo fato de o grupo fosfato carregar duas cargas negativas a adição enzimaticamente catalisada de um grupo fosfato a uma proteína pode causar uma mu dança conformacional significativa por exemplo pela atração de um grupo de cadeias laterais de aminoácidos carregados positivamente Isso pode por sua vez afetar a liga ção de novos ligantes na superfície da proteína mudando de forma drástica a atividade da proteína Quando uma segunda enzima remove o grupo fosfato a proteína retorna à sua conformação original e restabelece sua atividade inicial Figura 359 Atividade enzimática versus concentração do inibidor para enzimas alostéricas monoméricas e en zimas com múltiplas subunidades Para uma enzima com uma única subunidade linha vermelha uma queda na atividade enzimática de 90 para 10 indicada pelos dois pontos na curva requer um au mento de cem vezes na concentração do inibidor A atividade enzimática é calculada a partir da relação de equilíbrio K IPI P onde P é a proteína ativa I é o inibidor e IP é a proteína inativa ligada ao inibidor Uma curva idêntica se aplica a qualquer interação de ligação entre duas moléculas A e B Em contraste uma enzima alos térica com múltiplas subunidades pode responder diferentemente a mudanças na concentração do ligante a resposta abrup ta é causada por uma ligação cooperativa de moléculas ligantes como mostrado na Figura 360 Aqui a linha verde re presenta o resultado ideal para a ligação cooperativa de duas moléculas ligantes inibitórias a uma enzima alostérica com duas subunidades e a linha azul mostra o resultado ideal de uma enzima com quatro subunidades Como indicado pelos dois pontos em cada curva a atividade das en zimas mais complexas diminui de 90 para 10 com uma concentração bem menor do inibidor do que a enzima composta por uma única subunidade 0 50 100 5 10 Porcentagem de atividade enzimática Concentração de inibidor 1 subunidade 2 subunidades 4 subunidades Figura 360 Transição alostérica cooperativa em uma enzima composta por duas subunidades idênticas Este diagrama ilustra como a conformação de uma subunida de pode influenciar a conformação da subunidade adjacente A ligação de uma única molécula de um ligante inibidor amarelo a uma das subunidades da enzima ocorre com dificuldade pois o inibidor muda a conformação dessa subunidade destruindo a simetria da enzima Uma vez que essa mudança de conformação tenha ocorrido no entanto o ganho de energia para restaurar o pareamento simétrico entre as duas subunidades torna especialmente fácil para a segunda subunidade ligar o segundo ligante inibidor e sofrer a mesma alteração conformacional Como a ligação da primeira molécula do ligante aumenta a afinidade de ligação com que a outra subunidade liga o mesmo ligante a res posta da enzima a mudanças na concentração do ligante será muito mais acentuada do que a resposta de uma enzima monomérica ver Figura 359 e Animação 310 TRANSIÇÃO DIFÍCIL TRANSIÇÃO FACILITADA ENZIMA INATIVA ENZIMA ATIVA Inibidor Substrato 154 PARTE I Introdução à célula Segundo a ligação de um grupo fosfato pode formar parte de uma estrutura que os sítios de ligação de outras proteínas podem reconhecer Como discutido anteriormente o domínio SH2 se liga a uma curta sequência peptídica que contém uma cadeia lateral de tirosina fosforilada ver Figura 340B Mais de dez outros domínios comuns apresentam sí tios de ligação que permitem a ligação das proteínas que os contêm a peptídeos fosforilados em outras moléculas proteicas cada um reconhecendo uma cadeia lateral fosforilada de aminoácidos diferente em contextos distintos Terceiro a adição de um grupo fosfato pode mascarar o sítio de ligação que mantinha duas proteínas unidas rompendo as interações proteínaproteína Como resultado os eventos de fosforilação e desfosforilação de proteínas têm um papel importante na regulação dos processos de associação e de dissociação de complexos proteicos ver p ex Figura 1511 A fosforilação reversível de proteínas controla a atividade a estrutura e a locali zação celular de enzimas e de muitos outros tipos de proteínas das células eucarióticas De fato essa regulação é tão ampla que mais de um terço das 10 mil ou mais proteínas em uma célula típica de mamíferos pode ser fosforilado em um dado momento muitas proteínas com mais de um fosfato Como poderia ser esperado a adição e a remoção de grupos fosfato em proteínas específicas muitas vezes ocorre em resposta a sinais que es pecificam alguma mudança no estado da célula Por exemplo a complicada sucessão de eventos que ocorre durante a divisão celular de eucariotos é em grande parte controlada por esse processo discutido no Capítulo 17 e muitos dos sinais que medeiam as inte rações célulacélula são transmitidos da membrana plasmática para o núcleo por uma cascata de eventos de fosforilação de proteínas discutido no Capítulo 15 Uma célula eucariótica contém uma ampla coleção de proteínascinase e proteínasfosfatase A fosforilação de proteínas envolve a transferência enzimática do grupo fosfato terminal de uma molécula de ATP para uma hidroxila da cadeia lateral dos aminoácidos de serina de treonina ou de tirosina na proteína Figura 361 Uma proteínacinase catalisa essa reação e a reação é essencialmente unidirecional devido à grande quantidade de ener gia livre liberada quando a ligação fosfatofosfato do ATP é quebrada para produzir ADP discutido no Capítulo 2 Uma proteínafosfatase catalisa a reação inversa de remoção do grupo fosfato ou desfosforilação As células contêm centenas de proteínascinase di ferentes cada uma responsável pela fosforilação de uma proteína diferente ou de um conjunto de proteínas Há também muitas proteínasfosfatase diferentes algumas delas são altamente específicas e removem grupos fosfato de apenas uma ou poucas proteínas enquanto outras agem sobre um amplo espectro de proteínas e são direcionadas a subs tratos específicos por meio de subunidades reguladoras O estado de fosforilação de uma proteína em um dado momento bem como sua atividade dependerá das atividades re lativas das proteínascinase e proteínasfosfatase que agem sobre ela As proteínascinase que fosforilam outras proteínas nas células eucarióticas per tencem a uma grande família de enzimas que compartilham uma sequência catalítica cinase de 290 aminoácidos Os vários membros da família contêm diferentes sequên cias de aminoácidos em ambas as terminações da sequência cinase p ex ver Figura 310 e frequentemente possuem curtas sequências de aminoácidos inseridas em alças Algumas dessas sequências de aminoácidos adicionais permitem que cada cinase reco nheça um grupo específico das proteínas a serem fosforiladas ou liguese a estruturas que se localizam em regiões específicas da célula Outras partes da proteína permitem a regulação da atividade de cada cinase podendo assim ser ativada e desativada em resposta a diferentes sinais específicos como descrito a seguir Comparandose o número de diferentes sequências de aminoácidos entre os vá rios membros de uma família de proteínas podese construir uma árvore evolutiva que aparentemente reflete o padrão de duplicação e divergência dos genes que originaram a família A Figura 362 mostra uma árvore evolutiva de proteínascinase As cinases com funções relacionadas frequentemente localizamse em ramos próximos da árvore as proteínascinase envolvidas na sinalização celular e que fosforilam cadeias laterais de tirosina por exemplo estão todas agrupadas no canto superior esquerdo da árvore As outras cinases mostradas fosforilam cadeias laterais de resíduos de serina ou de treoni O CH2 P O O O PROTEÍNA CINASE PROTEÍNA FOSFATASE OH Cadeia lateral CH2 de serina Proteína fosforilada A B ATIVA INATIVA INATIVA ATIVA Fosfatase Cinase Fosfatase Cinase ATP ADP C C P P Pi Figura 361 Fosforilação proteica Milhares de proteínas em uma célula eucariótica típica são modificadas pela adição covalente de um grupo fosfato A A reação geral transfere um grupo fosfato do ATP para a cadeia lateral de um aminoácido da proteínaalvo por meio de atividade de uma proteínacinase A remoção do grupo fosfato é catalisada por uma segunda enzima uma proteínafosfatase Neste exem plo o fosfato é adicionado à cadeia lateral da serina em outros casos ele é ligado ao grupo OH de uma treonina ou de uma tirosina B A fosforilação da proteína por uma proteínacinase pode aumentar ou diminuir a atividade da proteína dependendo do sítio de fosforilação e da estrutura da proteína Figura 362 Árvore evolutiva de algumas proteínascinase selecionadas Uma célula de um organismo eucarioto superior contém centenas dessas enzimas e o genoma humano codifica mais de 500 dessas moléculas Observe que apenas algumas dessas moléculas aquelas discutidas neste livro estão representadas 156 PARTE I Introdução à célula normalmente existem em uma conformação inativa na qual uma tirosina fosforilada pró xima ao Cterminal está ligada ao domínio SH2 e o domínio SH3 está ligado ao peptídeo interno de modo a distorcer o sítio ativo da enzima ajudando a mantêla inativa Como mostrado na Figura 364 a ativação da cinase envolve pelo menos duas ativações específicas a remoção do fosfato da porção Cterminal e a ligação do domí nio SH3 por uma proteína ativadora específica Dessa maneira a ativação da cinase Src significa a completude de um conjunto particular de eventos distintos localizados em um nível superior da via de sinalização Figura 365 Assim a família de cinases Src atua como integradores de sinais específicos contribuindo para os eventos da rede de processamento de informações que permite a combinação de respostas úteis à célula em diferentes condições Proteínas que ligam e hidrolisam GTP são reguladores celulares onipresentes Temos descrito como a adição e a remoção de grupos fosfato a uma proteína pode ser utilizada pela célula para controlar a atividade da proteína No exemplo discutido an teriormente uma cinase transfere uma molécula de ATP para a cadeia lateral de um aminoácido da proteínaalvo As células eucarióticas também possuem outro meio de controlar a atividade de uma proteína pela adição e remoção de grupos fosfato Nesse caso o fosfato não é ligado diretamente à proteína ele faz parte do nucleotídeo guani na GTP que se liga com alta afinidade a uma classe de proteínas chamada proteínas de ligação ao GTP Em geral as proteínas reguladas dessa forma estão na sua conformação ativa quando ligadas a GTP A perda do grupo fosfato ocorre quando o GTP ligado é hi drolisado a guanosina difosfato GDP guanosine diphosphate em uma reação catalisada pela própria proteína e no estado ligado ao GDP a proteína está inativa Assim proteínas que ligam GTP são dispositivos de ativaçãoinativação cuja atividade é determinada pela presença ou ausência de um fosfato adicional na molécula de GDP ligada Figura 366 As proteínas de ligação ao GTP também chamadas de GTPases devido à hidróli se do GTP que elas catalisam compreendem uma grande família de proteínas que apre sentam variações no mesmo domínio globular de ligação ao GTP Quando uma molécula de GTP ligada com alta afinidade à enzima é hidrolisada em GDP esse domínio sofre uma alteração conformacional que inativa a proteína A estrutura tridimensional de um membro típico dessa família a GTPase monomérica denominada Ras é mostrada na Figura 367 Figura 363 A estrutura do domínio da família Src de proteínascinase mapeada ao longo da sequência de aminoácidos Para a estrutura tridimen sional da proteína Src ver Figura 313 NH2 COOH 500 aminoácidos Ácido graxo SH3 SH2 Domínios da cinase A CINASE AGORA PODE FOSFORILAR A TIROSINA E SE ATIVAR LIGANTES ATIVADORES SE ASSOCIAM AO DOMÍNIO SH3 REMOÇÃO DO FOSFATO RELAXA A ESTRUTURA INATIVA ATIVA SH2 SH3 Domínio da cinase Tirosina Ligantes ativadores Cinase ativada P P P P Pi Figura 364 A ativação de uma proteínacinase do tipo Src por dois eventos sequenciais Conforme descrito no texto a necessidade de múltiplos even tos anteriores para o desencadeamento do processo de ativação permite que uma cinase atue como um integrador de sinais Animação 311 Adaptada de SC Harrison et al Cell 112737740 2003 Com permissão de Elsevier CAPÍTULO 3 Proteínas 157 A proteína Ras tem um importante papel na sinalização celular discutido no Ca pítulo 15 Na sua forma ligada a GTP ela é ativa e estimula uma cascata de fosforilação de proteínas na célula Na maior parte do tempo no entanto essa proteína se encontra na sua forma inativa ligada à GDP Ela se torna ativa quando troca seu GDP por uma molécula de GTP em resposta a sinais extracelulares como fatores de crescimento que se ligam aos receptores da membrana plasmática ver Figura 1547 As proteínas reguladoras GAP e GEF controlam a atividade de proteínas de ligação ao GTP por determinar se uma molécula de GTP ou de GDP está ligada As proteínas de ligação ao GTP são controladas por proteínas reguladoras que determinam se o GTP ou o GDP está ligado da mesma maneira que proteínas fosforiladas são ativadas e inativadas por proteínascinase e proteínasfosfatase Assim a proteína Ras é inativada pela proteína ativadora de GTPase GAP GTPaseactivating protein a qual se liga à proteína Ras e induz a hidrólise de sua molécula de GTP a GDP que permanece ligado com alta afinida de e a fosfato inorgânico Pi que é rapidamente dissociado A proteína Ras permanece em seu estado inativo na conformação com o GDP ligado até que ela encontre um fator de troca do nucleotídeo guanina GEF guanine nucleotide exchange factor que se liga a GDP Ras e ela liberar seu GDP Como o sítio vazio de ligação do nucleotídeo é imediatamente preenchido por uma molécula de GTP GTP está presente em maior concentração em re lação ao GDP nas células o GEF ativa a Ras indiretamente pela adição do fosfato removido pela hidrólise de GTP De certo modo as funções de GAP e de GEF são análogas àquelas das proteínasfosfatase e proteínascinase respectivamente Figura 368 Proteínas podem ser reguladas pela adição covalente de outras proteínas As células contêm uma família especial de pequenas proteínas cujos membros são adi cionados de modo covalente a outras proteínas e determinam a atividade ou destino dessa proteína a qual se ligam Em cada caso a terminação carboxila de pequena proteína se liga ao grupo amino de uma cadeia lateral de lisina da proteínaalvo por meio de uma ligação isopeptídica A primeira dessas proteínas a ser descoberta e também a que é utilizada com maior frequência é a ubiquitina Figura 369A A ubiquitina pode ser ligada à proteínaalvo de modo covalente de diferentes formas com diferentes significa dos para a célula A forma mais frequente de ligação de ubiquitina dá origem a cadeias de poliubiquitina na qual uma vez que a primeira molécula de ubiquitina tenha sido ligada à proteínaalvo cada molécula subsequente de ubiquitina se liga ao resíduo de Lis48 da ubiquitina anterior formando uma cadeia de moléculas de ubiquitina ligadas ao resíduo Lis48 e conectadas a uma única cadeia lateral de lisina da proteínaalvo Essa forma de poliubiquitina promove o deslocamento da proteínaalvo para o interior de um proteas somo onde ela é digerida em pequenos peptídeos ver Figura 684 Em outros exemplos apenas uma molécula de ubiquitina é adicionada à proteínaalvo Algumas proteínas alvo são ainda modificadas por cadeias diferentes de poliubiquitina Essas modificações têm diferentes consequências funcionais para a proteína marcada Figura 369B Figura 365 Como uma proteínacinase tipo Src atua como um integrador de si nais A interrupção de uma interação de inibição representada pelo domínio SH3 verde ocorre quando sua ligação à região conectora representada em laranja é substituída pela ligação de alta afinidade de um ativador SINAIS RECEBIDOS Uma proteínacinase tipo Src só se torna completamente ativa se a resposta para todas as questões acima for sim RESULTADO Esta ligação foi rompida Este fosfato foi adicionado Este fosfato foi removido P P Figura 366 Proteínas de ligação ao GTP enquanto interruptores molecula res A atividade da proteína de ligação ao GTP também chamada de GTPase geral mente requer a presença de uma molécula de GTP fortemente ligada interruptor ligado A hidrólise dessa molécula de GTP pela proteína de ligação ao GTP produz GDP e fosfato inorgânico Pi e induz a conversão da proteína em uma conforma ção distinta geralmente inativa A ativa ção do interruptor requer a dissociação do GDP de alta afinidade Essa etapa é lenta e pode ser acelerada por sinais específicos uma vez que o GDP é dissociado uma molécula de GTP se liga à proteína de forma rápida HIDRÓLISE DO GTP Proteína de ligação ao GTP ETAPA LENTA ETAPA RÁPIDA ATIVA INATIVA INATIVA ATIVA GDP GDP GTP GTP GDP GDP Pi GTP 158 PARTE I Introdução à célula Estruturas semelhantes são formadas quando outro membro da família de ubiqui tina como a proteína SUMO do inglês small ubiquitinrelated modifier é adicionado de modo covalente à cadeia lateral de um resíduo de lisina da proteínaalvo Conforme esperado todas essas modificações são reversíveis As células possuem grupos de en zimas que promovem a adição e a remoção de ubiquitina e de proteína SUMO e que agem sobre esses complexos covalentes desempenhando papéis análogos aos das pro teínascinase e proteínasfosfatase que adicionam e removem grupos fosfato das cadeias laterais de proteínas Um sistema complexo de conjugação de ubiquitinas é utilizado para marcar proteínas Como as células selecionam as proteínasalvo para a adição de ubiquitinas Na etapa inicial a terminação carboxila da ubiquitina deve ser ativada Essa ativação ocorre quan do uma proteína denominada enzima de ativação de ubiquitina E1 utiliza a energia da hidrólise de uma molécula de ATP para se ligar à ubiquitina por meio de uma ligação covalente de alta energia uma ligação tioéster Então a enzima E1 transfere essa mo lécula de ubiquitina ativada para um conjunto de enzimas de conjugação de ubiquitinas E2 cada qual atuando em conjunto com um grupo de proteínas acessórias E3 deno minadas ubiquitinasligase Existem aproximadamente 30 enzimas E2 distintas mas estruturalmente similares nos mamíferos e centenas de proteínas E3 diferentes que formam complexos com enzimas E2 específicas A Figura 370 ilustra como esse processo é utilizado para a marcação de proteínas para a degradação no proteassomo Mecanismos semelhantes são utilizados para a li gação de ubiquitina e SUMO a outros tipos de proteínasalvo Aqui a ubiquitinaligase se liga às moléculas específicas de sinalização de degradação chamadas degrons pre sentes nos substratos proteicos auxiliando as enzimas E2 a formarem a cadeia de po liubiquitina ligada ao resíduo de lisina da proteínaalvo Esta cadeia de poliubiquitina na proteínaalvo será então reconhecida para um receptor específico no proteassomo promovendo a degradação da proteínaalvo As ubiquitinasligase distintas reconhe cem diferentes sinais de degradação marcando diferentes subconjuntos de proteínas intracelulares para a degradação frequentemente em resposta a sinais específicos ver Figura 686 P P P COOH NH2 Hélice interruptora Sítio de hidrólise de GTP GTP Figura 367 Estrutura da proteína Ras em sua forma ligada ao GTP Essa proteína GTPase monomérica ilustra a estrutura de um domínio de ligação de GTP presente na grande família de proteínas que ligam GTP As regiões mostradas em vermelho alteram sua conformação quando a molécula de GTP é hidrolisada a GDP e a fosfato inorgânico o GDP permanece ligado à proteína enquanto o fosfato inorgânico é liberado A função princi pal da hélice interruptora nas proteínas rela cionadas a Ras é explicada no texto ver Figura 372 e Animação 157 ATIVADA SINAL RECEBIDO SINAL EMITIDO ATIVADA SINAL RECEBIDO SINAL EMITIDO SINALIZAÇÃO MEDIADA PELA PROTEÍNA FOSFORILADA SINALIZAÇÃO MEDIADA POR PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO GTP PROTEÍNA CINASE PROTEÍNA FOSFATASE GAP GEF INATIVADA INATIVADA P Pi Pi ATP GTP GTP ADP GDP GDP Figura 368 Uma comparação entre dois principais mecanismos de sinalização intracelular em células eucarióticas Em ambos os casos a proteína sinalizadora é ativada pela adição de um grupo fosfato e inativada pela remoção desse fosfato Observe que a adição de um fosfato a uma proteína também pode ter um efeito inibitório Adaptada de ER Kantrowitz e WN Lipscomb Trends Biochem Sci 155359 1990 CAPÍTULO 3 Proteínas 159 Complexos proteicos com partes intercambiáveis aumentam a eficiência da informação genética A ubiquitinaligase SCF é um complexo proteico que se liga a diferentes proteínasalvo em momentos distintos do ciclo celular adicionando covalentemente cadeias poliu biquitina a seus alvos Essa estrutura com formato semicircular é composta por cinco subunidades proteicas nas quais a maior delas atua como estrutura base sobre a qual o restante do complexo é formado A estrutura revela um mecanismo notável Figura 371 Em uma das terminações da estrutura semicircular está localizada a enzima E2 de conjugação de ubiquitina Na outra extremidade localizase um braço de ligação de substrato a subunidade conhecida como proteína Fbox Essas duas subunidades são separadas em uma distância de 5 nm Quando o complexo proteico é ativado a proteína Fbox se liga a um local específico da proteínaalvo posicionando essa proteína no espa ço entre as duas extremidades da estrutura semicircular de forma que algumas das suas cadeias laterais de lisina entrem em contato com a enzima de conjugação de ubiquitina A enzima pode então catalisar a adição repetida de ubiquitina a essas lisinas ver Figura 371C formando as cadeias de poliubiquitina que marcam as proteínasalvo para a de gradação rápida no proteassomo Figura 369 Marcação de proteínas pela ubiquitina A Estrutura tridi mensional da ubiquitina uma pequena proteína composta por 76 aminoácidos Uma família específica de enzimas promo ve a ligação da terminação carboxila da ubiquitina à cadeia lateral de um resíduo de lisina da proteínaalvo formando uma ligação isopeptídica B Alguns padrões de modificação com significados específicos para a célula Observe que os dois tipos de poliubiquitinação diferem na forma como as moléculas de ubiquitina estão unidas A ligação por intermédio da Lys48 dire ciona a proteínaalvo para a degradação pelo proteassomo ver Figura 684 e a ligação feita pela Lys63 apresenta outros significados As marcações com ubiquitina são lidas por proteínas que reconhecem especificamente cada tipo de modificação Reparo do DNA Degradação proteossômica Endocitose Regulação de histonas MONOUBIQUITINAÇÃO MULTIUBIQUITINAÇÃO POLIUBIQUITINAÇÃO B A N Lys48 Lys63 Ubiquitina C O HN HC Ligação isopeptídica Cadeia lateral de uma lisina da proteínaalvo Lys48 Lys63 E1 E2 E2 E2 E1 E1 SH E1 SH SH S C O S C O S C O COO Ubiquitina Enzima de ativação de ubiquitinas Ligação a uma enzima de conjugação de ubiquitinas Enzima de conjugação de ubiquitinas ativada por uma ubiquitina A B NH2 E3 E2 E3 NH2 Proteínaalvo ligada a uma cadeia poliubiquitina Primeira molécula de ubiquitina ligada à proteínaalvo Proteínaalvo ligada a uma ubiquitinaligase Sinal de degradação na proteínaalvo Grupo amino ε de uma cadeia lateral de lisina ATP AMP P P Figura 370 A marcação de proteínas com ubiquitina A A extremidade Cterminal de uma ubiquitina é inicialmente ativada pela ligação tioéster de alta energia a uma cadeia lateral de cisteína de uma proteína E1 Essa reação requer ATP e apresenta um intermediário covalente AMPubiquitina A ubiquitina ativa da em E1 também chamada de enzima de ativação de ubiquitina é então transferida à cisteína de uma molécula E2 B A adição de uma cadeia poliubiquiti na a uma proteínaalvo Nas células de mamíferos existem centenas de complexos E2E3 distintos As enzimas E2 são denominadas enzimas de conjugação de ubiquitina As enzimas E3 são chamadas de ubiquitinasligase Adaptada de DR Knighton et al Science 253407414 1991 160 PARTE I Introdução à célula Dessa forma proteínas específicas são marcadas para uma degradação rápida em resposta a sinais específicos colaborando no andamento do ciclo celular discutido no Capítulo 17 Com frequência a marcação para a destruição envolve a criação de um pa drão específico de fosforilação na proteínaalvo necessário para o seu reconhecimento pela subunidade Fbox A marcação também requer a ativação de uma ubiquitinaligase SCF que contenha o braço de ligação ao substrato apropriado Muitos desses braços as subunidades Fbox são intercambiáveis no complexo proteico ver Figura 371B e exis tem mais de 70 genes humanos que os codificam Como enfatizado anteriormente uma vez que uma proteína bem adaptada te nha evoluído sua informação genética tende a ser duplicada para gerar uma família de proteínas correlatas Dessa forma por exemplo não existem apenas diversas proteínas Fbox tornando possível o reconhecimento de diferentes conjuntos de proteínasalvo mas também uma família de proteínas de suporte conhecidas como culinas que deu origem à família de ubiquitinasligase do tipo SCF Um complexo proteico como a ubiquitinaligase SCF com suas partes intercambiá veis torna o uso da informação genética nas células mais eficiente Esse princípio também promove a evolução rápida uma vez que novas funções podem ser selecionadas para todo o complexo simplesmente pelo uso de versões alternativas de suas subunidades As ubiquitinasligase compõem uma família variada de complexos proteicos Al guns desses complexos são muito maiores e mais elaborados que SCF mas suas funções enzimáticas básicas são conservadas Figura 371D Uma proteína de ligação ao GTP ilustra como grandes movimentos proteicos podem ser originados As estruturas detalhadas determinadas para um membro da família de proteínas de li gação ao GTP a proteína EFTu fornecem um bom exemplo de como alterações alosté ricas na conformação de proteínas podem originar grandes movimentos por meio da amplificação de pequenas alterações conformacionais localizadas Como será discutido no Capítulo 6 a EFTu é uma molécula abundante que serve como um fator de alon gamento EF elongation factor na síntese de proteínas levando cada aminoaciltRNA RNA transportador para o ribossomo EFTu contém um domínio semelhante à Ras ver Figura 367 e a molécula de tRNA forma um complexo de alta afinidade com a Figura 371 Estrutura e modo de ação da ubiquitinaligase SCF A Estrutura do complexo de cinco subunidades da ubiquitina ligase incluindo a enzima E2 de conjugação de ubiquitina Quatro proteínas compõem a região E3 A proteína representada aqui como proteína adaptadora 1 é a proteína RbxHrt1 a proteína adaptadora 2 é a proteína Skp1 e a culina é a proteína Cul1 Uma das diferentes proteínas Fbox completa o complexo B Comparação do mesmo complexo com dois braços de ligação de substrato diferentes as proteínas Fbox Skp2 acima e btrCP1 abaixo respectivamente C Ligação e ubiquitinação de uma proteína alvo pela ubiquitinaligase SCF Se conforme indicado uma cadeia de moléculas de ubiquiti na é adiciona à mesma lisina da proteínaalvo essa proteína fica marcada para a destruição rápida pelo proteassomo D Comparação da estrutura do complexo SCF parte inferior com a imagem de microscopia de baixa resolução de uma ubiquitinaligase chamada de complexo promotor de anáfase APCC parte superior em mesma escala APCC é um complexo gran de composto por 15 proteínas Conforme dis cutido no Capítulo 17 a adição de ubiquitinas mediada por esse complexo controla as etapas posteriores da mitose Esse complexo possui relação evolutiva distante com SCF e possui uma subunidade culina verde localizada na região lateral direita do complexo apenas par cialmente visível nesta orientação As proteínas E2 não estão representadas na imagem mas seus sítios de ligação estão indicados em laran ja assim como os sítios de ligação ao substrato em lilás A e B adaptada de G Wu et al Mol Cell 1114451456 2003 Com permissão de Elsevier D adaptada de P da Fonseca et al Nature 470274278 2011 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd A B C D Proteínaalvo LIGAÇÃO DA PROTEÍNAALVO Ubiquitina Proteína poliubiquitinada marcada para a degradação Ubiquitinaligase Dois de diversos braços de ligação de substratos possíveis Proteína Fbox braço de ligação ao substrato Proteína adaptadora 2 Proteína adaptadora 1 Proteína de suporte culina Enzima E2 de conjugação de ubiquitinas Ligação de substrato Ligação de E2 APCC SCF 10 nm CAPÍTULO 3 Proteínas 161 forma ligada ao GTP Essa molécula de tRNA pode transferir seu aminoácido à cadeia po lipeptídica nascente apenas após a hidrólise e dissociação do GTP ligado à EFTu Uma vez que essa hidrólise de GTP é induzida por um ajuste próprio do tRNA à molécula de RNA mensageiro mRNA no ribossomo a EFTu serve como um fator de discriminação entre pareamentos corretos e incorretos de mRNA e tRNA ver Figura 665 Pela comparação da estrutura tridimensional de EFTu em suas formas ligadas a GTP e a GDP podemos ver como acontece o reposicionamento do tRNA A dissociação do grupo Pi que ocorre na reação GTP GDP Pi causa a mudança de alguns décimos de nanômetros no sítio de ligação de GTP assim como o faz na proteína Ras Esse sutil movi mento equivalente a algumas vezes o diâmetro de um átomo de hidrogênio causa uma mudança conformacional que se propaga ao longo de um segmento crucial de ahélice chamado de hélice interruptora no domínio do tipo Ras da proteína A hélice interruptora parece servir como uma dobradiça que se liga a um sítio específico de outro domínio da molécula mantendo a proteína em uma conformação fechada A mudança conforma cional desencadeada pela hidrólise de GTP promove a dissociação da hélice interruptora permitindo que os domínios separados da proteína possam se afastar em uma distância de cerca de 4 nm Figura 372 Isso libera a molécula de tRNA possibilitando que o ami noácido ligado a ela seja utilizado Figura 373 Podese observar por esse exemplo como as células exploram uma simples mu dança química que ocorre na superfície de um pequeno domínio proteico para criar um movimento 50 vezes maior As mudanças conformacionais drásticas desse tipo também ocorrem nas proteínas motoras como discutiremos a seguir As proteínas motoras geram grandes movimentos nas células Já vimos como mudanças conformacionais nas proteínas têm um papel central na regu lação de enzimas e na sinalização celular Vamos discutir agora as proteínas cuja função principal é mover outras moléculas Essas proteínas motoras geram as forças responsá veis pela contração muscular e também pelos movimentos celulares como rastejamento e nado As proteínas motoras também realizam movimentos sutis no interior das células ajudam a mover os cromossomos para os polos opostos da célula durante a mitose dis cutido no Capítulo 17 movimentam organelas ao longo de trilhas moleculares dentro da célula discutido no Capítulo 16 e deslocam enzimas ao longo da fita de DNA durante a síntese de uma nova molécula de DNA discutido no Capítulo 5 Todos esses processos fundamentais dependem de proteínas que operam como máquinas geradoras de força Como essas máquinas trabalham Em outras palavras como as células utilizam mudanças na forma das proteínas para gerar movimentos ordenados Se por exemplo uma proteína precisa moverse ao longo de uma linha estreita como a fita de DNA ela poderá fazêlo passando por uma série de mudanças conformacionais como ilustrado na Figura 374 No entanto sem a orientação dessas mudanças em uma sequência orde Aminoácido ligado ao tRNA tRNA EFTu GTP Figura 373 Molécula de aminoaciltRNA ligada a EFTu Observe que a proteína ligada bloqueia o uso do aminoácido ligado ao tRNA verde para a síntese de proteínas até que hidrólise do GTP desencadeie as alterações conformacionais mostradas na Figura 372C promovendo a dissociação do complexo proteínatRNA EFTu é uma proteína bacteriana entretanto proteínas muito similares existem em eucariotos nos quais são chamadas de EF1 Animação 312 Coordenadas determinadas por P Nis sen et al Science 27014641472 1995 Código PDB 1B23 B Domínio 1 P P P Domínio 3 Domínio 2 P P GDP ligado G G HOOC NH2 Hélice interruptora GTP A Sítio de ligação do tRNA Sítio de ligação de GTP Hidrólise do GTP Liberação do tRNA Hélice interruptora Figura 372 Grande mudança conformacional da EFTu causada pela hidrólise de GTP A e B Estrutura tridimensional de EFTu ligada ao GTP O domínio na parte superior da figura tem uma estrutura similar à da proteína Ras e sua ahélice em vermelho é a hélice interruptora que se move após a hidrólise do GTP C A alteração na conformação da hélice interruptora do domínio 1 permite que os domínios 2 e 3 girem como uma unidade cerca de 90 na direção do observador o que libera o tRNA ligado à estrutura ver também Figura 373 A adaptada de H Berchtold et al Nature 365126132 1993 Com permis são de Macmillan Publishers Ltd B cortesia de Mathias Sprinzl e Rolf Hilgenfeld Código PDB 1EFT 162 PARTE I Introdução à célula nada elas serão perfeitamente reversíveis e a proteína poderá vagar ao acaso de um lado para outro ao longo da linha Podemos considerar essa situação de outra maneira Uma vez que o movimento direcionado de uma proteína realiza trabalho as leis da termodi nâmica discutidas no Capítulo 2 impõem que tal movimento utilize energia livre de al guma outra fonte caso contrário a proteína poderia ser utilizada como uma máquina de movimento contínuo Então sem um aporte de energia a molécula de proteína poderá apenas vagar sem propósito Como então uma série de mudanças conformacionais pode se tornar unidirecio nal Para forçar que todo o ciclo proceda em uma única direção basta apenas que uma das mudanças conformacionais seja irreversível Para a maioria das proteínas que são capazes de se deslocar em uma direção por longas distâncias isso é conseguido acoplan dose a mudança conformacional à hidrólise de uma molécula de ATP fortemente liga da à proteína Esse mecanismo é semelhante àquele já descrito que provoca mudanças alostéricas na forma da proteína por meio da hidrólise de GTP Uma vez que uma quan tidade razoável de energia livre é liberada quando o ATP ou GTP é hidrolisado é pouco provável que uma proteína que liga nucleotídeos sofra uma mudança conformacional reversível já que isso implicaria também na reversão da hidrólise de ATP adicionando se um grupo fosfato ao ADP para formar ATP No modelo mostrado na Figura 375A a ligação de ATP a uma proteína motora promove a transição da conformação 1 para a conformação 2 O ATP ligado é então hi drolisado para produzir ADP e Pi causando a mudança da conformação 2 para a con formação 3 Finalmente a liberação do ADP e do Pi para o meio leva a proteína de volta à conformação 1 Uma vez que a transição 2 3 é promovida pela energia derivada da hidrólise do ATP essa série de mudanças conformacionais será efetivamente irreversível Assim o ciclo inteiro acontecerá em uma única direção fazendo a proteína se deslocar continuamente para a direita nesse exemplo Diversas proteínas motoras geram movimentos direcionados pelo uso de polias uni direcionais incluindo a proteína motora miosina que se desloca ao longo dos filamentos 1 2 3 Figura 374 Deslocamento de uma proteína alostérica Apesar das suas três diferentes conformações permitirem que ela se mova aleatoriamente para frente e para trás enquanto ligada a um filamento a proteína não pode se mover uniforme mente em uma única direção Figura 375 Como uma proteína pode se deslocar em uma única direção A Uma proteína motora alostérica ativada pela hidrólise de ATP A transição entre as três conformações distintas inclui uma etapa controlada pela hidrólise de uma molécula de ATP ligada gerando uma polia unidire cional que torna todo o ciclo essencialmen te irreversível Por meio de repetidos ciclos a proteína se move continuamente para a di reita ao longo do filamento B Visualização direta de uma proteína motora miosina de deslocando utilizando microscopia de força atômica de alta velocidade o tempo trans corrido entre cada etapa é menor que 05 segundo ver Animação 163 B modifica da de N Kodera et al Nature 4687276 2010 Com permissão de Macmillan Publi shers Ltd A A ADP HIDRÓLISE LIBERAÇÃO LIGAÇÃO DE ATP 1 2 3 1 Direção do movimento A Miosina V Actina 50 nm P P P P P P P P P B A CAPÍTULO 3 Proteínas 163 de actina Figura 375B e a proteína cinesina que se desloca ao longo dos microtúbulos ambas discutidas no Capítulo 16 Esses movimentos podem ser rápidos algumas proteí nas motoras envolvidas na replicação de DNA as DNAhelicases deslocamse ao longo da fita de DNA a uma velocidade equivalente a mil nucleotídeos por segundo Os transportadores ligados à membrana utilizam energia para bombear moléculas através das membranas Vimos até agora como as proteínas passam por alterações conformacionais alostéricas e podem atuar como microprocessadores família de cinases Src como fatores de asso ciação EFTu e como geradores de força mecânica e movimento proteínas motoras As proteínas alostéricas também podem usar energia derivada da hidrólise de ATP de gradientes iônicos ou de processos de transporte de elétrons para bombear íons especí ficos ou pequenas moléculas através da membrana Iremos considerar aqui um exemplo que será discutido com mais detalhes no Capítulo 11 Os transportadores ABC ATPbinding cassette transporters são uma importante classe de proteínas bombeadoras ligadas à membrana Em humanos pelo menos 48 ge nes codificam tais proteínas Esses transportadores agem principalmente na exportação de moléculas hidrofóbicas do citoplasma atuando na remoção de moléculas tóxicas na superfície da mucosa de células do trato intestinal por exemplo ou na barreira hematen cefálica O estudo dos transportadores ABC é de grande interesse para a área médica pois a superprodução de proteínas dessa classe de transportadores contribui para a resistên cia de células tumorais a fármacos quimioterápicos Nas bactérias os mesmos tipos de proteínas atuam principalmente na captação de nutrientes essenciais para a célula Um transportador ABC típico contém um par de domínios transmembrana ligados a um par de domínios de ligação a ATP localizados logo abaixo da membrana plasmática Assim como nos exemplos discutidos anteriormente a hidrólise das moléculas ligadas de ATP desencadeia alterações conformacionais na proteína transmitindo forças que fazem o transportador mover sua molécula ligada através da bicamada lipídica Figura 376 Os humanos inventaram diversos tipos de bombas mecânicas e não deveria ser surpresa que as células também contenham bombas ligadas à sua membrana que funcio nam de outras maneiras Entre as mais notáveis estão as bombas rotativas que acoplam Figura 376 O transportador ABC uma máquina proteica que bombeia molé culas através da membrana A Como essa grande família de transpor tadores bombeia moléculas para o interior de uma célula bacteriana Conforme indi cado a ligação de duas moléculas de ATP induz a associação dos dois domínios de ligação a ATP promovendo a abertura do canal para a face externa da célula A ligação de uma molécula de substrato na face extracelular do complexo proteico desencadeia a hidrólise do ATP seguida pela liberação de ADP o que abre o poro de acesso ao citoplasma então a bomba retorna ao estado inicial para um novo ciclo B Como discutido no Capítulo 11 em eucariotos ocorre um processo inverso levando ao bombeamento das moléculas de substrato para fora da célula C A estrutura do transportador ABC bac teriano ver Animação 115 C de RJ Dawson e KP Locher Nature 443180 185 2006 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Código PDB 2HYD CITOSOL ATP ATP ATP ADP Pi 2 2 Pequena molécula Domínios ATPase CITOSOL ATP ATP ATP ADP Pi 2 2 Pequena molécula Domínios ATPase A TRANSPORTADOR ABC BACTERIANO C B TRANSPORTADOR ABC EUCARIÓTICO 164 PARTE I Introdução à célula a hidrólise de ATP ao transporte de íons H prótons Essas bombas se assemelham a pequenas turbinas e são usadas para acidificar o interior de lisossomos e de outras orga nelas de células eucarióticas Assim como outras bombas de íons que criam gradientes iônicos elas podem funcionar ao contrário para catalisar a reação ADP Pi ATP se hou ver um acentuado gradiente de íons a serem transportados através da membrana Uma dessas bombas a ATPsintase aproveita o gradiente de concentração de prótons produzido pelo processo de transporte de elétrons para produzir a maioria do ATP utilizado pelos organismos vivos Essa bomba ubíqua tem um papel central na conversão de energia e discutiremos sua estrutura tridimensional e seu mecanismo de ação no Capítulo 14 As proteínas frequentemente formam complexos grandes que funcionam como máquinas proteicas As proteínas grandes formadas por diversos domínios são capazes de desempenhar funções mais elaboradas que proteínas pequenas e monoméricas No entanto os gran des complexos proteicos compostos por diversas proteínas unidas por meio de ligações não covalentes desempenham as funções mais impressionantes Agora que se tornou possível reconstruir a maior parte dos processos biológicos em sistemas livres de células em laboratório ficou claro que cada um dos principais processos de uma célula como a replicação de DNA a síntese de proteínas a formação de vesículas ou a sinalização transmembrana é catalisado por um conjunto altamente organizado de 10 ou mais proteínas interligadas Na maioria dessas máquinas proteicas uma reação energetica mente favorável como a hidrólise de nucleotídeos trifosfato ATP ou GTP induz uma série ordenada de mudanças conformacionais em uma ou mais subunidades proteicas permitindo ao complexo moverse de forma coordenada Assim as enzimas podem ser posicionadas diretamente no local onde são necessárias conforme a máquina catalisa uma sucessão de reações Figura 377 Isso é o que acontece por exemplo na síntese de proteínas em um ribossomo discutido no Capítulo 6 ou na replicação do DNA em que um grande complexo multiproteico movimentase rapidamente ao longo do DNA discutido no Capítulo 5 As células desenvolveram máquinas proteicas pela mesma razão que os humanos inventaram máquinas mecânicas e eletrônicas Para realizar qualquer tipo de tarefa as etapas temporal e espacialmente coordenadas por processos interligados são muito mais eficientes do que o uso sequencial de muitas ferramentas individuais Proteínas de suporte concentram conjuntos de proteínas que interagem entre si Conforme os cientistas aprenderam mais sobre os detalhes da biologia celular eles reconhe ceram o crescente grau de sofisticação da química celular Não apenas sabemos que as má quinas proteicas desempenham papéis essenciais mas também se tornou claro que elas es tão frequentemente localizadas em pontos específicos no interior da célula associandose e tornandose ativas apenas no local e no momento em que são necessárias Por exemplo quando moléculas de sinalização extracelular se ligam a proteínas receptoras na membrana plasmática os receptores ativados com frequência recrutam um conjunto de proteínas para a superfície interna da membrana plasmática formando um grande complexo proteico que é responsável pela transmissão dos sinais recebidos discutido no Capítulo 15 Esses mecanismos frequentemente envolvem proteínas de suporte estrutural Essas proteínas possuem sítios de ligação para diversas outras proteínas e atuam como elemento de conexão para conjuntos específicos de proteínas que interagem entre si e as mantém em locais específicos no interior da célula Um exemplo são as proteínas de su porte rígidas como a culina na ubiquitinaligase SCF ver Figura 371 Outro exemplo ATP ATP ATP ADP ADP Pi Pi ADP Pi ATP ADP Pi Figura 377 Como as máquinas proteicas realizam funções complexas Essas máquinas são compostas por proteínas individuais que atuam em conjunto para desem penhar uma atividade específica Animação 313 O movimento dessas proteínas é frequentemente coordenado pela hidrólise de um nucleotídeo ligado como ATP ou GTP Alterações conformacionais alostéricas direcionais de proteínas controladas dessa manei ra frequentemente ocorrem em grandes complexos proteicos onde a atividade de diver sas moléculas proteicas distintas é coordenada pelos movimentos internos do complexo CAPÍTULO 3 Proteínas 165 são as grandes proteínas de suporte flexíveis que frequentemente revestem regiões espe cializadas da membrana plasmática Esse exemplo inclui a proteína Disclarge Dlg uma proteína com cerca de 900 aminoácidos que está presente em alta concentração logo abai xo de regiões especializadas da membrana plasmática de células epiteliais e nas sinapses A Dlg possui sítios de ligação para pelo menos sete outras proteínas distribuídos entre regiões mais flexíveis da cadeia polipeptídica Ela é uma proteína antiga e conservada em diversos organismos como esponjas vermes moscas e humanos O nome Dlg é deriva do do fenótipo mutante do organismo em que foi inicialmente descoberto as células dos discos imaginais do embrião de Drosophila com o gene mutante Dlg não param de se pro liferar no momento adequado produzem discos imaginais anômalos e maiores do que a estrutura normal e suas células epiteliais podem originar tumores Embora ainda não tenha sido estudada em detalhes acreditase que Dlg e um grande número de proteínas de suporte similares exerçam sua função como a proteína representada esquematicamente na Figura 378 Por meio da ligação de um conjunto específico de proteínas que interagem entre si essas proteínas de suporte podem au mentar a velocidade de reações essenciais e ao mesmo tempo confinar essas enzimas a regiões específicas das células Por razões semelhantes as células também utilizam moléculas de RNA de suporte conforme discutido no Capítulo 7 Várias proteínas são controladas por modificações covalentes que as mantêm em locais específicos no interior da célula Até agora descrevemos apenas algumas maneiras pelas quais as proteínas podem ser mo dificadas após a tradução Um grande número de outras modificações também ocorre sendo conhecidos mais de 200 tipos distintos Para dar uma ideia dessa variedade a Ta bela 33 apresenta alguns grupos modificadores com papel regulador conhecido Assim Figura 378 Como a proximidade promovida pelas proteínas de suporte pode acelerar a velocidade de reações nas células Neste exemplo longas regiões não organizadas da cadeia polipep tídica em uma grande proteína de suporte conectam uma série de domínios organi zados que ligam um conjunto de proteínas que reagem entre si As regiões não orga nizadas servem como conexões flexíveis que aumentam a velocidade das taxas de reação por causarem colisões rápidas e aleatórias entre todas as proteínas ligadas à proteína de suporte Para exemplos específicos de proteínas de conexão ver Figura 354 e Figura 1618 para moléculas de suporte de RNA ver Figura 749B Região não organizada Proteína de suporte Colisões rápidas Produto Proteínas interagindo Domínio organizado Proteína de suporte pronta para outro ciclo de reação TABELA 33 Algumas moléculas ligadas covalentemente a proteínas regulam a função proteica Grupo modificador Algumas funções predominantes Fosfato em resíduos de serina treonina ou tirosina Promove a associação da proteína em complexos proteicos maiores ver Figura 1511 Metila em resíduos de lisina Ajuda a estabelecer regiões específicas da cromatina pela formação de mono di ou trimetilisinas nas histonas ver Figura 436 Acetila em resíduos de lisina Ajuda a ativar genes na cromatina pela modificação de histonas ver Figura 433 Grupos palmitil em resíduos de cisteína A adição desse ácido graxo promove a associação da proteína à membrana ver Figura 1018 Nacetilglicosamina em resíduos de serina ou treonina Controla a atividade enzimática e expressão gênica na homeostasia da glicose Ubiquitina em resíduos de lisina A adição de uma ubiquitina regula o transporte de proteínas de membrana em vesículas ver Figura 1350 Uma cadeia poliubiquitina marca uma proteína para a degradação ver Figura 370 A ubiquitina é um polipeptídeo de 76 aminoácidos existem pelo menos 10 outras enzimas semelhantes à ubiquiti na nas células de mamíferos 166 PARTE I Introdução à célula como na adição de grupos fosfato e ubiquitina descritos anteriormente esses grupos são adicionados e removidos das proteínas de acordo com as necessidades da célula Sabese que um grande número de proteínas é modificado em mais de uma cadeia lateral de aminoácido com diferentes eventos reguladores causando diferentes padrões dessas modificações Um exemplo notório é a proteína p53 que tem papel central no controle da resposta celular a circunstâncias adversas ver Figura 1762 Através de um entre quatro tipos diferentes de adições moleculares essa proteína pode ser modifica da em 20 sítios distintos Como é possível um enorme número de combinações dessas 20 modificações distintas o comportamento da proteína pode em princípio ser alterado de diversas formas Essas modificações com frequência dão origem a sítios de ligação na proteína modificada e promovem a sua ligação a uma proteína de suporte em um local específico da célula conectando a proteína modificada por meio da proteína de supor te a outras proteínas necessárias a uma reação em um determinado local Cada conjunto de modificações covalentes em uma proteína pode ser considerado um código combinatório regulador Grupos modificadores específicos são adicionados ou removidos da proteína em resposta a sinais e esse código modifica então as pro priedades da proteína alterando sua atividade ou estabilidade a sua ligação a outras moléculas eou a sua localização específica no interior da célula Figura 379 Conse quentemente a célula consegue responder de forma rápida e com grande versatilidade às alterações nas suas condições ou no ambiente Uma complexa rede de interações de proteínas é a base da função celular Os biólogos celulares enfrentam diversos desafios na era atual rica em informações nas quais um grande número de sequências genômicas completas é conhecido Um desafio é a necessidade de dissecar e reconstruir cada uma das milhares de máquinas protei cas que existem em um organismo como o nosso Para entender esses notáveis com plexos proteicos cada um precisará ser reconstituído a partir de suas partes proteicas purificadas para que possamos estudar detalhadamente em um tubo de ensaio e sob condições controladas seu modo de operação livre de todos os outros componentes da célula Essa é uma tarefa árdua Mas agora sabemos que cada um desses subcomponen tes de uma célula também interage com outras macromoléculas criando uma grande rede de interações proteínaproteína e proteínaácidos nucleicos por toda a célula Para entender a célula então será necessário analisar a maioria dessas outras interações Figura 379 Modificação de proteínas em múltiplos locais e seus efeitos A Uma proteína que apresente mais de uma modificação póstradução por adição em mais de uma das suas cadeias laterais de aminoácidos pode ser considerada uma proteína que apresenta um código combinatório regulador Grupos modifi cadores são adicionados e removidos em múltiplos domínios de uma proteína por meio de redes de sinalização e o código combinatório regulador resultante é inter pretado para alterar o comportamento de uma célula B O padrão de algumas das modificações covalentes da proteína p53 N C N C 50 aminoácidos O CÓDIGO É INTERPRETADO PROTEÍNA X LIGAÇÃO ÀS PROTEÍNAS Y E Z B ALGUMAS MODIFICAÇÕES CONHECIDAS DA PROTEÍNA p53 A UM CONJUNTO DE MODIFICAÇÕES COVALENTES DÁ ORIGEM AO CÓDIGO REGULADOR DE PROTEÍNAS DESLOCAMENTO PARA O PROTEASSOMO PARA DEGRADAÇÃO SINAIS MOLECULARES CONTROLAM A ADIÇÃO OU REMOÇÃO DE GRUPOS MODIFICADORES DESLOCAMENTO PARA A MEMBRANA PLASMÁTICA DESLOCAMENTO PARA O NÚCLEO ou ou ou eou eou eou eou Ac P U Fosfato Acetila Ubiquitina SUMO CAPÍTULO 3 Proteínas 167 Podemos ilustrar a ideia da complexidade das redes proteicas intracelulares com um exemplo particularmente bem estudado descrito no Capítulo 16 as várias dezenas de proteínas que interagem com o citoesqueleto de actina para controlar o comporta mento dos filamentos de actina ver Painel 163 p 906 A extensão de tais interações proteínaproteína também pode ser estimada de uma forma mais geral Uma grande quantidade de informações valiosas está agora disponí vel livremente na internet em bancos de dados de proteínas dezenas de milhares de es truturas tridimensionais de proteínas e milhões de sequências de proteínas derivadas de sequências de nucleotídeos de genes Os cientistas têm desenvolvido novos métodos de mineração de dados dessa grande fonte para aumentar nossa compreensão das célu las Em particular ferramentas de bioinformática têm sido combinadas com tecnologias de robótica entre outras para permitir que milhares de proteínas sejam investigadas em um único conjunto de experimentos Proteômica é o termo utilizado para descrever tais pesquisas focadas em análises de proteínas em larga escala em analogia ao termo genô mica utilizado para descrever a análise em larga escala de sequências de DNA e de genes Um método bioquímico baseado na marcação por afinidade e espectroscopia de massa tem se mostrado especialmente útil para a determinação de interações diretas de ligação entre diversas proteínas distintas em uma célula discutido no Capítulo 8 Os resultados são tabulados e organizados em bancos de dados disponíveis na internet Isso permite que um biólogo celular que esteja estudando um pequeno conjunto de proteínas descubra facilmente quais outras proteínas na mesma célula ligam e interagem com o conjunto de proteínas em estudo Quando representadas graficamente em um mapa de interação de proteínas cada proteína aparece como um retângulo ou um ponto na rede bidimensional com uma linha reta conectando as proteínas que se ligam uma à outra Quando centenas ou milhares de proteínas são representadas no mesmo mapa a rede de conexões se torna extremamente complicada ilustrando o grande desafio que é a compreensão da célula para os cientistas Figura 380 Os mapas menores subseções dos mapas citados anteriormente focados em algumas proteínas de interesse são muito mais úteis Descrevemos anteriormente a estrutura e o modo de ação da ubiquitinaligase SCF utilizandoa como exemplo para ilustrar como os complexos proteicos são forma dos por partes intercambiáveis ver Figura 371 A Figura 381 mostra a rede de intera ções proteínaproteína para cinco das proteínas que compõem esse complexo proteico em uma célula de levedura Quatro das subunidades que fazem parte da ligase estão localizadas no canto inferior direito da figura A subunidade restante a proteína Fbox que atua como o braço de ligação do substrato aparece como o conjunto de 15 produtos de diferentes genes que se ligam à proteína adaptadora 2 a proteína Skp1 Ao longo da parte superior e à esquerda da figura estão os conjuntos adicionais de interações protei cas marcados com sombreamento amarelo e verde conforme indicado esses conjuntos de proteínas atuam na origem da replicação do DNA no controle do ciclo celular na síntese da metionina no cinetocoro e na formação da ATPaseH vacuolar Utilizaremos essa figura para explicar como tais mapas de interações de proteínas são utilizados o que eles significam e o que não significam 1 Mapas de interações de proteínas são úteis para a identificação de funções corre latas de proteínas ainda não caracterizadas Por exemplo os produtos dos genes cuja existência foi apenas inferida até agora a partir da sequência genômica de le veduras que são as três proteínas na figura que não apresentam abreviação de três letras letras brancas começando com Y As três proteínas restantes no diagrama são proteínas Fbox que ligam Skp1 e provavelmente fazem parte da ubiquitinali gase atuando como braços de ligação de substrato reconhecendo diferentes alvos proteicos No entanto como discutiremos a seguir nenhuma dessas inferências pode ser considerada correta sem dados adicionais 2 Redes de interações de proteínas devem ser interpretadas com cuidado pois como a evolução utiliza a informação genética de um organismo de maneira eficiente a mesma proteína pode fazer parte de complexos proteicos distintos com diferen tes tipos de funções Dessa forma apesar de a proteína A se ligar à proteína B e a proteína B se ligar à proteína C as proteínas A e C não necessariamente atuam no mesmo processo Por exemplo sabemos a partir de estudos bioquímicos detalha Figura 380 Rede de interações proteína proteína em uma célula de levedura Cada linha que conecta dois pontos proteínas indica uma interação proteínaproteína De A Gui merá e M SalesPardo Mol Syst Biol 242 2006 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd 168 PARTE I Introdução à célula dos que as funções da proteína Skp1 no cinetocoro e na formação da ATPaseH vacuolar sombreado amarelo são independentes da sua função na ubiquitina ligase SCF De fato apenas as três funções restantes da Skp1 ilustradas no dia grama síntese de metionina regulação do ciclo celular e origem de replicação sombreado verde envolvem ubiquitinação 3 Em comparações entre espécies é provável que as proteínas que apresentam padrões de interações similares nos dois mapas de interações tenham a mesma função na célula Dessa forma conforme os cientistas geram mapas mais e mais detalhados para diversos organismos esses resultados se tornarão cada vez mais úteis na inferência de funções de proteínas As comparações desses mapas serão ferramentas particularmente importantes para decifrar as funções das proteínas humanas pois uma vasta quantidade de informações sobre as funções de proteí nas podem ser obtidas por meio da engenharia genética mutações e análises ge néticas de organismos experimentais como leveduras vermes e moscas que não são possíveis em organismos humanos O que o futuro reserva O número de proteínas diferentes em uma célula huma na provavelmente está na ordem de 10 mil cada uma interagindo com 5 a 10 parceiros distintos Apesar do grande progresso recente ainda não é possível afirmar que mesmo as células mais simples são compreendidas como a bactéria Mycoplasma que possui apenas cerca de 500 genes ver Figura 110 Como podemos então ter esperanças de compreender uma célula humana É óbvio que novos métodos bioquímicos serão es senciais no sentido que cada proteína em um conjunto de proteínas que interagem en Skp1 Cdc53 Hrt1 Cdc34 YLR224W Me130 Ctfl3 YDR306 YDR131 Mdm30 Skp2 Grr1 Cdc4 Yak1 Rcy1 Dla2 Ufb1 Hrt3 Swe1 Met31 Met32 Erd3 Met4 Met28 Orc2 Orc3 Orc1 Orc6 Orc5 Orc4 Cdc5 Rpt1 Cks1 Sic1 Cli1 Cli2 Cdc28 Okp1 Ctf19 Mit2 Cbf1 Cbf2 Mck1 Vma4 Vma8 Vma2 Tfp1 Ram1 Ram2 Mcm21 Cep3 SÍNTESE DE METIONINA Proteínas Fbox CINETOCORO FORMAÇÃO DA BOMBA ATPaseH VACUOLAR REGULADORES DO CICLO CELULAR ORIGEM DE REPLICAÇÃO Proteína adaptadora 2 Proteína adaptadora 1 Enzima E2 de conjugação à ubiquitina Proteína de suporte culina Das1 Figura 381 Mapa de algumas interações proteínaproteína da ubiquitinaligase SCF e outras proteínas na levedura S cerevisiae Os símbolos eou as cores utilizados para as cinco proteínas da ligase são os mesmos utilizados na Figura 371 Observe que 15 proteínas Fbox diferentes são mostradas roxo aquelas em letras brancas começando com Y são conhecidas a partir da sequência genômica como ORFs open reading frames Para detalhes adicionais con sultar o texto Cortesia de Peter Bowers e David Eisenberg UCLADOE Institute for Genomics and Proteomics UCLA CAPÍTULO 3 Proteínas 169 tre si deverá ser purificada e ter suas propriedades químicas e suas interações estudadas em tubos de ensaio Além disso ferramentas com maior capacidade de análise de redes de interação serão necessárias baseadas em modelos matemáticos e computacionais ainda não desenvolvidos como será enfatizado no Capítulo 8 Existem muitos e instigan tes desafios ainda remanescentes para as futuras gerações de biólogos celulares Resumo As proteínas podem formar dispositivos químicos bastante sofisticados cujas funções dependem em grande parte das propriedades químicas detalhadas de sua superfície Os sítios de ligação para ligantes são formados nas cavidades da superfície nas quais es tão precisamente posicionadas cadeias laterais de aminoácidos arranjadas a partir do enovelamento da proteína Da mesma maneira cadeias laterais de aminoácido normal mente não reativas podem ser ativadas sendo então capazes de formar e romper liga ções covalentes As enzimas são proteínas catalíticas que aceleram muito as reações pela ligação ao estado de transição de alta energia para uma reação específica elas também executam de forma simultânea catálise ácida e básica As taxas de reações de enzimas são com frequência tão rápidas que são limitadas apenas pela difusão Velocidades de reação podem então ser aumentadas apenas se as enzimas atuarem de modo sequencial em um substrato ligado a um complexo multienzimático ou se as enzimas e seus substratos esti verem ligados a proteínas de suporte ou ainda limitadas em um mesmo compartimento celular As proteínas mudam reversivelmente sua forma quando ligantes ligamse à sua superfície As mudanças alostéricas na conformação da proteína produzidas por um li gante afetam a ligação de um segundo ligante e esse acoplamento entre os dois ligantes ao sítio de ligação provê um mecanismo crucial para regular os processos da célula Por exemplo as vias metabólicas são controladas pela regulação por retroalimentação algu mas moléculas pequenas inibem e outras ativam enzimas da via As enzimas controladas dessa forma geralmente constituem complexos simétricos empregando mudanças confor macionais cooperativas para criar uma súbita resposta a mudanças nas concentrações do ligante que as regulam As mudanças na conformação das proteínas podem ser induzidas de maneira uni direcional pela liberação de energia química Nas mudanças alostéricas acopladas à hi drólise de ATP por exemplo as proteínas podem realizar trabalho gerando uma força mecânica ou movimentandose por longas distâncias em uma única direção As estruturas tridimensionais de proteínas têm revelado como uma pequena mudança local causada pela hidrólise de um nucleotídeo trifosfato é amplificada para criar mudanças maiores em outro local na proteína Isso significa que essas proteínas podem atuar como dispositi vos de ativaçãoinativação que transmitem informação como fatores de associação como motores ou como bombas ligadas a membranas Máquinas proteicas altamente eficientes são formadas pela incorporação de muitas moléculas de proteínas diferentes em grandes complexos que coordenam os movimentos alostéricos dos componentes individuais Esses complexos desempenham a maior parte das reações essenciais em uma célula As proteínas são alvo de diferentes modificações póstradução como a adição co valente de um grupo fosfato ou de um grupo acetila à cadeia lateral de um aminoácido específico A adição desses grupos modificadores é utilizada para regular a atividade da proteína alterando sua conformação sua ligação a outras proteínas e sua localização na célula Uma proteína típica em uma célula irá interagir com mais de outras cinco pro teínas Com ajuda da proteômica os biólogos podem analisar milhares de proteínas em um único conjunto de experimentos Um resultado importante é a produção de mapas detalhados de interações proteicas que almejam descrever todas as interações de ligação entre milhares de proteínas distintas de uma célula No entanto a compreensão desses mapas requer novos métodos bioquímicos pelos quais pequenos conjuntos de proteínas que interagem entre si possam ser purificados e caracterizados em detalhes Além disso novos métodos computacionais serão necessários para a análise desse grande volume de dados complexos O QUE NÃO SABEMOS Quais são as funções das cadeias polipeptídicas não enoveladas en contradas em quantidade surpre endentemente alta nas proteínas Quantos tipos de funções protei cas ainda não são conhecidos Quais são os métodos mais pro missores para a sua descoberta Quando os cientistas serão capa zes de a partir de uma sequência de aminoácidos determinar a estrutura tridimensional de uma proteína e suas propriedades quí micas Quais são as informações essenciais necessárias para se atin gir esse objetivo Existem meios para determinar de talhadamente a função de máqui nas proteicas que não requerem a purificação de cada um dos seus componentes em grande quan tidade para que as funções do complexo proteico possam ser re constituídas e estudadas utilizan do métodos químicos em tubos de ensaio Quais são as funções de dezenas de tipos de modificações covalen tes distintas de proteínas que são conhecidas além das modifica ções listadas na Tabela 33 Quais são essenciais para o funciona mento celular e por quê Por que amiloides são tóxicos para as células e como contribuem para doenças neurodegenerativas como o mal de Alzheimer 170 PARTE I Introdução à célula TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 31 Cada fita em uma folha b é uma hélice com dois ami noácidos por volta 32 Regiões de proteínas intrinsecamente desordenadas podem ser identificadas com a utilização de métodos de bio informática que identificam genes que codificam sequências de aminoácidos que possuem alto conteúdo hidrofóbico e baixa carga 33 As alças dos polipeptídeos que se projetam da super fície da proteína frequentemente formam sítios de ligação para outras moléculas 34 Uma enzima atinge a velocidade máxima em altas con centrações de substrato pois ela tem um número fixo de sí tios ativos onde o substrato pode se ligar 35 Altas concentrações de enzima acarretam um maior número de turnover 36 Enzimas que passam por transições alostéricas coope rativas são invariavelmente compostas por múltiplas subu nidades organizadas de modo simétrico 37 A adição e a remoção contínua de fosfatos pelas prote ínascinase e fosfatase é um gasto de energia uma vez que sua ação combinada consome ATP mas é uma consequên cia necessária da regulação efetiva por fosforilação Discuta as questões a seguir 38 Considere a seguinte afirmação Para produzir uma molécula de cada tipo possível de cadeia polipeptídica de 300 aminoácidos de comprimento seriam necessários mais átomos do que os que existem no universo Dado o tama nho do universo você acha que essa afirmação é correta Uma vez que contar átomos é bastante complicado con sidere o problema do ponto de vista das massas A massa observável do universo é estimada em cerca de 10 80 gramas com uma ordem de grandeza a mais ou a menos Assumin do que a massa média de um aminoácido é de 110 dáltons qual seria a massa de uma das cadeias polipeptídicas possí veis de 300 aminoácidos O valor final é maior que a massa do universo 39 Uma estratégia comum para a identificação de proteí nas com relação distante é a busca em bancos de dados uti lizando sequências de assinatura que indicam uma função proteica em particular Por que é melhor fazer essa busca com uma sequência curta do que com uma sequência longa Haverá mais chances de encontrar um hit no banco de dados com a sequência longa 310 Os motivos estruturais chamados de kelch são com postos por quatro fitas de folhas b organizadas na forma das lâminas de uma hélice propulsora Esse motivo é observado em repetições de 4 a 7 vezes formando uma bhélice ou do mínio de repetição kelch em proteínas compostas por múl tiplas subunidades Um desses domínios de repetição kelch está representado na Figura Q31 Você o classificaria como um domínio do tipo linear ou de encaixe N β6 β5 β4 β3 β2 β1 β7 C Figura Q31 O domínio repetido kelch da enzima galactose oxidase de D dendroides As sete lâminas individuais da bhélice propulsoras estão representadas em cores distintas e indicadas As porções Nterminal e Cterminal são indicadas por N e C 311 A titina com massa molecular de aproximadamente 3 10 6 dáltons é o maior polipeptídeo já descrito Moléculas de titina se estendem dos filamentos finos musculares até a placa Z onde agem como molas para manter os filamentos finos centrados nos sarcômeros A titina é composta por um grande número de sequências de 89 aminoácidos de imuno globulinas Ig repetidas cada uma enovelada em um domí nio de cerca de 4 nm de extensão Figura Q32A Digamos que você desconfie que esse comportamen to de mola da titina é causado pela perda sequencial de sua estrutura e enovelamento dos domínios Ig individuais Você testa essa hipótese utilizando um microscópio de força atômica que permite segurar uma terminação da molécula proteica e puxála com uma força mensurada com precisão Para um fragmento de titina contendo sete repetições do do mínio Ig esse experimento forneceu uma curva de força ver sus extensão com diversos picos mostrada na Figura Q32B Se o experimento for repetido em uma solução de ureia 8 M um desnaturante de proteínas os picos desaparecem e a extensão medida se torna muito maior para a mesma força aplicada Se o experimento é repetido após a proteína ter sido interligada com um tratamento com glutaraldeído mais uma vez os picos desaparecem mas a extensão se torna mui to menor para a mesma força aplicada 0 100 200 300 400 0 50 100 150 200 Extensão nm Força pN N C A B Figura Q32 O comportamento de mola da titina A Estrutura de um do mínio Ig individual B Força em piconewtons versus extensão em nanôme tros obtida por microscopia de força atômica A Os dados são consistentes com a sua hipótese de que o comportamento de mola da titina se deve à perda sequen CAPÍTULO 3 Proteínas 171 cial da estrutura dos domínios Ig individuais Explique seu raciocínio B A extensão de cada evento de desenovelamento dos do mínios tem a magnitude esperada Em uma cadeia polipep tídica estendida os aminoácidos são separados por interva los de 034 nm C Por que cada pico na Figura Q32B é um pouco maior que o pico anterior D Por que a força diminui tão abruptamente após cada pico 312 O vírus do sarcoma de Rous RSV Rous sarcoma vi rus possui um oncogene denominado Src que codifica uma tirosinacinase continuamente ativa que induz a pro liferação celular sem controle Normalmente a Src carrega um grupo ácido graxo miristoilato ligado que permite sua ligação à face citoplasmática da membrana plasmática Uma versão mutante da Src não permite a ligação do miristoilato e não se liga à membrana A infecção de células com RSV que codifica tanto a proteína Src normal quanto a mutante induz o mesmo aumento da atividade da proteína tirosinacinase mas a mutante Src não causa a proliferação celular A Assumindo que todas as proteínas Src normais estão ligadas à membrana plasmática e que a forma mutante Src está distribuída no citosol calcule suas concentrações re lativas nas adjacências da membrana plasmática Para esse cálculo assuma que a célula é uma esfera com raio r igual a 10 μm e que a proteína mutante Src está distribuída na cé lula enquanto a proteína normal Src está confinada a uma camada de 4 nm de espessura adjacente à membrana Para este problema considere que a membrana não tem espessu ra O volume da esfera é 43πr 3 B O alvo X para a fosforilação mediada pela Src está lo calizado na membrana Explique por que a proteína mutante Src não induz a proliferação celular 313 Um anticorpo se liga a outra proteína com uma constante de equilíbrio K igual a 5 10 9 M 1 Quando se liga a uma segunda proteína relacionada ele forma três li gações de hidrogênio a menos reduzindo sua afinidade de ligação em 119 kJmol Qual é o valor de K para a ligação da segunda proteína A variação de energia livre está rela cionada com a constante de equilíbrio por meio da equa ção G 23 RT log K onde R é 83 10 3 kJmol K e T é 310 K 314 A proteína SmpB se liga a tipos especiais de tRNA tmRNA para eliminar proteínas incompletas feitas a par tir de moléculas de mRNA truncadas em bactérias Se a li gação da SmpB ao tmRNA for representada graficamente como a fração de tmRNA ligado versus a concentração de SmpB obtémse uma curva simétrica em forma de S con forme mostrado na Figura Q33 Essa curva é a demonstra ção visual de uma relação bastante útil entre Kd e concen tração tendo uma grande aplicabilidade A expressão geral para a fração de ligante ligado é derivada da equação para Kd Kd Pr LPr L pela substituição de LTOT L por Pr L e rearranjo Como a concentração total de ligan te LTOT é igual à concentração de ligante livre L mais o ligante ligado Pr L a fração ligada é PrLLTOT PrPr Kd Figura Q33 Fração de tmRNA ligada versus con centração de SmpB 1011 109 107 105 0 025 05 075 10 Fração ligada Concentração de SmpB M Para SmpB e tmRNA a fração ligada SmpBtmRNA tmRNATOT SmpBSmpB Kd Utilizando essas rela ções calcule a fração de tmRNA ligada para concentrações de SmpB iguais a 10 4 Kd 10 3 Kd 10 2 Kd 10 1 Kd Kd 10 1 Kd 10 2 Kd 10 3 Kd e 10 4 Kd 315 Diversas enzimas seguem a cinética simples de MichaelisMenten que pode ser resumida pela equação velocidade Vmáx SS Km onde Vmáx velocidade máxima S concentração de subs trato e Km constante de Michaelis É instrutivo testar diferentes valores de S na equação para ver como a velocidade é afetada Quais os valores da ve locidade de reação para S igual a zero igual ao Km e igual à concentração infinita 316 A enzima hexocinase adiciona um fosfato à dglicose mas ignora a sua imagem especular a lglicose Suponha que você seja capaz de sintetizar uma hexocinase totalmente a partir de daminoácidos que são a imagem especular dos laminoácidos A Assumindo que uma enzima D irá se enovelar em uma conformação estável qual relação você esperaria com a enzima L normal B Você acha que uma enzima D irá adicionar um fosfato à lglicose e ignorar a dglicose 317 Como você acha que uma molécula de hemoglobina é capaz de ligar de maneira eficaz o oxigênio nos pulmões e liberálo também com alta eficiência nos tecidos 318 A síntese de nucleotídeos de purina AMP e GMP ocorre pela ramificação da via que começa com ribose5 fosfato R5P conforme mostrado esquematicamente na Figura Q34 Utilizando os princípios de inibição por retro alimentação proponha uma estratégia reguladora para essa via de forma a garantir quantidades suficientes de AMP e GMP e minimizar a síntese de intermediários AI quando houver quantidades adequadas de AMP e GMP R5P A B C D F G AMP H I GMP E Figura Q34 Representação esquemática da via metabólica de síntese de AMP e GMP a partir de R5P 172 PARTE I Introdução à célula REFERÊNCIAS Gerais Berg JM Tymoczko JL Stryer L 2011 Biochemistry 7th ed New York WH Freeman Branden C Tooze J 1999 Introduction to Protein Structure 2nd ed New York Garland Science Dickerson RE 2005 Present at the Flood How Structural Molecular Biology Came About Sunderland MA Sinauer Kuriyan J Konforti B Wemmer D 2013 The Molecules of Life Physical and Chemical Principles New York Garland Science Perutz M 1992 Protein Structure New Approaches to Disease and Therapy New York WH Freeman Petsko GA Ringe D 2004 Protein Structure and Function London New Science Press Williamson M 2011 How 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CROMOSSÔMICO E SUA COMPACTAÇÃO NA FIBRA DE CROMATINA ESTRUTURA E FUNÇÃO DA CROMATINA A ESTRUTURA GLOBAL DOS CROMOSSOMOS COMO OS GENOMAS EVOLUEM DNA cromossomos e genomas MECANISMOS GENÉTICOS BÁSICOS CAPíTulo 4 A vida depende da capacidade das células de armazenar recuperar e traduzir as instru ções genéticas necessárias para manter o organismo vivo Essa informação hereditária é passada de uma célula às suas célulasfilhas durante a divisão celular e de uma geração de um organismo a outra por meio de células reprodutoras Em todas as células vivas essas instruções são armazenadas nos genes os elementos que contêm a informação que determina as características de uma espécie como um todo bem como as de um indivíduo Logo que a genética surgiu como uma ciência no início do século XX os cientis tas ficaram intrigados com a estrutura química dos genes A informação contida neles é copiada e transmitida de uma célula para as célulasfilhas milhões de vezes durante a vida de um organismo multicelular sobrevivendo a esse processo praticamente sem alterações Que molécula teria capacidade de replicação quase ilimitada e com tamanha precisão e ainda exercer um controle exato direcionando o desenvolvimento multice lular bem como as rotinas metabólicas de cada célula Que tipos de instruções estão contidas na informação genética E como esse excesso de informações necessárias ao desenvolvimento e à manutenção do mais simples organismo está organizada para ca ber no pequeno espaço de uma célula As respostas para várias dessas questões começaram a surgir na década de 1940 quando os pesquisadores descobriram ao estudar os fungos que a informação genética consistia principalmente em instruções para a produção de proteínas As proteínas são macromoléculas muito versáteis que realizam a maioria das funções celulares Como vimos no Capítulo 3 elas atuam como unidades fundamentais para as estruturas celula res e formam as enzimas que catalisam a maioria das reações químicas das células Elas também regulam a expressão gênica Capítulo 7 permitem a comunicação intercelular Capítulo 15 e seu movimento Capítulo 16 As propriedades e as funções de células e organismos são determinadas quase inteiramente pelas proteínas que elas produzem Observações meticulosas de células e embriões no final do século XIX levaram ao reconhecimento de que a informação genética é transmitida pelos cromossomos es truturas com forma de cordão presentes no núcleo das células eucarióticas e visíveis em microscopia óptica no início da divisão celular Figura 41 Mais tarde com o desen volvimento de análises bioquímicas foi descoberto que os cromossomos consistem em ácido desoxirribonucleico DNA e proteínas presentes em quantidades aproximada mente iguais Por várias décadas o DNA era visto como um mero elemento estrutural Contudo um outro avanço crucial que ocorreu na década de 1940 foi a identificação do DNA como o provável portador da informação genética Essa espantosa descoberta no Figura 42 Primeira demonstração experimental de que o DNA é o material genético Esses experimentos realizados nas décadas de 1920 A e 1940 B mostraram que a adição de um DNA purificado a uma bactéria alterou as propriedades desta e essas alterações são fielmente transmitidas para as gerações subsequentes Duas cepas relacionadas da bactéria Streptococcus pneumoniae diferem uma da outra por sua aparência ao microscópio e sua patogenicidade Uma cepa tem aspecto liso S e causa morte quando injetada em camundongos e a outra tem aspecto rugoso R e não é letal A Um experimento inicial mostra que alguma substância presente na cepa S pode transformar a cepa R em uma cepa S e que essa mudança é herdada pelas gerações subsequentes de bactérias B Esse experimento no qual a cepa R foi incubada com várias classes de moléculas biológicas obtidas da cepa S identifica o DNA como a substância ativa responsável pela informação genética CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 175 sequências têm fornecido informações preciosas sobre o processo de evolução o tema que finaliza este capítulo Este é o primeiro de quatro capítulos que tratam dos mecanismos genéticos bá sicos a forma pela qual a célula mantém replica e expressa a informação genética contida no seu DNA No capítulo seguinte Capítulo 5 discutiremos os mecanismos pelos quais a célula replica e repara seu DNA de forma precisa Também descreveremos como as sequências de DNA podem ser rearranjadas pelo processo de recombinação genética A expressão gênica o processo pelo qual a informação codificada no DNA é interpretada pela célula para direcionar a síntese de proteínas é o principal tópico do Capítulo 6 No Capítulo 7 descreveremos como a expressão gênica é controlada pela célula para assegurar que cada uma das milhares de proteínas e moléculas de RNA co dificadas no DNA seja produzida apenas no momento e no local apropriados da vida de uma célula ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA Na década de 1940 os biólogos tinham dificuldade em aceitar que o DNA era o material genético A molécula parecia muito simples um longo polímero composto apenas por quatro tipos de subunidades semelhantes quimicamente entre si No início da década de 1950 o DNA foi examinado por difração de raios X uma técnica utilizada para deter minar a estrutura atômica tridimensional de uma molécula discutida no Capítulo 8 Os primeiros resultados indicaram que o DNA era composto por duas fitas de um po límero enroladas como uma hélice A observação de que o DNA era composto de uma fita dupla foi fundamental na elucidação do modelo da estrutura do DNA de Watson e Crick o qual logo após sua proposta em 1953 tornou evidente o potencial do DNA para replicação e armazenamento da informação genética A molécula de DNA consiste em duas cadeias de nucleotídeos complementares Uma molécula de ácido desoxirribonucleico DNA consiste em duas longas cadeias polipeptídicas compostas por quatro tipos de subunidades nucleotídicas Cada uma dessas cadeias é conhecida como uma cadeia de DNA ou fita de DNA As cadeias são antiparalelas entre si e ligações de hidrogênio entre a porção base dos nucleotídeos unem as duas cadeias Figura 43 Como vimos no Capítulo 2 Painel 26 p 100101 os nucleotídeos são compostos de açúcares com cinco carbonos aos quais um ou mais grupos fosfato estão ligados e uma base contendo nitrogênio No caso dos nucleotídeos do DNA o açúcar é uma desoxirribose ligada a um único grupo fosfato por isso o nome ácido desoxirribonucleico e a base pode ser adenina A citosina C guanina G ou timina T Os nucleotídeos estão covalentemente ligados em uma cadeia por açúcares e fosfatos os quais formam a estrutura principal alternada de açúcarfosfatoaçúcarfos fato chamada de cadeia principal Como apenas a base difere em cada uma das quatro subunidades nucleotídicas cada cadeia polinucleotídica no DNA assemelhase a um co lar de açúcarfosfato cadeia principal do qual os quatro tipos de contas se projetam as bases A C G e T Esses mesmos símbolos A C G e T normalmente são usados para representar as quatro bases ou os quatro nucleotídeos inteiros isto é as bases ligadas com seus grupos fosfato e açúcar A forma na qual os nucleotídeos estão ligados confere uma polaridade química à fita de DNA Se imaginarmos cada açúcar como um bloco com uma protuberância o fosfato 5 em um lado e uma cavidade a hidroxila 3 no outro ver Figura 43 cada cadeia completa formada por protuberâncias e cavidades entrelaçadas terá todas as suas subunidades alinhadas na mesma orientação Além disso as duas extremidades da cadeia serão facilmente distinguíveis por apresentarem uma delas uma cavidade a hi droxila 3 e a outra uma protuberância o fosfato 5 Essa polaridade na cadeia de DNA é indicada pela denominação das extremidades como extremidade 3 e extremidade 5 nomes derivados da orientação do açúcar desoxirribose Em relação à sua capacidade de carregar a informação a cadeia de nucleotídeos em uma fita de DNA sendo direcional e linear pode ser lida quase como as letras nesta página Figura 43 O DNA e suas unidades fundamentais O DNA é composto por quatro tipos de nucleotídeos ligados covalentemente formando uma cadeia polinucleotídica uma fita de DNA com uma cadeia principal de açúcarfosfato a partir do qual as bases A C G e T se estendem Uma molécula de DNA é composta por duas fitas de DNA antiparalelas unidas por ligações de hidrogênio entre as bases pareadas As setas nas extremidades das cadeias de DNA indicam a polaridade das duas fitas No diagrama na parte de baixo e à esquerda da figura o DNA está mostrado de forma plana na realidade ele é torcido formando uma duplahélice como mostrado à direita Para mais detalhes ver Figura 45 e Animação 41 Figura 44 Pares de bases complementares na duplahélice de DNA As formas e a estruturas químicas das bases permitem que as ligações de hidrogênio sejam formadas de maneira eficiente apenas entre A e T e entre G e C porque os átomos que são capazes de formar ligações de hidrogênio ver Painel 23 e p 9495 podem então aproximarse sem distorcer a duplahélice Como indicado duas ligações de hidrogênio são formadas entre A e T enquanto três são formadas entre G e C As bases podem formar par dessa forma somente quando as duas cadeias polinucleotídicas que contêm as bases forem antiparalelas entre si um organismo poderia ser armazenada em uma forma química E segundo como essa informação poderia ser duplicada e copiada de geração a geração A resposta à primeira pergunta veio da compreensão de que o DNA é um polímero linear formado por quatro tipos de monômeros ordenados em uma sequência definida como as letras em um documento escrito com o alfabeto A resposta à segunda questão veio da natureza helicoidal dupla da sua estrutura como cada fita de DNA contém uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência de nucleotídeos da fita associada cada fita pode atuar como um molde para a síntese de uma nova fita complementar Em outras palavras se designarmos as duas fitas de DNA com S e S a fita S pode servir como um molde para síntese de uma nova fita S enquanto a fita S pode ser usada como molde para fazer uma nova fita S Figura 46 Assim a informação genética no DNA pode ser fielmente copiada por Figura 45 A duplahélice do DNA A Modelo de preenchimento de 15 volta da duplahélice do DNA Cada volta do DNA contém 104 pares de nucleotídeos e a distância entre pares adjacentes de centroacentro é de 034 nm O enrolamento das duas fitas uma ao redor da outra cria duas fendas na duplahélice a fenda mais larga é chamada de fenda maior e a mais estreita de fenda menor B Uma pequena seção da duplahélice vista lateralmente mostrando quatro pares de bases Os nucleotídeos são ligados covalentemente por ligações fosfodiéster pelo grupo 3hidroxila OH de um açúcar e o grupo 5hidroxila do próximo açúcar Assim cada fita polinucleotídica tem uma polaridade química isto é as duas extremidades são quimicamente diferentes A extremidade 5 do DNA é por convenção ilustrada carregando o grupo fosfato enquanto a extremidade 3 é ilustrada com um grupo hidroxila Figura 46 O DNA atua como molde para a sua própria duplicação Como o nucleotídeo A irá parear de maneira eficiente apenas com T e G apenas com C cada fita de DNA pode atuar como molde e especificar a sequência de nucleotídeos na sua fita complementar Dessa forma a duplahélice de DNA pode ser precisamente copiada e cada hélice de DNA parental produz duas hélicesfilhas de DNA idênticas meio de um processo simples no qual a fita S separase da fita S e cada fita separada atua como molde para a produção de novas fitas complementares idênticas a sua fita associada A capacidade de cada fita de DNA de atuar como um molde para a produção de uma fita complementar permite que a célula possa copiar ou replicar seus genes antes de passálos a suas descendentes O elegante mecanismo utilizado pela célula para realizar essa tarefa é descrito no Capítulo 5 Os organismos diferem uns dos outros porque suas respectivas moléculas de DNA possuem diferentes sequências de nucleotídeos e consequentemente carregam diferentes mensagens biológicas No entanto como esse alfabeto é usado para produzir as mensagens e o que elas significam Como discutido anteriormente antes que a estrutura da molécula de DNA fosse determinada sabiase que os genes continham as instruções para produzir as proteínas Se os genes são formados por DNA este deve de alguma forma codificar proteínas Figura 47 Como apresentado no Capítulo 3 as propriedades de uma proteína que são responsáveis pela sua função biológica são determinadas pela sua estrutura tridimensional Essa estrutura por sua vez é determinada pela sequência linear de aminoácidos que a compõe A sequência linear de nucleotídeos em um gene deve portanto corresponder à sequência linear de aminoácidos em uma proteína A correspondência exata entre as quatro letras do alfabeto de nucleotídeos do DNA e as 20 letras do alfabeto dos aminoácidos das proteínas o código genético não é óbvia a partir da estrutura do DNA e somente foi compreendida uma década após a descoberta da duplahélice No Capítulo 6 descrevemos esse código em detalhes durante um processo elaborado conhecido como expressão gênica em que a célula converte a sequência nucleotídica de um gene primeiro em uma sequência de nucleotídeos na molécula de RNA e então na sequência de aminoácidos de uma proteína O conteúdo total da informação de um organismo é o seu genoma que codifica todas as moléculas de RNA e proteínas que o organismo poderá sintetizar durante toda vida O termo genoma também é usado para descrever o DNA que contém essa informação A quantidade de informação contida nos genomas é impressionante A sequência nucleotídica de um gene humano muito pequeno escrito na forma do alfabeto de quatro nucleotídeos ocupa um quarto de página de texto Figura 48 enquanto a sequência completa de nucleotídeos do genoma humano preencheria mais de mil livros do tamanho deste Além de outras informações essenciais nosso genoma inclui aproximadamente 21 mil genes que codificam proteínas os quais por meio de splicing alternativo ver p 415 originam um número muito maior de proteínas diferentes Em eucariontes o DNA é limitado ao núcleo celular Como descrito no Capítulo 1 quase todo o DNA de uma célula eucariótica está contido em um núcleo que ocupa cerca de 10 do volume celular total Esse compartimento é delimitado por um envelope nuclear formado por duas membranas de bicamada lipídica concêntricas Figura 49 Essas membranas são perfuradas em intervalos por CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 179 grandes poros nucleares por meio dos quais as moléculas movemse entre o núcleo e o citoplasma O envelope nuclear está diretamente ligado ao extenso sistema de membra nas intracelulares chamado retículo endoplasmático que se estende do núcleo ao cito plasma O envelope nuclear conta com o suporte mecânico de uma rede de filamentos intermediários chamada lâmina nuclear uma malha delgada localizada logo abaixo da membrana nuclear interna ver Figura 49B O envelope nuclear permite que muitas proteínas que atuam no DNA sejam con centradas onde são necessárias à célula e como veremos nos próximos capítulos ele mantém as enzimas nucleares separadas das enzimas citoplasmáticas uma característi ca crucial para o funcionamento adequado das células eucarióticas Resumo A informação genética é armazenada em uma sequência linear de nucleotídeos no DNA Cada molécula de DNA é uma duplahélice formada por duas fitas complementares e antiparalelas de nucleotídeos unidos por ligações de hidrogênio entre os pares de bases GC e AT A duplicação da informação genética ocorre pelo uso de uma das fitas de DNA como um molde para a formação de uma fita complementar A informação genética con tida no DNA de um organismo contém as instruções para todas as moléculas de RNA e proteínas que o organismo irá sintetizar compondo o genoma do organismo Nos euca riotos o DNA está localizado no núcleo celular um grande compartimento delimitado por membrana O DNA CROMOSSÔMICO E SUA COMPACTAÇÃO NA FIBRA DE CROMATINA A função mais importante do DNA é carregar os genes a informação que especifica to das as moléculas de RNA e proteínas que formam um organismo incluindo a informa ção sobre quando em quais tipos celulares e quais as quantidades de cada molécula de RNA e de proteínas devem ser produzidas O DNA nuclear dos eucariotos é dividido em cromossomos e nesta seção veremos como os genes estão organizados em cada cro mossomo Além disso descreveremos as sequências especializadas de DNA que permi tem que os cromossomos sejam precisamente duplicados como uma entidade separada e passados de uma geração para outra Também confrontaremos o desafio do empacotamento do DNA Se as duplashé lices que compõem todos os 46 cromossomos em uma célula humana fossem colocadas uma ligada à extremidade da outra atingiriam cerca de 2 metros no entanto o núcleo que contém o DNA tem somente cerca de 6 mm de diâmetro Isso é geometricamente equivalente a acomodar 40 km de uma linha extremamente fina em uma bola de tênis A complexa tarefa de compactar o DNA é realizada por proteínas especializadas que se ligam ao DNA e fazem seu enovelamento gerando uma série de espirais e alças ordena das com níveis crescentes de organização e evitam que o DNA se torne um emaranhado desordenado Apesar de estar fortemente compactado é surpreendente como o DNA permanece acessível às diversas proteínas dentro da célula que o replicam reparam e utilizam seus genes para produzir as moléculas de RNA e as proteínas Figura 48 Sequência de nucleotídeos no gene da bglobina humana Por conven ção uma sequência nucleotídica é escrita sempre da extremidade 5 para a 3 devendo ser lida da esquerda para a direita e nas linhas sucessivas em direção ao final da página como é lido um texto normal Esse gene contém a informação para a sequência de ami noácidos de um dos dois tipos de subunidades da molécula de hemoglobina um gene diferente o aglobina contém a informação do outro A hemoglobina proteína que transporta o oxigênio no sangue possui quatro subunidades duas de cada tipo Apenas uma das duas fitas da duplahélice do DNA contendo o gene da bglobina é mostrada a outra fita tem a sequência complementar exata As sequências de DNA destacadas em amarelo mostram as três regiões do gene que codificam a sequência de aminoácidos da proteína bglobina Veremos no Capítulo 6 como a célula processa e une essas três sequências no nível de mRNA para sintetizar uma proteína bglobina completa Figura 49 Corte transversal de um núcleo celular característico A Micrografia eletrônica de uma fina seção do núcleo de um fibroblasto humano B Diagrama esquemático mostrando que o envelope nuclear consiste em duas membranas sendo a externa contínua à membrana do retículo endoplasmático RE ver também Figura 127 O espaço interno do retículo endoplasmático o lumen do RE está colorido em amarelo sendo contínuo com o espaço entre as duas membranas nucleares As bicamadas lipídicas das membranas nucleares interna e externa estão conectadas a cada poro nuclear Uma fina rede de filamentos intermediários em marrom dentro do núcleo forma a lâmina nuclear em marrom que fornece suporte mecânico ao envelope nuclear para detalhes ver Capítulo 12 A heterocromatina porção fortemente corada contém regiões de DNA especialmente condensadas que serão discutidas mais adiante A cortesia de EG Jordan e J McGovern O DNA eucariótico é compactado em um conjunto de cromossomos Cada cromossomo em uma célula eucariótica consiste em uma única e enorme molécula de DNA linear juntamente com proteínas que enovelam e empacotam a fina fita de DNA em uma estrutura mais compacta Além das proteínas envolvidas na compactação os cromossomos estão associados a várias outras proteínas e a diversas moléculas de RNA Estas são necessárias para os processos de expressão gênica replicação e reparo do DNA O complexo que engloba o DNA e as proteínas fortemente associadas é chamado de cromatina do grego chroma cor devido às suas propriedades de coloração As bactérias não possuem um compartimento nuclear especial e normalmente transportam seus genes em uma única molécula de DNA muitas vezes circular ver Figura 124 Esse DNA também está associado a proteínas que o empacotam e o condensam mas elas são diferentes das proteínas que desempenham essas funções em eucariotos Embora o DNA bacteriano e suas proteínas acessórias sejam normalmente chamadas de cromossomo bacteriano ele não possui a mesma estrutura dos cromossomos eucariotos e sabese menos sobre a compactação do DNA bacteriano Portanto nossa discussão sobre a estrutura dos cromossomos será quase inteiramente sobre os cromossomos de eucariotos Com exceção dos gametas óvulos e espermatozoides e uns poucos tipos celulares altamente especializados que não podem se multiplicar ou não possuem DNA p ex os eritrócitos ou tenham replicado seu DNA sem completar o ciclo de divisão celular por exemplo os megacariócitos cada núcleo celular humano contém duas cópias de cada cromossomo uma herdada da mãe e outra herdada do pai Os cromossomos maternos e paternos de um par são chamados de cromossomos homólogos O único par de cromossomos não homólogos é o dos cromossomos sexuais do macho onde um cromossomo Y é herdado do pai e um cromossomo X é herdado da mãe Assim cada célula humana contém um total de 46 cromossomos 22 pares comuns tanto para indivíduos masculinos quanto femininos mais os dois cromossomos sexuais X e Y nos indivíduos do sexo masculino e dois X nos indivíduos do sexo feminino Esses cromossomos humanos podem ser facilmente distinguidos pela coloração de cada um com uma cor diferente usando uma técnica baseada na hibridização de DNA Figura 410 Nesse método descrito em detalhes no Capítulo 8 uma pequena fita de ácido nucleico é marcada com um corante fluorescente que atua como uma sonda e se liga à sua sequência CAPÍTULO 4 DNA cromossomos e genomas 181 Figura 410 O conjunto completo de cromossomos humanos Os cromossomos de um indivíduo do sexo feminino foram isolados de uma célula em divisão nuclear mitose e estão portanto em um estado altamente compactado Cada cromossomo foi colorido com uma cor diferente para identificação precisa ao microscópio de fluorescência usando a técnica denominada cariotipagem espectral A coloração cromossômica pode ser realizada pela exposição dos cromossomos a uma grande variedade de moléculas de DNA cuja sequência complemente sequências de DNA conhecidas no genoma humano O conjunto das sequências complementares a cada cromossomo é ligada a uma combinação diferente de corantes fluorescentes Moléculas de DNA derivadas do cromossomo 1 foram marcadas com uma combinação específica de corantes as do cromossomo 2 com outra e assim por diante Como o DNA marcado pode formar pares de bases ou hibridizar apenas com o cromossomo do qual a sequência foi derivada cada cromossomo é marcado com uma combinação diferente de corantes Nesses experimentos os cromossomos são submetidos a tratamentos que separam as duas fitas da duplahélice de DNA de modo a permitir o pareamento de bases com o DNA de fita simples marcado porém preservando a estrutura geral do cromossomo A Cromossomos visualizados na forma como foram expulsos da célula lisada B Os mesmos cromossomos ordenados artificialmente de acordo com sua numeração Esse arranjo do conjunto total dos cromossomos é chamado de cariótipo Adaptada de N McNeil e T Ried Expert Rev Mol Med 2114 2000 Com permissão de Cambridge University Press Figura 411 Padrão de bandas dos cromossomos humanos Os cromossomos de 1 a 22 estão numerados em ordem aproximada de tamanho Uma célula humana típica contém dois de cada desses cromossomos mais dois cromossomos sexuais dois cromossomos X na fêmea um cromossomo X e um Y no macho Os cromossomos usados para fazer estes mapas foram corados em um estágio inicial da mitose quando os cromossomos estão um pouco menos compactados A linha horizontal em vermelho representa a posição do centrômero ver Figura 419 que aparece como uma constrição nos cromossomos mitóticos As protuberâncias nos cromossomos 13 14 15 21 e 22 indicam as posições dos genes que codificam os RNAs ribossômicos maiores discutidos no Capítulo 6 Esses padrões são obtidos pela coloração dos cromossomos com Giemsa e são observados ao microscópio óptico Adaptada de U Francke Cytogenet Cell Genet 312432 1981 Com permissão do autor 182 PARTE II Mecanismos genéticos básicos ma o padrão de bandas em cada tipo de cromossomo é único e estabeleceu o caminho inicial para a identificação e numeração de cada cromossomo de forma confiável A representação dos 46 cromossomos mitóticos é chamada de cariótipo humano Caso partes de cromossomos sejam perdidas ou estejam trocadas entre cromossomos essas alterações podem ser detectadas tanto pela alteração no padrão de bandas ou com maior sensibilidade por alterações no padrão de coloração dos cromossomos Figura 412 Os citogeneticistas utilizam essas alterações para detectar anormalidades cromos sômicas hereditárias e para revelar os rearranjos cromossômicos que ocorrem em células tumorais à medida que elas progridem para a malignidade discutido no Capítulo 20 Os cromossomos contêm longas sequências de genes Os cromossomos carregam os genes as unidades funcionais da hereditariedade Um gene normalmente é definido como um segmento de DNA que contém as instruções para produzir uma determinada proteína ou uma série de proteínas relacionadas mas essa definição é muito limitada Os genes que codificam proteínas são realmente a gran de maioria e a maior parte dos genes com fenótipos claramente mutantes caem nessa categoria Entretanto existem diversos genes de RNA segmentos de DNA que ori ginam uma molécula de RNA funcionalmente importante em vez de proteínas como produto final Discutiremos sobre os genes de RNA e seus produtos mais adiante Como esperado existe uma correlação entre a complexidade de um organismo e o número de genes em seu genoma ver Tabela 12 p 29 Por exemplo algumas bacté rias simples possuem apenas 500 genes em comparação aos cerca de 30 mil genes em humanos As bactérias arqueias e alguns eucariotos unicelulares como as leveduras possuem genomas concisos e consistem em pouco mais do que segmentos de genes muito compactados Por outro lado os genomas de plantas e animais multicelulares e de vários outros eucariotos contêm além dos genes uma enorme quantidade de DNA intercalante com função pouco conhecida Figura 413 Partes desse DNA extra é es sencial para a expressão gênica adequada e pode explicar em parte porque existe em grande quantidade nos organismos multicelulares cujos genes precisam ser ativados e desativados de acordo com instruções complexas durante o desenvolvimento discutido nos Capítulos 7 e 21 As diferenças na quantidade de DNA intercalante entre os genes respondem muito mais pela espantosa variação no tamanho dos genomas do que propriamente pelas di ferenças no número de genes vistas na comparação entre espécies ver Figura 132 Por exemplo o genoma humano é 200 vezes maior que o da levedura Saccharomyces cerevi siae mas 30 vezes menor do que o de algumas plantas e anfíbios e 200 vezes menor do que o de uma espécie de ameba Além disso devido às diferenças na quantidade de DNA não codificador os genomas de espécies muito relacionadas p ex peixes ósseos po dem variar centenas de vezes no conteúdo de DNA mesmo contendo aproximadamente Cromossomo 6 A B Translocação cromossômica recíproca Cromossomo 4 Figura 412 Cromossomos humanos aberrantes A Dois cromossomos humanos normais 4 e 6 B Em um indivíduo com uma translocação cromossômica balanceada a duplahélice de DNA em um cromossomo foi cruzada com a duplahélice de DNA de ou tro cromossomo devido a um evento de recombinação anormal A técnica de coloração cromossômica usada nos cromossomos de cada um dos grupos permite a identificação dos segmentos cromossômicos que sofreram translocação mesmo sendo pequenos um evento comum em células cancerosas Cortesia de Zhenya Tang e the NIGMS Human Ge netic Cell Repository at the Coriell Institute for Medical Research GM21880 Figura 413 Organização dos genes no genoma de S cerevisiae comparado aos humanos A A levedura por brota mento S cerevisiae é bastante utilizada na produção de cervejas e pães O genoma desse eucarioto unicelular está distribuído em 16 cromossomos Uma pequena região de um cromossomo foi selecionada arbi trariamente para mostrar sua alta densida de de genes B Uma região do genoma humano com o mesmo comprimento do segmento da levedura em A Os genes humanos são muito menos compactados e a quantidade de sequências de DNA intercalantes é muito maior Não está ilustrado nesta amostra mas na realidade a maioria dos genes humanos é muito maior do que os genes de leveduras ver Figura 415 0 10 20 30 quilobases 30 quilobases 0 10 20 B Humano A Saccharomyces cerevisiae Gene Repetição espalhada pelo genoma CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 183 o mesmo número de genes Independentemente da função desse DNA em excesso pa rece claro que ele não é um grande problema para a célula eucariótica A forma como o genoma é dividido nos cromossomos também difere de uma espécie de eucarioto para outra Por exemplo enquanto as células humanas possuem 46 cromossomos as de um pequeno cervo possuem apenas 6 e as células da carpa co mum contêm mais de 100 cromossomos Mesmo espécies muito relacionadas com ge nomas de tamanho similar podem apresentar números e tamanhos de cromossomos muito diferentes Figura 414 Não há uma regra simples para o número cromossômico complexidade do organismo e o tamanho total do genoma Ao contrário o genoma e os cromossomos das espécies atuais foram moldados por uma história particular de even tos genéticos aparentemente ao acaso nos quais uma pressão seletiva pouco compreen dida atuou durante longos períodos da evolução A sequência nucleotídica do genoma humano mostra como nossos genes são organizados Com a publicação da sequência completa de DNA do genoma humano em 2004 foi pos sível ver em detalhes como os genes estão dispostos ao longo de cada um dos nossos cromossomos Figura 415 Levará algumas décadas para que a informação contida na sequência do genoma humano seja completamente analisada mas já estimulou a realização de novos experimentos e afetou o conteúdo de cada capítulo deste livro Cervo chinês Cervo indiano X Y Y2 X Y1 Figura 414 Duas espécies de cervos re lacionadas mas com diferentes números cromossômicos Durante a evolução do cervo indiano os cromossomos que eram inicialmen te separados se fundiram sem causar efeitos graves nos animais Essas duas espécies pos suem aproximadamente o mesmo número de genes Cervo chinês foto cortesia de Deborah Carreno Natural Wonders Photography Figura 415 Organização dos genes em um cromossomo humano A O cromossomo 22 um dos menores cromossomos humanos contém 48 10 6 pares de nucleotídeos e cor responde aproximadamente a 15 de todo o genoma humano Grande parte do braço esquerdo do cromossomo 22 consiste em pequenas sequências de DNA repetidas que são compactadas em uma forma especial de cromatina heterocromatina discutida pos teriormente neste capítulo B Um segmento do cromossomo 22 ampliado 10 vezes con tendo cerca de 40 genes Os genes indicados em marromescuro são conhecidos e os genes em vermelho são suposições C Um segmento ampliado de B mostrando quatro genes D O arranjo de éxons e íntrons de um gene típico é mostrado após uma ampliação de 10 vezes Cada éxon em vermelho codifica uma porção da proteína enquanto a sequência de DNA dos íntrons em cinza tem pouca importância como discutido em detalhes no Capítulo 6 O genoma humano 32 10 9 pares de nucleotídeos é a totalidade da informação genética que pertence a nossa espécie Qua se todo esse genoma está distribuído pelos 22 autossomos diferentes e dois cromossomos sexuais ver Figuras 410 e 411 encontrados dentro do núcleo Uma fração mínima do ge noma humano 16569 pares de nucleotídeos em cópias múltiplas por célula é encontrada na mitocôndria introduzida no Capítulo 1 e discutida com detalhes no Capítulo 14 O termo sequência genômica humana se refere à sequência nucleotídica completa do DNA nos 24 cromossomos nucleares e na mitocôn dria Sendo diploide o núcleo de uma célula somática humana contém aproximadamente duas vezes a quantidade haploide de DNA ou 64 10 9 pares de nucleotídeos quando não estiver duplicando seus cromossomos no pre paro para a divisão Adaptada de International Human Genome Sequencing Consortium Nature 409860921 2001 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Heterocromatina Sequências reguladoras de DNA Cromossomo 22 humano em sua conformação mitótica composto de duas moléculas de DNA de fita dupla cada uma com 48 106 pares de nucleotídeos Um gene contendo 34 104 pares de nucleotídeos 10 10 10 10 do braço do cromossomo com 40 genes 1 do braço do cromossomo contendo 4 genes Proteína RNA Proteína enovelada Expressão gênica Éxon Íntron A B C D 184 PARTE II Mecanismos genéticos básicos A primeira característica marcante do genoma humano é que apenas uma parte muito pequena somente cerca de 15 codifica proteínas Tabela 41 e Figura 416 Também é interessante notar que quase metade do DNA cromossômico é formada por segmentos de DNA móveis que se inseriram gradativamente nos cromossomos durante a evolução multiplicandose no genoma como parasitas ver Figura 462 Discutiremos esses elementos transponíveis em detalhes em capítulos seguintes Uma segunda característica marcante do genoma humano é o enorme tamanho médio dos genes cerca de 27 mil pares de nucleotídeos Como discutido anteriormente um gene típico carrega a informação da sequência linear de aminoácidos de uma pro teína na sua sequência linear de nucleotídeos Para codificar uma proteína de tamanho médio com cerca de 430 aminoácidos em humanos são necessários apenas cerca de 1300 pares de nucleotídeos A maior parte da sequência restante no gene consiste em inúmeros segmentos de DNA não codificador que interrompem uma sequência relati vamente curta de pequenos segmentos de DNA codificador da proteína Como discu tido em detalhes no Capítulo 6 as sequências codificadoras são chamadas de éxons as sequências intercalantes não codificadoras são denominadas íntrons ver Figura 415 e Tabela 41 A maioria dos genes humanos portanto é formada por uma longa sequência alternada de éxons e íntrons sendo que a maior parte é formada por íntrons Em contraste a maioria dos genes de organismos com genoma compactos não possui íntrons Isso explica o tamanho muito menor desses genes cerca de um vigésimo com parado a genes humanos e também a proporção muito mais alta de DNA codificador em seus cromossomos Além dos éxons e íntrons cada gene está associado a sequências de DNA regulador as quais são responsáveis por assegurar que cada gene será ativado e desativado no de vido tempo expresso no nível adequado e apenas em determinados tipos celulares Em TABELA 41 Algumas estatísticas vitais do genoma humano Genoma humano Comprimento do DNA 32 10 9 pares de nucleotídeos Número de genes que codificam proteínas Aproximadamente 21 mil Maior gene que codifica proteína 24 10 6 pares de nucleotídeos Tamanho médio de genes que codificam proteínas 27 mil pares de nucleotídeos Menor número de éxons por gene 1 Maior número de éxons por gene 178 Número médio de éxons por gene 104 Tamanho do maior éxon 17106 pares de nucleotídeos Tamanho médio dos éxons 145 pares de nucleotídeos Número de genes de RNA não codificador Aproximadamente 9 mil Número de pseudogenes Mais de 20 mil Porcentagem de sequências de DNA nos éxons sequências codificadoras de proteínas 15 Porcentagem de DNA em outras sequências altamente conservadas 35 Porcentagem de DNA em elementos repetitivos com alto número de cópias Aproximadamente 50 A sequência dos 285 bilhões de nucleotídeos é conhecida com precisão taxa de erro de apenas 1 a cada 100 mil nucleotídeos O restante do DNA consiste principalmente de sequências curtas repetidas diversas vezes uma atrás da outra com o número de repetições diferindo de um indivíduo para outro Esses blocos altamente repetitivos são difíceis de ser sequenciados com precisão Esse número é apenas uma estimativa Um pseudogene é uma sequência de DNA que se assemelha a um gene funcional mas contém muitas mutações prejudiciais que impedem sua expressão ou função adequadas A maioria dos pseudogenes surgiu da duplicação de um gene funcional seguido do acúmulo de mutações prejudiciais em uma das cópias Essas regiões funcionais conservadas incluem DNA que codifica as UTRs de 5 e 3 regiões não tradu zidas do mRNA DNA que codifica RNAs estruturais e funcionais e DNA com sítios de ligação a proteínas conservados A B Figura 416 Escala do genoma humano Se em uma ilustração cada par de nucleo tídeos tivesse 1 mm de distância um do ou tro como em A todo o genoma humano teria 3200 km de extensão o suficiente para traçar uma linha através do centro da África o local da origem do homem linha vermelha em B Nessa escala teríamos um gene que codifica uma proteína a cada 150 m Em média um gene teria 30 m de extensão mas as sequências codificadoras desse gene teriam apenas um pouco mais de 1 m CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 185 humanos as sequências reguladoras para um gene típico estão distribuídas por milhares de pares de nucleotídeos Como seria esperado essas sequências reguladoras são muito mais comprimidas em organismos com genomas compactos Discutiremos no Capítulo 7 como essas sequências reguladoras de DNA atuam Nesta última década pesquisas têm surpreendido os biólogos pela descoberta de que além dos 21 mil genes que codificam proteínas o genoma humano contém vários milhares de genes que codificam moléculas de RNA que não produzem proteínas mas possuem diversas outras funções importantes O que é sabido atualmente sobre essas moléculas será apresentado nos Capítulos 6 e 7 Por último mas não menos importante a sequência nucleotídica do genoma humano revelou que o arquivo de informações necessárias para produzir um ser humano parece estar em um estado de caos alarman te Como foi comentado a respeito do nosso genoma De certo modo ele se parece com sua garagemquartorefrigeradorvida altamente individualista porém desarru mado pouca evidência de organização cheio de coisas acumuladas que os iniciantes chamam de lixo praticamente nada é descartado e os poucos itens valiosos estão desordenados e aparentemente dispostos de qualquer jeito por todo lugar Nós discuti remos como isso parece ter ocorrido na seção final deste capítulo intitulada Como os genomas evoluem Cada molécula de DNA que forma um cromossomo linear deve conter um centrômero dois telômeros e origens de replicação Para formar um cromossomo funcional uma molécula de DNA deve fazer mais do que simplesmente transportar os genes Ela deve ser capaz de replicar e as cópias replicadas devem ser separadas e fielmente divididas entre as duas célulasfilhas a cada divisão celular Esse processo ocorre por meio de uma série de estágios ordenados conhecidos coletivamente como ciclo celular que fornece uma separação temporal entre a dupli cação dos cromossomos e sua separação entre as duas célulasfilhas O ciclo celular está resumido na Figura 417 sendo discutido em detalhes no Capítulo 17 Resumidamente durante a longa interfase os genes são expressos e os cromossomos são replicados e as duas réplicas são mantidas unidas formando um par de cromátidesirmãs Durante esse período os cromossomos estão estendidos e muito de sua cromatina está disposta no núcleo na forma de longas linhas enroladas de modo que os cromossomos individuais não podem ser distinguidos facilmente Apenas durante um período muito breve da mitose os cromossomos são condensados permitindo que as duas cromátidesirmãs sejam separadas e distribuídas aos núcleosfilhos Os cromossomos altamente conden sados nas células em divisão são denominados cromossomos mitóticos Figura 418 Essa é a forma na qual os cromossomos são mais facilmente visualizados Na verdade todas as imagens de cromossomos mostradas até agora neste capítulo são de cromos somos mitóticos Cada cromossomo atua como uma unidade estrutural distinta para que uma có pia possa ser transmitida a cada célulafilha durante a divisão cada cromossomo deve ser capaz de se replicar e a nova cópia replicada deve subsequentemente ser separada e dividida corretamente entre as duas célulasfilhas Essas funções básicas são controla das por três tipos de sequências nucleotídicas especializadas no DNA às quais se ligam EXPRESSÃO GÊNICA E DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA MITOSE DIVISÃO CELULAR INTERFASE FASE M INTERFASE Envelope nuclear envolvendo o núcleo Fuso mitótico Cromossomo mitótico Cromossomo de interfase paterno Cromossomo de interfase materno Figura 417 Visão simplificada do ciclo celular eucariótico Durante a interfase a célula está transcrevendo ativamente seus genes e sintetizando proteínas Ainda du rante a interfase e antes da divisão celular o DNA está replicado e cada cromossomo foi duplicado originando duas moléculas irmãs de DNA próximas e emparelhadas chamadas cromátidesirmãs Uma célula com apenas um tipo de cromossomo com as cópias materna e paterna é ilustrada aqui Uma vez completada a replicação do DNA a célula pode entrar na fase M quando ocorre a mitose e o núcleo é divi dido em dois núcleosfilhos Durante essa etapa os cromossomos se condensam o envelope nuclear se fragmenta e o fuso mitótico é formado a partir de microtúbu los e outras proteínas Os cromossomos mitóticos condensados são capturados pelo fuso mitótico e um conjunto comple to de cromossomos é então puxado para cada extremidade da célula separando os membros de cada par de cromátides irmãs Um envelope nuclear se forma em volta de cada conjunto de cromossomos e na etapa final da fase M a célula se divide para produzir duas célulasfilhas A célula passa a maior parte do tempo do ciclo celular na interfase a fase M é breve em comparação com a interfase ocupando apenas cerca de 1 hora em diversas células de mamíferos Figura 418 Um cromossomo mitótico Um cromossomo mitótico é um cromossomo duplicado e condensado no qual os dois cromossomos novos denominados cromátidesirmãs ainda estão ligados entre si ver Figura 417 A região de constrição indica a posição do centrômero Cortesia de Terry D Allen Figura 419 As três sequências de DNA necessárias para produzir um cromossomo eucariótico que pode ser replicado e então segregado de forma precisa na mitose Cada cromossomo tem diversas origens de replicação um centrômero e dois telômeros A sequência de eventos que um cromossomo típico segue durante o ciclo celular é mostrada aqui O DNA é replicado na interface a partir das origens de replicação e procede bidirecionalmente pelo cromossomo Na fase M o centrômero liga os cromossomos duplicados ao fuso mitótico e uma cópia do genoma total é distribuída para cada célulafilha durante a mitose a estrutura especial que liga o centrômero ao fuso é um complexo proteico chamado de cinetocoro em verdeescuro O centrômero também ajuda a manter os cromossomos duplicados unidos até que estejam prontos para a segregação Os telômeros formam uma proteção especial nas extremidades de cada cromossomo proteínas específicas que direcionam a maquinaria que replica e segrega os cromossomos Figura 419 Experimentos com leveduras cujos cromossomos são relativamente pequenos e fáceis de manipular identificaram as sequências mínimas de DNA dos elementos responsáveis por cada uma dessas funções Um tipo de sequência nucleotídica atua como origem de replicação do DNA o local em que a duplicação do DNA é iniciada Os cromossomos eucarióticos contêm muitas origens de replicação para assegurar que todo o cromossomo seja replicado rapidamente como discutido em detalhes no Capítulo 5 Após a replicação do DNA as duas cromátidesirmãs que formam cada cromossomo permanecem unidas uma à outra e com a progressão do ciclo celular são mais condensadas para produzir cromossomos mitóticos A presença de uma segunda sequência especializada de DNA chamada de centrômero permite que uma cópia de cada cromossomo duplicado e condensado seja levada para cada célulafilha no momento da divisão celular Um complexo proteico chamado de cinetocoro é formado no centrômero e liga o fuso mitótico aos cromossomos duplicados permitindo que eles sejam separados discutido no Capítulo 17 Uma terceira sequência especializada de DNA forma os telômeros as extremidades dos cromossomos Os telômeros contêm sequências nucleotídicas repetidas que permitem que as extremidades dos cromossomos sejam replicadas de maneira eficiente Os telômeros também desempenham uma outra função as sequências de DNA repetidas juntamente com as regiões adjacentes a elas formam estruturas que evitam que as extremidades cromossômicas sejam confundidas com uma molécula de DNA quebrada que necessita de reparo pela célula Discutiremos esse tipo de reparo e a estrutura e função dos telômeros no Capítulo 5 Em células de levedura os três tipos de sequências necessárias para propagar os cromossomos são relativamente curtas geralmente menores que mil pares de bases cada e portanto usam apenas uma pequena fração da capacidade do cromossomo de carregar informações Embora as sequências teloméricas sejam simples e pequenas em todos os eucariotos as sequências de DNA que formam os centrômeros e as origens de replicação em organismos mais complexos são muito mais longas que suas correspondentes em leveduras Por exemplo alguns experimentos sugerem que um centrômero humano contém até 1 milhão de pares de nucleotídeos e que talvez nem necessitem de um segmento de DNA com uma sequência nucleotídica definida Em vez disso como veremos mais adiante neste capítulo acreditase que um centrômero humano seja formado por uma grande estrutura repetida de ácidos nucleicos e proteínas que pode ser herdada na replicação do cromossomo CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 187 As moléculas de DNA estão extremamente condensadas nos cromossomos Todos os organismos eucarióticos apresentam formas elaboradas de compactar seu DNA nos cromossomos Por exemplo se os 48 milhões de pares de nucleotídeos no DNA do cromossomo 22 pudessem ser estendidos como uma duplahélice perfeita a molé cula teria cerca de 15 cm de comprimento de uma ponta à outra Mas o cromossomo 22 mede apenas cerca de 2 mm de comprimento na mitose ver Figuras 410 e 411 apre sentando um grau de compactação de cerca de 7 mil vezes Esse impressionante feito de compressão é realizado por proteínas que enrolam e enovelam o DNA sucessivamente em níveis cada vez mais altos de organização Embora seja muito menos condensado comparado aos cromossomos mitóticos o DNA dos cromossomos humanos na interfase ainda é fortemente compactado É importante lembrar durante a leitura das próximas seções que a estrutura cro mossômica é dinâmica Vimos que cada cromossomo sofre um grau de condensação ex tremo na fase M do ciclo celular Muito menos visível mas de enorme interesse e impor tância regiões específicas dos cromossomos de interfase sofrem uma descondensação para permitir o acesso a sequências de DNA específicas para a expressão gênica o reparo e a replicação de DNA e então se recondensam após o término desses processos O em pacotamento dos cromossomos deve portanto ser feito de forma que permita o acesso rápido e localizado no momento requerido ao DNA Nas seções seguintes discutiremos as proteínas especializadas que tornam essa compactação possível Os nucleossomos são as unidades básicas da estrutura dos cromossomos eucarióticos As proteínas que se ligam ao DNA e formam os cromossomos eucarióticos são divididas em duas classes as histonas e as proteínas cromossômicas não histonas cada uma con tribuindo com cerca da mesma massa no cromossomo que o DNA O complexo dessas duas classes de proteínas com o DNA nuclear eucariótico é conhecido como cromatina Figura 420 As histonas são responsáveis pelo primeiro e mais básico nível de organização cro mossômica o nucleossomo um complexo de DNAproteína descoberto em 1974 Quan do o núcleo interfásico é delicadamente rompido e seu conteúdo examinado sob micros cópio eletrônico a maior parte da cromatina parece estar na forma de uma fibra com 30 nm de diâmetro Figura 421A Se essa cromatina for submetida a um tratamento que a desenrole parcialmente observase ao microscópio eletrônico uma série de contas em um colar Figura 421B O colar é o DNA e cada conta é uma partícula do cerne do nu cleossomo que consiste em DNA enrolado em um núcleo de histonas Animação 42 A organização estrutural dos nucleossomos foi determinada após seu isolamento da cromatina compactada pela digestão com enzimas específicas chamadas de nuclea ses que degrada o DNA clivandoo entre os cernes dos nucleossomos Após digestão por um curto período o DNA exposto entre as partículas dos nucleossomos chamado de DNA de ligação é degradado Cada partícula do cerne nucleossômico individual consis te em um complexo de oito proteínas histonas duas moléculas de cada uma das histo nas H2A H2B H3 e H4 e a fita dupla de DNA com 147 nucleotídeos de comprimento Cromatina Histona Proteínas não histonas DNA Figura 420 Cromatina Como ilustrado a cromatina consiste em DNA ligado a proteínas histonas e não histonas A massa das proteínas histonas presentes equivale a massa total de proteínas não histona porém como indicado esquematica mente essa última é composta por um número enorme de proteínas de diferentes espécies No total um cromossomo con siste em termos de massa em aproxima damente um terço de DNA e dois terços de proteína 188 PARTE II Mecanismos genéticos básicos O octâmero de histonas forma um cerne proteico ao redor do qual a fita dupla de DNA é enrolada Figura 422 O comprimento da região do DNA de ligação que separa cada cerne do nucleosso mo do próximo pode variar de alguns poucos pares de nucleotídeos até cerca de 80 pb O termo nucleossomo tecnicamente referese à partícula do cerne do nucleossomo jun to com um de seus DNAs de ligação adjacente mas frequentemente é usado como sinô nimo para a partícula do cerne do nucleossomo Em média portanto os nucleossomos se repetem aproximadamente a cada 200 pares de nucleotídeos Por exemplo uma cé lula humana diploide com 64 10 9 pares de nucleotídeos contém cerca de 30 milhões de nucleossomos A formação do nucleossomo converte uma molécula de DNA em uma fita de cromatina com aproximadamente um terço de seu comprimento inicial A estrutura da partícula do cerne do nucleossomo revela como o DNA é compactado A estrutura em alta resolução da partícula do cerne do nucleossomo elucidada em 1997 apresenta um cerne de histonas em forma de disco ao redor do qual o DNA se encontra fortemente enrolado com 17 volta para a esquerda Figura 423 As quatro histonas que formam o cerne são relativamente pequenas contendo de 102 a 135 aminoácidos e apresentam um motivo estrutural comum conhecido como enovelamento de histonas formado por três ahélices ligadas por duas alças Figura 424 Na formação do nucle ossomo primeiro as histonas ligamse umas às outras para formar os dímeros H3H4 e H2AH2B e os dímeros H3H4 combinamse para formar tetrâmeros Então um tetrâ mero H3H4 se combina a dois dímeros H2AH2B para formar o octâmero compacto do cerne ao redor do qual o DNA é enrolado A interface entre o DNA e a histona é extensa Em cada nucleossomo 142 ligações de hidrogênio são formadas entre o DNA e o cerne de histonas Quase metade dessas liga ções formase entre os aminoácidos da estrutura das histonas e a cadeia principal açúcar fosfato do DNA Numerosas interações hidrofóbicas e pontes salinas também mantêm o DNA ligado às proteínas no nucleossomo Mais de um quinto dos aminoácidos em cada cerne de histonas são lisina ou arginina dois aminoácidos com cadeias laterais básicas e suas cargas positivas neutralizam a carga negativa da cadeia principal fosfodiéster do DNA Essas múltiplas interações explicam em parte por que praticamente qualquer sequência de DNA pode ser ligada a um octâmero de histonas O caminho do DNA em torno do cerne de histonas não é regular na verdade várias dobras são vistas no DNA A B 50 nm Figura 421 Nucleossomos vistos ao microscópio eletrônico A A cromatina isolada diretamente de um núcleo inter fásico aparece no microscópio eletrônico como uma fibra com cerca de 30 nm de espessura B Esta micrografia eletrônica mostra um segmento da cromatina que foi experimentalmente descompactado ou descondensado após o isolamento para mostrar os nucleossomos A cortesia de Barbara Hamkalo B cortesia de Victoria Foe Figura 422 Organização estrutural de um nucleossomo Um nucleossomo contém um cerne proteico constituído por oito moléculas de histona Em experimentos bioquími cos a partícula do cerne pode ser liberada da cromatina isolada pela digestão do DNA de ligação pela ação de uma nuclease uma enzima que degrada o DNA A nuclease pode degradar o DNA exposto mas não pode atacar o DNA enrolado em volta do nucleosso mo Depois da dissociação dos nucleossomos isolados no cerne de proteínas e DNA o comprimento do DNA que estava enrolado em volta do cerne pode ser determinado Seu comprimento de 147 pares de nucleotídeos é suficiente para se enrolar 17 vez ao redor do cerne de histonas DNA de ligação Forma da cromatina de colar de contas A NUCLEASE DIGERE O DNA DE LIGAÇÃO DISSOCIAÇÃO COM ALTA CONCENTRAÇÃO SALINA DISSOCIAÇÃO Cerne de histonas do nucleossomo O nucleossomo inclui 200 pares de nucleotídeos de DNA A partícula do cerne do nucleossomo é liberada 11 nm Cerne octamérico de histonas Duplahélice de DNA de 147 pares de nucleotídeos H2A H2B H3 H4 CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 189 como seria de se esperar devido à superfície irregular do cerne O dobramento requer uma substancial compressão da cavidade menor da hélice de DNA Alguns dinucleotíde os na cavidade menor são mais fáceis de serem comprimidos e algumas sequências de nucleotídeos ligamse aos nucleossomos mais fortemente que outras Figura 425 Isso provavelmente explica alguns casos notáveis mas raros de um posicionamento muito preciso ao longo do DNA Porém a sequência preferida pelos nucleossomos deve ser fra ca o suficiente para permitir que outros fatores dominem uma vez que os nucleossomos Vista lateral Vista frontal Duplahélice de DNA Histona H2A Histona H2B Histona H3 Histona H4 Figura 423 Estrutura de uma partícula do cerne do nucleossomo determinada por difração de raios X e pela análise de cristais Cada histona está colorida de acordo com o esquema mostrado na Figura 422 com a duplahélice de DNA em cinzaclaro Adaptada de K Luger et al Nature 389251260 1997 Com per missão de Macmillan Publishers Ltd H2A H2B H3 H4 N C C N C N C N N N N C C C A B D C Enovelamento de histona Cauda Nterminal Octâmero de histonas N N N N N N N N Figura 424 Organização geral da estrutura do cerne de histonas A Cada cerne de histonas contém uma cauda Nterminal sujeita a diversas formas de modificações covalentes e uma região do enovelamento de his tonas como indicado na figura B A estrutura de enovelamento da histona formada pelas quatro histonas do cerne C As histonas 2A e 2B formam um dímero por uma interação conhecida como aperto de mãos As his tonas H3 e H4 formam um dímero pelo mesmo tipo de interação D O octâmero de histonas de DNA finalizado Observe que as oito caudas Nterminais das histonas projetamse para fora da estrutura do cerne em forma de disco Suas conformações são altamente flexíveis e atuam como sítios de ligação para grupos de outras proteínas 190 PARTE II Mecanismos genéticos básicos podem ocupar qualquer posição relativa à sequência de DNA na maioria das regiões cro mossômicas Além do enovelamento das histonas cada uma das histonas do cerne possui uma cauda Nterminal de aminoácidos que se projeta para fora do cerne histonaDNA ver Figura 424D Essas caudas de histonas estão sujeitas a diferentes tipos de modificações covalentes que por sua vez controlam aspectos críticos da estrutura e função da croma tina como veremos Em razão de seu papel fundamental na função do DNA pelo controle da estrutura da cromatina as histonas estão entre as proteínas eucarióticas mais conservadas Por exemplo a sequência de aminoácidos das histonas H4 de uma ervilha difere da bovina em apenas 2 das 102 posições de aminoácidos Essa forte conservação evolutiva sugere que a função das histonas envolve quase todos os seus aminoácidos de modo que uma alteração em qualquer posição seria prejudicial para a célula Mas além dessa conser vação notável muitos organismos eucarióticos também produzem pequenas quanti dades de variantes de histonas especializadas que diferem das histonas principais na sequência de aminoácidos Como discutido mais adiante essas variantes combinadas a um surpreendente número de modificações covalentes que podem ser adicionadas às histonas nos nucleossomos originam uma grande diversidade de estruturas da croma tina nas células Os nucleossomos possuem uma estrutura dinâmica e frequentemente estão sujeitos a alterações catalisadas pelos complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP Por muitos anos os cientistas acreditaram que uma vez formado em uma determina da posição no DNA o nucleossomo permaneceria fixo naquele lugar devido à forte as sociação entre o cerne de histonas e o DNA Se fosse verdade isso traria problemas ao mecanismo genético de leitura que em princípio necessita um acesso fácil as várias sequências específicas de DNA Também prejudicaria a rápida passagem das maquina rias de transcrição e replicação de DNA pela cromatina Porém experimentos de ciné tica mostraram que o DNA em um nucleossomo isolado é desenrolado a partir de cada extremidade a uma taxa de cerca de quatro vezes por segundo permanecendo exposto por 10 a 50 milissegundos antes que a estrutura parcialmente desenrolada se feche no vamente Portanto a maioria do DNA em um nucleossomo isolado está em princípio disponível para ligação com outras proteínas Um afrouxamento adicional dos contatos entre DNA e histonas na cromatina é obviamente necessário pois as células eucarióticas contêm uma grande variedade de complexos de remodelagem da cromatina dependentes de adenosina trifosfato ATP de adenosine triphosphate Esses complexos incluem uma subunidade que hidrolisa ATP uma ATPase relacionada evolutivamente às DNAhelicases discutidas no Capítulo 5 Essa subunidade ligase tanto à proteína do cerne do nucleossomo como à duplafita de DNA enrolada nele Usando a energia da hidrólise do ATP para deslocar o DNA do cerne esse complexo de proteínas altera temporariamente a estrutura do nucleosso mo tornando a ligação do DNA ao cerne mais livre Por meio de ciclos repetidos de hi drólise de ATP que impulsionam o cerne do nucleossomo ao longo da duplahélice de DNA os complexos de remodelagem podem catalisar o deslizamento dos nucleossomos Dessa forma eles podem reposicionar os nucleossomos para expor regiões específicas do DNA tornandoas acessíveis a outras proteínas na célula Figura 426 Além dis so pela cooperação com uma variedade de outras proteínas que ligamse às histonas e atuam como chaperonas de histonas alguns complexos de remodelagem são capazes de remover todo ou partes do cerne do nucleossomo catalisando a troca das histonas H2AH2B ou a remoção total do octâmero do cerne do DNA Figura 427 Como resul tado desses processos experimentos de medição revelaram que um nucleossomo típico é substituído no DNA a cada 1 ou 2 horas dentro da célula As células possuem dezenas de complexos de remodelagem da cromatina depen dentes de ATP especializados em diferentes funções A maioria é composta por grandes complexos proteicos contendo 10 ou mais subunidades algumas delas ligandose a his tonas com modificações específicas ver Figura 426C A atividade desses complexos é Cerne de histonas do nucleossomo octâmero de histonas Dinucleotídeos AA TT e TA são preferidos aqui fenda menor para o lado interno DNA do nucleossomo GC é preferido aqui fenda menor para o lado externo Figura 425 Dobramento do DNA em um nucleossomo A hélice de DNA dá 17 volta ao redor do octâmero de histonas Este diagrama ilustra como a fenda menor é comprimida no lado interno da dobra Devido a características estruturais da molécula de DNA os dinucleotí deos indicados são acomodados preferencial mente na fenda menor mais estreita o que ajuda a explicar por que certas sequências de DNA se ligam mais fortemente ao cerne do que outras CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 191 cuidadosamente controlada pela célula À medida que genes são ativados ou desativa dos esses complexos são direcionados para regiões específicas do DNA onde atuarão localmente influenciando a estrutura da cromatina discutido no Capítulo 7 ver tam bém Figura 440 a seguir Embora algumas sequências de DNA sejam ligadas mais firmemente do que ou tras ao cerne do nucleossomo ver Figura 425 o fator mais importante no posiciona mento do nucleossomo parece ser a presença de outras proteínas fortemente associadas ao DNA Algumas proteínas ligadas favorecem a formação de um nucleossomo adjacen te Outras criam obstáculos que forçam o nucleossomo a moverse para outro lugar Por tanto a posição exata de um nucleossomo ao longo de um segmento de DNA depende principalmente da presença e da natureza de outras proteínas ligadas ao DNA É devido à presença dos complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP que o ar ranjo dos nucleossomos no DNA é altamente dinâmico podendo alterarse rapidamente de acordo com as necessidades da célula Normalmente os nucleossomos são condensados para formar uma fibra de cromatina compacta Embora cordões de nucleossomos extremamente longos sejam formados no DNA cro mossômico a cromatina de uma célula viva raramente apresenta a forma de colar de contas Na verdade os nucleossomos são compactados uns em cima dos outros produ zindo arranjos nos quais o DNA encontrase altamente condensado Assim quando o núcleo é delicadamente lisado e colocado na tela de microscopia eletrônica uma gran de parte da cromatina é vista na forma de uma fibra com cerca de 30 nm de diâmetro consideravelmente mais espessa do que a cromatina na forma de colar de contas ver Figura 421 A maneira como os nucleossomos estão organizados nos arranjos condensados não é clara A estrutura de um tetranucleossomo um complexo de quatro nucleosso mos obtido por cristalografia de raios X e microscopia eletrônica de alta resolução da cromatina reconstituída foi utilizada para reforçar o modelo de ziguezague para o empi lhamento dos nucleossomos em uma fibra de 30 nm Figura 428 Estudos usando mi Figura 426 Deslizamento do nucleosso mo catalisado pelos complexos de re modelagem da cromatina dependentes de ATP A Utilizando a energia de hidrólise de ATP o complexo de remodelagem pare ce deslocar o DNA de seu nucleossomo e afrouxar sua ligação ao cerne do nucleos somo Assim cada ciclo de ligação do ATP hidrólise e liberação dos produtos ADP e Pi desloca o DNA em relação ao octâmero de histonas na direção mostrada pela seta no diagrama Vários desses ciclos são necessários para produzir o deslizamento do nucleossomo ilustrado B Estrutura de um dímero formado por duas subunidades idênticas de ATPase em verde ligado a um nucleossomo que realiza o deslizamento dos nucleossomos para frente e para trás na família de complexos de remodelagem da cromatina ISW1 C Estrutura de um grande complexo de remodelagem da cro matina mostrando como se acredita que ele se enrole ao redor de um nucleossomo O complexo RSC de leveduras modelado em verde contém 15 subunidades incluindo uma ATPase e pelo menos quatro subunida des com domínios que reconhecem histonas com modificações covalentes específicas B de LR Racki et al Nature 46210161021 2009 Com permissão de Macmillan Publi shers Ltd C adaptada de AE Leschziner et al Proc Natl Acad Sci USA 1044913 4918 2007 Complexo de remodelagem da cromatina dependente de ATP CATÁLISE DO DESLIZAMENTO DO NUCLEOSSOMO B C A 10 nm ATP ADP 192 PARTE II Mecanismos genéticos básicos croscopia crioeletrônica de núcleos cuidadosamente preparados porém sugerem que a maioria das regiões da cromatina apresentem estrutura menos regular O que causa o forte empilhamento entre os nucleossomos As ligações nucleosso monucleossomo que envolvem as caudas das histonas especialmente a cauda da H4 constituem um fator importante Figura 429 Um outro fator importante é uma histona adicional normalmente presente na proporção 110 em relação aos cernes conhecida como histona H1 Essa histona de ligação é maior do que as histonas do cerne sendo consideravelmente menos conservada na evolução Uma única molécula de histona H1 ligase a cada nucleossomo fazendo contato com o DNA e com a proteína e alteran do a direção do DNA quando ele sai do nucleossomo Essa alteração na via de saída do DNA parece auxiliar a compactação do DNA nucleossômico Figura 430 A maioria dos organismos eucarióticos produz várias histonas H1 com sequências de aminoácidos distintas porém relacionadas A presença de várias outras proteínas de ligação ao DNA bem como as proteínas que se ligam diretamente às histonas certamente adicionará ca racterísticas extras a qualquer arranjo nucleossômico TROCA DOS DÍMEROS H2AH2B TROCA DO CERNE DO NUCLEOSSOMO OCTÂMERO DE HISTONAS Complexo de remodelagem da cromatina dependente de ATP Chaperona de histonas Chaperona de histonas DNA sem nucleossomo ATP ADP ATP ADP ATP ADP Figura 427 Remoção de nucleossomos e troca de his tonas catalisada pelo complexo de remodelagem da cromatina dependente de ATP Por meio da cooperação com membros específicos de uma grande família de dife rentes chaperonas de histonas alguns complexos de remo delagem podem remover dímeros H2AH2B de um nucle ossomo série de reações na parte superior e substituílos por dímeros contendo formas variantes de histonas como os dímeros H2AZH2B ver Figura 435 Outros complexos de remodelagem são atraídos para sítios específicos da cromatina e cooperam com as chaperonas de histonas para remover completamente o octâmero de histonas eou subs tituindoo por um cerne de nucleossomo diferente reações na parte inferior As figuras mostradas aqui ilustram esses processos de modo muito simplificado A B C Figura 428 Modelo de ziguezague para a fibra de cromatina de 30 nm A Conformação de dois dos quatro nucleossomos em um tetranucleossomo a partir da estrutura determinada por cristalografia de raios X B Diagrama do tetranucleossomo inteiro o quarto nucle ossomo não é visível estando empilhado sobre e atrás do nucleossomo de baixo neste diagrama C Ilustração esquemática de uma possível estrutura de ziguezague que pode ser responsável pela formação da fibra de cromatina de 30 nm A código PDB 1ZBB C adaptada de CL Woodcock Nat Struct Mol Biol 12639 640 2005 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 193 Resumo Um gene é uma sequência de nucleotídeos em uma molécula de DNA que atua como uma unidade funcional para a produção de uma proteína de um RNA estrutural ou de uma molécula de RNA catalítica ou reguladora Em eucariotos os genes que codificam proteí nas normalmente são compostos por uma sequência alternada de íntrons e éxons asso ciados a regiões reguladoras de DNA Um cromossomo é formado a partir de uma única molécula de DNA extremamente longa que contém vários genes em uma disposição linear ligada a um enorme conjunto de proteínas O genoma humano contém 32 10 9 pares de nucleotídeos divididos entre 22 cromossomos autossômicos diferentes cada um presente com duas cópias e dois cromossomos sexuais Somente uma pequena porcentagem desse DNA codifica proteínas ou moléculas funcionais de RNA A molécula de DNA cromossô mico também contém três outros tipos de sequências nucleotídicas importantes as origens de replicação e os telômeros que permitem que a molécula de DNA seja replicada de ma neira eficiente enquanto o centrômero liga as moléculasirmãs de DNA ao fuso mitótico assegurando sua segregação precisa às célulasfilhas durante a fase M do ciclo celular O DNA dos eucariotos é fortemente ligado a uma massa igual de histonas as quais formam unidades repetidas de proteínaDNA chamadas de nucleossomos O nucleossomo é composto por um cerne octamérico de proteínas histonas ao redor das quais se enrola a duplahélice de DNA Os nucleossomos estão dispostos em intervalos de cerca de 200 pares de nucleotídeos e normalmente são compactados com o auxílio de moléculas da histona H1 em arranjos quase regulares formando uma fibra de cromatina de 30 nm Apesar de compacta a estrutura da cromatina deve ser altamente dinâmica para permitir o acesso ao DNA Alguns enrolamentos e desenrolamentos entre DNA e nucleossomo são espon tâneos porém a estratégia geral para as alterações reversíveis locais na estrutura da cro matina são os complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP As células contêm um grande número desses complexos que são direcionados a regiões específicas da cromatina em períodos específicos Os complexos de remodelagem colaboram com as chaperonas de histonas e permitem que os cernes nucleossômicos sejam reposicionados reconstituídos a partir de diferentes histonas ou completamente removidos para expor o DNA neles enrolado Cauda H2A Cauda H2A Cauda H2B Cauda H2B Cauda H4 Cauda H3 Cauda H3 Cauda H4 A B Figura 429 Um modelo para a função das caudas de histonas na compac tação da cromatina A Um diagrama mostra os locais aproximados da saída das caudas das oito histonas cada cauda oriunda de uma proteína que se projeta para fora de cada nucleossomo A estru tura real é mostrada à direita Na estrutura em alta resolução do nucleossomo as cau das estão desestruturadas sugerindo que são altamente flexíveis B Como indicado as caudas das histonas parecem estar envolvidas nas interações entre os nucleos somos que auxiliam a compactação desses nucleossomos A código PDB 1K X 5 Figura 430 Maneira como a histona de ligação se liga ao nucleossomo A posição e a estrutura da histona H1 são mostradas A região central de H1 restrin ge uns 20 pares de nucleotídeos de DNA adicionais na saída do cerne do nucleos somo e é importante na compactação da cromatina A Diagrama esquemático e B estrutura deduzida para um único nucleossomo derivada da estrutura obtida por microscopia eletrônica de alta resolu ção de uma fibra de cromatina reconstituí da C B e C adaptadas de F Song et al Science 344376380 2014 Histona H1 Histona H1 C N A B C Nucleossomo 194 PARTE II Mecanismos genéticos básicos ESTRUTURA E FUNÇÃO DA CROMATINA Após descrevermos como o DNA é empacotado nos nucleossomos criando a fibra de cromatina discutiremos agora os mecanismos que produzem as diferentes estruturas da cromatina em diferentes regiões do genoma celular Mecanismos desse tipo exercem uma variedade de importantes funções nas células Surpreendentemente alguns tipos de estrutura da cromatina podem ser herdados isto é a estrutura pode ser transmitida diretamente de uma célula a suas descendentes Como a memória celular resultante é fundamentada em uma estrutura de cromatina herdada e não em alterações da sequên cia de DNA essa é uma forma de herança epigenética O prefixo epi do grego em cima é apropriado porque a epigenética representa uma forma de herança que se sobrepõe à herança genética com base no DNA No Capítulo 7 introduziremos as diversas formas de regulação da expressão gêni ca Lá a herança epigenética será discutida em detalhes e serão apresentados os vários mecanismos diferentes que a produzem Aqui nos deteremos em apenas um que se ba seia na estrutura da cromatina Iniciaremos esta seção revisando as observações que de monstraram inicialmente que as estruturas da cromatina podem ser herdadas A seguir descreveremos alguns aspectos químicos que tornam isso possível as modificações co valentes das histonas nos nucleossomos Essas modificações possuem muitas funções na medida em que atuam como sítios de reconhecimento para domínios de proteínas que se ligam a complexos proteicos específicos a diferentes regiões da cromatina Dessa forma as histonas têm efeito na expressão gênica bem como em vários outros processos ligados ao DNA Por meio desses mecanismos a estrutura da cromatina desempenha um papel importante no desenvolvimento no crescimento e na manutenção de todos os organismos eucarióticos incluindo humanos A heterocromatina é altamente organizada e restringe a expressão gênica Estudos de microscopia óptica na década de 1930 mostraram dois tipos diferentes de cromatina do núcleo em interfase de várias células de eucariotos superiores uma forma altamente condensada chamada de heterocromatina e todo o resto uma forma menos condensada chamada de eucromatina A heterocromatina representa uma forma com pacta especial ver Figura 49 e ainda há muito a ser entendido sobre suas propriedades moleculares Ela é grandemente concentrada em algumas regiões especializadas parti cularmente nos centrômeros e telômeros introduzidos anteriormente ver Figura 419 mas também está presente em vários outros locais nos cromossomos locais que podem variar de acordo com o estado fisiológico da célula Em uma célula típica de mamíferos mais de 10 do genoma estão empacotados nessa forma Normalmente o DNA na heterocromatina contém poucos genes quando regiões da eucromatina são convertidas ao estado de heterocromatina seus genes geralmente são desligados Contudo sabemos que o termo heterocromatina inclui inúmeros modos distintos de compactação da cromatina que possuem implicações diferentes na expres são gênica Portanto a heterocromatina não deve ser considerada simplesmente como uma forma de isolamento do DNA morto e sim como um modo de descrever domínios compactos de cromatina que possuem em comum a característica de ser anormalmente resistentes à expressão gênica O estado da heterocromatina é autopropagável Por meio de quebras e religações cromossômicas causadas por um acidente genético natural ou por um artifício experimental um segmento cromossômico normalmente eu cromático pode ser translocado para um local próximo à heterocromatina Notavelmen te isso provoca quase sempre o silenciamento a inativação de genes normalmente ativos Esse fenômeno é denominado efeito posicional Ele reflete a distribuição do es tado de heterocromatina na região originalmente eucromática e fornece indicações im portantes para os mecanismos de criação e manutenção da heterocromatina Os efeitos posicionais primeiramente reconhecidos em Drosophila foram observados em vários eucariotos incluindo leveduras plantas e humanos CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 195 Nos eventos de quebra e religação do tipo descrito acima a zona de silenciamen to em que a eucromatina é convertida a um estado de heterocromatina é espalhada a distâncias diferentes nas diferentes células precoces do embrião da mosca Interessan temente essas diferenças são perpetuadas pelo resto da vida do animal em cada célula uma vez estabelecida a condição da heterocromatina em um segmento da cromatina ela tende a ser herdada de modo estável por toda descendência da célula Figura 431 Esse fenômeno surpreendente chamado de efeito posicional variegado foi inicialmen te identificado por uma análise genética detalhada da perda do pigmento vermelho no olho da mosca produzindo efeito de pintas Figura 432 Esse efeito apresenta seme lhanças com a extensa propagação da heterocromatina que inativa um dos dois cromos somos X nas fêmeas de mamíferos Nesse caso também ocorre um processo aleatório em cada célula do embrião no início do desenvolvimento que comanda qual cromosso mo X será inativado e esse mesmo cromossomo X permanecerá inativo em toda a des cendência da célula formando um mosaico de clones diferentes no organismo adulto ver Figura 750 Essas observações juntas levam a uma estratégia fundamental da formação da heterocromatina heterocromatina gera mais heterocromatina Esse mecanismo de re torno positivo pode atuar tanto no espaço causando a propagação do estado de hete rocromatina pelo cromossomo como no tempo por meio das gerações propagando o estado de heterocromatina da célulamãe às célulasfilhas O desafio é explicar os meca nismos moleculares que dirigem esse surpreendente comportamento Como primeira etapa uma pesquisa das moléculas envolvidas pode ser efetuada Isso foi realizado por meio de rastreamentos genéticos em que um grande número de mutantes é produzido e aqueles que apresentam uma anormalidade no processo es 1 2 3 4 5 Genes 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Heterocromatina Eucromatina Barreira TRANSLOCAÇÃO CROMOSSÔMICA Heterocromatina Eucromatina Na etapa inicial do desenvolvimento embrionário a heterocromatina é formada e propagase pela eucromatina vizinha em diferentes intensidades nas diferentes células A B Clone de células com o gene 1 inativo Clone de células com os genes 1 2 e 3 inativos Clone de células com nenhum gene inativo Proliferação celular Figura 431 A causa do efeito posicional variegado na Drosophila A A heterocromatina verde normalmente é impedida de se espalhar por regiões adjacentes da eucromatina vermelho por sequências de barreira de DNA que discutiremos adiante Nas moscas que herdam certos rearranjos cromossômicos essa barreira não está mais presente B Durante o início do desenvolvimento dessas moscas a heterocromatina pode se espalhar no DNA cromossômico vizi nho avançando por distâncias variadas em células diferentes A propagação logo para mas o padrão de heterocromatina estabelecido é subsequentemente herdado de modo que são produzidos grandes clones de células da progênie possuindo os mesmos genes vizinhos condensados em heterocromatina e portanto inativados por isso a aparência variegada de algumas dessas moscas ver Figura 432 Embora o termo propagação seja usado para descrever a formação de nova heterocromatina próxima à heterocromatina preexistente o termo pode não ser adequado Há evidências de que durante a expansão a condensação de DNA em heterocromatina pode pular algumas regiões de cromatina evitando efeitos repressores nos genes ali localizados Figura 432 Descoberta dos efeitos de posição na expressão gênica O gene White da mosca Drosophila controla a produção de pigmentos do olho recebendo essa denominação devido à mutação que permitiu sua identificação Moscas com o tipo selvagem do gene isto é com um gene White normal White possuem pigmentação normal nos olhos que lhes confere olhos vermelhos mas se o gene White estiver mutado e inativado as moscas mutantes White não produ zirão pigmentos e terão olhos brancos Nas moscas nas quais um gene White nor mal foi colocado próximo a uma região de heterocromatina foram produzidos olhos manchados com partes verme lhas e brancas As manchas brancas repre sentam as linhagens celulares em que o gene White foi silenciado pelos efeitos da heterocromatina Em contraste as man chas vermelhas representam as linhagens celulares onde o gene White é expresso Em estágios iniciais do desenvolvimento quando a heterocromatina é formada pela primeira vez ela se propaga pela eucroma tina adjacente em distâncias diferentes nas diferentes células embrionárias ver Figura 431 A presença de manchas de célu las vermelhas e brancas revela que o esta do de ativação transcricional determinado pela compactação do gene na cromatina naquelas células ancestrais é herdado por todas as célulasfilhas Inversão cromossômica rara Heterocromatina Gene White na localização normal Gene White próximo à heterocromatina Barreira Barreira 196 PARTE II Mecanismos genéticos básicos tudado são selecionados Rastreamentos genéticos extensos realizados em Drosophila fungos e camundongos identificaram mais de cem genes cujos produtos aumentam ou reduzem a propagação da heterocromatina e a estabilidade da herança em outras pa lavras genes que atuam como intensificadores ou supressores do efeito posicional varie gado Muitos desses genes codificam proteínas cromossômicas não histonas que intera gem com as histonas e estão envolvidas na modificação ou manutenção da estrutura da cromatina Discutiremos como elas atuam nas seções seguintes As histonas do cerne são modificadas covalentemente em vários sítios diferentes As cadeias laterais dos aminoácidos das quatro histonas no cerne do nucleossomo estão sujeitas a uma grande variedade de modificações covalentes incluindo a acetilação de lisinas a mono di e trimetilação de lisinas e a fosforilação de serinas Figura 433 Um grande número de modificações de cadeias laterais ocorre nas caudas Nterminais de histonas relativamente sem estrutura que se projetam para fora do nucleossomo Figu ra 434 Entretanto mais de 20 modificações específicas também ocorrem em cadeias laterais do cerne globular do nucleossomo Todos os tipos de modificações são reversíveis com uma enzima atuando na for mação de um tipo particular de modificação e outra para removêla Essas enzimas são altamente específicas Portanto por exemplo os grupos acetil adicionados a lisinas es pecíficas por um conjunto de diferentes histonas acetiltransferases HAT são removidos por um conjunto de complexos de histonas desacetilases HDACs Da mesma forma os grupos metil adicionados às cadeias laterais de lisinas por um grupo de diferentes me tiltransferases de histonas são removidos por um conjunto de demetilases de histonas Cada enzima é recrutada a sítios específicos na cromatina em períodos determinados durante a vida da célula Para a maioria o recrutamento inicial depende de proteínas reguladoras da transcrição às vezes denominadas fatores de transcrição ou regula dores de transcrição Como será discutido no Capítulo 7 essas proteínas reconhecem e H C C O O N H CH2 CH2 CH2 CH2 N Lisina Acetillisina Monometillisina Dimetillisina Trimetillisina Fosfosserina H C C O N H CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 H C C O N H CH2 CH2 CH2 CH2 N H C C O N H CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 H C C O N H CH2 CH2 H C C O N H CH2 O P O O O Serina H C C O N H CH2 OH CH2 CH2 H C H3C H H N H3C H CH3 N H3C CH3 CH3 A ACETILAÇÃO E METILAÇÃO DA LISINA SÃO REAÇÕES QUE COMPETEM B FOSFORILAÇÃO DA SERINA Figura 433 Alguns tipos de modificações importantes nas cadeias laterais de aminoá cidos ligados covalentemente encontradas nas histonas de nucleossomos A Três níveis diferentes de metilação de lisina são mostrados cada um reconhecido por uma proteína de ligação diferente e portanto cada um com um significado diferente para a célula Observe que a acetilação remove a carga positiva da lisina e que o mais importante uma lisina acetilada não pode ser metilada e viceversa B A fosforilação da serina adiciona uma carga negativa a uma histona Modificações de histonas não mostradas aqui incluem a mono ou a dimetilação da argi nina a fosforilação da treonina a adição de uma ADPribose a um ácido glutâmico e a adição de um grupo ubiquitila sumoil ou biotina a uma lisina CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 197 ligamse a sequências específicas de DNA nos cromossomos Elas são produzidas em di ferentes períodos e locais durante a vida de um organismo e assim determinam onde e quando as enzimas que modificam a cromatina irão atuar Sendo assim no final das con tas é a sequência de DNA que determina como as histonas são modificadas Porém pe los menos em alguns casos as modificações covalentes nos nucleossomos permanecem por muito tempo após o desaparecimento dos fatores de transcrição que as induziram fornecendo à célula portanto uma memória da história de seu desenvolvimento Mais notável ainda é que assim como no fenômeno de efeito posicional variegado discutido acima essa memória pode ser transmitida de uma geração celular à outra Padrões muito diferentes de modificações covalentes são encontrados nos diferen tes grupos de nucleossomos dependendo da sua posição exata no genoma e da história da célula As modificações das histonas são cuidadosamente controladas e apresentam consequências importantes A acetilação de lisinas nas caudas Nterminais afrouxa a estrutura da cromatina em parte porque a adição de um grupo acetil à lisina remove sua carga positiva reduzindo a afinidade das caudas aos nucleossomos adjacentes En tretanto os efeitos mais significativos das modificações das histonas é sua capacidade de recrutar outras proteínas específicas ao segmento de cromatina modificado A trime tilação de uma lisina específica na cauda da histona H3 por exemplo atrai a proteína específica de heterocromatina HP1 e contribui para o estabelecimento e propagação da heterocromatina Mais genericamente as proteínas recrutadas atuam junto com as histonas modificadas para determinar como e quando os genes serão expressos além de outras funções cromossômicas Dessa forma a estrutura exata de cada domínio da cromatina determina a leitura da informação genética que contém portanto a estrutura e função da célula eucariótica B A S G R G K Q G G K A R A K A K T R S S R A G L Q F P V G R V 13 15 9 5 1 P E P A K S A P A P K K G S K K A V T K A Q K K D G K K R K 5 12 1415 20 2324 A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S A P A T G G V K 2 4 9 10 14 1718 23 262728 36 S G R G K G G K G L G K G G A K R H R K V L R D N I Q G I T 1 3 5 8 12 16 20 P P P P P P A A A A A A A A A A A A A A M M M M A A A A M M A M M M M M M M A M H2A H2B H3 H4 Caudas Nterminais Domínios globulares Fosforilação Metilação Acetilação LEGENDA H3 H3 H3 H3 H4 H4 H4 H2B H2B H2B H2B H2A H2A H2A H2A Vista inferior Vista lateral Figura 434 Modificações covalentes nas caudas das histonas do cerne A Estrutura do nucleossomo ressaltando a localização dos primeiros 30 aminoácidos aproximadamente em cada uma das oito caudas Nterminais das histonas verde Essas caudas são desestruturadas e muito móveis alterando assim sua confor mação de acordo com as outras proteínas ligadas B As modificações mais bem conhecidas das quatro histonas do cerne estão indicadas Embora apenas um único símbolo seja utilizado para a metilação M cada lisina K ou arginina R pode ser metilada de várias maneiras Observe que algumas posições p ex lisina 9 de H3 podem ser modificadas tanto pela metilação como pela acetilação mas não por ambas A maioria das modificações mostradas adiciona uma molécula relativamente pequena nas caudas das histonas exceto a ubiquitina uma proteína com 76 aminoácidos também usada em outros processos celulares ver Figura 369 Não está mostrado mas existem mais de 20 modificações possíveis no cerne globular das histonas A código PDB 1KX5 B adaptada de H SantosRosa e C Caldas Eur J Cancer 4123812402 2005 Com permissão de Elsevier 198 PARTE II Mecanismos genéticos básicos A cromatina adquire mais variedade pela inserção sítioespecífica de um pequeno conjunto de variantes de histonas Além das quatro histonaspadrão do cerne altamente conservadas os eucariotos con têm algumas variantes de histonas que podem formar os nucleossomos Essas histonas estão presentes em quantidades muito pequenas comparadas às histonas principais e foram bem menos conservadas durante a evolução Variantes de histonas são conhe cidas para todas as histonas do cerne exceto H4 alguns exemplos estão ilustrados na Figura 435 As histonas principais são sintetizadas especialmente durante a fase S do ciclo ce lular e montadas nos nucleossomos das duplashélices de DNA das célulasfilhas logo atrás da forquilha de replicação ver Figura 532 Em contraste a maior parte das va riantes de histonas é sintetizada durante a interfase Elas normalmente são inseridas na cromatina já formada o que requer um processo de troca de histonas catalisado pelos complexos de remodelagem dependentes de ATP discutidos anteriormente Esses com plexos de remodelagem contêm subunidades que promovem sua ligação a sítios especí ficos na cromatina e também a chaperonas de histonas que carregam uma determinada variante Assim cada variante de histona é inserida na cromatina de forma altamente seletiva ver Figura 427 Modificações covalentes e variantes de histonas atuam em conjunto no controle das funções dos cromossomos O número de diferentes marcações possíveis em um mesmo nucleossomo é enorme e esse grande potencial de diversidade é ainda maior quando consideramos a possibili dade dos nucleossomos conterem variantes de histonas Contudo é sabido que as mo dificações das histonas ocorrem em grupos coordenados Mais de 15 desses grupos são identificados em células de mamíferos Ainda não está claro porém quantos tipos dife rentes de cromatina apresentam importância funcional nas células Algumas combinações são conhecidas por possuírem um significado específico na célula de modo a determinar quando e como o DNA compactado nos nucleosso mos deverá ser acessado ou manipulado levando à ideia de um código de histonas Por exemplo um tipo de marca indica que um segmento da cromatina foi recente mente replicado outro indica que o DNA na cromatina foi danificado e necessita ser reparado enquanto outros sinalizam quando e como a expressão gênica deve ocor rer Diversas proteínas reguladoras contêm pequenos domínios que se ligam a essas marcas específicas e reconhecem por exemplo uma lisina trimetilada na posição 4 na histona H3 Figura 436 Esses domínios estão normalmente ligados como módulos em uma única e grande proteína ou em complexos proteicos que assim reconhecem Repressão transcricional e inativação do cromossomo X Expressão gênica e segregação cromossômica Reparo e recombinação de DNA Função do centrômero e montagem do cinetocoro Ativação transcricional MacroH2A H2AZ H2AX H2A CENPA H33 H3 Enovelamento da histona FUNÇÃO ESPECIAL Enovelamento da histona Inserção da alça Figura 435 Estrutura de algumas formas variantes de histonas em comparação às histonas principais que elas substituem As variantes de histonas são inseridas nos nucleossomos em sítios cromossômicos específicos por enzimas de remodelagem da cromatina depen dentes de ATP que atuam juntamente às chaperonas de histonas ver Figura 427 A CENPA proteína centroméricaA uma variante da histona H3 é discutida mais adiante neste capítulo ver Figura 442 outras variantes são discutidas no Capítulo 7 As sequências com colorações diferen tes em cada variante indicam regiões com uma sequência de aminoácidos diferente da histona principal mostrada acima Adaptada de K Sarma e D Reinberg Nat Rev Mol Cell Biol 6139149 2005Com permissão de Macmillan Publishers Ltd CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 199 uma combinação específica de modificações nas histonas Figura 437 O resultado é um complexo de leitura que permite que uma determinanda combinação de marcas na cromatina atraia outras proteínas para executar uma função biológica específica no momento certo Figura 438 As marcas nos nucleossomos resultantes das adições covalentes às histonas são dinâmicas sendo constantemente removidas e adicionadas a velocidades que depen dem da localização cromossômica Como as caudas das histonas projetamse para fora do cerne nucleossômico e provavelmente estejam acessíveis mesmo quando a croma tina está condensada elas parecem propiciar um formato adequado para criar marca ções que podem ser prontamente alteradas de acordo com a mudança das necessidades da célula Embora muitos aspectos careçam de esclarecimentos alguns poucos exem plos bem estudados da informação que pode ser codificada pela cauda da histona H3 estão listados na Figura 439 Um complexo de proteínas de leitura e escrita marcação pode propagar modificações específicas da cromatina ao longo do cromossomo O fenômeno de efeito posicional variegado descrito anteriormente requer que algumas formas modificadas da cromatina tenham a capacidade de disseminarse por distâncias substanciais ao longo da molécula de DNA cromossômico ver Figura 431 Como isso é possível As enzimas que adicionam ou removem as modificações de histonas nos nucleossomos são componentes de complexos multiproteicos Elas podem inicialmen te ser trazidas a uma determinada região da cromatina por uma das proteínas de ligação Zn Zn Thr6 Thr3 Arg2 Lys4 Nterminal Ala Gln5 CH3 CH3 H3C N B C A Figura 436 Como uma marca no nucleossomo é lida A figura mostra a estrutura de um módulo proteico denominado domínio ING PHD que reconhece especificamente a lisina 4 trimetilada na histona H3 A Um grupo trimetil B Modelo de preenchimento de um do mínio ING PHD ligado à cauda de histona verde com o grupo trimetil destacado em amarelo C Modelo de fitas mostrando como os 6 aminoácidos Nterminais da cauda de H3 são reconhecidos As linhas vermelhas representam ligações de hidrogênio Este é um membro de uma família de domínios PHD que reconhece lisinas metiladas em histonas diferentes membros da família ligamse fortemente às lisinas localizadas em diferentes posições e podem diferenciar entre lisinas mono di e trimetiladas Da mesma forma outros pequenos módulos proteicos reconhecem cadeias laterais específicas que foram marcadas com grupos acetil fosfato e assim por diante Adaptada de PV Peña et al Nature 442100103 2006 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Figura 437 Reconhecimento de uma combinação específica de marcas em um nucleossomo Nos exemplos mostrados dois domínios adjacentes que compõem o complexo de remodelagem da cromatina NURF fator de remodelagem de nucleossomo do inglês nucleossome remodeling factor ligamse ao nucleossomo pelo domínio PHD em vermelho que reconhece uma lisina 4 metilada em H3 e um outro domínio um bromodomínio em azul reconhece uma lisina 16 acetilada em H4 Essas duas marcas nas histonas formam um padrão de modificação de histonas único que ocorre em alguns subgrupos de nucleossomos nas células humanas Aqui as duas caudas de histonas estão indicadas por linhas pontilhadas em verde e apenas uma metade de um nucleossomo é mostrada Adaptada de AJ Ruthenburg et al Cell 145692706 2011 Com permissão de Elsevier Saída da cauda de H3 do cerne Saída da cauda de H4 do cerne 200 PARTE II Mecanismos genéticos básicos ao DNA sequênciaespecíficas reguladores de transcrição discutido nos Capítulos 6 e 7 para um exemplo específico ver Figura 720 Mas após uma enzima de modificação escrever sua marca em um ou em alguns nucleossomos adjacentes seguemse eventos que se assemelham a uma reação em cadeia Nesses casos uma enzima de escrita atua em conjunto com uma proteína de leitura localizada no mesmo complexo proteico A proteína de leitura possui um módulo que reconhece a marca e se liga firmemente ao nucleossomo recémmodificado ver Figura 436 ativando a enzima de leitura ligada e Figura 438 Diagrama mostrando como uma combinação específica de modificações nas histonas pode ser identificada por um complexo de leitura Um grande complexo proteico com vários módulos pequenos cada um reconhecendo uma marca específica nas histonas está esquematicamente ilustrado em verde Esse complexo de leitura só irá se ligar fortemente a uma região da cromatina que contenha várias marcas nas histonas que são reconhecidas pelo com plexo Portanto apenas uma combinação específica de marcas provocará a ligação do complexo à cromatina e atrairá os com plexos proteicos adicionais em roxo ne cessários para catalisar funções biológicas Proteína de suporte Complexo proteico com atividades catalíticas e sítios de ligação adicionais Ligação de módulos proteicos a modificações específicas das histonas nos nucleossomos Modificação covalente na cauda da histona marca Ligação a outros componentes no núcleo resultando em expressão gênica silenciamento gênico ou outras funções biológicas Complexo de leitura A PROTEÍNA DE LEITURA LIGASE E ATRAI OUTROS COMPONENTES Figura 439 Alguns significados es pecíficos de modificações das histo nas A A figura mostra as modificações na cauda Nterminal da histona H3 repe tidas da Figura 434 B A cauda de H3 pode ser marcada por diferentes conjuntos de modificações que atuam em conjunto para produzir um determinado significado Apenas poucos significados são conheci dos incluindo os três exemplos apresenta dos Não está mostrado que a leitura das marcas de histona normalmente envolve o reconhecimento conjunto de marcas em outros sítios do nucleossomo como sugerido na Figura 438 juntamente com o reconhecimento indicado na cauda H3 Além disso níveis específicos de metilação grupos mono di ou trimetil geralmente são necessários Assim por exemplo a trimetilação da lisina 9 atrai a proteína HP1 específica da heterocromatina que induz uma onda de propagação de trimetilações adicionais da lisina 9 seguidas por mais li gações de HP1 de acordo com o diagrama geral ilustrado adiante ver Figura 440 Também é importante nesse processo a trimetilação sinérgica da lisina 20 na cauda Nterminal da histona H4 2 4 9 10 14 17 18 23 26 27 28 36 A A A M A M M M M M M M A P P Histona H3 K K K K K K K R R S S R 4 9 A M K K 27 K 9 M K A B Estado de modificação Significado Formação da heterocromatina silenciamento gênico Expressão gênica Silenciamento gênico complexo de repressão Polycomb M Trimetil Trimetil M Trimetil CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 201 a posicionando próxima ao nucleossomo adjacente Por vários ciclos de escrita e leitura a proteína de leitura pode carregar a enzima de leitura ao longo do DNA distribuindo a marca de mão em mão pelo cromossomo Figura 440 Na realidade o processo é mais complicado que o esquema descrito Tanto as proteínas de leitura como as de escrita são parte de um complexo proteico que pro vavelmente contenha diversas proteínas de leitura e escrita e necessite de diversas marcas nos nucleossomos para sua propagação Além disso muitos desses complexos de leitura e escrita também contêm uma proteína de remodelagem da cromatina de pendente de ATP ver Figura 426C e todos podem atuar em conjunto para condensar ou descondensar longos segmentos de cromatina à medida que a proteína de leitura se desloca progressivamente ao longo do DNA empacotado no nucleossomo Um processo semelhante é usado na remoção das modificações de histonas de regiões específicas do DNA nesse caso uma enzima de remoção como uma histona demetilase ou histona desacetilase é trazida para o complexo Como ocorre para o com plexo de escrita na Figura 440 proteínas de ligação a segmentos específicos de DNA reguladores de transcrição definem onde tais modificações devem ocorrer discutido no Capítulo 7 Uma ideia da complexidade dos processos acima pode ser evidenciada por meio de resultados de rastreamentos genéticos para genes que intensificam ou que reduzem a disseminação e a estabilidade da heterocromatina como demonstrado nos efeitos do efeito posicional variegado em Drosophila ver Figura 432 Como mencionado mais de cem genes desse tipo são conhecidos e a maioria deles parece codificar subunidades de proteínas de leitura e escrita de complexos de remodelagem ONDA DE PROPAGAÇÃO DE CONDENSAÇÃO DA CROMATINA Proteína reguladora Proteína de leitura Enzima modificadora de histonas proteína de escrita Modificação da histona marca LIGAÇÃO DE UM NOVO COMPLEXO DE LEITURA E ESCRITA REPETIÇÃO Figura 440 Como o recrutamento de um complexo de leitura e escrita pode espalhar alterações da cromatina ao longo do cromossomo A enzima de leitura cria uma modificação específica em uma ou mais das quatro histonas do nucleossomo Após seu recrutamento a um sítio específico no cromossomo por uma proteína de regulação da transcrição a proteína de escrita colabora com a de leitura para espalhar sua marcação de nucleossomo em nucleossomo por meio do complexo de leitura e escrita mencio nado Para esse mecanismo funcionar a proteína de leitura deve reconhecer a mesma marca de modificação de histona que a proteína de escrita produz sua liga ção à marca ativa a escrita e isso pode ser demonstrado No exemplo esquemático uma onda de propagação de condensação da cromatina é induzida desse modo As proteínas adicionais envolvidas incluindo um complexo de remodelagem da croma tina dependente de ATP necessário para reposicionar os nucleossomos modifica dos não estão mostradas 202 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Sequências de DNA de barreira bloqueiam a propagação dos complexos de leitura e escrita e portanto separam domínios de cromatina adjacentes O mecanismo mencionado para a propagação da estrutura da cromatina suscita uma questão Mesmo que cada cromossomo contenha uma molécula contínua e extrema mente longa de DNA como a cacofonia de conversas cruzadas entre domínios de cro matina adjacentes com diferentes estruturas e funções é evitada Estudos iniciais do efeito posicional variegado sugerem uma resposta determinadas sequências de DNA indicam os limites dos domínios de cromatina e separam esses domínios entre si ver Figura 431 Diversas dessas sequências de barreira foram identificadas e caracteriza das usando técnicas de engenharia genética que permite que segmentos específicos de DNA sejam removidos ou inseridos nos cromossomos Por exemplo nas células destinadas a originar os glóbulos vermelhos do sangue uma sequência chamada HS4 normalmente separa o domínio de cromatina ativa que contém o lócus da bglobina humana de uma região adjacente silenciada de cromati na condensada Se essa sequência for removida o lócus da bglobina é invadido pela cromatina condensada Essa cromatina silencia os genes nela contidos e se propaga em diferentes extensões nas diferentes células provocando um efeito posicional variegado semelhante ao observado na Drosophila Como descrito no Capítulo 7 as consequências são sérias os genes da globina são pouco expressos e indivíduos que possuem essa dele ção apresentam uma forma grave de anemia Em experimentos de engenharia genética a sequência HS4 é geralmente adicio nada às duas extremidades de um gene para ser inserido no genoma de mamíferos a fim de proteger o gene do silenciamento causado pela propagação da heterocromatina A análise da sequência de barreira revela que ela contém uma série de sítios de ligação para as enzimas acetilases de histonas Como a acetilação de uma cadeia lateral da lisina é incompatível com a metilação da mesma cadeia lateral e como a metilação de lisinas específicas é necessária para a propagação da heterocromatina as acetilases de histonas são candidatas lógicas à formação dessas barreiras de DNA à propagação Figura 441 Contudo vários outros tipos de modificações da cromatina são conhecidos e também protegem os genes do silenciamento A B C Propagação da heterocromatina Proteína de barreira Eucromatina Proteína de barreira Proteína de barreira Poro nuclear Figura 441 Alguns mecanismos de ação das barreiras Esses modelos de rivam de análises experimentais da ação das barreiras e uma combinação de vários deles pode atuar em um mesmo sítio A A união de uma região da cromatina a um grande sítio fixo como um poro nuclear ilustrado aqui pode formar uma barreira que bloqueia a propagação da heterocromatina B A forte ligação de proteínas de barreira a um grupo de nucle ossomos torna essa cromatina resistente à propagação da heterocromatina C Por meio do recrutamento de um grupo de enzimas de modificação de histonas alta mente ativas as barreiras podem apagar as marcas nas histonas necessárias para o espalhamento da heterocromatina Por exemplo a forte acetilação da lisina 9 na histona H3 irá competir com a metila ção da lisina 9 evitando assim a ligação da proteína HP1 necessária para formação da principal forma de heterocromatina Baseada em AG West e P Fraser Hum Mol Genet14R101R111 2005 Com permissão de Oxford University Press CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 203 A cromatina nos centrômeros revela como as variantes de histonas podem criar estruturas especiais Nucleossomos com variantes de histonas possuem uma característica distinta e parecem ser capazes de produzir marcas na cromatina com um duração anormalmente longa Um exemplo importante é visto na formação e na herança da estrutura de cromatina especializada no centrômero a região de cada cromossomo necessária à ligação ao fuso mitótico e segregação ordenada das cópias duplicadas do genoma para as célulasfilhas cada vez que a célula se divide Em vários organismos complexos incluindo humanos cada centrômero está inserido em uma região de cromatina centromérica especial que permanece durante a interfase mesmo que a ligação ao fuso e o movimento do DNA promovidos pelo centrômero ocorram durante a mitose Essa cromatina contém uma variante de histona H3 específica de centrômero conhecida como CENPA proteína centroméricaA ver Figura 435 além de proteínas adicionais que compactam os nu cleossomos em arranjos especialmente densos e formam o cinetocoro uma estrutura especial necessária à ligação ao fuso mitótico ver Figura 419 Uma sequência específica de DNA com aproximadamente 125 pares de nucleo tídeos é suficiente para atuar como um centrômero na levedura S cerevisiae Apesar do tamanho reduzido mais de uma dúzia de proteínas diferentes se associam a essa se quência de DNA as proteínas incluem a variante CENPA da histona H3 a qual junto com outras três proteínas do cerne de histonas forma o nucleossomo específico do cen trômero As proteínas adicionais no centrômero de leveduras ligam esse nucleossomo a um único microtúbulo a partir do fuso mitótico Figura 442 Centrômeros nos organismos mais complexos são consideravelmente maiores comparados a leveduras Por exemplo centrômeros de moscas e de humanos pos suem centenas de milhares de pares de nucleotídeos e mesmo que contenham CENP A não parecem conter uma sequência de DNA específica de centrômeros Esses cen trômeros consistem em grande parte em pequenas sequências repetidas de DNA conhecidas como DNA satélite alfa em humanos Porém essas mesmas sequências repetidas também são encontradas em outras posições não centroméricas nos cro mossomos indicando que não são suficientes para promover a formação do centrô mero É notável que em alguns casos raros foi observado que centrômeros humanos novos chamados de neocentrômeros formamse espontaneamente em cromosso mos fragmentados Algumas dessas novas posições eram originalmente eucromatina e não possuíam DNA satélite alfa Figura 443 Parece que os centrômeros de organis mos complexos são definidos por um conjunto de proteínas em vez de uma sequência específica de DNA A inativação de alguns centrômeros e a formação de novo de outros parece ter tido uma função essencial na evolução Espécies diferentes mesmo quando próximas em termos evolutivos normalmente têm números de cromossomos diferentes ver Figura Figura 442 Modelo para a estrutura de um centrômero simples A Na levedura Saccharomyces cerevisiae uma sequência de DNA centromérica especial é montada em um único nucleossomo no qual duas cópias de uma forma variante da histona H3 denominada CENPA na maioria dos organismos substituem a H3 normal B De que forma sequências pep tídicas exclusivas a essa variante ver Figura 435 auxiliam a montagem de proteínas adicionais entre elas as proteínas que for mam o cinetocoro O cinetocoro é atípico na captura de apenas um único microtú bulo os humanos possuem centrômeros muito maiores e formam cinetocoros capa zes de capturar 20 ou mais microtúbulos ver Figura 443 O cinetocoro é discutido em detalhes no Capítulo 17 Adaptada de A Joglekar et al Nat Cell Biol 8581 585 2006 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd A B Nucleossomo normal Nucleossomo com histona H3 específica do centrômero DNA centromérico de leveduras Microtúbulo Cinetocoro de leveduras Nucleossomo específico do centrômero Proteína de ligação ao DNA de sequência específica 204 PARTE II Mecanismos genéticos básicos 414 para um exemplo extremo Como será discutido a seguir comparações genômicas detalhadas mostram que em muitos casos as alterações no número de cromossomos surgiram por eventos de quebra e religação de cromossomos criando cromossomos no vos alguns dos quais inicialmente com número anormal de centrômeros tanto mais de um como nenhum Apesar disso a herança estável requer que cada cromossomo contenha um e apenas um centrômero Parece que centrômeros a mais devem ter sido inativados ou novos centrômeros criados de modo a permitir a manutenção estável dos conjuntos de cromossomos Algumas estruturas da cromatina podem ser herdadas diretamente As alterações na atividade do centrômero discutidas anteriormente uma vez estabeleci das precisam ser perpetuadas por meio das gerações Qual seria o mecanismo para esse tipo de herança epigenética Foi proposto que a formação de novo do centrômero requer um evento inicial de semeadura que envolve a formação de uma estrutura especializada de DNA e proteína e que contenha nucleossomos formados com a variante CENPA da histona H3 Em hu manos esse evento de semeadura ocorre mais prontamente em arranjos de DNA satélite alfa em comparação a outras sequências Os tetrâmeros H3H4 de cada nucleossomo na hélice de DNA original são diretamente herdados pelas hélicesirmãs de DNA na forqui lha de replicação ver Figura 532 Portanto uma vez que um conjunto de nucleossomos contendo CENPA tenha sido formado em um segmento de DNA é fácil entender como um novo centrômero é produzido no mesmo lugar em ambos os cromossomosfilhos após cada ciclo de divisão celular É necessário apenas assumir que a presença da histo na CENPA em um nucleossomo herdado recruta seletivamente mais histonas CENPA para os seus vizinhos recémformados Existem algumas semelhanças notáveis entre a formação e a manutenção dos cen trômeros e a formação e a manutenção de algumas outras regiões da heterocromatina Em particular todo o centrômero é formado como uma entidade única e total sugerindo Heterocromatina pericêntrica Centrômero inativo com DNA satélite alfa não funcional Centrômero ativo Neocentrômero formado sem DNA satélite alfa Repetição de ordem maior Monômero de DNA satélite alfa 171 pares de nucleotídeos A B Figura 443 Evidências para a plasticidade de formação de um centrômero humano A Diversas sequências ricas em AT de DNA satélite alfa são repetidas milhares de vezes em cada centrômero humano em vermelho envolvidos por he terocromatina pericêntrica em marrom Porém devido a um evento de quebra e religação ancestral alguns cromossomos humanos contêm dois blocos de DNA satélite alfa cada um provavelmente atuando como um centrômero no seu cromos somo original Normalmente cromossomos com dois centrômeros funcionais não são propagados de modo estável porque se ligam de modo incorreto ao fuso sendo quebrados durante a mitose Nos cromossomos que sobrevivem porém um dos centrômeros tornouse inativado de algum modo mesmo que contenha todas as sequências de DNA necessárias Isso per mite que o cromossomo seja propagado de modo estável B Em uma pequena parcela dos nascimentos humanos 12000 cromossomos extras são observados nas células dos descendentes Alguns desses cromossomos extras que foram formados por eventos de quebra não possuem DNA satélite alfa mas mesmo assim novos centrômeros neocentrômeros foram for mados a partir de DNA originalmente da eucromatina A complexidade da cromatina centromérica não é ilustrada nestes diagramas O DNA satélite alfa que forma a cromati na centromérica em humanos é compactada em blocos alternados de cromatina Um bloco é formado a partir de um longo cordão de nucleossomos contendo a variante de histona H3 CENPA o outro bloco contém nucleossomos especialmente marcados com dimetillisina 4 nas histonas H3 normais Cada bloco possui mais de mil nucleossomos Essa cromatina centro mérica é flanqueada pela heterocromatina pericêntrica como mostrado A cromatina pericêntrica contém lisina 9 metilada nas suas histonas H3 com a proteína HP1 e é um exemplo de heterocromatina clássica ver Figura 439 CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 205 que a criação da cromatina centromérica é um processo altamente cooperativo espa lhandose a partir de uma semente inicial de maneira que lembra o fenômeno de efeito posicional variegado discutido anteriormente Nos dois casos uma estrutura particular de cromatina uma vez formada é diretamente herdada pelo DNA seguinte a cada tur no de replicação cromossômica Um recrutamento cooperativo de proteínas juntamente com a ação dos complexos de escrita e leitura não apenas é responsável pela propagação de formas específicas de cromatina no espaço ao longo do cromossomo como também pela sua propagação através das gerações da célulamãe às célulasfilhas Figura 444 Experimentos com embriões de rã sugerem que estruturas da cromatina de ativação e de repressão podem ser herdadas epigeneticamente A herança epigenética tem uma função crucial na formação de organismos multicelula res Os seus tipos celulares diferenciados são estabelecidos durante o desenvolvimento e são mantidos mesmo após repetidos ciclos de divisão celular As filhas de uma célula hepática continuam sendo células hepáticas as de células epidérmicas continuam como células epidérmicas e assim por diante apesar de possuírem o mesmo genoma e isso é porque padrões distintos de expressão gênica são transmitidos fielmente da célulamãe às celulasfilhas A estrutura da cromatina possui importante função nessa transmissão epigenética da informação de uma geração celular para a próxima Um tipo de evidência resultou de estudos nos quais o núcleo de uma célula de uma rã ou girino foi transplantado para um óvulo de rã cujo núcleo foi removido óvulo enucleado Em uma série de experimentos clássicos realizados em 1968 foi demons trado que um núcleo retirado de uma célula doadora diferenciada pode ser reprogra mado dessa forma para permitir o desenvolvimento de um novo girino inteiro ver Figu ra 72 Porém essa reprogramação ocorre com dificuldade e é cada vez menos eficiente à medida que são usados núcleos de animais mais velhos Assim por exemplo menos de 2 dos óvulos enucleados injetados com núcleo de uma célula epitelial de girino se desenvolveu ao estágio de girino jovem comparado a 35 quando o núcleo doador foi retirado de um embrião jovem estágio de gástrula Com novos recursos técnicos a causa da resistência à reprogramação pode ser estudada Ela surge pelo menos em parte porque estruturas específicas da cromatina nos núcleos diferenciados originais tendem a ser mantidos e transmitidos pelos inúmeros ciclos de divisão celular neces sários no desenvolvimento embrionário Experimentos com embriões de Xenopus de monstaram que formas específicas de estruturas de cromatina tanto de ativação como de repressão foram mantidas por 24 ciclos de divisões celulares resultando em expres são gênica inadequada A Figura 445 descreve brevemente o experimento com foco na cromatina contendo a variante de histona H33 Voltaremos a esses fenômenos na Figura 444 Como a compactação de DNA na cromatina pode ser herdada após a replicação cromossômica Neste modelo alguns dos componentes espe cializados da cromatina são distribuídos para cada cromossomoirmão após a du plicação do DNA juntamente com os nu cleossomos especialmente marcados aos quais se ligam Após a replicação de DNA os nucleossomos modificados herdados atuam em conjunto com os componentes da cromatina alterando o padrão de mo dificação das histonas nos nucleossomos recémformados nas proximidades Isso gera sítios de ligação para os mesmos componentes da cromatina que se ligam e completam a estrutura Esse último pro cesso parece envolver complexos de leitura e escrita e remodelagem que operam de modo similar ao previamente ilustrado na Figura 440 Proteínas de heterocromatina Nucleossomos Heterocromatina Eucromatina Heterocromatina Eucromatina Heterocromatina Eucromatina DUPLICAÇÃO CROMOSSÔMICA NOVAS PROTEÍNAS DE HETEROCROMATINA ADICIONADAS ÀS REGIÕES COM HISTONAS MODIFICADAS Modificação das histonas 206 PARTE II Mecanismos genéticos básicos seção final do Capítulo 22 onde discutiremos as células germinativas e as maneiras que convertem um tipo celular em outro As estruturas da cromatina são importantes para a função dos cromossomos eucarióticos Embora existam ainda várias lacunas no entendimento das funções das diferentes estru turas de cromatina é provável que o empacotamento do DNA nos nucleossomos tenha sido crucial para a evolução de eucariotos Para formar um organismo multicelular com plexo as células de diferentes linhagens devem se especializar pela alteração do acesso e da atividade de várias centenas de genes Como descrito no Capítulo 21 esse processo depende da memória celular cada célula mantém um registro da história de seu desen volvimento nos circuitos reguladores que controlam seus diversos genes Esse registro parece ser parcialmente armazenado na estrutura da cromatina Apesar de as bactérias também possuírem mecanismos de memória celular a complexidade dos circuitos de memória nos eucariotos superiores é incomparável Es tratégias com base em variações locais da estrutura da cromatina exclusiva em eucario tos podem permitir que genes particulares uma vez ativados ou desativados permane çam nesse estado até que um fator novo os reverta Em um extremo estão as estruturas como a cromatina centromérica que uma vez estabelecida é herdada de modo estável de uma geração celular à outra Da mesma forma o principal tipo clássico de hetero cromatina que contém longos agrupamentos da proteína HP1 ver Figura 439 pode persistir de modo estável por toda a vida Em contraste uma forma de cromatina con densada criada por um grupo de proteínas Polycomb atua silenciando genes que devem ser mantidos inativos em determinadas condições mas ativos em outras Esse último mecanismo governa a expressão de um grande número de genes que codificam regu ladores de transcrição importantes nas fases iniciais do desenvolvimento embrionário como discutido no Capítulo 21 Existem muitas outras formas variantes de cromatina algumas com pouca duração muitas vezes menos de um período de divisão da célula Discutiremos mais sobre a variedade dos tipos de cromatina na próxima seção Figura 445 Evidência para a herança de um estado de cromatina ativador de genes O gene MyoD bem caracteri zado codifica a principal proteína de re gulação da transcrição no músculo MyoD ver p 399 Esse gene é normalmente ati vado na região indicada do embrião jovem onde os somitos são formados Quando um núcleo dessa região é injetado em um óvulo enucleado como mostrado a maior parte dos núcleos da progênie da célula expressam a proteína MyoD de modo anormal em regiões não musculares do embrião com transplante nuclear que é formado Essa expressão anormal pode ser atribuída à manutenção da região do pro motor MyoD em seu estado de cromatina ativa pelos vários ciclos de divisão celular que produz o embrião estágio de blástu la a chamada memória epigenética que persiste nesse caso na ausência da transcrição A cromatina ativa ao redor do promotor MyoD contém a variante de histona H33 ver Figura 435 na forma metilada na lisina 4 Como indicado uma superprodução dessa histona causada pela injeção do mRNA que codifica a proteína H33 normal em excesso aumenta tanto a ocupação de H33 no promotor MyoD quanto a produção epigenética de MyoD enquanto a injeção de um mRNA produzindo a forma mutante de H33 que não pode ser metilada na Lys4 reduz a produção epigenética de MyoD Esses experimentos demonstram que um estado herdado da cromatina é o fundamento para a memória epigenética observada Adaptada de RK Ng e JB Gurdon Nat Cell Biol 10102109 2008 Com permis são de Macmillan Publishers Ltd Embrião de Xenopus doador Células dos somitos expressando MyoD Óvulo enucleado Transferência nuclear Embrião no estágio de duas células Sem injeção controle Células analisadas para expressão de MyoD e para a histona H33 no promotor MyoD Injeção do mRNA H33 mutante Injeção do mRNA H33 normal ALTA MEMÓRIA EPIGENÉTICA DE MyoD alta produção da proteína MyoD MODERADA MEMÓRIA EPIGENÉTICA DE MyoD BAIXA MEMÓRIA EPIGENÉTICA DE MyoD pouca produção da proteína MyoD Embriões no estágio de blástula CAPÍTULO 4 DNA cromossomos e genomas 207 Resumo Nos cromossomos dos eucariotos o DNA é uniformemente arranjado em nucleossomos mas existe uma grande variedade de estruturas de cromatina possíveis Essa variedade baseiase em um grande conjunto de modificações covalentes reversíveis das quatro histonas no cerne do nucleossomo Essas modificações incluem mono di e trimetilação de várias cadeias laterais da lisina uma reação importante que é incompatível com a acetilação que pode ocorrer nessas mesmas lisinas Combinações específicas das modificações marcam muitos nucleossomos dirigindo sua interação com outras proteínas Essas marcas são lidas quando módulos proteicos que compõem um complexo proteico maior se ligam aos nucleossomos modificados em uma região da cromatina Essas proteínas de leitura por sua vez atraem proteínas adicionais que realizam várias funções Alguns complexos de proteínas de leitura contêm uma enzima que modifica histonas como a lisina metilase de histonas que escreve a mesma marca reconhecida pela proteína de leitura Um complexo de remodelagem de leitura e escrita desse tipo pode propagar uma forma específica de cromatina pelo cromossomo Em particular grandes regiões de heterocromatina parecem ser formadas desse modo A heterocromatina é normalmente encontrada ao redor dos centrômeros e próxima aos telômeros mas também está presente em diversos outros locais dos cromossomos O forte empacotamento do DNA em heterocromatina normalmente provoca o silenciamento dos genes nessa região O fenômeno do efeito posicional variegado fornece forte evidência para a herança de estados condensados da cromatina de uma geração a outra Um mecanismo semelhante parece ser responsável pela manutenção da cromatina especializada nos centrômeros Mais genericamente a capacidade de propagar estruturas específicas da cromatina através de gerações celulares torna possível um processo de memória celular epigenética que possui uma função essencial na preservação dos diferentes grupos de estados celulares necessários aos organismos multicelulares complexos A ESTRUTURA GLOBAL DOS CROMOSSOMOS Após discutir o DNA e as moléculas proteicas que constituem a fibra de cromatina nos voltamos agora para a organização do cromossomo em uma escala mais global e para o modo como seus vários domínios são organizados no espaço Na forma de fibra de 30 nm um cromossomo típico humano tem 01 cm de comprimento e é capaz de se expandir no núcleo mais de cem vezes Obviamente deve haver um nível superior de enovelamento mesmo nos cromossomos interfásicos Embora os detalhes moleculares sejam em grande parte um mistério essa compactação de mais alta ordem certamente envolve o enovelamento da cromatina em uma série de alças e espirais A estrutura da cromatina interfásica é fluida e frequentemente sofre alterações em resposta às necessidades da célula Iniciaremos esta seção descrevendo alguns cromossomos de interfase não comuns que podem ser facilmente visualizados Apesar de excepcionais estes casos especiais revelam características que parecem representar todos os cromossomos de interfase Além disso eles fornecem formas de investigar alguns aspectos fundamentais da estrutura da cromatina que mencionamos nas seções anteriores A seguir descreveremos como um cromossomo de interfase típico é organizado no núcleo celular de mamíferos Os cromossomos são dobrados em grandes alças de cromatina Informações sobre a estrutura dos cromossomos de células na interfase foram obtidas por meio de estudos sobre cromossomos rígidos e enormemente estendidos em oócitos de anfíbios em desenvolvimento óvulos imaturos Esses cromossomos plumosos em inglês lampbrush muito incomuns os maiores cromossomos conhecidos pareados na preparação para a meiose são claramente visíveis mesmo em microscopia óptica e podem ser vistos organizados em uma série de grandes alças de cromatina que se projetam a partir de um eixo cromossômico linear Figura 446 e Figura 447 Figura 446 Um modelo para os domínios de cromatina em um cromossomo plumoso Apenas uma pequena porção de um par das cromátidesirmãs está mostrada Duas duplashélices de DNA idênticas estão alinhadas lado a lado condensadas em diferentes tipos de cromatina O conjunto de cromossomos plumosos em vários anfíbios contém um total de aproximadamente 10 mil alças semelhantes às alças mostradas na figura O restante do DNA em cada cromossomo a grande maioria permanece supercondensado Quatro cópias de cada alça estão presentes na célula porque cada cromossomo plumoso consiste em dois conjuntos alinhados de cromátides pareadas Essa estrutura de quatro fitas é característica dessa etapa de desenvolvimento do oócito que fica suspenso no estágio diplóteno da meiose ver Figura 1756 CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 209 lulas imensas que contêm centenas de milhares de cópias do genoma Além disso nesse caso todas as cópias de cada cromossomo estão alinhadas lado a lado numa lista exata como em uma caixa de canudos formando cromossomos politênicos gigantes Esse caso permite a detecção das características que se acredita ocorrer nos cromossomos de interfase comuns mas que são normalmente difíceis de serem visualizados Quando os cromossomos politênicos das glândulas salivares de mosca são vistos em um microscópio óptico bandas escuras e regiões interbandas claras distintas e al ternadas são identificadas Figura 450 cada uma formada por milhares de sequências de DNA idênticas dispostas lado a lado como em uma lista Cerca de 95 do DNA do cromossomo politênico estão dispostos nas bandas e 5 nas interbandas Uma banda muito fina contém cerca de 3 mil pares de nucleotídeos enquanto uma banda espes sa pode conter 200 mil pares de nucleotídeos em cada uma de suas fitas de cromatina A cromatina de cada banda aparece escura porque o DNA é muito mais condensado que o DNA nas interbandas podendo também conter uma maior concentração de proteínas Figura 451 Esse padrão de bandas parece refletir o mesmo tipo de organização iden tificado nos cromossomos plumosos de anfíbios descrito previamente Existem aproximadamente 3700 bandas e 3700 interbandas no conjunto comple to de cromossomos politênicos de Drosophila As bandas podem ser reconhecidas pelas suas diferentes espessuras e espaçamentos e cada uma recebe um número que a iden tifica gerando um mapa cromossômico indexado à sequência do genoma finalizado desse inseto Os cromossomos politênicos de Drosophila fornecem um bom ponto de partida para a análise de como a cromatina é organizada em larga escala Na seção anterior vi mos que existem várias formas de cromatina cada uma contendo nucleossomos com diferentes combinações de histonas modificadas Grupos específicos de proteínas não histonas se associam aos nucleossomos e afetam a função biológica de várias manei ras O recrutamento de algumas dessas proteínas não histonas pode ser propagado por REMOÇÃO DAS LIGAÇÕES CRUZADAS PELO TRATAMENTO COM CALOR E PROTEÓLISE O produto de DNA é obtido somente se as proteínas mantiverem as duas sequências de DNA unidas próximas entre si na célula VERIFICAÇÃO DOS SEGMENTOS LIGADOS PELA PCR Proteínas de ligação ao DNA Formação da ligação cruzada TRATAMENTO COM FORMALDEÍDO CORTAR COM NUCLEASE DE RESTRIÇÃO LIGAÇÃO DO DNA Sondas de DNA usadas para PCR Figura 448 Método para determi nação da posição das alças em cro mossomos de interfase Nessa técnica conhecida como método de captura de conformação cromossômica 3C as células são tratadas com formaldeído para criar ligações cruzadas covalentes DNAproteína e DNADNA O DNA é então tratado com uma enzima uma endonuclease de restrição que cliva o DNA em vários segmentos em sequências bem definidas e forma conjuntos de extremidades coesivas idênticas ver Figura 828 As extremidades coesivas podem ser unidas pelo pareamento entre bases complementares Antes da etapa de ligação mostrada o DNA é diluído de modo que os fragmentos mantidos nas proximidades pela ligação cruzada são os preferidos para o pareamento Finalmente as ligações cruzadas são revertidas e os fragmentos recémligados de DNA são identificados e quantificados por reação em cadeia da polimerase PCR polymerase chain reaction descrita no Capítulo 8 Esses resultados combinados à informa ção da sequência de DNA permitem a dedução de modelos para a conformação dos cromossomos de interfase Fibra de cromatina dobrada Domínio em alça Alto nível de expressão dos genes na alça Proteínas que formam o suporte do cromossomo Enzimas de modificação de histonas Complexos de remodelagem de cromatina RNApolimerase Figura 449 Modelo para a organização de um cromossomo na interfase Um corte de um cromossomo interfásico é mostrado dobrado em uma série de domínios de alças cada uma contendo cerca de 50 mil a 200 mil pares de nucleotídeos ou mais na duplahélice de DNA condensada na fibra de cromatina A cromatina em cada alça individual é condensada ainda mais por processos de enovelamento pouco entendidos os quais são revertidos quando a célula neces sita de acesso direto ao DNA empacotado na alça Nem a composição do possível eixo nem a possível ancoragem da fibra dobrada de cromatina nesse eixo es tão claras Porém nos cromossomos mitóticos as bases das alças cromossômicas são enriquecidas tanto em condensinas discutidas adiante como em enzimas DNAtopoisomerases II discutidas no Capítulo 5 duas proteínas que podem formar uma boa parte do eixo na metáfase 214 PARTE II Mecanismos genéticos básicos são formados apenas quando há necessidade e criam uma alta concentração local de diversas enzimas e moléculas de RNA necessárias a um determinado processo De forma análoga quando o DNA é danificado por irradiação o conjunto de enzi mas necessário para efetuar o reparo forma agregados em pontos discretos dentro do núcleo gerando fábricas de reparo ver Figura 552 Com frequência os núcleos contêm centenas de pontos discretos representando fábricas para a síntese de DNA ou RNA ver Figura 647 Parece que todos esses processos utilizam o tipo de conexão ilustrada na Figura 458B em que segmentos longos e flexíveis de cadeias polipetídicas eou moléculas de RNA longo não codificador são intercalados com sítios de ligação específicos que con centram as diversas proteínas e outras moléculas necessárias para catalisar um deter minado processo Não é de surpreender que as conexões também sejam usadas para auxiliar no aumento da velocidade de processos biológicos no citoplasma aumentando a velocidade específica da reação para exemplos ver Figura 1618 Existe também uma estrutura de sustentação intranuclear análoga ao citoesque leto na qual os cromossomos e outros componentes do núcleo estão organizados A matriz nuclear ou de suporte é definida como o material insolúvel que permanece no núcleo após uma série de etapas de extração bioquímica Muitas das proteínas e molé culas de RNA que formam esse material insolúvel provavelmente são derivadas dos sub compartimentos nucleares fibrosos discutidos anteriormente enquanto outras podem ser proteínas que auxiliam a formar a base das alças cromossômicas ou que ligam os cromossomos a outras estruturas no núcleo Cromossomos mitóticos são especialmente supercondensados Após discutirmos a estrutura dinâmica dos cromossomos interfásicos veremos ago ra os cromossomos mitóticos Os cromossomos de quase todas as células eucarióticas tornamse prontamente visíveis ao microscópio óptico durante a mitose quando for mam espirais e produzem estruturas altamente condensadas Essa condensação reduz o comprimento de um cromossomo interfásico típico em apenas cerca de dez vezes mas produz uma alteração drástica na aparência dos cromossomos A Figura 459 representa um cromossomo mitótico típico no estágio da metáfa se para estágios da mitose ver Figura 173 As duas moléculas de DNA produzidas na replicação durante a interfase do ciclo de divisão celular são dobradas separadamente produzindo dois cromossomosirmãos ou cromátidesirmãs unidas pelos centrômeros como mencionado anteriormente Esses cromossomos normalmente são recobertos por várias moléculas incluindo grandes quantidades de complexos proteínaRNA Uma vez A B Envelope nuclear Figura 458 Compartimentalização efetiva sem a membrana bicamada A Ilustração esquemática da organização de uma organela subnuclear esférica à esquerda e um subcompartimento possivelmente organizado de modo seme lhante logo abaixo do envelope nuclear à direita Em ambos os casos os RNAs eou as proteínas em cinza se associam formando estruturas altamente porosas como um gel que contêm os sítios de ligação para outras proteínas e moléculas de RNA específicas objetos coloridos B Forma pela qual a união de um grupo determinado de proteínas e moléculas de RNA a longas cadeias flexíveis de polímero como em A pode criar áreas organizadas que aceleram bastante a velocidade de reação em subcompartimentos do núcleo As reações catalisadas dependem das macromoléculas localizadas na união Essa mesma estratégia de aceleração de vias de reações complexas é também usada em subcompartimentos em outros locais da célula ver também Figura 378 Cromossomo Centrômero Cromátide Figura 459 Cromossomo mitótico típico de metáfase Cada cromátideirmã contém uma das duas moléculasirmãs de DNA idênticas produzidas previamente no ciclo celular pela replicação de DNA ver também Figura 1721 216 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Resumo Geralmente os cromossomos estão descondensados durante a interfase de forma que os de talhes em sua estrutura são difíceis de serem visualizados Notáveis exceções são os cromos somos plumosos especializados dos oócitos de vertebrados e os cromossomos politênicos das células secretoras gigantes de insetos Estudos desses dois tipos de cromossomos interfá sicos sugerem que cada molécula de DNA em um cromossomo está dividida em um grande número de domínios discretos e organizados em alças de cromatina que são adicionalmen te compactadas por dobramento Quando os genes contidos em uma alça são expressos a alça é desdobrada e permite que a maquinaria celular tenha fácil acesso ao DNA Os cromossomos interfásicos ocupam territórios discretos no núcleo celular isto é eles não estão extensivamente entrelaçados A eucromatina constitui a maior parte do cromossomo interfásico sendo provável que quando não está sendo transcrita apresente a forma de fibras de nucleossomos compactados fortemente dobradas Entretanto ela é interrompida por segmentos de heterocromatina em que os nucleossomos estão sujeitos a níveis adicionais de empacotamento o que normalmente torna o DNA resistente à ex pressão gênica A heterocromatina apresentase de várias formas algumas encontradas em grandes blocos nos centrômeros e ao redor deles assim como próximas aos telômeros Porém a heterocromatina também está presente em outras posições nos cromossomos onde pode ajudar na regulação de genes importantes do desenvolvimento O interior do núcleo é altamente dinâmico com a heterocromatina normalmente posicionada próxima ao envelope nuclear e as alças de cromatina movendose para fora de seu território cromossômico durante a alta expressão de seus genes Isso reflete a exis tência de subcompartimentos nucleares em que diferentes grupos de reações bioquími cas são facilitados por um aumento na concentração de proteínas e RNAs selecionados Os componentes envolvidos na formação dos subcompartimentos podem se autoorgani zar em organelas discretas como os nucléolos e os corpos de Cajal podendo também ser presos a estruturas fixas como o envelope nuclear Durante a mitose a expressão gênica é desligada e todos os cromossomos adotam uma conformação extremamente condensada em um processo que começa no início da fase M e empacota as duas moléculas de DNA de cada cromossomo replicado como duas cromátides dobradas separadamente A condensação é acompanhada por modificações das histonas que promovem a compactação da cromatina porém a finalização satisfatória desse processo ordenado que reduz a distância de cada molécula de DNA de ponta a pon ta do seu comprimento na interfase por um fator adicional de 10 requer proteínas extras COMO OS GENOMAS EVOLUEM Nesta seção final do capítulo apresentamos uma visão geral de como os genes e os geno mas evoluíram ao longo do tempo produzindo a grande diversidade de formas de vida atuais no nosso planeta O sequenciamento dos genomas de milhares de organismos está revolucionando nosso entendimento do processo evolutivo revelando uma riqueza de informações impressionante não apenas sobre as relações de parentesco entre diferentes organismos mas também sobre os mecanismos moleculares que permitiram a evolução Talvez não seja surpreendente que genes com funções semelhantes possam ser encontrados em uma variedade de coisas vivas A maior revelação dos últimos 30 anos porém é o grau de conservação que as sequências nucleotídicas de vários genes apre sentam Genes homólogos isto é genes semelhantes tanto na sua sequência nucleotí dica como na função devido a um ancestral comum muitas vezes podem ser reconhe cidos mesmo por meio de distâncias filogenéticas enormes Homólogos incontestáveis de vários genes humanos estão presentes em organismos tão diversos como vermes ne matódeos moscasdasfrutas leveduras e até mesmo em bactérias Em muitos casos a semelhança é tão próxima que por exemplo a porção que codifica a proteína de um gene de leveduras pode ser substituída por seu homólogo humano mesmo que huma nos e leveduras estejam separados por mais de 1 bilhão de anos de história evolutiva Como enfatizado no Capítulo 3 o reconhecimento de similaridades entre sequên cias tornouse uma ferramenta importante para associar um gene a uma função protei ca Embora uma sequência similar não garanta similaridade de função está provado que fornece excelentes indicações Então é geralmente possível prever a função de genes em CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 217 humanos para os quais não há informação bioquímica nem genética disponível sim plesmente pela comparação das sequências nucleotídicas a sequências de genes que já foram caracterizados em organismos mais estudados Em geral a sequência de genes individuais é muito mais fortemente conservada do que a estrutura genômica completa Características da organização dos genomas como tamanho número de cromossomos ordem dos genes ao longo do cromossomo abundância e tamanho dos íntrons e quantidade de DNA repetitivo variam bastante quando comparadas com organismos distantes bem como o número de genes que cada organismo contém A comparação genômica revela sequências de DNA funcionais através de sua conservação durante a evolução Um primeiro obstáculo na interpretação da sequência dos 32 bilhões de pares de nu cleotídeos no genoma humano é o fato de a sua maioria provavelmente não ter impor tância funcional As regiões do genoma que codificam as sequências de aminoácidos das proteínas os éxons são normalmente encontradas em pequenos segmentos com tamanho médio de 145 pares de nucleotídeos pequenas ilhas em um mar de DNA cuja sequência nucleotídica exata parece ser o que menos importa Essa disposição dificulta a identificação de todos os éxons em um segmento de DNA tornando também difícil determinar onde exatamente onde um gene começa e termina Uma abordagem muito importante para decifrar nosso genoma é pesquisar se quências de DNA muito semelhantes em espécies diferentes seguindo o princípio de que uma sequência de DNA que possui uma função é muito mais provável de ser con servada do que uma sequência sem função Por exemplo humanos e camundongos divergiram de um mamífero ancestral comum há cerca de 80 10 6 anos tempo longo o suficiente para a maioria dos nucleotídeos desses genomas sofrerem eventos de mu tações ao acaso Como consequência as únicas regiões que permaneceram muito simi lares nos dois genomas são aquelas em que as mutações prejudicaram funções impor tantes e colocaram os indivíduos que as carregam em desvantagem resultando na sua eliminação da população por seleção natural Esses segmentos de DNA muito similares são conhecidos como regiões conservadas Além de revelarem sequências de DNA que codificam éxons funcionalmente importantes e moléculas de RNA essas regiões conser vadas incluem sequências reguladoras de DNA e sequências de DNA com funções ainda desconhecidas Em contraste a maioria das regiões não conservadas refletem DNA cuja sequência provavelmente é menos crítica para a função A potência desse método pode ser ampliada incluindose nessa comparação os genomas de um grande número de espécies cujos genomas já foram sequenciados como ratos galinhas peixes cachorros e chimpanzés além de camundongos e huma nos Expondo os resultados desse longo experimento natural que durou centenas de milhares de anos essas análises comparativas do sequenciamento de DNA revelaram as regiões mais interessantes no nosso genoma As comparações demonstraram que cerca de 5 do genoma humano consiste em sequências conservadas em multiespé cies Para nossa grande surpresa apenas cerca de um terço dessas sequências codificam proteínas ver Tabela 41 p 184 Muito do restante das sequências conservadas consiste em regiões de sítios de ligação a proteínas envolvidas na regulação gênica e algumas produzem moléculas de RNA que não são traduzidas em proteínas mas são importan tes para outras finalidades conhecidas Contudo mesmo nas espécies mais estudadas a função da grande maioria dessas sequências altamente conservadas permanece sem explicação Essa descoberta levou à conclusão de que entendemos muito menos sobre a biologia celular de vertebrados do que pensávamos Certamente existem enormes opor tunidades para novas descobertas e podemos esperar muitas surpresas à frente Alterações no genoma são causadas por falhas nos mecanismos normais que copiam e mantêm o DNA e por elementos de DNA transponíveis A evolução depende de acidentes e erros seguidos de sobrevivência não aleatória A maioria das alterações genéticas que ocorrem simplesmente resulta de falhas nos 218 PARTE II Mecanismos genéticos básicos mecanismos normais pelos quais os genomas são copiados e corrigidos quando dani ficados embora o movimento dos elementos transponíveis de DNA discutidos abaixo também desempenhe uma função importante Como explicaremos no Capítulo 5 os mecanismos que mantêm as sequências de DNA são extremamente precisos mas não são perfeitos As sequências de DNA são herdadas com uma fidelidade tão extraordiná ria que normalmente em uma determinada linha de descendência somente um par de nucleotídeos em mil é aleatoriamente alterado na linhagem germinativa a cada milhão de anos Mesmo assim em uma população de 10 mil indivíduos diploides cada substi tuição nucleotídica possível será testada cerca de 20 vezes durante 1 milhão de anos um período pequeno em relação à evolução das espécies Erros na replicação do DNA na recombinação ou no reparo do DNA podem causar tanto alterações locais simples na sequência de DNA as chamadas mutações pontuais como a substituição de um par de base por outro quanto rearranjos genômicos de larga escala como as deleções duplicações inversões e translocações de DNA de um cromos somo para outro Além dessas falhas na maquinaria genética genomas contêm elemen tos móveis de DNA que são uma fonte importante de alterações genômicas ver Tabela 53 p 267 Esses elementos de transposição de DNA transpósons são sequências pa rasitas de DNA capazes de se disseminarem pelos genomas que colonizam No processo eles frequentemente interrompem a função ou alteram a regulação dos genes existen tes Algumas vezes eles criaram novos genes por meio de fusões entre as sequências do transpóson e segmentos dos genes existentes Durante os longos períodos de tempo evo lutivo os eventos de transposição de DNA tiveram um efeito significativo nos genomas tanto que quase metade do DNA do genoma humano consiste em vestígios de eventos de transposição passados Figura 462 Mais ainda do nosso genoma parece ter deri vado de transposições que ocorreram há tanto tempo 10 8 anos que essas sequências nem podem mais ser rastreadas aos transpósons As sequências genômicas de duas espécies diferem na mesma proporção do período de tempo de sua separação evolutiva As atuais diferenças entre os genomas de espécies vivas acumulam mais de 3 bilhões de anos Ainda que não exista um registro direto das alterações durante esse período cien tistas podem reconstruir o processo de evolução do genoma a partir de comparações detalhadas dos genomas de organismos contemporâneos A estrutura básica da organização em genômica comparativa é a árvore filoge nética Um simples exemplo é a árvore que descreve a divergência entre os humanos e os grandes macacos Figura 463 O principal suporte para essa árvore deriva de comparações entre sequências de genes e proteínas Por exemplo comparações entre as sequências de genes e proteínas humanas e de macacos normalmente revelam as pouquíssimas diferenças entre humanos e chimpanzés e as maiores diferenças entre humanos e orangotangos Para organismos intimamente relacionados como humanos e chimpanzés é re lativamente fácil reconstruir as sequências gênicas extintas do último ancestral comum entre as duas espécies Figura 464 A grande similaridade entre os genes humanos e de chimpanzés resulta principalmente do reduzido período disponível para o acúmulo de mutações nas duas linhagens divergentes e não de limitações funcionais que man tiveram as mesmas sequências Evidências para essa proposta surgiram da observação 10 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 LINEs SINEs Íntrons Elementos semelhantes a retrovírus Repetições de sequências simples DNA não repetitivo que não é íntron nem códon Regiões codificadoras de proteínas Fósseis de transpósons exclusivamente de DNA TRANSPÓSONS Duplicações de segmentos GENES SEQUÊNCIAS REPETIDAS SEQUÊNCIAS ÚNICAS Porcentagem Figura 462 Uma representação do conteúdo da sequência nucleotídica do genoma humano Os LINEs elementos nucleares intercalados longos SINEs ele mentos nucleares intercalados curtos ele mentos semelhantes a retrovírus e transpó sons exclusivamente de DNA são elementos genéticos móveis que se multiplicaram no nosso genoma pela autorreplicação e inserção das novas cópias em diferentes posições Os elementos genéticos móveis são discutidos no Capítulo 5 ver Tabela 53 e p 267 As repetições de sequências sim ples são pequenas sequências de nucleotí deos menos de 14 pares de nucleotídeos que são repetidas várias vezes por longos segmentos A duplicação de segmentos en volve grandes blocos da sequência de DNA 1 a 200 mil pares de nucleotídeos que estão presentes em dois ou mais locais no genoma Os blocos de DNA mais repetidos na heterocromatina não foram ainda com pletamente sequenciados portanto cerca de 10 das sequências do DNA humano não estão representados neste diagrama Dados cortesia de E Margulies CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 219 de que os genomas de humanos e chimpanzés são quase idênticos mesmo onde não há restrição funcional na sequência nucleotídica como na terceira posição de códons sinônimos códons que especificam o mesmo aminoácido mas diferem no terceiro nucleotídeo Em organismos menos relacionados como humanos e galinhas cuja distância de separação evolutiva é de aproximadamente 300 milhões de anos a conservação entre as sequências encontradas nos genes é quase inteiramente devida à seleção de purificação ie a seleção que elimina indivíduos com mutações que interferem em funções genéticas importantes e não a um período inadequado para a ocorrência de mutações Árvores filogenéticas construídas a partir de comparações de sequências de DNA indicam as relações entre todos os organismos As árvores filogenéticas baseadas nos dados da sequência molecular podem ser compa radas aos registros fósseis e o melhor entendimento é obtido pela integração dos dois métodos O registro fóssil continua essencial como fonte absoluta de datação baseada Figura 463 Árvore filogenética mos trando a correlação entre humanos e os grandes macacos com base nos da dos da sequência nucleotídica Como indicado estimase que a diferença entre as sequências dos genomas das quatro espécies e a sequência genômica de um último ancestral comum seja de pouco mais de 15 Como as alterações ocor rem independentemente nas duas linha gens divergentes comparações entre os pares revelam o dobro da divergência de sequência do último ancestral comum Por exemplo comparações entre humanos e orangotangos normalmente apresentam divergências de sequência de pouco mais de 3 enquanto humanos e chimpanzés mostram divergências de aproximada mente 12 Modificada de FC Chen e WH Li Am J Hum Genet 68444456 2001 5 0 10 15 15 10 05 00 Último ancestral comum Humanos Chimpanzés Gorilas Orangotangos Milhões de anos atrás Porcentagem de substituição nucleotídica Figura 464 Dedução de uma sequên cia ancestral a partir da comparação de sequências de regiões codificadoras do gene da leptina em humanos e chim panzés Lendo da esquerda para direita e de cima para baixo está ilustrado um seg mento contínuo de 300 nucleotídeos para o gene que codifica a leptina A leptina é um hormônio que regula a ingestão de alimentos e a utilização de energia em res posta à adequação de reservas de gordura Como indicado pelos códons nos retângu los em verde apenas cinco nucleotídeos de um total de 441 diferem entre essas duas espécies Além disso somente uma das cinco posições nos nucleotídeos pro voca uma diferença no aminoácido codi ficado Para cada uma das cinco posições variáveis dos nucleotídeos a sequência correspondente no gorila também é indi cada Em dois casos a sequência do gorila concorda com a sequência de humanos e em três casos ela concorda com a sequência do chimpanzé Qual seria a sequência do gene da leptina no último ancestral comum A hipótese mais econômica é que a evolu ção seguiu uma via que requer o número mínimo de mutações consistente com os dados Assim parece provável que a se quência de leptina do último ancestral co mum era a mesma das sequências de hu manos e chimpanzés em que concordam quando diferem a sequência de gorilas seria usada no desempate Por conveniên cia apenas os 300 primeiros nucleotídeos da sequência codificadora da leptina são mostrados Os 141 restantes são idênticos em humanos e chimpanzés GTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGG GTGCCCATCCAAAAAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGG Humanos Gorilas Chimpanzés V P I Q K V Q D D T K T L I K T I V T R Proteína CAA Q ATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGAC ATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAGGTCACCGGTTTGGAC Humanos Gorilas Chimpanzés I N D I S H T O S V S S K Q K V T G L D Proteína AAG K TTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTC TTCATTCCTGGGCTCCACCCTATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTC Humanos Gorilas Chimpanzés F I P G L H P I L T L S K M D Q T L A V Proteína CCC P TACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTG TACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACATGATCCAAATATCCAACGACCTG Humanos Gorilas Chimpanzés Y Q Q I L T S M P S R N M I Q I S N D L Proteína ATG V GAGAACCTCCGGGATCTTCTTCAGGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGG GAGAACCTCCGGGACCTTCTTCAGGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGG Humanos Gorilas Chimpanzés E N L R D L L H V L A F S K S C H L P W Proteína GAC D 1 60 61 120 121 180 181 240 241 300 220 PARTE II Mecanismos genéticos básicos no decaimento radioativo nas formações rochosas em que os fósseis são encontrados Entretanto os registros fósseis apresentam muitas lacunas e o tempo de divergência preciso entre espécies é difícil de ser estabelecido mesmo em espécies que deixam bons fósseis com morfologia distinta As árvores filogenéticas em que o tempo foi medido de acordo com os regis tros fósseis sugerem que as alterações nas sequências de determinados genes ou proteínas tendem a ocorrer em uma taxa praticamente constante embora taxas que diferem da regra por um fator de duas vezes tenham sido observadas em linhagens específicas Isso nos fornece um relógio molecular para a evolução ou melhor um conjunto de relógios moleculares que correspondem a diferentes categorias da se quência de DNA Da mesma forma que no exemplo da Figura 465 o relógio anda mais rapidamente e mais regularmente em sequências que não estão sujeitas à se leção de purificação Estas incluem as porções de íntrons que não são processadas nem possuem sinais de regulação a terceira posição dos códons sinônimos e genes que foram irreversivelmente inativados por mutações chamados de pseudogenes O relógio anda mais devagar para sequências sujeitas a fortes restrições funcionais por exemplo a sequência de aminoácidos de proteínas que participam de interações específicas com várias outras proteínas e cuja estrutura é portanto muito restrita ou sequências nucleotídicas que codificam subunidades de RNAs ribossômicos do qual toda a síntese proteica depende Ocasionalmente uma alteração rápida ocorre em uma sequência previamente con servada Como discutido mais adiante tais episódios são especialmente interessantes porque parecem refletir períodos de uma forte seleção positiva para mutações que confe riram uma vantagem seletiva à linhagem particular na qual essa alteração rápida ocorreu O ritmo do relógio molecular durante a evolução é determinado não somente pelo grau de seleção de purificação mas também pela taxa de mutações Mais especialmen te em animais embora não em plantas os relógios baseados em sequências de DNA mitocondrial sem limitação funcional andam muito mais rápido comparados a relógios baseados em sequências nucleares sem limitações funcionais isso porque a taxa de mu tações em mitocôndrias de animais é excepcionalmente alta As categorias de DNA nas quais o relógio anda mais rápido são muito mais infor mativas para eventos evolucionários recentes o relógio de DNA mitocondrial é usado por exemplo na abordagem da divergência entre a linhagem Neandertal e do Homo sapiens moderno Para estudar eventos evolucionários mais primitivos devese exa minar DNA nos quais o relógio anda mais lentamente assim a divergência dos ramos principais da árvore da vida bactérias arqueias e eucariotos foi deduzida a partir do estudo de sequências que codificam RNA ribossômico Em geral os relógios moleculares devidamente escolhidos fornecem uma defi nição mais específica do período comparado ao registro fóssil e são um guia mais con fiável para detalhar a estrutura de árvores filogenéticas do que os métodos clássicos de construção dessas árvores baseados em semelhanças anatômicas e de desenvolvimento embrionário entre famílias Por exemplo a árvore exata da família dos grandes símios e humanos não foi determinada até que os dados reunidos das sequências moleculares na década de 1980 produziram a genealogia mostrada previamente na Figura 463 Além disso com as enormes quantidades de sequências de DNA determinadas atualmente para uma grande diversidade de mamíferos estimativas muito melhores dessas correla ções estão sendo obtidas Figura 466 GTGCCTATCCAGAAAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACCATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGGTAGGAGTCTCATGGGGGGACAAAGATGTAGGACTAGA GTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGGTAAGGAGAGTATGCGGGGACAAAGTAGAACTGCA ACCAGAGTCTGAGAAACATGTCATGCACCTCCTAGAAGCTGAGAGTTTATAAGCCTCGAGTGTACATTATTTCTGGTCATGGCTCTTGTCACTGCTGCCTGCTGAAATACAGGGCTGA GCCAGCCCAGCACTGGCTCCTAGTGGCACTGGACCCAGATAGTCCAAGAAACATTTATTGAACGCCTCCTGAATGCCAGGCACCTACTGGAAGCTGAGAAGGATTTGAAAGCACA Éxon Íntron Camundongo Humano Camundongo Humano Figura 465 Taxas de evolução muito diferentes de éxons e íntrons ilustradas pela comparação de um segmento dos genes da leptina em ca mundongos e humanos As posições em que as sequências diferem pela substituição de um único nucleotídeo estão sombreadas em verde e as posições que diferem pela adição ou perda de nucleotídeos estão sombreadas em amarelo Observe que devido à seleção de purificação a sequência codificadora dos éxons é muito mais conservada do que a sequência do íntron adjacente CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 221 Uma comparação entre cromossomos humanos e de camundongos revela como a estrutura dos genomas diverge Como seria esperado os genomas de humanos e chimpanzés são muito mais seme lhantes do que os genomas de humanos e camundongos mesmo que os três genomas tenham aproximadamente o mesmo tamanho e contenham conjuntos de genes quase idênticos As linhagens de camundongos e humanos tiveram cerca de 80 milhões de anos para divergir por meio do acúmulo de mutações versus 6 milhões de anos entre humanos e chimpanzés Além disso como indicado na Figura 466 linhagens de roe dores representadas pelos ratos e camundongos possuem relógios moleculares muito mais rápidos que o normal e divergiram da linhagem dos humanos mais rapidamente do que o esperado Enquanto o modo como o genoma é organizado nos cromossomos é quase idênti co em humanos e chimpanzés essa organização divergiu enormemente entre humanos e camundongos De acordo com estimativas grosseiras um total de 180 eventos de que bra e religação ocorreu nas duas linhagens desde que as duas espécies compartilharam um ancestral comum Nesse processo embora o número de cromossomos seja seme lhante 23 por genoma haploide no homem versus 20 no camundongo sua estrutura geral é bastante diferente No entanto mesmo após um extenso embaralhamento ge nômico eles possuem grandes blocos de DNA nos quais a ordem dos genes é a mesma em humanos e camundongos Esses segmentos com a ordem dos genes conservada são chamados de regiões de sintenia A Figura 467 ilustra como segmentos de cromosso mos de camundongo diferentes são mapeados ao conjunto de cromossomos humanos Em vertebrados muito mais distantes como galinhas e humanos o número de eventos de quebra e religação foi muito maior e as regiões de sintenia são muito menores além disso elas são muitas vezes mais difíceis de serem identificadas devido à divergência entre as sequências de DNA que elas contêm Uma conclusão inesperada derivada da comparação dos genomas completos de humanos e de camundongos e confirmada pela comparação com outros vertebrados é que pequenos blocos de sequência de DNA estão sendo removidos e adicionados a ge nomas a uma velocidade incrivelmente alta Assim se assumirmos que nosso ancestral comum tinha o genoma do tamanho do humano cerca de 32 bilhões de pares de nu cleotídeos os camundongos tiveram uma perda de aproximadamente 45 desse geno ma por deleções que foram acumuladas durante os 80 milhões de anos enquanto os hu manos tiveram uma perda de 25 Contudo sequências substanciais foram adquiridas por várias duplicações cromossômicas pequenas e pela multiplicação de transpósons que compensaram essa perda Como resultado acreditase que o tamanho do genoma humano ficou praticamente inalterado em comparação ao genoma do ancestral comum enquanto o de camundongos foi reduzido em apenas 03 bilhão de nucleotídeos Figura 466 Uma árvore filogenética mostrando as relações evolutivas de alguns mamíferos atuais O comprimen to de cada linha é proporcional ao número de substituições neutras isto é alte rações nucleotídicas em locais em que se acredita não haver seleção de purificação Adaptada de GM Cooper et al Genome Res 15901913 2005 Com permissão de Cold Spring Harbor Laboratory Press Gambá Canguru Marmota Tatu Morcego Gato Cachorro Cavalo Vaca Ovelha Porco Cervo indiano Coelho Rato Camundongo Gálago Lêmure Saguidetufobranco Macacoesquilo Macacodecarapreta Babuíno Chimpanzé Macaca Gorila Orangotango Humanos Ancestral 222 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Evidências que confirmam a perda de sequências de DNA em pequenos blocos durante a evolução podem ser obtidas pela comparação detalhada das regiões de har monia nos genomas de humanos e de camundongos O encolhimento comparativo do genoma de camundongos pode ser claramente visto nessas comparações com as se quências perdidas espalhadas através de longos segmentos de DNA que se não houves se perdas seriam homólogos Figura 468 A adição de DNA nos genomas ocorre pela duplicação espontânea de segmentos cromossômicos normalmente com comprimentos de dezenas de milhares de pares de nucleotídeos como será discutido em seguida e também pela inserção de novas cópias de transpósons ativos A maior parte dos eventos de transposição são duplicativos por que o transpóson original permanece onde estava e a cópia se insere em um novo sítio ver como exemplo a Figura 563 As comparações das sequências de DNA derivadas de transpósons entre humanos e camundongos prontamente revelam algumas dessas adições de sequências Figura 469 Ainda permanece sem explicação por que todos os mamíferos mantiveram os ta manhos dos genomas com cerca de 3 bilhões de pares de nucleotídeos contendo con juntos de genes quase idênticos apesar de parecer que somente cerca de 150 milhões de pares de nucleotídeos apresentam limitação funcional da sequênciaespecífica O tamanho do genoma de um vertebrado reflete as taxas relativas de adição e perda de DNA em uma linhagem Em vertebrados distantes mas relacionados o tamanho do genoma pode variar conside ravelmente sem causar um efeito drástico no organismo ou no número de genes Dessa forma o genoma da galinha com 1 bilhão de pares de nucleotídeos possui apenas cerca de um terço do tamanho do genoma de mamíferos Um exemplo extremo é o peixebalão Figura 467 Sintenia entre cromosso mos humanos e de camundongos Neste diagrama o conjunto cromossômico de humanos é mostrado com cada parte do cromossomo colorido de acordo com o cromossomo de camungo ao qual é sintê nico O código de cores usado para cada cromossomo de camundongo é indicado na parte inferior da figura Regiões hete rocromáticas altamente repetitivas como os centrômeros difíceis de sequenciar não podem ser mapeadas desse modo e foram coloridas em preto Adaptada de EE Eichler e D Sankoff Science 301793 797 2003 Com permissão de AAAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X Índice dos cromossomos de camundongo Figura 468 Comparação de um seg mento sintênico dos genomas de camundongos e humanos Cerca de 90 dos dois genomas podem ser alinha dos dessa forma Observe que enquanto há uma ordem idêntica das sequências correspondentes marcas em vermelho há também uma perda líquida de DNA na linhagem do camundongo espalhada por toda a região Esse tipo de perda é típico para todas as regiões como esta sendo responsável pelo fato de o genoma de camundongos possuir 14 menos DNA do que o genoma humano Adaptada de Mouse Genome Sequencing Consortium Nature 420520562 2002 Com permis são de Macmillan Publishers Ltd Cromossomo 14 de humanos Cromossomo 12 de camundongo 200 mil bases Figura 469 Comparação do bloco de genes da βglobina nos genomas humanos e de camundongos mostrando a localização dos elementos transponíveis Esse segmento do genoma humano contém cinco genes funcionais semelhantes à βglobina em laranja a região correspondente do genoma de camundongos possui apenas quatro As posições das sequências Alu humanas estão indicadas por círculos verdes e as sequências humanas L1 por círculos vermelhos O genoma de camundongos contém elementos transponíveis diferentes porém relacionados as posições dos elementos B1 relacionados às sequências Alu em humanos estão indicadas por triângulos azuis e as posições dos elementos L1 de camundongos relacionados às sequências L1 em humanos são indicadas por triângulos em laranja A ausência de elementos transponíveis nos genes estruturais da globina pode ser atribuída à seleção de purificação que teria eliminado qualquer inserção que comprometesse a função de gene Cortesia de Ross Hardison e Webb Miller Figura 470 O peixe baiacu Fugu rubripes Cortesia de Byrappa Venkatesh 224 PARTE II Mecanismos genéticos básicos cos deles Figura 472 A diferença média das sequências de DNA de humanos e Ne anderthais mostrou que nossas duas linhagens divergiram entre 270 mil e 440 mil anos atrás muito antes do período no qual se acredita que os humanos tenham emigrado da África Entretanto como decifrar os genomas de ancestrais muito mais antigos aqueles para os quais não há como isolar amostras de DNA Para organismos próximos como humanos e chimpanzés vimos que não difícil usando a sequência de gorilas como referência para classificar quais das poucas diferenças nas sequências de humanos e chimpanzés foram herdadas do nosso ancestral comum há cerca de 6 milhões de anos ver Figura 464 E para um ancestral que tenha produzido um grande número de organismos diferentes vivos hoje sequências de DNA de diversas espécies podem ser comparadas simultaneamente para organizar muito da sequência ancestral permitindo derivar sequências de DNA de muito tempo atrás Por exemplo pelas sequências de genomas atualmente obtidas para dezenas de mamíferos placentários modernos seria possível deduzir muito da sequência genômica do ancestral comum de 100 milhões de anos o precursor de espécies tão diversas como cachorros camundongos coelhos tatu e humanos ver Figura 466 Comparações entre sequências multiespécies identificam sequências de DNA conservadas com função desconhecida A imensa quantidade de sequências de DNA atualmente nos bancos de dados centenas de bilhões de pares de nucleotídeos fornecem um rico terreno para exploração com vários propósitos Essa informação pode ser utilizada não apenas para recompor as vias evolucionárias que levaram aos organismos modernos como também proporcionar es clarecimentos sobre como as células e os organismos funcionam Talvez a descoberta mais impressionante nessa esfera venha da observação de que uma espantosa quanti dade de sequências de DNA que não codificam proteínas foi conservada durante a evo lução dos mamíferos ver Tabela 41 p 184 Isso é mais claramente evidenciado quan do blocos sintênicos de DNA de várias espécies diferentes são alinhados e comparados Figura 471 Comparação das se quências genômicas dos genes que codificam a proteína huntingtina de humanos e do Fugu Ambos os genes indicados em vermelho contêm 67 pequenos éxons que se alinham com correspondência de 11 entre si esses éxons são conectados por linhas curvas O gene humano é 75 vezes maior que o gene do Fugu 180 mil versus 24 mil pares de nucleotídeos A diferença no tamanho é devida exclusivamente aos íntrons muito maiores no gene humano O enorme ta manho dos íntrons humanos é devido em parte à presença de retrotranspósons dis cutidos no Capítulo 5 cujas posições são representadas por linhas verticais em ver de os íntrons do Fugu não possuem retro transpósons Em humanos mutações no gene da huntingtina causam a doença de Huntington uma doença neurodegenera tiva herdável Adaptada de S Baxendale et al Nat Genet 106776 1995 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd 1800 1000 00 Gene humano Gene do Fugu Milhares de pares de nucleotídeos Figura 472 Os homens de Neander thal A Mapa da Europa mostrando a localização da caverna na Croácia onde fo ram descobertos muitos dos ossos usados para isolar o DNA e derivar a sequência genômica do homem de Neanderthal B Fotografia da caverna em Vindija C Fotografia dos ossos com 38 mil anos de Vindija Estudos mais recentes tiveram êxito na extração de informações de sequências de DNA de restos mortais de hominídeos consideravelmente mais anti gos ver Animação 83 B cortesia de Jo hannes Krause C from RE Green et al Science 328 710722 2010 Reproduzida com permissão de AAAS Caverna em Vindija na Croácia A B C 5 cm Figura 473 Detecção de sequências conservadas multiespécies Neste exemplo as sequências genômicas de cada organismo mostrado foram comparadas à região indicada do gene CFTR regulador da condutância transmembrana da fibrose cística humano essa região contém um éxon e uma enorme quantidade de DNA intrônico Para cada organismo o percentual de identidade com humanos para cada bloco de nucleotídeos de 25 pares de bases está representado em verde Além disso um algoritmo computacional foi usado para detectar as sequências dentro dessa região que são mais conservadas quando as sequências de todos os organismos são consideradas Além do éxon em azulescuro na linha superior da figura as posições de outros três blocos de regiões conservadas em várias espécies estão indicadas em azulclaro A função da maioria dessas sequências no genoma humano não é conhecida Cortesia de Eric D Green 226 PARTE II Mecanismos genéticos básicos de 01 de diferença em sobrevivência pode ser suficiente para favorecer fortemente a retenção de uma sequência específica de DNA durante a evolução Não surpreende portanto que várias dessas sequências de DNA ultraconservadas possam ser removi das do genoma de camundongos sem causar nenhum efeito palpável no camundongo de laboratório Uma segunda abordagem importante para descobrir a função de uma sequência misteriosa de DNA não codificador utiliza técnicas bioquímicas para identificar proteí nas ou moléculas de RNA que se ligam a elas ou a alguma molécula de RNA que ela produz A maioria dessas tarefas ainda paira sobre nós mas já houve um bom início ver p 435 Alterações em sequências previamente conservadas podem auxiliar a decifrar etapas críticas na evolução Obtida a informação da sequência genômica podemos voltar a atenção para outra questão curiosa quais as alterações no nosso DNA produziram humanos tão diferen tes dos outros animais ou o que torna uma determinada espécie tão diferente de es pécies relacionadas Por exemplo tão logo as sequências genômicas de chimpanzés e de humanos foram disponibilizadas cientistas iniciaram a busca por alterações nas sequências de DNA que poderiam responder pelas diferenças marcantes entre as duas espécies Com 32 bilhões de pares de nucleotídeos para comparar entre duas espé cies pode parecer uma tarefa impossível Porém o trabalho foi facilitado limitandose a busca a 35 mil sequências conservadas multiespécies claramente definidas cerca de 5 milhões de pares de nucleotídeos no total que representam partes do genoma com maior probabilidade de serem funcionalmente importantes Apesar de muito conservadas essas sequências não são perfeitamente conservadas e quando a versão em uma espécie é comparada a outra elas geralmente refletem pequenos desvios que correspondem simplesmente ao tempo decorrido desde o ancestral comum Em uma pequena proporção dos casos porém um repentino pulo evolutivo pode ser visto Foi observado que algumas sequências de DNA altamente conservadas em outras espé cies de mamíferos acumularam alterações nucleotídicas de maneira excepcionalmen te rápida durante os 6 milhões de anos de evolução humana desde a divergência dos chimpanzés Essas regiões aceleradas humanas HARs human accelerated regions pa recem refletir funções especialmente importantes para nos tornar diferentes de algum modo vantajoso Cerca de 50 sítios foram identificados em um estudo um quarto sendo localizado próximo a genes associados ao desenvolvimento neural A sequência que exibiu as alte rações mais rápidas 18 alterações entre humanos e chimpanzés comparada a apenas duas alterações entre chimpanzés e galinhas foi examinada e especifica uma molécula de RNA não codificador de 118 nucleotídeos a HAR1F região acelerada humana 1F produzida pelo córtex cerebral humano em um período decisivo durante o desenvolvi mento do cérebro A função desse RNA HAR1F ainda não é conhecida porém achados desse tipo são estudos de pesquisa estimulantes e devem ajudar a esclarecer caracterís ticas cruciais do cérebro humano Uma abordagem similar na busca de mutações importantes que contribuíram para a evolução humana também inicia com sequências de DNA que foram conserva das durante a evolução dos mamíferos mas em vez de procurar alterações aceleradas em nucleotídeos individuais ela se concentra em sítios cromossômicos que sofreram deleções durante os 6 milhões de anos desde a divergência da nossa linhagem e chim panzés Mais de 500 dessas sequências conservadas entre outras espécies e ausentes em humanos foram descobertas Cada deleção remove uma sequência de DNA de 95 nucleotídeos em média Apenas uma dessas deleções afeta uma região codificadora de proteínas o restante parece alterar regiões que afetam a expressão de genes próximos uma expectativa que foi confirmada experimentalmente em alguns casos Assim uma grande proporção das potenciais regiões de regulação estão próximas a genes que afe tam a função neural ou próximas a genes envolvidos na sinalização por esteroides su gerindo que alterações no sistema nervoso e nas funções imunológicas ou reprodutivas tiveram uma participação especialmente importante na evolução humana CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 227 As mutações nas sequências de DNA que controlam a expressão gênica impulsionaram muitas das alterações evolutivas em vertebrados A enorme quantidade de dados de sequências genômicas atualmente acumulada pode ser estudada de diversas maneiras revelando eventos que ocorreram há centenas de mi lhões de anos Um exemplo seria uma tentativa de rastrear as origens de elementos de regulação no DNA que tiveram uma função fundamental na evolução de vertebrados Um estudo desses iniciou com a identificação de quase 3 milhões de sequências não codi ficadoras contendo uma média de 28 pares de bases de comprimento conservados na evolução de vertebrados recentes porém ausentes em ancestrais mais antigos Cada uma dessas sequências não codificadoras especiais pode representar uma inovação funcional peculiar a um ramo específico de uma família de vertebrados e parece que a maioria de las consiste em DNA de regulação que determina a expressão de genes adjacentes Dadas as sequências genômicas completas é possível identificar os genes localizados na vizi nhança e dessa forma tem maior chance de estar sob a influência desses novos elemen tos reguladores Por meio da comparação de várias espécies diferentes com tempos de divergência conhecidos é possível estimar quando cada um desses elementos de regu lação surgiram como uma característica conservada Esses achados sugerem diferenças evolutivas impressionantes entre as várias classes funcionais de genes Figura 474 Ele mentos reguladores conservados originados no início da evolução de vertebrados isto é há mais de 300 milhões de anos que foi quando a linhagem de mamíferos foi separada da linhagem que originou aves e répteis parecem estar bastante associados a genes que codificam proteínas reguladoras de transcrição e proteínas com funções na organização do desenvolvimento embrionário A partir daí teve início uma era em que inovações na regulação do DNA surgiram próximas a genes codificando os receptores de sinalização extracelular Finalmente durante o curso de 100 milhões de anos as inovações na regula ção parecem ter se concentrado na proximidade de genes que codificam proteínas como as proteínascinase que atuam na modificação póstraducional de outras proteínas Muitas questões sobre esses fenômenos e seus significados precisam ser respon didas Uma interpretação possível é que a lógica o diagrama do circuito da rede de regulação gênica em vertebrados foi estabelecida precocemente e que alterações evolu tivas mais recentes tenham ocorrido principalmente pelo aprimoramento de parâmetros quantitativos Isso poderia explicar por que entre os mamíferos por exemplo o plano corporal básico a topologia dos tecidos e órgãos foi tão amplamente conservado A duplicação gênica também fornece uma fonte importante de novidades genéticas durante a evolução A evolução depende da criação de novos genes e de modificações daqueles já existen tes Como isso ocorre Quando comparamos organismos que parecem diferentes um primata com um roedor por exemplo ou um camundongo com um peixe raramente Figura 474 Os tipos de alterações na regulação gênica atribuídas como predominantes durante a evolução de nossos ancestrais vertebrados Para produzir a informação resumida neste gráfico o tipo de gene regulado por cada sequência conservada não codificadora foi sempre que possível deduzido pela identidade da proteína produzida pelo gene codificador mais próximo O tempo de fixação para cada sequência conser vada foi usado para derivar as conclusões apresentadas Baseada em CB Lowe et al Science 33310191024 2011 Com permissão de AAAS 500 400 300 200 100 0 Desenvolvimento e regulação da transcrição Modificação póstraducional de proteínas Recepção de sinais extracelulares Milhões de anos atrás HUMANOS CAMUNDONGOS BOVINOS ORNITORRINCOS GALINHAS RÃS PEIXES 228 PARTE II Mecanismos genéticos básicos encontramos um gene em uma espécie que não tenha um homólogo na outra Os genes sem correspondentes homólogos são raros mesmo quando comparamos animais tão di vergentes como um mamífero e um verme Por outro lado frequentemente famílias de genes com diferentes números de membros são encontradas nas diferentes espécies Para criar essas famílias os genes foram repetidamente duplicados e então as cópias diver giram para atuar em novas funções que geralmente variam de uma espécie para outra A duplicação gênica ocorre em altas taxas em todas as linhagens evolutivas contri buindo para o vigoroso processo de adição de DNA discutido anteriormente Um estudo detalhado em duplicações espontâneas em leveduras mostrou que duplicações de 50 mil a 250 mil pares de nucleotídeos podiam ser comumente observadas a maioria sendo re petições consecutivas Elas parecem resultar de erros na replicação do DNA pelo reparo inexato de quebras cromossômicas de fita dupla Uma comparação entre os genomas de humanos e de chimpanzés revelou que desde o período que esses organismos sofreram divergência essas duplicações de segmentos adicionaram cerca de 5 milhões de pares de nucleotídeos em cada genoma a cada milhão de anos com uma média de 50 mil pares de nucleotídeos a cada duplicação contudo existem algumas duplicações 5 vezes maio res Na verdade em números de nucleotídeos os eventos de duplicação criaram mais diferenças entre as duas espécies do que as substituições de apenas um nucleotídeo Genes duplicados sofrem divergência Qual o destino dos genes recémduplicados Na maioria dos casos parece haver pouca ou nenhuma seleção pelo menos inicialmente para manter o estado duplicado desde que uma cópia possa fornecer uma função equivalente Portanto vários eventos de du plicação provavelmente foram seguidos por mutações com perda de função em um ou em outro gene Esse ciclo restauraria funcionalmente o estado de um gene que precedeu a duplicação Existem vários exemplos nos genomas contemporâneos em que uma cópia de um gene duplicado foi inativada de forma irreversível por múltiplas mutações Com o passar do tempo a similaridade de sequência entre um pseudogene e o gene funcional cuja duplicação o produziu vai sendo desgastada pelo acúmulo das diversas mutações no pseudogene até que a correlação de homologia não seja mais detectável Um outro destino para as duplicações cromossômicas é as duas cópias perma necerem funcionais mesmo divergindo na sequência e no padrão de expressão assu mindo assim funções diferentes Esse processo de duplicação e divergência explica a presença de grandes famílias de genes com funções relacionadas em organismos bio logicamente complexos e parece ter um papel importante na evolução do aumento da complexidade biológica Uma análise dos genomas de diferentes eucariotos sugere que a probabilidade de um determinado gene sofrer um evento de duplicação que seja dis tribuído a quase todos os indivíduos em uma espécie é de aproximadamente 1 a cada milhão de anos A duplicação de genomas inteiros oferece um exemplo especialmente crítico do ciclo de duplicação e divergência Uma duplicação de todo o genoma pode acontecer de modo bem simples necessita apenas que ocorra uma rodada de replicação genômica na linhagem de uma célula germinativa sem que ocorra a divisão celular correspondente Inicialmente o número de cromossomos simplesmente dobra Aumentos repentinos as sim que aumentam a ploidia de um organismo são comuns em fungos e plantas Após a duplicação de um genoma inteiro todos os genes estão duplicados Porém a menos que os eventos de duplicação tenham ocorrido recentemente para que não haja tempo suficiente para alterações subsequentes na estrutura genômica os resultados de uma série de segmentos duplicados que ocorreram em períodos diferentes são difíceis de distinguir do produto final da duplicação de todo o genoma Em mamíferos por exem plo a duplicação total do genoma versus uma série de segmentos de DNA duplicados é incerta No entanto está claro que uma grande parcela de duplicações gênicas ocorreu em um passado distante Estudos do genoma do peixezebra em que pelo menos uma duplicação de todo o genoma parece ter ocorrido há centenas de milhões de anos forneceram alguns es clarecimentos sobre os processos de duplicação gênica e divergência Embora muitas cópias duplicadas dos genes do peixezebra pareçam ter sido perdidas por mutações uma proporção significante 30 a 50 divergiu funcionalmente porém ambas as có Figura 475 Comparação da estrutura da globina com uma e com quatro cadeias A globina de quatro cadeias mostrada é a hemoglobina um complexo de duas cadeias de αglobina e duas de βglobina A globina de uma cadeia presente em alguns vertebrados primordiais representa um intermediário na evolução da globina de quatro cadeias Ligada ao oxigênio ela existe como monômero na ausência do oxigênio ela forma dímeros Figura 476 Esquema evolutivo para as cadeias da globina que transportam oxigênio no sangue de animais O esquema ressalta a família de genes do tipo βglobina Uma duplicação gênica relativamente recente no gene γcadeia produziu γe e γa as cadeias tipo β fetais com funções idênticas A localização dos genes da globina no genoma humano é mostrada na parte superior da figura 230 PARTE II Mecanismos genéticos básicos regiões reguladoras que determinam o período e o nível de expressão do gene Como resultado cada globina é produzida em diferentes quantidades nas diferentes etapas do desenvolvimento humano A história dessas duplicações gênicas se reflete na disposição dos genes de he moglobina no genoma No genoma humano os genes que surgiram a partir do gene b original estão dispostos como uma série de sequências de DNA homólogas localizados em um mesmo cromossomo e com uma região de 50 mil pares de nucleotídeos entre si Um bloco semelhante dos genes da aglobina está localizado em um cromossomo humano separado Além de outros mamíferos as aves também possuem os blocos de genes da a e bglobina em cromossomos separados Na rã Xenopus contudo eles estão juntos sugerindo que um evento de translocação na linhagem de aves e mamíferos pro vocou a separação dos dois blocos de genes há cerca de 300 milhões de anos logo após a divergência entre nossos ancestrais e os anfíbios ver Figura 476 Existem várias sequências de DNA da globina duplicadas nos blocos dos genes das a e bglobinas que são pseudogenes e não genes funcionais Esses pseudogenes são similares aos genes funcionais mas foram inativados por mutações que impedem sua expressão como proteínas funcionais A existência desses pseudogenes deixa claro que como esperado nem toda duplicação de DNA produz um gene funcional Genes que codificam novas proteínas podem ser criados pela recombinação de éxons A importância da duplicação na evolução não está limitada à expansão de famílias gêni cas Ela também pode ocorrer em escala menor criando genes pela ligação de pequenos segmentos duplicados de DNA As proteínas codificadas por genes produzidos dessa for ma podem ser reconhecidas pela presença de domínios proteicos similares e repetidos unidos em série por ligação covalente As imunoglobulinas Figura 477 por exemplo assim como a maioria das proteínas fibrosas como o colágeno são codificadas por ge nes que evoluíram pela duplicação repetida de uma sequência de DNA primordial Nos genes que evoluíram dessa forma e em vários outros genes cada éxon geral mente codifica uma unidade de enovelamento individual da proteína ou um domínio Acreditase que a organização das sequências codificadora do DNA como uma série de éxons separados por longos íntrons facilitou bastante a evolução de novas proteínas As duplicações necessárias para formar um único gene que codifica uma proteína com domínios repetidos por exemplo pode ocorrer facilmente pela quebra e religação de DNA em qualquer sítio dos longos íntrons dos dois lados do éxon sem íntrons apenas alguns sítios do gene original da troca recombinatória entre as moléculas de DNA pode riam duplicar o domínio e não perturbálo A capacidade de duplicação por recombina ção em vários sítios potenciais em vez de em uns poucos sítios aumenta a probabilidade de um evento de duplicação favorável Pelas sequências genômicas sabemos que várias partes dos genes tanto éxons como elementos de regulação atuaram como elementos modulares os quais foram du plicados e se moveram pelo genoma criando a vasta diversidade de coisas vivas Assim por exemplo diversas proteínas atuais são formadas por porções de domínios de origens diferentes refletindo sua complexa história evolutiva ver Figura 317 Mutações neutras geralmente se difundem e tornamse fixas em uma população e sua probabilidade depende do tamanho da população Na comparação entre duas espécies que divergiram por um milhão de anos entre si os indivíduos de cada espécie que foram comparados não afetam muito as análises Cadeia pesada H2N H2N NH2 NH2 Cadeia leve HOOC COOH Figura 477 Visão esquemática de uma molécula de anticorpo imunoglobulina Esta molécula é um complexo de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas Cada cadeia pesada contém quatro domínios similares ligados covalentemen te enquanto cada cadeia leve contém apenas dois domínios Cada domínio é codificado por um éxon individual separado e todos os éxons parecem ter se desenvolvido pela duplicação seriada de um único éxon ancestral CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 231 Por exemplo as sequências de DNA típicas de humanos e de chimpanzés diferem cerca de 1 Em contraste quando a mesma região do genoma é analisada em dois seres humanos escolhidos aleatoriamente normalmente as diferenças são de cerca de 01 Em organismos mais distantes as diferenças interespécies superam a variação intraespécies ainda mais significativamente Contudo cada diferença fixada entre um humano e um chimpanzé em outras palavras cada diferença que é agora carac terística de todos ou quase todos os indivíduos de cada espécie teve início a partir de uma mutação em um único indivíduo Se o tamanho da população na qual a mutação ocorreu é N a frequência do alelo inicial com a nova mutação seria 12N para um organismo diploide Como uma mutação tão rara é fixada na população tornandose uma característica da espécie e não apenas uma característica do genoma de alguns indivíduos esparsos A resposta depende das consequências funcionais da mutação Se a mutação pos sui um efeito prejudicial importante será simplesmente eliminada pela seleção de pu rificação e não será fixada Em casos mais extremos o indivíduo que possui a mutação morrerá sem deixar descendentes Por outro lado as raras mutações que conferem uma vantagem reprodutiva aos indivíduos que as herdam serão difundidas rapidamente na população Como a reprodução é sexuada no homem e a recombinação genética ocorre cada vez que um gameta é formado discutido no Capítulo 5 o genoma de cada indi víduo que herda a mutação será um mosaico único de recombinação herdado de vá rios ancestrais A mutação selecionada juntamente com uma pequena quantidade de sequências vizinhas herdadas a partir daquele indivíduo no qual a mutação ocorreu será simplesmente uma peça de um enorme mosaico A grande maioria das mutações não é prejudicial nem benéfica Essas mutações neutras também são distribuídas e são fixadas na população contribuindo muito para alterações evolutivas dos genomas Por exemplo como visto anteriormente tais mu tações respondem pela maioria das diferenças de sequências de DNA entre macacos e humanos A difusão de mutações neutras na população não é tão rápida como uma mu tação rara de efeito vantajoso Ela depende da variação aleatória no número de descen dentes que carregam a mutação produzidos por cada um dos indivíduos que possuem a mutação provocando alterações na frequência relativa do alelo mutante na população Por um tipo de processo de passeio aleatório o alelo mutante pode ser extinto ou pode tornarse muito comum Esse processo pode ser moldado matematicamente para uma população de reprodução cruzada idealizada assumindose um tamanho constante para a população e acasalamento aleatório e uma seletividade neutra para as mutações Mesmo que nenhuma das duas primeiras hipóteses descreva bem a história da popu lação humana o estudo do caso idealizado revela os princípios gerais de modo claro e simples Quando uma nova mutação neutra ocorre na população de tamanho constante N que cruza aleatoriamente entre si a probabilidade de fixação da mutação é de aproxima damente 12N Isso porque existem 2N cópias do gene na população diploide e cada cópia tem uma chance igual de tornarse a versão predominante a longo prazo Para as mutações que foram fixadas a matemática mostra que o período médio para fixação é de aproximadamente 4N gerações Análises detalhadas dos dados em variação genética su gerem um tamanho de população ancestral de cerca de 10 mil durante o qual o padrão atual de variação genética foi estabelecido Com uma população desse tamanho a pro babilidade de que uma nova mutação neutra seja fixada é pequena 120000 enquanto o tempo médio para fixação é da ordem de 800 mil anos considerando um tempo de geração de 20 anos Assim embora a população tenha crescido bastante desde o de senvolvimento da agricultura há cerca de 15 mil anos a maioria das variantes genéticas vistas hoje reflete variações já existentes muito tempo antes disso quando a população humana ainda era bastante pequena Argumentos semelhantes explicam um outro fenômeno com implicações práticas importantes no aconselhamento genético Em uma comunidade isolada descendente de um pequeno grupo de fundadores como o povo da Islândia ou os judeus da Europa Oriental as variantes genéticas que são raras na população humana como um todo po dem muitas vezes estar presentes com alta frequência mesmo que essas variantes sejam levemente prejudiciais Figura 478 232 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Muito pode ser aprendido pelas análises da variação entre os humanos Mesmo que os alelos de variantes gênicas comuns entre humanos modernos tenham se originado de variantes presentes em um grupo relativamente pequeno de ancestrais o número total de variantes hoje encontrado incluindo aqueles individualmente raros é muito grande Novas mutações neutras estão constantemente acontecendo e se acu mulando mesmo que nenhuma tenha tido tempo suficiente para ser fixada na grande população humana moderna Comparações detalhadas de sequências de DNA de um grande número de huma nos no mundo permitiram estimar quantas gerações ocorreram desde a origem de uma mutação neutra específica A partir desses dados é possível mapear as rotas de imigra ção dos humanos primitivos Por exemplo com a combinação desse tipo de análise ge nética com achados arqueológicos cientistas puderam deduzir as rotas mais prováveis que nossos ancestrais seguiram quando partiram da África há 60 mil ou 80 mil anos Figura 479 Estivemos focando em mutações que afetam um único gene mas essa não é a úni ca fonte de variação Uma outra fonte talvez mais importante porém ignorada por vários anos reside nas duplicações e deleções de grandes blocos de DNA humano Quando se compara um indivíduo humano qualquer com o padrão de referência da sequência genômica no banco de dados são encontrados normalmente umas cem diferenças en volvendo perda ou ganho de longos blocos de sequências totalizando talvez 3 milhões de pares de nucleotídeos Agumas dessas variações no número de cópias CNVs copy number variations serão muito comuns provavelmente refletindo origens relativamen te antigas enquanto outras estarão presentes em uma pequena quantidade de pessoas Figura 480 Em média quase metade dos CNVs contém genes conhecidos Os CNVs têm sido envolvidos em diversos traços humanos incluindo daltonismo infertilidade hipertensão e em uma variedade de suscetibilidades a doenças Em retrospectiva esse tipo de variação não causa surpresa devido ao papel proeminente das adições e perdas de DNA na evolução de vertebrados As variações intraespécie mais estudadas contudo são os polimorfismos de um único nucleotídeo SNPs singlenucleotide polymorphisms Eles são simples muta ções de ponto na sequência genômica em que uma grande proporção da população humana possui um nucleotídeo enquanto outra parte substancial da população pos sui outro Para ser considerado um polimorfismo as variantes devem ser suficiente mente comuns para gerar uma probabilidade razoavelmente alta em que os genomas de dois indivíduos escolhidos ao acaso possam diferir no sítio determinado uma pro Figura 478 Como o efeito do funda dor determina um conjunto de varian tes genéticas em uma população de indivíduos pertencentes a uma mesma espécie Este exemplo ilustra como um alelo raro vermelho pode ser fixado em uma população isolada mesmo se a muta ção que o produziu não oferecer uma van tagem seletiva ou seja moderadamente prejudicial População original Grupo fundador População nova Indivíduo com um alelo raro Sobreviventes de doença ou migrantes Figura 479 Traçando o curso da his tória humana por meio da análise de sequências genômicas O mapa mostra as rotas das migrações humanas primitivas que tiveram sucesso As linhas pontilhadas indicam duas rotas alternativas que se acredita terem sido seguidas pelos nossos ancestrais para sair da África Compara ções entre sequências de DNA sugerem que os europeus modernos descendem de uma população ancestral pequena Em concordância achados arqueológicos sugerem que as populações de ancestrais dos nativos australianos modernos setas sólidas em vermelho e as populações modernas da Europa e Oriente Médio chegaram ao seu destino cerca de 45 mil anos atrás Estudos mais recentes que comparam as sequências de genomas de humanos atuais com o genoma dos neandertais e de outra população extinta do extremo sul da Sibéria os denisova nos sugerem que a saída da África foi um pouco mais complicada e também revelou que vários dos nossos ancestrais acasalaram com esses vizinhos hominídeos durante sua jornada pelo globo Modifi cada de P Forster e S Matsumura Science 308965966 2005 CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 233 babilidade de 1 é normalmente usada como ponto de corte Dois genomas humanos escolhidos aleatoriamente da população moderna mundial apresentarão diferenças em aproximadamente 25 10 6 desses sítios 1 a cada 1300 pares de nucleotídeos Como será descrito na visão geral da genética no Capítulo 8 os SNPs no genoma hu mano podem ser extremamente úteis nas análises de mapeamento genético em que se tenta associar características específicas fenótipos a sequências de DNA específicas para fins médicos ou científicos ver p 493 Apesar de úteis como marcadores genéti cos existem fortes evidências de que a maioria desses SNPs possui pouco ou nenhum efeito sobre a aptidão humana Isso é esperado pois as variantes prejudiciais sofreriam seleção negativa durante a evolução humana e seriam raras ao contrário dos SNPs Algumas sequências raras com uma taxa de mutação excepcionalmente alta se des tacam entre os SNPs comuns herdados de nossos ancestrais préhistóricos Um exemplo extremo são as repetições CA presentes por todo o genoma humano e nos genomas de outros eucariotos Sequências com o motivo CAn são replicadas com fidelidade muito baixa devido ao deslizamento que ocorre entre a fitamolde e a fita recémsintetizada durante a replicação de forma que o valor de n varia muito de um genoma para o próxi mo Essas repetições formam marcadores genéticos de DNA ideais uma vez que quase todos humanos são heterozigotos tendo herdado um comprimento de repetições n da mãe e outro do pai Enquanto os valores de n são raramente alterados na maioria das transmissões paifilho que propagam as repetições CA com fidelidade essas alterações são suficientes para manter um alto nível de heterozigose na população Essas e outras repetições simples que apresentam uma variabilidade muito alta fornecem as bases para a identificação de indivíduos pela análise de DNA em investigações criminais testes de paternidade e outras aplicações forenses ver Figura 839 Enquanto a maioria dos SNPs e CNVs na sequência do genoma humano parece ter pouco ou nenhum efeito no fenótipo um subgrupo de variações de sequências do genoma deve ser responsável pela herança dos aspectos da individualidade humana Sabemos que mesmo a alteração de um único nucleotídeo pode modificar um ami noácido de uma proteína o qual por sua vez pode causar uma grave doença como a anemia falciforme causada por uma mutação na hemoglobina Animação 43 Sa bemos também que a dosagem do gene a duplicação ou a metade no número de cópias de alguns genes pode ter um efeito drástico no desenvolvimento pela alte ração dos níveis do produto gênico ou pelas alterações nas sequências de regulação do DNA Existem portanto diversas razões para supor que as muitas diferenças entre dois indivíduos humanos terão um efeito substancial na saúde na fisiologia no com portamento e no físico humanos Um desafio crucial da genética humana é reconhe cer essas poucas variações funcionalmente importantes contra um enorme leque de variações neutras e sem consequência Figura 480 Detecção de variações no número de cópias no cromossomo 17 humano Quando 100 indivíduos fo ram analisados por microarranjos de DNA capazes de detectar o número de cópias de sequências de DNA por todo o cro mossomo as distribuições indicadas para adições de DNA barras verdes e perdas de DNA barras vermelhas foram obser vadas em comparação a uma sequência arbitrária humana As barras verde e ver melha mais curtas representam uma ocor rência única em todos os 200 cromosso mos examinados enquanto as barras mais longas representam as adições e perdas mais frequentes Os resultados mostram regiões preferenciais nas quais as variações acontecem ocorrendo em regiões ou próximas a regiões que já contêm blocos de duplicação de segmentos Muitas das trocas incluem genes conhecidos Adap tado de JL Freeman et al Genome Res 16949961 2006 Com permissão de Cold Spring Harbor Laboratory Press Cromossomo 17 humano 10000000 pares de nucleotídeos Densidade de genes conhecidos Adições de DNA em humanos individuais Perdas de DNA em humanos individuais 234 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Resumo Comparações entre sequências nucleotídicas de genomas atuais revolucionaram nosso en tendimento sobre a evolução de genes e genomas Devido à fidelidade extremamente alta dos processos de replicação e reparo de DNA erros aleatórios na manutenção das sequên cias nucleotídicas ocorrem tão raramente que apenas cerca de um nucleotídeo em mil é alterado em cada milhão de anos em uma descendência eucariótica específica Não nos surpreende portanto que uma comparação entre os cromossomos de humanos e de chim panzés separados há cerca de 6 milhões de anos de evolução revelou poucas alterações Não só temos essencialmente os mesmos genes como a ordem na qual eles estão dispostos em cada cromossomo é quase idêntica Embora um número substancial de duplicações e deleções de segmentos tenha ocorrido nesses 6 milhões de anos até mesmo posições de elementos transponíveis que constituem a maior parte do nosso DNA não codificador são praticamente as mesmas Quando comparamos os genomas de organismos com distâncias evolutivas maiores como humanos e camundongos separados por cerca de 80 milhões de anos encontra mos muito mais alterações Nesse caso os efeitos da seleção natural podem ser claramente vistos pela seleção de purificação sequências nucleotídicas essenciais tanto reguladoras como codificadoras éxons foram conservadas Em contraste sequências não essenciais p ex muito do DNA dos íntrons foram alteradas a tal ponto que não é possível identifi car qualquer semelhança que possam agrupálas em famílias Devido à seleção de purificação a comparação das sequências genômicas de diver sas espécies relacionadas é uma maneira importante para encontrar sequências de DNA com funções relevantes Embora apenas cerca de 5 do genoma humano sejam conserva dos como resultado da seleção de purificação a função da maioria desse DNA milhares de sequências multiespécies conservadas permanece um mistério Experimentos futuros de caracterização das suas funções devem ensinar muitas novas lições sobre a biologia de vertebrados Outras comparações de sequências mostram que um grande grau de complexidade em organismos modernos é devido à expansão de famílias gênicas ancestrais A duplica ção de DNA seguida pela divergência dessas sequências tem sido claramente a principal fonte de novidades genéticas durante a evolução Em uma escala temporal mais recente os genomas de dois indivíduos humanos quaisquer apresentam diferenças entre si devido a substituições nucleotídicas SNPs e devido à herança de adições e perdas de DNA que resultam em variações do número de cópias gênicas CNVs A compreensão dos efeitos dessas diferenças irá aperfeiçoar a medicina e o nosso entendimento da biologia humana o QuE NÃo SABEMoS Quantos tipos diferentes de estru tura de cromatina são importantes para as células Como cada uma dessas estruturas é determinada e mantida e quais são herdadas após a replicação do DNA Por que existem tantos complexos de remodelagem da cromatina diferentes nas células Quais suas principais funções e como são co locados na cromatina em locais e períodos determinados Como as alças cromossômicas são formadas durante a interfase e o que acontece a essas alças nos cromossomos mitóticos conden sados Que alterações genéticas nos tor nam exclusivamente humanos Que outros aspectos do nosso de senvolvimento evolutivo recente podem ser reconstruídos pelo se quenciamento de DNA de amos tras de hominídeos primitivos Quanto da enorme compexidade encontrada na biologia celular é desnecessária uma vez que evo luiu por derivação genética alea tória TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 41 As mulheres possuem 23 cromossomos diferentes en quanto os homens possuem 24 42 As quatro histonas do cerne são proteínas relativamen te pequenas com uma alta proporção de aminoácidos com carga positiva essa carga positiva auxilia na forte ligação ao DNA não importando sua sequência nucleotídica 43 Os nucleossomos ligam o DNA tão fortemente que eles não podem alterar a posição em que foram inicialmente es tabelecidos 44 Em uma comparação entre DNAs de organismos rela cionados como humanos e camundongos a identifcação de sequências conservadas de DNA facilita a busca por regiões funcionalmente importantes 45 A duplicação e a divergência gênica parecem ter tido um papel fundamental no aumento da complexidade bioló gica durante a evolução Discuta as questões a seguir 46 O DNA isolado de um vírus bacte riano o M13 contém 25 de A 33 de T 22 de C e 20 de G Esses resultados lhe surpreendem de algum modo Justifique sua resposta Como você poderia explicar esses valores 47 Um segmento de DNA do interior de uma fita simples é mostrado na Figu ra Q41 Qual a polaridade desse DNA de cima para baixo 48 O DNA humano contém 20 de C em base molar Quais as porcentagens molares de A G e T CH2 O O O O P O CH2 O O O O O P O CH2 O O A C T Figura Q41 Três nucleotídeos do interior de uma fita simples de DNA As setas nas extremidades da fita de DNA indicam que a estrutura continua em ambas as direções CAPíTulo 4 DNA cromossomos e genomas 235 49 O cromossomo 3 de orangotangos difere do cromosso mo 3 de humanos por dois eventos de inversão que ocorreram na linhagem humana Figura Q42 Desenhe o cromossomo intermediário que resulta da primeira inversão e indique cla ramente os segmentos incluídos em cada inversão Duas inversões Orangotango Humano Figura Q42 Cromossomos 3 de orangotangos e humanos Blocos em cores diferentes indicam seg mentos cromossômicos que são homólogos na sequência de DNA 410 Considerando que uma fibra de cromatina de 30 nm contém cerca de 20 nucleossomos 200 pares de base por nucleossomos por 50 nm de comprimento calcule o grau de compactação do DNA associado a esse tipo de nível de es trutura de cromatina Que fração da condensação de 10 mil vezes que ocorre na mitose esse nível de empacotamento representa 411 Em contraste à acetilação de histonas que sempre está correlacionada à ativação gênica a metilação de histo nas pode resultar na ativação transcricional ou na repressão Como você supõe que a mesma modificação metilação possa promover diferentes efeitos biológicos 412 Por que um cromossomo com dois centrômeros um cromossomo dicêntrico é instável Um centrômero reserva não seria bom para o cromossomo dando a ele duas chan ces de formar o cinetocoro e se ligar aos microtúbulos na mitose Isso não poderia ajudar a garantir que nenhum cro mossomo fosse deixado para trás na mitose 413 Observe as duas colônias de leveduras na Figura Q43 Cada uma dessas colônias contém cerca de 100 mil células descendentes de uma única célula originada em algum lugar no meio de uma touceira Uma colônia branca surge quando o gene Ade2 é expresso na sua localização cromossômica nor mal Quando o gene Ade2 é movido para um local próximo ao telômero é compactado na heterocromatina e inativado na maioria das células produzindo colônias na sua maioria ver melhas Nessas colônias essencialmente vermelhas setores brancos de dispersam a partir do meio da colônia Em ambos os setores brancos e vermelhos o gene Ade2 ainda está lo calizado próximo aos telômeros Explique por que os setores brancos são formados próximos às bordas da colônia verme lha Com base nos padrões observados o que pode ser con cluído sobre a propagação do estado de transcrição do gene Ade2 da célulamãe às célulasfilhas neste experimento Colônia branca de células de levedura Colônia vermelha de células de levedura com setores brancos Telômero Telômero Gene Ade2 no sítio normal Gene Ade2 localizado próximo ao telômero Figura Q43 Efeito posicional na expressão do gene Ade2 de leveduras O gene Ade2 codifica uma das enzimas de biossíntese da adenosina e a ausência do produto gênico leva ao acúmulo de um pigmento vermelho Portanto uma colônia de células que expressam Ade2 é branca e uma com posta por células em que o gene Ade2 não é expresso é vermelha 414 Segmentos móveis de DNA os elementos transpo níveis inseremse nos cromossomos e se acumulam duran te a evolução somando mais de 40 do genoma humano Elementos transponíveis dos quatro tipos elementos nu cleares intercalados longos LINEs elementos nucleares intercalados curtos SINEs retrotranspósons com repe tições terminais longas LTR e transpósons de DNA são inseridos quase aleatoriamente pelo genoma humano Esses elementos são visivelmente raros nos quatro blocos gênicos de homeobox HoxA HoxB HoxC e HoxD como ilustrado para HoxD na Figura Q44 com uma região de cromossomo 22 equivalente que não possui um bloco Hox Cada bloco Hox tem um comprimento de cerca de 100 kb e contém de 9 a 11 genes cuja expressão diferencial ao longo do eixo an teroposterior do embrião em desenvolvimento estabelece o plano corporal básico para humanos e outros animais Por que você acha que os elementos transponíveis são tão raros nos blocos de genes Hox 100 kb Bloco HoxD Cromossomo 2 Cromossomo 22 Figura Q44 Elementos transponíveis e genes em uma região de 1 Mb dos cromossomos 2 e 22 As linhas azuis que se projetam para cima indicam éxons de genes conhecidos Linhas vermelhas que se projetam para baixo indicam elementos transponíveis eles são tão numerosos constituindo mais de 40 do genoma humano que quase formam um bloco sólido no lado externo dos blocos Hox Adaptada de E Lander et al Nature 409860921 2001 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd 236 PARTE II Mecanismos genéticos básicos REFERÊNCIAS Gerais Armstrong L 2014 Epigenetics New York Garland Science Hartwell L Hood L Goldberg ML et al 2010 Genetics From Genes to Genomes 4th ed Boston MA McGraw Hill Jobling M Hollox E Hurles M et al 2014 Human Evolutionary Genetics 2nd ed New York Garland Science Strachan T Read AP 2010 Human Molecular Genetics 4th ed New York Garland Science Estrutura e função do DNA Avery OT MacLeod CM McCarty M 1944 Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types J Exp Med 79 137158 Meselson M Stahl FW 1958 The replication of DNA in Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA 44 671682 Watson JD Crick FHC 1953 Molecular structure of nucleic acids A structure for deoxyribose nucleic acid Nature 171 737738 O DNA cromossômico e sua compactação na fibra de cromatina Andrews AJ Luger K 2011 Nucleosome structures and stability variations on a theme Annu Rev Biophys 40 99117 Avvakumov N Nourani A Cõté J 2011 Histone chaperones modulators of chromatin marks Mol Cell 41 502514 Deal RB Henikoff JG Henikoff 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comparative analysis of the mouse genome Nature 420 520562 Pollard KS Salama SR Lambert N et al 2006 An RNA gene expressed during cortical development evolved rapidly in humans Nature 443 167172 NESTE CAPÍTULO MANUTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE DNA MECANISMOS DE REPLICAÇÃO DO DNA INÍCIO E TÉRMINO DA REPLICAÇÃO DO DNA NOS CROMOSSOMOS REPARO DO DNA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA TRANSPOSIÇÃO E RECOMBINAÇÃO SÍTIOESPECÍFICA CONSERVATIVA Replicação reparo e recombinação do DNA CAPÍTULO 5 A capacidade das células de manter um alto grau de organização em um ambiente ca ótico depende da duplicação exata de grandes quantidades de informação genética ar mazenadas na forma química de DNA Esse processo denominado replicação do DNA deve ocorrer antes de a célula produzir duas célulasfilhas geneticamente iguais A ma nutenção da ordem também requer a vigilância contínua e o reparo dessa informação genética uma vez que o DNA contido na célula é repetidamente danificado por com postos químicos e radiação oriundos do ambiente por acidentes térmicos e por molé culas reativas Neste capítulo descrevemos as maquinarias proteicas responsáveis pela replicação e pelo reparo do DNA nas células Essas maquinarias catalisam alguns dos processos mais rápidos e precisos que ocorrem na célula e seus mecanismos ilustram a elegância e a eficiência da química celular Enquanto a sobrevivência de curto prazo de uma célula depende da sua capacida de de prevenir alterações no seu DNA a sobrevivência em longo prazo de uma espécie requer que as sequências de DNA sofram alterações ao longo de gerações a fim de per mitir a adaptação evolutiva a circunstâncias dinâmicas Veremos que apesar do grande esforço da célula para proteger seu DNA alterações ocasionais na sequência aconte cem Com o passar do tempo essas alterações produzem variações genéticas sujeitas à pressão seletiva durante a evolução dos organismos Começaremos este capítulo com uma breve discussão sobre as alterações que ocorrem no DNA conforme ele vai sendo transmitido de geração em geração A seguir discutiremos os mecanismos celulares replicação e reparo do DNA responsáveis por minimizar essas alterações Finalmente iremos considerar algumas das vias mais fasci nantes que alteram as sequências de DNA especialmente aquelas de recombinação do DNA que incluem o movimento nos cromossomos de sequências especiais denomina das elementos transponíveis MANUTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE DNA Como mencionado anteriormente embora alterações genéticas ocasionais aumentem a sobrevivência em longo prazo de uma espécie durante a evolução a sobrevivência de um indivíduo necessita de alto grau de estabilidade genética Raramente os processos de manutenção do DNA celular falham resultando em uma alteração permanente no DNA Tal alteração é chamada de mutação podendo destruir um organismo se ocorrer em uma posição vital na sequência do DNA As taxas de mutação são extremamente baixas A taxa de mutação isto é a proporção na qual alterações acontecem nas sequências de DNA pode ser determinada diretamente a partir de experimentos realizados em uma bactéria como Escherichia coli um componente da nossa flora intestinal e um organismo muito utilizado em laboratórios ver Figura 124 Em condições de labora tório a E coli dividese aproximadamente a cada 30 minutos e uma única célula pro duz uma população bastante grande vários bilhões em menos de um dia Em uma população assim é possível detectar uma pequena proporção de bactérias que tenham sofrido uma mutação prejudicial em um determinado gene se este gene não for ne cessário à sobrevivência dessas bactérias Por exemplo a taxa de mutação de um gene especificamente necessário para utilização do açúcar lactose como fonte de energia pode ser determinada pelo crescimento das células na presença de um açúcar diferen te como glicose testandoas a seguir para verificar quantas dessas células perderam a capacidade de sobreviver em uma dieta sem lactose A fração de genes danificados 238 PARTE II Mecanismos genéticos básicos é subestimada em relação à taxa de mutação real uma vez que várias mutações são silenciosas p ex as mutações que alteram um códon mas não o aminoácido codifica do ou aquelas que alteram o aminoácido sem afetar a atividade da proteína codificada pelo gene Estimase que um único gene que codificadores uma proteína de tamanho médio 10 3 pares de nucleotídeos codificadores após o ajuste para alterações silen ciosas sofra uma mutação não necessariamente uma mutação que inative a proteína a cada 10 6 gerações de células bacterianas aproximadamente Em outras palavras as bactérias apresentam uma taxa de mutação de aproximadamente três alterações de nucleotídeo a cada 10 10 nucleotídeos por geração Recentemente tornouse possível medir diretamente a taxa de mutação em células germinativas de organismos mais complexos com reprodução sexual como os humanos Nesse caso os genomas completos de uma família progenitores e descendentes foram sequenciados de forma direta e uma comparação meticulosa revelou que aproximadamente 70 novas mutações de um nucleotídeo surgiram nas células germinativas de cada descendente Normalizada para o tamanho do genoma humano a taxa de mutação é um nucleotídeo alterado por 10 8 nucleotídeos por gera ção humana Essa taxa é levemente subestimada porque algumas mutações são le tais e portanto estarão ausentes na prole mas como uma quantidade relativamente pequena do genoma humano carrega informação essencial essa consideração tem um efeito muito pequeno na taxa de mutação real Estimase que ocorram aproxi madamente cem divisões celulares na linhagem germinativa desde o momento da concepção até o momento da produção de óvulos e espermatozoides que produzirão a próxima geração Assim a taxa de mutação humana expressa em termos de divi sões celulares em vez de gerações humanas é de aproximadamente 1 mutação10 10 nucleotídeosdivisão celular Embora a E coli e humanos sejam extremamente diferentes em seus modos de reprodução e tempos de geração quando as taxas de mutação de cada um são norma lizadas para um ciclo de replicação do DNA ambos são extremamente baixos e diferem entre si por um fator de três Veremos mais adiante que os mecanismos básicos que ga rantem essas baixas taxas de mutação são conservados desde os primórdios da história das células na Terra Taxas de mutação baixas são necessárias à vida que conhecemos Como a maioria das mutações é prejudicial nenhuma espécie pode permitir seu acú mulo em altas taxas nas células germinativas Apesar de a frequência observada de mu tação ser baixa ela parece limitar o número de proteínas essenciais que cada organismo necessita em uns 30 mil Mais que isso e a probabilidade de que pelo menos um com ponente crítico venha a sofrer uma mutação prejudicial tornase dramaticamente alta Por esse mesmo argumento uma frequência de mutação dez vezes maior limitaria um organismo a cerca de 3 mil genes essenciais Nesse caso a evolução estaria limitada a organismos bem menos complexos que a moscadasfrutas As células de um animal ou planta com reprodução sexual são de dois tipos célu las germinativas e células somáticas As células germinativas transmitem a informação genética do progenitor aos seus descendentes as células somáticas formam o corpo do organismo Figura 51 Vimos que as células germinativas devem ser protegidas contra as altas taxas de mutação para a manutenção da espécie Por outro lado as células somá ticas de organismos multicelulares também devem ser protegidas de alterações genéti cas para manter a estrutura do corpo organizada e correta As alterações nucleotídicas em células somáticas podem gerar células variantes algumas das quais pela seleção natural local proliferamse rapidamente às custas do resto do organismo Em casos extremos o resultado é a proliferação celular descontrolada conhecida como câncer uma doença que causa mais de 20 das mortes de seres humanos a cada ano na Euro pa e América do Norte Essas mortes são em grande parte provocadas pelo acúmulo de alterações na sequência de DNA das células somáticas como discutido no Capítulo 20 É provável que um aumento significativo da frequência de mutação cause um desas troso aumento na incidência de câncer pela aceleração da taxa de surgimento dessas células variantes Assim tanto para a perpetuação de espécies com um grande número 248 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Cadeia principal de açúcarfosfato da fita simples de DNA Bases do DNA 2 nm Domínio A Domínio B Proteína ligadora de fita simples A 5ʹ 3ʹ B SSB DNA de fita simples Figura 516 Proteína ligadora de fita simples dos humanos ligada ao DNA A Vista frontal dos dois domínios de ligação do DNA da proteína chamada RPA que cobre oito nucleotídeos no total Observe que as bases do DNA permanecem expostas no complexo proteínaDNA B Diagrama mostrando a estrutura tridimen sional com a fita de DNA em laranja vista pela extremidade Código PDB 1JMC A B Cinta deslizante Montador da cinta 5ʹ ATP ADP Pi ATP ATP DNA DNA polimerase 3ʹ 5ʹ 5ʹ 3ʹ 3ʹ RECICLAGEM DO MONTADOR DA CINTA LIBERADO LIGAÇÃO DO ATP AO MONTADOR DA CINTA ABRE A CINTA DESLIZANTE DNA ENGATADO NA CINTA HIDRÓLISE DO ATP PRENDE A CINTA DESLIZANTE AO REDOR DO DNA E LIBERA O MONTADOR DA CINTA DNAPOLIMERASE LIGASE À CINTA DESLIZANTE Figura 517 A cinta deslizante regulada que prende a DNApolimerase ao DNA A Estrutura da cin ta deslizante de E coli determinada por cristalografia de raios X com uma hélice de DNA adicionada para indicar como a proteína é ajustada ao redor do DNA Animação 53 B Ilustração mostrando como a cinta com subunidades em vermelho e amarelo é montada no DNA e atua como uma fixação para a molécula de DNApolimerase em movimento A estrutura do montador da cinta verdeescuro assemelhase a um sistema porcaeparafuso com a rosca do parafuso coincidindo com os sulcos da fita dupla de DNA O mon tador ligase a uma molécula livre da cinta forçando e formando uma lacuna no anel das subunidades de modo que este anel seja capaz de deslizar ao redor do DNA O montador da cinta em função da sua estru tura de porcaeparafuso reconhece a região do DNA de fita dupla e se agarra a ela ajustandose em torno do complexo de uma fitamolde com uma fita recémsintetizada alongada a partir do iniciador Ele carrega a cinta pela região de fita dupla até encontrar a extremidade 3do iniciador e daí o montador libera a cinta pela hidrólise de ATP permitindo que ela se feche ao redor do DNA e se ligue à DNApolimerase Na reação simplificada mostrada aqui o montador da cinta dissociase na solução após a formação da cinta Em uma forquilha de replicação verdadeira o montador da cinta permanece próximo à polimerase na fita retardada de modo que fique pronto para montar uma nova cinta no início de cada novo fragmento de Okazaki ver Figura 518 A de XP Kong et al Cell 69425437 1992 Com permissão de Elsevier B adaptada de BA Kelch et al Science 33416751680 2011 Com permissão de AAAS Código PDB 3BEP 250 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Na fita retardada a maquinaria de replicação de DNA deixa para trás uma série de fragmentos de Okazaki não ligados que ainda contêm segmentos de RNA que iniciaram a síntese a partir das extremidades 5 Como discutido anteriormente esse RNA é remo vido e o intervalo resultante é preenchido por enzimas de reparo de DNA que atuam atrás da forquilha de replicação ver Figura 511 Um sistema de reparo de pareamento incorreto remove erros de replicação que escapam da maquinaria de replicação Como mencionado anteriormente bactérias como E coli são capazes de se dividir a cada 30 minutos sendo relativamente fácil a verificação de grandes populações para encontrar uma célula mutante rara com alterações em um processo específico Uma classe interessante de mutantes consiste naqueles com alterações nos chamados genes mutadores que aumentam muito a taxa de mutações espontâneas Não é de surpre ender que um desses mutantes produza uma forma defeituosa da exonuclease de cor reção 35 que é uma parte da enzima DNApolimerase ver Figuras 58 e 59 Essa forma mutante de DNApolimerase não é mais capaz de fazer a correção eficiente do DNA resultando no acúmulo de erros de replicação que teriam sido removidos se a enzima atuasse corretamente O estudo de outros mutantes de E coli que exibem taxas anormalmente altas de mutação revelou um outro sistema de correção que remove erros de replicação produzi dos pela polimerase e que escaparam à exonuclease de correção Esse sistema de reparo de pareamento incorreto detecta o potencial de distorção na hélice de DNA que resulta da interação incorreta entre bases não complementares Se o sistema de correção simplesmente reconhecesse um malpareamento no DNA recémsintetizado e corrigisse de forma aleatória qualquer um dos dois nucleotídeos o sistema corrigiria erroneamente o molde original da metade dos casos e portanto não reduziria a taxa total de erros Para ser eficiente esse sistema deve ser capaz de dife renciar e remover o nucleotídeo incorreto apenas na fita recémsintetizada onde o erro ocorreu Na E coli o mecanismo de diferenciação das fitas usado pelo sistema de reparo de pareamento incorreto depende da metilação de determinados resíduos A no DNA Os grupos metil são adicionados a todos os resíduos A na sequência GATC mas somen te um tempo após a incorporação deste A na cadeia de DNA recémsintetizada Como resultado as únicas sequências GATC que não foram ainda metiladas são as fitas recém sintetizadas atrás da forquilha de replicação O reconhecimento desses GATCs não me tilados permite que as fitas novas sejam temporariamente diferenciadas das sequências originais possibilitando a remoção seletiva do erro O processo de três etapas envolve o reconhecimento de uma fita recémsintetizada a remoção da porção que contém o mal pareamento e a ressíntese do segmento removido usando a fita original como molde Esse sistema de reparo de pareamento incorreto reduz o número de erros produzidos durante a replicação por um fator adicional de 100 a 1000 ver Tabela 51 p 244 Um sistema semelhante de correção de malpareamento atua nas células eucari óticas porém tem uma estratégia diferente para distinguir a fita recémproduzida da original Figura 519 A fita retardada de DNA recémsintetizada contém quebras tem porárias antes de serem unidas pela DNAligase e essas quebras também chamadas quebras de fitasimples fornecem o sinal que direciona o sistema de correção de mal pareamento à fita correta Essa estratégia requer que as fitas de DNA recémsintetizadas na fitalíder também sejam transitoriamente clivadas ainda não está claro como isso ocorre A importância da correção de pareamento incorreto em humanos é demonstrada em indivíduos que herdam uma cópia defeituosa de um gene de reparo com uma cópia funcional do gene no outro cromossomo Esses indivíduos apresentam uma predispo sição significativa para certos tipos de câncer Por exemplo em um tipo de câncer de cólon chamado de câncer de cólon hereditário sem polipose HNPCC hereditary non polyposis colon cancer mutações espontâneas no único gene funcional produzem clo nes de células somáticas que devido à deficiência no sistema de reparo de pareamento CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 253 Um segundo tipo de DNAtopoisomerase a topoisomerase II forma uma ligação covalente com ambas as fitas da hélice de DNA ao mesmo tempo formando uma que bra de fita dupla temporária na hélice Essas enzimas são ativadas em sítios nos cromos somos onde duas duplas hélices foram cruzadas uma sobre a outra como as produzidas por superespirais à frente de uma forquilha de replicação ver Figura 520 Uma vez que a molécula de topoisomerase II ligase a um desses sítios de cruzamento a proteína utiliza a hidrólise do ATP para executar de maneira eficiente um conjunto de reações 1 clivagem reversível de uma duplahélice criando uma abertura no DNA 2 pas sagem da segunda duplahélice que está próxima pela abertura e 3 religação da que bra e dissociação do DNA Nos pontos de entrecruzamento produzidos pela superes piral a passagem da duplahélice pela abertura ocorre na direção que reduz a espiral Desta forma as topoisomerases do tipo II podem aliviar a tensão do superenrolamento formada à frente da forquilha Seu mecanismo de reação também permite que as topoi somerases do tipo II separem dois círculos entrelaçados de DNA de maneira eficiente Figura 522 A topoisomerase II também evita sérios problemas de emaranhamento do DNA que poderiam surgir durante sua replicação Essa função é bem demonstrada em células mutantes de leveduras que produzem uma versão da topoisomerase II que é inativada a 37 C no lugar da versão original Quando as células mutantes são incubadas a essa temperatura os cromossomosfilhos permanecem entrelaçados após a replicação e são incapazes de se separar A magnitude da utilidade da topoisomerase II para evitar o ema ranhamento dos cromossomos pode ser comparada a um indivíduo com dificuldades em desenrolar uma linha de pescar emanharada sem o auxílio de tesoura A replicação do DNA é fundamentalmente semelhante em eucariotos e em bactérias Muito do que se sabe sobre a replicação do DNA foi descoberto a partir de estudos em sistemas multienzimáticos purificados de bactérias e bacteriófagos capazes de realizar replicação de DNA in vitro O desenvolvimento desses sistemas na década de 1970 foi bastante facilitado pelo isolamento prévio de mutantes em vários genes envolvidos na replicação esses mutantes foram utilizados para identificar e purificar as proteínas de replicação correspondentes O primeiro sistema de replicação em mamíferos capaz de replicar DNA in vitro foi descrito em meados da década de 1980 e as mutações nos genes que codificam quase todos os componentes da replicação já foram isoladas e ana lisadas na levedura Saccharomyces cerevisiae Como resultado muito é conhecido sobre a enzimologia detalhada da replicação de DNA em eucariotos e está claro que as carac terísticas fundamentais da replicação incluindo a geometria da forquilha de replicação e o uso de uma maquinaria multiproteica de replicação foram conservadas durante o longo processo evolutivo que separa bactérias e eucariotos Existem mais componentes proteicos na maquinaria de replicação eucariótica em comparação aos seus análogos em bactérias apesar de as funções básicas serem as mes mas Assim por exemplo a proteína SSB eucariótica é formada por três subunidades enquanto apenas uma única subunidade é encontrada em bactérias Da mesma forma a DNAprimase eucariótica é incorporada em uma enzima com múltiplas subunidades que também contém a polimerase chamada de DNApolimerase aprimase Esse com plexo proteico inicia cada fragmento de Okazaki na fita retardada com o RNA e estende então o iniciador de RNA com um pequeno segmento de DNA Nesse ponto as duas principais DNApolimerases replicativas eucarióticas Pold e Pol entram em ação Pold completa cada fragmento de Okazaki na fita retardada e Pol alonga a fitalíder O au Figura 522 Reação de passagem da hélice de DNA catalisada pela topoisomera se II Ao contrário das topoisomerases tipo I as enzimas do tipo II hidrolisam o ATP em vermelho necessário para liberar e regenerar a enzima após cada ciclo As topoisomera ses do tipo II são limitadas quase exclusivamente a células proliferativas em eucariotos parcialmente por isso as topoisomerases são alvos eficazes para fármacos anticâncer Alguns desses fármacos inibem a topoisomerase II na terceira etapa mostrada na figura e portanto causam altos níveis de quebras de fita dupla que rapidamente matam as células em divisão Os pequenos círculos em amarelo representam os fosfatos na cadeia principal de DNA que foram covalentemente ligados à topoisomerase ver Figura 521 Duas duplashélices de DNA circular entrelaçadas Duas duplashélices de DNA circular separadas A topoisomerase reconhece o emaranhamento e forma uma ligação covalente reversível com as duas fitas opostas de uma das duplashélices em laranja criando uma quebra na fita dupla e formando um portão proteico O portão da topoisomerase abre e permite a passagem da segunda hélice de DNA O portão é fechado liberando a hélice em vermelho A reversão da ligação covalente da topoisomerase regenera uma duplahélice em laranja intacta Topoisomerase II ATP ADP Pi Pi 2 2 254 PARTE II Mecanismos genéticos básicos mento da complexidade da maquinaria de replicação eucariótica provavelmente reflete controles mais elaborados Por exemplo a manutenção ordenada dos diferentes tipos celulares e tecidos em plantas e animais requer que a replicação do DNA seja fortemente regulada Além disso a replicação de DNA eucariótico deve ser coordenada com o pro cesso complexo da mitose como discutiremos no Capítulo 17 Como veremos na próxima seção a maquinaria de replicação eucariótica possui um fator complicador adicional pois precisa replicar passando pelos nucleossomos as unidades estruturais repetidas dos cromossomos discutidas no Capítulo 4 Os nucle ossomos estão dispostos em intervalos de cerca de 200 pares de nucleotídeos ao longo do DNA o que como veremos pode explicar por que os novos fragmentos de Okazaki na fita retardada são sintetizados em intervalos de 100 a 200 nucleotídeos nos eucario tos em vez de 1000 a 2000 nucleotídeos como nas bactérias Os nucleossomos podem também atuar como barreiras que reduzem o movimento das moléculas de DNApoli merase justificando por que a forquilha de replicação dos eucariotos possui um décimo da velocidade da forquilha bacteriana Resumo A replicação do DNA ocorre em uma estrutura em forma de Y chamada de forquilha de replicação Uma enzima DNApolimerase autocorretiva catalisa a polimerização de nu cleotídeos na direção 53 copiando uma fitamolde de DNA com extraordinária fideli dade Como as duas fitas da duplahélice de DNA são antiparalelas essa síntese de DNA 53 só pode ser realizada continuamente em uma das fitas da forquilha de replicação fitalíder Na fita retardada pequenos fragmentos de DNA são sintetizados de trás para frente Uma vez que a DNApolimerase autocorretiva não pode iniciar uma nova cadeia esses fragmentos da fita retardada são iniciados por pequenas moléculas de RNA que sub sequentemente são removidas e substituídas por DNA A replicação do DNA necessita da cooperação de várias proteínas incluindo 1 a DNApolimerase e a DNAprimase que catalisam a polimerização dos nucleosídeos trifosfa to 2 as DNAhelicases e as proteínas ligadoras de DNA de fita simples SSB que auxiliam na abertura da duplahélice para permitir que as fitas sejam copiadas 3 a DNAligase e uma enzima que degrada os iniciadores de RNA para ligar os fragmentos descontínuos de DNA formados na fita retardada e 4 as DNAtopoisomerases que aliviam a tensão causa da pelo enrolamento helicoidal e os problemas de emaranhamento do DNA Muitas dessas proteínas associamse entre si na forquilha de replicação formando uma maquinaria de replicação altamente eficiente em que as atividades e os movimentos espaciais dos compo nentes individuais são coordenados INÍCIO E TÉRMINO DA REPLICAÇÃO DO DNA NOS CROMOSSOMOS Vimos como um conjunto de proteínas de replicação gera duas duplashélices de DNA com rapidez e precisão atrás de uma forquilha de replicação móvel Mas como essa ma quinaria de replicação é formada no início do processo e como a forquilha é formada na molécula de DNA de fita dupla intacta Nesta seção discutimos como a replicação é iniciada e como as células regulam cuidadosamente esse processo para assegurar que ele ocorra não apenas no local adequado do cromossomo mas também no momento adequado da vida da célula Também são discutidos alguns problemas especiais que a maquinaria de replicação eucariótica deve vencer Esses problemas incluem a necessi dade de replicar moléculas de DNA extremamente longas e a dificuldade de copiar mo léculas de DNA que estão fortemente complexadas com as histonas nos nucleossomos A síntese de DNA inicia na origem de replicação Como discutido anteriormente a duplahélice de DNA normalmente é muito estável as duas fitas são unidas firmemente por várias ligações de hidrogênio formadas entre as bases presentes em cada fita Para iniciar a replicação do DNA a duplahélice deve pri meiramente ser aberta e as duas fitas separadas para expor as bases não pareadas Como veremos o processo de replicação de DNA é iniciado por proteínas iniciadoras especiais Origem de replicação ABERTURA LOCAL DA HÉLICE DE DNA SÍNTESE DO INICIADOR DE RNA INÍCIO DA SÍNTESE DA FITALÍDER INICIADORES DE RNA INICIAM A SÍNTESE DA FITA RETARDADA FORQUILHA 1 Fita retardada da forquilha 1 Fitalíder da forquilha 2 Fitalíder da forquilha 1 Fita retardada da forquilha 2 FORQUILHA 2 Figura 523 Bolha de replicação formada no início da forquilha de replicação O dia grama mostra as etapas principais envolvidas no início das forquilhas na origem de replica ção A estrutura formada na última etapa na qual as duas fitas da hélice de DNA parental foram separadas uma da outra e atuam como moldes para a síntese de DNA é chamada de bolha de replicação CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 255 que se ligam à fita dupla de DNA e separam as duas ligações rompendo as ligações de hidrogênio entre as bases As posições onde a hélice inicialmente é aberta são chamadas de origens de re plicação Figura 523 Em células simples como bactérias e leveduras as origens são determinadas por sequências de DNA formadas por várias centenas de pares de nucleo tídeos Esse DNA contém pequenas sequências de DNA que atraem as proteínas inicia doras e segmentos de DNA especialmente fáceis de separar Vimos na Figura 44 que o par de base AT é unido por menos ligações de hidrogênio do que o par GC Portanto segmentos de DNA ricos em pares de bases AT são relativamente mais fáceis de serem separados e essas regiões de DNA ricas em pares AT estão normalmente presentes nas origens de replicação Apesar de o processo básico de replicação apresentado na Figura 523 ser o mes mo para bactérias e eucariotos a maneira detalhada de como ele é executado e regulado difere entre esses dois grupos de organismos Primeiramente iremos considerar o caso das bactérias mais simples e mais bem entendido e a seguir situações mais complexas que ocorrem em leveduras em mamíferos e em outros eucariotos Os cromossomos bacterianos geralmente têm uma única origem de replicação do DNA O genoma da E coli está contido em uma única molécula de DNA circular com 46 x 10 6 pares de nucleotídeos A replicação do DNA inicia em uma única origem de replicação e as duas forquilhas formadas seguem a cerca de 1000 nucleotídeos por segundo em direções opostas até se encontrarem aproximadamente no meio do caminho ao redor do cromossomo Figura 524 O único ponto no qual a E coli pode controlar a replicação do DNA é o seu início uma vez formadas na origem as forquilhas deslocamse a uma velocidade relativamente constante até o término da replicação Portanto não é de sur preender que o início da replicação seja um processo altamente controlado O processo inicia quando múltiplas cópias de proteínas iniciadoras no estado ligado à ATP ligam se a sítios específicos no DNA localizados nas origens de replicação enrolando o DNA em volta das proteínas formando um grande complexo proteínaDNA que desestabiliza a duplahélice adjacente A seguir esse complexo atrai duas DNAhelicases cada uma ligada a um carregador de helicase e essas são colocadas em torno de fitas simples de DNA adjacentes cujas bases foram expostas pela montagem do complexo de iniciação proteínaDNA O carregador da helicase é análogo ao montador da cinta visto anterior mente mas possui a tarefa adicional de manter a helicase na forma inativa até que ela esteja corretamente colocada na forquilha de replicação nascente Uma vez colocadas na posição os carregadores se dissociam e as helicases começam a desenrolar o DNA ex pondo DNA de fita simples suficiente para a DNAprimase sintetizar os primeiros inicia dores primers de RNA Figura 525 Isso rapidamente determina o arranjo das demais proteínas para formar duas forquilhas de replicação com maquinarias que se deslocam em direções opostas em relação à origem de replicação Elas continuam a sintetizar DNA até que toda a fita de DNAmolde à frente de cada forquilha tenha sido replicada Na E coli a interação da proteína iniciadora com a origem de replicação é cuidado samente regulada e o início ocorre apenas quando há nutrientes suficientes disponíveis para a bactéria completar todo o processo de replicação A iniciação também é controlada de maneira a garantir que ocorra somente um ciclo de replicação do DNA a cada divi são celular Após o início da replicação a proteína iniciadora é inativada pela hidrólise da molécula de ATP ligada e a origem de replicação passa por um período refratário O período refratário é causado por um atraso na metilação de nucleotídeos A recém incorporados na origem Figura 526 A iniciação não pode ocorrer novamente até que os As estejam metilados e a proteína iniciadora restaurada ao estado com ATPligado Figura 524 A replicação do DNA de um genoma bacteriano A duplicação do geno ma de E coli composto por 46 x 10 6 pares de nucleotídeos dura cerca de 30 minutos Para simplificação os fragmentos de Okazaki da fita retardada foram omitidos O que ocorre à medida que as duas forquilhas se aproximam entre si e colidem ao final do ciclo de replicação não está totalmente entendido porém as maquinarias de replicação são dissociadas como parte do processo Início da replicação Origem de replicação Término da replicação Duas moléculasfilhas de DNA circular 256 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Os cromossomos eucarióticos contêm múltiplas origens de replicação Vimos como nas bactérias duas forquilhas de replicação são formadas em uma única ori gem de replicação Essas forquilhas procedem em direções opostas distanciandose da origem até que todo o DNA contido em um único cromossomo circular seja replicado O ge noma bacteriano é relativamente pequeno levando cerca de 30 minutos para ser totalmente duplicado a partir das duas forquilhas Como os cromossomos eucarióticos são muito maio res uma estratégia diferente é utilizada para permitir sua replicação em um tempo hábil Um método para determinar o padrão geral da replicação de cromossomos euca rióticos foi desenvolvido no início da década de 1960 As células humanas em cultura são marcadas com 3Htimidina por um breve período de modo que o DNA sintetizado du rante esse período é altamente radioativo As células são então gentilmente lisadas e o DNA é disperso sobre uma lâmina de vidro coberta com uma emulsão fotográfica A re velação da emulsão mostra o padrão do DNA marcado pela técnica de autorradiografia O tempo para a marcação é determinado de modo a permitir o deslocamento de vários micrometros de cada forquilha ao longo do DNA e o DNA replicado pode ser detectado no microscópio óptico como uma linha com pontos prateados embora a molécula de DNA por si só seja muito fina para ser visualizada Desse modo tanto a velocidade como a direção do movimento da forquilha podem ser determinadas Figura 527 A partir Origem de replicação Proteínas iniciadoras Hélice de DNA parental LIGAÇÃO DE PROTEÍNAS INICIADORAS À ORIGEM DE REPLICAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO DA SEQUÊNCIA RICA EM AT INSERÇÃO DAS DNAHELICASES ATIVAÇÃO DAS HELICASES INSERÇÃO DA DNAPRIMASE SÍNTESE DO INICIADOR DE RNA PERMITE QUE AS DNAPOLIMERASES INICIEM AS NOVAS CADEIAS DNAprimase Iniciador de RNA Sequência rica em AT DNAhelicase ligada à proteína carregadora da helicase Proteína carregadora da helicase DUAS FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO MOVENDOSE EM DIREÇÕES OPOSTAS DNApolimerase inicia a síntese da fitalíder INSERÇÃO DE DUAS DNAPOLIMERASES ADICIONAIS INÍCIO DA SÍNTESE DA FITA RETARDADA Figura 525 As proteínas que iniciam a re plicação do DNA em bactérias O mecanismo mostrado foi estabelecido a partir de estudos in vitro com uma mistura de proteínas altamente purificadas Para a replicação do DNA da E coli a principal proteína iniciadora a helicase e a primase são as proteínas dnaA dnaB e dnaG respectivamente Na primeira etapa várias moléculas da proteína iniciadora ligamse a sequências específicas de DNA na origem de replicação e desestabilizam a duplahélice pela formação de uma estrutura compacta na qual o DNA é firmemente enrolado ao redor da pro teína A seguir duas helicases são trazidas ao local pelas proteínas carregadoras das helicases as proteínas dnaC que inibem as helicases até que estas estejam corretamente posicionadas na origem de replicação As proteínas carre gadoras das helicases evitam que as hélices replicativas entrem de forma incorreta em outros segmentos de DNA de fita simples no genoma bacteriano Auxiliadas pela proteína ligadora de fita simples não mostrada as heli cases posicionadas abrem o DNA permitindo a entrada das primases e a síntese dos primeiros iniciadores Nas etapas subsequentes duas for quilhas de replicação completas são montadas na origem e se deslocam em direções opostas As proteínas iniciadoras são removidas confor me a forquilha se move para o lado esquerdo não mostrado 258 PARTE II Mecanismos genéticos básicos são formadas em pares e criam uma bolha de replicação à medida que se deslocam em direções opostas distanciandose do ponto de origem comum parando apenas quan do se encontram cabeça a cabeça ou quando chegam à extremidade do cromossomo Dessa forma várias forquilhas podem operar de forma independente em cada cromos somo formando duas hélices de DNA filhas completas A replicação de DNA em eucariotos ocorre apenas durante uma etapa do ciclo celular Durante o crescimento rápido as bactérias replicam o seu DNA quase de forma contínua Em contraste a replicação do DNA na maioria das células eucarióticas ocorre apenas du rante uma parte do ciclo de divisão celular chamada de fase de síntese de DNA ou fase S Figura 529 Nas células de mamíferos a fase S normalmente dura cerca de 8 horas em eucariotos mais simples como as leveduras a fase S pode durar cerca de 40 minutos ape nas Ao término dessa fase cada cromossomo foi replicado e produziu duas cópias com pletas que permanecem unidas pelo centrômero até a fase M M de mitose na sequência do ciclo No Capítulo 17 descrevemos o sistema de controle que comanda o ciclo celular e explicamos o porquê da necessidade de completar cada fase com sucesso antes de passar à próxima Nas seções seguintes exploramos como a replicação cromossômica é coordenada na fase S do ciclo celular Regiões diferentes no mesmo cromossomo replicam em tempos distintos na fase S Nas células de mamíferos a replicação do DNA na região entre duas origens de replica ção normalmente necessitaria de apenas 1 hora para ser replicada devido à velocidade de deslocamento das forquilhas e às grandes distâncias medidas entre as origens em uma unidade de replicação Porém a fase S normalmente dura cerca de 8 horas nessas células Isso sugere que as origens de replicação não são todas ativadas simultaneamente e de fato as origens de replicação são ativadas em blocos com cerca de 50 origens adjacentes e cada uma delas é replicada apenas durante um breve período do intervalo total da fase S Parece que a ordem de ativação das origens de replicação depende em parte da es trutura da cromatina em que a origem está localizada Vimos no Capítulo 4 que a hetero cromatina é um estado especialmente condensado da cromatina enquanto a eucromatina Figura 528 Uso de um microarranjo de DNA para monitorar a formação e a pro gressão das forquilhas de replicação Para este experimento uma população de células foi sincronizada de modo que to das iniciam a replicação ao mesmo tempo O DNA é coletado e hibridizado ao micro arranjo o DNA que foi replicado apenas uma vez apresenta um sinal quadrados em verdeescuro com o dobro da inten sidade do DNA não replicado quadrados em verdeclaro Os pontos no microarran jo representam as sequências consecutivas de um segmento do cromossomo dispos tas da esquerda para a direita e de cima para baixo Apenas 81 pontos são mos trados mas o microarranjo real contém centenas de milhares de sequências distri buídas em todo um genoma Como pode ser visto a replicação inicia na origem e procede bidirecionalmente Para simplifi car apenas uma origem é mostrada Nas células humanas a replicação inicia em 30 a 50 mil origens localizadas pelo genoma Com essa estratégia é possível observar a formação e o progresso de cada forquilha de replicação por todo o genoma 0 min 5 min 10 min 20 min O início da replicação é permitido Fragmentação do DNA separação das fitas e marcação fluorescente SEM REPLICAÇÃO REPLICAÇÃO INICIA NA ORIGEM CONTINUAÇÃO DA REPLICAÇÃO DNA COMPLETAMENTE REPLICADO Cultura de células suspensa antes do início da replicação M G1 G2 S Figura 529 As quatro fases suces sivas de um ciclo celular padrão em eucariotos Durante as fases G1 S e G2 a célula cresce continuamente Na fase M o crescimento para ocorre a divisão nuclear e a célula se divide em duas A replicação do DNA é limitada à parte do ciclo celular conhecida como fase S G1 é o intervalo entre as fases M e S G2 é o intervalo entre as fases S e M CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 259 onde ocorre a maior parte da transcrição apresenta uma conformação menos condensada A heterocromatina tende a ser replicada em um estágio bastante tardio da fase S sugerindo que o momento da replicação está relacionado à compactação do DNA na cromatina Uma vez iniciadas porém as forquilhas de replicação se deslocam em velocidades equivalentes pela fase S de modo que a extensão da condensação cromossômica parece influenciar o momento da iniciação das forquilhas de replicação em vez de sua veloci dade após ter sido formada Um grande complexo de múltiplas subunidades ligase às origens de replicação de eucariotos Tendo visto que um cromossomo eucarioto é replicado usando várias origens de replica ção onde cada uma dispara em um determinado momento na fase S do ciclo celular retornamos à natureza dessas origens de replicação Neste capítulo vimos que as origens de replicação foram bem definidas em bactérias como sequências específicas de DNA que atraem as proteínas iniciadoras as quais por sua vez formam a maquinaria de re plicação do DNA Veremos que esse é o caso para a levedura unicelular de brotamento S cerevisiae no entanto parece não ser o caso da maioria dos outros eucariotos A localização de cada origem de replicação em cada cromossomo foi determinada para a levedura de brotamento O cromossomo em particular mostrado na Figura 530 cromossomo III da S cerevisiae é um dos menores cromossomos conhecidos com um comprimento de menos de 1100 do comprimento de um cromossomo humano típico Suas origens principais estão distanciadas em média por 30 mil pares de nucleotídeos mas apenas um subgrupo dessas origens é usado em uma determinada célula Apesar disso todo esse cromossomo pode ser replicado em uns 15 minutos A sequência mínima necessária para promover a iniciação da replicação de DNA na S cerevisiae foi determinada pela redução sucessiva de um segmento de DNA que contém uma origem de replicação e verificandose a capacidade desta atuar como origem de replicação em fragmentos cada vez menores A maioria das sequências de DNA que pode atuar como uma origem contém 1 um sítio de ligação para uma grande proteína de iniciação com múltiplas subunidades chamada ORC complexo de reco nhecimento da origem do inglês origin recognition complex 2 uma sequência de DNA rica em As e Ts e portanto fácil de desnaturar e 3 pelo menos um sítio de ligação para proteínas que facilitam a ligação do ORC provavelmente pelo ajuste da estrutura da cromatina Em bactérias uma vez que a proteína iniciadora está corretamente ligada à única origem de replicação as forquilhas de replicação parecem seguir de modo quase auto mático Em eucariotos a situação é bastante diferente porque os eucariotos têm um gra ve problema na replicação dos cromossomos com tantos locais para iniciar a replicação como o processo é controlado para assegurar que todo o DNA seja copiado uma vez e apenas uma única vez A resposta está no modo sequencial com que ocorre a montagem inicial da helica se replicativa nas origens e sua ativação para iniciar a replicação do DNA Essa questão é discutida em detalhes no Capítulo 17 onde consideraremos o mecanismo que controla o ciclo de divisão celular Brevemente durante a fase G1 as helicases replicativas são colo cadas no DNA próximas ao ORC criando um complexo préreplicativo A seguir na pas sagem da fase G1 para fase S as proteínascinase especializadas se juntam ao complexo e ativam as helicases Isso resulta na abertura da duplahélice o que permite a montagem das demais proteínas replicativas incluindo as DNApolimerases As proteínascinase que promovem a replicação do DNA simultaneamente impe dem a formação de novos complexos préreplicativos até a próxima fase M quando todo 100 0 200 Pares de nucleotídeos milhares 300 Telômero Telômero Centrômero Origens de replicação CROMOSSOMO III Figura 530 As origens da replicação do DNA no cromossomo III da levedu ra S cerevisiae Este cromossomo um dos menores cromossomos eucarióticos conhecidos contém 180 genes no total Como indicado ele contém 18 origens de replicação que são utilizadas com diferentes frequências As mostradas em vermelho são normalmente utilizadas em menos de 10 das divisões celulares e as em verde são empregadas em cerca de 90 do tempo 260 PARTE II Mecanismos genéticos básicos o ciclo é reiniciado detalhes nas p 974975 Elas atingem esse objetivo em parte pela fosforilação do ORC produzindo um complexo incapaz de interagir com novas helica ses Essa estratégia fornece uma única janela de oportunidade para a formação de novos complexos préreplicativos fase G1 quando a atividade da cinase está baixa e uma se gunda janela para sua ativação e subsequente dissociação fase S quando a atividade da cinase está alta Como essas duas fases do ciclo celular são mutuamente excludentes e ocorrem em uma ordem determinada cada origem de replicação é ativada apenas uma vez durante cada ciclo celular Figura 531 As características do genoma humano que determinam as origens de replicação ainda precisam ser descobertas Comparada à situação das leveduras de brotamento os determinantes das origens de replicação em outros eucariotos têm sido difíceis de descobrir Foi possível identificar sequências específicas de DNA humano cada uma contendo vários milhares de pares de nucleotídeos de comprimento que atuam como origens de replicação Essas origens continuam a atuar quando movidas para diferentes regiões do cromossomo por meio de métodos de DNA recombinante desde que colocadas em uma região em que a cromati na esteja pouco condensada Contudo comparações entre estas sequências de DNA não revelaram sequências específicas que marcam as origens de replicação Apesar disso um ORC humano muito similar ao ORC de leveduras ligase às ori gens de replicação e inicia a replicação do DNA em humanos Diversas proteínas que Figura 531 Início da replicação do DNA em eucariotos Esse mecanismo as segura que cada origem de replicação seja ativada apenas uma vez por ciclo celular Uma origem de replicação pode ser utiliza da apenas se um complexo préreplicativo for formado na fase G1 No início da fase S cinases especializadas fosforilam Mcm ativandoo e ORC inativandoo Um novo complexo préreplicativo não pode ser formado na origem até a célula ter pro gredido à próxima fase G1 quando o ORC ligado será defosforilado Observe que as helicases Mcm de eucariotos movemse ao longo do molde da fitalíder enquanto a helicase bacteriana movese ao longo do molde da fita retardada ver Figura 525 À medida que as forquilhas iniciam seu movimento o ORC é deslocado e novos ORCs são rapidamente ligados às origens recémreplicadas Cdc6 ORC complexo de reconhecimento da origem P P P P Origem Cdt1 Helicase Mcm Complexo préreplicativo FOSFORILAÇÃO DE Mcm E ORC HELICASES ATIVADAS ORC DESLOCADO RECRUTAMENTO DA DNAPOLIMERASE E OUTRAS PROTEÍNAS DA REPLICAÇÃO RELIGAÇÃO DO ORC INÍCIO DA SÍNTESE DE DNA TÉRMINO DA REPLICAÇÃO DO DNA G1 S G2 DNA P P CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 261 atuam no início da replicação em leveduras da mesma forma têm função fundamental também em humanos Portanto parece que em linhas gerais os mecanismos de inicia ção em humanos e leveduras são semelhantes mas a estrutura da cromatina a atividade transcricional ou alguma outra propriedade do genoma além da sequência específica de DNA têm função essencial na atração da ORC para especificar as origens de replicação de mamíferos Essas teorias podem ajudar a explicar como uma determinada célula de mamífero escolhe quais entre as diversas origens possíveis deve usar para replicar seu genoma e como essa escolha pode diferir de célula para célula Claramente há muito a ser descoberto sobre o processo fundamental da iniciação da replicação do DNA Novos nucleossomos são formados atrás da forquilha de replicação Vários aspectos adicionais da replicação do DNA são específicos de eucariotos Como discutido no Capítulo 4 os cromossomos eucarióticos são compostos por uma mistura de partes relativamente iguais de DNA e proteínas A duplicação cromossômica por tanto necessita não apenas da replicação do DNA mas também da síntese de novas proteínas cromossômicas e sua associação ao DNA atrás de cada forquilha de replicação Apesar de estarmos longe de compreender os detalhes desse processo começamos a entender como a unidade fundamental de compactação da cromatina o nucleossomo é duplicada A célula necessita de uma enorme quantidade de novas proteínas histo nas aproximadamente equivalente em massa ao DNA recémsintetizado para formar os novos nucleossomos a cada ciclo celular Por isso a maioria dos organismos eucario tos possui múltiplas cópias dos genes para cada histona As células de vertebrados por exemplo possuem cerca de 20 conjuntos de genes repetidos a maior parte contendo os genes que codificam todas as cinco histonas H1 H2A H2B H3 e H4 Diferentemente da maior parte das proteínas que são produzidas de forma contí nua as histonas são sintetizadas principalmente na fase S quando o seu nível de mRNA aumenta cerca de 50 vezes como resultado do aumento da transcrição e da redução da degradação do mRNA Os principais mRNAs das histonas são degradados em minutos quando a síntese de DNA para ao final da fase S O mecanismo depende de propriedades especiais nas extremidades 3 desses mRNAs como discutido no Capítulo 7 Em contras te as proteínas histonas são extremamente estáveis e podem sobreviver por toda a vida da célula A forte relação entre a síntese de DNA e a síntese de histonas provavelmente está sujeita a um mecanismo de retroalimentação que monitora o nível de histonas li vres assegurando que a quantidade de histonas produzidas se ajuste perfeitamente à quantidade de DNA sintetizado À medida que a forquilha de replicação avança ela deve passar sobre os nucleos somos parentais Na célula a replicação eficiente requer que os complexos de remodela gem da cromatina discutidos no Capítulo 4 desestabilizem as interfaces DNAhistonas Com o auxílio desses complexos as forquilhas de replicação podem transitar de manei ra eficiente mesmo na cromatina altamente condensada À medida que a forquilha de replicação passa pela cromatina as histonas são tem porariamente deslocadas resultando em uns 600 pares de nucleotídeos de DNA não nu cleossômico em seu rastro O restabelecimento dos nucleossomos atrás da forquilha em movimento ocorre de modo curioso Quando um nucleossomo é atravessado por uma forquilha de replicação o octâmero de histonas parece ser dissociado em um tetrâmero H3H4 e dois dímeros H2AH2B discutidos no Capítulo 4 O tetrâmero H3H4 permane ce fracamente associado ao DNA e é distribuído de forma aleatória a um dos dois duplex filhos porém os dímeros H2AH2B são completamente dissociados do DNA Os tetrâ meros H3H4 recémformados são adicionados ao DNA recémsintetizado preenchendo os espaços vazios e os dímeros H2AH2B metade novos e metade originais são adi cionados aleatoriamente para completar os nucleossomos Figura 532 A formação dos novos nucleossomos atrás da forquilha de replicação traz uma consequência importante para o próprio processo de replicação Enquanto a DNApolimerase d sintetiza a fita retar dada ver p 253254 o comprimento de cada fragmento de Okazaki é determinado pelo local em que a DNApolimerase d é bloqueada por um nucleossomo recémformado Esse forte acoplamento entre a duplicação nucleossômica e a replicação do DNA explica 262 PARTE II Mecanismos genéticos básicos porque os fragmentos de Okazaki em eucariotos 200 nucleotídeos têm aproximada mente o mesmo comprimento da repetição do nucleossomo A adição ordenada e rápida dos novos tetrâmeros H3H4 e dímeros H2AH2B atrás da forquilha de replicação requer chaperonas de histonas também chamadas de fato res de associação da cromatina Esses complexos com várias subunidades ligamse às histonas altamente básicas e as liberam apenas no contexto apropriado As chaperonas de histonas com suas cargas são conduzidas ao DNA recémreplicado pela interação específica com a cinta deslizante eucariótica chamada PCNA ver Figura 532 As cintas são deixadas atrás da forquilha em movimento e permanecem no DNA por um período suficiente para que as chaperonas de histonas completem sua função A telomerase replica as extremidades dos cromossomos Vimos que a síntese da fita retardada na forquilha de replicação ocorre de modo des contínuo por um mecanismo de voltar para trás produzindo pequenos fragmentos de DNA Esse mecanismo encontra um problema especial quando a forquilha de replicação alcança a extremidade de um cromossomo linear O iniciador de RNA final sintetizado no molde da fita retardada não pode ser substituído por DNA porque não há uma extre midade 3OH disponível para a polimerase de reparo Na ausência de um mecanismo para contornar esse problema o DNA das extremidades de todos os cromossomos seria perdido cada vez que uma célula se dividisse As bactérias resolveram esse problema do final da replicação possuindo cromos somos formados por moléculas circulares de DNA ver Figura 524 Os eucariotos re solvem esse problema de um modo diferente por meio de sequências nucleotídicas es peciais nas extremidades dos cromossomos incorporadas em estruturas denominadas telômeros discutido no Capítulo 4 Os telômeros contêm várias repetições consecutivas de sequências curtas semelhantes em organismos tão diversos como protozoários fun gos plantas e mamíferos Em humanos a sequência da unidade de repetição é GGGTTA sendo repetida aproximadamente mil vezes em cada telômero As sequências de DNA telomérico são reconhecidas por proteínas ligadoras de DNA que reconhecem uma sequência específica de DNA e atraem uma enzima cha mada de telomerase que repõe essas sequências cada vez que a célula se divide A te lomerase reconhece a extremidade de uma sequência telomérica de DNA existente e a estende na direção 53 utilizando um molde de RNA que compõe a própria enzima para sintetizar novas cópias da repetição Figura 533 A parte enzimática da telome rase se assemelha às transcriptases reversas proteínas que sintetizam DNA usando um molde de RNA embora nesse caso o RNA da telomerase contribua também com grupos funcionais que tornam a catálise mais eficiente Após a extensão da fita de DNA paren tal pela telomerase a replicação da fita retardada na extremidade cromossômica pode ser completada pelas enzimas DNApolimerases convencionais usando essas extensões como molde para a síntese da fita complementar Figura 534 Figura 532 Formação dos nucleos somos atrás da forquilha de replica ção Os tetrâmeros H3H4 parentais são distribuídos aleatoriamente às moleculas filhas de DNA com aproximadamente metade sendo herdado por cada uma Em contraste os dímeros H2AH2B são libe rados do DNA na passagem da forquilha de replicação Essa liberação inicia logo à frente da forquilha de replicação e é reali zada pelos complexos de remodelagem da cromatina que se movem com a forquilha As chaperonas de histonas NAP1 e CAF1 regeneram o complemento completo das histonas às moléculasfilhas usando histonas parentais e recémsintetizadas Embora alguns nucleossomosfilhos pos sam conter apenas histonas parentais ou apenas histonas novas a maioria é híbrida formada por histonas parentais e novas Para simplificar a duplahélice de DNA é mostrada como uma única linha em vermelho Adaptada de JD Watson et al Molecular Biology of the Gene 5ª ed Cold Spring Harbor Cold Spring Harbor Laboratory Press 2004 Tetrâmero H3H4 parental Tetrâmero H3H4 recémsintetizado NAP1 insere o dímero H2AH2B CAF1 insere o tetrâmero H3H4 Dímero H2AH2B Dímero H2AH2B é deslocado para a frente da forquilha de replicação Forquilha de replicação Cromatina parental Cinta deslizante CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 265 segurança contra a proliferação celular descontrolada de células anormais em tecidos somáticos e assim auxiliar na proteção contra o câncer A hipótese de que o comprimento do telômero atue como uma haste de medição para contar as divisões celulares e assim regular a duração da vida de uma linhagem celular tem sido avaliada de diversas maneiras Em determinados tipos de células hu manas cultivadas em cultura os resultados experimentais concordam com essa teoria Os fibroblastos humanos normalmente sofrem cerca de 60 divisões celulares em cultu ra antes de sofrerem senescência celular replicativa Como a maioria das outras células somáticas em humanos os fibroblastos produzem níveis muito baixos de telomerase e seus telômeros são gradativamente encurtados a cada divisão Quando a telomerase é oferecida aos fibroblastos pela inserção de um gene de telomerase ativo o comprimento do telômero é mantido e muitas das células continuam a proliferarse indefinidamente Foi proposto que esse tipo de controle da proliferação celular pode contribuir para o envelhecimento de animais incluindo humanos Essas ideias têm sido avaliadas pela produção de camundongos transgênicos sem nenhuma telomerase Os telômeros dos cromossomos dos camundongos são cerca de cinco vezes mais longos que os telômeros humanos e os camundongos devem portanto reproduzirse no mínimo três gerações até que seus telômeros tenham encurtado ao tamanho normal dos humanos Não foi surpresa então que as primeiras gerações de camundongos se desenvolvessem normal mente Porém camundongos de gerações posteriores desenvolveram progressivamente mais defeitos em alguns tecidos de alta proliferação Além disso esses camundongos apresentaram sinais de envelhecimento prematuro e uma tendência pronunciada ao de senvolvimento de tumores Nesses e em outros aspectos esses camundongos lembram humanos com a doença genética disceratose congênita Indivíduos afetados por essa doença possuem uma cópia funcional e outra cópia não funcional do gene da enzima RNAtelomerase eles apresentam um encurtamento prematuro dos telômeros e nor malmente morrem por destruição progressiva da medula óssea Eles também desenvol vem problemas pulmonares e cirrose hepática e apresentam anormalidades em várias estruturas epidérmicas incluindo pele folículos pilosos e unhas As observações anteriores demonstram claramente que o controle da proliferação celular pelo encurtamento dos telômeros impõe um risco aos organismos pois nem todas as células que começam a perder as extremidades cromossômicas irão parar de se dividir Algumas aparentemente tornamse geneticamente instáveis mas continuam a se dividir e geram variantes celulares que podem levar ao câncer Claramente a utilização do encur tamento telomérico como mecanismo de regulação não é à prova de falhas e assim como vários mecanismos nas células parece estabelecer um equlíbrio entre risco e benefício Resumo As proteínas que iniciam a replicação do DNA ligamse a sequências de DNA na origem de replicação e catalisam a formação de uma bolha de replicação com duas forquilhas de replicação que se deslocam em sentidos opostos O processo inicia quando um complexo DNAproteína iniciadora é formado e subsequentemente acopla uma DNAhelicase ao DNAmolde Outras proteínas são então adicionadas formando uma maquinaria de re plicação multienzimática que catalisa a síntese de DNA em cada forquilha de replicação Nas bactérias e em alguns eucariotos simples as origens de replicação são deter minadas por sequências de DNA específicas com apenas algumas centenas de pares de nucleotídeos Em outros eucariotos como os humanos as sequências necessárias para de terminar uma origem de replicação de DNA parecem ser bem menos definidas e a origem pode estenderse por vários milhares de pares de nucleotídeos Em geral as bactérias possuem uma única origem de replicação em um cromosso mo circular Com uma velocidade de mil nucleotídeos por segundo as forquilhas comple tam a replicação do genoma em menos de 1 hora A replicação do DNA eucariótico ocorre em apenas uma fase do ciclo celular a fase S Em eucariotos a forquilha de replicação se desloca cerca de 10 vezes mais lentamente comparada à forquilha de replicação de bacté rias e cada cromossomo eucariótico muito mais longo requer diversas origens de repli cação para completar sua replicação na fase S que dura normalmente 8 horas em células humanas As diferentes origens de replicação nos cromossomos eucarióticos são ativadas em uma sequência determinada em parte pela estrutura da cromatina em que as regiões 266 PARTE II Mecanismos genéticos básicos mais condensadas da cromatina iniciam sua replicação mais tardiamente Após a passa gem da forquilha a estrutura da cromatina é regenerada pela adição de novas histonas às histonas originais as quais são diretamente herdadas em cada moléculafilha de DNA Os eucariotos resolvem o problema da replicação das extremidades dos seus cro mossomos lineares por meio de uma estrutura especializada na porção terminal o telô mero mantido por uma enzima especial de polimerização de nucleotídeos chamada de telomerase A telomerase estende uma das fitas de DNA na extremidade do cromossomo utilizando um molde de RNA que é parte integral da enzima produzindo uma sequência altamente repetida de DNA que caracteristicamente estendese por milhares de pares de nucleotídeos em cada extremidade cromossômica Os telômeros possuem estruturas espe cializadas que os diferenciam de quebras nas extremidades cromossômicas assegurando que não sejam erroneamente reparados REPARO DO DNA A manutenção da estabilidade genética de um organismo necessária à sobrevivência re quer não apenas um mecanismo extremamente preciso para replicar o DNA mas tam bém mecanismos para corrigir as diversas lesões acidentais que ocorrem continuamente no DNA Grande parte das alterações espontâneas é temporária pois são imediatamente corrigidas por um conjunto de processos chamados coletivamente de reparo do DNA Das dezenas de milhares de alterações aleatórias geradas a cada dia no DNA de uma célula humana por calor acidentes metabólicos radiações de vários tipos e exposição a substâncias ambientais apenas algumas alterações menos de 002 acumulamse como mutações permanentes na sequência de DNA O restante é eliminado com uma eficiência impressionante pelo reparo de DNA A importância do reparo de DNA é evidenciada pelo enorme investimento que as células fazem nas enzimas que o realizam uma enorme porcentagem da capacidade codificadora da maioria dos genomas é dedicada exclusivamente às funções de reparo de DNA A importância do reparo do DNA também pode ser demonstrada pelo aumento da taxa de mutação que ocorre após a inativação de um gene de reparo Muitas proteínas de reparo do DNA e os genes que as codificam que operam em uma grande variedade de organismos incluindo os humanos foram originalmente identificados em bactérias pelo isolamento e caracterização de mutantes que apresentavam uma taxa de mutação aumentada ou uma sensibilidade aumentada a agentes que danificam o DNA TABELA 52 Algumas síndromes humanas hereditárias causadas por defeitos no reparo do DNA Nome Fenótipo Enzima ou processo afetado MSH2 3 6 MLH1 PMS2 Câncer de cólon Reparo de pareamento incorreto Xeroderma pigmentoso XP grupos AG Câncer de pele sensibilidade à radiação ultravioleta UV anormalidades neurológicas Reparo por excisão de nucleotídeos Síndrome de Cockayne Sensibilidade à radiação UV anormalidades no desenvolvimento Reparo por excisão de nucleotídeos acoplado à transcrição Variante de XP Câncer de pele sensibilidade à radiação UV Síntese translesão pela DNApolimerase Ataxiatelangiectasia AT Leucemia linfoma sensibilidade a raios g instabilidade genômica Proteína ATM uma proteínacinase ativada por quebras na fita dupla BRCA1 Câncer de mama e ovário Reparo por recombinação homóloga BRCA2 Câncer de mama ovário e próstata Reparo por recombinação homóloga Síndrome de Werner Envelhecimento prematuro câncer em vários sítios instabilidade genômica Uma 3exonuclease acessória e a DNA helicase usada no reparo Síndrome de Bloom Câncer em vários sítios suspensão do crescimento instabilidade genômica DNAhelicase necessária para a recombinação Anemia de Fanconi grupos AG Anormalidades congênitas leucemia instabilidade genômica Reparo de cruzamento interfitas do DNA Paciente 46 BR Hipersensibilidade a agentes que danificam DNA instabilidade genômica DNAligase I CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 267 Estudos recentes sobre as consequências da capacidade reduzida de reparo do DNA em humanos demonstraram a associação de diversas doenças com essa capaci dade reduzida de reparo Tabela 52 Portanto vimos anteriormente que defeitos em um gene humano cujo produto normalmente atua no reparo de pares de bases mal pa reados resultantes de erros na replicação do DNA podem causar uma predisposição hereditária a cânceres de cólon e alguns outros órgãos devido a uma taxa aumentada de mutações Em outra doença humana o xeroderma pigmentoso XP os indivíduos afe tados apresentam uma sensibilidade extrema à radiação ultravioleta pois são incapazes de reparar determinados fotoprodutos no DNA Esse defeito no reparo resulta em um aumento na taxa de mutação o que provoca graves lesões na pele e uma suscetibilidade aumentada ao câncer de pele Finalmente mutações nos genes Brca1 e Brca2 compro metem um tipo de reparo de DNA conhecido como recombinação homóloga e são a cau sa do câncer hereditário de mama e ovário Sem o reparo do DNA as lesões espontâneas rapidamente modificariam as sequências de DNA Embora o DNA seja um material bastante estável como exigido para o armazenamen to da informação genética ele é uma molécula orgânica complexa suscetível a altera ções espontâneas mesmo nas condições normais da célula que resultariam em muta ções caso não fossem corrigidas Figura 537 e ver Tabela 53 Por exemplo o DNA de TABELA 53 Lesões endógenas no DNA que surgem e são corrigidas em uma célula mamífera diploide em 24 horas Lesão no DNA Número de reparos em 24 h Hidrólise Depurinação 18000 Depirimidinação 600 Desaminação da citosina 100 Desaminação da 5metilcitosina 10 Oxidação 8oxo guanosina 1500 Pirimidinas com anel saturado timidinaglicol hidratos de citosina 2000 Produtos da peroxidação de lipídeos M1G etenoA etenoC 1000 Metilação não enzimática pela Sadenosilmetionina 7metilguanina 6000 3metiladenina 1200 Metilação não enzimática por poliaminas nitrosadas e peptídeos O 6metilguanina 20100 As lesões do DNA listadas na tabela são o resultado das reações químicas normais que ocorrem nas células As células expostas a agentes químicos externos e à radiação sofrem lesões no DNA em um número maior e de muitas outras formas De T Lindahl e DE Barnes Cold Spring Harb Symp Quant Biol 65127133 2000 Figura 537 Resumo das alterações espontâneas que necessitam de reparo do DNA Os sítios de cada nucleotídeo modificados por lesões oxidativas espon tâneas setas em vermelho ataque hidro lítico setas em azul e metilação setas em verde são mostrados a largura da seta indica a frequência relativa de cada evento ver Tabela 53 De T Lindahl Nature 362709715 1993 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd N N N N H2N H O CH G O CH2 O P O O O N N O C O CH2 O P O O O NH2 N N O T O CH2 O P O O O H H H H H O CH3 N N N N A O CH2 O P O O O NH2 CH 268 PARTE II Mecanismos genéticos básicos cada célula humana perde cerca de 18 mil purinas adenina e guanina todos os dias em função da hidrólise das ligações Nglicosil à desoxirribose uma reação espontânea denominada depurinação Similarmente uma desaminação espontânea da citosina para uracila no DNA ocorre a uma proporção de aproximadamente 100 bases por célula por dia Figura 538 As bases do DNA também são danificadas ocasionalmente por metabólitos reativos produzidos na célula incluindo as formas reativas do oxigênio e o doador de alta energia Sadenosilmetionina ou pela exposição a produtos químicos no ambiente Da mesma forma a radiação ultravioleta do sol pode produzir uma ligação covalente entre duas pirimidinas adjacentes no DNA formando por exemplo díme ros de timina Figura 539 Caso não fossem corrigidas quando o DNA foi replicado grande parte dessas alterações resultaria na deleção de um ou de mais pares de bases ou na substituição de um par de bases na cadeiafilha de DNA Figura 540 As muta ções seriam propagadas em todas as gerações celulares subsequentes Uma proporção tão alta de alterações aleatórias na sequência de DNA fatalmente teria consequências desastrosas A duplahélice de DNA é corrigida imediatamente A estrutura de duplahélice do DNA é perfeitamente adequada para o reparo pois pos sui duas cópias separadas de toda a informação genética uma em cada fita Portan to quando uma das fitas é danificada a fita complementar possui uma cópia intacta da mesma informação sendo normalmente usada para restaurar a sequência nucleotídica correta na fita danificada Uma indicação da importância de uma hélice de fita dupla para o armazenamento seguro da informação genética é que todas as células a utilizam apenas uns poucos vírus utilizam uma fita simples de DNA ou de RNA como material genético Os tipos de proces sos de reparo descritos nesta seção não atuam nesses ácidos nucleicos e uma vez dani ficados a chance de ocorrer uma alteração nucleotídica permanente nesses genomas de fita simples é muito alta Parece que apenas organismos com genomas muito pequenos e portanto alvos mínimos para lesões no DNA podem codificar sua informação gené tica em uma outra molécula que não uma duplahélice de DNA GUANINA O O CH2 P O O O N N N N H N H H H O GUANINA O O CH2 P O O O N N N N H N H H H O Fita de DNA Fita de DNA H OH H2O Açúcarfosfato após depurinação CITOSINA URACILA N N N H H H H O O O CH2 P O O O O N N H H H O O O CH2 P O O O H2O NH3 DESAMINAÇÃO DEPURINAÇÃO Figura 538 Depurinação e desaminação Essas reações são duas das reações químicas espontâneas mais frequentes que produzem sérias lesões no DNA da célula A depurinação pode remover a guanina como mostrado e a adenina do DNA O principal tipo de reação de desaminação con verte a citosina a uma base alterada a uracila ilustrada aqui mas a desaminação também pode ocorrer em outras bases Essas reações ocorrem na duplahélice de DNA por conveniência apenas uma fita é mostrada CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 269 Uma lesão no DNA pode ser removida por mais de uma via As células possuem múltiplas vias para o reparo do DNA usando diferentes enzimas que atuam em diferentes tipos de lesões A Figura 541 apresenta duas das vias mais co muns Em ambas a lesão é removida a sequência de DNA original é restaurada por uma DNApolimerase que utiliza a fita não danificada como molde e a quebra resultante na duplahélice é ligada pela DNAligase ver Figura 512 As duas vias diferem na maneira pela qual a lesão é removida do DNA A primeira via denominada reparo por excisão de bases envolve uma bateria de enzimas deno minadas DNAglicosilases cada uma capaz de reconhecer um tipo específico de base alterada no DNA e de catalisar sua remoção hidrolítica Existem pelo menos seis tipos dessas enzimas incluindo as que removem Cs desaminados As desaminados diferen tes tipos de bases alquiladas ou oxidadas bases com anéis rompidos e bases nas quais a ligação dupla carbonocarbono foi acidentalmente convertida em uma ligação simples entre os carbonos Como a base alterada é detectada no contexto da duplahélice Uma etapachave é a projeção do nucleotídeo alterado para fora da hélice em um processo mediado por enzimas que permite que a DNAglicosilase procure uma lesão em todas as faces da base Figura 542 Acreditase que essas enzimas deslocamse pelo DNA usando a projeção das bases para avaliar a situação de cada par de bases Uma vez reco nhecida a lesão a enzima remove a base do açúcar A lacuna criada pela ação da DNAglicosilase é reconhecida por uma enzima chamada endonuclease AP AP para apúrica ou apirimídica e endo para indicar que a nuclease cliva dentro da cadeia polinucleotídica que cliva a cadeia principal fosfodi éster depois do qual a lacuna resultante é corrigida ver Figura 541A A depurinação o tipo de lesão mais frequente sofrido pelo DNA também gera uma desoxirribose sem uma base As depurinações são diretamente corrigidas começando pela AP nuclease seguida pela metade inferior da via mostrada na Figura 541A A segunda principal via de reparo é chamada de reparo por excisão de nucleo tídeos Esse mecanismo pode corrigir uma lesão causada por praticamente qualquer alteração volumosa na estrutura da duplahélice de DNA Essas lesões volumosas in Figura 539 Tipo mais comum de dímero de timina Esse tipo de lesão ocorre no DNA de células expostas à radiação ultravioleta como a luz do sol Um dímero seme lhante também pode ser formado entre duas bases pirimídicas quaisquer C ou T presen tes no DNA H O O CH3 C C N N O O CH3 P C C N O O CH3 C C N N C C H O O CH3 C C N N C C O O O O C C C C N H H H H H H P P P PP PP P P P P P T A T A U A A T Um G foi trocado por um A REPLICAÇÃO DO DNA REPLICAÇÃO DO DNA C desaminado Fita nova Fita nova Fita original Fita original A Um par de nucleotídeos AT foi removido Mutado Não alterada A depurinado Fita nova Fita nova Fita original Fita original B Mutado Não alterada T A T A C G T A T A C G T T A T A C G A T T A T A C G A T T A T A U G A T Figura 540 Como as modificações químicas dos nucleotídeos produzem mutações A A desaminação da citosina se não for corrigida resulta na substituição de uma base por outra na replicação do DNA Como mostrado na Figura 538 a desaminação da citosina produz uracila A uracila dife re da citosina nas propriedades de pareamento e forma par de base preferencialmente com a adenina A maquinaria de replicação do DNA portanto irá adicionar uma adenina quando encontrar uma uracila na fitamolde B A depurinação pode resultar na perda de um par de nucleotídeos Quando a maquinaria da replicação encontra uma purina ausente na fitamolde ela pode passar para o próximo nucleotídeo completo como ilustrado aqui produzindo uma deleção nucleotídica na fita recémsintetizada Muitos outros tipos de lesões no DNA ver Figura 537 se não forem corrigidos pro duzem mutações no momento da replicação do DNA CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 271 O acoplamento do reparo por excisão de nucleotídeos à transcrição garante que o DNA mais importante da célula seja corrigido de maneira eficiente Todo o DNA celular é constantemente monitorado para verificação de lesões e os me canismos de reparo descritos aqui atuam em todas as partes do genoma Contudo as células têm uma maneira de direcionar o reparo às sequências de DNA em que ele é mais urgentemente necessário Isso ocorre pelo acoplamento da RNApolimerase a enzima que transcreve DNA em RNA na primeira etapa da expressão gênica à via de reparo por excisão de nucleotídeos Como discutido anteriormente esse sistema de reparo pode corrigir vários tipos diferentes de lesões no DNA A RNApolimerase para nas lesões de DNA e por meio de proteínas acopladoras direciona a maquinaria de reparo a esses sí tios Nas bactérias onde os genes são relativamente pequenos a RNApolimerase parada pode ser dissociada do DNA o reparo no DNA ocorre e o gene é transcrito novamente a partir do início Nos eucariotos onde os genes podem ser imensos uma reação mais complexa é usada para dar suporte à RNApolimerase reparar a lesão e reiniciar a po limerase A relevância do acoplamento de transcrição ao reparo por excisão é demonstrado em indivíduos com síndrome de Cockayne que é causada por um defeito no acopla mento Esses indivíduos apresentam retardo de crescimento anormalidades esquelé ticas retardo neural progressivo e uma grave sensibilidade à luz solar A maioria desses problemas parece surgir das moléculas de RNApolimerase que ficaram permanente mente estacionárias nos sítios de lesões no DNA onde se localizam genes importantes A química das bases do DNA facilita a detecção das lesões A duplahélice de DNA parece ter sido construída para o reparo Como visto anterior mente ela contém uma cópia extra de toda informação genética Igualmente importan te a natureza das bases do DNA também facilita a diferenciação entre bases normais e danificadas Por exemplo todo evento de desaminação possível no DNA produz uma base não natural que pode ser prontamente reconhecida e removida por uma DNA glicosilase específica A hipoxantina por exemplo é a purina mais simples capaz de pareamento específico com C porém a hipoxantina é o produto de desaminação de A Figura 543A A adição de um segundo grupo amino à hipoxantina produz G que não pode ser formada a partir de A por desaminação espontânea e cujo produto de desa minação xantina também é único Como discutido no Capítulo 6 acreditase que o RNA em termos evolutivos tenha sido o material genético anterior ao DNA e parece provável que o código genético tenha sido inicialmente formado pelos quatro nucleotídeos A C G e U Isso suscita a questão de por que o U no RNA foi substituído no DNA por T que é 5metiluracila Vimos que a desaminação espontânea de C o converte em U e que esse evento gera um produto relativamente inofensivo para a uracila DNAglicosilase Porém se o DNA contivesse U Figura 542 Reconhecimento de um nucleotídeo incomum no DNA pela torção da base A família de enzimas DNAglicosilases reconhece bases ina propriadas específicas na conformação mostrada Cada uma dessas enzimas cliva a ligação glicosídica que une uma base de terminada amarelo à cadeia principal de açúcarfosfato removendoa do DNA A Modelo de varetas B modelo de preenchimento espacial A B 272 PARTE II Mecanismos genéticos básicos O N N N N H H H N N N N H H O O N N N N H H O H N N N O H H H H N H H N O N O H H H BASES NATURAIS DO DNA BASES NÃO NATURAIS DO DNA NÃO HÁ DESAMINAÇÃO NH3 NH3 NH3 Adenina N N N N H H N H H Guanina Xantina Citosina Uracila N N N O H H H N O N O H H H2O H2O H2O H2O NH3 5metilcitosina Timina N O N O H H3C H3C H3C H Timina Hipoxantina A B Figura 543 Desaminação dos nucleotídeos do DNA Em cada caso o átomo de oxigênio adicionado a essa reação com a água é mostrado em vermelho A Os produtos da desaminação espontânea de A e G são reconhecidos como incomuns no DNA sendo prontamente reconhecidos e corrigidos A desaminação de C para U também foi ilustrada na Figura 538 T não possui um grupo amino para ser removido B Cerca de 3 dos nucleotídeos C no DNA de vertebrados são metilados para auxiliar no controle da expressão gênica discutida no Capítulo 7 Quando esses nucleotídeos 5metil C são acidentalmente desaminados eles formam o nucleotídeo natural T Porém esse T forma par com um G na fita oposta produzindo um pareamento incorreto CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 273 como base natural o sistema de reparo seria incapaz de distinguir um C desaminado de uma base U de ocorrência natural Uma situação especial ocorre no DNA de vertebrados em que determinados nucleotídeos C são metilados em sequências CG específicas e associadas a genes inativos discutidos no Capítulo 7 A desaminação acidental desses nucleotídeos C metilados produz o nucleotídeo natural T Figura 543B em um pareamento in correto com um G na fita de DNA oposta Para auxiliar no reparo de nucleotídeos C desaminados uma DNAglicosilase especial reconhece o par de bases pareado de forma incorreta envolvendo T na sequência TG e o remove Contudo esse mecanis mo de reparo de DNA é relativamente ineficiente pois os nucleotídeos C metilados são sítios muito comuns de mutação no DNA de vertebrados É interessante observar que apesar de apenas cerca de 3 dos nucleotídeos C serem metilados no DNA de humanos as mutações nesses nucleotídeos metilados respondem por cerca de um terço das mutações de ponto envolvendo uma única base observadas nas doenças hereditárias humanas DNApolimerases translesão especiais são usadas em emergências Se o DNA celular estiver extremamente danificado os mecanismos de reparo discutidos anteriormente em geral não serão suficientes para corrigilo Nesses casos uma estraté gia diferente que implica risco à célula é utilizada As DNApolimerases replicativas al tamente precisas param quando encontram um DNA danificado e em emergências as células empregam polimerases de reserva versáteis porém menos precisas conhecidas como polimerases translesão para replicar durante a lesão do DNA As células humanas possuem sete polimerases translesão algumas das quais capazes de reconhecer um tipo específico de lesão no DNA e adicionar corretamente o nucleotídeo necessário para restaurar a sequência inicial Outras fazem boas adi vinhações especialmente quando a base do molde foi muito danificada Essas enzi mas não são tão precisas como as polimerases replicativas normais quando copiam uma sequência normal de DNA Por exemplo as polimerases translesão não possuem atividade de correção de leitura e são muito menos criteriosas do que as polimerases replicativas na escolha do nucleotídeo a ser inicialmente incorporado Possivelmente por essa razão essas polimerases translesão são capazes de adicionar apenas um ou uns poucos nucleotídeos antes que a polimerase replicativa de alta precisão continue a síntese de DNA Apesar de sua utilidade em permitir a replicação de DNA muito danificado es sas polimerases translesão impõem riscos à celula como mencionado anteriormente Elas são provavelmente responsáveis pela maioria das mutações de substituição de ba ses e deleção de um único nucleotídeo que se acumulam nos genomas Embora geral mente produzam mutações quando o DNA danificado é copiado ver Figura 540 elas provavelmente também originem mutações em menor nível no DNA não danifica do Obviamente é importante que essas polimerases sejam fortemente reguladas pela célula sendo liberadas somente nos sítios da lesão no DNA Como isso ocorre exata mente para cada polimerase translesão ainda precisa ser elucidado porém um modelo conceitual é apresentado na Figura 544 O princípio desse modelo se aplica a vários processos de reparo de DNA discutidos neste capítulo como as enzimas que realizam essas reações são potencialmente perigosas para o genoma elas devem ser recrutadas somente nos sítios danificados Quebras na fita dupla são corrigidas de maneira eficiente Um tipo de lesão no DNA potencialmente perigosa ocorre quando as duas fitas da du plahélice são quebradas não havendo uma fita molde intacta para o reparo As quebras desse tipo são causadas por radiação ionizante erros na replicação agentes oxidantes e alguns outros metabólitos produzidos pela célula Se essas lesões não forem corrigi 276 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Como será discutido em detalhes no Capítulo 17 a progressão ordenada do ciclo celular é suspensa se uma lesão no DNA for detectada e reinicia somente após sua correção Dessa forma nas células de mamíferos a presença de DNA danificado pode bloquear a progressão da fase G1 para a fase S retardar a fase S uma vez que já tenha sido iniciada e bloquear a transição da fase G2 para a fase M Esses atrasos auxiliam o reparo do DNA fornecendo o tempo necessário para que a correção seja completada As lesões no DNA também resultam em um aumento da síntese de algumas en zimas de reparo do DNA Essa resposta depende de proteínas de sinalização especiais que percebem as lesões no DNA e aumentam as enzimas de reparo adequadas A im portância desse mecanismo é revelada pelo fenótipo de indivíduos que nasceram com defeitos nos genes que codificam a proteína ATM Esses indivíduos possuem a doença ataxiatelangiectasia AT cujos sintomas incluem neurodegeneração predisposição ao câncer e instabilidade genômica A proteína ATM é uma cinase volumosa envolvida na geração de sinais intracelulares que soam o alarme em resposta a diversos tipos de le sões espontâneas no DNA ver Figura 1762 e indivíduos com defeitos nessa proteína sofrem os efeitos das lesões não corrigidas no seu DNA Resumo A informação genética só pode ser armazenada de modo estável nas sequências de DNA devido a um grande grupo de enzimas de reparo do DNA que continuamente verificam o DNA e substituem qualquer nucleotídeo danificado A maioria dos tipos de reparo do DNA depende da presença de uma cópia separada da informação genética em cada uma das duas fitas da duplahélice de DNA Portanto uma lesão acidental em uma fita pode ser re movida por uma enzima de reparo e a fita correta é ressintetizada tendo como referência a informação contida na fita não danificada A maior parte das lesões nas bases de DNA é removida por uma das duas principais vias de reparo No reparo por excisão de bases a base alterada é removida pela enzima DNAglicosilase seguida pela excisão do açúcarfosfato resultante No reparo por excisão de nucleotídeos uma pequena porção da fita de DNA que flanqueia a lesão é removida da duplahélice como um oligonucleotídeo Em ambos os casos o intervalo deixado na hélice de DNA é preenchido pela ação sequencial de DNApolimerase e DNAligase utilizando a fita de DNA não danificada como molde Alguns tipos de lesões no DNA podem ser re parados por uma estratégia diferente a reversão química direta da lesão realizada por proteínas de reparo especializadas Quando o dano no DNA é muito grave uma classe especial de DNApolimerases não precisas chamadas de polimerases translesão é empre gada para passar sobre a lesão permitindo que a célula sobreviva mas algumas vezes produz mutações permanentes nos locais da lesão Outros sistemas críticos de reparo com base nos mecanismos de ligação de extre midades não homólogas e recombinação homóloga unem quebras acidentais nas duas fitas que ocorrem na hélice de DNA Na maioria das células um nível elevado de lesões no DNA provoca um retardo no ciclo celular que assegura que o DNA danificado seja corrigi do antes de ocorrer a divisão celular RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA Nas duas seções anteriores abordamos os mecanismos que permitem que as sequências de DNA das células sejam mantidas de geração a geração com pouquíssimas alterações Nesta seção iremos explorar em detalhes um dos mecanismos de reparo de DNA um grupo diverso de reações conhecidas como recombinação homóloga Uma característi ca fundamental da recombinação homóloga também chamada recombinação geral é uma troca de fitas do DNA entre um par de sequências de DNA de duplex homólo gos isto é segmentos de duplahélice com sequências nucleotídicas semelhantes ou idênticas Essa troca permite que um segmento do duplex de DNA atue como um molde para recuperar uma informação perdida ou danificada em um outro segmento de um duplex de DNA Como o molde para o reparo não está limitado à fita complementar da fita que contém a lesão a recombinação homóloga pode corrigir inúmeros tipos de le sões no DNA Por exemplo ela é a principal via para restaurar com precisão as quebras de fitadupla como mencionamos na seção anterior ver Figura 545B As quebras de CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 277 fita dupla resultam de radiação ou compostos químicos reativos na maioria das vezes no entanto são causadas por forquilhas de replicação estacionárias ou quebradas sem nenhuma relação com qualquer causa externa A recombinação homóloga corrige com precisão esses acidentes e como eles ocorrem em quase todos os ciclos de replicação do DNA esse mecanismo de reparo é essencial para todas as células em proliferação A re combinação homóloga é talvez o mecanismo de reparo do DNA mais versátil disponível na célula a natureza universal do reparo por recombinação provavelmente explica por que esses mecanismos e as proteínas que o realizam foram conservados em praticamen te todas as células na Terra Além disso veremos que a recombinação homóloga tem uma função especial em organismos com reprodução sexuada Durante a meiose ela catalisa uma etapachave na produção dos gametas espermatozoide e óvulo a troca ordenada de porções de informações genética entre os cromossomos homólogos materno e paterno criando novas combinações de sequências de DNA nos cromossomos que serão transmitidos à progênie A recombinação homóloga possui características comuns em todas as células O entendimento atual da recombinação homóloga como um mecanismo crítico no repa ro do DNA em todas as células evoluiu lentamente desde sua descoberta original como componentechave no processo especializado da meiose de plantas e animais O reco nhecimento subsequente de que a recombinação homóloga também ocorre em orga nismos unicelulares tornoua muito mais receptiva à análise molecular Assim muito do que se sabe sobre a bioquímica da recombinação genética foi originalmente derivado de estudos realizados em bactérias especialmente E coli e seus vírus bem como de experi mentos em eucariotos simples como as leveduras No caso desses organismos com tem pos de geração curtos e genomas relativamente pequenos foi possível isolar um grande número de mutantes com defeitos nos processos de recombinação A proteína alterada em cada mutante foi identificada e sua bioquímica foi estudada Os parentes próximos dessas proteínas foram encontrados em eucariotos mais complexos como moscas ca mundongos e em humanos e mais recentemente foi possível analisar de forma direta a recombinação homóloga também nestas espécies Esses estudos revelaram que os pro cessos fundamentais que promovem a recombinação homóloga são comuns a todas as células A recombinação homóloga é dirigida pelas interações de pareamento de bases do DNA O princípio da recombinação homóloga é que ela ocorre apenas entre dois duplex de DNA com extensas regiões de sequências similares homologia Não é de surpreender portanto que o pareamento de bases seja responsável por esse requerimento e os dois duplex de DNA que sofrem a recombinação homóloga testam suas sequências com a do outro pelo extensivo pareamento de bases entre a fita simples de uma hélice de DNA e a fita simples complementar da outra O pareamento não precisa ser perfeito mas deve ser muito próximo para que ocorra a recombinação homóloga Na sua forma mais simples esse tipo de interação de pareamento de bases pode ser mimetizado em tubo de ensaio permitindose que uma duplahélice de DNA possa ser formada novamente a partir de suas fitas simples Esse processo chamado de renaturação do DNA ou hibridização ocorre quando uma colisão rara e ao acaso justapõe sequências de nucleotídeos complementares em duas fitas simples comple mentares possibilitando a formação de um pequeno segmento de duplahélice entre eles Essa etapa de nucleação da hélice relativamente lenta é seguida por uma etapa rápida de pareamento como o fechamento de um zíper à medida que a região de fita dupla é estendida para maximizar o número de interações de pareamento entre as bases Figura 547 A hibridização pode produzir uma região de duplahélice de DNA formada por fitas originárias de duas moléculas de DNA diferentes desde que sejam complementa 278 PARTE II Mecanismos genéticos básicos res ou quase complementares Como veremos em breve a formação de uma molécula híbrida conhecida como heteroduplex é uma característica essencial da recombinação homóloga A hibridização do DNA e a formação de heteroduplex é também a base de diversos métodos usados para estudar as células como será apresentado no Capítulo 8 Em uma célula viva o DNA está quase todo na forma estável de duplahélice e a reação representada na Figura 547 raramente ocorre in vivo Pelo contrário como vere mos a recombinação homóloga ocorre por um conjunto de reações extremamente con troladas que permite que dois duplex de DNA possam experimentar as sequências um do outro sem se dissociarem por completo em fitas simples A recombinação homóloga pode reparar corretamente as quebras na fita dupla de DNA Na seção anterior vimos que a ligação de extremidades não homólogas ocorre na ausên cia de um molde e normalmente produz uma mutação no sítio em que a quebra da fita dupla foi corrigida Em contraste a recombinação homóloga pode corrigir quebras de fita dupla com precisão sem qualquer perda ou alteração de nucleotídeos no local do re paro Para que a recombinação homóloga faça esse trabalho o DNA com a quebra deve ser aproximado de um DNA homólogo sem quebras que servirá de molde para o reparo Por isso a recombinação homóloga ocorre normalmente logo após a replicação onde as duas moléculasfilhas de DNA estão bem próximas e uma pode atuar como molde para a correção da outra Como veremos o próprio processo de replicação do DNA traz um risco especial de acidentes que exigem esse tipo de reparo A via mais simples de reparo de quebras de fitas duplas pela recombinação ho móloga é mostrado na Figura 548 Essencialmente o duplex de DNA quebrado e o duplexmolde realizam uma dança das fitas de modo que uma das fitas danificadas utiliza uma fita complementar do duplex intacto para o reparo Primeiro as extremi dades do DNA danificado são removidas ou recortadas por nucleases especializa das produzindo uma extremidade de fita simples 3 A próxima etapa é a troca de fitas também chamada de invasão de fitas em que uma das extremidades 3 da molécula de DNA quebrada abre caminho até o duplexmolde e busca a sequência homóloga pelo pareamento de bases Essa reação impressionante é descrita em detalhes na pró xima seção Uma vez estabelecido o pareamento entre as bases que completa a etapa de troca de fitas uma DNApolimerase com alta precisão alonga a fita invasora usando a informação fornecida pela moléculamolde não danificada corrigindo o DNA dani ficado As últimas etapas deslocamento da fita síntese adicional do reparo e ligação regeneram as duas hélices duplas de DNA originais e completam o processo de reparo A recombinação homóloga é semelhante a outras reações de reparo do DNA no sentido que a DNApolimerase utiliza um molde de pristina para restaurar o DNA danificado Contudo em vez de utilizar a fita parceira complementar como molde como na maioria das vias de reparo a recombinação homóloga utiliza uma fita complementar em um duplex de DNA separado A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B C D E A B D E C A B D E C Interações de não pareamento Interações de pareamento NUCLEAÇÃO DA HÉLICE PAREAMENTO RÁPIDO Figura 547 Hibridização do DNA As duplashélices de DNA podem se re fazer a partir das fitas separadas em uma reação que depende da colisão aleatória entre duas fitas complementares A maio ria dessas colisões não é produtiva como mostrado à esquerda mas algumas pou cas resultam em uma pequena região em que os pares de bases complementares são formados nucleação da hélice Um rápido pareamento leva então à formação de uma duplahélice completa Pelo processo de tentativa e erro uma fita de DNA encontra sua parceira comple mentar mesmo entre milhões de fitas não complementares 280 PARTE II Mecanismos genéticos básicos A RecA hidrolisa ATP e as etapas supracitadas necessitam que cada monômero de RecA no filamento esteja ligado ao ATP A busca pelo pareamento por si só não exi ge a hidrólise do ATP pelo contrário o processo ocorre pela simples colisão molecular permitindo a avaliação rápida de muitas sequências Entretanto uma vez completada a reação de troca de fitas a hidrólise de ATP é necessária para desmontar a RecA do com plexo com as moléculas de DNA Nesse estágio o reparo pelas DNApolimerase e DNA ligase completam o processo de reparo como ilustrado na Figura 548 A recombinação homóloga pode resgatar forquilhas de replicação com DNA danificado Embora corrija com precisão as quebras de fita dupla que podem ser causadas por radiação ou reações químicas uma função crucial da recombinação homóloga talvez sua atribuição mais importante seja o resgate de forquilhas de replicação de DNA es tacionárias ou quebradas Diversos tipos de eventos podem provocar a quebra da for quilha de replicação mas aqui iremos considerar apenas um exemplo uma quebra de fita simples ou uma lacuna na hélice parental de DNA logo à frente de uma forquilha de replicação Quando a forquilha encontra essa lesão ela se quebra resultando em um cromossomofilho intacto e um quebrado A forquilha quebrada pode ser corrigi da sem falhas Figura 550 pelo mesmo mecanismo básico da recombinação homó loga discutido anteriormente para o reparo de quebra na fita dupla Com pequenas modificações o conjunto de reações representadas nas Figuras 548 e 550 conhe cidas coletivamente como recombinação homóloga pode corrigir diversos tipos de danos no DNA As células controlam cuidadosamente o uso da recombinação homóloga no reparo do DNA Embora a recombinação homóloga resolva o problema de reparo de quebras na fita dupla com precisão além de outros tipos de danos no DNA ela apresenta alguns pro blemas à célula pois às vezes ela corrige a lesão usando um segmento errado do ge noma como molde Por exemplo algumas vezes um cromossomo humano quebrado é reparado usando um homólogo do outro progenitor em vez da cromátideirmã como molde Como os cromossomos materno e paterno diferem em várias posições na sequência de DNA esse tipo de reparo converte a sequência do DNA corrigido da sequência materna à sequência paterna e viceversa O resultado desse tipo de recom binação errôneo é conhecido como perda de heterozigosidase e pode produzir con Figura 549 Invasão de fitas catalisada pela proteína RecA O que sabemos so bre essa reação é baseado em parte pelas estruturas da RecA ligada a fitas simples e a fitas duplas de DNA determinadas por difração de raios X Essas estruturas de DNA mostradas sem a proteína RecA estão na parte esquerda do diagrama Iniciando pela parte superior a RecA com ATPligado associase à fita simples de DNA mantendoa na forma estendida de forma que grupos de três bases são se parados entre si por uma cadeia principal distendida e torcida Na próxima etapa a fita simples ligada à RecA ligase ao du plex de DNA e o desestabiliza permitindo que a fita simples teste a sequência pelo pareamento dos grupos de três bases por vez Se não há pareamento a fita simples de DNA ligada à RecA dissociase rapida mente e começa uma nova busca Caso um pareamento extenso seja encontrado a estrutura é desmontada pela hidrólise do ATP resultando na dissociação da proteína RecA e na troca de uma fita simples de DNA por outra formando um heterodu plex Código PDB 3CMX Proteína RecA ATP ADP Pi Heteroduplex de DNA na forma ligada à RecA DNA de fita simples na foma ligada à RecA Duplex de DNA Heteroduplex de DNA CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 285 do chamado de controle de entrecruzamento assegura uma distribuição mais ou menos equilibrada de pontos de entrecruzamento nos cromossomos Ele também garante que cada cromossomo não importando seu tamanho sofra pelo menos um entrecruza mento a cada meiose Em muitos organismos ocorrem cerca de dois entrecruzamentos por cromossomo durante cada meiose um em cada braço No Capítulo 17 discutiremos em detalhes a importância mecânica desses entrecruzamentos na segregação correta dos cromossomos durante a meiose No evento de recombinação meiótica resolvido tanto como entrecruzamento como não entrecruzamento a maquinaria de recombinação sempre deixa uma região de heteroduplex em que uma fita com a sequência de DNA do homólogo paterno forma par de bases com uma sequência do homólogo materno Figura 558 Essas regiões de heteroduplex podem suportar uma pequena porcentagem de pares de bases incorretos e devido à migração da ramificação normalmente se estendem por milhares de pares de nucleotídeos Os diversos eventos de não entrecruzamento que ocorrem na meiose portanto produzem sítios dispersos pequenas sequências de DNA de um homólogo que foram inseridas no outro homólogo nas células germinativas As regiões de heterodu plex marcam sítios potenciais para a conversão gênica onde os quatro cromossomos haploides produzidos pela meiose contêm três cópias de uma sequência de DNA de um homólogo e apenas uma cópia dessa sequência do outro homólogo ver Figura 553 como explicado a seguir A recombinação homóloga normalmente resulta em conversão gênica Em organismos de reprodução sexuada uma lei fundamental da genética é exceto pelo DNA mitocondrial que é herdado apenas por herança materna cada genitor dá uma contribuição genética igual para sua progênie Um conjunto completo de genes nuclea Figura 557 Movimento da ramifica ção catalisado por enzimas na junção de Holliday por migração da ramifica ção Na E coli um tetrâmero da proteína RuvA verde e dois hexâmeros da proteína RuvB amarelo ligamse à estrutura aberta da junção A proteína RuvB que se asse melha às helicases hexaméricas usadas na replicação do DNA Figura 514 utiliza a energia da hidrólise do ATP para expelir DNA rapidamente pela junção de Holliday estendendo a região de heteroduplex como mostrado A proteína RuvA coorde na esse movimento enrolando as fitas de DNA para evitar o emaranhamento Códi gos PDB 1IXR 1C7Y DNA MOVESE PARA DENTRO DNA MOVESE PARA DENTRO DNA MOVESE PARA FORA DNA MOVESE PARA FORA RuvB RuvA RuvB Sítio de entrecruzamento Sítio de conversão gênica Heteroduplex Heteroduplex Figura 558 Heteroduplex formados durante a meiose O heteroduplex de DNA está presente nos sítios de recombinação que foram resolvidos tanto como entrecruzamentos como não entrecruzamentos Como as se quências de DNA dos cromossomos materno e paterno diferem em várias posições os heteroduplex geralmente contêm um pequeno número de pareamentos incorretos 286 PARTE II Mecanismos genéticos básicos res é herdado do pai e um outro conjunto completo é herdado da mãe Por trás dessa lei está a divisão precisa dos cromossomos nas células germinativas óvulos e espermato zoide que ocorre durante a meiose Portanto quando uma célula diploide de um proge nitor sofre meiose e produz quatro células germinativas haploides exatamente metade dos genes distribuídos entre essas quatro células devem ser de origem materna genes herdados da mãe desse progenitor e a outra metade de origem paterna genes herdados do pai do mesmo progenitor Em alguns organismos p ex fungos é possível recupe rar e analisar todos os quatro gametas haploides produzidos por uma única célula pela meiose Os estudos nesses organismos revelaram casos raros nos quais a divisão dos ge nes violou as regraspadrão da genética Ocasionalmente por exemplo a meiose produz três cópias da versão materna do gene e apenas uma cópia do alelo paterno Versões alternativas do mesmo gene são chamadas de alelos e a divergência da sua distribui ção esperada durante a meiose é conhecida como conversão gênica Estudos genéticos mostram que somente pequenas porções de DNA sofrem conversão gênica e em muitos casos apenas uma parte de um gene é alterada Várias vias na célula podem produzir a conversão gênica mas uma das mais im portantes resulta de uma consequência particular da recombinação durante a meiose Vimos que tanto os entrecruzamentos como os não entrecruzamentos produzem re giões de heteroduplex de DNA Caso as duas fitas que formam a região de heterodu plex não possuam sequências nucleotídicas idênticas há a formação de pareamentos incorretos que normalmente são corrigidos pelo sistema de reparo de pareamento in correto ver Figura 519 Contudo o sistema de reparo não é capaz de diferenciar as fitas materna e paterna e escolhe aleatoriamente a fita que será usada como molde para o reparo Como consequência um alelo será perdido e o outro duplicado Figura 559 resultando na conversão de um alelo em outro Assim a conversão gênica original mente vista como um desvio misterioso das regras da genética pode ser vista como uma consequência direta dos mecanismos de recombinação homóloga Resumo A recombinação homóloga descreve um conjunto flexível de reações que resulta na troca de sequências de DNA entre um par de duplex de DNA idênticos ou quase idênticos Em todas as células esse processo é essencial para o reparo correto e sem erros de cromossomos da nificados especialmente quebras de fita dupla e forquilhas de replicação quebradas ou es tacionárias A recombinação homóloga também é responsável pelo entrecruzamento dos cromossomos que ocorre durante a meiose Ela ocorre de diversas maneiras mas sempre possuem em comum uma etapa de troca de fitas em que uma fita simples de um duplex de DNA invade um segundo duplex e forma pares de bases com uma fita e desloca a outra Essa reação catalisada pela família de proteínas de RecARad51 apenas pode ocorrer se a fita invasora formar um pequeno segmento de pares de nucleotídeos consecutivos com uma das fitas do duplex Essa exigência assegura que a recombinação homóloga aconteça apenas entre sequências de DNA idênticas ou muito semelhantes Quando utilizada como um mecanismo de reparo a recombinação homóloga ocor re entre uma molécula de DNA danificada e sua cromátideirmã recémduplicada na qual a duplex não danificada serve como molde para corrigir a cópia danificada de modo preciso Na meiose a recombinação homóloga é iniciada pela quebra deliberada e cuida dosamente controlada das fitas duplas e ocorre preferencialmente entre dois cromossomos Figura 559 Conversão gênica provocada pelo reparo de pareamento incorreto Nesse processo o heteroduplex de DNA é formado nos sítios de recombinação homóloga entre os cromossomos materno e paterno Se as sequências materna e paterna forem le vemente diferentes a região de heteroduplex incluirá alguns pareamentos incorretos que podem ser corrigidos pela maquinaria de reparo de pareamentos incorretos ver Figura 519 Tal reparo pode apagar sequências de nucleotídeos tanto na fita materna como na paterna A consequência desse reparo de pareamento incorreto é a conversão gênica detectada como um desvio da segregação de cópias iguais dos alelos maternos e pater nos que normalmente ocorre na meiose A heteroduplex produzida durante a meiose cobre o sítio no gene X onde os alelos vermelho e azul diferem O REPARO DE PAREAMENTO INCORRETO REMOVE UM SEGMENTO DA FITA AZUL A SÍNTESE DE DNA PREENCHE O INTERVALO CRIANDO UMA CÓPIA EXTRA DE ALELO VERMELHO DO GENE X Gene X CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 287 homólogos em vez de entre as cromátidesirmãs recémsintetizadas O resultado pode ser dois cromossomos que foram entrecruzados ie cromossomos em que o DNA em ambos os lados do sítio do pareamento de DNA produziram dois homólogos diferentes ou dois cromossomos não entrecruzados No último caso os dois cromossomos resultantes são idênticos aos homólogos originais exceto por mínimas alterações na sequência de DNA no sítio de recombinação TRANSPOSIÇÃO E RECOMBINAÇÃO SÍTIOESPECÍFICA CONSERVATIVA Vimos que a recombinação homóloga pode resultar na troca de sequências de DNA en tre cromossomos Porém a ordem dos genes nos cromossomos envolvidos permanece basicamente a mesma após a recombinação homóloga tanto que as sequências recom binantes devem ser muito semelhantes para que o processo ocorra Nesta seção descre vemos dois tipos diferentes de recombinação a transposição também chamada de recombinação transposicional e a recombinação sítioespecífica conservativa que não necessitam de uma grande homologia entre as regiões de DNA Esses dois tipos de reações de recombinação podem alterar a ordem dos genes ao longo de um cromossomo e provocar tipos não comuns de mutações que introduzem blocos inteiros de sequên cias de DNA no genoma A transposição e a recombinação sítioespecífica conservativa são especialmente responsáveis pelo deslocamento de uma variedade de segmentos especializados de DNA denominados coletivamente elementos genéticos móveis de uma posição a outra em um genoma Veremos que os elementos genéticos móveis podem variar em tamanho de algumas poucas centenas até dezenas de milhares de pares de nucleotídeos e cada um geralmente carrega um conjunto determinado de genes Com frequência um dos genes codifica uma enzima especializada que catalisa o deslocamento apenas desse elemento possibilitando esse tipo de recombinação Praticamente todas as células contêm elementos genéticos móveis conhecidos informalmente como genes saltadores Como explicado no Capítulo 4 na escala evo lutiva esses elementos tiveram um efeito profundo na formação dos genomas modernos Por exemplo quase metade do genoma humano pode ser associada a esses elementos ver Figura 462 Com o passar do tempo suas sequências nucleotídicas foram alteradas por mutações aleatórias de modo que apenas algumas poucas das muitas cópias desses elementos no nosso DNA ainda estão ativas e são capazes de mobilidade O restante são fósseis moleculares cuja existência fornece indicações impressionantes sobre nossa his tória evolutiva Os elementos genéticos móveis geralmente são considerados parasitas molecula res também são chamados de DNA egoísta que persistem porque as células não po dem livrarse deles eles quase chegaram a ultrapassar nosso próprio genoma Contudo os elementos genéticos móveis podem proporcionar benefícios à célula Por exemplo os genes que eles transportam algumas vezes podem ser vantajosos como no caso de resistência a antibióticos nas células bacterianas discutido a seguir O deslocamento dos elementos genéticos móveis também produz muitas das variantes genéticas necessárias à evolução pois além de se deslocarem provocam rearranjos ocasionais nas sequências adjacentes no genoma do hospedeiro Assim mutações espontâneas observadas na Drosophila em humanos e em outros organismos normalmente ocorrem devido aos elementos genéticos móveis Muitas dessas mutações serão prejudiciais ao organismo porém algumas serão vantajosas e podem disseminarse pela população É quase certo que muito da variedade observada no mundo originalmente surgiu do deslocamento dos elementos genéticos móveis Nesta seção introduzimos os elementos genéticos móveis e discutimos os meca nismos que permitem seu movimento no genoma Veremos mais adiante que alguns desses elementos se movem por mecanismos de transposição e outros por recombina ção sítioespecífica conservativa Iniciaremos com transposição uma vez que conhece mos muito mais exemplos desse tipo de movimento 288 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Pela transposição os elementos genéticos móveis podem se inserir em qualquer sequência de DNA Os elementos que se movem por transposição são chamados transpósons ou elemen tos transponíveis Na transposição uma enzima específica normalmente codificada pelo próprio transpóson e chamada de transposase atua em uma sequência específica de DNA presente em cada extremidade do transpóson causando sua inserção em um novo sítioalvo de DNA A maioria dos transpósons é pouco seletiva na escolha dos sí tiosalvo e portanto pode se inserir em diversos locais em um genoma Em particular não há uma exigência para similaridade de sequência entre as extremidades do elemen to e a sequênciaalvo A maior parte dos transpósons movese muito raramente Em bac térias em que é possível medir a frequência com precisão os transpósons geralmente movemse uma vez a cada 10 5 divisões celulares Movimentos muito frequentes prova velmente destruiriam o genoma da célula hospedeira Com base em sua estrutura e em seu mecanismo de transposição os transpósons podem ser divididos em três grandes classes transpósons exclusivamente de DNA retro transpósons semelhantes a vírus e retrotranspósons não retrovirais As diferenças entre eles são resumidas brevemente na Tabela 54 e cada classe será discutida de cada vez Transpósons exclusivamente de DNA podem se mover por um mecanismo de corte e colagem Os transpósons exclusivamente de DNA chamados assim porque existem apenas como DNA durante seu movimento são predominantes em bactérias e são os principais responsáveis pela disseminação da resistência de cepas bacterianas aos antibióticos Quando antibióticos como a penicilina e a estreptomicina tornaramse inicialmente dis poníveis na década de 1950 a maior parte das bactérias causadoras de doenças huma nas era suscetível a eles Agora a situação é diferente os antibióticos como a penicilina e seus derivados modernos não são mais eficazes contra diversas cepas bacterianas modernas incluindo as causadoras de gonorreia e de pneumonia bacteriana A dissemi TABELA 54 As três principais classes de elementos transponíveis Descrição da classe e estrutura Enzimas especializadas necessárias ao movimento Modo de movimento Exemplos Transpósons exclusivamente de DNA Repetições invertidas curtas em cada extremidade Transposase Movese como DNA por meio de corte e colagem ou por vias replicativas Elemento P Drosophila AcDs milho Tn3 e Tn10 E coli Tam3 bocadeleão Retrotranspósons semelhantes a retrovírus Repetições terminais longas LTRs long terminal repeats e diretas em cada extremidade Transcriptase reversa e integrase Movese através de um intermediário de RNA cuja produção é dirigida por um promotor na LTR Copia DrosophilaTy1 leveduras THE1 humanos Bs1 milho Retrotranspósons não retrovirais AAAA TTTT PoliA na extremidade 3 do transcrito de RNA a extremidade 5 normalmente é truncada Transcriptase reversa e endonuclease Movese através de um intermediário de RNA normalmente sintetizado por um promotor adjacente Elemento F Drosophila L1 humanos Cin4 milho Esses elementos variam de mil a aproximadamente 12 mil pares de nucleotídeos de comprimento Cada família contém diversos membros apenas alguns sendo listados aqui Alguns vírus podem se mover também para dentro e para fora dos cromossomos da célula hospedeira por mecanismos de transposição Esses vírus estão relacionados às duas primeiras classes de transpósons 290 PARTE II Mecanismos genéticos básicos de vertebrados catalisando os rearranjos de DNA que produzem a diversidade de anti corpos e receptores de células T Esse processo conhecido como recombinação VDJ será discutido no Capítulo 24 A recombinação VDJ é encontrada apenas em vertebra dos sendo uma novidade evolutiva relativamente recente mas que parece ter derivado a partir dos transpósons de corte e colagem muito mais antigos Alguns vírus utilizam o mecanismo de transposição para moveremse para dentro dos cromossomos das células hospedeiras Certos vírus são considerados elementos genéticos móveis porque utilizam o mecanis mo de transposição para integrar o seu genoma no genoma da célula hospedeira Porém ao contrário dos transpósons esses vírus codificam proteínas que acondicionam sua in formação genética em partículas virais capazes de infectar outras células Muitos dos vírus que se inserem no cromossomo hospedeiro utilizam um dos dois primeiros meca nismos listados na Tabela 54 ou seja ou atuam como um transpóson de DNA ou como retrotranspósons semelhantes a retrovírus Na verdade muito do conhecimento desses mecanismos foi elucidado a partir do estudo de determinados vírus que empregam tais mecanismos A transposição tem uma função importante no ciclo vital de diversos vírus Espe cialmente notáveis são os retrovírus que incluem o vírus humano da Aids o HIV Fora da célula um retrovírus existe como um genoma de RNA de fita simples empacotado em uma capa proteica o capsídeo com a enzima transcriptase reversa codificada pelo vírus Durante o processo de infecção o RNA viral penetra a célula sendo convertido em uma molécula de DNA de fita dupla pela ação dessa enzima essencial capaz de polime rizar o DNA usando RNA ou DNA como molde Figura 562 O termo retrovírus refere se à capacidade desses vírus de reverter o fluxo normal da informação genética que é do DNA para o RNA ver Figura 14 Capsídeo Envelope RNA Transcriptase reversa ENTRADA NA CÉLULA E PERDA DO ENVELOPE RNA RNA DNA DNA DNA A TRANSCRIPTASE REVERSA PRODUZ UMA DUPLAHÉLICE DE DNARNA E DEPOIS DE DNADNA INTEGRAÇÃO DA CÓPIA DE DNA NO CROMOSSOMO HOSPEDEIRO DNA integrado TRANSCRIÇÃO Múltiplas cópias do RNA TRADUÇÃO Proteínas do capsídeo Proteínas do envelope Transcriptase reversa FORMAÇÃO DE MÚLTIPLAS PARTÍCULAS VIRAIS INFECCIOSAS NOVAS Figura 562 O ciclo vital de um retrovírus O genoma do retrovírus consiste em uma molécula de RNA em azul normalmente com 7 mil a 12 mil nucleotí deos de comprimento Ela é empacotada em um capsídeo proteico que por sua vez é envolvido por um envelope lipídico contendo as proteínas virais codifi cadas pelo vírus em verde Dentro da célula infectada a enzima transcriptase reversa círculo vermelho primeiramente produz uma cópia do DNA da molécula de RNA viral e depois uma segunda fita de DNA produzindo uma cópia de DNA de fita dupla do genoma de RNA A integração dessa duplahélice de DNA no cromossomo da célula hospedeira é catalisada por uma enzima integrase codificada pelo vírus Essa integração é essencial para a síntese de novas moléculas de RNA viral pela RNApolimerase celular a enzima que transcreve o DNA em RNA discutido no Capítulo 6 292 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Diferentes elementos transponíveis predominam em diferentes organismos Vários tipos de elementos transponíveis foram descritos 1 transpósons de DNA cuja mobilidade tem como base reações de clivagem e ligação de DNA 2 retrotranspósons semelhantes a retrovírus que também se movem por meio de clivagem e ligação de DNA mas tendo o RNA com funçãochave atuando como molde para originar o subs trato para a recombinação do DNA e 3 retrotranspósons não retrovirais nos quais uma cópia de RNA do elemento é fundamental para sua incorporação no DNAalvo atuando como um molde direto para o evento de transcrição reversa dirigido pelo DNAalvo Curiosamente tipos diferentes de transpósons predominam em diferentes or ganismos A grande maioria de transpósons bacterianos por exemplo é do tipo DNA estando presentes uns poucos relacionados aos retrotranspósons não virais Em leve duras os principais elementos móveis são os retrotranspósons semelhantes a retroví rus Na Drosophila são encontrados transpósons de DNA retrovirais e não retrovirais Finalmente o genoma humano contém os três tipos de transpósons entretanto como apresentado a seguir suas histórias evolutivas são bastante diferentes As sequências genômicas revelam o número aproximado de vezes que os elementos transponíveis foram movidos A sequência nucleotídica do genoma humano nos fornece um precioso registro fóssil da atividade dos transpósons na escala evolutiva A comparação cuidadosa da sequência nucleotídica de aproximadamente 3 milhões de elementos transponíveis remanescentes presentes no genoma humano possibilitou a reconstrução aproximada dos movimentos dos transpósons no genoma de nossos ancestrais durante centenas de milhares de anos Por exemplo os transpósons de DNA parecem ter sido ativos muito antes da divergência entre humanos e macacos do Velho Mundo de 25 a 35 milhões de anos atrás mas como foram gradualmente acumulando mutações que os inativaram eles têm estado dormen tes na linhagem humana desde então Da mesma forma apesar de o nosso genoma estar repleto de vestígios de retrotranspósons semelhantes a retrovírus nenhum parece estar atualmente ativo Uma única família de retrotranspósons semelhantes a retrovírus parece ter sofrido transposição no genoma humano desde a divergência entre humanos e chim panzés há aproximadamente 6 milhões de anos Os retrotranspósons não retrovirais tam bém são bastante antigos mas ao contrário dos outros tipos alguns ainda estão em movi mento no nosso genoma como mencionado anteriormente Por exemplo estimase que o movimento de novo de um elemento Alu ocorra uma vez a cada 100 a 200 nascimentos humanos O movimento de retrotranspósons não retrovirais é responsável por uma pe quena proporção de novas mutações humanas talvez duas mutações em cada mil A situação em camundongos é muito diferente Apesar de os genomas de camun dongos e humanos conterem aproximadamente a mesma densidade dos três tipos de transpósons ambos os tipos de retrotranspósons ainda estão em transposição ativa no genoma de camundongos sendo responsáveis por cerca de 10 das novas mutações Embora estejamos apenas começando a compreender como o movimento dos transpósons contribuiu para a formação dos genomas dos mamíferos atuais foi pro posto que grandes incrementos da atividade de transposição poderiam ser responsáveis pelos eventos decisivos da especiação durante a radiação das linhagens de mamíferos a partir de um ancestral comum um processo que teve início há aproximadamente 170 milhões de anos Nesse ponto podemos apenas imaginar quantas das características ex clusivamente humanas resultaram da atividade dos muitos elementos genéticos móveis cujos resquícios são hoje encontrados espalhados nos nossos cromossomos A recombinação sítioespecífica conservativa pode rearranjar o DNA de modo reversível Um tipo diferente de mecanismo de recombinação conhecido como recombinação sí tioespecífica conservativa reorganiza outros tipos de elementos de DNA móveis Nes CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 293 sa via a clivagem e a ligação ocorrem em dois sítios específicos um em cada molécula de DNA participante do evento Dependendo da posição e da orientação dos dois sítios de recombinação pode ocorrer integração excisão ou inversão do DNA Figura 564 A recombinação sítioespecífica conservativa é realizada por enzimas especializadas que clivam e religam as duas hélices de DNA em sequências específicas em cada mo lécula O mesmo sistema de enzimas que liga as duas moléculas também pode separá las regenerando com precisão a sequência das duas moléculas originais de DNA ver Figura 564A A recombinação sítioespecífica conservativa é geralmente utilizada por vírus de DNA para moverem inserir e remover seus genomas do genoma das células hospe deiras Quando integrados no genoma do hospedeiro o DNA viral é replicado com o DNA do hospedeiro e é fielmente transmitido a todas as células descendentes Se a célula hospedeira sofre uma lesão p ex radiação UV o vírus pode reverter a reação de recom binação sítioespecífica remover seu genoma e acomodálo dentro de uma partícula vi ral Assim muitos vírus podem ser replicados passivamente como um componente do genoma do hospedeiro porém podem abandonar o navio quando este está afundando pela excisão do seu genoma e empacotandoo em uma capa protetora até que uma nova célula hospedeira sadia seja encontrada Diversas características diferenciam a recombinação sítioespecífica conservativa da transposição Primeiro a recombinação sítioespecífica conservativa requer sequên cias de DNA especializadas no DNA doador e no receptor daí o termo sítioespecífica Essas sequências possuem sítios de reconhecimento para a recombinase específica que catalisa o rearranjo Em contraste a transposição necessita apenas que o transpóson possua uma sequência especializada para a maioria dos transpósons o DNA receptor pode ter qualquer sequência Segundo os mecanismos da reação são fundamentalmen te diferentes As recombinases que catalisam a recombinação sítioespecífica conserva tiva assemelhamse às topoisomerases no sentido de formarem ligações covalentes de alta energia transitórias com o DNA e utilizarem essa energia para completar o rearranjo de DNA ver Figura 521 Dessa forma todas as ligações de fosfato clivadas durante o evento de recombinação são regeneradas após o término daí o termo conservativa Em contraste a transposição não ocorre através de um intermediário proteínaDNA unidos covalentemente e esse processo produz lacunas no DNA que devem ser reparadas pelas DNApolimerases INTEGRAÇÃO EXCISÃO INVERSÃO A A B B Y X X Y A A B B B A A B Figura 564 Dois tipos de rearranjos no DNA produzidos por recombinação sítioespecífica conserva tiva A única diferença entre as reações em A e B é a orientação relativa dos dois sítios de DNA indicados por setas em que ocorreu o evento de recombinação sítioespecífica A Por meio da reação de integração uma molécula de DNA circular é incorporada em uma segunda molécula de DNA pela ação reversa excisão ela pode ser liberada e regenerar o DNA circular original Diversos vírus bacterianos movemse para dentro e para fora do cromossomo hospedeiro exatamente assim B A recombinação sítioespecífica conservativa também pode inverter um segmento específico de DNA no cromossomo Um exemplo bem estudado de inversão de DNA por essa recombinação ocorre na bactéria Salmonella typhimurium principal agente envolvido na intoxica ção alimentar dos humanos como descrito na próxima seção a inversão de um segmento de DNA altera o tipo de flagelo produzido pela bactéria 294 PARTE II Mecanismos genéticos básicos A recombinação sítioespecífica conservativa pode ser utilizada para ativar ou inativar genes Muitas bactérias utilizam a recombinação sítioespecífica conservativa para contro lar a expressão de determinados genes Um exemplo bem estudado ocorre na bactéria Salmonella sendo conhecido como variação de fase A alteração na expressão gênica resulta da inversão ocasional de um segmento de DNA específico de mil pares de nu cleotídeos realizada por uma recombinase sítioespecífica conservativa codificada no genoma da Salmonella Isso altera a expressão da proteína de superfície celular flagelina para a qual a bactéria possui dois genes diferentes Figura 565 A inversão do DNA altera a orientação de um promotor uma sequência de DNA que promove a transcrição de um gene localizado dentro do segmento invertido Com o promotor em uma orien tação as bactérias sintetizam um tipo de flagelina com o promotor na outra orientação elas sintetizam o outro tipo A reação de recombinação é reversível permitindo que as populações de bactérias alternem entre os dois tipos de flagelina Como as inversões ra ramente ocorrem e como essas alterações no genoma serão copiadas precisamente du rante todos os ciclos de replicação subsequentes clones inteiros de bactérias terão um dos dois tipos de flagelina A variação de fase ajuda a proteger a população bacteriana contra a resposta imu ne do seu hospedeiro vertebrado Se o hospedeiro produz anticorpos contra um tipo de flagelina algumas poucas bactérias cuja flagelina foi alterada pela inversão gênica ainda serão capazes de sobreviver e de se multiplicar Recombinases sítioespecíficas conservativas bacterianas tornaramse valiosas ferramentas para a biologia celular e de desenvolvimento Assim como vários mecanismos usados por células e vírus a recombinação sítioespe cífica tem sido utilizada para estudar uma grande variedade de questões Para decifrar a função de determinados genes e proteínas em organismos multicelulares complexos técnicas de engenharia genética são usadas para produzir vermes moscas e camundon gos contendo genes que codificam uma enzima sítioespecífica além de um DNAalvo criteriosamente produzido com os sítios de DNA reconhecidos por essa enzima No mo mento apropriado o gene que codifica a enzima pode ser ativado para rearranjar a se quência do DNAalvo Esse rearranjo é muito utilizado para remover um gene específico em um tecido determinado de um organismo multicelular Figura 566 Essas técnicas são especialmente úteis quando o gene de interesse possui função importante nos está Figura 565 Controlando a expressão gênica por inversão de DNA em bac térias A alternância da transcrição de dois genes de flagelina em uma bactéria Salmonella é causada por um evento de recombinação sítioespecífica que inverte um pequeno segmento de DNA contendo um promotor A Em uma orientação o promotor ativa a transcrição do gene da flagelina H2 assim como a proteína repressora que bloqueia a expressão do gene da flagelina H1 Promotores e repres sores são descritos em detalhes no Capí tulo 7 aqui vemos simplesmente que um promotor é necessário para a expressão de um gene em uma proteína e que um repressor bloqueia essa ação B Quando o promotor é invertido ele não mais ativa H2 ou o repressor e o gene H1 que é liberado da repressão é expresso em seu lugar A reação de inversão requer sequên cias específicas de DNA vermelho e uma enzima recombinase que é codificada pelo segmento inversível de DNA Esse meca nismo de recombinação sítioespecífica é ativado apenas raramente cerca de uma vez a cada 10 5 divisões celulares Portan to a produção de uma flagelina ou outra tende a ser fielmente herdada em cada clone de células ATIVADO ATIVADO Proteína H2 Proteína repressora RNA ATIVADO RECOMBINAÇÃO SÍTIOESPECÍFICA CONSERVATIVA Segmento inversível Promotor H2 Repressor Promotor H1 INATIVADO Repressor bloqueia a síntese de H1 ATIVADO Proteína H1 RNA Promotor H2 Repressor Promotor H1 ATIVADO INATIVADO INATIVADO Segmento inversível A B CAPÍTULO 5 Replicação reparo e recombinação do DNA 295 gios iniciais do desenvolvimento de vários tecidos e sua remoção completa da linhagem germinativa causaria a morte precoce durante o desenvolvimento A mesma estratégia pode ser empregada para expressar de forma inadequada qualquer gene específico no tecido de interesse aqui a remoção provoca a junção de um promotor transcricional forte ao gene de interesse Com essas técnicas é possível em princípio determinar a influência de qualquer proteína em qualquer tecido de um animal intacto Resumo Os genomas de praticamente todos os organismos contêm elementos genéticos móveis que são capazes de se mover de uma posição do genoma para outra por um processo de re combinação tanto sítioespecífica transposicional como conservativa Na maior parte dos casos esse movimento é aleatório e ocorre em uma frequência muito baixa Os elementos genéticos móveis incluem os transpósons que podem movimentarse apenas dentro de uma única célula e suas descendentes e os vírus cujos genomas podem ser integrados ao genoma das suas células hospedeiras Existem três classes de transpósons os transpósons de DNA os retrotranspósons se melhantes a retrovírus e os retrotranspósons não retrovirais Todas exceto a última são relacionadas aos vírus Embora os vírus e os elementos móveis possam ser vistos como pa rasitas muitos dos novos arranjos nas sequências de DNA produzidos pelos seus eventos de recombinação sítioespecífica foram decisivos na criação da variação genética essencial para a evolução das células e organismos Gene de interesse Gene de interesse Gene da recombinase Cre GENE INATIVADO GENE ATIVADO Promotor tecidoespecífico p ex o promotor ativo apenas no fígado Sítio LoxP EM OUTROS TECIDOS O GENE DE INTERESSE É EXPRESSO NORMALMENTE EM UM TECIDO ESPECÍFICO p ex o fígado Sítio LoxP Sítio LoxP Sítio LoxP mRNA mRNA Proteína de interesse Recombinase Cre produzida apenas nas células hepáticas Gene de interesse removido do cromossomo e perdido na divisão das células hepáticas Gene da recombinase Cre Figura 566 Como uma enzima de recombinação sítioespecífica conservativa bacteriana é utilizada para remover genes específicos de determinados tecidos de camundongos Essa técnica requer a inserção de duas moléculas de DNA especialmente modificadas na linhagem germinativa do animal A primeira contém o gene para recombinase neste caso a recombinase Cre do bacteriófago P1 controlada por um promotor tecidoespecí fico que assegura que a recombinase será expressa apenas naquele tecido A segunda molécula de DNA contém o gene de interesse flanqueado pelos sítios de reconhecimento para a recombinase neste caso os sítios LoxP O camundongo é modificado de modo que essa seja a única cópia desse gene Portanto se a recombinase for ex pressa apenas no fígado o gene de interesse será ausente nesse e somente nesse tecido A reação que remove o gene é a mesma mostrada na Figura 564A Como descrito no Capítulo 7 diversos promotores tecidoespecíficos são conhecidos além disso muitos desses promotores são ativados apenas em determinados períodos do desen volvimento Assim é possível estudar o efeito da remoção de genes específicos em períodos diferentes do desen volvimento de cada tecido O QUE NÃO SABEMOS Como a replicação do DNA com pete com todos os outros proces sos que ocorrem simultaneamente nos cromossomos incluindo repa ro de DNA e transcrição gênica Qual o fundamento para a baixa frequência de erros na replica ção do DNA observada em todas as células Isso é o melhor que as células conseguem em função da velocidade de replicação e dos limites da difusão molecular A taxa de mutação foi selecionada durante a evolução para gerar a variação genética As células possuem basicamente apenas uma maneira de replicar seu DNA porém diversas manei ras para corrigilo Existirão outras maneiras diferentes de reparo de DNA ainda não descobertas Será que os inúmeros transpósons mortos no genoma humano fornecem algum benefício aos se res humanos 296 PARTE II Mecanismos genéticos básicos TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 51 As diferentes células no seu corpo raramente têm ge nomas com sequência nucleotídica idêntica 52 Na E coli onde a forquilha de replicação avança 500 pares de nucleotídeos por segundo o DNA à frente da forquilha na ausência das topoisomerases teria sofrido uma rotação de quase 3 mil revoluções por minuto 53 Na bolha de replicação a mesma fita parental de DNA atua como fitamolde para a síntese de fitalíder em uma for quilha de replicação e como molde para a fita retardada na outra forquilha 54 Quando forquilhas de replicação bidirecionais oriun das de origens adjacentes se encontram uma fitalíder sem pre encontra uma fita retardada 55 Todos os mecanismos de reparo do DNA dependem da existência de duas cópias da informação genética uma em cada um dos cromossomos homólogos Discuta as questões a seguir 56 Para determinar a reprodutibilidade de medidas da frequência de mutações você faz o seguinte experimento você inocula cada uma de 10 culturas com uma única bac téria E coli permite que a cultura cresça até que contenha 10 6 células e então verifica o número de células que contêm a mutação no gene de interesse em cada cultura Você fica tão surpreso com os resultados iniciais que repete os expe rimentos para confirmálos Ambos os grupos de resultados apresentam grande variabilidade como mostrado na Tabela Q51 Assumindo que a taxa de mutação é constante como você explica essa grande variação nas frequências de células mutantes em culturas diferentes TABELA Q51 Frequências de células mutantes em múltiplas culturas Experimento Cultura células mutantes10 6células 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 4 0 257 1 2 32 0 0 2 1 2 128 0 1 4 0 0 66 5 0 2 57 As enzimas de reparo do DNA corrigem preferencial mente bases pareadas de modo incorreto na fita de DNA recémsintetizada utilizando a fita original como molde Se os pareamentos incorretos fossem corrigidos sem levar em conta qual fita atua como molde o reparo de pareamento incorreto reduziria os erros da replicação Um sistema de re paro desse tipo resultaria em menos mutações mais muta ções ou no mesmo número de mutações que apresentariam sem nenhum tipo de reparo Justifique sua resposta 58 Discuta a seguinte afirmativa A primase é uma enzi ma descuidada que comete muitos erros Os iniciadores de RNA que ela produz são mais tarde substituídos por DNA sintetizado por uma polimerase com uma fidelidade mais alta Isso é um desperdício Seria mais energeticamente efi ciente se uma DNApolimerase produzisse uma cópia mais correta já no início do processo 59 Se a DNApolimerase requer um iniciador perfeita mente pareado para adicionar o próximo nucleotídeo como um nucleotídeo pareado incorretamente escapa desse requerimento e tornase um substrato para as enzimas de re paro de pareamento incorreto 510 O laboratório no qual você trabalha está pesquisan do o ciclo vital de um vírus animal com genoma de DNA de fita dupla circular Seu projeto é definir a localização das origemns de replicação e determinar se a replicação ocorre em ambas as direções a partir da origem replicação unidi recional ou bidirecional Para alcançar o objetivo você lisa as células infectadas com o vírus isola os genomas virais em replicação trata com enzimas de restrição que clivam o ge noma em um único sítio e examina as moléculas resultan tes em um microscópio eletrônico Algumas das moléculas observadas estão ilustradas esquematicamente na Figura Q51 Observe que é impossível distinguir a orientação de uma molécula de DNA em relação à outra ao microscópio eletrônico Você deve apresentar suas conclusões ao resto do pes soal do laboratório amanhã Como você responderá às duas questões solicitadas Há uma única origem de replicação ou são várias A replicação é unidirecional ou bidirecional Figura Q51 Formas parentais e replicantes de um vírus animal Molécula original Bolhas Formas H 511 Você está investigando a síntese de DNA em célu las de cultura de tecido usando 3Htimidina para marcar radioativamente as forquilhas de replicação As células são lisadas de modo a permitir que algumas fitas de DNA se estendam para fora e longas cadeias de DNA intactas possam ser isoladas e examinadas Você cobre o DNA com uma emulsão fotográfica e expõe por 3 a 6 meses em um processo conhecido como autorradiografia Como a emul são é sensível à emissão radioativa o DNA marcado com 3H aparece como rastros de grãos prateados A extensão pro voca o colapso das bolhas de replicação de modo que os duplexfilhos ficam dispostos lado a lado e não podem ser distinguidos entre si 298 PARTE II Mecanismos genéticos básicos REFERÊNCIAS Gerais Brown TA 2007 Genomes 3 New York Garland Science Friedberg 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Tmem187 Mir3202 Irak1 Conservação Íntron Cromossomo X humano 155 milhões de pares de nucleotídeos 5 do genoma Tamanho total desta seção 125 milhão de pares de nucleotídeos Éxon Região intergênica Diferença não sinônima na sequência Neanderthal MicroRNA ou snoRNA Fenótipo de doença causada por alterações no gene indicado Conservação entre as espécies alinhamento de 100 genomas de vertebrados 100 0 LEGENDA DNA 100 0 Adrenoleucodistrofia CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 301 Os problemas que as células enfrentam na decodificação dos genomas podem ser avaliados ao se considerar uma porção bastante pequena do genoma humano Figura 62 A região ilustrada representa menos de 12000 do nosso genoma e inclui pelo me nos 48 genes que codificam proteínas e seis genes para moléculas de RNA não codifica dor Quando consideramos todo o genoma humano só podemos maravilharnos com a capacidade das nossas células em lidar com tamanha presteza e precisão com essa enorme quantidade de informação Neste capítulo explicaremos como as células decodificam e usam a informação contida em seus genomas Veremos que muito foi descoberto sobre como as instruções genéticas escritas em um alfabeto de apenas quatro letras os quatro diferentes nu cleotídeos do DNA determinam a formação de uma bactéria uma moscadasfrutas ou um ser humano No entanto se ainda temos muito a descobrir sobre como a informação armazenada no genoma de um organismo é capaz de produzir mesmo a mais simples bactéria unicelular a qual contém 500 genes o que não dizer do desenvolvimento de um ser humano com aproximadamente 30 mil genes Ainda desconhecemos uma enorme quantidade de informações portanto muitos desafios fascinantes aguardam as próximas gerações de biólogos celulares DO DNA AO RNA A transcrição e a tradução são os meios pelos quais as células leem ou expressam as instruções genéticas de seus genes Como muitas cópias idênticas de RNA podem ser produzidas a partir do mesmo gene e como cada molécula de RNA pode promover a síntese de várias moléculas idênticas de proteína as células podem quando necessário sintetizar uma grande quantidade de proteína a partir de um simples gene No entanto genes podem ser transcritos e traduzidos em taxas diferentes permitindo que a célula sintetize enormes quantidades de certas proteínas e mínimas quantidades de outras Fi Figura 62 Representação esquemática de uma pequena porção do cromossomo X humano Como resumido na legenda os genes codificadores de proteínas conhecidos começando no Abcd1 e terminando no F8 são mostrados em cinza escuro com as regiões codificadoras éxons indicadas por barras que se estendem acima e abaixo da linha central RNAs não codificadores com funções conhecidas são indicados por losangos roxos Triângulos amarelos indicam as posições dentro das regiões codificadoras de proteínas onde as sequências do genoma Neanderthal codificam um aminoácido diferente daquele encontrado no genoma humano O trecho de triângulos amarelos no gene Tktl1 parece ter sido positivamente selecionado des de a divergência entre Homo sapiens e neandertais cerca de 200 mil anos atrás Observe que a maioria das proteínas é idêntica entre nós e nosso parente extinto O histograma azul indica o grau de conservação de porções do genoma humano em relação a outras espécies de vertebrados É provável que genes adicionais atualmente não identificados também se encontrem nessa porção do genoma humano Os genes nos quais uma mutação provoca uma doença humana hereditária são indicados por colchetes vermelhos O gene Abcd1 codifica uma proteína que importa ácidos graxos para o peroxissomo mutações nesse gene causam desmielini zação dos nervos que pode resultar em perturbações cognitivas e distúrbios do movimento A incontinência pigmentar é uma doença que afeta a pele os cabelos as unhas os dentes e os olhos A hemofilia A é uma doença hemorrágica causada por mutações no gene do Fator VIII que codifica uma proteína da cascata de coagulação do sangue Visto que os homens têm uma única cópia do cromossomo X a maioria das condições aqui apresentadas afeta somente os homens as mulheres que herdam um desses genes defeituosos são frequentemente assintomáticas pois uma proteína funcional é produzida a partir de seu outro cromossomo X Cortesia de Alex Williams obtida da University of California Genome Browser httpgenomeucscedu Figura 63 Os genes podem ser expres sos em diferentes graus de eficiência Neste exemplo o gene A é transcrito de maneira mais eficiente do que o gene B e cada molécula de RNA que ele produz também é traduzida mais frequentemente Isso torna a quantidade da proteína A na célula muito maior do que a quantidade da proteína B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A B DNA Gene A Gene B TRANSCRIÇÃO TRADUÇÃO TRADUÇÃO TRANSCRIÇÃO RNA RNA 306 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Cada segmento de DNA transcrito é denominado unidade de transcrição Nos eu cariotos uma unidade de transcrição normalmente carrega a informação de apenas um gene e portanto codifica uma única molécula de RNA ou uma única proteína ou grupo de proteínas relacionadas se o transcrito de RNA inicial for processado de diferentes maneiras para produzir diferentes mRNAs Em bactérias um conjunto de genes adja centes é frequentemente transcrito como uma unidade e a molécula de mRNA resultante carrega dessa forma a informação para várias proteínas distintas Em geral o RNA representa uma pequena porcentagem do peso seco de uma cé lula enquanto as proteínas constituem cerca de 50 desse valor A maioria do RNA nas células é rRNA o mRNA representa somente 3 a 5 do RNA total em uma célula típica de mamíferos A população de mRNAs é composta por dezenas de milhares de diferentes ti pos existindo em média apenas 10 a 15 moléculas de cada tipo de mRNA em cada célula Sinais codificados no DNA indicam à RNApolimerase onde iniciar e onde terminar a transcrição Para transcrever um gene com precisão a RNApolimerase deve reconhecer seu início e término no genoma A maneira pela qual as RNApolimerases desempenham essa tarefa difere entre bactérias e eucariotos Como o processo em bactérias é mais simples ele será discutido primeiro A iniciação da transcrição é uma etapa extremamente importante na expressão de um gene pois esse é o ponto principal onde a célula regula quais proteínas serão pro duzidas e a frequência dessa produção A enzima central da RNApolimerase bacteriana é um complexo de múltiplas subunidades que sintetiza RNA a partir de um molde de DNA Uma subunidade adicional denominada fator sigma s associase a essa enzima e auxilia a leitura dos sinais no DNA que indicam onde iniciar a transcrição Figura 611 Em conjunto a enzimabase e o fator s são denominados holoenzima RNApolimerase esse complexo se liga fracamente ao DNA bacteriano quando colide com ele e uma holo enzima desliza rapidamente ao longo da molécula de DNA até dissociarse No entanto quando a holoenzima polimerase desliza sobre uma sequência especial de nucleotídeos que indica o ponto de início para a síntese de RNA chamada promotor a polimerase ligase fortemente pois o seu factor s faz contatos específicos com a região das bases expostas do lado externo da duplahélice do DNA etapa 1 na Figura 611A A holoenzima RNApolimerase fortemente ligada a um promotor abre a dupla hélice para expor um pequeno trecho de nucleotídeos em cada fita etapa 2 na Figura 611A A região de DNA não pareada cerca de 10 nucleotídeos é chamada de bolha de transcrição e é estabilizada pela ligação do factor s às bases não pareadas de uma das fitas expostas A outra fita de DNA exposta atua como um molde para o pareamento de bases complementares com os ribonucleotídeos dois dos quais são unidos pela polime rase para dar início a uma cadeia de RNA etapa 3 na Figura 611A Os primeiros 10 ou mais nucleotídeos de RNA são sintetizados usando um mecanismo de arraste durante o qual a RNApolimerase permanece ligada ao promotor e puxa o DNA a montante para o seu sítio ativo expandindo assim a bolha de transcrição Esse processo cria um estresse considerável e frequentemente os RNAs curtos são liberados aliviando a tensão e for çando a polimerase que permanece no mesmo lugar para reiniciar a síntese Por fim esse processo de iniciação abortiva é superado e o estresse gerado pelo arraste ajuda a enzima central a se dissociar do DNA promotor etapa 4 na Figura 611A e descartar o fator s etapa 5 na Figura 611A Nesse momento a polimerase começa a moverse sobre o DNA sintetizando o RNA de uma forma gradativa a polimerase se desloca para frente um par de bases para cada nucleotídeo adicionado Durante esse processo a bo lha de transcrição expandese continuamente na parte da frente da polimerase e contrai se na sua retaguarda O alongamento da cadeia continua a uma velocidade de cerca de 50 nucleotídeossegundo no caso de RNApolimerases bacterianas até que a enzima encontre um segundo sinal o terminador etapa 6 na figura 611A onde a polimerase para e libera tanto a molécula de RNA recémsintetizada quanto o molde de DNA etapa 7 na Figura 611A Em seguida a enzima polimerase livre se reassocia a um factor s livre para formar uma holoenzima que pode novamente dar início ao processo de transcrição etapa 8 na Figura 611A 308 PARTE II Mecanismos genéticos básicos nucleotídica consenso é derivada pela comparação de muitas sequências que apresen tam a mesma função básica e pelo alinhamento dos nucleotídeos mais comuns encon trados em cada posição Isso serve portanto como um resumo ou uma média de um grande número de sequências nucleotídicas individuais Uma maneira mais exata de ilustrar a gama de sequências de DNA reconhecidas por uma proteína é pelo uso de um logotipo da sequência que revela as frequências relativas de cada nucleotídeo em cada posição Figura 612C As diferenças entre as sequências de DNA dos promotores bacterianos indivi duais determinam a sua força ou o número de eventos de iniciação por unidade de tempo para cada promotor Os processos evolutivos sintonizaram cada promotor para iniciar com a frequência necessária e criaram assim um amplo espectro de força para os promotores Os promotores de genes que codificam as proteínas abundantes são muito mais fortes do que aqueles associados a genes que codificam proteínas ra ras e as sequências nucleotídicas dos seus promotores são as responsáveis por essas diferenças Assim como os promotores bacterianos os terminadores de transcrição tam bém apresentam um amplo espectro de sequências e o potencial de formar uma estrutura de RNA em grampo é a característica comum mais importante desses pro motores Uma vez que um número quase ilimitado de sequências nucleotídicas tem esse potencial as sequências de terminadores são muito mais heterogêneas do que as dos promotores Nós apresentamos os promotores e terminadores bacterianos e alguns de seus detalhes para ilustrar um ponto importante no que diz respeito à análise das sequências genômicas Apesar de conhecermos muito sobre promotores e terminadores bacteria nos e podermos estabelecer sequências consenso que resumem suas características mais óbvias sua identificação exata e definitiva no genoma pela análise da sequência nucleotídica é bastante dificultada devido à sua diversidade em termos de sequência de nucleotídeos É ainda mais difícil posicionar sequências análogas em genomas de eucariotos parcialmente devido ao excesso de DNA presente nesses genomas Com T T G A C A T A T A A T 1519 nucleotídeos Frequência do nucleotídeo em cada posição 50 25 0 75 100 A C Frequência 0 50 25 B 15 16 17 18 19 Espaçamento entre as sequências 35 e 10 35 10 35 10 Sequência consenso T C A GA T G T A G C T A G C C T A GT C G T C A GT G A CG A T T A C T A C C T A 0 1 2 Bits Figura 612 Sequência nucleotídica consen so e logotipo da sequência das principais classes de promotores de E coli A Com base em uma comparação de 300 promotores são dadas as frequências de cada um dos quatro nucleotídeos em cada posição no promotor A sequência consenso ilustrada abaixo do gráfi co reflete os nucleotídeos mais comuns encon trados em cada posição no conjunto de promo tores Esses promotores são caracterizados por duas sequências hexaméricas de DNA a sequên cia 35 e a sequência 10 assim denominadas por sua localização aproximada com relação ao ponto de início da transcrição designado como 1 A sequência de nucleotídeos entre os hexâ meros 35 e 10 não mostra similaridades signi ficativas entre os promotores Por conveniência é mostrada a sequência nucleotídica de um DNA de fita simples na realidade os promotores são DNA de fita dupla Os nucleotídeos mostrados na figura são reconhecidos pelo factor s uma subunidade da holoenzima RNApolimerase B Distribuição de espaçamento entre os hexâ meros 35 e 10 encontrados nos promotores de E coli C Um logotipo da sequência exibin do as mesmas informações do painel A Aqui a altura de cada letra é proporcional à frequên cia na qual a base ocorre nessa posição em uma ampla gama de sequências promotoras A altura total de todas as letras em cada posição é pro porcional ao conteúdo da informação expresso em bits nessa posição Por exemplo o conteúdo total de informação de uma posição que pode tolerar diversas bases diferentes é pequeno ver as três últimas bases das sequências 35 mas estatisticamente maior do que ao acaso 310 PARTE II Mecanismos genéticos básicos A RNApolimerase II requer um conjunto de fatores gerais de transcrição Os fatores gerais de transcrição ajudam a posicionar corretamente a RNApolimerase eucariótica sobre o promotor auxiliando a separação das duas cadeias de DNA para per mitir o início da transcrição e liberando a RNApolimerase do promotor para dar início ao seu modo de alongamento As proteínas são gerais porque elas são necessárias para praticamente todos os promotores utilizados pela RNApolimerase II Elas consistem em um conjunto de proteínas de interação denominadas arbitrariamente como TFIIA TFIIB TFIIC TFIID e assim por diante TFII significando fator de transcrição para a polimerase II do inglês transcription factor for polymerase II Em um sentido amplo os fatores gerais de transcrição eucarióticos desempenham funções equivalentes àquelas do fator s em bactérias de fato determinadas regiões de TFIIF apresentam a mesma estrutura tridimensional que as regiões equivalentes do fator s A Figura 615 ilustra como os fatores gerais de transcrição se associam aos pro motores utilizados pela RNApolimerase II e a Tabela 63 resume suas atividades O processo de associação começa quando o TFIID se liga a uma curta sequência de DNA de duplahélice principalmente composta por nucleotídeos T e A Por essa razão essa sequência é conhecida como a sequência TATA ou TATAbox e a subunidade de TFIID que a reconhece é chamada de TBP proteína de ligação a TATA do inglês TATAbinding protein A sequência TATAbox normalmente está localizada 25 nucleotídeos antes do sítio de início da transcrição Essa não é a única sequência de DNA que sinaliza o início da transcrição Figura 616 mas para a maioria dos promotores de polimerase II ela é a mais importante A ligação de TFIID provoca uma grande distorção no DNA do TATA box Figura 617 Acreditase que essa distorção sirva como um marco físico para a Figura 614 Similaridade estrutural entre uma RNApolimerase bacteriana e uma RNApolimerase II eucariótica As regiões das duas RNApolimerases que têm similaridade estrutural estão indica das em verde A polimerase eucariótica é maior do que a enzima bacteriana 12 subunidades em vez de cinco e algu mas das regiões adicionais estão ilustradas em cinza As esferas azuis representam átomos de Zn que atuam como compo nentes estruturais das polimerases e a esfera vermelha representa o átomo de Mg presente no sítio ativo onde a poli merização ocorre As RNApolimerases de todas as células atuais bactérias arque obactérias e eucariotos são intimamente relacionadas indicando que as caracterís ticas básicas da enzima existiam anterior mente à divergência dos três principais ramos da vida Cortesia de P Cramer e R Kornberg Figura 615 Iniciação da transcrição de um gene eucariótico pela RNApolimerase II Para iniciar a transcrição a RNApolimerase requer vários fatores gerais de transcrição A O promotor contém uma sequência de DNA denominada TATAbox localizada a 25 nucleotídeos do sítio no qual a transcrição é iniciada B Por meio de sua subunidade TBP o TFIID reconhece e se liga ao TATAbox o que permite a ligação adjacente de TFIIB C Para simplificar a distorção do DNA produzida pela ligação de TFIID ver Figura 617 não está ilustrada D Os demais fatores gerais de transcrição assim como a própria RNA polimerase associamse no promotor E Então o TFIIH usa a energia da hidrólise do ATP para separar a dupla fita do DNA no ponto de início da transcrição expondo localmente a fitamolde O TFIIH também fosforila a RNApolimerase II modificando sua conformação de tal modo que a polimerase se dissocia dos fatores gerais e pode iniciar a fase de extensão da transcrição Como ilustrado o sítio de fosforilação é uma longa cauda polipeptídica Cterminal também denominado domínio Cterminal CTD que se estende a partir da mo lécula de polimerase O esquema de associação mostrado nesta figura foi deduzido a partir de experimentos realizados in vitro e a ordem exata na qual os fatores gerais de transcrição se associam nos promotores in vivo provavelmente varia de acordo com o gene Os fatores gerais de transcrição são altamente conservados alguns dos fatores de células humanas podem ser substituídos em experimentos bioquímicos pelos fatores correspondentes de simples leveduras TATAbox TFIID TBP Início da transcrição TFIIB TFIIE TFIIF CTD RNApolimerase II TRANSCRIÇÃO TFIIH A B C D E UTP ATP CTP GTP RNA P P P P FATOR DE LIBERAÇÃO CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 311 localização de um promotor ativo no interior de um genoma extremamente grande e que mantenha as sequências de DNA de ambos os lados da distorção unidas para permitir as etapas subsequentes de associação das proteínas do complexo Outros fatores são então reunidos junto à RNApolimerase II para formar um complexo de iniciação da trans crição completo ver Figura 615 O mais complexo dos fatores gerais de transcrição é TFIIH Composto por nove subunidades ele é praticamente tão grande quanto a própria RNApolimerase II sendo como veremos em breve o responsável pela realização de di ferentes etapas necessárias à iniciação da transcrição Após a formação de um complexo de iniciação de transcrição sobre o DNA a RNApolimerase II deverá ter acesso à fitamolde no ponto de início da transcrição O TFIIH que contém uma DNAhelicase como uma de suas subunidades torna pos sível essa etapa com a hidrólise de ATP desespiralização do DNA e consequente expo sição da fitamolde A seguir a RNApolimerase II da mesma forma que a polimerase bacteriana se liga ao promotor sintetizando pequenos fragmentos de RNA até sofrer uma série de alterações estruturais que permitem sua dissociação ao promotor e iní cio da fase de extensão ou alongamento da transcrição Uma etapachave para essa transição é a adição de grupos fosfato à cauda da RNApolimerase conhecida como CTD ou domínio Cterminal do inglês Cterminal domain Em seres humanos o CTD consiste em 52 repetições adjacentes de uma sequência de sete aminoácidos que se estende a partir da estrutura central da RNApolimerase Durante a iniciação da trans crição a serina localizada na quinta posição da sequência repetida Ser5 é fosforila da por TFIIH que contém uma proteínacinase como uma de suas subunidades ver Figura 615D e E A polimerase pode então separarse do agrupamento de fatores TABELA 63 Os fatores gerais de transcrição necessários à iniciação da transcrição pela RNApolimerase II eucariótica Nome Número de subunidades Funções na iniciação da transcrição TFIID Subunidade TBP Subunidades TAF 1 11 Reconhece o TATAbox Reconhece outras sequências de DNA próximas ao ponto de início da transcrição regula a ligação ao DNA pela TBP TFIIB 1 Reconhece o elemento BRE nos promotores posiciona com exatidão a RNApolimerase no sítio de início da transcrição TFIIF 3 Estabiliza a interação da RNApolimerase com TBP e TFIIB auxilia a atrair TFIIE e TFIIH TFIIE 2 Atrai e regula TFIIH TFIIH 9 Desespiraliza o DNA no sítio de início da transcrição fosforila a Ser5 do CTD da RNA polimerase libera a RNApolimerase do promotor TFIID é composto por TBP e 11 subunidades adicionais denominadas TAFs fatores associados à TBP CTD domínio Cterminal Figura 616 Sequências consenso adjacentes aos pontos de iniciação da RNApolimerase II eucariótica Estão indicados o nome dado a cada sequência consenso primeira coluna e o fator geral de transcrição que a reconhece última coluna N indica qualquer nucleotídeo e dois nucleotídeos separados por uma barra indicam uma probabilidade igual de qualquer um deles ocorrer na posição in dicada Na realidade cada sequência con senso é uma representação resumida de um histograma similar ao da Figura 612 Na maioria dos pontos de iniciação da transcrição da RNApolimerase II ape nas duas ou três das quatro sequências estão presentes Por exemplo a maioria dos promotores da polimerase II tem uma sequência TATAbox e aqueles que não a possuem normalmente apresentam uma sequência INR forte Embora a maioria das sequências de DNA que influenciam o início da transcrição esteja localizada aci ma do ponto de iniciação da transcrição algumas poucas como o elemento DPE mostrado na figura estão localizadas na região transcrita GC GC GA C G C C TFIIB BRE T A T A AT A AT TBP Subunidade de TFIID TATA CT CT A N TA CT CT TFIID INR AG G AT C G T G TFIID DPE Elemento Sequência consenso Fator geral de transcrição BRE TATA INR DPE 35 30 30 Ponto de início da transcrição CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 313 da cromatina e assim facilitam a montagem da maquinaria de iniciação da transcrição sobre o DNA Como ilustrado na Figura 618 várias proteínas bem mais de uma centena de su bunidades individuais devem se associar no ponto de início da transcrição para promo ver a iniciação da transcrição em uma célula eucariótica A ordem de associação dessas proteínas não parece seguir uma rota preestabelecida de fato ela varia entre diferentes genes Na verdade alguns desses diferentes complexos proteicos podem ser transporta dos para o DNA sob a forma de subarranjos préformados Para iniciar a transcrição a RNApolimerase II deve ser liberada desse grande complexo de proteínas Além das etapas descritas na Figura 614 essa liberação mui tas vezes requer a proteólise in situ da proteína ativadora Voltaremos a algumas dessas questões incluindo o papel dos complexos de remodelagem da cromatina e das enzimas modificadoras de histonas no Capítulo 7 no qual discutiremos como as células eucarió ticas regulam o processo de iniciação da transcrição O alongamento da transcrição nos eucariotos requer proteínas acessórias Uma vez que a RNApolimerase tenha iniciado a transcrição ela movese de forma ir regular parando em algumas sequências de DNA e transcrevendo rapidamente outras As RNApolimerases em funcionamento tanto em bactérias quanto em eucariotos es tão associadas a uma série de fatores de alongamento ou fatores de extensão proteí nas que diminuem a probabilidade de dissociação da RNApolimerase antes que esta chegue ao término de um gene Esses fatores caracteristicamente associamse à RNA polimerase logo após a iniciação ter ocorrido e ajudam a polimerase a se mover sobre a ampla variedade de sequências de DNA encontradas nos genes As RNApolimerases eucarióticas também devem lidar com a estrutura da cromatina conforme elas se mo vem sobre o molde de DNA e para isso geralmente são auxiliadas por complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP que podem moverse com a polime rase ou simplesmente podem procurar e resgatar uma polimerase que eventualmente esteja paralisada Além disso as chaperonas de histonas ajudam a dissociar parcial mente os nucleossomos a frente de uma RNApolimerase em movimento e a associá los após sua passagem À medida que a RNApolimerase movese sobre um gene algumas das enzimas ligadas a ela modificam as histonas deixando para trás um registro da passagem da po limerase Embora não esteja exatamente claro como a célula usa essa informação isso Figura 618 Iniciação da transcrição pela RNApolimerase II em uma célula eucariótica O início da transcrição in vivo requer a da presença de proteínas ativadoras de transcrição Como descrito no Capítulo 7 essas proteínas se ligam a pequenas sequências específicas no DNA Embora somente uma seja aqui apresen tada um gene eucariótico típico utiliza varias proteínas ativadoras de transcrição que combinadas determinam sua taxa e seu padrão de transcrição Às vezes agindo a uma distância de vários milhares de pares de nucleotídeos indicados pela linha tracejada na molécula de DNA essas proteínas auxiliam a RNApolimerase os fatores gerais e o Mediador a associarem se no promotor Além disso ativadores atraem complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP e enzimas modificadoras de histonas Um dos prin cipais papéis do Mediador é coordenar a associação de todas essas proteínas sobre o promotor de tal forma que a transcrição possa começar Como discutido no Capí tulo 4 o estado padrão da cromatina é o de uma fibra condensada ver Figura 428 e essa é provavelmente a forma de DNA sobre a qual a maior parte da trans crição é iniciada Para simplificar a croma tina não foi ilustrada na figura INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO Proteína ativadora Estimulador sítio de ligação para a proteína ativadora LIGAÇÃO DOS FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO RNAPOLIMERASE MEDIADOR COMPLEXOS DE REMODELAGEM DE CROMATINA E ENZIMAS MODIFICADORAS DE HISTONAS TATAbox Início da transcrição Mediador Complexo de remodelagem de cromatina Enzima modificadora de histona RNApolimerase ligada a fatores gerais de transcrição 314 PARTE II Mecanismos genéticos básicos talvez possa ajudar a transcrever novamente um gene uma vez que ele tenha se tornado ativo anteriormente Talvez essa informação também seja útil para acoplar o alongamen to da transcrição ao processamento do RNA conforme este emerge da RNApolimerase um tópico que discutiremos mais adiante neste capítulo A transcrição cria tensão superhelicoidal Existe ainda outra barreira para o alongamento pelas RNApolimerases sejam elas bac terianas ou eucarióticas que também se aplica às DNApolimerases como discutido no Capítulo 5 ver Figura 520 Para descrever esse assunto em mais detalhes primei ramente devemos considerar uma propriedade sutil inerente ao DNA de duplahélice denominada supertorção do DNA A supertorção do DNA é o nome dado a uma con formação que o DNA adota em resposta à tensão superhelicoidal alternativamente a criação de alças ou dobras em uma molécula de DNA dupla hélice pode criar tal tensão A Figura 619 ilustra a razão dessa situação Existem aproximadamente 10 pares de nucleotídeos para cada giro da hélice em uma duplahélice de DNA Se imaginarmos uma hélice cujas duas extremidades estão fixas uma em relação à outra como ocorre em um DNA circular como um cromossomo bacteriano ou em alças firmemente aper tadas como se acredita estarem dispostos os cromossomos eucarióticos uma grande supertorção se formará para compensar cada 10 pares de nucleotídeos que são abertos desenrolados A formação dessa supertorção é energeticamente favorável pois res taura o enrolamento helicoidal normal das regiões que permanecem pareadas que caso contrário sofreriam uma superespiralização devido às suas extremidades fixas A tensão superhelicoidal é criada conforme a RNApolimerase se move ao longo da fita de DNA que possui extremidades fixas ver Figura 619C Considerando que a polimerase não é livre para girar rapidamente e que tal rotação é pouco provável devido ao tamanho das RNApolimerases e de seus transcritos acoplados uma polimerase em movimento gera tensão positiva da superhélice no DNA à sua frente e tensão helicoidal negativa atrás de si Para eucariotos acreditase que essa situação represente um bô nus embora a tensão superhelicoidal positiva à frente da polimerase torne a hélice de DNA mais difícil de abrir a tensão deve facilitar o desenrolamento parcial do DNA nos Figura 619 A tensão superhelicoidal no DNA causa supertorção do DNA A Para uma molécula de DNA com uma extremidade livre ou com uma quebra em uma das fitas que serve como ponto de tor ção a duplahélice de DNA gira uma volta a cada 10 pares de nucleotídeos que são abertos B Se a rotação é impedida ocorre introdução de tensão superhelicoidal no DNA quando a hélice é aberta No exemplo mostrado a hélice de DNA contém 10 voltas helicoidais uma das quais está aberta Uma forma de acomodar a tensão criada seria aumentar a torção helicoidal de 10 para 11 pares de nucleotídeos por volta na dupla hélice remanescente A hélice do DNA no entanto resiste a tal deformação como uma mola preferindo aliviar a tensão superhelicoidal pela formação de alças supertorcidas Como resultado uma super torção de DNA formase na duplahélice do DNA a cada 10 pares de nucleotídeos abertos A supertorção formada nesse caso é uma supertorção positiva C A supertor ção do DNA é induzida por uma proteína que trafega sobre a duplahélice de DNA As duas extremidades do DNA ilustradas aqui não são capazes de girar livremente uma em relação à outra e acreditase que a molécula proteica também seja impedida de rotação livre conforme se move Sob essas condições o movimento da proteína provoca um excesso de torção que se acu mula na hélice de DNA à sua frente e um déficit de torção no DNA atrás da proteína conforme ilustrado Desenrolamento de 10 pares de bases de DNA uma volta da hélice DNA com extremidade livre A hélice de DNA deve girar uma vez A B C Desenrolamento de 10 pares de bases de DNA uma volta da hélice DNA com extremidades fixas A hélice de DNA forma uma supertorção DNA Molécula de proteína SUPERTORÇÃO NEGATIVA Abertura da hélice facilitada SUPERTORÇÃO POSITIVA Abertura da hélice dificultada 326 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Os mRNAs processados de forma inadequada e outros resíduos de RNA p ex sequências intrônicas excisadas são retidos no núcleo onde eventualmente serão degradados pelo exossomo nuclear um grande complexo proteico cujo interior é rico em exonucleases de RNA 35 Figura 636 Assim as células eucarióticas exportam apenas moléculas de RNA úteis para o citoplasma enquanto fragmentos de RNA são eliminados no núcleo Entre todas as proteínas que se agregam às moléculas de prémRNA conforme elas emergem das RNApolimerases que estão transcrevendo as mais abundantes são as proteínas ribonucleares nucleares heterogêneas hnRNPs heterogeneous nuclear ri bonuclear proteins Algumas dessas proteínas existem aproximadamente 30 diferentes em humanos desenrolam as hélices em grampo no RNA de tal forma que os sinais de splicing e outros sinais no RNA podem ser lidos mais facilmente Outras empacotam pre ferencialmente o RNA contido nas sequências de íntrons extremamente longos típicos de organismos complexos ver Figura 631 e podem desempenhar um papel importante na distinção entre mRNAs maduros e restos do processamento de RNA Os mRNAs adequadamente processados são transportados através dos complexos do poro nuclear NPCs nuclear pore complexes canais aquosos da membrana nuclear os quais conectam diretamente o nucleoplasma e o citosol Figura 637 Pequenas moléculas com menos de 60 mil dáltons podem difundirse livremente através desses canais No entanto a maioria das macromoléculas celulares inclusive os mRNAs com plexados a proteínas apresenta tamanho excessivo o que as impossibilita de atravessar os canais sem o uso de processos especiais A célula usa energia para o transporte ativo dessas macromoléculas em ambos os sentidos através dos complexos do poro nuclear Como explicado em detalhes no Capítulo 12 as macromoléculas são transportadas através dos complexos do poro nuclear via receptores de transporte nuclear os quais de pendendo da identidade da macromolécula as escoltam do núcleo para o citoplasma ou viceversa Para que ocorra a exportação do mRNA um receptor de transporte nuclear es pecífico deve ser ligado ao mRNA uma etapa que em muitos organismos ocorre simulta neamente à clivagem e poliadenilação 3 Após ter ajudado a mover uma molécula de RNA através do complexo do poro nuclear o receptor de transporte se dissocia do mRNA penetra novamente no núcleo e é utilizado para exportar uma nova molécula de mRNA A exportação dos complexos mRNAproteína a partir do núcleo pode ser facilmente observada ao microscópio eletrônico para os incomumente abundantes mRNAs dos genes do Anel de Balbiani de insetos Conforme esses genes são transcritos podese observar o empacotamento do RNA recémformado mediado por proteínas como hnRNPs proteí nas SR e componentes do spliceossomo Esse complexo proteínaRNA sofre uma série de transições estruturais provavelmente refletindo eventos de processamento do RNA cul minando em uma fibra curva Figura 637 Essa fibra curva movese então através do nucleoplasma penetra o complexo do poro nuclear sendo seu quepe 5 a primeira porção a penetrar e sofre outra série de transições estruturais enquanto se move através do poro Essas e outras observações revelaram que os complexos prémRNAproteína e mRNApro Figura 636 Estrutura da região central do exossomo de RNA humano O RNA pene tra por uma extremidade do poro central e é degradado por RNAses que se associam com a outra extremidade Nove diferentes subunida des proteicas cada qual representada por uma cor diferente compõem essa grande estrutura em anel As células eucarióticas possuem tanto um exossomo nuclear quanto um exossomo citoplasmático ambas as formas incluem a porcas central do exossomo mostrado aqui e subunidades adicionais incluindo RNAses especializadas que diferenciam as duas formas O exossomo nuclear degrada RNAs aberrantes antes que eles sejam exportados para o cito sol Ele também processa certos tipos de RNA p ex os RNAs ribossômicos para produzir a sua forma final A forma citoplasmática do exossomo é responsável pela degradação de mRNAs no citosol e é portanto essencial para a determinação do tempo de vida de cada mo lécula de mRNA Código PDB 2NN6 B 200 nm NÚCLEO CITOSOL Complexo do poro nuclear Cromatina A TRANSCRIÇÃO RNA conforme emerge da RNApolimerase RNA pronto para exportação NÚCLEO CITOPLASMA Figura 637 Transporte de uma grande molécula de mRNA pelo complexo do poro nuclear A A maturação de uma molécula de mRNA conforme ela é sintetizada pela RNApolimerase e empacotada pelas diversas proteínas nucleares Esta ilustração de um RNA de inseto incomumente grande e abundante chamado mRNA do anel de Balbiani baseiase em fotomicrografias de microscopia eletrônica como as mostradas em B A adaptada de B Daneholt Cell 88585588 1997 Com permissão de Elsevier B de BJ Stevens e H Swift J Cell Biol 315577 1966 Com permissão de The Rockefeller University Press CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 331 dores são transcritos processados e ligados a proteínas para formar uma ampla gama de complexos ribonucleoproteicos O núcleo contém uma variedade de agregados subnucleares Apesar de o nucléolo ser a estrutura mais proeminente no núcleo outros corpos nucle ares foram visualizados e estudados Figura 646 Esses corpos incluem os corpos de Cajal assim nomeados em homenagem ao cientista que primeiro os descreveu em 1906 e grupos de grânulos de intercromatina também denominados speckles ou manchas Como o nucléolo essas outras estruturas nucleares não têm membranas e são altamen te dinâmicas dependendo das necessidades da célula Sua formação é provavelmente mediada pela associação de domínios proteicos de baixa complexidade como descrito no Capítulo 3 ver Figura 336 A sua aparência é o resultado da estreita associação dos componentes proteicos e RNA envolvidos na síntese associação e armazenamento das macromoléculas envolvidas na expressão gênica Os corpos de Cajal são os locais onde os snRNPs e os snoRNPs passam pelas etapas finais de maturação e onde os snRNPs são reciclados e seus RNAs são reinicializados após os rearranjos que ocorreram durante o splicing ver p 321 Em contraste foi sugerido que os grupos de grânulos de inter cromatina correspondam a acúmulos de reserva de snRNPs totalmente maduros e de outros componentes do processamento de RNA que estão prontos para ser utilizados na produção dos mRNAs Figura 645 A função do nucléolo na síntese do ribossomo e de outras ribonucleoproteínas O rRNA precur sor 45S é empacotado em uma grande partícula ribonucleoproteica contendo várias proteínas ribossômicas importadas do citoplasma Enquanto essa partícula permanece no nucléolo componentes selecionados são adicionados e outros descartados conforme ela é processada em subunidades ribossômicas imaturas maiores e menores As duas subunidades ribossômicas atingem sua forma funcional final apenas após serem transportadas individualmente através dos poros nucle ares para o citoplasma Outros complexos ribonucleoproteicos incluindo a telomera se aqui mostrada também são formados no nucléolo NUCLÉOLO NÚCLEO CITOPLASMA Alça de DNA cromossômico Gene de rRNA TRANSCRIÇÃO Precursor de rRNA 45S Proteínas ribossômicas produzidas no citoplasma Grande partícula ribonucleoproteica RECICLAGEM DE RNAs E DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO PROCESSAMENTO DO rRNA rRNA 5S Subunidade maior imatura Subunidade maior Subunidade menor TRANSPORTE E ORGANIZAÇÃO FINAL DOS RIBOSSOMOS Subunidade 40S Subunidade 60S snoRNAs Proteínas envolvidas no processa mento do rRNA MODIFICAÇÃO E PROCESSAMENTO DOS rRNAs RNA da telomerase Proteínas telomerase Telomerase CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 333 Os grupos de grânulos de intercromatina que contêm estoques de componentes en volvidos no processamento do RNA são frequentemente observados nas proximidades dessas regiões de transcrição e acreditase que estejam envolvidos na reposição dos su primentos utilizados O núcleo pode ser considerado uma estrutura organizada em sub domínios com snRNPs snoRNPs e outros componentes nucleares movendose entre eles de forma ordenada de acordo com as necessidades da célula Resumo Antes de a síntese de uma determinada proteína poder ocorrer a molécula de mRNA cor respondente deve ser produzida por transcrição As bactérias contêm um único tipo de RNApolimerase a enzima que realiza a transcrição de DNA em RNA Uma molécula de mRNA é produzida depois que esta enzima inicia a transcrição em um promotor sinteti za o RNA pela extensão da cadeia finaliza a transcrição em um terminador e libera tanto o DNAmolde quanto a molécula de mRNA finalizada Nas células eucarióticas o processo de transcrição é muito mais complexo e existem três RNApolimerases designadas como po limerase I II e III evolutivamente relacionadas umas às outras e à polimerase bacteriana O mRNA dos eucariotos é sintetizado pela RNApolimerase II Essa enzima requer um conjunto de proteínas adicionais os fatores gerais de transcrição e proteínas especí ficas de ativação transcricional para iniciar a transcrição em um molde de DNA Ainda são necessárias mais proteínas incluindo complexos de remodelagem da cromatina e en zimas modificadoras de histonas para iniciar a transcrição nos moldes de cromatina no interior da célula Durante a fase de extensão ou alongamento da transcrição o RNA em formação sofre três tipos de eventos de processamento um nucleotídeo especial é adicionado à sua extremidade 5 capeamento os íntrons são removidos da molécula de RNA splicing e a extremidade 3 do RNA é gerada por clivagem e poliadenilação Cada um desses pro cessos é iniciado por proteínas que acompanham a RNApolimerase II por interação com sítios sobre sua longa cauda estendida Cterminal O splicing difere dos demais pelo fato de muitas de suas etapaschave serem mediadas por moléculas de RNA especializadas e não por proteínas Apenas os mRNAs adequadamente processados são transportados através dos complexos do poro nuclear para o citosol onde serão traduzidos em proteína No caso de diversos genes o produto final é o RNA e não uma proteína Nos eucario tos esses genes são normalmente transcritos pela RNApolimerase I ou pela RNApolime rase III A RNApolimerase I produz os RNAs ribossômicos Após sua síntese sob a forma de um grande precursor os rRNAs são modificados quimicamente clivados e organizados sob a forma das duas subunidades ribossômicas no nucléolo uma estrutura subnuclear distinta que também ajuda a processar alguns complexos RNAproteína menores na célu la As estruturas subnucleares adicionais como os corpos de Cajal e os grupos de grânulos de intercromatina são regiões onde os componentes envolvidos no processamento de RNA são organizados estocados e reciclados A concentração elevada de componentes em tais fábricas assegura que os processos serão catalisados de modo rápido e eficiente DO RNA À PROTEÍNA Na seção anterior vimos que o produto final de alguns genes é a própria molécula de RNA como os RNAs presentes nos snRNPs e nos ribossomos Entretanto a maioria dos genes de uma célula produz moléculas de mRNA que são utilizadas como intermediárias na via de síntese de proteínas Nesta seção examinaremos como a célula converte a in formação contida em uma molécula de mRNA em uma proteína A tradução atraiu a atenção dos biólogos inicialmente no fim dos anos 1950 quando foi abordado o pro blema da codificação como a informação em uma sequência linear de nucleotídeos no RNA é traduzida em uma sequência linear de um conjunto de subunidades quimi camente tão diferentes os aminoácidos em proteínas Essa questão fascinante trou xe grande excitação Havia um quebracabeças criado pela natureza que após mais de 3 bilhões de anos de evolução poderia finalmente ser resolvido por um dos produtos da evolução os seres humanos De fato não somente o código foi finalmente decifrado passo a passo como no ano 2000 a elaborada maquinaria pela qual as células leem esse código o ribossomo foi finalmente revelada em seus detalhes atômicos CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 337 tão modifica quimicamente cada aminoácido ligado incorretamente de tal forma que este agora corresponda ao anticódon exibido pelo tRNA ao qual ele se encontra covalen temente ligado A reação catalisada pela sintetase que liga o aminoácido à extremidade 3 do tRNA é uma das muitas reações celulares associadas à hidrólise de ATP com liberação de ener gia ver p 6465 e produz uma ligação de alta energia entre o tRNA e o aminoácido A energia dessa ligação é usada em uma etapa posterior na síntese de proteínas para ligar covalentemente o aminoácido à cadeia polipeptídica em crescimento As enzimas aminoaciltRNAs sintetases e os tRNAs são adaptadores igualmente importantes para o processo de decodificação Figura 656 Isso foi estabelecido por um experimento no qual um aminoácido cisteína foi convertido quimicamente em um aminoácido diferente alanina após estar ligado ao seu tRNA específico Quando tais moléculas aminoaciltRNA híbridas foram usadas para a síntese de proteínas em um sistema livre de células o aminoácido errado foi inserido em todos os pontos da Figura 653 Alguns dos nucleotídeos incomuns encontrados nas moléculas de tRNA Esses nucleotídeos são produ zidos por modificação covalente de um nucleotídeo normal após a incorporação deste em uma cadeia de RNA Dois outros tipos de nucleotídeos modificados estão ilustrados na Figura 641 Na maioria das moléculas de tRNA aproximadamente 10 dos nucleotídeos são modificados ver Figura 650 Como ilustrado na Figura 651 a inosina às vezes está presente na posição oscilante do anticódon do tRNA Ribose H H N N N N N O CH3 CH3 Ribose H N N O O H H H H Ribose H N N S O H H Dois grupos metila adicionados a G NNdimetil G Dois átomos de hidrogênio adicionados a U dihidro U Ribose H N N N N H H O Desaminação de A inosina Enxofre substitui oxigênio em U 4tiouridina P P P P R C H C O OH H2N AMP 2 Aminoácido Aminoácido adenilado Ribose Adenina Ribose Adenina tRNA OH Aminoacil tRNA R C H C O H2N R C H C O O H2N ATP P P P P Pi Figura 654 Ativação de aminoácidos por enzimas sintetases Um aminoácido é ativado para a síntese proteica por uma enzima aminoaciltRNAsintetase em duas etapas Como indicado a energia da hidrólise de ATP é utilizada para ligar cada aminoácido à sua molécula de tRNA em uma ligação altamente energética O aminoácido é inicialmente ativado por meio da ligação de seu grupo carboxila diretamente a um AMP for mando um aminoácido adenilado a ligação do AMP normalmente uma reação desfavorável é promovida pela hidrólise da molécula de ATP que doa o AMP Sem deixar a enzima sintetase o grupo carboxila ligado ao AMP no aminoácido é então transferido para um grupo hidroxila no açúcar na extremidade 3 da molécula de tRNA Essa transferência liga o aminoácido por uma ligação éster ativada ao tRNA formando a molécula final de aminoaciltRNA A enzima sintetase não está ilustrada neste diagrama 340 PARTE II Mecanismos genéticos básicos vez de energia para a sua própria adição um exemplo de polimerização do tipo frente de crescimento descrita na Figura 244 A mensagem de RNA é decodificada nos ribossomos Como vimos a síntese de proteínas é guiada pela informação presente nas moléculas de mRNA Para manter a fase de leitura correta e para assegurar a exatidão aproxi madamente 1 erro a cada 10 mil aminoácidos a síntese proteica é realizada no ribos somo uma máquina catalítica complexa composta por mais de 50 proteínas diferen tes as proteínas ribossômicas e diversas moléculas de RNA os RNAs ribossômicos rRNAs Uma célula eucariótica típica contém milhões de ribossomos em seu citoplas ma Figura 660 As subunidades menores e maiores dos ribossomos são formadas no nucléolo onde rRNAs recentemente transcritos e modificados se associam às proteínas ribossômicas que foram transportadas para o núcleo após a sua síntese no citoplasma Essas duas subunidades ribossômicas são então exportadas para o citoplasma onde serão unidas para realizar a síntese de proteínas Os ribossomos eucarióticos e bacterianos têm estruturas e funções semelhantes sendo compostos por uma subunidade maior e uma menor que se associam para for mar um ribossomo completo com massa de vários milhões de dáltons Figura 661 A subunidade menor fornece uma região sobre a qual os tRNAs são pareados de maneira eficiente aos códons do mRNA enquanto a subunidade maior catalisa a formação das ligações peptídicas que unem os aminoácidos formando uma cadeia polipeptídica ver Figura 658 H H2N R1 R2 C O C C N H H C H N C H C R3 O O O C H C O O H2N R4 3 4 H H2N R1 R2 C O C C N H H C H N C H C R3 O O C H C O O R4 N H 4 OH 3 tRNApeptidil ligado ao Cterminal da cadeia polipeptídica em crescimento AminoaciltRNA Molécula de tRNA livre de sua ligação peptidil Nova molécula tRNApeptidil ligada ao Cterminal de uma cadeia polipeptídica em crescimento Figura 659 Incorporação de um aminoácido em uma proteína Uma cadeia polipeptídica cresce pela adição sucessiva de aminoácidos à sua extremidade Cterminal A formação de cada ligação peptídica é energeticamente favorável pois a extremidade Cterminal em crescimento foi ativada pela ligação covalente de uma molécula de tRNA A ligação peptidiltRNA que ativa a extremidade em crescimento é regenerada a cada adição As cadeias laterais dos aminoácidos estão indicadas como R1 R2 R3 e R4 como ponto de referência todos os átomos no segundo aminoácido na cadeia polipeptídica estão sombreados em cinza A figura mostra a adição do quarto aminoácido vermelho à cadeia em crescimento Figura 660 Ribossomos no citoplasma de uma célula eucariótica Esta fotomi crografia eletrônica mostra uma fina seção de uma pequena região do citoplasma Os ribossomos aparecem como pontos pretos setas vermelhas Alguns estão livres no citosol outros estão ligados a membranas do retículo endoplasmático Cortesia de Daniel S Friend 400 nm CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 341 Quando a síntese de proteínas não está ativa as duas subunidades do ribossomo estão separadas Elas se associam a uma molécula de mRNA normalmente próximo à sua extremidade 5 para iniciar a síntese de uma proteína O mRNA é então puxado através do ribossomo três nucleotídeos de cada vez Conforme seus códons penetram no ribossomo a sequência de nucleotídeos do mRNA é traduzida em uma sequência de aminoácidos usando os tRNAs como adaptadores para adicionar cada aminoácido na sequência correta na extremidade crescente da cadeia polipeptídica Quando um códon de terminação é encontrado o ribossomo libera a proteína finalizada e suas duas subunidades separamse novamente Nesse ponto essas subunidades podem ser reuti lizadas para iniciar a síntese de outra proteína com outra molécula de mRNA Os ribos somos operam com uma eficiência incrível em um segundo um ribossomo eucariótico adiciona dois aminoácidos a uma cadeia polipeptídica os ribossomos das células bac terianas operam ainda mais rapidamente a velocidades de cerca de 20 aminoácidos por segundo Para coreografar os muitos movimentos coordenados necessários para uma tra dução eficiente um ribossomo contém quatro sítios de ligação para moléculas de RNA um é para o mRNA e três chamados de sítio A sítio P e sítio E são para tRNAs Figura 662 Uma molécula de tRNA se liga com alta afinidade aos sítios A e P apenas se seus anticódons formarem pares de bases com o códon complementar permitindose osci lamento na molécula de mRNA que está ligada ao ribossomo Figura 663 Os sítios A e P estão suficientemente próximos para que suas duas moléculas de tRNA sejam forçadas a formarem pares de bases com códons adjacentes da molécula de mRNA Essa caracte rística do ribossomo mantém a fase de leitura correta no mRNA Uma vez que a síntese de proteínas tenha sido iniciada cada novo aminoácido é adicionado à cadeia em crescimento em um ciclo de reações que segue quatro etapas 70S PM 2500000 Subunidade 50S maior Subunidade 30S menor PM 1600000 PM 900000 rRNA 5S rRNA 23S 120 nucleotídeos 2900 nucleotídeos 1540 nucleotídeos rRNA 16S 34 proteínas 21 proteínas RIBOSSOMO BACTERIANO 80S PM 4200000 Subunidade 60S maior Subunidade 40S menor PM 2800000 PM 1400000 rRNA 5S rRNA 28S rRNA 58S rRNA 18S 120 nucleotídeos 4700 nucleotídeos 160 nucleotídeos 1900 nucleotídeos 49 proteínas 33 proteínas RIBOSSOMO EUCARIÓTICO Figura 661 Comparação entre ribossomos bacterianos e eucarióticos Apesar das diferenças no número e no tamanho de seus rRNAs e componentes pro teicos ambos os ribossomos bacterianos e eucarióticos apresentam aproximadamente a mesma estrutura e funcionam de modo semelhante Embora os rRNAs 18S e 28S dos ribossomos eucarióticos contenham muitos nucleotídeos extras que não ocorrem nos equivalentes bacterianos esses nucleotídeos estão presentes como inserções múltiplas que formam domínios extras não alterando muito a estrutura básica do rRNA 342 PARTE II Mecanismos genéticos básicos principais ligação do tRNA etapa 1 formação da ligação peptídica etapa 2 translo cação da subunidade maior etapa 3 e translocação da subunidade menor etapa 4 Como resultado das duas etapas de translocação o ribossomo completo movese três nucleotídeos sobre o mRNA e é posicionado para o próximo ciclo A Figura 664 ilustra esse processo de quatro etapas a partir de um ponto em que três aminoácidos já foram ligados entre si e há uma molécula de tRNA no sítio P do ribossomo covalentemente ligada à extremidade Cterminal do pequeno polipeptídeo Na etapa 1 um tRNA carre gando o próximo aminoácido da cadeia ligase ao sítio A ribossômico formando pares de bases com o códon do mRNA lá posicionado Dessa forma o sítio P e o sítio A contêm tRNAs adjacentes ligados Na etapa 2 a extremidade carboxila da cadeia polipeptídica é liberada do tRNA no sítio P pelo rompimento da ligação de alta energia entre o tRNA e seu aminoácido e é ligada ao grupo amino livre do aminoácido ligado ao tRNA no sítio A formando uma nova ligação peptídica Essa reação central da síntese de proteí nas é catalisada por uma peptidiltransferase contida na subunidade ribossômica maior Na etapa 3 a subunidade maior se move em relação ao mRNA que está ligado à subuni dade menor o que interfere nas hastes aceptoras dos dois tRNAs que se encontram nos sítios E e P da subunidade maior Na etapa 4 uma nova série de alterações conforma cionais move a subunidade menor e o mRNA a ela ligado exatamente três nucleotídeos ejetando o tRNA ligado ao sítio E e reinicializando o ribossomo para que ele esteja pronto A B C E P A Sítio E Sítio P Sítio A Sítio de ligação ao mRNA Subunidade ribossômica maior Subunidade ribossômica menor D 90 Subunidade maior Subunidade menor Figura 662 Sítios de ligação ao RNA nos ribossomos Cada ribossomo possui um sítio de ligação ao mRNA e três sítios de ligação ao tRNA os sítios A P e E sigla para aminoaciltRNA peptidiltRNA e saída exit respectivamente A Um ribossomo bacteriano com a subunidade menor à frente verdees curo e a subunidade maior atrás verdeclaro Tanto os rRNAs quanto as proteínas ribossômicas estão ilustrados Os tRNAs estão apresentados ligados aos sítios E vermelho P laranja e A amarelo Embora os três sítios de ligação de tRNA estejam ocupados neste exemplo acreditase que durante o processo de síntese proteica não mais do que dois desses sítios contenham moléculas de tRNA simultaneamente ver Figura 664 B As subunidades ribossômicas maior e menor associadas como se o ribossomo em A fosse aberto como um livro C O ribossomo em A foi girado 90 sendo visto com a subunidade maior para cima e a subunidade menor para baixo D Representação esquemática de um ribossomo na mesma orientação que em C que será utilizada nas figuras subsequentes A B e C adaptados de MM Yusupov et al Science 292883896 2001 Com permissão de AAAS cortesia de Albion Baucom e Harry Noller CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 345 ou U No entanto se apenas a diferença nas ligações de hidrogênio for considerada em termos de afinidade um pareamento correto diferiria de um incorreto por um fator somente de 10 a 100 vezes No entanto esses processos possuem uma precisão muito maior do que a explicada por essa diferença Embora os mecanismos utilizados para ex trair especificidade adicional do pareamento de bases complementares sejam distintos de um processo para outro dois princípios exemplificados pelo ribossomo parecem ser gerais O primeiro é o encaixe induzido Vimos que antes de um aminoácido ser adicio nado a uma cadeia polipeptídica em crescimento o ribossomo se enovela em torno da in teração códonanticódon e apenas quando o pareamento está correto este enovelamento é interrompido e a reação pode prosseguir Assim a interação códonanticódon é verifi cada duas vezes a primeira pelo pareamento de bases complementares e uma segunda pelo enovelamento do ribossomo que depende da exatidão do pareamento Esse mesmo princípio de encaixe induzido é visto na transcrição pela RNApolimerase nesse caso um nucleosídeo trifosfato forma inicialmente um par de bases com o molde nesse ponto a enzima se enovela em torno do par de bases avaliando assim a sua correção e ao fazêlo gera o sítio ativo da enzima A enzima pode então adicionar covalentemente o nucleotídeo à cadeia em crescimento Devido a uma geometria errada pares de bases incorretos bloqueiam este encaixe induzido e são portanto suscetíveis de dissociação antes de serem incorporados à cadeia em crescimento Um segundo princípio usado para aumentar a especificidade do pareamento de bases complementares é a chamada correção cinética Vimos que após o pareamento inicial códonanticódon e a alteração conformacional do ribossomo o GTP é hidroli sado Isso cria uma etapa irreversível e marca o início do intervalo de tempo durante o qual a aminoaciltRNA se move para a posição apropriada para a catálise Durante esse intervalo os pares de códonanticódon incorretos que de alguma forma escaparam ao escrutínio do encaixe induzido apresentam uma maior probabilidade de se dissociar do que os pares corretos Há duas razões para isso 1 a interação do tRNA errado com o códon é mais fraca e 2 o intervalo é mais longo para os pareamentos incorretos do que para os corretos Na sua forma mais geral a correção cinética referese a um intervalo de tempo que é iniciado com uma etapa irreversível como a hidrólise de GTP ou ATP durante o qual um substrato incorreto apresenta maior probabilidade de dissociarse do que um substrato correto Nesse caso a revisão cinética coloca a especificidade do pareamento de bases complementares em um patamar acima do que é possível unicamente devido a simples associações termodinâmicas O aumento da especificidade produzido pela cor reção cinética tem um custo energético representado pela hidrólise de ATP ou de GTP Acreditase que a correção cinética atue em muitos processos biológicos mas seu papel está particularmente bem compreendido na tradução A exatidão na tradução requer um gasto de energia livre A tradução pelo ribossomo deve chegar a um balanço entre os limites que opõem exa tidão e velocidade Vimos por exemplo que a exatidão da tradução 1 erro a cada 10 4 aminoácidos sintetizados requer um intervalo a cada novo aminoácido adicionado à cadeia polipeptídica em crescimento resultando em uma velocidade geral de tradução de 20 aminoácidos incorporados por segundo em bactérias Os mutantes bacterianos que possuem uma alteração específica em suas subunidades ribossômicas menores apresentam intervalos maiores e traduzem o mRNA em proteína com uma exatidão con Figura 666 Reconhecimento do pareamento códonanticódon correto pelo rRNA da subunidade menor do ribossomo Aqui é mostrada a interação entre um nucleotídeo do rRNA da subunidade menor e o primeiro par de nucleotídeos de um códonanticódon corretamente pareado Interações semelhantes são formadas entre outros nucleotídeos do rRNA e a segunda e terceira posições do par códonanticódon O rRNA da subunidade menor pode formar essa rede de ligações de hidrogênio somente quando um anticódon estiver adequadamente pareado a um códon Como explicado no texto esse monitoramento códonanticódon pelo rRNA da subunidade menor aumenta a exatidão da síntese proteica De JM Ogle et al Science 292897902 2001 Com permissão de AAAS Anticódon Códon RNA 16S 346 PARTE II Mecanismos genéticos básicos sideravelmente mais alta do que essa entretanto a síntese de proteínas é tão lenta nesses mutantes que as bactérias sobrevivem com certa dificuldade Vimos também que para atingir a exatidão observada da síntese de proteínas é necessário um grande gasto de energia livre isso é esperado visto que como discutido no Capítulo 2 um preço deve ser pago para qualquer incremento na organização de uma cé lula Na maioria das células a síntese de proteínas consome mais energia do que qualquer outro processo de biossíntese Pelo menos quatro ligações fosfato altamente energéticas são rompidas para produzir cada nova ligação peptídica duas são consumidas ao se car regar uma molécula de tRNA com um aminoácido ver Figura 654 e outras duas direcio nam etapas no ciclo de reações que ocorre no ribossomo durante a síntese de proteínas propriamente dita ver Figura 665 Além disso é consumida energia extra cada vez que uma ligação incorreta de aminoácido é hidrolisada por uma tRNAsintetase ver Figura 657 e cada vez que um tRNA incorreto entra no ribossomo provoca hidrólise de GTP e é rejeitado ver Figura 665 Para ser eficiente qualquer mecanismo de controle também deve remover uma fração considerável de interações corretas por essa razão o sistema de correção têm um custo energético ainda maior do que inicialmente se imaginaria O ribossomo é uma ribozima O ribossomo é um grande complexo composto por dois terços de RNA e por um ter ço de proteína A determinação no ano 2000 da estrutura tridimensional completa de suas subunidades maior e menor é um dos principais triunfos da biologia estrutural moderna A estrutura confirma evidências anteriores de que os rRNAs e não as pro teínas são os responsáveis pela estrutura geral do ribossomo por sua capacidade de posicionar tRNAs sobre o mRNA e por sua atividade catalítica de formação de ligações peptídicas covalentes Os rRNAs são enovelados em estruturas tridimensionais precisas altamente densas que formam o cerne compacto do ribossomo e determinam sua for ma geral Figura 667 Contrastando com o posicionamento central dos rRNAs as proteínas ribossômicas geralmente estão localizadas na superfície do complexo e preenchem frestas e ranhu ras da estrutura enovelada do RNA Figura 668 Algumas dessas proteínas estendem projeções de cadeia polipeptídica as quais penetram mesmo que superficialmente em buracos da estrutura do cerne de RNA Figura 669 A função principal das proteínas ribossômicas parece ser a de estabilizar o cerne de RNA ao mesmo tempo permitindo as mudanças na conformação do rRNA necessárias para que ele catalise de maneira efi ciente a síntese proteica As proteínas também auxiliam a associação inicial dos rRNAs que constituirão o cerne do ribossomo Figura 667 Estrutura dos rRNAs na subunidade maior de um ribossomo bacteriano como determinado por cristalografia de raios X A Conforma ções tridimensionais dos rRNAs 5S e 23S da subunidade maior como eles aparecem no ribossomo Uma das subunidades proteicas do ribossomo L1 também é mostrada como um ponto de referência já que forma uma projeção característica no ribossomo B Diagrama esquemático da estrutura secundária do rRNA 23S mos trando a extensiva rede de pareamento de bases A estrutura foi dividida em seis domínios estruturais cujas cores corres pondem àquelas da estrutura tridimen sional em A O diagrama da estrutura secundária está bastante esquematizado para representar o máximo possível da es trutura em duas dimensões Para isso vá rias descontinuidades foram introduzidas na cadeia do RNA embora na realidade o RNA 23S seja uma molécula única de RNA Por exemplo a base do Domínio III é con tígua à base do Domínio IV mesmo que no diagrama exista um espaçamento entre elas Adaptada de N Ban et al Science 289905920 2000 Com permissão de AAAS A rRNA 5S Domínio V Domínio II Domínio VI Domínio IV Domínio III Domínio I L1 B Domínio II Domínio III Domínio IV Domínio VI Domínio V Domínio I CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 347 Não apenas os sítios de ligação de tRNA A P e E são formados principalmente por rRNAs como o sítio catalítico para a formação da ligação peptídica é formado por RNA estando o aminoácido mais próximo a mais de 18 nm de distância Essa descoberta trou xe muita surpresa aos biólogos pois diferentemente das proteínas o RNA não contém grupos funcionais facilmente ionizáveis que possam ser utilizados para a catálise de rea ções sofisticadas como a formação de uma ligação peptídica Além disso íons metálicos que com frequência são utilizados por moléculas de RNA para catalisar reações químicas como será posteriormente discutido neste capítulo não são observados nos sítios ativos do ribossomo Em contraste acreditase que o rRNA 23S forme uma fenda extremamente estruturada que através de uma rede de ligações de hidrogênio seja capaz de orientar de forma precisa os dois reagentes a cadeia peptídica em formação e o aminoaciltRNA e promover a sua ligação covalente Uma surpresa adicional veio da descoberta de que o tRNA no sítio P contribui com um grupo OH importante para o sítio ativo e participa diretamente na catálise Esse mecanismo parece assegurar que a catálise ocorra apenas quando o tRNA do sítio P estiver adequadamente posicionado no ribossomo As moléculas de RNA que possuem atividade catalítica são conhecidas como ribo zimas Vimos anteriormente neste capítulo que algumas ribozimas atuam em reações de autosplicing Na seção final deste capítulo consideraremos o potencial significado que teve a capacidade das moléculas de RNA em funcionarem como catalisadores para a evolu ção inicial das células vivas Aqui vamos apenas salientar que existem boas razões para sus peitar que moléculas de RNA em vez de proteínas tenham servido como os primeiros ca talisadores em células vivas Se tiver sido assim o ribossomo com seu cerne de RNA pode ser considerado uma relíquia de um tempo ancestral da história da vida quando a síntese de proteína evoluiu em células que eram mantidas quase que inteiramente por ribozimas As sequências nucleotídicas no mRNA sinalizam onde iniciar a síntese proteica A iniciação e a terminação da tradução compartilham características com o ciclo de ex tensão da tradução descrito anteriormente O sítio em que a síntese de proteína inicia no mRNA é especialmente importante uma vez que ele define a fase de leitura de toda a mensagem Um erro de um nucleotídeo para mais ou para menos nesse estágio fará todos os códons subsequentes na mensagem serem lidos de maneira errada de tal forma que uma proteína não funcional com uma sequência distorcida de aminoácidos será produzida A etapa de iniciação também é importante porque para a maioria dos genes é o último momento no qual a célula pode decidir se o mRNA deverá ser traduzido para produzir uma proteína A velocidade dessa etapa é portanto um determinante da velo cidade em que uma proteína em particular será sintetizada Veremos no Capítulo 7 como ocorre a regulação dessa etapa A tradução de um mRNA tem início com um códon AUG e um tRNA especial é necessário para iniciar essa tradução Esse tRNA iniciador sempre carrega o aminoácido metionina nas bactérias uma forma modificada de metionina é utilizada a formilmetio nina portanto todas as proteínas recémformadas possuem metionina como o primeiro aminoácido de sua extremidade Nterminal a extremidade da proteína que é sintetiza da primeiro Após essa metionina geralmente é removida por uma protease específica O tRNA iniciador é especialmente reconhecido pelos fatores de iniciação pois tem uma sequência nucleotídica distinta do tRNA que normalmente carrega a metionina Nos eucariotos o complexo tRNA iniciadormetionina MettRNAi é inicialmente depositado sobre a subunidade ribossômica menor juntamente com proteínas adicionais denominadas fatores de iniciação eucarióticos eIFs eucaryotic initiation factors De to dos os aminoaciltRNAs na célula apenas o tRNA iniciador carregado com metionina é ca paz de estabelecer uma ligação de alta afinidade com a subunidade menor do ribossomo sem que o ribossomo completo esteja presente e ao contrário dos outros tRNAs ele se liga diretamente ao sítio P Figura 670 A seguir a subunidade menor do ribossomo se liga à extremidade 5 de uma molécula de mRNA que é reconhecida em virtude de seu quepe ou capa 5 que se ligou previamente a dois fatores de iniciação eIF4E e eIF4G ver Figura 638 A subunidade ribossômica menor então movese para frente de 5 para 3 ao longo do mRNA à procura do primeiro AUG fatores de iniciação adicionais que atuam como he Figura 668 Localização dos componen tes proteicos da subunidade ribossômica maior bacteriana Os rRNAs 5S e 23S estão ilustrados em azul e as proteínas da subuni dade maior em verde Esta é a vista da porção exterior do ribossomo a interface com a su bunidade menor encontrase na face oposta Código PDB 1FFK Figura 669 Estrutura da proteína L15 na subunidade maior do ribossomo bacteriano O domínio globular da pro teína repousa na superfície do ribossomo e uma extensão penetra profundamente a região central de RNA do ribossomo A proteína L15 é mostrada em verde e uma porção da região central de rRNA está apresentada em azul De D Klein PB Moore e TA Steitz J Mol Biol 340141177 2004 Com permissão de Academic Press Código PDB 1S72 CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 351 Inibidores da síntese de proteínas em procariotos são úteis como antibióticos Muitos dos mais eficientes antibióticos utilizados na medicina moderna são compostos produzidos por fungos que inibem a síntese de proteína bacteriana Os fungos e as bacté rias competem por vários nichos ambientais semelhantes e milhões de anos de coevolu ção resultaram nos potentes inibidores bacterianos desenvolvidos pelos fungos Alguns desses fármacos exploram as diferenças estruturais e funcionais entre os ribossomos bacterianos e eucarióticos de forma a interferir preferencialmente no funcionamento dos ribossomos bacterianos Consequentemente alguns desses compostos podem ser ingeridos em altas doses por seres humanos sem que ocorra uma toxicidade indeseja da Muitos antibióticos se alojam em fendas dos rRNAs e simplesmente interferem no bom funcionamento do ribossomo outros bloqueiam porções específicas do ribosso mo como o canal de saída Figura 675 A Tabela 64 lista alguns desses antibióticos comuns além de vários outros inibidores da síntese proteica alguns dos quais capazes de atuar em células eucarióticas e que portanto não podem ser utilizados como anti bióticos Devido ao fato de bloquearem etapas específicas nos processos que levam do DNA à proteína muitos dos compostos listados na Tabela 64 são utilizados para estudos de biologia celular Entre os fármacos mais comumente utilizados em tais investigações es tão o cloranfenicol a ciclohexamida e a puromicina todos inibidores específicos da sín tese proteica Em uma célula eucariótica por exemplo o cloranfenicol inibe a síntese de proteína nos ribossomos somente na mitocôndria e nas plantas nos cloroplastos pro vavelmente refletindo as origens procarióticas dessas organelas discutido no Capítulo 14 A ciclohexamida ao contrário afeta somente ribossomos no citosol A puromicina apresenta um detalhe interessante pois é estruturalmente análoga a uma molécula de tRNA ligada a um aminoácido sendo consequentemente outro exemplo de mimetis mo molecular o ribossomo reconhece erroneamente esse composto como se fosse um aminoácido autêntico e incorporao covalentemente na extremidade Cterminal de uma cadeia peptídica em crescimento provocando dessa forma a terminação prematura e a liberação do polipeptídeo Como esperado a puromicina inibe a síntese proteica tanto em procariotos quanto em eucariotos Mecanismos de controle de qualidade impedem a tradução de mRNAs danificados Em eucariotos a produção de mRNA envolve a transcrição e uma série de etapas elabo radas de processamento do RNA como já vimos esse processamento ocorre no núcleo segregado dos ribossomos e apenas quando concluído os mRNAs são transportados para o citoplasma para serem traduzidos ver Figura 638 No entanto esse esquema não é à prova de erros e alguns mRNAs processados de forma incorreta são inadvertida Tetraciclina Espectinomicina Higromicina B Estreptomicina Cloranfenicol Estreptogramina B Eritromicina Subunidade ribossômica menor Subunidade ribossômica maior Figura 675 Sítios de ligação para anti bióticos em ribossomos bacterianos As subunidades menor à esquerda e maior à direita do ribossomo estão dis postas como se o ribossomo fosse aberto como um livro Os sítios de ligação de antibióticos estão marcados com esferas coloridas e as moléculas de tRNA ligadas são mostradas em roxo ver Figura 662 A maioria dos antibióticos mostrados liga se diretamente a fendas formadas pelas moléculas do rRNA A higromicina B induz erros de tradução a espectinomicina bloqueia a translocação do peptidiltRNA do sítio A para o sítio P e a estreptogra mina B impede a extensão de peptídeos nascentes A Tabela 64 lista os mecanis mos de inibição dos outros antibióticos mostrados na figura Adaptada de J Poehlsgaard e S Douthwaite Nat Rev Mi crobiol3870881 2005 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd 352 PARTE II Mecanismos genéticos básicos mente transferidos para o citosol Além disso uma molécula de mRNA que estava intacta ao deixar o núcleo pode ser quebrada ou sofrer alguma outra alteração no citosol O pe rigo da tradução de um mRNA lesado ou processado de forma incompleta que levaria à produção de proteínas truncadas ou aberrantes é aparentemente tão grande que a célu la possui várias medidas de controle para evitar esse tipo de acontecimento Para evitar a tradução de moléculas quebradas de mRNA por exemplo tanto o quepe 5 quanto a cauda de poliA são reconhecidos pelo aparato de iniciação da tradução antes de seu início ver Figura 670 O mais poderoso sistema de vigilância do mRNA chamado de decaimento do mRNA mediado por ausência de sentido elimina os mRNAs defeituosos antes que eles se afastem do núcleo Esse mecanismo é acionado quando a célula identifica que uma molécula de mRNA apresenta um códon sem sentido de terminação UAA UAG ou UGA em um local errado Essa situação poderá ocorrer em uma molécula de mRNA que sofreu splicing indevido pois o splicing inadequado geralmente resultará na intro dução aleatória de um códon sem sentido na fase de leitura do mRNA especialmente em organismos como os seres humanos que têm íntrons com um tamanho médio grande ver Figura 631B O mecanismo de decaimento do mRNA mediado por ausência de sentido começa quando uma molécula de mRNA está sendo transportada do núcleo para o citoplasma Conforme sua extremidade 5 emerge de um poro nuclear há o encontro do mRNA com um ribossomo e o início da tradução Conforme a tradução prossegue os complexos de junção de éxons EJCs que estão ligados ao mRNA em cada sítio de splicing são desloca dos pelo ribossomo em movimento O códon de parada normal se situa internamente ao último éxon por isso quando o ribossomo alcançálo e nele ficar retido não haverá mais EJCs ligados ao mRNA Nesse caso o mRNA terá passado a inspeção e será liberado no citosol onde poderá ser traduzido em quantidade Figura 676 No entanto se o ribosso mo atingir um códon de parada precocemente quando EJCs ainda permanecem ligados a molécula de mRNA será rapidamente degradada Assim o primeiro ciclo de tradução permite que a célula teste cada molécula de mRNA no momento em que ela sai do núcleo O decaimento mediado por ausência de sentido pode ter sido especialmente im portante na evolução permitindo que células eucarióticas explorassem mais facilmen te novos genes formados por rearranjo de DNA mutações ou padrões alternativos de splicing e selecionasse para a tradução apenas aqueles mRNAs que produzissem uma proteína completa O decaimento mediado por ausência de sentido também é impor tante no desenvolvimento das células do sistema imune onde os extensivos rearranjos TABELA 64 Inibidores de síntese proteica ou de RNA Inibidor Efeito específico Com ação somente em bactérias Tetraciclina Bloqueia a ligação do aminoaciltRNA ao sítio A do ribossomo Estreptomicina Evita a transição da iniciação da tradução para a extensão de cadeia podendo também causar erros de decodificação Cloranfenicol Bloqueia a reação da peptidiltransferase nos ribossomos etapa 2 na Figura 664 Eritromicina Ligase no canal de saída do ribossomo e dessa forma inibe a extensão da cadeia peptídica Rifampicina Bloqueia a iniciação das cadeias de RNA por meio da ligação à RNApolimerase evita a síntese de RNA Com ação em bactérias e em eucariotos Puromicina Causa a liberação prematura das cadeias polipeptídicas em formação por meio de sua adição à extremidade da cadeia em crescimento Actinomicina D Ligase ao DNA e bloqueia o movimento da RNApolimerase evita a síntese de RNA Com ação em eucariotos mas não em bactérias Ciclohexamida Bloqueia a reação de translocação nos ribossomos etapa 3 na Figura 664 Anisomicina Bloqueia a reação da peptidiltransferase nos ribossomos etapa 2 na Figura 664 aamanitina Bloqueia a síntese de mRNA por meio de sua ligação preferencial à RNApolimerase II Os ribossomos de mitocôndrias e de cloroplastos de eucariotos com frequência assemelhamse aos ribossomos de bactérias no que concerne à sua sensibilida de a inibidores Portanto alguns desses antibióticos podem ter um efeito deletério sobre as mitocôndrias de humanos CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 353 de DNA que ocorrem ver Figura 2428 com frequência geram códons de terminação precoce O sistema de vigilância degrada os mRNAs produzidos a partir de tais rearranjos gênicos e dessa forma evita os potenciais efeitos tóxicos de proteínas truncadas A via de vigilância mediada pela ausência de sentido também desempenha um importante papel na diminuição dos sintomas de várias doenças genéticas humanas Como vimos anteriormente doenças hereditárias são muitas vezes causadas por mu tações que interferem negativamente no funcionamento de uma proteína essencial como a hemoglobina ou um dos fatores de coagulação sanguínea Aproximadamente um terço das doenças genéticas em humanos é resultante de mutações sem sentido ou de alterações que incorporam mutações sem sentido na fase de leitura do gene como as mutações de troca de fase de leitura ou mutações em sítios de splicing Em indiví duos portadores de um gene mutante e um gene funcional o decaimento mediado por ausência de sentido elimina o mRNA anormal e dessa forma impede que uma proteína potencialmente tóxica seja formada Sem esse sistema de segurança indivíduos com um gene funcional e um gene mutante da doença provavelmente apresentariam sin tomas muito mais graves Algumas proteínas iniciam o seu enovelamento ainda durante a síntese O processo de expressão de genes não termina quando o código genético foi utilizado para criar a sequência de aminoácidos que constitui a proteína Para ser útil à célula essa nova cadeia polipeptídica deve se enovelar adquirindo a sua conformação tridi mensional característica ligarse a alguma pequena molécula cofator necessária para a sua atividade ser apropriadamente modificada por proteínascinase ou outras enzimas modificadoras de proteínas e associarse corretamente a outras subunidades proteicas necessárias para sua função Figura 677 As informações necessárias para todas as etapas listadas anteriormente estão conti das em última instância na sequência de aminoácidos que o ribossomo produz quando traduz uma molécula de mRNA em uma cadeia polipeptídica Como discutido no Capí AUG UAA UGA UAA AUG UAA UAA AUG UAA AUG UAA PrémRNA AAA200 AAA200 AAA200 NÚCLEO CITOSOL Códon de iniciação Íntron Íntron Códon de terminação em fase Códon de terminação normal Ribossomo Ribossomo Complexos de junção do éxon EJCs O mRNA SOBREVIVE TRADUÇÃO EFICIENTE SPLICING NORMAL SPLICING ANORMAL Upf INDUZ A DEGRADAÇÃO DO mRNA AUG UAA UAA AAA200 Proteínas Upf Poro nuclear Figura 676 Decaimento do mRNA mediado por ausência de sentido Como ilustrado à direita uma incapacidade de realizar o splicing adequado de um prémRNA frequentemente introduz um códon de terminação precoce em fase de leitura para a proteína Esses mRNAs anormais são destruídos pelo mecanis mo de decaimento mediado por ausência de sentido Para ativar esse mecanismo uma molécula de mRNA contendo complexos de junção do éxon EJCs para marcar locais de processamento completo de modo adequado é inicialmente ligada por um ribossomo que realiza um ciclo de teste de tradução Conforme o mRNA passa através do estreito canal do ribossomo os EJCs se dissociam e mRNAs que conseguem realizar toda a passagem são liberados para múltiplos ciclos de tradução lado esquerdo No entanto se um códon de parada em fase de leitura é encontrado antes que o EJC final seja alcançado lado direito o mRNA sofre decaimento mediado por ausência de sentido acionado pelas proteínas Upf verde que se ligam a cada EJC Observe que este mecanismo garante que o decaimento mediado por ausência de sentido seja desencadeado apenas quando o códon de parada prematuro está na mesma fase de leitura que a proteína normal Adaptada de J LykkeAndersen et al Cell 10311211131 2000 Com permissão de Elsevier 354 PARTE II Mecanismos genéticos básicos tulo 3 quando uma proteína se enovela formando uma estrutura compacta ela esconde a maioria de seus resíduos hidrofóbicos na região central em seu interior Além disso muitas interações não covalentes são formadas entre várias partes da molécula É a soma de todos esses arranjos energeticamente favoráveis que determina o padrão de enove lamento final da cadeia polipeptídica com a conformação de menor energia livre ver p 114115 Ao longo de muitos milhões de anos de evolução a sequência de aminoácidos de cada proteína foi selecionada não somente pela conformação que ela adota mas tam bém por sua capacidade de se enovelar rapidamente Para algumas proteínas esse eno velamento começa imediatamente enquanto a cadeia de proteína ainda emerge do ri bossomo começando a partir da extremidade Nterminal Nesses casos conforme cada domínio proteico emerge do ribossomo em um intervalo de poucos segundos o ribos somo forma uma estrutura compacta a qual contém a maior parte das características secundárias finais ahélices e folhas b alinhadas de uma maneira aproximadamente correta Figura 678 Em alguns domínios proteicos essa estrutura flexível e aberta denominada glóbulo maleável é o ponto inicial para um processo relativamente lento em que ocorrem muitos ajustes nas cadeias laterais os quais finalmente levam à for mação correta da estrutura terciária São necessários vários minutos para sintetizar uma proteína de tamanho médio e no caso de muitas proteínas grande parte do processo de enovelamento estará completa no momento em que o ribossomo libera a extremidade Cterminal da proteína Figura 679 As chaperonas moleculares auxiliam no enovelamento da maioria das proteínas A maioria das proteínas provavelmente não é corretamente enovelada durante a sua sín tese e exige uma classe especial de proteínas chamadas chaperonas moleculares para esse procedimento As chaperonas moleculares são úteis para as células pois há muitas vias de enovelamento diferentes disponíveis para uma proteína não enovelada ou par cialmente enovelada Sem as chaperonas algumas dessas vias não conduziriam à for ma corretamente enovelada e mais estável pois a proteína se tornaria cineticamente Figura 677 Etapas da criação de uma proteína funcional Como indicado a tradu ção de uma sequência de um mRNA em uma sequência de aminoácidos no ribossomo não constitui o final do processo de formação de uma proteína Para funcionar a cadeia polipeptídica completa deve se enovelar adquirindo uma conformação tridimensional correta ligarse aos cofatores necessários e unirse a cadeias proteicas adicionais se necessário Essas alterações são direcionadas pela formação de ligações não covalentes Como indicado muitas proteínas também precisam de modificações covalentes em aminoácidos determinados Embora as modificações mais frequentes sejam a glicosilação e a fosforilação das proteínas mais de 200 tipos diferentes de modificações covalentes são conhecidos ver p 165166 Cadeia polipeptídica em formação Enovelamento e ligação a cofatores interações não covalentes Alterações covalentes por glicosilação fosforilação acetilação etc Ligação a outras subunidades proteicas Proteína funcional madura P P A B Figura 678 Estrutura de um glóbulo maleável A A forma de um glóbulo maleável do citocromo b562 é mais aberta e menos organizada do que a forma final enovelada da proteína ilustrada em B Observe que o glóbulo maleável já apre senta quase toda a estrutura secundária da forma final embora as extremidades das ahélices estejam desordenadas e uma das hélices esteja somente parcialmente formada Cortesia de Joshua Wand de Y Feng et al Nat Struct Biol 13035 1994 Com permissão de Macmillan Pu blishers Ltd CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 355 presa em estruturas que estão às margens do caminho Algumas dessas conformações iriam agregar dando origem a becos sem saída de estruturas não funcionais irreversíveis e potencialmente perigosas As chaperonas moleculares reconhecem especificamente configurações erradas e enovelamentos inadequados devido à exposição de superfícies hidrofóbicas que nas proteínas corretamente enoveladas normalmente encontramse protegidas do ambien te A ligação entre essas superfícies hidrofóbicas expostas leva à agregação irreversível das conformações errôneas Vimos no Capítulo 3 que em alguns casos de doenças hu manas hereditárias formamse agregados que podem causar sintomas graves ou mes mo levar à morte As chaperonas impedem que isso aconteça em proteínas normais por ligaremse às superfícies hidrofóbicas expostas com suas próprias superfícies hidrofóbi cas Como veremos a seguir existem vários tipos de chaperonas uma vez ligadas a uma proteína enovelada incorretamente elas irão em última instância liberálas sob uma forma que dará à proteína uma nova chance de se enovelar corretamente As células utilizam diversos tipos de chaperonas As chaperonas moleculares são denominadas proteínas de choque térmico hsp heat shock proteins pois são sintetizadas em quantidades significativamente aumentadas após uma breve exposição das células a uma temperatura elevada p ex 42C para cé lulas que normalmente vivem a 37C Isso reflete a operação de um sistema de retroa limentação que responde a um aumento de proteínas erroneamente enoveladas como aquelas produzidas por temperaturas elevadas induzindo a síntese das chaperonas as quais auxiliam essas proteínas a se enovelarem novamente Existem várias famílias importantes de chaperonas moleculares incluindo as pro teínas hsp60 e hsp70 Diferentes membros dessas famílias atuam em diferentes organelas Assim como discutido no Capítulo 12 as mitocôndrias contêm suas próprias moléculas de hsp60 e hsp70 que são diferentes daquelas que atuam no citosol e uma hsp70 especial denominada BIP ajuda as proteínas a se enovelarem no retículo endoplasmático As proteínas hsp60 e hsp70 trabalham com seus próprios pequenos grupos de pro teínas associadas quando auxiliam o enovelamento de outras proteínas Elas comparti lham uma afinidade por pequenas áreas hidrofóbicas expostas nas proteínas enoveladas de forma incompleta e hidrolisam ATP geralmente ligando e liberando seus substratos proteicos a cada ciclo de hidrólise de ATP Em outros aspectos os dois tipos de proteínas hsp funcionam de forma diferente A maquinaria da hsp70 atua precocemente sobre mui tas proteínas muitas vezes antes que a proteína deixe o ribossomo com cada monômero da hsp70 ligandose a uma cadeia de cerca de quatro ou cinco aminoácidos hidrofóbicos mRNA Ribossomo Cadeia polipeptídica em crescimento Domínio Nterminal enovelado Enovelamento do domínio Cterminal Enovelamento da proteína só é completo após sua liberação do ribossomo Figura 679 Enovelamento cotraducional de uma proteína Uma cadeia polipeptídica em crescimento é ilustrada adquirindo suas estruturas secundária e terciária conforme emerge do ribossomo O domínio Ntermi nal se enovela antes enquanto o domínio Cterminal ainda está sendo sintetizado Essa proteína no momento em que for liberada do ribossomo ainda não terá adquirido sua conformação final Modificada de AN Fedorov e TO Baldwin J Biol Chem 2723271532718 1997 356 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Figura 680 Quando da ligação ao ATP a hsp70 libera a proteína em solução dando lhe uma nova oportunidade de enovelamento Em contraste as proteínas semelhantes a hsp60 formam uma grande estrutura em forma de barril que age após a proteína ter sido totalmente sintetizada Esse tipo de chaperona às vezes chamado de chaperonina forma uma câmara de isolamento para o processo de dobramento Figura 681 Para entrar em uma câmara uma proteína substrato é inicialmente capturada pela entrada hidrofóbica da câmara A proteína é então liberada no interior da câmara que é revestida com superfícies hidrofílicas e a câmara é selada com uma tampa um passo que requer ATP Nesse momento o substrato pode se enovelar adquirindo sua confor mação final no isolamento situação em que não há outras proteínas com as quais possa agregar Quando o ATP é hidrolisado a tampa é ejetada e a proteína substrato tenha ela conseguido se enovelar ou não é liberada da câmara As chaperonas ilustradas nas Figuras 680 e 681 frequentemente requerem vários ciclos de hidrólise de ATP para promover o enovelamento correto de uma única cadeia po lipeptídica Essa energia é utilizada para executar movimentos mecânicos das máquinas hsp60 e hsp70 convertendoas de formas de ligação para formas de liberação Da mesma forma que vimos para a transcrição para o splicing e para a tradução o gasto de energia pode ser usado pelas células para aumentar a acurácia dos processos biológicos No caso do enovelamento de proteínas a hidrólise de ATP permite que as chaperonas reconheçam uma ampla variedade de estruturas erroneamente enoveladas impeçam novos enovela mentos inadequados e recomecem o enovelamento da proteína de forma correta Figura 680 A família de chaperonas moleculares hsp70 Essas proteínas agem precocemente reconhecendo uma pe quena região de aminoácidos hidrofóbicos na superfície de uma proteína Auxiliadas por um grupo de proteínas hsp40 meno res não ilustradas as moléculas hsp70 ligadas ao ATP ligamse à proteínaalvo e hidrolisam ATP em ADP sofrendo uma alteração conformacional que faz as mo léculas hsp70 se prenderem ainda mais fortemente ao seu alvo A seguir ocorre dissociação da hsp40 e a rápida religação de ATP induz a dissociação da proteína hsp70 por meio da liberação de ADP Os ciclos repetidos de ligação e liberação da hsp ajudam o novo enovelamento da proteínaalvo ATP ATP Ribossomo Maquinaria hsp70 Maquinaria hsp70 Proteína enovelada corretamente Proteína enovelada incorretamente ATP ADP ADP Pi Proteína enovelada corretamente Proteína enovelada de forma incompleta ou incorreta Quepe GroES Sítios hidrofóbicos de ligação à proteína A Complexo proteico semelhante à hsp60 B ATP ATP ADP Pi 10 nm Figura 681 Estrutura e função da família hsp60 de chaperonas moleculares A Uma proteína mal enovelada é inicialmente capturada por interações hidrofóbicas com a superfície exposta da abertura A ligação inicial muitas vezes ajuda a desnaturar uma proteína mal enovelada A subsequente ligação de ATP e de um quepe libera a proteína do substrato em um espaço fechado onde ela tem uma nova opor tunidade de enovelamento Após cerca de 10 segundos ocorre hidrólise de ATP enfraquecendo a ligação do quepe A subsequente ligação de moléculas de ATP adicionais ejeta o quepe e a proteína é liberada Conforme indicado somente uma metade do cilindro simétrico opera sobre uma determinada proteína de cada vez Esse tipo de chaperona molecular também é conhecido como uma chaperonina é designada como hsp60 na mitocôndria TCP1 no citosol das células de vertebrados e GroEL em bactérias B A estru tura de GroEL ligada ao seu quepe GroES conforme determinado por cristalografia de raios X À esquerda mostrase a parte externa da estrutura em barril e à direita um corte transversal através do seu centro B adaptada de B Bukau e AL Horwich Cell 92351366 1998 Com permissão de Elsevier CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 357 Apesar de nossa discussão estar centrada em apenas dois tipos de chaperonas a célula possui uma ampla variedade dessas moléculas A enorme diversidade de proteí nas nas células provavelmente requer um amplo espectro de chaperonas com certa ver satilidade em termos de capacidades de correção e vigilância As regiões hidrofóbicas expostas fornecem sinais essenciais para o controle de qualidade da proteína Se aminoácidos radioativos forem adicionados a células por um curto período as novas proteínas sintetizadas poderão ser acompanhadas à medida que elas amadurecerem até suas formas funcionais finais Esse tipo de experimento demonstra que as proteínas hsp70 agem cedo atuando inicialmente quando uma proteína ainda está sendo sintetizada em um ribossomo e que as proteínas semelhantes a hsp60 atuam apenas mais tarde para auxi liar a enovelar as proteínas completas Vimos que a célula distingue proteínas erroneamen te enoveladas que requerem novos ciclos de enovelamento mediados por ATP daquelas com as estruturas corretas por meio do reconhecimento das superfícies hidrofóbicas Geralmente se uma proteína possui uma área considerável de aminoácidos hi drofóbicos exposta em sua superfície ela não é normal ou ela sofreu um enovelamento incorreto após ter deixado o ribossomo ou sofreu um acidente em um dado momento que a desnaturou parcialmente ou não encontrou outra subunidade normal para a for mação de um complexo proteico maior Tal proteína não apenas é inútil para a célula como pode também ser perigosa As proteínas que rapidamente sofrem enovelamento correto por conta própria não apresentam tais padrões e geralmente dispensam as chaperonas Para as demais proteínas as chaperonas podem realizar o reparo de proteína dandolhes possibilida des adicionais de enovelamento ao mesmo tempo em que impedem a sua agregação A Figura 682 destaca o controle de qualidade e as escolhas que uma célula apre senta para uma proteína recémsintetizada difícil de enovelar Como indicado quando a tentativa de enovelamento de uma proteína falha um mecanismo adicional é aciona do o qual destrói completamente a proteína por proteólise A via proteolítica inicia com o reconhecimento de uma região hidrofóbica anormal na superfície de uma proteína e finaliza com a entrega da proteína para uma máquina de destruição proteica uma protease complexa conhecida como proteassomo Como descrito a seguir esse proces so depende de um sistema elaborado de marcação da proteína que também tem outras funções centrais na célula envolvendo a destruição de proteínas normais selecionadas O proteassomo é uma protease compartimentalizada com sítios ativos sequestrados A maquinaria proteolítica e as chaperonas competem entre si para reorganizar as proteí nas erroneamente enoveladas Se uma proteína recémsintetizada sofrer um rápido eno velamento no máximo uma pequena fração da proteína será degradada Em contras te uma proteína de enovelamento lento fica vulnerável para a atuação da maquinaria proteolítica por mais tempo e um número muito maior de moléculas pode ser destruído antes que ela possa atingir seu estado de enovelamento adequado Devido a mutações ou a erros na transcrição no splicing do RNA ou na tradução algumas proteínas nunca Figura 682 Os processos que moni toram a qualidade da proteína após a síntese proteica Uma proteína re centemente sintetizada algumas vezes se enovela corretamente e associase a outras proteínas semelhantes sem a necessidade de auxílio nesse caso os mecanismos de controle de qualidade não processam a proteína As proteínas enoveladas incorre tamente são auxiliadas pelas chaperonas moleculares visando seu enovelamento correto inicialmente atua a família de proteínas hsp70 e a seguir em alguns casos as proteínas semelhantes à hsp60 Para ambos os tipos de chaperonas as proteínas substrato são reconhecidas devi do a uma região anormal de aminoácidos hidrofóbicos expostos na sua superfície Esse processo de resgate compete com um sistema diferente que reconhece uma região hidrofóbica anormal exposta e transfere a proteína que a contém para um proteassomo visando sua completa destruição A atividade combinada de to dos esses processos é necessária para evi tar a agregação massiva de proteínas em uma célula o que pode ocorrer quando muitas regiões hidrofóbicas das proteínas se agrupam de forma inespecífica Enovelamento correto sem necessidade de auxílio Enovelamento correto com o auxílio de uma chaperona molecular Formas enoveladas de maneira incompleta digeridas pelo proteassomo Proteína recentemente sintetizada Agregado de proteínas Aumento do tempo 358 PARTE II Mecanismos genéticos básicos se enovelam corretamente e é particularmente importante que a célula destrua essas proteínas potencialmente nocivas O aparato que deliberadamente destrói proteínas anormais é o proteassomo uma abundante protease dependente de ATP que constitui cerca de 1 das proteínas celula res Presente em muitas cópias dispersas no citosol e no núcleo o proteassomo também destrói proteínas aberrantes que entram no retículo endoplasmático RE Nesse último caso um sistema de vigilância baseado no RE detecta proteínas que falharam no proces so de enovelamento ou de associação corretos após entrarem no RE e retrotranslocaas para o citosol para serem degradadas pelo proteassomo discutido no Capítulo 12 Cada proteoassomo consiste em um cilindro central oco o proteassomo central 20S formado a partir de múltiplas subunidades proteicas que se associam sob a for ma de um tubo de quatro anéis heptaméricos Figura 683 Algumas das subunidades são proteases cujos sítios ativos estão voltados para a câmara interna do cilindro im pedindoas de atuar descontroladamente sobre a célula Cada extremidade do cilindro normalmente está associada a um grande complexo proteico a capa 19S que contém um anel proteico com seis subunidades pelo qual as proteínasalvo são introduzidas no centro do proteassomo onde serão degradadas Figura 684 A reação de desespirali zação direcionada por hidrólise de ATP desnatura ou desestrutura as proteínasalvo conforme elas se movem através do quepe expondoas para as proteases que revestem a região central do proteassomo Figura 685 As proteínas que compõem a estrutura em anel da capa do proteassomo pertencem a uma grande classe de proteínas de desna turação conhecidas como proteínas AAA Muitas delas funcionam como hexâmeros e Figura 683 O proteassomo A Uma visão em corte da estrutura do cilindro 20S central conforme determinada por crista lografia de raios X com os sítios ativos das proteases indicados por pontos vermelhos B A estrutura completa do proteassomo na qual o cilindro central amarelo é su plementado por um quepe 19S azul em cada extremidade O complexo do quepe também denominado partícula regula dora se liga seletivamente às proteínas marcadas com ubiquitina para a destrui ção a seguir usa a hidrólise de ATP para desnaturar suas cadeias polipeptídicas e as coloca através de um estreito canal ver Figura 685 na câmara interna do cilindro 20S para sua digestão em peque nos peptídeos B de W Baumeister et al Cell 92367380 1998 Com permissão de Elsevier A B Cilindro central protease Anel de desnaturação Quepe Proteínaalvo marcada com cadeia poliubiquitina A B Sítios ativos Quepe Anel de desnaturação Receptor ubiquitina Proteínaalvo marcada com cadeia poliubiquitina Hidrolase de ubiquitina Figura 684 Digestão progressiva de proteínas pelo proteassomo A O quepe do proteassomo reconhece proteínas marcadas por uma cadeia poliubiquitina ver Figura 370 e subsequentemente translocaas para o centro do proteassomo onde serão digeridas Em uma etapa inicial a ubiquitina é clivada do substrato pro teico e é reciclada A translocação para o centro do proteassomo é mediada por um anel de ATPases que desnatura o substrato proteico conforme ele atravessa o anel rumo ao centro do proteassomo Esse anel de desnaturação está representado na Figura 685 B Estrutura detalhada do quepe do proteassomo O quepe inclui um receptor ubiquitina que segura uma proteína ubiquitinada no lugar enquanto esta é puxada para o interior do núcleo do proteassomo e uma hidrolase de ubiquitina que cliva a ubiquitina da proteína a ser destruída A de S Prakash and A Matouschek Trends Biochem Sci 29593600 2004 Com permissão de Elsevier B adaptado de GC Lander et al Nature 482186191 2012 CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 359 compartilham características mecânicas com as DNA helicases dependentes de ATP que desenrolam o DNA ver Figura 514 Uma propriedade crucial do proteassomo e uma razão da sua estrutura complexa é a processividade do seu mecanismo em contraste com uma protease simples que cliva o substrato da cadeia polipeptídica apenas uma vez antes da dissociação o proteas somo mantém o substrato ligado até que todo ele tenha sido convertido em pequenos peptídeos Seria de esperar que uma máquina tão eficiente quanto o proteassomo fosse for temente regulada em particular o proteassomo deve ser capaz de distinguir proteínas anormais daquelas que estão adequadamente enoveladas O quepe 19S do proteassomo age como um portão na entrada do núcleo proteolítico interno e apenas as proteínas marcadas para destruição são introduzidas pelo quepe A marca da destruição é a liga ção covalente à pequena proteína ubiquitina Como vimos no Capítulo 3 a ubiquitina ção de proteínas é usada para muitas finalidades na célula O tipo particular de ligação da ubiquitina que nos interessa aqui é o de uma cadeia de moléculas de ubiquitina uni das pela lisina 48 ver Figura 369 essa é a característica distintiva da ligação a ubiquiti na que marca uma proteína para a destruição no proteassomo Um conjunto especial de moléculas E3 ver Figura 370B é responsável pela ubiquitinação das proteínas desnaturadas ou enoveladas de forma inadequada e das proteínas contendo aminoácidos oxidados ou com outras anormalidades As proteínas anormais tendem a exibir em sua superfície sequências de aminoácidos hidrofóbicos ou motivos conformacionais que são reconhecidos como sinais de degradação pelas molé culas de E3 essas sequências estão internalizadas e portanto inacessíveis nas versões proteicas normais adequadamente enoveladas Entretanto uma via proteolítica que re conhece e destrói proteínas anormais deve ser capaz de distinguir proteínas completas que apresentam conformações erradas dos muitos polipeptídeos em crescimento nos ribossomos bem como dos polipeptídeos recémliberados dos ribossomos que ainda não tenham conseguido finalizar seu enovelamento normal Esse não é um problema trivial no curso do exercício da sua função principal o sistema ubiquitinaproteassomo provavelmente destrói muitas moléculas de proteínas nascentes e recémformadas não porque essas proteínas são anormais mas por estarem expondo transitoriamente sinais de degradação que estarão escondidos em sua forma madura enovelada Muitas proteínas são reguladas por destruição controlada Uma função dos mecanismos proteolíticos intracelulares é o reconhecimento e a elimina ção de proteínas erroneamente enoveladas ou que tenham qualquer outra anormalidade como descrito anteriormente De fato qualquer proteína de uma célula eventualmente acumula danos e é provavelmente degradada pelo proteassomo Uma outra função des sas vias proteolíticas é conferir tempo de vida curto a proteínas normais específicas cuja concentração deve mudar rapidamente em resposta a alterações no estado de uma cé lula Algumas dessas proteínas de vida curta são sempre degradadas de forma rápida ao passo que muitas outras apresentam vida curta condicional ou seja são metabolicamen te estáveis sob determinadas condições mas tornamse instáveis quando ocorrer uma mudança no estado da célula Por exemplo as ciclinas mitóticas têm vida longa durante o ciclo celular até sua súbita degradação no final da mitose como descrito no Capítulo 17 Figura 685 Uma proteína hexamérica de desnaturação A O quepe do pro teassomo inclui proteínas laranja que re conhecem e hidrolisam a ubiquitina e um anel hexamérico azul pelo qual as proteí nas ubiquitinadas devem ser inseridas no complexo O anel hexamérico é formado por seis subunidades todas pertencentes à família de proteínas AAA B Modelo de proteínas AAA com atividade de des naturação dependente de ATP A forma ligada a ATP de um anel hexamérico de proteínas AAA liga uma proteína substra to enovelada que é mantida localmente pela sua marca ubiquitina Uma alteração conformacional direcionada pela hidrólise de ATP puxa o substrato para o núcleo central e estica a estrutura do anel Nesse ponto a proteína substrato que está sendo puxada para cima pode ser desna turada parcialmente e penetrar ainda mais no poro ou pode manter sua estrutura e parcialmente retroceder Os substratos proteicos muito estáveis podem necessitar de centenas de ciclos de hidrólise de ATP e dissociação antes de serem introduzidos de maneira eficiente pelo anel de proteína AAA Uma vez desnaturada e desubi quitinada a proteína substrato se move de forma relativamente rápida pelo poro por ciclos sucessivos de hidrólise de ATP A adaptada de GC Lander et al Nature 482186191 2012 B adaptada de RT Sauer et al Cell 119918 2004 Com permissão de Elsevier B A Hidrólise de ATP provoca uma alteração conformacional Um estiramento na estrutura do anel puxa o substrato Rara translocação e desnaturação ATP ATP ATP ADP ADP P Anel hexamérico Região central do proteassomo Quepe 360 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Como é regulada a destruição controlada de uma proteína Vários mecanismos gerais são ilustrados na Figura 686 Exemplos específicos de cada mecanismo serão discutidos nos capítulos posteriores Em uma classe mecanicista geral Figura 686A a atividade de uma ubiquitinaligase é ligada ou pela fosforilação de E3 ou por uma tran sição alostérica em uma proteína E3 causada por sua ligação a uma molécula específica grande ou pequena Por exemplo o complexo promotor de anáfase APC anaphasepro moting complex é uma ubiquitinaligase de múltiplas subunidades ativada por uma adi ção de subunidade de controle temporal do ciclo celular na mitose Então a APC ativada provoca a degradação das ciclinas mitóticas e de vários outros reguladores da transição metáfaseanáfase ver Figura 1715A Alternativamente em resposta a sinais intracelulares ou a sinais ambientais pode ser criado um sinal de degradação em uma proteína causando sua rápida ubiquitinação e destruição pelo proteassomo Figura 686B Uma maneira comum de criar tal sinal é fosforilar um sítio específico em uma proteína expondo dessa forma um sinal de degra dação que normalmente permaneceria oculto Outra maneira de revelar tal sinal é por meio da dissociação regulada de uma subunidade proteica Finalmente podem ser cria dos fortes sinais de degradação por uma única clivagem de uma ligação peptídica desde que essa clivagem crie uma nova extremidade Nterminal que será reconhecida por uma proteína E3 específica como um resíduo Nterminal desestabilizador Essa proteína E3 reconhece apenas certos aminoácidos na extremidade Nterminal de uma proteína des se modo nem todos os eventos de clivagem de proteína conduzirão à degradação do fragmento Cterminal produzido Em seres humanos cerca de 80 das proteínas são acetiladas no seu resíduo Nterminal e atualmente sabemos que essa modificação é reconhecida por uma enzima E2 E3 E2 E3 E2 E2 E3 E2 E3 E2 E3 Fosforilação por proteínacinase Fosforilação por proteínacinase Revelação mediada por dissociação proteica Criação de um Nterminal desestabilizante Transição alostérica causada por ligação a ligante Transição alostérica causada por adição de subunidade proteica A ATIVAÇÃO DE UMA UBIQUITINALIGASE B ATIVAÇÃO DE UM SINAL DE DEGRADAÇÃO H2O N N N C C C E3 ATP ADP ATP ADP P P Figura 686 Duas maneiras gerais de induzir a degradação de uma proteína específica A A ativação de uma molé cula E3 específica cria uma de ubiquitina ligase As células eucarióticas possuem vária moléculas E3 distintas ativadas por diferentes sinais B Criação de um sinal de degradação exposto na proteína a ser degradada Esse sinal provoca a ligação de uma ubiquitinaligase provocando a adi ção de uma cadeia poliubiquitina à lisina adjacente sobre a proteínaalvo Sabese que todas as seis vias aqui ilustradas são utilizadas por células para induzir e direcio nar o movimento de proteínas seleciona das para o proteassomo 362 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Como veremos no Capítulo 7 existem exemplos de regulação em cada uma das etapas do gene à proteína Resumo A tradução da sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA em proteína ocorre no citosol em um grande arranjo ribonucleoproteico denominado ribossomo Cada aminoá cido utilizado para a síntese das proteínas é inicialmente ligado a uma molécula de tRNA que reconhece por interações de complementaridade de bases um conjunto particular de três nucleotídeos códons no mRNA Conforme um mRNA é passado através de um ribos somo a sua sequência de nucleotídeos é lida de uma extremidade a outra em conjuntos de três de acordo com o código genético Para iniciar a tradução uma subunidade ribossômica menor se liga a uma molécula de mRNA em um códon de iniciação AUG que é reconhecido por uma molécula de tRNA iniciadora característica Então uma subunidade ribossômica maior se liga para comple tar o ribossomo e iniciar a síntese proteica Durante essa fase os aminoaciltRNAs cada um carregando um aminoácido específico ligamse sequencialmente ao códon apropria do no mRNA por meio de complementaridade de bases entre o anticódon do tRNA e os códons do mRNA Cada aminoácido é adicionado à extremidade Cterminal do polipeptí deo em crescimento por quatro etapas sequenciais ligação do aminoaciltRNA seguida da formação da ligação peptídica e de duas etapas de translocação do ribossomo Os fatores de alongamento usam hidrólise de GTP tanto para promover essas reações quanto para melhorar a exatidão da seleção dos aminoácidos A molécula de mRNA progride códon a códon ao longo do ribossomo na direção de 5 para 3 até alcançar um de três possíveis códons de terminação Então um fator de liberação se liga ao ribossomo finalizando a tradução e liberando o polipeptídeo completo Os ribossomos eucarióticos e bacterianos são intimamente relacionados apesar de diferenças em número e em tamanho de seus rRNAs e de seus componentes proteicos O rRNA tem a função dominante na tradução determinando a estrutura geral do ribosso mo formando os sítios de ligação para os tRNAs pareando os tRNAs aos códons no mRNA e criando o sítio da enzima peptidiltransferase que liga os aminoácidos durante a tradução Nas etapas finais da síntese de proteína dois tipos distintos de chaperonas mole culares auxiliam o enovelamento das cadeias polipeptídicas Essas chaperonas conheci das como hsp60 e hsp70 reconhecem regiões hidrofóbicas expostas nas proteínas e ser vem para evitar a agregação da proteína que poderia competir com o enovelamento das proteínas recentemente sintetizadas em suas conformações tridimensionais corretas Esse processo de enovelamento da proteína deve também competir com um mecanismo de con trole de qualidade altamente elaborado que degrada proteínas que contenham regiões hi drofóbicas anormalmente expostas Nesse caso a ubiquitina é covalentemente adicionada a uma proteína mal enovelada por uma ubiquitinaligase e a cadeia de poliubiquitina re sultante é reconhecida pelo quepe de um proteassomo que desenrola a proteína e a insere no proteassomo para a degradação proteolítica Um mecanismo proteolítico intimamen te relacionado baseado em sinais de degradação especiais reconhecidos por ubiquitinas ligase é utilizado para determinar o tempo de vida de muitas proteínas normalmente enoveladas e também para remover da célula proteínas selecionadas em resposta a sinais específicos O MUNDO DE RNA E A ORIGEM DA VIDA Vimos que a expressão da informação hereditária requer uma maquinaria extraordina riamente complexa que vai do DNA à proteína por intermédio do RNA Essa maquinaria apresenta um paradoxo central se são necessários ácidos nucleicos para a síntese de pro teínas e por sua vez são necessárias proteínas para a síntese de ácidos nucleicos como pode esse sistema de componentes interdependentes ter se originado Uma hipótese para isso é que um mundo de RNA tenha existido na Terra antes do aparecimento das células modernas Figura 688 De acordo com essa hipótese o RNA tanto estocava a in formação genética quanto catalisava as reações químicas nas células primitivas Somente evolutivamente mais tarde o DNA se sobrepôs como o material genético e as proteínas tornaramse as principais catalisadoras e os principais componentes estruturais das célu CAPÍTULO 6 Como as células leem o genoma do DNA à proteína 365 Visto que o RNA tem todas as propriedades necessárias a uma molécula que pode catalisar uma ampla variedade de reações químicas incluindo as que conduzem à sua própria síntese Figura 692 foi proposto que os RNAs tenham atuado há muito tem po como os catalisadores da síntese de RNA dependente de molde Embora sistemas de autorreplicação de moléculas de RNA não tenham sido encontrados na natureza os cientistas fizeram progressos significativos ao construílos em laboratórios Embora essas demonstrações não provem que moléculas de RNA autorreplicativas foram fun damentais para a origem da vida na Terra elas podem estabelecer esse cenário como bastante plausível Como ocorreu a evolução da síntese de proteínas Os processos moleculares envolvidos na síntese de proteínas nas células atuais parecem extremamente complexos Embora compreendamos a maioria desses processos eles não apresentam um sentido conceitual da forma que a transcrição de DNA o reparo de DNA e a replicação de DNA o fazem É especialmente difícil de imaginar como a síntese de proteínas evoluiu tendo em vista que hoje ela é realizada por um sistema complexo e interligado de moléculas de proteína e RNA obviamente as proteínas não podem ter existido antes que uma versão inicial dos mecanismos de tradução tenha existido Ape sar de atrativa em relação ao início da vida a ideia do mundo de RNA não é capaz de explicar como os sistemas atuais de síntese de proteínas puderam se desenvolver Em bora possamos somente especular sobre a origem do código genético várias abordagens experimentais têm proporcionado cenários possíveis Nas células modernas alguns pequenos peptídeos como os antibióticos são sintetizados sem a ação do ribossomo as enzimas peptídeosintetases sintetizam esses peptídeos em sua sequência correta de aminoácidos sem mRNAs que guiem sua sínte se É possível que essa síntese não codificada uma versão primitiva da síntese proteica tenha evoluído no mundo de RNA e tenha sido catalisada por moléculas de RNA Essa ideia não apresenta falhas conceituais atualmente pois como vimos o rRNA catalisa a formação de ligações peptídicas nas células atuais No entanto isso deixa inexplicado como o código genético central para a síntese das proteínas nas células atuais poderia ter surgido Sabemos que ribozimas criadas em laboratório podem realizar reações de aminoacilação específicas ou seja podem carregar aminoácidos específicos em tRNAs específicos Portanto é possível que adaptadores semelhantes aos tRNAs cada um asso ciado a um aminoácido específico tenham surgido no mundo de RNA formando a base de um código genético Uma vez que a síntese de proteínas tenha evoluído pode ter ocorrido a transição para um mundo dominado por proteínas no qual elas se tornaram cada vez mais res ponsáveis pela maior parte das tarefas estruturais e catalíticas devido à sua maior ver satilidade elas possuem 20 subunidades diferentes em vez de 4 Embora essas ideias sejam altamente especulativas elas são consistentes com as propriedades conhecidas das moléculas de RNA e de proteína Todas as células atuais usam DNA como material hereditário Se as especulações evolutivas sobre a hipótese do mundo de RNA estiverem corretas essas células primordiais também diferiam fundamentalmente das células que conhe cemos hoje por terem sua informação hereditária estocada sob a forma de RNA e não de DNA Figura 693 As evidências de que o RNA surgiu antes do DNA na evolução Figura 692 Molécula de RNA que pode catalisar sua própria síntese Esse processo hipotético necessitaria da catálise tanto da produção de uma segunda fita de RNA com sequência complementar de nucleotídeos não mostrada como do uso desta segunda molécula de RNA como molde para a formação de muitas molécu las de RNA com a sequência original Os raios vermelhos representam o sítio ati vo dessa enzima de RNA hipotética Catálise Sistemas baseados em RNA RNA DNA EVOLUÇÃO DE RNAs QUE PODEM PROMOVER A SÍNTESE PROTEICA Sistemas baseados em proteínas e RNAs EVOLUÇÃO DE NOVAS ENZIMAS QUE REPLICAM DNA E FAZEM CÓPIAS DE RNA A PARTIR DO DNA Células atuais RNA RNA Proteína Proteína Figura 693 Hipótese de que o RNA precedeu o DNA e as proteínas na evo lução Nas primeiras células moléculas de RNA ou seus análogos próximos teriam desempenhado funções genéticas estru turais e catalíticas combinadas Nas células atuais o DNA é o repositório de informações genéticas e as proteínas realizam a grande maioria das funções catalíticas O RNA fun ciona principalmente como um intermediário na síntese de proteínas embora continue atuando como catalisador em um pequeno número de reações importantes 366 PARTE II Mecanismos genéticos básicos podem ser encontradas nas diferenças químicas entre eles A ribose como a glicose e ou tros carboidratos simples pode ser formada a partir de formaldeído HCHO um com posto químico simples facilmente produzido em experimentos laboratoriais que tentam simular as condições da Terra primitiva O açúcar desoxirribose é mais difícil de produzir e nas células atuais é produzido a partir da ribose em uma reação catalisada por uma enzima proteica sugerindo que a ribose precedeu a desoxirribose nas células Possivel mente o DNA apareceu no cenário mais tarde porém provou ser mais adaptado do que o RNA como um repositório permanente da informação genética Particularmente a de soxirribose na sua cadeia principal de açúcarfosfato produz cadeias de DNA quimica mente mais estáveis que as cadeias de RNA de tal forma que os DNAs de comprimentos maiores podem ser mantidos sem quebras As outras diferenças entre RNA e DNA a estrutura em duplahélice do DNA e o uso da timina em vez da uracila incrementam ainda mais a estabilidade do DNA fazendo com que os muitos acidentes inevitáveis que ocorrem na molécula sejam mais fáceis de serem reparardos como discutido em detalhes no Capítulo 5 ver p 271273 Resumo De acordo com nosso conhecimento a respeito dos organismos atuais e das moléculas que eles contêm é provável que o desenvolvimento dos mecanismos autocatalíticos distinti vos fundamentais para os sistemas vivos tenha começado com a evolução de famílias de moléculas de RNA que podiam catalisar sua própria replicação É presumível que o DNA tenha sido uma aquisição tardia conforme o acúmulo de catalisadores proteicos permitiu a evolução de células mais eficientes e complexas a duplahélice de DNA substituiu o RNA como uma molécula mais estável para o armazenamento da crescente quantidade de in formação genética necessária para essas células TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 61 As consequências de erros na transcrição são menos graves do que as de erros na replicação de DNA 62 Visto que os íntrons são em sua maioria lixo genéti co não há necessidade de removêlos com exatidão durante o splicing do RNA 63 O pareamento oscilante ocorre entre a primeira posi ção do códon e a terceira posição do anticódon 64 Durante a síntese das proteínas a termodinâmica do pareamento de bases entre tRNAs e mRNAs define o limite superior para a exatidão com a qual as moléculas de proteína serão sintetizadas 65 Acreditase que as enzimas proteicas superem enor memente em número as ribozimas nas células modernas porque elas podem catalisar uma variedade muito maior de reações e todas elas têm taxas de reação mais rápidas do que as de qualquer ribozima Discuta as questões a seguir 66 Em que direção sobre o molde deve a RNApolimerase da Figura Q61 se mover para gerar as estruturas em super torção ilustradas Você esperaria que fossem geradas super torções se a RNApolimerase pudesse girar livremente em tor no do eixo do DNA à medida que progredisse sobre o molde Figura Q61 Supertorções adjacentes a uma RNApolimerase em movimento 67 Você liga uma molécula de RNApolimerase a uma lâ mina de vidro e permite que ela inicie a transcrição de um DNAmolde que está preso a uma microesfera magnética como ilustrado na Figura Q62 Se o DNA com a sua micro esfera magnética ligada movese em relação à RNApolime rase como indicado na figura em que direção a microesfera irá girar Figura Q62 Sistema para a medição da rotação do DNA provocada pela RNApolimerase O ímã prende a microesfera na vertical mas não interfere na sua rotação e as pequenas esferas fluorescentes ligadas permitem que o sentido do movimento seja visualizado ao microscópio A RNApolimerase é mantida no lu gar por fixação à lâmina de vidro DNA RNA RNA polimerase Microesfera magnética Ímã Lâmina de vidro Microesferas fluorescentes O QUE NÃO SABEMOS Como evoluiram as relações atuais entre ácidos nucleicos e proteí nas Como originouse o código genético A informação armazenada em genomas especifica as sequências de todas as proteínas e moléculas de RNA na célula e isso determi na quando e onde essas molécu las são sintetizadas Os genomas transportam outros tipos de infor mação que ainda não tenhamos descoberto As células fazem um grande es forço para corrigir erros nos pro cessos de replicação de DNA transcrição splicing e tradução Existem estratégias análogas para corrigir erros na seleção de quais genes serão expressos em um tipo determinado de célula Poderia a grande complexidade da iniciação da transcrição em plantas e ani mais refletir essa estratégia 368 PARTE II Mecanismos genéticos básicos REFERÊNCIAS Gerais Atkins JF Gesteland RF Cech TR eds 2011 The RNA Worlds From Lifes Origins to Diversity in Gene Regulation Cold Spring 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geralmente não envolvem mudanças na sequência de DNA do genoma Diferentes tipos celulares sintetizam diferentes conjuntos de RNAs e proteínas Como um primeiro passo para entender a diferenciação celular gostaríamos de saber quantas diferenças existem entre um tipo celular e outro Embora ainda não saibamos a resposta exata a essa questão fundamental podemos fazer várias afirmações gerais 1 Muitos processos são comuns a todas as células e quaisquer duas células em um único organismo portanto possuem muitos produtos gênicos em comum Esses incluem as proteínas estruturais dos cromossomos RNA e DNApolimerases enzi mas de reparo do DNA proteínas ribossômicas e RNAs enzimas que catalisam as Figura 72 Células diferenciadas contêm to das as instruções genéticas necessárias para dirigir a formação de um organismo comple to A O núcleo de uma célula da pele de uma rã adulta transplantada em um óvulo que teve seu núcleo retirado pode dar origem a um girino completo A seta tracejada indica que para dar ao genoma transplantado tempo para ajustarse ao meio embrionário é necessário um passo de transferência adicional no qual um dos núcleos é retirado de um embrião inicial que começa seu desenvolvimento e é recolocado em um segundo óvulo que teve o núcleo retirado B Em muitos tipos de plantas as células diferenciadas retêm a habilidade de diferenciarse de forma que uma única célula pode formar um clone de cé lulas da progênie que mais tarde darão origem a uma planta completa C Um núcleo removido de uma célula diferenciada de uma vaca adulta e introduzido em um óvulo que teve seu núcleo re tirado de uma célula de uma vaca diferente pode dar origem a um bezerro Bezerros diferentes produzidos a partir do mesmo doador de células diferenciadas são todos clones do doador sendo portanto geneticamente idênticos A modifica da de JB Gurdon Sci Am 2192435 1968 Óvulo não fertilizado Núcleo destruído por luz UV Rã adulta A B C Células cutâneas em placa de cultura Núcleo em uma pipeta Núcleo injetado no óvulo Embrião normal Girino Corte de uma cenoura Massa de células proliferativas Células separadas em meio líquido rico Célula isolada Clone de células em divisão Embrião jovem Planta jovem Cenoura Vacas Células epiteliais do oviduto Óvulo não fertilizado Fuso meiótico FUSO MEIÓTICO E CROMOSSOMOS ASSOCIADOS REMOVIDOS CÉLULA DOADORA COLOCADA PRÓXIMO AO ÓVULO ENUCLEADO Zigoto reconstruído PULSO ELÉTRICO FAZ A CÉLULA DOADORA SE FUSIONAR COM O ÓVULO ENUCLEADO DIVISÃO CELULAR Embrião colocado na mãe adotiva Bezerro Embrião UV 372 PARTE II Mecanismos genéticos básicos gênica em resposta a sinais extracelulares Se uma célula do fígado é exposta a um hor mônio glicocorticoide por exemplo a produção de um grupo de proteínas específicas aumenta drasticamente Liberados no corpo durante períodos de inanição ou exercício intenso os glicocorticoides sinalizam ao fígado para aumentar a produção de energia a partir de aminoácidos e outras pequenas moléculas o conjunto de proteínas cuja pro dução é induzida inclui a enzima tirosina aminotransferase mencionada anteriormente Quando o hormônio não está mais presente a produção dessas proteínas diminui para o seu nível normal não estimulado nas células do fígado Outros tipos celulares respondem de modo diferente aos glicocorticoides As célu las adiposas por exemplo reduzem a produção de tirosina aminotransferase enquanto alguns outros tipos celulares simplesmente não respondem aos glicocorticoides Esses exemplos ilustram a característica geral da especialização celular diferentes tipos ce lulares frequentemente respondem de maneiras bastante diversas para o mesmo sinal extracelular Outras características do padrão de expressão gênica não mudam e dão a cada tipo celular suas propriedades particulares A expressão gênica pode ser regulada em muitas etapas no caminho que vai do DNA ao RNA e até a proteína Se as diferenças entre os vários tipos celulares dependem dos genes particulares que a célula expressa em qual nível o controle da expressão gênica é exercido Como vimos no capítulo anterior existem muitos passos no caminho que leva do DNA à proteína Agora sabemos que todos eles podem em princípio ser regulados Portanto uma cé lula pode controlar as proteínas que produz 1 controlando quando e como um deter minado gene é transcrito controle transcricional 2 controlando como o transcrito de RNA é submetido a splicing ou é processado controle do processamento de RNA 3 selecionando quais mRNAs completos são exportados do núcleo para o citoplasma e determinando onde no citoplasma eles ficam localizados controle do transporte e da localização de RNA 4 selecionando quais mRNAs no citoplasma são traduzidos pelos ribossomos controle traducional 5 desestabilizando seletivamente certas mo léculas de mRNA no citoplasma controle da degradação do mRNA ou 6 ativando inativando degradando ou compartimentalizando seletivamente moléculas de proteína específicas após a sua produção controle da atividade proteica Figura 75 Para a maioria dos genes os controles transcricionais são os mais importantes Isso faz sentido porque de todos os possíveis pontos de controle ilustrados na Figura 75 somente o controle transcricional garante que a célula não sintetizará intermediários supérfluos Nas seções seguintes discutiremos os componentes de DNA e proteína que desempenham essa função regulando o início da transcrição gênica Nós retornaremos então ao tema das formas adicionais de regulação da expressão gênica Resumo O genoma de uma célula contém em sua sequência de DNA a informação para fazer muitos milhares de moléculas diferentes de proteína e de RNA Uma célula normalmente expressa somente uma fração dos seus genes e os diferentes tipos de células em organismos multicelulares surgem porque diferentes conjuntos de genes são expressos Além disso as Figura 74 Diferenças nas proteínas expressas por dois tecidos humanos A cérebro e B fígado Em cada painel as proteínas estão mostradas usandose a eletroforese em gel de poliacrilamida bidi mensional ver p 452454 As proteínas foram separadas pelo peso molecular de cima para baixo e pelo ponto isoelé trico o pH no qual a proteína não possui carga líquida da direita para a esquerda Os pontos de proteína coloridos artificial mente em vermelho são comuns a ambas as amostras os em azul são específicos àquele tecido As diferenças entre as duas amostras de tecido subestimam bastante suas similaridades mesmo para as proteí nas compartilhadas entre os dois tecidos sua abundância relativa normalmente é diferente Observe que essa técnica separa as proteínas tanto por tamanho como por carga portanto uma proteína que possua por exemplo vários estados diferentes de fosforilação aparecerá como uma série de pontos horizontais ver parte superior à direita do painel direito Somente uma porção pequena do espectro completo de proteínas é mostrada em cada amostra Os métodos baseados em espectro metria de massa ver p 455457 forne cem informação muito mais detalhada incluindo a identidade de cada proteína a posição de cada modificação e a natureza de cada modificação Cortesia de Tim My ers e Leigh Anderson Large Scale Biology Corporation A Cérebro humano B Fígado humano Ácido Ponto isoelétrico Básico Baixo Peso molecular Alto CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 373 células podem alterar o padrão de genes que elas expressam em resposta a mudanças em seu meio ambiente como sinais de outras células Embora todas as etapas envolvidas na expressão de um gene possam em princípio ser reguladas para a maioria dos genes a ini ciação da transcrição do RNA é o ponto de controle mais importante CONTROLE DA TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA Como uma célula determina quais dos seus milhares de genes devem ser transcritos Talvez o conceito mais importante aquele que se aplica a todas as espécies da Terra es teja baseado em um grupo de proteínas conhecidas como reguladores da transcrição ou transcricionais Essas proteínas reconhecem sequências específicas de DNA ge ralmente com 5 a 10 pares de nucleotídeos de comprimento que são frequentemente denominadas sequências reguladoras cisatuantes pois devem estar no mesmo cro mossomo ou seja em cis em que se localizam os genes que elas controlam Os regu ladores transcricionais ligamse a essas sequências que se encontram dispersas pelos genomas e essas ligações dão início a uma série de reações que por último especificam quais genes serão transcritos e em quais taxas Aproximadamente 10 dos genes codifi cadores de proteínas da maioria dos organismos produzem reguladores transcricionais tornando essa uma das maiores classes de proteínas nas células Na maioria dos casos um dado regulador transcricional reconhece as suas próprias sequências reguladoras cisatuantes que são diferentes daquelas reconhecidas por todos os outros reguladores presentes na célula A transcrição de cada gene é por sua vez controlada por seu conjunto particular de sequências reguladoras cisatuantes Essas sequências geralmente residem próximas ao gene com frequência na região intergênica diretamente a montante do ponto de início de transcrição do gene Ainda que alguns poucos genes sejam controlados por uma única sequência reguladora cisatuante que é reconhecida por um único regulador transcricio nal a maioria dos genes possui arranjos complexos de sequências reguladoras cisatuan tes cada uma delas sendo reconhecida por um regulador transcricional diferente Desse modo as posições identidade e arranjo das sequências reguladoras cisatuantes que correspondem a uma parte importante da informação embutida no genoma determi nam em última análise o momento e o local em que cada gene é transcrito Iniciaremos nossa discussão descrevendo como reguladores transcricionais reco nhecem sequências reguladoras cisatuantes A sequência de nucleotídeos da duplahélice de DNA pode ser lida por proteínas Como discutido no Capítulo 4 o DNA em um cromossomo consiste em uma duplahélice muito longa que possui um sulco maior e um menor Figura 76 Reguladores transcri cionais devem ser capazes de reconhecer sequências reguladoras cisatuantes pequenas e específicas localizadas dentro dessa estrutura Quando descobertas pela primeira vez na década de 1960 pensavase que essas proteínas deveriam necessitar de um acesso direto ao interior da duplahélice para poder distinguir diferentes sequências de DNA Entre tanto sabese hoje que a porção exterior da duplahélice é cravejada com informação de Figura 75 Seis etapas nas quais a expressão gênica eucariótica pode ser controlada Os controles que operam nas etapas de 1 a 5 são discutidos neste capítulo A etapa 6 a regulação da ativida de proteica ocorre majoritariamente por modificações covalentes póstraducionais incluindo fosforilação acetilação e ubiqui tinação ver Tabela 33 p 165 A etapa 6 foi introduzida no Capítulo 3 e é discutida subsequentemente em vários capítulos ao longo do livro DNA 1 Controle transcricional 2 Controle do processamento de RNA Transcrito de RNA mRNA mRNA 3 Controle do transporte e da localização de RNA NÚCLEO CITOSOL Controle da degradação do mRNA Controle de tradução 4 6 Controle de atividade proteica mRNA inativo Proteína Proteína inativa Proteína ativa 5 Sulco menor Sulco maior Figura 76 Estrutura de duplahélice do DNA Modelo de preenchimento de espaços do DNA mostrando os sulcos maior e menor na parte externa da dupla hélice ver Animação 41 Os átomos estão coloridos da seguinte forma car bono azul mais escuro nitrogênio azul mais claro hidrogênio branco oxigênio vermelho fósforo amarelo 374 PARTE II Mecanismos genéticos básicos sequência de DNA que os reguladores transcricionais são capazes de reconhecer a ex tremidade de cada par de bases apresenta um padrão particular de doadores de ligações de hidrogênio aceptores de ligações de hidrogênio e porções hidrofóbicas em ambos os sulcos maior e menor Figura 77 Como o sulco maior é mais amplo e possui mais in formações moleculares que o sulco menor praticamente todos os reguladores transcri cionais realizam a maioria dos seus contatos com o sulco maior como veremos adiante Reguladores da transcrição contêm motivos estruturais que podem ler sequências de DNA O reconhecimento molecular na biologia geralmente depende de um encaixe exato en tre as superfícies de duas moléculas e o estudo dos reguladores transcricionais forneceu alguns dos exemplos mais claros desse princípio Um regulador transcricional reconhe ce uma sequência reguladora cisatuante específica porque a superfície da proteína é extensivamente complementar às características de superfície que são particulares à duplahélice que apresenta essa sequência Cada regulador transcricional faz um grande número de contatos com o DNA envolvendo ligações de hidrogênio ligações iônicas e interações hidrofóbicas Embora cada contato individual seja fraco os aproximadamen te 20 contatos que normalmente são formados em uma interface proteínaDNA somam se para assegurar que a interação seja altamente específica e muito forte Figura 78 De fato as interações DNAproteína incluem algumas das interações moleculares mais fortes e mais específicas conhecidas na biologia Embora cada exemplo de reconhecimento proteínaDNA seja único quanto aos de talhes os estudos de cristalografia por raios X e de espectroscopia por ressonância mag Figura 77 Como os diferentes pares de bases no DNA podem ser reconhe cidos a partir das suas bordas sem a necessidade de abrir a duplahélice As quatro possíveis combinações de pares de bases estão mostradas com os possí veis doadores de ligações de hidrogênio indicados em azul os possíveis aceptores de ligações de hidrogênio indicados em vermelho e as ligações de hidrogênio e os pares de bases propriamente ditos como uma série de pequenas linhas para lelas vermelhas Grupos metila que for mam protuberâncias hidrofóbicas estão mostrados em amarelo e os átomos de hidrogênio que estão ligados a carbonos e portanto não estão disponíveis para formar ligações de hidrogênio estão em branco A partir do sulco maior cada uma das quatro configurações de pares de bases projeta um padrão único de carac terísticas De C Branden e J Tooze Intro duction to Protein Structure 2nd ed New York Garland Publishing 1999 S ul co m e n or Su lc o m ai or N N N O O H N H N H N N N H H G C S ul co m e n or Su lc o m ai or C G N N O H H N N H N O H N H N N S ul co m e n or Su lc o m ai or N N N O O H N H CH3 N H N N A T S ul co m e n or Su lc o m ai or CH3 N O O N H N N N N N H H T A H H H H H H H H H H H H CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 375 nética nuclear RMN de centenas de reguladores transcricionais têm revelado que muitas proteínas contêm um ou outro motivo de um pequeno conjunto de motivos estruturais de ligação ao DNA Painel 71 Esses motivos geralmente usam ahélices ou folhas b para se ligarem ao sulco maior do DNA As cadeias laterais dos aminoácidos que se estendem a partir desses motivos proteicos realizam os contatos específicos com o DNA Portanto um dado motivo estrutural pode ser usado para reconhecer muitas sequências reguladoras cisatuantes dependendo das cadeias laterais específicas presentes A dimerização de reguladores da transcrição aumenta a afinidade e a especificidade deles por DNA Um monômero de um regulador transcricional típico reconhece cerca de 6 a 8 pares de nucleotídeos de DNA Entretanto proteínas ligadoras de DNA sequênciaespecíficas não se ligam firmemente a uma única sequência de DNA e rejeitam todas as outras em vez disso elas reconhecem uma gama de sequências intimamente relacionadas com a afi nidade da proteína pelo DNA variando de acordo com o quanto o DNA se assemelha à sequência ótima para cada proteína ligadora Como consequência sequências regula doras cisatuantes são frequentemente representadas como logos que mostram a gama de sequências reconhecidas por um regulador transcricional em particular Figura 79A e B No Capítulo 6 vimos essa mesma representação sendo usada para mostrar a ligação da RNApolimerase a promotores ver Figura 612 A sequência de DNA reconhecida por um monômero não contém informação su ficiente que possibilite que ela seja selecionada a partir do conjunto total de sequências presentes pois a mesma pode ocorrer de forma aleatória ao longo de todo o genoma Por exemplo esperase que 1 sequência exata de DNA de seis nucleotídeos ocorra por acaso aproximadamente 1 vez a cada 4096 nucleotídeos 4 6 e que a gama de sequências de seis nucleotídeos descritas por um logo típico seria esperada por acaso de maneira muito mais frequente talvez a cada 1000 nucleotídeos Claramente para um genoma bacteria no de 46 x 10 6 pares de nucleotídeos para não mencionar um genoma de um mamífero de 3 x 10 9 pares de nucleotídeos essa informação é insuficiente para controlar de forma precisa a transcrição de genes individuais Portanto contribuições adicionais à especi ficidade de ligação ao DNA devem estar presentes Muitos reguladores transcricionais formam dímeros com ambos os monômeros realizando contatos praticamente idênticos com o DNA Figura 79C Esse arranjo duplica o tamanho da sequência reguladora cis atuante reconhecida e aumenta grandemente tanto a afinidade quanto a especificidade da ligação do regulador transcricional Como a sequência de DNA reconhecida pela pro teína aumenta de aproximadamente 6 para 12 pares de nucleotídeos existe um número muito menor de ocorrências aleatórias dessa sequência no genoma Figura 78 A ligação de um regulador da transcricição a uma sequência de DNA específica À esquerda um único contato é mostrado entre um regulador transcricional e o DNA tais contatos permi tem à proteína ler a sequência do DNA À direita o conjunto completo de conta tos entre o regulador transcricional um membro da família de homeodomínios ver Painel 71 e sua sequência regula dora cisatuante é mostrado A porção de ligação ao DNA da proteína possui 60 aminoácidos de extensão Ainda que as interações no sulco maior sejam as mais importantes a proteína também estabe lece contatos com o sulco menor e com os fosfatos da cadeia principal de açúcar fosfato do DNA Ver C Wolberger et al Cell 67517528 1991 N N N N H H N O H N N O H CH3 T A H H N H O C CH2 H Proteína de ligação ao DNA Asparagina 51 Limite externo da cadeia principal de açúcarfosfato no exterior da duplahélice T A A A A A A A A T T T T T T T Arg31 Arg53 Tyr25 Lys57 Thr6 Thr48 Lys55 Arg3 Arg5 Gln50 Ile47 Asn51 Asn51 Sulco maior do DNA Sulco menor do DNA Par de bases Cadeia principal de açúcarfosfato Sulco maior Sulco menor 378 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Os heterodímeros são frequentemente formados a partir de dois reguladores da transcrição diferentes Os reguladores transcricionais podem formar heterodímeros com mais de uma proteína parceira desse modo o mesmo regulador transcricional pode ser reusado para criar diferentes especificidades de ligação de DNA ver Figura 79C Reguladores da transcrição ligamse cooperativamente ao DNA No caso mais simples o conjunto de ligações não covalentes que mantêm os dímeros ou heterodímeros mencionados anteriormente unidos é tão extenso que essas estruturas se formam obrigatoriamente e nunca se separam Nesse caso a unidade de ligação é o dímero ou heterodímero e a curva de ligação para o regulador transcricional a fração de DNA ligado como uma função da concentração de proteína assume uma forma expo nencial padrão Figura 710A Em muitos casos entretanto os dímeros e heterodímeros encontramse unidos de forma muito fraca eles existem predominantemente como monômeros em solução e ainda assim os dímeros são observados na sequência de DNA apropriada Nesse caso dizse que as proteínas ligamse ao DNA cooperativamente e a curva que descreve a li gação delas assume uma forma sigmoidal Figura 710B Ligação cooperativa significa que em uma gama de concentrações do regulador transcricional a ligação se apresenta mais como um fenômeno do tipo tudo ou nada do que não cooperativo ou seja na maior parte das concentrações proteicas a sequência reguladora cisatuante está pra ticamente vazia ou quase totalmente ocupada encontrandose raramente em alguma condição intermediária Uma discussão da matemática subjacente à ligação cooperativa é apresentada no Capítulo 8 ver Figura 879A Figura 79 Reguladores da transcrição e suas sequências reguladoras cisatuantes A Representação da sequência reguladora cisatuante Nanog um membro da família de homeodomínios que é um reguladorchave em células tronco embrionárias Essa forma em logotipo ver Figura 612 mostra que a proteína pode reconhecer uma coleção de sequências de DNA intimamente relacio nadas e fornece os pares de nucleotídeos preferidos a cada posição Sequências reguladoras cisatuantes são lidas como DNA de fita dupla mas normalmente apenas uma fita é mostrada em um logo tipo B Representação de uma sequência reguladora cisatuante como uma caixa colorida C Muitos reguladores da trans crição formam dímeros homodímeros e heterodímeros No exemplo mostrado três especificidades de ligação a DNA são formadas a partir de dois reguladores transcricionais 2 1 0 Sequência reguladora cisatuante Nanog Sequência reguladora cisatuante no genoma A B C Regulador da transcrição Dímero Dímero Heterodímero Bits Figura 710 Ocupação de uma sequência reguladora cisatuante por um regulador da transcrição A Liga ção não cooperativa por um heterodímero estável B Ligação cooperativa por com ponentes de um heterodímero que são predominantemente monômeros em solu ção A forma da curva difere daquela em A porque a fração da proteína em uma forma competente para se ligar ao DNA o heterodímero aumenta com o aumento na concentração da proteína 1 0 0 Ocupação do DNA fração ligada 1 Ocupação do DNA fração ligada Concentração de proteína Concentração de proteína A B Elementos reguladores cisatuantes CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 379 A estrutura nucleossômica promove ligação cooperativa de reguladores da transcrição Como acabamos de ver a ligação cooperativa de reguladores transcricionais ao DNA ocorre com frequência pois os monômeros apresentam apenas uma afinidade fraca uns pelos outros Entretanto existe um segundo mecanismo indireto para ligação coopera tiva originado da estrutura do nucleossomo dos cromossomos eucarióticos Em geral reguladores transcricionais ligamse ao DNA em nucleossomos com me nor afinidade do que com o DNA nu livre de proteínas Existem duas razões para essa diferença Primeiro a superfície da sequência reguladora cisatuante reconhecida pelo regulador transcricional pode estar voltada para dentro no nucleossomo em direção ao cerne de histonas e portanto pode não estar prontamente disponível para a proteína reguladora Segundo mesmo que a face da sequência reguladora cisatuante esteja ex posta na superfície externa do nucleossomo muitos reguladores transcricionais alteram sutilmente a conformação do DNA quando se ligam a ele e essas mudanças geralmente deixam de ocorrer devido ao enrolamento apertado do DNA ao redor do cerne de histo nas Por exemplo muitos reguladores transcricionais induzem uma curvatura ou dobra no DNA quando se ligam a ele Vimos no Capítulo 4 que a remodelagem nucleossômica pode alterar a estrutura do nucleossomo possibilitando que reguladores transcricionais acessem o DNA Entretanto ainda que na ausência de remodelagem reguladores transcricionais podem obter acesso limitado ao DNA em um nucleossomo O DNA na extremidade de um nucleossomo respira expondo transitoriamente o DNA e permitindo a ligação de reguladores Essa respiração ocorre a uma taxa muito mais baixa no centro do nucleossomo portanto as posições nas quais o DNA sai do nucleossomo são mais propensas a serem ocupadas Figura 711 Essas propriedades do nucleossomo promovem ligação cooperativa ao DNA por re guladores transcricionais Se uma proteína reguladora entra no DNA de um nucleossomo e impede que esse DNA seja uma vez mais firmemente enrolado ao redor do cerne do nucle ossomo então essa proteína irá aumentar a afinidade de um segundo regulador transcricio nal por uma sequência reguladora cisatuante vizinha Se além disso os dois reguladores transcricionais também interagirem um com o outro como anteriormente descrito então o efeito cooperativo será ainda maior Em alguns casos a ação combinada de proteínas re guladoras pode eventualmente deslocar o cerne de histonas do nucleossomo por completo A cooperação entre reguladores transcricionais pode se tornar ainda muito maior quando complexos de remodelagem de nucleossomos estiverem envolvidos Se um regula dor transcricional ligase à sua sequência reguladora em cis e atrai um complexo de remode lagem da cromatina a ação localizada do complexo de remodelagem pode permitir que um segundo regulador transcricional se ligue de maneira eficiente na vizinhança Além disso Figura 711 Como os nucleossomos afetam a ligação de reguladores trans cricionais Respiração Sequência reguladora cisatuante Esta forma aberta ocorre cerca de 120 do tempo A B Comparado à sua afinidade pelo DNA nu um regulador transcricional típico se ligará com afinidade 20 vezes menor se sua sequência reguladora cisatuante estiver localizada próximo à extremidade de um nucleossomo Um regulador transcricional típico se ligará com afinidade cerca de 200 vezes menor se a sua sequência reguladora cisatuante estiver localizada no meio de um nucleossomo Regulador transcricional Cerne de histonas D C Um regulador transcricional pode desestabilizar o nucleossomo facilitando a ligação de outro regulador transcricional 380 PARTE II Mecanismos genéticos básicos discutimos como reguladores transcricionais podem trabalhar em pares na realidade um número maior de reguladores frequentemente cooperam uns com os outros usando repeti damente os mesmos princípios Uma ligação altamente cooperativa de reguladores transcri cionais ao DNA provavelmente explica por que muitos sítios em genomas eucarióticos que são ligados por reguladores transcricionais são livres de nucleossomos Resumo Os reguladores transcricionais reconhecem pequenos trechos de DNA duplahélice de sequência definida denominadas sequências reguladoras cisatuantes e desse modo determinam quais dos milhares de genes de uma célula serão transcritos Aproximadamente 10 dos genes codificadores de proteínas na maioria dos organismos produzem reguladores transcricionais e eles controlam muitas características das células Embora cada um desses reguladores transcricionais tenha características únicas a maioria ligase ao DNA como ho modímeros ou heterodímeros e reconhece o DNA por meio de um entre um pequeno núme ro de motivos estruturais Os reguladores transcricionais normalmente atuam em grupos e ligamse ao DNA cooperativamente uma característica que apresenta vários mecanismos subjacentes alguns dos quais exploram o empacotamento do DNA em nucleossomos REGULADORES DA TRANSCRIÇÃO ATIVAM E INATIVAM OS GENES Tendo visto como reguladores transcricionais ligamse às sequências reguladoras cisatuantes embebidas no genoma podemos agora discutir como uma vez ligadas es sas proteínas influenciam na transcrição dos genes A situação nas bactérias é mais sim ples do que nos eucariotos a estrutura da cromatina não é um problema e portanto discutiremos primeiramente o caso bacteriano Em um segundo momento voltaremos para a situação mais complexa dos eucariotos O repressor do triptofano inativa os genes O genoma da bactéria Escherichia coli consiste em uma única molécula de DNA circular de aproximadamente 46 10 6 pares de nucleotídeos Esse DNA codifica aproximada mente 4300 proteínas embora apenas uma fração seja sintetizada pela célula de cada vez As bactérias regulam a expressão de muitos dos seus genes de acordo com as fontes de alimentação que estão disponíveis no ambiente Por exemplo na E coli cinco genes codificam enzimas que produzem o aminoácido triptofano Esses genes estão arranjados em um agrupamento no cromossomo e são transcritos a partir de um único promotor como uma única longa molécula de mRNA esses agrupamentos de genes transcritos coordenadamente são denominados óperons Figura 712 Ainda que os óperons se jam comuns em bactérias eles são raros em eucariotos onde os genes são normalmente transcritos e regulados individualmente ver Figura 73 Quando as concentrações de triptofano estão baixas o óperon é transcrito o mRNA resultante é traduzido para produzir o conjunto completo de enzimas biossin téticas que irão trabalhar juntas para sintetizar triptofano a partir de moléculas muito mais simples Entretanto quando o triptofano está abundante por exemplo quando a bactéria está no intestino de um mamífero que recém se alimentou de uma refeição rica em proteínas o aminoácido é importado pelas células que interrompem a produção dessas enzimas que passam a não ser mais necessárias Figura 712 Um grupo de genes bac terianos pode ser transcrito a partir de um único promotor Cada um desses cinco genes codifica uma enzima diferen te e todas essas enzimas são necessárias para sintetizar o aminoácido triptofano a partir de moléculas mais simples Os genes são transcritos como uma única molécula de RNA uma característica que possibilita que sua expressão seja coordenada Os conjuntos de genes transcritos como uma única molécula de mRNA são comuns em bactérias Cada um desses conjuntos é denominado óperon porque sua expres são é controlada por uma sequência regu ladora cisatuante denominada operador em verde situado dentro do promotor Nesta e em figuras subsequentes os blo cos em amarelo no promotor representam sequências de DNA que se ligam à RNA polimerase ver Figura 612 Série de enzimas necessárias à biossíntese de triptofano Promotor E D C B A Cromossomo de E coli Molécula de mRNA Operador 382 PARTE II Mecanismos genéticos básicos As proteínas ativadoras ligadas ao DNA podem aumentar a taxa de início da trans crição até mil vezes um valor consistente com a interação relativamente fraca e não es pecífica entre o regulador transcricional e a RNApolimerase Por exemplo uma altera ção de mil vezes na afinidade da RNApolimerase por seu promotor corresponde a uma mudança no DG de 18 kJmol a qual poderia ser derivada de algumas poucas ligações fracas não covalentes Dessa forma muitas proteínas ativadoras trabalham simples mente fornecendo algumas poucas interações favoráveis que auxiliem na atração da RNApolimerase ao promotor Para fornecer esse auxílio entretanto a proteína ativado ra deve estar ligada à sua sequência reguladora cisatuante e essa sequência deve estar posicionada com respeito ao promotor de tal forma que interações favoráveis possam ocorrer Como o repressor triptofano as proteínas ativadoras com frequência devem inte ragir com uma segunda molécula para serem capazes de ligar ao DNA Por exemplo a proteína ativadora bacteriana CAP deve se ligar ao AMP cíclico cAMP antes de poder se ligar ao DNA Genes ativados pela CAP são ligados em resposta a um aumento na concentração intracelular de cAMP que aumenta quando a glicose a fonte de carbono preferida pelas bactérias não está mais disponível como resultado CAP aciona a produ ção de enzimas que possibilitam à bactéria digerir outros açúcares Um ativador e um repressor controlam o óperon Lac Em muitos casos a atividade de um único promotor é controlada por vários reguladores transcricionais diferentes O óperon Lac em E coli por exemplo é controlado tanto pelo repressor Lac quanto pelo ativador CAP recentemente discutido O óperon Lac codifica proteínas requeridas para importar e digerir o dissacarídeo lactose Na ausência de gli cose a bactéria produz cAMP que ativa CAP a ligar genes que possibilitam à célula usar fontes alternativas de carbono incluindo lactose Contudo seria um desperdício se a CAP induzisse a expressão do óperon Lac se a própria lactose não estivesse disponível Portanto o repressor Lac desliga o óperon na ausência de lactose Esse arranjo possibi lita que a região controladora do óperon Lac integre dois sinais diferentes de maneira que o óperon somente é altamente expresso quando duas condições são encontradas a glicose tem que estar ausente e a lactose tem que estar presente Figura 715 Esse circuito genético comportase portanto de forma muito similar a um comutador que de sempenha uma operação lógica em um computador Quando a lactose estiver presente e Figura 715 O óperon Lac é controlado por dois reguladores transcricionais o repressor Lac e CAP LacZ o primei ro gene do óperon codifica a enzima bgalactosidase que quebra a lactose em galactose e glicose Quando a lactose está ausente o repressor Lac ligase a uma sequência reguladora cisatuante denomi nada operador Lac e desliga a expressão do óperon Animação 74 A adição de lacto se aumenta a concentração intracelular de um composto relacionado a alolactose a alolactose ligase ao repressor Lac fazendo o sofrer uma mudança conformacional que libera a sua pinça do DNA do operador não mostrado Quando a glicose está ausente o AMP cíclico triângulo vermelho é produzi do pela célula e o CAP ligase ao DNA Sequência reguladora cisatuante para CAP Sítio de ligação à RNApolimerase promotor Início da transcrição Operador Lac Gene LacZ 80 40 1 40 80 Pares de nucleotídeos ÓPERON DESLIGADO RNApolimerase ÓPERON DESLIGADO ÓPERON DESLIGADO ÓPERON LIGADO mRNA GLICOSE LACTOSE GLICOSE LACTOSE GLICOSE LACTOSE GLICOSE LACTOSE Repressor Lac Repressor Lac CAP AMP cíclico 35 10 CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 383 a glicose ausente a célula executa o programa apropriado nesse caso a transcrição de genes que possibilitam a incorporação e a utilização da lactose Todos os reguladores transcricionais sejam eles repressores ou ativadores devem estar ligados ao DNA para exercerem os seus efeitos Dessa forma cada proteína regulado ra atua seletivamente controlando somente aqueles genes que apresentem uma sequên cia reguladora cisatuante de DNA reconhecida por ela A lógica do óperon Lac atraiu pela primeira vez a atenção dos biólogos há mais de 50 anos A forma como ele funciona foi revelada por meio de uma combinação de genética e bioquímica fornecendo algumas das primeiras percepções de como a transcrição é controlada em qualquer organismo A formação de alças no DNA pode ocorrer durante a regulação gênica bacteriana Vimos que ativadores transcricionais auxiliam a RNApolimerase a iniciar a transcrição enquanto repressores a impedem de fazêlo Entretanto os dois tipos de proteínas são muito similares Por exemplo a fim de ocupar suas sequências reguladoras cisatuantes tanto o repressor triptofano quanto a proteína ativadora CAP devem ligarse a uma pe quena molécula além disso ambas reconhecem suas sequências reguladoras cisatuan tes usando o mesmo motivo estrutural a hélicevoltahélice mostrada no Painel 71 De fato algumas proteínas p ex a proteína CAP podem atuar tanto como um repres sor quanto como um ativador dependendo da localização exata das suas sequências reguladoras cisatuantes com relação ao promotor para alguns genes a sequência re guladora cisatuante CAP sobrepõe o promotor e a ligação do CAP portanto impede a associação da RNApolimerase com o promotor A maioria das bactérias possui genomas compactos e pequenos e as sequências reguladoras cisatuantes que controlam a transcrição de um gene normalmente são lo calizadas muito próximas ao sítio de início de transcrição Mas existem algumas exce ções a essa generalização sequências reguladoras cisatuantes podem estar localizadas a centenas ou até mesmo milhares de pares de nucleotídeos dos genes bacterianos que elas controlam Figura 716 Nesses casos o DNA interveniente comportase como uma alça que é deslocada para fora permitindo que uma proteína ligada a um sítio distante no DNA entre em contato com a RNApolimerase Nesse caso o DNA atua como uma cor rente aumentando enormemente a probabilidade de que as proteínas venham a colidir quando comparado com a situação na qual uma proteína se encontra ligada ao DNA e a outra livre em solução Veremos em breve que a formação de alças de DNA ainda que seja a exceção em bactérias ocorre na regulação de praticamente qualquer gene eucariótico Uma possível explicação para essa diferença está baseada em considerações evo lutivas Foi proposto que os comutadores genéticos simples e compactos encontrados em bactérias evoluíram em resposta a grandes tamanhos populacionais nos quais a competição por crescimento resultou em pressão seletiva nas bactérias para manter tamanhos de genomas pequenos Em contraste aparentemente houve pouca pressão seletiva para simplificar os genomas de organismos multicelulares Figura 716 Ativação transcricional a distância A A proteína NtrC é um regulador transcricional bacteriano que ativa a transcrição estabelecendo contatos diretos com a RNApolimerase B A inte ração entre NtrC e a RNApolimerase com a alça de DNA intermediária pode ser vista no microscópio eletrônico B cortesia de Harrison Echols e Sydney Kustu NtrC Sequência reguladora cisatuante Promotor RNApolimerase bacteriana Intermediário de ativação contendo alça A B 20 nm GENE LIGADO 384 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Comutadores complexos controlam a transcrição gênica em eucariotos Quando comparada à situação encontrada em bactérias a regulação da transcrição em eucariotos envolve um número muito maior de proteínas e sequências de DNA muito mais longas Frequentemente aparenta ser de uma complexidade desconcertante Ainda assim muitos dos mesmos princípios são igualmente aplicáveis Assim como nas bac térias o momento e o local nos quais cada gene deve ser transcrito é especificado por sequências reguladoras cisatuantes correspondentes que são lidas pelos reguladores transcricionais que se ligam a elas Uma vez ligados ao DNA reguladores transcricionais positivos ativadores auxiliam a RNApolimerase a iniciar a transcrição dos genes e re guladores negativos repressores bloqueiam esse processo Nas bactérias como vimos anteriormente a maior parte das interações entre reguladores transcricionais ligados ao DNA e RNApolimerases independentemente de ativarem ou reprimirem a transcrição são interações diretas Em contrapartida essas interações são quase sempre indiretas em eucariotos muitas proteínas intermediárias incluindo as histonas atuam entre o regula dor transcricional ligado ao DNA e a RNApolimerase Além disso em organismos multi celulares é comum dezenas de reguladores transcricionais controlarem um único gene com sequências reguladoras cisatuantes espalhadas ao longo de dezenas de milhares de pares de nucleotídeos A formação de alças de DNA possibilita que proteínas regulado ras ligadas ao DNA interajam umas com as outras e em última instância com a RNA polimerase no promotor Finalmente como praticamente todo o DNA em organismos eucarióticos se encontra compactado em nucleossomos e estruturas de ordem superior a iniciação da transcrição em eucariotos deve superar esse bloqueio inerente Nas seções seguintes discutiremos essas características da iniciação da transcri ção em eucariotos enfatizando como elas fornecem níveis extras de controle não encon trados em bactérias Uma região de controle gênico eucariótica consiste em um promotor e muitas sequências reguladoras cisatuantes Nos eucariotos a RNApolimerase II transcreve todos os genes codificadores de proteí nas e muitos genes de RNAs não codificadores como visto no Capítulo 6 Essa polime rase requer cinco fatores de transcrição gerais 27 subunidades ao todo ver Tabela 63 p 311 diferentemente da RNApolimerase bacteriana que necessita de apenas um úni co fator de transcrição geral a subunidade s Como vimos o acoplamento em etapas dos fatores de transcrição gerais no promotor eucariótico fornece em princípio múlti plos passos nos quais a célula pode acelerar ou diminuir a taxa de início de transcrição em resposta a reguladores transcricionais Como as muitas sequências reguladoras cisatuantes que controlam a expressão de um gene típico se encontram frequentemente espalhadas ao longo de grandes extensões de DNA usamos o termo região de controle gênico para descrever o conjunto completo de sequências de DNA envolvidas em regular e iniciar a transcrição de um gene eucarió tico Esse termo inclui o promotor onde os fatores de transcrição gerais e a RNApolime rase se associam e todas as sequências reguladoras cisatuantes nas quais reguladores transcricionais ligamse para controlar as taxas dos processos de associação no promotor Figura 717 Em animais e plantas não é raro encontrarmos sequências reguladoras de um gene ao longo de trechos de DNA de até 100 mil pares de nucleotídeos Parte desse DNA é transcrito mas não traduzido sendo que esses RNAs não codificadores longos lncRNAs serão discutidos posteriormente neste capítulo Por agora podemos considerar muito desse DNA como sequências espaçadoras que os reguladores transcricionais não reconhecem diretamente É importante ter em mente que como nas outras regiões dos cromossomos eucarióticos grande parte do DNA nas regiões de controle gênico está em pacotado em nucleossomos e em formas de maior hierarquia na cromatina compactando desse modo o seu tamanho total e alterando as suas propriedades Neste capítulo usaremos mais livremente o termo gene para nos referirmos a um segmento de DNA que é transcrito em uma molécula de RNA funcional uma que co difica uma proteína ou que apresenta uma função diferente na célula ver Tabela 61 p 305 Entretanto a visão clássica de um gene também inclui a região de controle gêni CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 385 co uma vez que mutações nessa região podem produzir um fenótipo alterado O proces samento de RNA alternativo complica ainda mais a definição de um gene um aspecto que será retomado posteriormente Em contrapartida ao pequeno número de fatores gerais de transcrição que são proteínas abundantes que se associam nos promotores de todos os genes transcritos pela RNApolimerase II existem milhares de reguladores da transcrição diferentes de votados a ligar e desligar genes individuais Nos eucariotos óperons conjuntos de ge nes transcritos como uma unidade são raros e em vez disso cada gene é regulado individualmente Não surpreende que a regulação de cada gene seja diferente nos de talhes da que ocorre em qualquer outro gene sendo difícil formular regras simples para a regulação gênica que se apliquem a qualquer caso Podemos entretanto fazer algu mas generalizações a respeito de como os reguladores transcricionais uma vez ligados a regiões de controle gênico no DNA influenciam a série de eventos que levam à ativação ou à repressão gênica Reguladores da transcrição eucarióticos atuam em grupos Em bactérias vimos que proteínas como o repressor triptofano o repressor Lac e a proteína CAP ligamse ao DNA sozinhas e afetam diretamente a atividade da RNApolimerase no promotor Os reguladores transcricionais eucarióticos em contrapartida geralmente se as sociam em grupos nas suas sequências reguladoras cisatuantes Com frequência dois ou mais reguladores ligamse cooperativamente como discutido anteriormente neste capítulo Além disso uma ampla classe de proteínas contendo múltiplas subunidades denominadas coativadores e correpressores associamse ao DNA com os reguladores Normalmente esses coativadores e correpressores não reconhecem por si próprios sequências de DNA específi cas eles são levados a essas sequências pelos reguladores transcricionais Com frequência as interações proteínaproteína entre reguladores transcricionais e entre reguladores e co ativadores são muito fracas para possibilitarem a associação entre eles em solução entre tanto a combinação apropriada de sequências reguladoras cisatuantes pode cristalizar a formação desses complexos no DNA Figura 718 Como seus nomes implicam os coativadores normalmente estão envolvidos em ati var a transcrição e os correpressores em reprimila Nas seções seguintes veremos como coativadores e correpressores podem atuar de diferentes formas para influenciar a trans crição depois de terem sido localizados no genoma pelos reguladores transcricionais Figura 717 A região de controle gênico de um gene eucariótico típico O promotor é a sequência de DNA onde os fatores de transcrição gerais e a polime rase se associam ver Figura 615 As sequências reguladoras cisatuantes são sítios de ligação para reguladores transcricionais cuja presença no DNA afeta a taxa de iniciação da transcrição Essas sequências podem estar localizadas adjacentes ao promotor muito a montan te dele ou mesmo dentro de íntrons ou a jusante do gene As linhas tracejadas do DNA significam que o comprimento do DNA entre as sequências de DNA regula dor cisatuantes e o início da transcrição varia alcançando algumas vezes dezenas de milhares de pares de nucleotídeos em extensão O TATAbox é uma sequência de DNA de reconhecimento para o fator de transcrição geral TFIID Como mos trado no painel inferior a formação das alças de DNA permite que os reguladores transcricionais liguemse em quaisquer dessas posições para interagirem com as proteínas que se associam no promotor Muitos reguladores transcricionais atuam por meio do Mediador descrito no Capítulo 6 enquanto algumas interagem diretamente com os fatores de transcrição gerais e com a RNApolimerase Os regula dores transcricionais também atuam recru tando proteínas que alteram a estrutura da cromatina do promotor não mostrado porém discutido adiante Enquanto o Mediador e os fatores de transcrição gerais são os mesmos para todos os genes transcritos pela RNApoli merase II os reguladores transcricionais e as localizações dos seus sítios de ligação com relação ao promotor diferem para cada gene Região de controle gênico do gene X Transcrito de RNA TATA TATA Promotor DNA espaçador Coativadores Reguladores da transcrição Fatores gerais de transcrição RNApolimerase II Gene X Sequência reguladora cisatuante Gene X Mediador 386 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Como mostrado na Figura 718 um regulador transcricional individual pode com frequência participar de mais de um tipo de complexo regulador Uma proteína pode ria funcionar por exemplo em uma situação como parte de um complexo que ativa a transcrição e em outra situação como parte de um complexo que a reprime Portanto reguladores transcricionais eucarióticos funcionam como partes reguladoras que são usadas para construir complexos cuja função depende da montagem final de todos os componentes individuais Cada gene eucariótico é dessa forma regulado por um co mitê de proteínas que precisam estar presentes para expressarem o gene em seu nível apropriado Proteínas ativadoras promovem a associação da RNApolimerase no sítio de início de transcrição As sequências reguladoras cisatuantes nas quais se ligam proteínas ativadoras da trans crição eucariótica foram originalmente denominadas estimuladores enhancers porque sua presença estimulava a taxa de iniciação da transcrição Foi uma surpresa quando se descobriu que essas sequências poderiam ser encontradas a dezenas de milhares de pares de nucleotídeos de distância do promotor como vimos a formação de uma alça de DNA que não era amplamente reconhecida na época pode agora explicar essa ob servação que foi inicialmente enigmática Uma vez ligados ao DNA como complexos de proteínas ativadoras aumentam a taxa de iniciação da transcrição Na maioria dos genes diferentes mecanismos atuam de modo conjunto Suas funções são tanto atrair e posicionar a RNApolimerase II no promotor quanto liberála de tal forma que a transcrição possa ser iniciada Algumas proteínas ativadoras ligamse em um ou mais dos fatores de transcrição gerais acelerando sua associação em um promotor que foi trazido para a proximidade desse ativador por meio da formação de uma alça de DNA Entretanto a maioria dos ativadores transcricionais atraem coativadores que então desempenham as tarefas bio químicas necessárias para iniciar a transcrição Um dos coativadores mais prevalentes é o grande complexo proteico Mediador composto por mais de 30 subunidades Com um tamanho próximo ao da RNApolimerase o Mediador atua como uma ponte entre ati vadores transcricionais ligados ao DNA RNApolimerase e fatores de transcrição gerais facilitando a associação entre eles no promotor ver Figura 717 Ativadores da transcrição eucarióticos dirigem a modificação da estrutura local da cromatina Os fatores de transcrição gerais eucarióticos e a RNApolimerase não são capazes por si próprios de se associarem a um promotor que esteja empacotado em nucleossomos Portanto além de dirigirem a montagem da maquinaria de transcrição no promotor ati vadores transcricionais eucarióticos promovem a transcrição dando início a mudanças na estrutura da cromatina de promotores fazendo a sequência de DNA associada ficar mais acessível As maneiras mais importantes de alterar localmente a estrutura da cromatina ocorrem por modificações covalentes nas histonas por remodelagem de nucleossomos Figura 718 Reguladores da trans crição eucarióticos associamse em complexos sobre o DNA A Sete regu ladores transcricionais são mostrados A natureza e função do complexo que eles formam depende de sequências regulado ras cisatuantes específicas que dão início à sua formação B Alguns complexos ati vam a transcrição gênica enquanto outros a reprimem Observe que as proteínas em verdeclaro e verdeescuro são comparti lhadas por ambos os complexos ativadores e repressores As proteínas que não se ligam sozinhas ao DNA mas associamse a outros reguladores transcricionais ligados ao DNA são denominadas coativadores ou correpressores Em alguns casos à direita abaixo moléculas de RNA são encontradas nesses complexos Como será descrito posteriormente neste capí tulo esses RNAs frequentemente atuam como suportes para manter um grupo de proteínas unidas A EM SOLUÇÃO B SOBRE O DNA ATIVA A TRANSCRIÇÃO REPRIME A TRANSCRIÇÃO GENE LIGADO GENE DESLIGADO ATIVA A TRANSCRIÇÃO ATIVA A TRANSCRIÇÃO GENE LIGADO GENE LIGADO Coativador Correpressor Coativador Coativador RNA CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 387 por remoção de nucleossomos e por substituição de histonas discutidos no Capítulo 4 Os ativadores transcricionais eucarióticos usam todos esses quatro mecanismos portan to eles atraem coativadores que incluem enzimas modificadoras de histonas complexos de remodelagem da cromatina dependentes de ATP e chaperonas de histonas cada um dos quais podendo alterar a estrutura da cromatina dos promotores Figura 719 Essas alterações locais na estrutura da cromatina fornecem um maior acesso ao DNA faci litando desse modo a montagem dos fatores de transcrição gerais no promotor Além disso algumas modificações de histonas atraem especificamente essas proteínas para o promotor Esses mecanismos com frequência atuam em conjunto durante a iniciação da transcrição Figura 720 Por fim como discutido anteriormente neste capítulo as mudanças locais da cromatina dirigidas por um regulador transcricional podem possibi litar a ligação de reguladores adicionais Pelo uso repetido desse princípio grandes com plexos de proteínas podem ser formados em regiões de controle de genes para regular a transcrição deles As alterações na estrutura da cromatina que ocorrem durante o início da trans crição podem persistir por tempos de duração diferentes Em alguns casos assim que o regulador transcricional dissociase do DNA as modificações na cromatina são re vertidas de forma rápida restaurando o gene para o seu estado de préativação Essa reversão rápida é especialmente importante para os genes que a célula precisa ativar e desativar rapidamente em resposta a sinais externos Em outros casos a estrutura alterada da cromatina persiste mesmo após o regulador transcricional que direcionou o seu estabelecimento ter se dissociado do DNA Em princípio essa memória pode estenderse para a próxima geração celular porque como discutido no Capítulo 4 a estrutura da cromatina pode se autorrenovar ver Figura 444 O fato de que diferentes modificações de histonas persistem por diferentes períodos fornece à célula um meca nismo que torna possível tanto memórias de curta quanto de longa duração de padrões de expressão gênica Um tipo especial de modificação da cromatina ocorre enquanto a RNApolimerase II transcreve ao longo de um gene As histonas localizadas logo à frente da polimerase podem ser acetiladas por enzimas associadas à ela removidas por chaperonas de histo Figura 719 Proteínas ativadoras de transcrição eucarióticas dirigem alte rações locais na estrutura da croma tina Remodelagem dos nucleossomos remoção de nucleossomos substituição de histonas e certos tipos de modificações de histonas favorecem a iniciação da trans crição ver Figura 439 Essas alterações aumentam a acessibilidade do DNA e fa cilitam a ligação da RNApolimerase e dos fatores de transcrição gerais TATA TATA Enzima modificadora de histonas Chaperona de histonas Chaperona de histonas Complexo de remodelagem da cromatina Padrão específico de modificação de histonas Nucleossomos remodelados Regulador transcricional Remoção do nucleossomo TATA Substituição de histonas DESLIZAMENTO DOS NUCLEOSSOMOS POSSIBILITA ACESSO DA MAQUINARIA DE TRANSCRIÇÃO AO DNA MAQUINARIA DE TRANSCRIÇÃO É MONTADA NO DNA LIVRE DE NUCLEOSSOMOS VARIANTES DE HISTONAS POSSIBILITAM UM MAIOR ACESSO AO DNA NUCLEOSSÔMICO PADRÕES ESPECÍFICOS DE MODIFICAÇÃO DE HISTONAS DESESTABILIZAM FORMAS COMPACTADAS DA CROMATINA E ATRAEM COMPONENTES DA MAQUINARIA DE TRANSCRIÇÃO 388 PARTE II Mecanismos genéticos básicos nas e depositadas atrás da polimerase em movimento Então essas histonas são rapida mente desacetiladas e metiladas também por complexos carregados pela polimerase deixando atrás nucleossomos especialmente resistentes à transcrição Esse processo notável parece impedir o suposto reinício da transcrição atrás de uma polimerase em movimento o que em essência deve liberar o caminho através da cromatina confor me ocorre a transcrição Mais adiante neste capítulo quando discutirmos interferência de RNA os perigos potenciais para a célula de tal transcrição inapropriada se tornarão especialmente óbvios A modificação dos nucleossomos atrás de uma RNApolimerase em movimento também desempenha um importante papel no processamento de RNA ver p 323 Ativadores da transcrição podem promover a transcrição liberando a RNApolimerase dos promotores Em alguns casos a iniciação da transcrição requer que um ativador transcricional ligado ao DNA libere a RNApolimerase do promotor permitindo dessa forma que ela inicie a transcrição do gene Em outros casos a RNApolimerase pausa após transcrever cerca de 50 nucleotídeos de RNA e alongamento subsequente da cadeia requer a presença de um ativador transcricional ligado atrás da RNApolimerase Figura 721 Essas polimerases pausadas são comuns em humanos nos quais uma fração significativa dos genes que não estão sendo transcritos possuem uma polimerase pausada localizada a jusante do promotor A liberação da RNApolimerase pode ocorrer de diferentes formas Em alguns ca sos o ativador traz consigo um complexo de remodelagem da cromatina que remove um bloqueio nucleossômico à RNApolimerase em processo de alongamento da transcri ção Em outros casos o ativador se comunica com a RNApolimerase geralmente por intermédio de um coativador sinalizando para que ela siga adiante Por fim como vi mos no Capítulo 6 a RNApolimerase requer fatores de alongamento para efetivamente transcrever através da cromatina Em alguns casos um passochave na ativação gênica é o carregamento desses fatores na RNApolimerase que pode ser direcionado por ativa dores transcricionais ligados ao DNA Uma vez carregados esses fatores possibilitam à polimerase se mover através dos bloqueios impostos pela estrutura da cromatina e ini ciar a transcrição do gene de forma efetiva Ao terse a RNApolimerase já pronta em um promotor nas etapas iniciais da transcrição evitase o passo de montagem de muitos componentes no promotor o que é frequentemente uma etapa lenta Esse mecanismo pode portanto permitir que as células iniciem a transcrição de um gene como uma res posta rápida a um sinal extracelular Ativadores transcricionais atuam sinergicamente Vimos que complexos de ativadores transcricionais e coativadores se associam coo perativamente no DNA Também vimos que esses complexos podem promover dife rentes etapas da iniciação da transcrição Em geral onde diversos fatores atuam jun Figura 720 Modificações sucessivas nas histonas durante a iniciação da transcri ção Neste exemplo retirado do promotor do gene de interferon humano um ativador transcricional ligase ao DNA empacotado na cromatina e atrai a histona acetiltransferase que acetila a lisina9 da histona H3 e a lisina8 da histona H4 Então a histonacinase também atraída pelo ativador transcricional fosforila a serina10 da histona H3 mas ela só pode fazer isso após a lisina9 ter sido acetilada Essa modificação na serina sinaliza a histona acetiltransferase a acetilar a posição K14 da histona H3 Em sequência o fator de transcrição geral TFIID e o complexo de remodelagem da cromatina ligamse à cromatina e promovem os passos subsequentes da iniciação da transcrição TFIID e o complexo de remodelagem reconhecem as caudas acetiladas da histona por meio de um bromodomí nio um domínio proteico especializado em ler essa marcação particular nas histonas um bromodomínio é portado por uma subunidade de cada complexo proteico A histona acetiltransferase a histonacinase e o complexo de remodelagem da cro matina são todos coativadores A ordem dos eventos mostrada se aplica a um promotor específico em outros genes os passos podem ocorrer em uma ordem diferente ou pas sos individuais podem ser omitidos completamente Adaptada de T Agalioti G Chen e D Thanos Cell 111381392 2002 Com permissão de Elsevier Histona acetil transferase Histona acetiltransferase coativador Histona cinase Histona cinase coativador H3K9 H3K9 H4K8 H4K8 H3K14 H3K14 H3S10 H3S10 TATA Ativador transcricional TATA Proteína ativadora da transcrição TFIID Complexo de remodelagem da cromatina Complexo de remode lagem da cromatina coativador TFIID MONTAGEM DO RESTANTE DA MAQUINARIA DE TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO P P P P P P CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 389 tos na estimulação de uma taxa de reação o efeito conjunto não é somente a soma das estimulações causadas por cada fator isolado mas o seu produto Se por exemplo o fator A diminui em determinado grau a barreira de energia livre para uma reação e dessa maneira acelera a reação 100 vezes e o fator B que atua em outro aspecto da reação faz algo semelhante então A e B atuando em paralelo irão diminuir a barreira em um grau duplicado acelerando a reação 10 mil vezes Mesmo que A e B simples mente auxiliem na atração da mesma proteína a afinidade daquela proteína para o sítio de reação aumenta de forma multiplicada Portanto ativadores transcricionais frequentemente exibem sinergia transcricional no qual várias proteínas ativadoras ligadas ao DNA atuando em conjunto produzem uma taxa de transcrição muito su perior à soma das taxas de transcrição alcançadas quando atuam individualmente Figura 722 Um aspecto importante é que uma proteína ativadora da transcrição deve estar ligada ao DNA para influenciar a transcrição do seu genealvo E a taxa de transcrição de um gene em última análise depende do espectro de proteínas reguladoras ligadas a montante e a jusante do seu sítio de início de transcrição juntamente com proteínas coativadoras que elas trazem para o DNA Figura 721 Ativadores transcricionais podem atuar em diferentes etapas Além de promoverem A a ligação de reguladores transcricionais adicionais e B a associação da RNApolimerase nos promotores os ativadores transcricionais são frequentemente necessários C para liberar RNApolimerases já associadas ao promotor ou D para liberar moléculas de RNApolimerase que ficaram paralisadas após transcrever cerca de 50 nucleotídeos de RNA As atividades mostradas na Figura 719 podem afetar cada uma dessas qua tro etapas Ativador transcricional Promotor A PROMOVE A LIGAÇÃO DE REGULADORES ADICIONAIS B RECRUTA A RNAPOLIMERASE PARA O PROMOTOR C LIBERA A RNAPOLIMERASE PARA INICIAR A TRANSCRIÇÃO D LIBERA A RNAPOLIMERASE DE UMA PAUSA Figura 722 Sinergia transcricional Este experimento compara a taxa de transcrição produzida por três regiões re guladoras construídas experimentalmente em uma célula eucariótica e revela a siner gia transcricional um efeito maior que o somatório dos múltiplos ativadores juntos Por simplicidade coativadores foram omi tidos do diagrama Essa sinergia transcricional não é observada somente entre diferentes ativadores transcricionais do mesmo orga nismo ela também é vista entre proteínas ativadoras de diferentes espécies eucarió ticas quando elas são experimentalmente introduzidas dentro da mesma célula Essa última observação reflete o alto grau de conservação da maquinaria responsável pela iniciação da transcrição eucariótica AUSÊNCIA DE TRANSCRIÇÃO 1 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO 2 UNIDADES DE TRANSCRIÇÃO 100 UNIDADES DE TRANSCRIÇÃO TATA 390 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Repressores transcricionais eucarióticos podem inibir a transcrição de diferentes formas Ainda que o estado padrão do DNA eucariótico empacotado em nucleossomos seja resis tente à transcrição eucariotos usam reguladores transcricionais para reprimir a transcrição de genes Esses repressores transcricionais podem diminuir a taxa de transcrição abaixo do valor padrão e rapidamente desligar genes que estavam previamente ativados Vimos no Capítulo 4 que grandes regiões do genoma podem ser silenciadas pelo empacotamento do DNA em formas de cromatina especialmente resistentes Entretanto genes eucarióticos estão raramente organizados no genoma de acordo com a função e essa estratégia não é geralmente aplicável para desligar um conjunto de genes que atuam em conjunto Em vez disso a maior parte dos repressores eucarióticos age gene a gene Ao contrário dos repres sores bacterianos eles não competem diretamente com a RNApolimerase pelo acesso ao DNA eles atuam por vários outros mecanismos alguns dos quais estão ilustrados na Figu ra 723 Ainda que todos esses mecanismos em última instância bloqueiem a transcrição pela RNApolimerase repressores transcricionais eucarióticos normalmente atuam trazen do correpressores para o DNA Assim como no caso da ativação transcricional a repressão da transcrição pode atuar por meio de mais de um mecanismo em um dado genealvo garantindo desse modo uma repressão especialmente eficiente A repressão gênica é especialmente importante para animais e plantas cujo cresci mento depende de programas de desenvolvimento elaborados e complexos A expressão alterada de um único gene em uma etapa crítica pode resultar em consequências de sastrosas para o indivíduo Por essa razão muitos dos genes que codificam as proteínas reguladoras do desenvolvimento mais importantes são mantidos fortemente reprimidos quando as proteínas não são necessárias TFIID TATA Sítio de ligação para o repressor Sítio de ligação para o ativador TATA Ativador Repressor Superfície de ativação Sítio de ligação para o repressor Sítio de ligação para o ativador Sítio de ligação para o ativador Sítio de ligação para o repressor Ligação competitiva ao DNA Mascaramento da superfície de ativação Interação direta com fatores gerais de transcrição A B C TATA Recrutamento de complexos de remodelagem da cromatina Complexo de remodelagem da cromatina D Acetilação de histonas Nucleossomos remodelados Recrutamento de histonas desacetilase E TATA Histona desacetilase Recrutamento de histonas metiltransferase F Histona metiltransferase Proteínas que se ligam a histonas metiladas Metilação de histonas Figura 723 Seis formas pelas quais proteínas repressoras eucarióticas podem operar A As proteínas de ativação e as proteínas de repressão compe tem pela ligação às mesmas sequências reguladoras de DNA B Ambas as proteínas se ligam ao DNA mas o repressor impede o ativador de desempenhar suas funções C O repressor bloqueia a montagem dos fatores gerais de transcrição D O repressor recruta um complexo de remodelagem da cromatina o qual retorna o estado nucleossômico da região do promotor para a sua forma prétranscricional E O repressor atrai a histona desacetilase para o promotor Como vimos a acetilação de histonas pode estimular o início da transcrição ver Figura 720 e o repressor simplesmente reverte essa modificação F O repressor atrai a histona metiltransferase que modifica certas posições nas histonas adicionando grupos metila as histonas metiladas por sua vez são ligadas por proteínas que mantêm a cromatina em uma forma transcricionalmente silenciosa 392 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Embora os cromossomos estejam organizados em domínios ordenados que de sencorajam as regiões controladoras de atuarem indiscriminadamente existem cir cunstâncias especiais em que se verificou que uma região controladora localizada em um cromossomo ativa um gene localizado em um cromossomo diferente Embora haja pouca compreensão a respeito desse mecanismo ele indica a extrema versatilidade das estratégias de regulação transcricional Resumo A transcrição de genes individuais é ativada e desativada nas células por reguladores transcricionais Nos procariotos essas proteínas normalmente ligamse a sequências de DNA específicas próximas do sítio de início da RNApolimerase e dependendo da nature za da proteína reguladora e da localização precisa do seu sítio de ligação em relação ao sítio de início pode tanto ativar como reprimir a transcrição do gene A flexibilidade da hélice do DNA entretanto também permite que proteínas ligadas em sítios distantes afe tem a RNApolimerase no promotor pela curvatura do DNA intermediário A regulação de genes de eucariotos superiores é muito mais complexa condizente com um tamanho de genoma maior e com a grande variedade de tipos celulares que é formada Um único gene eucariótico normalmente é controlado por muitos reguladores transcricionais liga dos a sequências que podem estar localizadas a dezenas ou até a centenas de milhares de pares de nucleotídeos do promotor que direciona a transcrição do gene Os ativadores e os repressores eucarióticos atuam por meio de vários mecanismos geralmente alterando a estrutura local da cromatina e controlando a associação dos fatores gerais de transcrição e da RNApolimerase no promotor Eles fazem isso atraindo coativadores e correpressores complexos proteicos que desempenham as reações bioquímicas necessárias O momento e o local no qual cada gene é transcrito assim como suas taxas de transcrição sob diferentes condições são determinadas por um conjunto particular de reguladores transcricionais que se ligam à região reguladora do gene MECANISMOS GENÉTICOMOLECULARES QUE CRIAM E MANTÊM TIPOS CELULARES ESPECIALIZADOS Embora todas as células devam ser capazes de ativar e desativar seus genes em resposta às mudanças em seus ambientes as células dos organismos multicelulares desenvolve ram essa capacidade em um grau extremo Em particular uma vez que uma célula em um organismo celular tornase comprometida a diferenciarse em um tipo celular espe cífico a célula mantém essa escolha por muitas gerações celulares subsequentes signi ficando que ela se lembra das mudanças na expressão gênica envolvidas nessa escolha Esse fenômeno de memória celular é um prérequisito para a criação de tecidos organi zados e para a manutenção de tipos celulares estavelmente diferenciados Em contraste outras mudanças na expressão gênica em eucariotos assim como a maioria dessas mu danças em bactérias são apenas transitórias O repressor do triptofano por exemplo de sativa os genes do triptofano nas bactérias somente na presença de triptofano assim que ele é removido do meio os genes são novamente ativados e os descendentes da célula não terão registro de que os seus ancestrais foram expostos ao triptofano Nesta seção não examinaremos somente os mecanismos celulares de memória mas também como os mecanismos de regulação gênica podem ser combinados para criar os circuitos lógicos pelos quais as células integram sinais e relembram eventos de seu passado Iniciaremos considerando em detalhes uma dessas complexas regiões de controle gênico Os comutadores genéticos complexos que regulam o desenvolvimento na Drosophila são formados a partir de moléculas menores Vimos anteriormente que reguladores transcricionais podem ser posicionados em múl tiplos sítios ao longo de vastos segmentos de DNA e que essas proteínas podem pôr em cena coativadores e correpressores Discutiremos agora como numerosos reguladores CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 393 transcricionais que estão ligados à região controladora de um gene podem fazer o gene ser transcrito no local e momento corretos Considere o gene da Drosophila Evenskipped Eve cuja expressão desempenha um papel importante no desenvolvimento do embrião de Drosophila Se esse gene for inativado por mutação muitas partes do embrião não se formam e ele morre em uma etapa precoce de seu desenvolvimento Como discutido no Capítulo 21 no estágio do desenvolvimento no qual Eve começa a ser expresso o embrião é uma única célula gi gante contendo múltiplos núcleos em um citoplasma comum Esse citoplasma contém uma mistura de reguladores transcricionais que estão distribuídos de forma desigual ao longo da extensão do embrião fornecendo uma informação posicional que distingue uma parte do embrião da outra Figura 726 Embora os núcleos sejam inicialmente idênticos eles rapidamente iniciam a expressão de genes diferentes pois são expostos a diferentes reguladores transcricionais Por exemplo os núcleos próximos da extremi dade anterior do embrião em desenvolvimento estão expostos a um conjunto de regu ladores transcricionais distinto do conjunto que influencia os núcleos do meio ou da extremidade posterior do embrião As sequências de DNA regulador que controlam o gene Eve evoluíram para ler as concentrações de reguladores transcricionais em cada posição ao longo da extensão do embrião e elas fazem o gene Eve ser expresso em sete listras precisamente posicionadas cada uma contendo inicialmente de 5 a 6 núcleos de largura Figura 727 Como esse feito notável de processamento de informação é realizado Embora ainda exista muito a aprender vários princípios gerais emergiram de estudos com Eve e com outros genes que são regulados de maneira semelhante A região reguladora do gene Eve é muito grande aproximadamente 20 mil pares de nucleotídeos Ela é formada por uma série de módulos reguladores relativamente simples cada qual contendo múltiplas sequências reguladoras cisatuantes e sendo res ponsável por especificar uma listra particular da expressão de Eve ao longo do embrião Essa organização modular da região de controle do gene Eve foi mostrada por experi mentos nos quais um módulo regulador particular digamos o que especifica a listra 2 é removido do seu conjunto normal na região a montante do gene Eve colocado à frente de um generepórter e reintroduzido no genoma da Drosophila Quando são examina dos os embriões em desenvolvimento derivados de moscas que carregam essa constru ção genética o generepórter é encontrado sendo expresso precisamente na posição da listra 2 Figura 728 Experimentos similares revelaram a existência de outros módulos reguladores cada um dos quais especificando outras listras Figura 726 Distribuição não uniforme de quatro reguladores transcricionais em um embrião jovem de Drosophila Nesse estágio o embrião é um sincício isto é múltiplos núcleos estão contidos em um citoplasma comum Embora não esteja ilustrado nestas representações todas essas proteínas estão concentradas no nú cleo Será discutido no Capítulo 21 como tais diferenças são estabelecidas Anterior Posterior Bicoid Giant Krüppel Hunchback Figura 727 As sete listras da proteína codificada pelo gene Evenskipped Eve em um embrião de Drosophila em desenvolvimento Após 25 horas da fertiliza ção o ovo foi fixado e corado com anticorpos que reconhecem a proteína Eve verde e anticorpos que reconhecem a proteína Giant vermelha Onde ambas as proteínas estão presentes a coloração aparece amarela Nessa etapa do desenvolvimento o ovo contém aproximadamente 4 mil núcleos As proteínas Eve e Giant estão ambas localizadas no núcleo e as listras de Eve apresentam cerca de quatro núcleos de largura O padrão da proteína Giant também é mostrado na Figura 726 Cortesia de Michael Levine 394 PARTE II Mecanismos genéticos básicos O gene Eve da Drosophila é regulado por controles combinatórios Um estudo detalhado do módulo regulador da listra 2 forneceu informações sobre como ele lê e interpreta a informação posicional O módulo contém sequências de reconheci mento para dois reguladores transcricionais Bicoid e Hunchback que ativam a trans crição de Eve e dois Krüppel e Giant que reprimem Figura 729 As concentrações relativas dessas quatro proteínas determinam se os complexos proteicos que são forma dos no módulo da listra 2 ativam a transcrição do gene Eve A Figura 730 mostra as dis tribuições dos quatro reguladores transcricionais ao longo da região do embrião de Dro sophila onde se forma a listra 2 Acreditase que ambas as proteínas repressoras quando ligadas ao DNA desliguem o módulo da listra 2 enquanto ambas as proteínas Bicoid e Hunchback devem se ligar para uma máxima ativação desse módulo Esse esquema simples de regulação é suficiente para ligar o módulo da listra 2 e portanto a expressão do gene Eve somente naqueles núcleos onde os níveis de Bicoid e Hunchback são altos e tanto Krüppel quanto Giant estão ausentes uma combinação que ocorre em somente uma região do embrião inicial Não se sabe exatamente como esses quatro reguladores transcricionais interagem com coativadores e correpressores para especificar o nível fi nal de transcrição ao longo da listra mas o resultado muito provavelmente depende de uma competição entre ativadores e repressores que atuam pelos mecanismos esboçados nas Figuras 717 719 e 723 O elemento da listra 2 é autônomo na medida em que ele especifica a listra 2 quan do isolado do seu contexto normal ver Figura 728 Acreditase que os outros módulos reguladores de listras sejam construídos de forma similar lendo informação posicional fornecida por outras combinações de reguladores transcricionais A região de controle do gene Eve inteira se liga a mais de 20 reguladores transcricionais diferentes Sete com binações de reguladores uma combinação para cada listra especifica a expressão de Eve enquanto muitas outras combinações todas aquelas encontradas nas regiões inter listras do embrião mantêm os elementos das listras silenciados Uma região controlado D C A B TATA box Gene Eve TATA box Gene LacZ Segmento regulador da listra 2 Segmentos reguladores de Eve Segmento regulador da listra 2 EXCISA INSERE DNA NORMAL DNA DE FUSÃO REPÓRTER Início da transcrição Início da transcrição Figura 728 Experimento demonstrando a construção modular da região reguladora do gene Eve A Uma seção de 480 pares de nucleotídeos da região reguladora de Eve foi removido e B inserido a montante de um promotorteste que direciona a síntese da enzi ma bgalactosidase o produto do gene LacZ de E coli ver Figura 715 C D Quando essa construção artificial foi reintroduzida no ge noma dos embriões de Drosophila os embriões D expressaram bgalactosidase detectável por coloração histoquímica precisamente na posição da segunda das sete listras de Eve C bGalactosidase é simples de ser detectada e portanto fornece uma forma conveniente de monitorar a expressão especificada por uma região de controle gênico Como usado nesse caso bgalactosidase serve como um repórter uma vez que ela reporta a atividade de uma região de controle gênico C e D cortesia de Stephen Small e Michael Levine Figura 729 A unidade da listra 2 de Eve O segmento da região controle do gene Eve identificada na Figura 728 con tém sequências reguladoras cisatuantes para quatro reguladores transcricionais Sabese a partir de experimentos genéti cos que essas quatro proteínas de regula ção gênica são responsáveis pela expres são correta de Eve na listra 2 As moscas que são deficientes nos dois ativadores gênicos Bicoid e Hunchback por exemplo falham em expressar de maneira eficiente Eve na listra 2 Em moscas deficientes em qualquer dos dois repressores gênicos Giant e Krüppel a listra 2 expandese e cobre uma região anormalmente ampla do embrião Como indicado em alguns casos os sítios de ligação para os regula dores transcricionais superpõemse e as proteínas podem competir pela ligação ao DNA Por exemplo a ligação de Krüppel e a ligação de Bicoid no sítio extremo direito são mutuamente exclusivas Bicoid Hunchback Ativadores transcricionais Repressores transcricionais Giant Krüppel Segmento de DNA regulador da listra 2 CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 395 ra complexa e grande é portanto construída a partir de uma série de módulos menores cada um dos quais consistindo de um arranjo particular de pequenas sequências regula doras cisatuantes reconhecidas por reguladores transcricionais específicos O próprio gene Eve codifica um regulador transcricional o qual após seu padrão de expressão estar distribuído nas sete listras controla a expressão de outros genes de Drosophila Conforme o desenvolvimento continua o embrião é subdividido em regiões cada vez mais finas que eventualmente originarão as diferentes partes do corpo de uma mosca adulta como discutido no Capítulo 21 Eve exemplifica as complexas regiões controladoras encontradas em plantas e ani mais Como mostra esse exemplo regiões controladoras podem responder a muitos es tímulos de entrada diferentes integrar essa informação e produzir uma saída temporal e espacial complexa à medida que o desenvolvimento prossegue Entretanto entendemos somente em seus esboços gerais como exatamente todos esses mecanismos atuam em conjunto para produzir a saída final Figura 731 Reguladores da transcrição são postos em cena por sinais extracelulares O exemplo anterior da Drosophila ilustra claramente o poder do controle combinatório mas esse caso não é comum no sentido de que os núcleos são expostos diretamente a pis tas posicionais na forma de concentrações de reguladores transcricionais Nos embriões da maioria dos outros organismos e em todos os adultos núcleos individuais estão loca lizados em células separadas e a informação extracelular incluindo pistas posicionais devem ser transmitidas através da membrana plasmática de tal forma a gerar sinais no citosol que resultem em diferentes reguladores transcricionais se tornando ativos em di ferentes tipos celulares Alguns dos diferentes mecanismos que sabemos serem usados para ativar os reguladores transcricionais estão esquematizados na Figura 732 e no Capítulo 15 discutiremos como sinais extracelulares disparam essas mudanças Figura 730 Distribuição dos regulado res da transcrição responsáveis por ga rantir que Eve seja expresso na listra 2 As distribuições dessas proteínas foram visualizadas pela coloração de um embrião em desenvolvimento de Drosophila com anticorpos direcionados contra cada umas das quatro proteínas A expressão de Eve na listra 2 ocorre somente na posição onde os dois ativadores Bicoid e Hunchback estão presentes e os dois repressores Giant e Krüppel estão ausentes Nos embriões de moscas que não possuem Krüppel por exemplo a listra 2 expandese na porção posterior Da mesma forma a listra 2 expandese posteriormente se os sí tios de ligação a DNA para Krüppel no mó dulo da listra 2 são inativados por mutação ver também Figuras 726 e 727 Concentração do regulador da transcrição Listra 2 de Eve formase aqui Posterior Anterior Posição ao longo do embrião Giant Bicoid Hunchback Krüppel Figura 731 Integração de múltiplas informações em um promotor Múltiplos conjuntos de reguladores trans cricionais coativadores e correpressores podem atuar conjuntamente para influen ciar a iniciação da transcrição no promo tor como o fazem no módulo da listra 2 de Eve ilustrado na Figura 729 Ainda não se sabe em detalhes como a integração dos múltiplos componentes é conseguida porém é provável que a atividade transcri cional final do gene resulte da competição entre ativadores e repressores que atuam por mecanismos resumidos nas Figuras 717 719 e 723 TATA Complexo ativador de forte atividade Complexo de proteínas reguladoras neutras Proteína inibidora de forte atividade Complexo de proteínas ativadoras de fraca atividade PROBABILIDADE DE INICIAR A TRANSCRIÇÃO DNA espaçador 396 PARTE II Mecanismos genéticos básicos O controle gênico combinatório cria muitos tipos celulares diferentes Vimos que reguladores transcricionais podem agir em combinação para controlar a expressão de um gene individual Geralmente também é verdade que cada regulador transcricional em um organismo contribui para o controle de muitos genes Esse aspecto é ilustrado de forma esquemática na Figura 733 que mostra como o controle gênico combinatório torna possível gerar uma grande parte da complexidade biológica mesmo com relativamente poucos reguladores transcricionais Devido ao controle combinatório um determinado regulador transcricional não tem necessariamente uma única função simples e definível como comandante de uma bateria particular de genes ou como especificador de um determinado tipo celular Em vez disso os reguladores transcricionais podem ser comparados às palavras de uma linguagem eles podem ser usados com diferentes significados em uma grande varieda de de contextos e raramente são utilizados sozinhos é a combinação bem escolhida que transmite a informação que especifica um evento gênico regulador O controle gênico combinatório faz o efeito de adicionar um novo regulador trans cricional em uma célula depender da história passada dessa célula uma vez que é essa história que determina quais reguladores transcricionais já estarão presentes Desse modo durante o desenvolvimento uma célula pode acumular uma série de reguladores transcricionais que inicialmente não precisam alterar a expressão gênica A adição dos membros finais da combinação necessária de reguladores transcricionais completará a mensagem reguladora podendo levar a grandes alterações na expressão gênica A importância de combinações de reguladores transcricionais para a especificação de tipos celulares é mais facilmente demonstrada pela habilidade dos mesmos quando expressos artificialmente de converter um tipo celular em outro Dessa forma a ex pressão artificial de três reguladores transcricionais específicos de neurônios em células hepáticas pode converter essas células hepáticas em células nervosas funcionais Figura 734 Em alguns casos a expressão de até mesmo um único regulador transcricional é suficiente para converter um tipo celular em outro Por exemplo quando o gene que co difica o regulador transcricional MyoD é introduzido artificialmente em fibroblastos cul tivados a partir de tecido conectivo de pele os fibroblastos formam células semelhantes a células musculares Como discutido no Capítulo 22 fibroblastos que são derivados da Figura 732 Algumas formas pelas quais a atividade de reguladores trans cricionais é controlada dentro das cé lulas eucarióticas A A proteína é sinte tizada somente quando necessário sendo rapidamente degradada por proteólise de maneira que ela não é acumulada B Ativação pela ligação de um ligante C Ativação por modificação covalente A fosforilação é indicada aqui mas muitas outras modificações são possíveis ver Tabela 33 p 165 D Formação de um complexo entre a proteína de ligação ao DNA e uma proteína separada com um domínio ativador de transcrição E Exposição de um domínio de ativa ção pela fosforilação de uma proteína inibitória F Estimulação para a entrada no núcleo por meio da remoção de uma proteína inibitória que de outra maneira impediria a proteína reguladora de entrar no núcleo G Liberação de um regulador transcricional associado à bicamada lipídi ca por proteólise regulada Núcleo SÍNTESE PROTEICA LIGAÇÃO AO LIGANTE MODIFICAÇÃO COVALENTE ADIÇÃO DE UMA SEGUNDA SUBUNIDADE DESMASCARAMENTO ESTÍMULO PARA ENTRADA NO NÚCLEO LIBERAÇÃO DA MEMBRANA ATIVO INATIVO ATIVO INATIVO F G E D C B A Subunidade de ligação ao DNA Subunidade ativadora Inibidor Proteína inibidora P P 398 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Tipos celulares especializados podem ser reprogramados experimentalmente para se tornarem célulastronco pluripotentes A manipulação de reguladores transcricionais pode também induzir várias células di ferenciadas a se desdiferenciar em célulastronco pluripotentes que são capazes de ori ginar diferentes tipos celulares no corpo de forma muito semelhante às célulastronco embrionárias ES discutidas no Capítulo 22 Quando três reguladores transcricionais específicos são artificialmente expressos em fibroblastos de camundongos cultivados uma série de células se tornam célulastronco pluripotentes induzidas células iPS células que se assemelham e se comportam como células ES pluripotentes que são derivadas de embriões Figura 736 Essa estratégia tem sido adaptada para produzir células iPS a partir de uma variedade de tipos celulares especializados incluindo células obtidas de humanos Tais células iPS humanas podem ser direcionadas para gerar uma população de células diferenciadas para uso no estudo ou no tratamento de doenças com discutiremos no Capítulo 22 Ainda que já se tenha pensado que a diferenciação celular fosse irreversível sa bese hoje que por meio da manipulação de combinações de reguladores mestres da transcrição tipos celulares e vias de diferenciação podem ser prontamente alteradas Combinações de reguladores mestres da transcrição especificam tipos celulares por meio do controle da expressão de muitos genes Como vimos na introdução deste capítulo diferentes tipos celulares de organismos mul ticelulares diferem enormemente nas proteínas e RNAs que expressam Por exemplo somente células musculares expressam tipos especiais de actina e miosina que formam o aparato contrátil enquanto células nervosas devem fazer e montar todas as proteínas Figura 735 A expressão do gene Eye less de Drosophila em células precur soras da perna desencadeia o desen volvimento de um olho na perna A Diagramas simplificados mostrando o que ocorre quando uma larva de mosca contém o gene Eyeless expresso normal mente esquerda ou quando um gene Eyeless é adicionalmente expresso de for ma artificial nas células que normalmente dariam origem ao tecido da perna direita B Fotografia de uma perna anormal que contém um olho em localização errada ver também Figura 212 O regulador transcricional foi denominado Eyeless sem olhos porque sua inativação em moscas resulta na perda dos olhos sem alterar outras características B cortesia de Walter Gehring B Grupo de células que dão origem a um olho no adulto Grupo de células que dão origem a uma pata no adulto Mosca normal A Células que expressam o gene Eyeless estão destacadas em vermelho Mosca com gene Eyeless expresso artificialmente em células precursoras da pata Estrutura de olho formada na pata Adulto de Drosophila Larva de Drosophila Figura 736 Uma combinação de re guladores transcricionais pode induzir uma célula diferenciada a se desdife renciar em uma célula pluripotente A expressão artificial de um conjunto de três genes cada um dos quais codificam um regulador transcricional pode repro gramar um fibroblasto a tornarse uma célula pluripotente com propriedades semelhantes a uma célulatronco embrio nária ES Assim como células ES tais célulastronco pluripotentes induzidas iPS podem proliferar indefinidamente em cultura e podem ser estimuladas por moléculas sinalizadoras extracelulares apropriadas para se diferenciar em prati camente qualquer tipo celular encontrado no corpo Os reguladores transcricionais como Oct4 Sox2 e Klf4 são denominados reguladores mestres da transcrição porque sua expressão é suficiente para disparar uma mudança na identidade celular Oct4 Sox2 Klf4 Fibroblasto Célula iPS DIVISÃO CELULAR EM CULTURA CÉLULAS INDUZIDAS A SE DIFERENCIAREM EM CULTURA Célula muscular Adipócito Neurônio GENES QUE CODIFICAM TRÊS REGULADORES TRANSCRICIONAIS INTRODUZIDOS EM NÚCLEOS DE FIBROBLASTOS CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 399 necessárias para formar dendritos e sinapses Vimos que esses padrões de expressão es pecíficos de tipos celulares diferentes são orquestrados por uma combinação de regula dores mestres da transcrição Em muitos casos essas proteínas ligamse diretamente a sequências reguladoras cisatuantes dos genes particulares desse tipo celular Portanto MyoD ligase diretamente a sequências reguladoras cisatuantes localizadas nas regiões controladoras de genes específicos de músculos Em outros casos reguladores mestres controlam a expressão de reguladores transcricionais a jusante que por sua vez ligam se a regiões controladoras de outros genes específicos de um tipo celular e controlam a síntese dos mesmos A especificação de um tipo celular em particular envolve mudanças na expressão de milhares de genes Os genes cujos produtos proteicos são requeridos no tipo celular são expressos em altos níveis enquanto aqueles que não são necessários normalmente são regulados para baixo Como poderia se esperar o padrão de ligação entre os regu ladores mestres e todos os genes regulados pode ser extremamente elaborado Figura 737 Quando consideramos que muitos dos genes regulados possuem regiões contro ladoras que abrangem dezenas de milhares de pares de nucleotídeos proporcionais ao exemplo do gene Eve discutido anteriormente podemos começar a apreciar a enorme complexidade da especificação dos tipos celulares Uma questão de extrema importância na biologia é saber como a informação em um genoma é usada para especificar um organismo multicelular Ainda que tenhamos um esboço geral da resposta estamos longe de entender como um único tipo celular é completamente especificado quanto mais um organismo inteiro Células especializadas devem ativar e inativar conjuntos de genes rapidamente Embora geralmente mantenham suas identidades as células especializadas devem res ponder de forma constante a mudanças no seu ambiente Entre as mudanças mais im portantes estão os sinais de outras células que coordenam o comportamento de todo o organismo Muitos dos sinais induzem mudanças transitórias na transcrição dos genes e discutiremos a natureza desses sinais em detalhes no Capítulo 15 Aqui consideraremos como tipos celulares especializados ativam ou inativam grupos de genes de forma rápida e decisiva em resposta ao seu ambiente Mesmo que o controle da expressão gênica seja combinatório os efeitos de um único regulador transcricional ainda podem ser decisi vos na ativação ou na inativação de um gene particular simplesmente por completar a combinação necessária para maximizar a ativação ou a repressão daquele gene Essa situação é análoga a ajustar o número final do segredo de um cofre o cofre será aberto prontamente se os outros números tiverem sido previamente ajustados Além disso o Figura 737 Uma parte da rede de transcrição que especifica as células tronco embrionárias A Os três regu ladores mestres da transcrição na Figura 736 são mostrados com círculos grandes Os genes cujas sequências reguladoras cisatuantes estejam ligadas por cada regulador nas célulastronco embrionárias estão indicadas por um ponto pequeno representando o gene conectado por uma linha fina representando a reação de ligação Observe que muitos dos genes alvo estão ligados por mais de um dos reguladores B Os reguladores mestres controlam sua própria expressão Como mostrado aqui os três reguladores trans cricionais ligamse às suas próprias regiões controladoras indicadas por ciclos de retroalimentação assim como àquelas de outros reguladores mestres indicado por setas retas Cortesia de Trevor Sor rells baseado nos dados de J Kim et al Cell 13210491061 2008 Klf4 Sox2 Oct4 Klf4 Sox2 Oct4 B A 400 PARTE II Mecanismos genéticos básicos mesmo número pode completar a combinação em diferentes cofres Da mesma forma a adição de uma proteína particular pode ativar muitos genes diferentes Um exemplo é o rápido controle da expressão gênica pela proteína humana recep tora de glicocorticoides Para poder se ligar nas suas sequências reguladoras cisatuantes no genoma esse regulador transcricional primeiro deve formar um complexo com uma molécula de um hormônio glicocorticoide tal como o cortisol ver Figura 1564 Esse hor mônio é liberado no corpo durante horas de fome e de intensa atividade física e entre suas outras atividades ele estimula as células do fígado a aumentarem a produção de glicose a partir de aminoácidos e de outras pequenas moléculas Para responder dessa forma as células hepáticas aumentam a expressão de muitos genes diferentes que codificam enzi mas metabólicas como a tirosina aminotransferase como discutido anteriormente neste capítulo ver Figura 73 Ainda que todos esses genes possuam regiões controladoras di ferentes e complexas sua expressão máxima depende da ligação do complexo formado entre o receptor de glicocorticoide e o hormônio na sequência reguladora cisatuante cor respondente presente na região controladora de cada gene Quando o corpo se recupera e o hormônio não está mais presente a expressão de cada um desses genes diminui para o seu nível normal no fígado Dessa maneira um único regulador transcricional pode con trolar rapidamente a expressão gênica de muitos genes diferentes Figura 738 Os efeitos de um receptor de glicocorticoides não estão confinados às células do fí gado Em outros tipos celulares a ativação desse regulador transcricional por hormônios também promove alterações nos níveis de expressão de muitos genes os genes afetados entretanto normalmente são diferentes daqueles afetados nas células hepáticas Como vimos cada tipo celular possui um conjunto individualizado de reguladores transcricio nais e devido ao controle combinatório esses afetam criticamente a ação do receptor de glicocorticoides Como o receptor é capaz de associarse com muitos conjuntos diferen tes de reguladores transcricionais de tipos celulares específicos ele pode produzir um espectro distinto de efeitos em cada tipo celular Células diferenciadas mantêm sua identidade Uma vez que a célula tenha se diferenciado em um tipo celular em particular ela ge ralmente irá permanecer diferenciada e todas as células da progênie irão permanecer nesse mesmo tipo celular Algumas células altamente especializadas incluindo células musculares esqueléticas e neurônios nunca se dividem novamente uma vez que tenham se diferenciado ou seja são diferenciadas terminalmente como discutido no Capítulo 17 Entretanto muitas outras células diferenciadas como fibroblastos células de mús Figura 738 Um único regulador trans cricional pode coordenar a expressão de vários genes diferentes A ação do receptor de glicocorticoides está ilustrada esquematicamente À esquerda está uma série de genes cada qual possuindo vários reguladores transcricionais ligados a sua região reguladora Entretanto essas pro teínas ligadas não são suficientes para so zinhas ativarem totalmente a transcrição À direita é mostrado o efeito de adicionar um regulador transcricional a mais o re ceptor de glicocorticoide em um complexo com o hormônio glicocorticoide que possui uma sequência reguladora cisatu ante na região controladora de cada gene O receptor de glicocorticoide completa a combinação de reguladores transcricionais necessária à iniciação máxima da transcri ção e os genes são agora ativados como um conjunto Quando o hormônio não está mais presente o receptor de glico corticoide se dissocia do DNA e os genes retornam aos seus níveis antes de serem estimulados Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 1 Gene 2 Gene 3 Hormônio glicocorticoide Receptor de glicocorticoide na ausência do hormônio glicocorticoide GENES EXPRESSOS EM BAIXO NÍVEL GENES EXPRESSOS EM ALTO NÍVEL CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 401 culo liso e células hepáticas irão se dividir muitas vezes durante a vida de um indivíduo Quando elas o fazem esses tipos celulares especializados originam somente células se melhantes a elas mesmas células de músculo liso não dão origem a células hepáticas tampouco células hepáticas originam fibroblastos Para que uma célula proliferativa mantenha sua identidade uma propriedade denominada memória celular os padrões de expressão gênica responsáveis por essa identidade devem ser lembrados e transmitidos para suas célulasfilhas por meio de di visões celulares subsequentes Portanto no modelo discutido na Figura 733 a produção de cada regulador transcricional uma vez iniciada deve ser continuada nas células re sultantes de cada divisão celular Como tal perpetuação é alcançada As células possuem várias formas de garantir que suas célulasfilhas se lembrem do tipo de célula que elas são Uma das formas mais simples e importantes consiste em um ciclo de retroalimentação positiva no qual um regulador mestre da transcrição de um tipo celular ativa a transcrição do seu próprio gene além de ativar a transcrição de outros genes específicos desse tipo celular Cada vez que uma célula se divide o re gulador é distribuído para ambas as célulasfilhas onde ele continua a estimular o ciclo de retroalimentação positiva produzindo mais de si mesmo a cada divisão A retroali mentação positiva é crucial para estabelecer circuitos autossustentáveis de expressão gênica que permitem a uma célula comprometerse a um destino particular e então transmitir essa informação para sua progênie Figura 739 Como previamente mostrado na Figura 737B os reguladores mestres necessários para manter a pluripotência das células iPS ligamse a sequências reguladoras cisatuantes em suas próprias regiões controladoras fornecendo exemplos de ciclos de retroalimenta ção positiva Além disso a maioria desses reguladores de células pluripotentes também ativam a transcrição de outros reguladores mestres resultando em uma série complexa de ciclos de retroalimentação indiretos Por exemplo se A ativa B e B ativa A isso forma um ciclo de retroalimentação positiva na qual A ativa sua própria expressão ainda que indiretamente As séries de ciclos de retroalimentação diretos e indiretos observados no circuito da iPS são típicas de outros circuitos celulares especializados Tal estrutura em rede fortalece a memória celular aumentando a probabilidade de que um padrão particu lar de expressão gênica seja transmitido através de gerações sucessivas Por exemplo se o nível de A cair abaixo de um limiar crítico para estimular sua própria síntese o regulador B pode recuperálo Pela aplicação sucessiva desse mecanismo uma série complexa de ci clos de retroalimentação positiva entre múltiplos reguladores transcricionais pode manter estavelmente um estado diferenciado através de muitas divisões celulares A A A A A A A A SINAL TRANSITÓRIO LIGA A EXPRESSÃO DO GENE A Regulador transcricional A não é produzido porque normalmente ele é requerido para transcrição do seu próprio gene GENE A CONTINUA A SER TRANSCRITO NA AUSÊNCIA DO SINAL INICIAL A A A A Célula parental Gene A MEMÓRIA CELULAR MEMÓRIA CELULAR Células da progênie Figura 739 Um ciclo de retroalimentação positiva pode criar uma memória celular A proteína A é um re gulador mestre da transcrição que ativa a transcrição de seu próprio gene assim como de outros genes específi cos de um tipo celular em particular não mostrado Todos os descendentes da célula original irão dessa maneira lembrarse de que a célula progenitora experimentou um sinal transitório que iniciou a produção da proteína A 402 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Ciclos de retroalimentação positiva formados por reguladores transcricionais são provavelmente a forma mais prevalente de garantir que as célulasfilhas lembrem qual o tipo de células foram predestinadas a ser e elas são encontradas em todas as espécies da Terra Por exemplo muitas bactérias e eucariotos unicelulares formam diferentes ti pos de células e ciclos de retroalimentação positiva estão no cerne dos mecanismos que mantêm seus tipos celulares de muitos ciclos de divisão celular As plantas e os animais também fazem amplo uso de ciclos de retroalimentação transcricionais como discutire mos posteriormente neste capítulo eles possuem mecanismos especializados adicionais para fortalecer ainda mais a memória celular Mas primeiramente iremos considerar como combinações de reguladores transcricionais e sequências reguladoras cisatuantes podem ser combinadas para criar dispositivos de lógica úteis para a célula Circuitos de transcrição permitem que a célula realize operações lógicas Os circuitos de regulação gênica simples podem ser combinados para criar todos os ti pos de mecanismos de controle assim como elementos simples de controle eletrônico em um computador são combinados para produzir diferentes tipos de operações lógi cas complexas Uma análise dos circuitos de regulação gênica revela que certos tipos simples de arranjo denominados motivos de rede são encontrados repetidamente em células de espécies amplamente diferentes Por exemplo ciclos de retroalimentação po sitiva e negativa são especialmente comuns em todas as células Figura 740 Enquanto o primeiro fornece um mecanismo de memória simples o segundo com frequência é usado para manter a expressão do gene próximo ao nívelpadrão apesar das variações nas condições bioquímicas dentro da célula Suponha por exemplo que um repressor transcricional se ligue à região reguladora do seu próprio gene e exerça uma forte re troalimentação negativa de tal forma que a transcrição caia para um nível muito baixo quando a concentração da proteína repressora estiver acima de um nível crítico deter minada pela sua afinidade pelo sítio de ligação ao DNA A concentração da proteína poderá então ser mantida próxima do valor crítico uma vez que qualquer circunstância que cause uma queda abaixo desse valor pode resultar em um aumento acentuado na síntese e qualquer circunstância que resulte em um aumento acima desse valor levará ao desligamento da síntese Tais ajustes irão entretanto levar tempo de maneira que uma alteração abrupta das condições causará uma alteração intensa porém transitória da expressão gênica Se há um atraso no ciclo de retroalimentação o resultado podem ser oscilações espontâneas na expressão do gene ver Figura 1518 Os tipos diferen tes de comportamento produzidos por um ciclo de retroalimentação irão depender dos detalhes do sistema por exemplo quão firmemente o regulador transcricional se liga a sua sequência reguladora cisatuante sua taxa de síntese e sua taxa de decaimento Discutiremos esses aspectos em termos quantitativos e em mais detalhes no Capítulo 8 Com dois ou mais reguladores transcricionais a amplitude possível dos comporta mentos dos circuitos tornase mais complexa Alguns vírus bacterianos contêm um tipo comum de circuito de dois genes que podem alternar entre a expressão de um gene e a de outro Outro arranjo comum de circuito é denominado ciclo de alimentação para a frente tal ciclo pode servir como um filtro respondendo a sinais de entrada que são prolongados mas desconsiderando sinais que são breves Figura 741 Esses vários mo A A A B Ciclo de retroalimentação positiva A A B A B Z A B Z A Ciclo de retroalimentação negativa Dispositivo de flipflop ciclo de retroalimentação positiva indireta Ciclo de alimentação para a frente Figura 740 Tipos comuns de motivos de rede em circuitos transcricionais A e B representam reguladores transcricionais setas indicam controle transcricional positivo enquanto linhas com barras representam controle transcricional negativo Em um ciclo de alimentação para a frente A e B representam reguladores transcricionais que ativam a transcrição do genealvo Z ver também Figura 886 CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 403 tivos de rede assemelhamse a dispositivos lógicos em miniatura e eles podem processar informação de formas surpreendentemente sofisticadas Os tipos simples de dispositivos recentemente ilustrados são encontrados de forma entrelaçada em células eucarióticas criando circuitos extremamente comple xos Figura 742 Cada célula em um organismo multicelular em desenvolvimento é equipada com uma maquinaria de controle similarmente complexa e deve de fato usar seu sistema intrincado de comutadores de transcrição entrelaçados para calcular como ela deve se comportar a cada momento em resposta a muitos estímulos recebi dos no passado e no presente Estamos somente começando a entender como estudar tais redes complexas de controle intracelular De fato sem novas abordagens acopladas com informação quantitativa que seja muito mais precisa e completa do que a disponí vel atualmente será impossível predizer o comportamento de um sistema como aquele mostrado na Figura 742 Como explicado no Capítulo 8 um diagrama de circuito por si só não é suficiente Figura 741 Como uma alça de ali mentação para a frente pode medir a duração de um sinal A Neste exemplo teórico os reguladores transcricionais A e B são ambos necessários para a transcrição de Z e A tornase ativo somente quando um sinal estiver presente B Se o sinal para A é breve A não permanece ativo o suficiente para B acumularse e o gene Z não é transcrito C Se o sinal para A for persistente B acumulase A permanece ativo e Z é transcrito Esse arranjo permite que a célula ignore flutuações rápidas do sinal e responda somente a níveis persis tentes Essa estratégia poderia ser utili zada por exemplo para distinguir entre sinais ocasionais e um sinal verdadeiro O comportamento mostrado aqui foi computado para um conjunto particular de valores em parâmetros descrevendo as pro priedades quantitativas de A B e o produ to de Z assim como as suas sínteses Com valores diferentes para esses parâmetros ciclos de alimentação para a frente podem em princípio desempenhar outras formas de cálculos Muitos ciclos de alimen tação para a frente têm sido descobertos nas células e a análise teórica auxilia os pesquisadores a discernir e subsequen temente testar as diferentes maneiras nas quais eles podem funcionar ver Figura 886 Adaptada de SS ShenOrr et al Nat Genet 316468 2002 Com permis são de Macmillan Publishers Ltd ENTRADA ENTRADA ENTRADA SAÍDA SAÍDA SAÍDA Tempo 1 0 Tempo 1 0 Tempo 1 0 Tempo 1 0 A B C A B Z A B Z Figura 742 Circuito gênico demasia damente complexo que especifica uma parte do embrião em desenvolvimento do ouriçodomar Cada caixa colorida pequena representa um gene diferente Aqueles em amarelo codificam regulado res transcricionais e aqueles em verde e azul codificam proteínas que conferem às células do mesoderma e do endoderma respectivamente as suas características especializadas Os genes ilustrados em cin za estão muito ativos na mãe e fornecem ao ovo os sinais necessários para o seu desenvolvimento apropriado Como na Figura 740 setas mostram exemplos nos quais um regulador transcricional ativa a transcrição de outro gene As linhas que terminam em barras indicam exemplos de repressão gênica De IS Peter e EH Da vidson Nature 474635639 2011 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd SAÍDA DIFERENCIAÇÃO DA ENDODERME MAQUINARIA DE INTERPRETAÇÃO SAÍDA DIFERENCIAÇÃO DA MESODERME SINAIS INICIAIS E MATERNOS 404 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Resumo Os vários tipos de células em animais e em plantas são criados em grande parte por meca nismos que fazem genes diferentes serem transcritos em células diferentes A transcrição de um gene geralmente é controlada por combinações de reguladores transcricionais Cada tipo de célula em um organismo eucarioto superior contém uma combinação específica de reguladores transcricionais que garantem a expressão somente dos genes apropriados para aquele tipo de célula Um dado regulador transcricional pode estar ativo em várias circunstâncias e normalmente estará envolvido na regulação de muitos genes Uma vez que muitas células animais especializadas podem manter suas caracterís ticas específicas por muitos ciclos de divisão celular mesmo quando crescidas em cultura os mecanismos de regulação gênica envolvidos em criálas precisam ser estáveis uma vez estabelecidos e herdáveis quando a célula se divide Essas características dotam a célula com uma memória da sua história de desenvolvimento Os ciclos de retroalimentação po sitiva diretos ou indiretos que possibilitam que os reguladores transcricionais perpetuem a sua própria síntese fornecem o mecanismo mais simples para a memória celular Cir cuitos de transcrição também fornecem à célula meios de realizar outros tipos de opera ções lógicas Os circuitos de transcrição simples combinados em grandes redes reguladoras impulsionam programas altamente sofisticados de desenvolvimento embrionário que irão necessitar de novas abordagens para serem decifrados MECANISMOS QUE REFORÇAM A MEMÓRIA CELULAR EM PLANTAS E ANIMAIS Até agora neste capítulo enfatizamos a regulação da transcrição gênica por proteínas que se associam direta ou indiretamente com DNA Entretanto o próprio DNA pode ser modificado covalentemente e certos tipos de estado da cromatina parecem ser herda dos Nesta seção veremos como esses fenômenos também fornecem oportunidades para a regulação da expressão gênica No final da seção discutiremos como em camun dongos e humanos um cromossomo inteiro pode ser inativado de forma transcricional usando tais mecanismos e como esse estado pode ser mantido através de muitas divi sões celulares Padrões de metilação do DNA podem ser herdados quando as células de vertebrados se dividem Nas células de vertebrados a metilação da citosina fornece um mecanismo pelo qual os padrões de expressão podem ser passados para a progênie celular A forma metilada da citosina 5metilcitosina 5metil C correlacionase à citosina da mesma maneira que a timina correlacionase à uracila e da mesma forma a modificação não produz efeito sobre o pareamento de bases Figura 743 A metilação do DNA vertebrado ocorre nos nucleotídeos de citosina C principalmente na sequência CG que faz o pareamento de bases com a mesma sequência na orientação oposta na outra fita da hélice de DNA Como consequência um mecanismo simples permite a existência de um padrão de me tilação do DNA a ser herdado diretamente pelas fitasfilhas de DNA Uma enzima cha mada de metiltransferase de manutenção atua preferencialmente naquelas sequências CG que estão pareadas com uma sequência CG que já esteja metilada Como resultado o padrão de metilação do DNA da fita de DNA parental serve como molde para a metilação da fitafilha de DNA tornando esse padrão diretamente herdável após a replicação do DNA Figura 744 Ainda que os padrões de metilação do DNA possam ser mantidos em células di ferenciadas pelo mecanismo mostrado na Figura 744 padrões de metilação são dinâ micos durante o desenvolvimento de mamíferos Logo após a fertilização ocorre uma ampla onda de desmetilação do genoma quando a grande maioria dos grupos metil é perdida do DNA Essa desmetilação pode ocorrer tanto pela supressão da atividade das metiltransferases de manutenção do DNA resultando em uma perda passiva de grupos metila durante cada ciclo de replicação do DNA como por uma enzima de desmetilação discutida adiante Posteriormente no desenvolvimento novos padrões de metilação N N 1 2 4 3 5 6 O H H N N N O H H N H3C Metilação Citosina 5metilcitosina H H H Figura 743 A formação de 5metilcitosina ocorre pela metilação de uma base citosina na duplahélice do DNA Em vertebrados esse evento é principalmente confinado a nucleotídeos de citosina C selecionados na sequência CG As sequências CG são algumas vezes denotadas como sequências CpG em que p indica a ligação fosfato para distinguila do par de bases CG Neste capítulo continua remos usando a nomenclatura mais simples CG para indicar esse dinucleotídeo 406 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Durante o curso da evolução mais de três de cada quatro CGs foram perdidos dessa forma deixando os vertebrados com uma considerável deficiência desse dinucleotídeo As sequências CG que permaneceram estão desigualmente distribuídas no genoma elas estão presentes em quantidades dez vezes maiores que a sua densidade média em regiões selecionadas chamadas de ilhas CG que apresentam em média mil pares de nucleotí deos de comprimento O genoma humano contém aproximadamente 20 mil ilhas CG e elas geralmente incluem promotores de genes Por exemplo 60 dos genes codificadores de proteínas possuem promotores embebidos em ilhas CG e elas incluem praticamente todos os promotores dos genes denominados genes de manutenção aqueles que codifi cam muitas proteínas essenciais para a viabilidade celular sendo portanto expressos em praticamente todas as células Figura 746 Em escalas de tempo evolutivas as ilhas CG foram poupadas da taxa de mutação acelerada do conjunto das sequências CG porque elas permaneceram não metiladas na linhagem germinativa Figura 747 As ilhas CG também permanecem não metiladas na maioria dos tecidos somáticos independentemente de os genes associados serem ou não expressos O estado não meti lado é mantido por proteínas ligadoras de DNA sequênciaespecíficas muitas das quais contêm um CG em suas sequências reguladoras cisatuantes Ao se ligarem nessas sequên cias que estão espalhadas através de ilhas CG elas protegem o DNA da ação das metil transferases Essas proteínas também recrutam DNA desmetilases que convertem 5metil C em hidroximetil C que é posteriormente substuído por C seja por meio de reparo de DNA ver Figura 541A ou passivamente por meio de múltiplos passos de replicação do DNA As ilhas CG não metiladas apresentam várias propriedades que as tornam particu Figura 745 Múltiplos mecanismos contribuem para a repressão gênica estável Neste exemplo esquemático as proteínas leitoras e escritoras de histonas discutidas no Capítulo 4 sob a direção de reguladores transcricionais estabele cem uma forma repressora de cromatina Uma DNAmetilase de novo é atraída pela leitora de histonas e metilases próximas às citosinas no DNA as quais são por sua vez ligadas por proteínas de ligação ao DNA metilado Durante a replicação do DNA algumas das histonas modifica das ponto azul serão herdadas por um cromossomofilho algumas pelo outro e em cada filho elas podem induzir a recons trução do mesmo padrão de modificações da cromatina discutido no Capítulo 4 Ao mesmo tempo o mecanismo mos trado na Figura 744 induzirá ambos os cromossomosfilhos a herdarem o mesmo padrão de metilação Nesses casos onde a metilação do DNA estimula a atividade da escritora de histona os dois mecanismos de herança irão se reforçar mutuamente Esse esquema pode explicar a herança pelas célulasfilhas das modificações tanto nas histonas como no DNA Ele também é capaz de explicar a tendência de algumas modificações da cromatina de se espalha rem ao longo do cromossomo ver Figura 444 Regulador transcricional que reprime a expressão gênica Enzima modificadora de histonas escritora Enzima DNA metilase Proteína ligadora de DNA metilado Grupo metila Proteína leitora do código 408 PARTE II Mecanismos genéticos básicos de um gene que de outro modo poderiam ser idênticas Figura 748 Como os genes que sofrem imprinting não são afetados pela onda de desmetilação que ocorre em segui da após a fertilização ver p 404405 esse marcador possibilita que células somáticas relembrem a origem parental de cada uma das duas cópias e como consequência re gulem a sua expressão de forma apropriada Na maioria das situações o imprinting de metilas silencia a expressão de genes próximos Em alguns casos entretanto ele pode ativar a expressão de um gene No caso do Igf2 por exemplo a metilação de um ele mento isolador no cromossomo de origem paterna bloqueia sua função e possibilita que sequências reguladoras cisatuantes distantes ativem a transcrição do gene Igf2 No cro mossomo de origem materna o isolador não é metilado e o gene Igf 2 portanto não é transcrito Figura 749A mRNA mRNA Camundongo fêmea Camundongo macho AMBOS OS PROGENITORES EXPRESSAM O MESMO ALELO DO GENE A Alelo do gene A que sofreu imprinting Alelo do gene A expresso Célula somática Célula somática REMOÇÃO DO IMPRINTING EM CÉLULAS GERMINATIVAS SEGUIDO DE MEIOSE IMPRINTING NA FÊMEA ESTABELECIDO IMPRINTING NO MACHO ESTABELECIDO ÓVULOS ESPERMATOZOIDES Célula somática na progênie Célula somática na progênie PROGÊNIE DIFERE NO ALELO DO GENE A QUE É EXPRESSO mRNA mRNA Cromossomo herdado do pai Figura 748 Imprinting no camundongo A parte superior da figura mostra um par de cromossomos homólogos das células somáticas de dois camundongos adultos um macho e uma fêmea Nesse exemplo ambos os camundongos herdaram o homólogo de cima de seu pai e o homólogo de baixo de sua mãe e a cópia paterna de um gene submetido a imprinting indicado em laranja está metilada o que impede a sua expressão A cópia materna do mesmo gene ama relo é expressa O restante da figura mostra o resultado de um cruzamento entre esses dois camundongos Durante a formação das células germinativas mas antes da meiose os padrões de imprinting genômicos são apagados e então muito depois no desenvolvimento das células germinativas elas são restabeleci das em um padrão sexoespecífico parte do meio da figura Nos óvulos produzidos pelas fêmeas nenhum alelo do gene A está metilado No espermatozoide do macho ambos os alelos do gene A estão metilados São mostrados mais abaixo na figura dois dos possíveis padrões de imprinting herdados pela progênie de camundongos o camundongo à esquerda possui o mesmo padrão de imprinting que seus pais enquanto o camundongo à direita possui o padrão oposto Se os dois alelos do gene A são distintos esses padrões diferentes de imprinting podem causar diferenças fenotípicas na progênie dos camundongos ainda que eles portem exatamente as mesmas sequências de DNA dos dois alelos do gene A O imprinting se constitui em uma exceção importante ao comportamento genético clássico e acreditase que várias centenas de genes de camundongos sejam afetados dessa forma Entretanto a grande maioria dos genes de camun dongo não sofre imprinting e assim as regras da herança mendeliana aplicamse para a maior parte do genoma de camundongos CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 409 Outros casos de imprinting envolvem RNAs não codificadores longos que são de finidos como moléculas de RNA com mais de 200 nucleotídeos de extensão que não co dificam proteínas Discutiremos amplamente os lncRNAs no final deste capítulo no mo mento focaremos no papel de um lncRNA específico no imprinting genômico No caso do gene Kcnq1 que codifica um canal de cálcio dependente de voltagem necessário para a função cardíaca apropriada o lncRNA é produzido a partir do alelo paterno que é não metilado mas não é liberado pela RNApolimerase permanecendo em vez disso no seu sítio de síntese no molde de DNA Esse RNA por sua vez recruta enzimas de modi ficação de histonas e de metilação de DNA que dirigem a formação de cromatina repres siva que silencia o gene codificador de proteína associado ao cromossomo de origem paterna Figura 749B Por outro lado o gene de origem materna é imune a esses efei tos porque a metilação específica presente resultante de imprinting bloqueia a síntese do lncRNA mas permite a transcrição do gene codificador de proteína Assim como o Igf2 a especificidade do imprinting do Kcnq1 é originada de padrões de metilação her dados a diferença reside na forma como esses padrões promovem expressão diferencial do gene que sofre imprinting Por que o imprinting existe é um completo mistério Em vertebrados ele é restrito aos mamíferos placentários e todos os genes que sofrem imprinting estão envolvidos no desenvolvimento fetal Uma ideia é a de que o imprinting reflita um meio termo na bata lha evolutiva entre os machos querendo produzir proles maiores e as fêmeas querendo limitar o tamanho da prole Qualquer que seja o objetivo o imprinting fornece uma evi dência surpreendente de que outras características do DNA além da sua sequência de nucleotídeos podem ser herdadas As grandes alterações cromossômicas na estrutura da cromatina podem ser herdadas Vimos que a metilação do DNA e certos tipos de estrutura da cromatina podem ser her dáveis preservando padrões de expressão gênica através de gerações celulares Talvez o exemplo mais notável desses efeitos ocorra em mamíferos nos quais uma alteração na estrutura da cromatina de um cromossomo inteiro é utilizada para modular os níveis de expressão da maioria dos genes daquele cromossomo Machos e fêmeas diferem em seus cromossomos sexuais As fêmeas possuem dois cro mossomos X enquanto os machos possuem um X e um Y Como resultado as células das fê meas contêm duas vezes mais cópias de genes do cromossomo X do que as células dos ma chos Em mamíferos os cromossomos sexuais X e Y diferem radicalmente em seu conteúdo gênico o cromossomo X é grande e contém mais de mil genes enquanto o cromossomo Y Figura 749 Mecanismos de imprin ting A Nos cromossomos herdados da fêmea uma proteína denominada CTCF ligase a um isolador ver Figura 724 blo queando a comunicação entre sequências reguladoras cisatuantes verde e o gene Igf2 laranja Dessa forma Igf2 não é ex pressa a partir do cromossomo herdado da mãe Devido ao imprinting o isolador pre sente no cromossomo paterno é metilado círculos vermelhos isso inativa o isolador por bloquear a ligação da proteína CTCF e possibilita que sequências reguladoras cisatuantes ativem a transcrição do gene Igf2 Em outros exemplos de imprinting a metilação simplesmente bloqueia a expres são gênica por interferir na ligação de pro teínas necessárias à transcrição dos genes B Imprinting do gene Kcnq1 de camun dongo A síntese do lncRNA a partir do cromossomo materno é bloqueada pela metilação do DNA círculos vermelhos e o gene Kcnq1 é expresso Por outro lado o lncRNA é sintetizado a partir do cromos somo paterno permanecendo no local de síntese e promovendo alterações na estrutura da cromatina que bloqueiam a expressão do gene Kcnq1 Ainda que mos tradas ligandose diretamente ao lncRNA as enzimas modificadoras de histonas são provavelmente recrutadas de forma indire ta por meio de proteínas adicionais Gene Igf2 Sequência reguladora cisatuante Sequência reguladora cisatuante Elemento isolador CTCF Cromossomo de origem materna Cromossomo de origem materna Cromossomo de origem paterna Gene Igf2 Elemento isolador Cromossomo de origem paterna GENE EXPRESSO GENE SILENCIADO Proteína mRNA Gene Kcnq1 RNApolimerase IncRNA Enzimas modificadoras de histonas A B Sítio de início para lncRNA Sítio de início para mRNA 410 PARTE II Mecanismos genéticos básicos é menor e contém menos de cem genes Os mamíferos desenvolveram um mecanismo de compensação de dose para equalizar a dosagem dos produtos gênicos do cromossomo X entre machos e fêmeas A razão correta entre os produtos gênicos do cromossomo X e os dos autossomos cromossomos que não são sexuais é cuidadosamente controlada e mutações que interferem nessa compensação de dose geralmente são letais Os mamíferos realizam a compensação de dose por meio da inativação transcri cional de um dos dois cromossomos X em células somáticas de fêmeas um processo denominado inativação do X Como resultado da inativação do X dois cromossomos X podem coexistir dentro do mesmo núcleo expostos aos mesmos reguladores transcri cionais difusíveis ainda que difiram completamente em sua expressão No início do desenvolvimento de um embrião de uma fêmea quando ele consiste em poucas centenas de células um dos dois cromossomos X em cada célula tornase altamente condensado em um tipo de heterocromatina A escolha inicial sobre qual cro mossomo X inativar o herdado da mãe Xm ou o herdado do pai Xp é feita ao acaso Uma vez que Xp ou Xm tenha sido inativado ele permanece silencioso por todas as di visões celulares daquela célula e da sua progênie indicando que o estado inativado é fielmente mantido por muitos ciclos de replicação do DNA e mitoses Devido ao fato de a inativação do X ocorrer ao acaso e após milhares de células já terem sido formadas no embrião cada fêmea é um mosaico de grupos clonais de células nas quais Xp ou Xm estão silenciosos Figura 750 Esses grupos clonais estão distribuídos em pequenos agrupamentos no animal adulto uma vez que as célulasirmãs tendem a permanecer juntas durante os estágios mais tardios no desenvolvimento Figura 751 Por exemplo a inativação do cromossomo X origina a coloração de pelagem cor de laranja e preta casco de tartaruga em algumas fêmeas de gatos Nessas gatas um cromossomo X porta um gene que produz pelos cor de laranja e outro cromossomo X porta um alelo do mes mo gene que resulta em pelos pretos é a inativação ao acaso do X que produz manchas de células de duas cores distintas Em contraste os gatos machos desse grupo genético Xp Xm Xp Xm Xp Xm CONDENSAÇÃO DE UM CROMOSSOMO X SELECIONADO ALEATORIAMENTE HERANÇA DIRETA DO PADRÃO DE CONDENSAÇÃO CROMOSSÔMICA HERANÇA DIRETA DO PADRÃO DE CONDENSAÇÃO CROMOSSÔMICA Célula no embrião jovem Somente Xm ativo neste clone Somente Xp ativo neste clone Figura 750 Inativação do X A herança clonal em fêmeas de mamíferos de um cromossomo X condensado inativado 412 PARTE II Mecanismos genéticos básicos somo X ou no imprinting e tais diferenças também podem ser transmitidas ao longo de muitas divisões celulares A capacidade de uma célulafilha de reter uma memória de padrões de expressão gênica que estiveram presentes na célula parental é um exemplo de herança epigenética uma alteração herdável no fenótipo de uma célula ou organismo que não resulta de mu danças na sequência de nucleotídeos do DNA discutido no Capítulo 4 Infelizmente o termo epigenética é algumas vezes também usado para se referir a todas as modificações covalentes das histonas e DNA sendo elas autopropagantes ou não muitas dessas modi ficações são apagadas cada vez que uma célula se divide e não geram memória celular Na Figura 753 contrastamos dois mecanismos epigenéticos autopropagantes que atuam em cis afetando somente uma das cópias cromossômicas com dois meca nismos autopropagantes que atuam em trans afetando ambas as cópias cromossômicas de um gene As células podem combinar esses mecanismos para garantir que padrões de expressão gênica sejam mantidos e herdados de forma acurada e segura por um período de até cem anos ou mais no nosso próprio caso Podemos ter uma ideia da prevalência das mudanças epigenéticas comparando gêmeos idênticos Seus genomas têm a mesma sequência de nucleotídeos e obviamente muitas características de gêmeos idênticos como sua aparência são determinadas for temente pelas sequências do genoma que eles herdam Entretanto quando seus padrões de expressão gênica modificação de histonas e metilação de DNA são comparados muitas diferenças são observadas Como essas diferenças de expressão são grosseiramente corre lacionadas não somente com a idade mas também com o tempo com que os gêmeos des penderam longe um do outro foi proposto que algumas dessas diferenças são herdáveis de célula para célula e são o resultado da ação de fatores ambientais Ainda que esses estudos estejam nas etapas iniciais a ideia de que eventos ambientais possam ser permanentemen te registrados como mudanças epigenéticas nas nossas células é fascinante e apresentase como um desafio importante para a próxima geração de cientistas da área biológica Resumo As células eucarióticas podem usar formas herdadas de metilação de DNA e estados her dados de condensação da cromatina como mecanismos adicionais para gerar memória celular de padrões de expressão gênica Um caso especialmente dramático que envolve condensação da cromatina é a inativação de um cromossomo X inteiro em fêmeas de ma míferos A metilação de DNA está por trás do fenômeno de imprinting em mamíferos no qual a expressão de um gene depende de ele ter sido herdado a partir do cromossomo ma terno ou paterno Figura 752 Inativação do cromossomo X de mamíferos A inativação do cromos somo X se inicia com a síntese do RNA Xist transcrito específico de inativação do X do inglês Xinactivation specific transcript a partir do lócus XIC centro de inativação do X do inglês Xinactivation center e se move para fora em direção às extremida des dos cromossomos De acordo com o modelo representado o longo RNA Xist 20000 nucleotídeos possui muitos sí tios de ligação de baixa afinidade por com ponentes estruturais dos cromossomos e se espalha liberando a sua associação em uma porção do cromossomo enquanto prendese em outra A síntese continuada de Xist a partir do centro do cromossomo impulsionao para as extremidades Como mostrado o RNA Xist não se move linear mente ao longo do DNA cromossômico mas em vez disso movese primeiramente através da base das alças cromossômicas Foi proposto que as porções do DNA cromossômico nas extremidades de alças longas contêm os 10 dos genes que es capam da inativação do cromossomo X Cromossomo X materno Cromossomo X paterno Cromossomo X ativo Cromossomo X inativo Centros de inativação do X RNA Xist RNA Xist Gene Xist Alças de cromatina Transcrição do RNA Xist a partir de um cromossomo X RNA Xist ligase a enzimas modificadoras de histonas e continua a se espalhar RNA Xist espalhase de forma escalonada 414 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Um exemplo bem estudado de atenuação da transcrição ocorre durante o ciclo de vida do HIV o vírus da imunodeficiência humana que é o agente causal da síndrome da imunodeficiência adquirida ou Aids Uma vez que o genoma do HIV tenha se inte grado no genoma hospedeiro o DNA viral é transcrito pela RNApolimerase II celular ver Figura 562 Entretanto essa polimerase do hospedeiro normalmente termina a transcrição após sintetizar transcritos de várias centenas de nucleotídeos e assim não consegue transcrever de maneira eficiente o genoma viral inteiro Quando as condições para o crescimento viral são ótimas uma proteína codificada pelo vírus denominada Tat que se liga a uma estrutura específica hastealça no RNA nascente que contém uma base saliente impede a sua terminação prematura ver Figura 689 Uma vez ligada a essa estrutura específica de RNA chamada de TAR a Tat associase a várias proteínas da célula hospedeira que possibilitam que a RNApolimerase continue a transcrever A função normal de pelo menos algumas dessas proteínas celulares é evitar pausas e a terminação prematura da RNApolimerase enquanto ela transcreve genes celulares normais Portanto um mecanismo celular normal foi aparentemente sequestrado pelo HIV para possibilitar que a transcrição do genoma dele seja controlada por uma única proteína viral Ribocontroladores provavelmente representam formas ancestrais de controle gênico No Capítulo 6 discutimos a ideia de que antes das células modernas terem surgido na Terra o RNA desempenhou o papel tanto de DNA quanto de proteínas armazenando a informação hereditária e catalisando reações químicas ver p 362366 A descoberta de ribocontroladores mostra que o RNA também pode formar mecanismos de contro le Os ribocontroladores são sequências curtas de RNA que alteram a sua conformação ligandose a pequenas moléculas como metabólitos Cada ribocontrolador reconhece uma molécula pequena específica e a alteração conformacional resultante é utilizada para regular a expressão gênica Os ribocontroladores estão frequentemente localizados próximos à extremidade 5 dos mRNAs e enovelamse enquanto o mRNA está sendo sin tetizado bloqueando ou permitindo o progresso da RNApolimerase dependendo de a molécula reguladora pequena estar ligada Figura 755 Os ribocontroladores são particularmente comuns em bactérias nas quais eles detectam pequenos metabólitoschave na célula e ajustam a expressão gênica de forma apropriada Talvez as suas características mais surpreendentes sejam a alta especificida de e afinidade com as quais cada um reconhece somente a molécula pequena apropria G G Guanina Terminador transcricional Genes para a biossíntese de purinas DESLIGADOS Genes para a biossíntese de purinas LIGADOS RNApolimerase Ribocontrolador A B C Figura 755 Ribocontrolador que res ponde à guanina A Neste exemplo que ocorre em bactérias o ribocontrolador regula a expressão de genes da biossíntese de purinas Quando os níveis de guanina nas células estão baixos uma RNApolime rase transcreve os genes para a biossíntese de purinas e as enzimas necessárias para a síntese de guanina são desse modo expressas B Quando a guanina está abundante ela ligase ao ribocontrolador induzindoo a sofrer uma alteração con formacional que força a RNApolimerase a terminar a transcrição ver Figura 611 C Guanina vermelho ligada ao ribocon trolador Somente aqueles nucleotídeos que formam a região de ligação à guanina estão mostrados Muitos outros ribocon troladores existem incluindo aqueles que reconhecem a Sadenosilmetionina a coenzima B12 o mononucleotídeo flavina a adenina a lisina e a glicina Adaptada de M Mandal e RR Breaker Nat Rev Mol Cell Biol 5451463 2004 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd e CK Vanderpool e S Gottesman Mol Microbiol 5410761089 2004 Com permissão de Blackwell Publishing 416 PARTE II Mecanismos genéticos básicos genes Esse exemplo também ilustra o perigo de equacionar um número gênico com a complexidade de um organismo Por exemplo o splicing alternativo é raro em leveduras unicelulares que se reproduzem por brotamento mas muito comum em moscas As leve duras que se reproduzem por brotamento possuem 6200 genes dos quais aproximada mente 300 estão sujeitos ao splicing e praticamente todos apresentam apenas um único íntron Dizer que as moscas possuem somente 2 a 3 vezes mais genes que as leveduras é subestimar muito a diferença em termos de complexidade desses dois genomas Em alguns casos o splicing alternativo do RNA ocorre porque há uma ambiguidade na sequência do íntron o mecanismopadrão do spliceossomo para a remoção das se quências intrônicas discutido no Capítulo 6 não é capaz de distinguir completamente entre dois ou mais pareamentos alternativos de sítios de splicing 5 e 3 de maneira que as diferentes escolhas são feitas ao acaso nos diferentes transcritos individuais Onde tal splicing alternativo constitutivo ocorre várias versões da proteína codificada pelo gene são feitas em todas as células nas quais o gene é expresso Em muitos casos entretanto o splicing alternativo do RNA é regulado Nos exem plos mais simples o splicing regulado é usado para alterar a produção de uma proteína não funcional para a produção de uma proteína funcional ou viceversa A transposase que catalisa a transposição do elemento P da Drosophila por exemplo é produzida em uma forma funcional nas células germinativas e em uma forma não funcional nas células somáticas da mosca permitindo ao elemento P espalharse por todo o genoma da mos ca sem causar danos às células somáticas ver Figura 561 A diferença na atividade do transpóson foi explicada pela presença de uma sequência intrônica no RNA da transpo sase que é removida somente nas células germinativas Além de permitir a comutação entre a produção de uma proteína funcional e a produção de uma proteína não funcional ou viceversa a regulação do splicing de RNA pode gerar diferentes versões de uma proteína em diferentes tipos celulares de acordo com as necessidades da célula A tropomiosina por exemplo é produzida em formas es pecializadas em diferentes tipos de células ver Figura 626 As formas de tipos celulares específicos de muitas outras proteínas são produzidas da mesma maneira O splicing do RNA pode ser regulado tanto negativamente por uma molécula que impeça que a maquinaria de splicing tenha acesso a um sítio particular de splicing no RNA como positivamente por uma molécula reguladora que auxilie a direcionar a maquinaria de splicing para outro sítio de splicing que de outra maneira seria ignorado Figura 758 Devido à plasticidade do splicing do RNA o bloqueio de um sítio de splicing forte frequentemente irá expor um sítio fraco e resultará em padrões diferentes de splicing Portanto o splicing de uma molécula de prémRNA pode ser pensado como um balanço delicado entre sítios de splicing competidores um balanço que pode ser facilmente des locado para um lado por meio da ação de proteínas reguladoras sobre o splicing A definição de gene foi modificada desde a descoberta do splicing alternativo do RNA A descoberta de que os genes eucarióticos normalmente contêm íntrons e que suas se quências codificadoras podem ser montadas de mais de uma maneira levantou novas Figura 758 Controles negativo e positivo do splicing alternativo do RNA A No controle negativo uma proteína repressora ligase a uma sequência especí fica do transcrito de prémRNA e bloqueia o acesso da maquinaria de splicing a uma junção de splicing Isso resulta frequen temente no uso de um segundo sítio de splicing produzindo desse modo um pa drão alterado de splicing ver Figura 756 B No controle positivo a maquinaria do splicing não é capaz de remover de maneira eficiente uma sequência intrônica particular sem a assistência de uma proteína ativado ra Como o RNA é flexível as sequências de nucleotídeos que se ligam nesses ativadores podem ser localizados a muitos pares de nucleotídeos de distância das junções de splicing que eles controlam sendo frequen temente denominados estimuladores de splicing em analogia aos estimuladores transcricionais mencionados anteriormente neste capítulo Transcrito de prémRNA Transcrito de prémRNA SPLICING AUSÊNCIA DE SPLICING mRNA mRNA A CONTROLE NEGATIVO B CONTROLE POSITIVO R Repressor AUSÊNCIA DE SPLICING mRNA A Ativador mRNA SPLICING CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 417 questões sobre a definição do gene Um gene foi primeiramente definido em termos mo leculares no começo dos anos de 1940 a partir de trabalhos sobre a genética bioquímica do fungo Neurospora Até então um gene havia sido definido operacionalmente como uma região do genoma que segregava como uma única unidade durante a meiose e dava origem a um traço fenotípico definível como olhos vermelhos ou brancos na Drosophila ou sementes de ervilhas enrugadas ou lisas O trabalho em Neurospora mostrou que a maioria dos genes correspondia a uma região do genoma que direciona a síntese de uma única enzima Isso levou à hipótese de que um gene codificava uma cadeia polipeptídi ca A hipótese provou ser útil para pesquisas subsequentes quanto mais o mecanismo de expressão gênica era entendido nos anos de 1960 mais o gene era identificado como uma região de DNA que era transcrita em RNA codificando uma única cadeia polipeptí dica ou um único RNA estrutural como um tRNA ou uma molécula de rRNA A desco berta dos genes segmentados e dos íntrons no final dos anos de 1970 pode ser pronta mente acomodada segundo a definição original do gene contanto que uma única cadeia polipeptídica fosse especificada pelo RNA transcrito a partir de qualquer sequência de DNA Entretanto atualmente está claro que muitas sequências de DNA em células euca rióticas superiores podem produzir um conjunto de proteínas distintas porém relacio nadas pelo splicing alternativo do RNA Como então um gene pode ser definido Naqueles casos relativamente raros nos quais duas proteínas eucarióticas muito di ferentes são produzidas a partir de uma única unidade de transcrição considerase que as duas proteínas são produzidas por genes distintos que se sobrepõem no cromossomo Parece desnecessariamente complexo entretanto considerar a maioria das variantes pro teicas produzidas pelo splicing alternativo de RNA como derivadas de genes sobrepostos Uma alternativa mais sensata consiste em modificar a definição original para contar uma sequência de DNA que seja transcrita como uma única unidade e codifique um conjunto de cadeias polipeptídicas muito semelhantes isoformas proteicas com um único gene codificador de proteína Essa definição também acomoda aquelas sequências de DNA que codificam variantes proteicas produzidas por processos póstraducionais diferentes do splicing de RNA como clivagem do transcrito e edição de RNA discutido a seguir Uma mudança no sítio de clivagem no transcrito de RNA e de adição de poliA pode alterar a extremidade Cterminal de uma proteína Vimos no Capítulo 6 que a extremidade 3 de uma molécula de mRNA eucariótica não é for mada pela terminação da síntese de RNA pela RNApolimerase como acontece na bactéria Em vez disso ela resulta de uma reação de clivagem do RNA que é catalisada por proteínas adicionais enquanto o transcrito está se alongando ver Figura 634 Uma célula pode controlar o sítio dessa clivagem de maneira a alterar a extremidade Cterminal da proteína resultante Nos casos mais simples uma variante proteica é simplesmente uma versão trun cada de outra em muitos outros casos entretanto os sítios de clivagem e poliadenilação alternativos residem dentro de sequências de íntrons e o padrão de splicing é dessa forma alterado Esse processo pode produzir duas proteínas intimamente relacionadas diferindo somente nas sequências de aminoácidos das suas extremidades Cterminais Uma análise detalhada dos RNAs produzidos pelo genoma humano em uma variedade de tipos celu lares ver Figura 73 indica que até 50 dos genes codificadores de proteínas humanos produzem espécies de mRNA que diferem no seu sítio de poliadenilação Um exemplo bem estudado de poliadenilação regulada é a mudança da síntese de moléculas de anticorpo ligadas à membrana para uma forma secretada durante o desen volvimento dos linfócitos B ver Figura 2422 Muito cedo na história de vida de um lin fócito B o anticorpo que ele produz fica ancorado na membrana plasmática onde serve como um receptor para os antígenos A estimulação por antígenos induz os linfócitos B a se multiplicarem e a começarem a secretar seus anticorpos A forma secretada do anti corpo é idêntica à forma ligada à membrana exceto pela extremidade Cterminal Nessa parte da proteína a forma ligada à membrana possui uma longa cadeia de aminoácidos hidrofóbicos que atravessa a bicamada lipídica da membrana enquanto a forma secre tada possui uma cadeia muito menor de aminoácidos hidrofílicos A mudança da forma ligada à membrana para a forma secretada do anticorpo é gerada por meio de uma mu dança no sítio de clivagem e poliadenilação do RNA como mostrado na Figura 759 CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 421 noma da célula hospedeira mas a produção de partículas virais cessa temporariamente Se após a sua entrada inicial na célula hospedeira as condições tornaremse desfavo ráveis para a transcrição e a replicação viral Rev e Tat são produzidas em níveis muito baixos para promover a transcrição e exportação do RNA não submetido a splicing Essa situação bloqueia o ciclo de crescimento viral Quando as condições para a replicação vi ral melhoram os níveis da Rev e Tat aumentam e o vírus pode entrar no ciclo replicativo Alguns mRNAs estão restritos a regiões específicas do citosol Uma vez que um mRNA eucariótico recentemente produzido tenha passado através de um poro nuclear e entrado no citosol ele normalmente é encontrado pelos ribossomos que o traduzem em uma cadeia polipeptídica ver Figura 68 Uma vez que a primeira rodada de tradução passa no teste de degradação mediada por ausência de sentido ver Figura 676 o mRNA normalmente é traduzido corretamente Se o mRNA codifica uma proteína que é destinada a ser secretada ou expressa na superfície celular uma sequência sinal na extremidade Nterminal da proteína irá dirigila para o retículo endoplasmático RE Nesse caso como discutido no Capítulo 12 componentes do aparato de endereçamento de proteínas celulares reconhecem a sequência sinal tão logo ela emerge do ribossomo e direcionam o complexo inteiro contendo o ribossomo o mRNA e a proteína nascente para a membrana do RE onde o restante da cadeia polipeptídica é sintetizado Em outros casos a proteína inteira é sintetizada por ribossomos livres no citosol e os sinais na cadeia polipeptídica completa podem então direcionar a proteína para outros sítios na célula Muitos RNAs são eles próprios direcionados a localizações intracelulares específicas antes de uma tradução eficiente começar permitindo à célula posicionar os seus mRNAs próximos dos sítios onde as proteínas codificadas são necessárias A localização do RNA tem sido observada em muitos organismos incluindo fungos unicelulares plantas e ani mais sendo provável que seja um mecanismo comum que as células utilizam para con centrar a produção em altos níveis de proteínas em sítios específicos Essa estratégia tam bém fornece à célula outras vantagens Por exemplo ela possibilita o estabelecimento de assimetrias no citosol da célula um passochave em muitos estágios do desenvolvimento A ocorrência de mRNA localizado acoplado com controle traducional também possibilita à célula regular a expressão gênica independentemente em diferentes regiões Essa carac terística é particularmente importante em células grandes e altamente polarizadas como os neurônios onde ela desempenha um papel central na função sináptica Vários mecanismos para a localização do mRNA foram descobertos Figura 764 e todos necessitam de sinais específicos no próprio mRNA Esses sinais normalmente estão concentrados na região 3 não traduzida UTR do inglês untranslated region Figura 764 Mecanismos para a lo calização dos mRNAs O mRNA a ser localizado deixa o núcleo através dos poros nucleares acima Alguns mRNAs localizados diagrama da esquerda viajam para seus destinos associandose a moto res citoesqueléticos que usam a energia da hidrólise do ATP para moverem mRNAs unidirecionalmente ao longo de filamentos no citoesqueleto vermelho ver Capítulo 16 Uma vez nos seus destinos os mRNAs são mantidos nesses locais por meio de proteínasâncora preto Outros mRNAs se difundem aleatoriamente através do citosol e são simplesmente capturados por proteínasâncora nos seus sítios de locali zação diagrama central Alguns mRNAs diagrama da direita são degradados no citosol a não ser que tenham se ligado por difusão ao acaso ao complexo de localização proteica que ancora e protege o mRNA da degradação preto Cada me canismo necessita de sinais no mRNA que normalmente estão localizados na UTR 39 Os componentes adicionais podem bloquear a tradução do mRNA até que ele esteja localizado adequadamente Adap tada de HD Lipshitz e CA Smibert Curr Opin Genet Dev 10476488 2000 Com permissão de Elsevier Transporte dirigido no citoesqueleto Difusão aleatória e captura Degradação generalizada em combinação com proteção local por captura 424 PARTE II Mecanismos genéticos básicos Devido ao eIF2 ligarse muito fortemente à GDP um fator de troca de nucleotídeos guanina ver p 157 denominado eIF2B é necessário para induzir a liberação de GDP de maneira que uma nova molécula de GTP possa se ligar e eIF2 possa ser reutilizado Figura 767A A reutilização de eIF2 é inibida quando ele está fosforilado o eIF2 fos forilado ligase a eIF2B de maneira anormalmente forte inativando eIF2B Há mais eIF2 do que eIF2B nas células e mesmo uma fração dos eIF2 fosforilados pode capturar pra ticamente todos os eIF2B Isso impede a reutilização do eIF2 não fosforilado e retarda de maneira significativa a síntese proteica Figura 767B A regulação do nível de eIF2 é especialmente importante nas células de mamífe ros sendo parte do mecanismo que permite entrar em um estado não proliferativo de inatividade chamado de G0 no qual a taxa de síntese proteica total é reduzida para cerca de um quinto da taxa das células em proliferação A iniciação em códons AUG a montante do início da tradução pode regular o início da tradução eucariótica Vimos no Capítulo 6 que a tradução eucariótica normalmente se inicia no primeiro AUG a jusante à extremidade 5 do mRNA uma vez que ele é o primeiro AUG encontrado por uma subunidade ribossômica menor em processo de varredura Mas os nucleotídeos ime diatamente vizinhos ao AUG também influenciam na eficiência do início da tradução Se o sítio de reconhecimento for muito pobre as subunidades ribossômicas em processo de varredura irão ignorar o primeiro códon AUG no mRNA e pularão para o segundo ou o ter ceiro códon AUG Esse fenômeno conhecido como varredura frouxa é uma estratégia frequentemente utilizada para produzir duas ou mais proteínas intimamente relacionadas diferindo somente nos seus Nterminais a partir do mesmo mRNA Um uso particularmen te importante desse mecanismo consiste na produção da mesma proteína com e sem uma sequência sinal ancorada na sua extremidade Nterminal Isso permite que a proteína seja dirigida para duas localizações diferentes na célula p ex para a mitocôndria e para o cito sol A célula pode regular a abundância relativa das isoformas de proteínas produzidas pela varredura frouxa por exemplo um tipo celular específico que aumenta a abundância do fator de iniciação eIF4F favorece o uso do AUG mais próximo da extremidade 5 do mRNA Outro tipo de controle encontrado nos eucariotos usa uma ou mais fases de leitura abertas pequenas trechos curtos de DNA que começam em um códon de início ATG e terminam em um códon de parada sem nenhum códon de parada no meio que re sidem entre a extremidade 5 de um mRNA e o começo do gene Frequentemente as sequências de aminoácidos codificadas por essas fases abertas de leitura localizadas a montante do gene uORFs do inglês upstream open reading frame não são críticas em vez disso as uORFs exercem uma função puramente reguladora Uma uORF presente Figura 767 O ciclo eIF2 A Reciclagem da utilização de eIF2 por um fator de troca de nucleotídeos de guanina eIF2B B A fosforilação de eIF2 controla a taxa de síntese proteica pelo bloqueio de eIF2B Fator de troca de nucleotídeos de guanina eIF2B eIF2 inativo eIF2 ativo A eIF2B PROTEÍNACINASE FOSFORILA eIF2 eIF2 FOSFORILADO SEQUESTRA TODO O eIF2B COMO UM COMPLEXO INATIVO B eIF2 inativo NA AUSÊNCIA DE eIF2B ATIVO O eIF2 NÃO LIGADO RESTANTE PERMANECE NA SUA FORMA INATIVA LIGADA À GDP E A SÍNTESE PROTEICA DIMINUI DRASTICAMENTE GTP GTP GDP GDP GDP GDP GDP GDP P P CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 429 ternativos do RNA 3 controle da formação das extremidades 3 por clivagem e adição de po liA 4 edição do RNA 5 controle do transporte do núcleo para o citosol 6 localização dos mRNAs em sítios determinados da célula 7 controle do início da tradução e 8 degradação regulada do mRNA A maioria desses processos de controle necessita do reconhecimento de sequências específicas ou de estruturas na molécula de RNA que está sendo regulada tarefa desempenhada tanto por proteínas reguladoras como por moléculas de RNA reguladoras REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR RNAs NÃO CODIFICADORES No capítulo anterior introduzimos o dogma central de acordo com o qual o fluxo da informação genética ocorre do DNA através do RNA para a proteína Figura 61 En tretanto vimos neste livro que moléculas de RNA desempenham muitas tarefas críticas na célula além de servirem como carreadores intermediários da informação genética Entre esses RNAs não codificadores estão as moléculas de rRNA e tRNA que são respon sáveis pela leitura do código genético e por sintetizar proteínas A molécula de RNA da telomerase atua como um molde para a replicação das extremidades dos cromossomos snoRNAs modificam RNA ribossômico e snRNAs desempenham os principais eventos do splicing de RNA E vimos na seção anterior que o RNA de Xist desempenha um papel importante na inativação de uma cópia do cromossomo X em fêmeas Uma série de descobertas recentes revelaram que RNAs não codificadores são ainda mais prevalentes do que pensado anteriormente Sabemos hoje que tais RNAs desempe nham amplas funções na regulação da expressão gênica e na proteção do genoma contra vírus e elementos transponíveis Esses RNAs recémdescobertos são o assunto desta seção Transcritos de RNAs não codificadores pequenos regulam muitos genes de animais e plantas por meio da interferência de RNA Iniciaremos nossa discussão com um grupo de RNAs pequenos que realizam a interferên cia de RNA RNAi Nesse processo pequenos RNAs de fita simples 2030 nucleotídeos atuam como RNAs guias que reorganizam seletivamente e se ligam por meio de parea mento de bases a outros RNAs na célula Quando o alvo é um mRNA maduro os RNAs não codificadores pequenos podem inibir a tradução desse alvo ou até mesmo catalisar a des truição do mesmo Se a molécula de mRNA alvo estiver no processo de ser transcrita o RNA não codificador pequeno pode se ligar a ele e dirigir a formação de certos tipos de cromatina repressiva no molde de DNA associado Figura 774 Três classes de RNAs não codificado res pequenos atuam desse modo microRNAs miRNAs pequenos RNAs de interferência siRNAs e RNAs que interagem com piwi piRNAs esses RNAs serão discutidos nas seções seguintes Ainda que difiram na forma como os trechos de RNA de fita simples pequenos são gerados os três tipos de RNAs pequenos localizam seus alvos por meio de pareamento de bases do tipo RNARNA e geralmente eles promovem reduções na expressão gênica miRNAs regulam a tradução e a estabilidade de mRNAs Mais de mil microRNAs miRNAs diferentes são produzidos pelo genoma humano e eles parecem regular pelo menos um terço de todos os genes codificadores de proteínas Figura 774 Interferência de RNA em eucariotos RNAs de interferência de fita simples são gerados a partir de RNAs de fita dupla Eles localizam os RNAsalvo por meio de pareamento de bases e nesse ponto como mostrado vários destinos são possíveis Como descrito no texto existem vários tipos de interferência de RNA a forma como o RNA de fita dupla é produzido e processado e o destino final do RNAalvo dependem do sistema em particular RNAalvo Processamento RNA de fita dupla Proteínas Argonauta ou Piwi Repressão traducional e destruição do RNAalvo Formação de heterocromatina sobre o DNA a partir do qual o RNAalvo está sendo transcrito Clivagem do RNAalvo RNA de interferência 432 PARTE II Mecanismos genéticos básicos vírus de RNA mesmo que somente algumas de suas células tenham sido infectadas Em geral a resposta de RNAi lembra certos aspectos dos sistemas imunes animais em ambos um organismo invasor induz uma resposta personalizada e pela amplificação das moléculas de ataque o hospedeiro tornase sistematicamente protegido Vimos que apesar de miRNAs e siRNAs serem gerados de formas ligeiramente diferentes eles se baseiam nas mesmas proteínas e procuram seus alvos de uma ma neira fundamentalmente similar Como os siRNAs são encontrados em muitas espécies diferentes acreditase que eles sejam a forma mais antiga de interferência de RNA com os miRNAs correspondendo a um refinamento posterior Esses mecanismos de defesa mediados por siRNAs são cruciais para as plantas vermes e insetos Em mamíferos um sistema baseado em proteínas descrito no Capítulo 24 assumiu em grande parte a tare fa de lutar contra os vírus A interferência de RNA pode direcionar a formação de heterocromatina A via de interferência do siRNA recémdescrita não necessariamente é interrompida com a destruição das moléculas de RNAalvo Em alguns casos a maquinaria da RNAi tam bém pode desativar seletivamente a síntese dos RNAsalvo Para isso ocorrer os pequenos siRNAs produzidos pela proteína Dicer são agrupados com um grupo de proteínas in cluindo Argonauta para formar o complexo de silenciamento transcricional induzido por RNA RITS RNAinduced transcriptional silencing Usando o siRNA como sequênciaguia esse complexo ligase a transcritos de RNA complementares assim que eles emergem de uma RNApolimerase II em transcrição Figura 777 Posicionado no genoma dessa ma neira o complexo RITS atrai proteínas que modificam covalentemente histonas e ao final direcionam a formação de heterocromatina para impedir eventos adicionais de iniciação da transcrição Em alguns casos uma RNApolimerase dependente de RNA e uma enzima Dicer são também recrutadas pelo complexo RITS para gerar siRNAs adicionais in situ de maneira continuada Esse ciclo de retroalimentação positiva garante repressão continuada do genealvo mesmo após as moléculas de siRNA iniciais terem desaparecido A formação de heterocromatina dirigida por RNAi é um importante mecanismo de defesa celular que limita a disseminação de elementos transponíveis em genomas pois mantém suas sequências de DNA em uma forma silenciosa transcricionalmente Entretanto esse mesmo mecanismo também é utilizado em alguns processos normais na célula Por exemplo em muitos organismos a maquinaria de interferência de RNA Figura 777 Interferência de RNA diri gida por siRNAs Em muitos organismos o RNA de fita dupla pode desencadear tanto a destruição de mRNAs complemen tares esquerda como o silenciamento transcricional direita A mudança na estrutura da cromatina induzida pelos complexos RITS ligados lembra a da Figura 745 RNA de fita dupla siRNAs Argonauta e outras proteínas RISC Argonauta e outras proteínas RITS A VIA AGORA SEGUE UMA DAQUELAS MOSTRADAS NA FIGURA 776 METILAÇÃO DE HISTONAS METILAÇÃO DE DNA REPRESSÃO TRANSCRICIONAL RISC RITS RNApolimerase CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 433 mantém a heterocromatina formada ao redor dos centrômeros As sequências de DNA centroméricas são transcritas em ambas as direções produzindo transcritos de RNA complementares que podem parearse com o RNA de fita dupla Esse RNA de fita dupla dispara a via de interferência de RNA e estimula a formação da heterocromatina que cer ca os centrômeros a qual é necessária para os centrômeros segregarem os cromossomos corretamente durante a mitose piRNAs protegem as linhagens germinativas dos elementos transponíveis Um terceiro sistema de interferência de RNA se baseia nos piRNAs RNAs que intera gem com piwi em referência à Piwi uma classe de proteínas relacionadas ao Argonauta Os piRNAs são produzidos especificamente na linhagem germinativa na qual eles blo queiam o movimento de elementos transponíveis Encontrados em muitos organismos incluindo humanos os genes codificadores de piRNAs consistem principalmente de frag mentos de sequências de elementos transponíveis Esses agrupamentos de fragmentos são transcritos e quebrados em pequenas porções os piRNAs de cadeia simples O pro cessamento difere daquele que ocorre para os miRNAs e siRNAs para começar a enzima Dicer não está envolvida e os piRNAs resultantes são ligeiramente maiores do que os miRNAs e siRNAs além disso eles são complexados com Piwi em vez das proteínas Ar gonauta Uma vez formados os piRNAs procuram os alvos de RNA por pareamento e de forma muito semelhante aos siRNAs silenciam em nível transcricional genes intactos de transpósons e destroem qualquer RNA incluindo mRNAs produzido por eles Muitos mistérios cercam os piRNAs Mais de 1 milhão de espécies de piRNA são codificadas nos genomas de muitos mamíferos e expressos nos testículos ainda assim somente uma pequena fração parece ser dirigida contra os transpósons presentes nesses genomas Serão os piRNAs resquícios de invasores do passado Cobrirão eles um espaço de sequência tão amplo que eles seriam protetores contra qualquer DNA exógeno Uma outra característica curiosa dos piRNAs é que muitos deles particularmente se o parea mento de bases não precisar ser perfeito deveriam em princípio atacar os mRNAs nor mais produzidos pelo organismo mas eles não o fazem Foi proposto que esses grandes números de piRNAs possam formar um sistema para distinguir o RNA próprio de RNAs exógenos e atacar posteriormente apenas os últimos Se for esse o caso deve existir uma forma especial para a célula poupar os seus próprios RNAs Uma proposta é a de que RNAs produzidos na geração anterior de um organismo sejam de alguma maneira registrados e colocados de lado do ataque de piRNA em gerações subsequentes Se esse mecanismo de fato existe e em caso afirmativo como ele pode funcionar são questões que demonstram nosso conhecimento incompleto de todas as implicações da interferência de RNA A interferência de RNA tornouse uma poderosa ferramenta experimental Ainda que provavelmente tenha surgido como um mecanismo de defesa contra vírus e elementos transponíveis a interferência de RNA como vimos tornouse completa mente integrada em muitos aspectos da biologia celular normal variando de controle da expressão gênica à estrutura dos cromossomos Os cientistas também o desenvolveram como uma ferramenta experimental poderosa que permite que quase qualquer gene seja inativado evocando a resposta de RNAi para ele Essa técnica bastante empregada em células em cultura e em muitos casos em animais e plantas inteiros tornaram pos síveis novas estratégias genéticas na biologia celular e molecular Discutiremos em de talhes essa técnica no capítulo seguinte onde iremos tratar de métodos de genética mo derna usados para estudar as células ver p 499501 A RNAi também possui potencial para o tratamento de doenças humanas Considerandose que muitas doenças humanas resultam da expressão alterada de genes a habilidade de desativar esses genes pela in trodução experimental de moléculas complementares de siRNA é uma grande promessa médica Ainda que o mecanismo de interferência do RNA tenha sido descoberto há al gumas décadas ainda estamos sendo surpreendidos pelos detalhes de seu mecanismo e pela amplitude de suas implicações biológicas CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 435 os crRNAs encontram suas sequências complementares no DNA de fita dupla Além disso em diferentes espécies de bactérias e arqueobactérias os crRNAs são processados de dife rentes formas e em alguns casos os crRNAs podem atacar RNAs virais assim como DNAs Veremos no próximo capítulo que sistemas CRISPR bacterianos já foram movi dos artificialmente para plantas e animais onde eles se tornaram ferramentas experi mentais poderosas para manipular genomas RNAs não codificadores longos possuem diversas funções na célula Neste e em capítulos anteriores vimos que moléculas de RNA não codificadoras apresen tam muitas funções na célula Ainda assim como no caso das proteínas existem muitos RNAs não codificadores cuja função permanece desconhecida Muitos RNAs de função desconhecida pertencem a um grupo conhecido como RNA não codificador longo lncRNA Esses são definidos arbitrariamente como RNAs maiores que 200 nucleotídeos que não codificam proteínas Como os métodos para a determinação das sequências de nucleotídeos de todas as moléculas de RNA produzidas por uma linhagem celular ou te cido foram aperfeiçoados o número total de lncRNAs estimado em 8 mil para o genoma humano por exemplo veio como uma surpresa para os cientistas A maioria dos lncRNAs são transcritos pela RNApolimerase II e possuem quepe 5 e caudas poliA e em mui tos casos sofrem splicing Tem sido difícil anotar lncRNAs porque hoje se sabe que bai xos níveis de RNA são produzidos para 75 do genoma humano Pensase que a maior parte desse RNA corresponda a um ruído de fundo da transcrição e processamento do RNA De acordo com essa ideia tais RNAs não funcionais não fornecem uma vantagem adaptativa e tampouco desvantagem ao organismo e são tolerados como subprodutos dos padrões complexos de expressão gênica que devem ser produzidos em organismos multicelulares Por essas razões é difícil estimar o número de lncRNAs que provavelmen te tenham uma função na célula e distinguilos da transcrição de fundo Já nos deparamos com alguns poucos lncRNAs incluindo o RNA na telome rase ver Figura 533 RNA Xist ver Figura 752 e um RNA envolvido em imprinting ver Figura 749 Outros lncRNAs têm sido implicados em controlar a atividade enzi mática de proteínas inativar reguladores transcricionais afetar padrões de splicing e bloquear a tradução de certos mRNAs Em termos de função biológica o lncRNA deve ser considerado como um termo que abarca tudo compreendendo uma grande diversidade de funções Entretanto exis tem duas características unificadoras dos lncRNAs que podem explicar os seus papéis diversificados nas células A primeira é que lncRNAs podem funcionar como moléculas de RNA de suporte mantendo unidos grupos de proteínas de forma a coordenar suas funções Figura 779A Já vimos um exemplo na telomerase em que uma molécula de RNA organiza e mantém componentes proteicos unidos Esses suportes baseados em RNA são análogos às proteínas de suporte discutidas no Capítulo 3 ver Figura 378 e Capítulo 6 ver Figura 647 As moléculas de RNA são bastante adequadas para atua rem como suportes pequenas porções de sequência de RNA com frequência aquelas porções que formam estruturas de hastealça podem servir como sítios de ligação para Figura 779 Funções do RNA não co dificador longo lncRNA A lncRNAs podem atuar como suportes aproximando proteínas que funcionam em um mesmo processo Como descrito no Capítulo 6 RNAs podem se enovelar em estruturas tri dimensionais específicas que são frequen temente reconhecidas pelas proteínas B Além de funcionarem como suportes lncRNAs podem por meio da formação de pares de bases complementares localizar proteínas em sequências específicas de moléculas de DNA ou RNA C Em alguns casos lncRNAs podem atuar somente em cis por exemplo quando o RNA é mantido no lugar pela RNApolimerase superior Outros lncRNAs entretanto difundemse a partir dos seus sítios de sín tese e portanto agem em trans A IncRNA IncRNA IncRNA C B RNA DNA RNApolimerase Controla a transcrição de genes no mesmo cromossomo Controla a transcrição de genes em outros cromossomos Cromossomo A Cromossomo A Cromossomo B ATUA EM CIS ATUA EM TRANS 436 PARTE II Mecanismos genéticos básicos proteínas e podem ser atados com sequências aleatórias de RNA no meio Essa proprie dade pode ser uma das razões pelas quais lncRNAs apresentam pouca conservação em termos de estrutura primária em diferentes espécies A segunda característicachave dos lncRNAs consiste na sua capacidade de ser vir como sequênciasguia ligandose a moléculasalvo de DNA ou RNA específicas por meio de pareamento de bases Ao fazer isso eles provocam a aproximação das proteínas que se ligam a essas sequências de DNA e RNA Figura 779B Esse comportamento é similar ao dos snoRNAs ver Figura 641 crRNAs ver Figura 778 e miRNAs ver Figura 775 todos agindo dessa mesma forma para guiar enzimas proteicas para sequências específicas de ácidos nucleicos Em alguns casos os lncRNAs atuam simplesmente por pareamento de bases sem trazer consigo enzimas ou outras proteínas Por exemplo uma série de genes de lncRNA estão embebidos dentro de genes codificadores de proteínas mas são transcri tos na direção errada Esses RNAs antissenso podem formar pareamentos entre bases complementares com o mRNA transcrito na direção correta e bloqueiam a tradução em proteína ver Figura 766D Outros lncRNAs antissenso pareiam com prémRNAs à medida que são sintetizados e mudam o padrão de splicing do RNA mascarando as sequências dos sítios de splicing Outros atuam como esponjas pareando com miRNAs e dessa forma reduzindo seus efeitos Finalmente observase que alguns lncRNAs podem atuar somente em cis ou seja eles afetam somente o cromossomo a partir do qual são transcritos Isso ocorre pronta mente quando o RNA transcrito ainda não foi liberado pelas RNApolimerases Figura 779C Muitos lncRNAs entretanto difundemse a partir do seu sítio de síntese e atuam em trans Ainda que os lncRNAs mais bem compreendidos ajam dentro do núcleo mui tos são encontrados no citosol As funções se existir alguma da grande maioria desses lncRNAs citosólicos permanecem desconhecidas Resumo As moléculas de RNA apresentam muitas funções na célula além de portarem a informa ção necessária para especificar a ordem de aminoácidos durante a síntese proteica Ainda que tenhamos encontrado RNAs não codificadores em outros capítulos p ex tRNAs rRNAs snoRNAs o número total de RNAs não codificadores produzidos pelas células tem surpreen dido os cientistas Um uso bem compreendido dos RNAs não codificadores ocorre na inter ferência de RNA na qual os RNAsguia miRNA siRNAs piRNAs se pareiam com mRNAs A RNAi pode induzir os mRNAs a serem destruídos ou terem a sua tradução reprimida Ela também pode induzir que genes específicos sejam empacotados em heterocromatina su primindo sua transcrição Em bactérias e arqueobactérias a interferência de RNA é usada como uma resposta imune adaptativa para destruir vírus que as infectam Uma grande famí lia de RNAs não codificadores longos lncRNAs tem sido descoberta recentemente Ainda que a função da maioria desses RNAs seja desconhecida alguns servem como suportes de RNA que aproximam proteínas específicas e moléculas de RNA acelerando reações necessárias O QUE NÃO SABEMOS Como a taxa final de transcrição de um gene é especificada pelas centenas de proteínas que se asso ciam em suas regiões controlado ras Seremos algum dia capazes de predizer essa taxa a partir da inspeção das sequências de DNA das regiões controladoras Como o conjunto das sequências reguladoras cisatuantes embebi das em um genoma orquestram o programa de desenvolvimento de um organismo multicelular Quanto da sequência do genoma humano é funcional e por que o restante é retido Quais dos milhares de RNAs não codificadores não estudados de sempenham funções na célula e quais são essas funções Estavam os íntrons presentes nas células originais tendo sido subse quentemente perdidos em alguns organismos ou eles surgiram em períodos posteriores TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 71 Em termos da maneira como interage com o DNA o mo tivo hélicealçahélice está mais intimamente relacionado ao motivo zíper de leucina do que ao motivo hélicevoltahélice 72 Uma vez que as células tenham se diferenciado em suas formas especializadas finais elas nunca alteram a ex pressão de seus genes novamente 73 Acreditase que ilhas CG surgiram durante a evolução pois estão associadas a porções do genoma que permanece ram não metiladas na linhagem germinativa 74 Na maioria dos tecidos diferenciados as célulasfilhas retêm uma memória dos padrões de expressão gênica que estiveram presentes na célula parental por meio de meca nismos que não envolvem mudanças na sequência de seus DNAs genômicos Discuta as questões a seguir 75 Uma pequena porção de uma análise bidimensional de proteínas do cérebro humano está mostrada na Figura Q71 Essas proteínas foram separadas com base no tama nho em uma dimensão e carga elétrica ponto isoelétrico na outra Nem todos os pontos proteicos em cada análise são produtos de genes diferentes alguns representam formas modificadas de uma proteína que migrou para diferentes posições Escolha alguns conjuntos de pontos que poderiam representar proteínas que diferem pelo número de fosfatos que carregam Explique a base para a sua seleção CAPÍTULO 7 Controle da expressão gênica 437 Figura Q71 Separação bidimensional de proteínas do cérebro humano As proteínas foram analisadas utilizando eletroforese em gel bidimensional Somente uma pequena porção do espectro de proteínas está mostrada Cortesia de Tim Myers e Leigh Anderson Large Scale Biology Corpo ration Ácido Básico Maior Menor 76 Comparações dos padrões de níveis de mRNA em di ferentes tipos celulares humanos mostram que o nível de expressão de praticamente qualquer gene ativo é diferente Os padrões de abundância de mRNA são tão característi cos do tipo celular que podem ser usados para determinar o tecido de origem das células cancerosas mesmo que elas tenham sofrido metástase para diferentes partes do corpo Por definição entretanto as células cancerosas são diferen tes de suas células precursoras não cancerosas Como você supõe então que os padrões de expressão de mRNA pode riam ser usados para determinar a fonte do tecido de um câncer humano 77 Quais são os dois componentes fundamentais de um comutador genético 78 O núcleo de uma célula eucariótica é muito maior do que uma bactéria e contém muito mais DNA Como consequência um regulador transcricional em uma célula eucariótica precisa ser capaz de selecionar o seu sítio de ligação específico entre muitas sequências não relacionadas a mais do que um regula dor de trascrição em uma bactéria Esse fato apresenta proble mas especiais para a regulação gênica eucariótica Considere a seguinte situação Assuma que o núcleo eu cariótico e a célula bacteriana possuam cada uma única cópia de um mesmo sítio de ligação ao DNA Além disso assuma que o núcleo possua um volume 500 vezes maior do que uma bactéria e 500 vezes mais DNA Se a concentração de um regu lador transcricional que se liga em um sítio fosse a mesma no núcleo e dentro de uma bactéria esse regulador iria ocupar o seu sítio de ligação dentro do núcleo eucariótico da mesma forma que o faz na bactéria Explique a sua resposta 79 Alguns reguladores transcricionais se ligam ao DNA e fazem a duplahélice se curvar em um ângulo agudo Tais proteínas de curvatura podem afetar a iniciação da trans crição sem estabelecer contatos diretos com nenhuma outra proteína Você poderia conceber uma explicação plausível para como agem tais proteínas para modular a transcrição Desenhe um diagrama que ilustre a sua explicação 710 Como é possível que interações proteínaproteína que são muito fracas para promoverem a associação de proteínas em solução possam fazer essas mesmas proteínas formarem complexos sobre o DNA 711 Imagine as duas situações mostradas na Figura Q72 Na célula 1 um sinal transitório induz a síntese da proteína A que é um ativador transitório que liga muitos genes in cluindo o seu próprio Na célula 2 um sinal transitório induz a síntese da proteína R que é um repressor transcricional que desliga muitos genes incluindo o seu próprio Em quais dessas situações se em alguma irão os descendentes da cé lula original se lembrar de que a célula progenitora expe rienciou o sinal transitório Explique seu raciocínio Repressor transcricional R R R Sinal transitório Sinal transitório DESLIGADO DESLIGADO Ativador transcricional A CÉLULA 1 B CÉLULA 2 A R Liga a transcrição do mRNA do repressor R Proteína repressora desliga a sua própria transcrição R Liga a transcrição do mRNA do ativador A Proteína ativadora liga a sua própria transcrição A A A A Figura Q72 Circuitos de regulação gênica e memória celular A Indução da síntese do ativador transcricional A por um sinal transitório B Indução da sínte se do repressor transcricional R por um sinal transitório 712 Examine os dois heredogramas mostrados na Figura Q73 Um deles é resultante da deleção de um gene autossômi co materno com imprinting O outro heredograma é resultante da deleção de um gene autossômico paterno com imprinting Em ambos os heredogramas os indivíduos afetados símbolos vermelhos são heterozigotos para a deleção Esses indivíduos são afetados porque uma cópia do cromossomo porta o gene inativo por imprinting enquanto a outra porta a deleção do gene Símbolos em amarelo indicam indivíduos que portam o lócus deletado mas não apresentam um fenótipo mutante Qual dos heredogramas é baseado em imprinting paterno e qual em imprinting materno Explique a sua resposta A B Figura Q73 Heredogramas refletindo imprinting materno e paterno Em um heredograma o gene sofre imprinting paterno no outro sofre imprinting materno Nas gerações 3 e 4 somente um dos dois genitores é mostrado nos cruzamentos indicados o outro genitor é um indivíduo normal de fora do heredograma Os indivíduos afetados estão representados por cír culos vermelhos para fêmeas e quadrados vermelhos para machos Símbolos amarelos com um ponto indicam indivíduos que portam a deleção porém não apresentam o fenótipo 713 Se você inserir um gene da bgalactosidase que não contenha sua própria região controladora da transcrição em um agrupamento de genes de piRNA em Drosophila você descobrirá que a expressão da bgalactosidase a partir de uma cópia normal localizada em algum outro lugar do geno ma será fortemente inibida nas células germinativas da mos ca Se o gene da bgalactosidase inativo for inserido fora do agrupamento de genes de piRNA o gene normal é expresso adequadamente O que você supõe ser a base para essa ob servação Como você testaria essa hipótese 438 PARTE II Mecanismos genéticos básicos REFERÊNCIAS Gerais Brown 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estimulante para a biologia Novos métodos para analisar células proteínas DNA e RNA estão fornecendo uma explosão de informações e permitindo aos cientistas estudar células e suas macromoléculas com ferramentas nunca antes imaginadas Agora temos acesso a sequências de vários bilhões de nucleotídeos fornecendo mapas moleculares completos de centenas de organismos de micróbios e sementes de mostarda até vermes moscas camundongos cães chim panzés e humanos Novas técnicas potentes estão nos auxiliando a decifrar essa infor mação permitindo não somente que compilemos enormes catálogos detalhados de ge nes e proteínas mas que iniciemos a compreender como esses componentes trabalham juntos para formar células e organismos funcionais O objetivo de obter um completo entendimento do que acontece no interior de uma célula enquanto ela responde ao seu meio e interage com suas vizinhas ainda está longe de ser alcançado Neste capítulo apresentamos alguns dos principais métodos utilizados para es tudar as células e seus componentes moleculares Consideraremos como separar as cé lulas de diferentes tipos de tecidos como fazer com que cresçam fora do corpo e como romper células e isolar suas organelas e constituintes macromoleculares na forma pura Também apresentaremos as técnicas utilizadas para determinar a estrutura a função e as interações das proteínas e discutiremos as descobertas marcantes na tecnologia do DNA que continuam a revolucionar nossa compreensão sobre a função das células Ter minaremos o capítulo com uma visão geral de algumas abordagens matemáticas que estão nos ajudando a lidar com a enorme complexidade das células Ao considerar as células como sistemas dinâmicos com várias partes em movimento as abordagens ma temáticas podem revelar indícios de como os vários componentes celulares atuam em conjunto para produzir as qualidades especiais da vida ISOLAMENTO DE CÉLULAS E SEU CRESCIMENTO EM CULTURA Embora as organelas e as moléculas grandes em uma célula possam ser visualizadas com microscópios entender como esses componentes funcionam requer uma análise 440 PARTE III Formas de trabalhar com células bioquímica detalhada A maioria dos procedimentos bioquímicos requer que grandes quantidades de células sejam rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus compo nentes Se a amostra é um pedaço de tecido composto por diferentes tipos de células populações de células heterogêneas estarão misturadas Para obter o máximo de infor mações possíveis sobre as células em um tecido biólogos desenvolveram maneiras para dissociar as células dos tecidos e separálas de acordo com o tipo Essas manipulações resultam em uma população relativamente homogênea de células que podem então ser analisadas diretamente ou após seu número ser bastante aumentado pela prolifera ção das células em cultura Células podem ser isoladas a partir de tecidos Tecidos intactos fornecem a fonte de material mais realística uma vez que representam as células encontradas no corpo da maneira como realmente são O primeiro passo no isolamento de células individuais é romper a matriz extracelular e as junções entre as cé lulas que as mantêm unidas Com esse propósito um tecido normalmente é tratado com enzimas proteolíticas como tripsina e colagenase para digerir as proteínas na matriz extracelular e com agentes como ácido etilenodiaminotetracético ou EDTA que ligam ou quelam o Ca 2 do qual a adesão entre as células depende O tecido pode então ser dissociado em células individuais por agitação leve Para algumas preparações bioquímicas a proteína de interesse pode ser obtida em quantidades suficientes sem que o tecido ou o órgão seja separado em tipos celulares Exemplos incluem a preparação das histonas a partir de timo de terneiro actina a partir de músculo de coelhos ou tubulina a partir de cérebro de bovinos Em outros casos a obtenção da proteína de interesse requer o enriquecimento de um tipo celular específi co Várias abordagens são utilizadas para separar os diferentes tipos celulares a partir de uma suspensão de mistura de células Uma das técnicas mais sofisticadas de separação celular utiliza um anticorpo ligado a um corante fluorescente para marcar determinadas células É escolhido um anticorpo que se liga especificamente à superfície de apenas um tipo de célula no tecido As células marcadas podem ser separadas das não marcadas em um separador de células ativado por fluorescência Nessa máquina extraordinária células individuais deslocamse em uma fileira única em um fluxo preciso atravessam um feixe de laser e sua fluorescência é rapidamente medida Um tubo vibrador gera pe quenas gotículas a maioria contendo uma ou nenhuma célula As gotículas contendo uma única célula são carregadas automaticamente com uma carga positiva ou negativa no momento da formação dependendo de a célula que elas contêm ser fluorescente elas são então defletidas por um campo elétrico intenso para um depósito apropriado Aglomerados ocasionais de células detectados pelo aumento do espalhamento de luz são deixados sem carga e descartados em um depósito de resíduos Essas máquinas po dem selecionar com acuidade 1 célula fluorescente entre 1000 células não marcadas e selecionar milhares de células a cada segundo Figura 82 Células podem ser cultivadas em meio de cultura Embora moléculas possam ser extraídas a partir de tecidos inteiros estes normalmente não são a fonte mais conveniente ou útil de material A complexidade dos tecidos e órgãos intactos é uma desvantagem inerente quando se tenta purificar determinadas moléculas As células cultivadas em meio de cultura fornecem uma população mais homogênea de células das quais material pode ser extraído sendo também muito mais apropriadas para se trabalhar no laboratório Dadas as condições favoráveis a maioria das células vegetais e animais pode sobreviver multiplicarse e até mesmo expressar propriedades diferenciadas em um frasco de cultura As células podem ser observadas continuamente ao microscópio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos de adicionar ou remover moléculas específicas como hormônios ou fatores de crescimento podem ser estudados de forma sistemática Experimentos realizados com células em cultura às vezes são referidos como con duzidos in vitro literalmente dentro de vidro em contraste com experimentos que utilizam organismos intactos os quais são referidos como conduzidos in vivo literalmen te em organismos vivos Entretanto esses termos podem ser confusos pois frequente mente são utilizados em um sentido muito diferente pelos bioquímicos Em laboratórios A B Figura 81 Vida microscópica Uma amostra dos diversos organismos mi croscópicos vistos por van Leeuwenhoek utilizando seu microscópio simples A Bactérias vistas no material que ele retirou de seus dentes As bactérias vistas na fig B foram descritas como nadando primeiro para a frente e depois para trás 1692 B A alga verde eucariótica Volvox 1700 Cortesia de John Innes Foundation CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 441 de bioquímica in vitro se refere às reações que ocorrem em um tubo de ensaio na ausên cia de células vivas enquanto in vivo se refere a qualquer reação que ocorra dentro de uma célula viva mesmo em células que estejam sendo cultivadas em um meio de cultura A cultura de tecidos começou em 1907 com um experimento designado para resol ver uma controvérsia em neurobiologia A hipótese sob investigação era conhecida como doutrina do neurônio que estabelecia que cada fibra nervosa era o produto de uma única célula nervosa e não o produto da fusão de várias células Para testar essa controvérsia pe quenos pedaços da medula espinal foram colocados sobre fluidos de tecido coagulado em uma câmara aquecida e úmida e observados em intervalos regulares ao microscópio Após um ou mais dias células nervosas individuais puderam ser vistas estendendo longos e finos filamentos axônios para dentro do coágulo Assim a doutrina do neurônio recebeu um forte suporte e os fundamentos para a revolução da cultura de células foram assentados Esses experimentos originais com fibras nervosas utilizavam culturas de pequenos fragmentos de tecidos chamados de explantes Atualmente culturas são mais comumente feitas a partir de suspensões de células dissociadas a partir de tecidos Diferentemente das bactérias a maioria das células de tecidos não está adaptada para viver em suspensão no líquido e requer uma superfície sólida sobre a qual pode crescer e se dividir Para culturas de células esse suporte geralmente é fornecido pela superfície de uma placa de cultura de plástico Entretanto as células variam nas suas necessidades e várias não crescem ou se diferenciam a não ser que a placa de cultura esteja coberta com materiais aos quais as células se aderem como polilisina ou componentes da matriz extracelular As culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo são chama das de culturas primárias Elas podem ser feitas com ou sem uma etapa inicial de fraciona mento para separar diferentes tipos de células Na maioria dos casos as células em cultu ras primárias podem ser removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente nas chamadas culturas secundárias dessa maneira elas podem ser subcultivadas passagens repetidamente durante semanas ou meses Tais células frequentemente apresentam várias das propriedades diferenciadas correspondentes à sua origem Figura 83 fibroblastos continuam a secretar colágeno células derivadas de músculo esquelético embrionário fusionamse para formar fibras musculares que se contraem espontaneamente na placa de cultura células nervosas estendem axônios excitáveis eletricamente e fazem sinapses com Vibrador ultrassônico Suspensão de células Fluido incidente Laser Detectores Pequenos grupos de gotas carregadas positivamente pela detecção de uma única célula não fluorescente Pequenos grupos de gotas carregadas negativamente pela detecção de uma única célula fluorescente 2000 V 2000 V Coletor de células Coletor de células Frasco para gotículas não defletidas Analisador Sinal de carregamento das gotas Figura 82 Separador de células ati vado por fluorescência Uma célula que passa pelo feixe de laser tem sua fluores cência medida As gotículas contendo uma única célula são carregadas negativa ou positivamente dependendo se a célula for fluorescente ou não Elas são então defletidas por um campo elétrico para um conjunto de tubos de acordo com a sua carga elétrica Observe que a con centração de células deve ser ajustada de maneira que a maioria das gotículas não contenha nenhuma célula e seja descarta da em um depósito de resíduos junto com quaisquer aglomerados celulares CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 443 damente fornecendo um gene que codifica a subunidade catalítica da telomerase nesse caso eles podem ser propagados como uma linhagem celular imortalizada Entretanto algumas células humanas não são imortalizadas por este procedimen to Embora seus telômeros permaneçam longos elas ainda param de se dividir após um número limitado de divisões pois as condições da cultura causam um estímulo mito gênico excessivo que ativa um mecanismo protetor pouco conhecido discutido no Ca pítulo 17 que interrompe a divisão celular um processo às vezes chamado de cho que de cultura Para imortalizar essas células devese fazer mais do que introduzir a telomerase Também devese inativar os mecanismos protetores o que pode ser feito pela introdução de certos oncogenes promotores de câncer discutido no Capítulo 20 Diferentemente de células humanas a maioria das células de roedores não desliga a pro dução de telomerase e assim seus telômeros não encurtam a cada divisão celular Dessa forma se o choque de cultura puder ser evitado alguns tipos de células de roedores se dividirão de forma indefinida em cultura Além disso células de roedores muitas vezes sofrem modificações genéticas espontâneas em cultura que inativam seus mecanismos de proteção produzindo dessa forma linhagens de células imortalizadas As linhagens celulares muitas vezes podem ser geradas com mais facilidade a partir de células cancerosas mas essas culturas referidas como linhagens celulares transformadas diferem daquelas preparadas a partir de células normais de diferen tes formas Essas linhagens frequentemente crescem sem aderir a uma superfície por exemplo e podem proliferar para uma densidade muito mais alta em uma placa de cul tura Propriedades similares podem ser induzidas experimentalmente em células nor mais transformandoas com um vírus ou químicos indutores de tumores As linhagens celulares transformadas resultantes normalmente podem causar tumores quando inje tadas em um animal suscetível As linhagens celulares transformadas e as não transformadas são extremamente úteis na pesquisa celular como fonte de um grande número de células de um tipo uni forme especialmente por poderem ser estocadas em nitrogênio líquido a 196C por um período indefinido e manter sua viabilidade quando descongeladas Entretanto é importante ter em mente que as linhagens celulares quase sempre diferem de maneira importante de suas progenitoras normais nos tecidos de onde elas foram originadas Algumas das linhagens celulares amplamente utilizadas estão listadas na Tabela 81 Diferentes linhagens têm diferentes vantagens por exemplo as linhagens celulares TABELA 81 Algumas das linhagens celulares comumente utilizadas linhagem celular Tipo e origem da célula 3T3 Fibroblasto camundongo BHK21 Fibroblasto hamster sírio MDCK Célula epitelial cão HeLa Célula epitelial humano PtK1 Célula epitelial canguru rato L6 Mioblasto rato PC12 Célula cromafim rato SP2 Célula plasmática camundongo COS Rim macaco 293 Rim humano transformada com adenovírus CHO Ovário hamster chinês DT40 Célula de linfoma para recombinação direcionada eficiente galinha R1 Célulatronco embrionária camundongo E141 Célulatronco embrionária camundongo H1 H9 Célulatronco embrionária humano S2 Célula semelhante a macrófago Drosophila BY2 Célula meristemática indiferenciada tabaco Várias dessas linhagens celulares derivaram de tumores Todas são capazes de se replicar indefinidamente em cultura e expressam pelo menos algumas das características especiais das suas células de origem 444 PARTE III Formas de trabalhar com células epiteliais PtK derivadas do ratocanguru diferentemente de outros tipos de linhagens celulares permanecem achatadas durante a mitose permitindo que o aparato mitótico seja prontamente observado em ação Linhagens celulares de hibridomas são fábricas que produzem anticorpos monoclonais Como vimos neste livro anticorpos são ferramentas particularmente úteis para a biologia celular A sua grande especificidade permite a visualização precisa de proteínas selecio nadas entre as milhares que cada célula produz normalmente Os anticorpos frequente mente são produzidos por inoculação de animais com a proteína de interesse e isolamento subsequente de anticorpos específicos para aquela proteína a partir do soro do animal Entretanto apenas quantidades limitadas de anticorpos podem ser obtidas de um único animal inoculado e os anticorpos produzidos serão uma mistura heterogênea de anticor pos que reconhecem uma variedade de sítios antigênicos diferentes em uma macromolé cula que difere de animal para animal Além disso os anticorpos específicos para o antí geno constituirão apenas uma fração dos anticorpos encontrados no soro Uma tecnologia alternativa que permite a produção de uma quantidade ilimitada de anticorpos idênticos e que aumenta muito a especificidade e conveniência dos métodos com base em anticor pos é a produção de anticorpos monoclonais por linhagens celulares de hibridomas Essa tecnologia desenvolvida em 1975 revolucionou a produção de anticorpos per mitindo sua utilização como ferramentas na biologia celular assim como no diagnóstico e no tratamento de certas doenças incluindo artrite reumatoide e câncer O procedimento requer a tecnologia da célula híbrida Figura 84 e envolve a propagação de um clone de células de um único linfócito B secretor de anticorpos para obter uma preparação homo gênea de anticorpos em grandes quantidades Os linfócitos B normalmente têm um tempo de vida limitado em cultura mas os linfócitos B individuais produtores de anticorpos de camundongos imunizados quando fusionados com células derivadas de uma linhagem celular de linfócitos B transformados podem dar origem a híbridos que têm tanto habi lidade de sintetizar um anticorpo específico como a habilidade de se multiplicar indefi nidamente em cultura Esses hibridomas são propagados como clones individuais cada um fornecendo uma fonte permanente e estável de um único tipo de anticorpo mono clonal Cada tipo de anticorpo monoclonal reconhece um tipo único de sítio antigênico por exemplo um determinado grupo de cadeias laterais de cinco ou seis aminoácidos na superfície de uma proteína Sua especificidade uniforme torna os anticorpos monoclonais muito mais úteis do que o antissoro convencional para muitos propósitos Uma vantagem importante da técnica do hibridoma é que os anticorpos mono clonais podem ser obtidos para moléculas que constituem apenas um componente mi noritário de uma mistura complexa Em um antissoro comum feito contra tal mistura a proporção de moléculas de anticorpo que reconhece o componente minoritário é muito pequena para ser útil Contudo se os linfócitos B que produzem os vários componentes desse antissoro são convertidos em hibridomas tornase possível rastrear clones de hi bridomas individuais a partir de uma grande mistura para selecionar um que produza o anticorpo monoclonal do tipo desejado e propagar o hibridoma selecionado indefinida Figura 84 Produção de células híbri das É possível fusionar uma célula com outra para formar um heterocarionte uma célula combinada com dois núcleos separados Normalmente uma suspen são de células é tratada com certos vírus inativados ou com polietilenoglicol que alteram as membranas plasmáticas das células para induzir sua fusão Finalmen te um heterocarionte entra em mitose e produz uma célula híbrida na qual os dois envelopes nucleares separados foram desestruturados permitindo que todos os cromossomos sejam combinados em um único grande núcleo Tais células híbridas podem originar linhagens celulares híbri das imortais Se uma das células parentais for uma linhagem celular tumoral a célula híbrida é chamada de hibridoma SUSPENSÃO DE DOIS TIPOS DE CÉLULAS CENTRIFUGADAS NA PRESENÇA DE UM AGENTE PARA FUSÃO FUSÃO CELULAR E FORMAÇÃO DE HETEROCARIONTES QUE SÃO ENTÃO CULTIVADOS O MEIO SELETIVO PERMITE APENAS QUE HETEROCARIONTES SOBREVIVAM E PROLIFEREM ELES SE TORNAM CÉLULAS HÍBRIDAS QUE SÃO ENTÃO CLONADAS Três clones de células híbridas Célula normal diferenciada Célula tumoral de camundongo Heterocarionte Célula híbrida CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 445 mente de maneira a produzir aquele anticorpo em quantidades ilimitadas Dessa forma em princípio um anticorpo monoclonal pode ser produzido contra qualquer proteína em uma amostra biológica Uma vez que um anticorpo foi produzido ele pode ser utili zado para localizar uma proteína em células e tecidos para seguir seu movimento e para purificar a proteína com o objetivo de estudar sua estrutura e função Resumo Os tecidos podem ser dissociados em suas células componentes das quais tipos individuais de células podem ser purificados e utilizados para análise bioquímica ou para o estabele cimento de culturas de células Várias células animais e vegetais sobrevivem e proliferam em uma placa de cultura se forem providas com um meio de cultura adequado conten do nutrientes e moléculas sinalizadoras apropriadas Embora a maioria das células ani mais pare de se dividir após um número finito de divisões celulares as células que foram imortalizadas por mutações espontâneas ou manipulação genética podem ser mantidas indefinidamente como linhagens celulares As células de hibridomas são amplamente uti lizadas para produzir quantidades ilimitadas de anticorpos monoclonais homogêneos utilizados para detectar e purificar proteínas celulares assim como no diagnóstico e no tratamento de doenças PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS O desafio de isolar um único tipo de proteína a partir de milhares de outras proteínas presentes em uma célula é formidável mas deve ser vencido para permitir o estudo da função das proteínas in vitro Como veremos mais adiante neste capítulo a tecnologia do DNA recombinante pode simplificar muito a tarefa de enganar as células para a pro dução de grandes quantidades de uma certa proteína tornando sua purificação muito mais fácil Independentemente de a fonte da proteína ser uma célula modificada ou um tecido normal o procedimento de purificação normalmente inicia com o fracionamento subcelular para reduzir a complexidade do material sendo então seguido por etapas de purificação com especificidade crescente Células podem ser divididas em seus componentes Para purificar uma proteína ela precisa primeiro ser extraída da célula As células po dem ser rompidas de várias maneiras podem ser submetidas ao choque osmótico ou à vibração ultrassônica forçadas a atravessar um pequeno orifício ou maceradas em um processador Esses procedimentos rompem várias das membranas da célula incluindo a membrana plasmática e o retículo endoplasmático em fragmentos que imediatamente se unem para formar pequenas vesículas fechadas Se aplicados com cuidado entretan to os procedimentos de ruptura deixam organelas como o núcleo a mitocôndria o apa relho de Golgi os lisossomos e os peroxissomos intactos A suspensão de células é desse modo reduzida a um caldo grosso chamado de homogenato ou extrato que contém uma variedade de organelas envolvidas por membranas cada qual com tamanho carga e densidade distintas Uma vez que o meio de homogenização tenha sido escolhido com cuidado por tentativa e erro para cada organela os vários componentes incluindo as vesículas derivadas do retículo endoplasmático chamadas de microssomos retêm a maioria das suas propriedades bioquímicas originais Os diferentes componentes do homogenato devem então ser separados Tais fra cionamentos celulares tornaramse possíveis somente após o desenvolvimento comer cial no início dos anos de 1940 de um instrumento chamado de ultracentrífuga prepa rativa que centrifuga extratos de células rompidas em altas velocidades Figura 85 Esse tratamento separa os componentes celulares por tamanho e densidade em geral os objetos maiores experimentam as forças centrífugas maiores e se movem mais rapi damente A uma velocidade relativamente baixa componentes grandes como núcleos depositamse no fundo do tubo da centrífuga a uma velocidade levemente mais alta um sedimento de mitocôndrias é depositado a velocidades ainda mais alta e com períodos mais longos de centrifugação primeiro as vesículas pequenas fechadas e depois os ri bossomos podem ser coletados Figura 86 Todas essas frações são impuras mas vá 446 PARTE III Formas de trabalhar com células rios contaminantes podem ser removidos ressuspendendose o sedimento e repetindo se o procedimento de centrifugação várias vezes A centrifugação é a primeira etapa na maioria dos fracionamentos porém ela se para apenas os componentes que diferem muito em tamanho Um grau mais refinado de separação pode ser alcançado colocandose o homogenato de maneira que forme uma fina camada no topo de uma solução salina em um tubo de centrífuga Quando centrifu gados os vários componentes na mistura movemse como uma série de bandas distintas pela solução cada uma em uma velocidade diferente em um processo chamado de se dimentação por velocidade Figura 87A Para que o procedimento funcione de forma efetiva é preciso evitar que as frações se misturem por convecção o que normalmente ocorre quando uma solução mais densa p ex uma solução contendo organelas é co locada no topo de uma solução menos densa uma solução salina Isso é conseguido preenchendose o tubo de centrífuga com um gradiente de sacarose preparado por um misturador especial O gradiente de densidade resultante com a parte mais densa no fundo do tubo mantém cada região da solução mais densa do que qualquer solução acima dela prevenindo dessa forma que uma mistura por convecção distorça a sepa ração Quando sedimentados por gradientes de sacarose os diferentes componentes ce lulares separamse em bandas distintas que podem ser coletadas individualmente A ve locidade relativa na qual cada componente sedimenta depende principalmente do seu tamanho e forma normalmente sendo descrita em termos de coeficiente de sedimen tação ou valor S As centrífugas atuais giram a velocidades de até 80000 rpm e produzem forças tão altas quanto 500 mil vezes a gravidade Essa enorme força induz até mesmo moléculas pequenas como moléculas de RNA transportador tRNA e simples enzimas a sedimentar a uma velocidade apreciável e permite que essas moléculas sejam separa das umas das outras pelo tamanho Rotor Motor Refrigeração Vácuo Câmara protetora A B Material em sedimentação Motor Refrigeração Vácuo Material em sedimentação Dobradiça Figura 85 Ultracentrífuga preparativa A A amostra é colocada em tubos que são colocados em um anel de orifícios cilíndricos angulados em um rotor de metal A rápida rotação do rotor gera forças centrífugas enor mes que fazem as partículas na amostra sedimentarem contra a lateral do fundo dos tubos de amostras como mostrado O vácuo reduz a fricção prevenindo o aquecimento do rotor e permitindo a refrigeração do sistema para manter a amostra a 4C B Alguns métodos de fracionamento requerem um tipo diferente de rotor cha mado de rotor móvel swingingbucket Nesse caso os tubos de amostra são colocados em tubos de metal com dobradiças que permitem que os tubos se movimentem quando o rotor girar Dessa forma os tubos de amostra ficam na horizontal durante a centrifugação e as amostras são sedimentadas de encontro ao fundo do tubo e não nas laterais do tubo permitindo uma melhor separação de componentes com tamanhos diferentes ver Figuras 86 e 87 Figura 86 Fracionamento celular por centrifugação A centrifugação repetida a velocidades progressivamente mais altas fracionará homogenatos de células em seus componentes Em geral quanto menor o componente subcelular maior é a força centrí fuga necessária para sedimentálo Valores típicos para as várias etapas de centrifugação referidos na figura são Velocidade baixa 1000 vezes a gravidade por 10 minutos Velocidade média 20000 vezes a gravidade por 20 minutos Velocidade alta 80000 vezes a gravidade por 1 hora Velocidade muito alta 150000 vezes a gravidade por 3 horas Homogenato de células O sedimento contém células inteiras núcleos citoesqueletos SOBRENADANTE SUBMETIDO À CENTRIFUGAÇÃO DE VELOCIDADE MÉDIA O sedimento contém mitocôndrias lisossomos peroxissomos SOBRENADANTE SUBMETIDO À CENTRIFUGAÇÃO DE VELOCIDADE ALTA O sedimento contém microssomos vesículas pequenas SOBRENADANTE SUBMETIDO À CENTRIFUGAÇÃO DE VELOCIDADE MUITO ALTA O sedimento contém ribossomos vírus macromoléculas grandes CENTRIFUGAÇÃO EM VELOCIDADE BAIXA CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 447 A ultracentrífuga também é utilizada para separar componentes celulares com base em sua densidade de flutuação independentemente de seu tamanho e forma Nesse caso a amostra é sedimentada por um gradiente de densidade que contém uma concentração muito alta de sacarose ou de cloreto de césio Cada componente celular começa a descer pelo gradiente como na Figura 87A mas finalmente alcança uma po sição em que a densidade da solução é igual a sua própria densidade Nesse ponto o componente flutua e não pode mais se mover adiante Uma série de bandas distintas é então produzida no tubo de centrífuga com as bandas mais próximas do fundo do tubo contendo componentes de maior densidade de flutuação Figura 87B Esse método chamado de sedimentação por equilíbrio é tão sensível que é capaz de separar macro moléculas que incorporaram isótopos pesados como 13C ou 15N das mesmas moléculas que contêm isótopos comuns mais leves 12C ou 14N De fato o método de cloreto de césio foi desenvolvido em 1957 para separar o DNA marcado do não marcado após a exposição de uma população de bactérias em crescimento a nucleotídeos precursores contendo 15N esse experimento clássico proporcionou a evidência direta para a replica ção semiconservativa do DNA ver Figura 55 Extratos de células fornecem sistemas acessíveis para o estudo da função celular O estudo de organelas e outros componentes subcelulares grandes isolados na ultracentrí fuga contribuiu muito para o nosso entendimento da função dos diferentes componentes celulares Os experimentos com mitocôndrias e cloroplastos purificados por centrifugação por exemplo demonstraram a função central dessas organelas de converter energia em for mas que a célula possa utilizar Similarmente vesículas soltas formadas a partir de fragmen Figura 87 Comparação entre sedi mentação por velocidade e por equilí brio A Na sedimentação por velocidade os componentes subcelulares sedimentam a velocidades diferentes de acordo com seu tamanho e forma quando colocados sobre uma solução contendo sacarose Para estabilizar as bandas de sedimenta ção contra uma mistura por convecção causada pelas pequenas diferenças na temperatura ou na concentração do solu to o tubo contém um gradiente contínuo de sacarose que aumenta de concentração em direção ao fundo do tubo normal mente de 5 a 20 de sacarose Após a centrifugação os diferentes componentes podem ser coletados de forma individual simplesmente perfurando o tubo plástico de centrífuga com uma agulha e coletan dose as gotas do fundo como ilustrado aqui B Na sedimentação por equilíbrio os componentes subcelulares movemse para cima e para baixo quando centrifu gados em um gradiente até alcançarem uma posição onde sua densidade se iguala à do meio Embora um gradiente de saca rose seja mostrado aqui gradientes mais densos que são muito úteis para separar proteínas e ácidos nucleicos podem ser formados com cloreto de césio As bandas resultantes em equilíbrio podem ser cole tadas como em A Amostra Gradiente de sacarose estabilizador p ex 520 CENTRIFUGAÇÃO Componente de sedimentação lenta Componente de sedimentação rápida FRACIONAMENTO A Amostra Gradiente de sacarose concentrado p ex 2070 Componente de baixa densidade de flutuação Componente de alta densidade de flutuação B SEDIMENTAÇÃO POR VELOCIDADE SEDIMENTAÇÃO POR EQUILÍBRIO 448 PARTE III Formas de trabalhar com células tos dos retículos endoplasmáticos rugoso e liso microssomos têm sido separadas umas das outras e analisadas como modelos funcionais desses compartimentos da célula intacta Similarmente extratos celulares muito concentrados especialmente extratos de oócitos de Xenopus laevis rã africana têm tido um papel crítico no estudo de processos muito complexos e organizados como o ciclo de divisão celular a separação dos cromos somos no fuso mitótico e as etapas de transporte vesicular envolvidas no movimento de proteínas do retículo endoplasmático pelo aparelho de Golgi até a membrana plasmática Os extratos celulares também fornecem em princípio o material inicial para a separação completa de todos os componentes macromoleculares individuais da célula Agora consideramos como essa separação é alcançada dando enfoque às proteínas Proteínas podem ser separadas por cromatografia As proteínas frequentemente são fracionadas por cromatografia em colunas na qual uma mistura de proteínas em solução é passada através de uma coluna contendo uma matriz sólida porosa Diferentes proteínas são retardadas distintamente pela sua inte ração com a matriz e podem ser coletadas separadamente à medida que emergem na parte inferior da coluna Figura 88 Dependendo da escolha da matriz as proteínas podem ser separadas de acordo com sua carga cromatografia de troca iônica sua hi drofobicidade cromatografia hidrofóbica seu tamanho cromatografia de filtração em gel ou sua habilidade de se ligar a pequenas moléculas em particular ou a outras macro moléculas cromatografia de afinidade Vários tipos de matrizes estão disponíveis Colunas de troca iônica Figura 89A são empacotadas com pequenas esferas que carregam uma carga positiva ou uma carga negativa de maneira que as proteínas são fracionadas de acordo com o arranjo das car gas na sua superfície As colunas hidrofóbicas são empacotadas com esferas das quais as cadeias laterais hidrofóbicas se projetam retardando de forma seletiva proteínas com regiões hidrofóbicas expostas As colunas de filtração em gel Figura 89B que separam as proteínas de acordo com o seu tamanho são empacotadas com esferas porosas ínfi mas moléculas que são suficientemente pequenas para entrar nos poros arrastamse lentamente por dentro de sucessivas esferas à medida que descem pela coluna enquan to moléculas maiores permanecem em solução movendose entre as esferas e dessa maneira movendose mais rápido e emergindo da coluna primeiro Além de constituir Figura 88 Separação de moléculas por cromatografia em colunas A amostra uma solução contendo uma mistura de diferentes moléculas é aplicada no topo de uma coluna cilíndrica de vidro ou plástico preenchida por uma matriz sólida permeável como celulose Uma quantida de grande de solvente é então passada lentamente através da coluna e coletada em tubos separados à medida que emerge na parte inferior da coluna Como vários componentes da amostra passam pela coluna em diferentes velocidades eles são fracionados em diferentes tubos Matriz sólida Orifício poroso Tubo de ensaio Moléculas fracionadas eluídas e coletadas Tempo Amostra aplicada Solvente aplicado continuamente no topo da coluna a partir de um grande reservatório de solvente CROMATOGRAFIA EM COLUNAS CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 449 um método de separação de moléculas a cromatografia por filtração em gel é um meio conveniente para estimar seu tamanho A cromatografia de afinidade Figura 89C aproveita as interações de ligações bio logicamente importantes que ocorrem na superfície das proteínas Se uma molécula de substrato é covalentemente ligada a uma matriz inerte como uma esfera de polissacarídeo a enzima que liga este substrato será retida especificamente pela matriz e pode em tal caso ser eluída lavada próximo a sua forma pura Do mesmo modo oligonucleotídeos peque nos de DNA de uma sequência especificamente desenhada podem ser imobilizados dessa maneira e utilizados para purificar proteínas que se ligam ao DNA as quais normalmente reconhecem essa sequência de nucleotídeos nos cromossomos Alternativamente anticor pos específicos podem ser acoplados à matriz para purificar moléculas proteicas reconhe cidas pelos anticorpos Pela alta especificidade de todas essas colunas de afinidade purifi cações de 1000 a 10000 vezes às vezes podem ser alcançadas em um único passo Se iniciarmos com uma mistura complexa de proteínas uma única passagem por uma coluna de troca iônica ou de filtração em gel não produzirá frações muito pu rificadas uma vez que estes métodos não aumentam individualmente a proporção de determinada proteína na mistura em mais de 20 vezes Como a maioria das proteínas individuais representa menos de 11000 das proteínas celulares totais normalmente é necessário utilizar vários tipos diferentes de colunas em sucessão para alcançar uma pu reza suficiente sendo a cromatografia de afinidade a mais eficiente Figura 810 A não homogenidade nas matrizes como a celulose que propicia um fluxo ir regular do solvente através da coluna limita a resolução da coluna de cromatografia convencional Resinas cromatográficas especiais normalmente com base em sílica compostas de esferas ínfimas 3 a 10 mm de diâmetro podem ser empacotadas com um aparelho especial para formar uma coluna uniforme Tais colunas de cromatografia lí quida de alto desempenho HPLC highperformance liquid chromatography possuem um alto grau de resolução Na HPLC os solutos se equilibram rapidamente com o in terior das pequenas esferas e assim solutos com diferentes afinidades pela matriz são separados de maneira eficiente uns dos outros mesmo a fluxos muito rápidos HPLC é portanto o método de escolha para separar várias proteínas e pequenas moléculas A imunoprecipitação é um método rápido de purificação por afinidade A imunoprecipitação é uma variação útil do tema sobre cromatografia de afinidade Os anticorpos específicos que reconhecem a proteína a ser purificada estão ligados a pequenas esferas de agarose Em vez de serem empacotadas em uma coluna como na cromatografia de afinidade uma pequena quantidade de esferas cobertas com o anti corpo é simplesmente adicionada a um extrato proteico em um tubo de ensaio e mistu rada por um curto período de tempo permitindo assim que os anticorpos se liguem à proteína desejada As esferas são então coletadas por centrifugação a baixa velocidade e as proteínas não ligadas presentes no sobrenadante são descartadas Esse método é nor malmente utilizado para purificar pequenas quantidades de enzimas a partir de extratos celulares para análise da atividade enzimática ou para estudos de proteínas associadas Figura 89 Três tipos de matrizes utilizadas para cromatografia A Na cromatografia de troca iônica a matriz insolúvel possui cargas iônicas que retar dam o movimento das moléculas de carga oposta As matrizes utilizadas para separar proteínas incluem dietilaminoetilcelulose DEAEcelulose que é carregada positiva mente e carboximetilcelulose CMcelu lose e fosfocelulose que são carregadas negativamente As matrizes análogas com base em agarose ou em outros polímeros também são utilizadas com frequência A força da associação entre as moléculas dissolvidas e a matriz para troca iônica depende tanto da força iônica quanto do pH da solução que está passando pela coluna que pode portanto ser variada sistematicamente como na Figura 810 para alcançar uma separação efetiva B Na cromatografia de filtração em gel as pequenas esferas que formam a matriz são inertes mas porosas As moléculas que são suficientemente pequenas para penetrar as esferas da matriz retardam e se deslocam mais lentamente através da coluna do que moléculas maiores que não podem penetrar As esferas de polis sacarídeos com ligação cruzada dextran agarose ou acrilamida estão disponíveis comercialmente em uma ampla variedade de tamanho de poros sendo adequadas para o fracionamento de moléculas de vá rias massas moleculares a partir de menos de 500 dáltons até mais de 5 10 6 dál tons C A cromatografia de afinidade uti liza uma matriz insolúvel covalentemente ligada a um ligante específico como uma molécula de anticorpo ou um substrato de uma enzima que ligará uma proteína es pecífica As moléculas de enzimas que se ligam a substratos imobilizados em tais co lunas podem ser eluídas com uma solução concentrada da forma livre da molécula do substrato enquanto moléculas que se ligam a anticorpos imobilizados podem ser eluídas dissociandose o complexo antíge noanticorpo com soluções concentradas de sais ou soluções com pH alto ou baixo Altos graus de purificação são frequen temente alcançados em uma única etapa com uma coluna de afinidade Fluxo do solvente Fluxo do solvente Fluxo do solvente Esfera carregada positivamente Molécula ligada carregada negativamente Molécula livre carregada positivamente A CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA B CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL C CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE Esfera porosa Molécula pequena retardada Molécula grande não retardada Esfera com um substrato ligado covalentemente Molécula da enzima ligada Outras proteínas 450 PARTE III Formas de trabalhar com células Marcadores produzidos por engenharia genética fornecem uma maneira fácil de purificar proteínas Pela utilização dos métodos de DNA recombinante discutidos nas seções subsequentes qualquer gene pode ser modificado para produzir sua proteína com um marcador de reconhecimento especial ligado a ele para fazer a subsequente purificação da proteína de forma simples e rápida Muitas vezes o próprio marcador de reconhecimento é um determinante antigênico ou epítopo que pode ser reconhecido por um anticorpo muito específico O anticorpo pode então ser utilizado para purificar a proteína por cromato grafia de afinidade ou imunoprecipitação Figura 811 Outros tipos de marcadores são especialmente projetados para purificação de proteínas Por exemplo uma sequência repetida de aminoácido histidina se liga a certos íons de metal incluindo níquel e cobre Se técnicas de engenharia genética são utilizadas para ligar uma cauda curta de histidi nas em uma extremidade da proteína a proteína levemente modificada pode ser retida seletivamente em uma coluna de afinidade contendo íons de níquel imobilizados A cro matografia de afinidade por metal pode desse modo ser utilizada para purificar essa proteína modificada a partir de uma mistura molecular complexa Em outros casos uma proteína inteira é utilizada como marcador de reconhecimen to Quando células são modificadas para sintetizar a pequena enzima glutationaStrans Figura 810 Purificação de proteínas por cromatografia Resultados típicos obtidos quando três etapas cromatográ ficas diferentes são utilizadas em suces são para purificar uma proteína Neste exemplo um homogenato de células foi inicialmente fracionado permitindose sua passagem por uma resina de troca iônica empacotada em uma coluna A A coluna foi lavada para remover todos os contaminantes não ligados e as proteínas ligadas foram então eluídas aplicandose uma solução contendo uma concentração de sal que aumenta gradualmente no topo da coluna As proteínas com menor afinidade pela resina de troca iônica pas saram diretamente pela coluna e foram coletadas nas primeiras frações eluídas na parte inferior da coluna As proteínas re manescentes foram eluídas em sequência de acordo com sua afinidade pela resina aquelas proteínas que se ligam mais fortemente à resina requerendo con centrações mais altas de sal para serem removidas A proteína de interesse foi eluída em várias frações e detectada pela sua atividade enzimática As frações com atividade foram selecionadas e então aplicadas em uma coluna de filtração em gel B A posição de eluição da proteína ainda impura foi determinada novamente pela sua atividade enzimática e as frações ativas foram selecionadas e purificadas à homogenidade em uma coluna de afinida de C que continha o substrato da enzima imobilizado INSERIR DNA CODIFICADOR DO MARCADOR DO EPÍTOPO PEPTÍDICO INTRODUZIR NA CÉLULA Gene para a proteína de interesse Purificação rápida da proteína marcada e quaisquer proteínas associadas Proteína epítopomarcada Figura 811 Marcação de epítopos para purificação de proteínas Utili zando técnicas de engenharia genética convencionais um marcador peptídico curto pode ser adicionado a uma proteína de interesse Caso o próprio marcador seja um determinante antigênico ou epí topo ele pode ser alvo de um anticorpo apropriado que pode ser utilizado para purificar a proteína por imunuprecipitação ou cromatografia de afinidade Quantidade relativa Número das frações A CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA Quantidade relativa Número das frações Quantidade relativa Número das frações C CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE B CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL Proteína Atividade Concentração de sal Combinar estas frações e aplicálas à próxima coluna abaixo Combinar estas frações e aplicálas à próxima coluna abaixo Combinar estas frações que agora contêm a proteína altamente purificada Proteína Atividade Proteína Atividade Eluição da solução aplicada à coluna CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 451 ferase GST ligada a uma proteína de interesse a proteína de fusão resultante pode ser purificada a partir de outros conteúdos da célula com uma coluna de afinidade contendo glutationa uma molécula de substrato que se liga especificamente e de modo forte à GST Como um refinamento adicional dos métodos de purificação que utilizam marca dores de reconhecimento uma sequência de aminoácidos que forma um sítio de cliva gem para uma enzima proteolítica altamente específica pode ser inserida entre a pro teína de escolha e o marcador de reconhecimento Como as sequências de aminoácidos no sítio de clivagem raramente são encontradas por acaso nas proteínas o marcador pode ser removido mais tarde sem destruir a proteína purificada Esse tipo de clivagem específica é utilizado em uma metodologia de purificação especialmente potente conhecida como marcação para purificação por afinidade em sequência TAPtagging de tandem affinity purification tagging Aqui uma extremidade da proteína é modificada para conter dois marcadores de reconhecimento separados por um sítio de clivagem de protease O marcador da extremidade do construto é escolhido para se ligar de forma irreversível a uma coluna de afinidade permitindo que a coluna seja lavada extensivamente para remover todas as proteínas contaminantes A clivagem por protease libera a proteína que então é purificada usando o segundo marcador Como essa estratégia de duas etapas fornece um grau especialmente alto de purificação com um esforço relativamente pequeno ela é muito utilizada em biologia celular Assim por exemplo um grupo de aproximadamente 6 mil cepas de leveduras cada uma com um gene diferente fusionado ao DNA que codifica um TAPtag foi construído para per mitir que qualquer proteína de levedura seja purificada rapidamente Sistemas purificados livres de células são necessários à dissecação precisa das funções moleculares Os sistemas purificados livres de células fornecem um meio para estudar processos bioló gicos livres de todas as reações complexas que ocorrem em uma célula viva Para tornar isso possível homogenatos de células são fracionados com a finalidade de purificar cada uma das macromoléculas individuais necessárias para catalisar o processo biológico de interesse Por exemplo os experimentos para decifrar o mecanismo de síntese proteica iniciaram com um homogenato de células que podia traduzir moléculas de RNA para produzir proteínas O fracionamento desse homogenato etapa por etapa produziu por sua vez os ribossomos os tRNAs e várias enzimas que juntas constituem a maquinaria de síntese proteica Uma vez que os componentes individuais puros estão disponíveis cada um pode ser adicionado ou retirado individualmente para definir seu papel exato no processo como um todo O principal objetivo dos biólogos celulares é a reconstituição de cada processo biológico em um sistema livre de células purificado Apenas dessa maneira todos os componentes necessários para o processo podem ser definidos e podese controlar suas concentrações o que é necessário para descobrir seus mecanismos de ação precisos Embora muito ainda precise ser feito uma grande parte do que conhecemos atualmente sobre a biologia molecular das células foi descoberta por estudos em tais sistemas li vres de células Esses sistemas têm sido utilizados por exemplo para decifrar os deta lhes moleculares da replicação do DNA e da transcrição do DNA do splicing do RNA da tradução de proteínas da contração muscular do transporte de partículas ao longo dos microtúbulos e de vários outros processos que ocorrem nas células Resumo As populações de células podem ser analisadas bioquimicamente rompendoas e fracionan do seu conteúdo permitindo que sistemas funcionais livres de células sejam desenvolvidos Os sistemas purificados livres de células são necessários para determinar os detalhes mole culares de processos celulares complexos e o desenvolvimento de tais sistemas requer uma purificação extensiva de todas as proteínas e outros componentes envolvidos As proteínas nos extratos celulares solúveis podem ser purificadas por colunas de cromatografia dependendo do tipo de matriz da coluna proteínas biologicamente ativas podem ser separadas com base em sua massa molecular hidrofobicidade características de carga ou afinidade por outras moléculas Em uma purificação típica a amostra é passada por várias colunas diferentes em CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 453 B C A Proteína com duas subunidades A e B unidas por uma ligação dissulfeto Proteína com uma única unidade A B C SS AQUECIDAS COM SDS E MERCAPTOETANOL SH HS Moléculas de SDS carregadas negativamente ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA A B C Placa de gel de poliacrilamida B A Cátodo Ânodo Amostra aplicada no gel com uma pipeta Cuba de plástico Tampão Tampão Gel A eletroforese bidimensional em gel permite uma maior separação das proteínas Como diferentes proteínas podem ter tamanhos formas massas e carga total diferentes a maioria das técnicas de separação como eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS ou cromatografia de troca iônica não consegue separar todas as proteínas em uma célula ou mesmo em uma organela Em contraste a eletroforese bidimensional em gel que combina dois procedimentos de separação diferentes pode resolver até 2 mil proteínas na forma de um mapa bidimensional de proteínas Na primeira etapa as proteínas são separadas por sua carga intrínseca A amostra é dissolvida em um volume pequeno de uma solução contendo um detergente não iô nico sem carga com bmercaptoetanol e o reagente desnaturante ureia Essa solução solubiliza desnatura e dissocia todas as cadeias polipeptídicas mas mantém suas cargas intrínsecas inalteradas As cadeias polipeptídicas são então separadas em um gradiente de pH por um procedimento chamado de focalização isoelétrica que aproveita a varia ção na carga líquida de uma molécula proteica com o pH da solução onde se encontra Cada proteína tem um ponto isoelétrico característico o pH no qual a proteína não apre Figura 813 Eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS SDSPAGE A Aparelho de eletroforese B Cadeias polipeptídicas individuais formam um complexo com moléculas do dodecilsulfato de sódio SDS carregadas negativa mente e dessa maneira migram como um complexo SDSproteína carregado negativamente através de um gel poroso de poliacrilamida Como a velocidade de migração nessas condições é maior quanto menor for o polipeptídeo essa técnica pode ser utilizada para determinar a massa molecular aproximada de uma cadeia polipeptídica assim como a composição das subunidades de uma proteína Entretanto se a proteína contém uma grande quantidade de carboi dratos ela se moverá anormalmente no gel e sua massa molecular aparente estimada por SDSPAGE será errônea Outras modificações como fosforilação também podem causar pequenas alterações na migração das proteínas no gel Figura 814 Análise de amostras de proteínas por eletroforese em gel de poliacri lamidaSDS A fotografia mostra um gel corado com Coomassie que foi utilizado para detectar as proteínas presentes nos estágios sucessivos da purificação de uma enzima A canaleta mais à esquerda canaleta 1 contém a mistura complexa de proteínas do extrato de células inicial e cada canaleta sucessiva analisa as proteínas obtidas após um fracionamento por cromatografia da amostra de proteína analisada na canaleta anterior ver Figura 810 A mesma quantidade de proteína 10 mg foi aplicada no gel no topo de cada canaleta As proteínas individuais normalmente aparecem como bandas finas co radas com corante entretanto uma banda se alarga quando contém uma grande quanti dade de proteína De T Formosa e BM Alberts J Biol Chem 26161076118 1986 1 2 3 4 5 Massa molecular dáltons 100000 40000 15000 454 PARTE III Formas de trabalhar com células senta carga líquida e dessa maneira não migra em um campo elétrico Na focalização isoelétrica as proteínas são separadas por eletroforese em um pequeno tubo de gel de poliacrilamida onde um gradiente de pH é estabelecido por uma mistura de tampões especiais Cada proteína migra para uma posição no gradiente que corresponde ao seu ponto isoelétrico e permanece lá Figura 815 Essa é a primeira dimensão da eletrofo rese bidimensional em gel de poliacrilamida Na segunda etapa o pequeno tubo de gel contendo as proteínas separadas é novamente submetido à eletroforese mas na direção de um ângulo reto em relação à direção utilizada na primeira etapa Dessa vez o SDS é adicionado e as proteínas são separadas de acordo com o seu tamanho como no SDSPAGE unidimensional o tubo de gel original é submerso em SDS e então colocado ao longo da borda superior de um gel de poliacrilamidaSDS através do qual cada cadeia polipeptídica migra para formar um ponto discreto Essa é a segunda dimensão da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida As únicas proteínas que não separam são aquelas que têm tanto tama nho como ponto isoelétrico idênticos uma situação relativamente rara Mesmo traços de cada cadeia polipeptídica podem ser detectados no gel por vários procedimentos de co loração ou por autorradiografia se a amostra proteica foi inicialmente marcada com um radioisótopo Figura 816 A técnica tem um poder de resolução tão grande que pode distinguir entre duas proteínas que diferem apenas em um único aminoácido carregado ou em um único sítio de fosforilação carregado negativamente Proteínas específicas podem ser detectadas por marcação com anticorpos Uma proteína específica pode ser identificada após o seu fracionamento em um gel de poliacrilamida pela exposição de todas as proteínas presentes no gel a um anticorpo es 4 5 6 7 8 9 10 Gradiente estável de pH Em pH baixo a proteína está carregada positivamente Em pH alto a proteína está carregada negativamente No ponto isoelétrico a proteína não tem carga líquida e assim não migra adiante no campo elétrico para a proteína mostrada o pH isoelétrico é 65 Figura 815 Separação de moléculas proteicas por focalização isoelétrica Em um pH baixo alta concentração de H os grupos do ácido carboxílico das proteínas tendem a ficar sem carga COOH e seus grupos do ácido carboxílico nitrogênio fi cam totalmente carregados p ex NH3 dando à maioria das proteínas uma carga líquida positiva Em pH alto os grupos do ácido carboxílico são negativamente carregados COO e os grupos básicos tendem a ficar sem carga p ex NH2 dando à maioria das proteínas uma carga líquida negativa Em seu pH isoelétrico uma proteína não tem carga líquida uma vez que as cargas positivas e negativas se equilibram Desse modo quando um tubo contendo um gradiente fixo de pH é submetido a um campo elétrico forte na direção apropriada cada espécie proteica migra até formar uma banda delgada em seu pH isoelétrico conforme mostrado Figura 816 Eletroforese bidimensio nal em gel de poliacrilamida Todas as proteínas em uma célula bacteriana de E coli estão separadas nesse gel onde cada ponto corresponde a uma cadeia polipeptídica diferente As proteínas foram primeiramente separadas com base no seu ponto isoelétrico por focalização isoelétri ca na dimensão horizontal Depois foram fracionadas de acordo com sua massa molecular por eletroforese de cima para baixo na presença de SDS Observe que proteínas diferentes estão presentes em quantidades muito diferentes As bactérias foram cultivadas na presença de uma mistura de aminoácidos marcados com ra dioisótopos de maneira que todas as suas proteínas são radioativas e puderam ser detectadas por autorradiografia Cortesia de Patrick OFarrell Básico Gradiente estável de pH 100 50 25 Migração em SDS massa molecular em quilodáltons Ácido CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 455 pecífico que tenha sido marcado com um isótopo radioativo ou um corante fluorescen te Esse procedimento normalmente é realizado depois de todas as proteínas separadas presentes no gel terem sido transferidas para uma folha de papel de nitrocelulose ou membrana de náilon Colocase a membrana sobre o gel e direcionase as proteínas para fora dele com uma corrente elétrica forte para transferir a proteína para a membrana Então a membrana é colocada em uma solução com o anticorpo marcado para revelar a proteína de interesse Esse método de detecção de proteínas é chamado de Western blot ting ou immunoblotting Figura 817 Os métodos sensíveis de Western blotting podem detectar quantidades muito pequenas de determinada proteína 1 nanograma ou menos a partir do extrato celular total ou outras misturas proteicas heterogêneas O método pode ser bastante útil quando avaliamos as quantidades de uma determinada proteína na célu la ou quando medimos as alterações nessas quantidades sob várias condições Medidas hidrodinâmicas revelam o tamanho e a forma de um complexo proteico A maioria das proteínas em uma célula atua como parte de complexos maiores e o conhe cimento do tamanho e da forma desses complexos muitas vezes revela informações a res peito da sua função Essas informações podem ser obtidas de várias maneiras importan tes Às vezes um complexo pode ser diretamente visualizado utilizandose a microscopia eletrônica como descrito no Capítulo 9 Uma abordagem complementar tem como base as propriedades hidrodinâmicas de um complexo ou seja seu comportamento à medida que se move por um meio líquido Normalmente duas medidas separadas são realizadas Uma medida é a velocidade de um complexo à medida que ele se move sob a influência de um campo centrífugo produzido por uma ultracentrífuga ver Figura 87A O coeficiente de sedimentação ou valor S obtido depende tanto do tamanho como da forma do com plexo e não revela por si só informação especialmente útil Entretanto uma vez que uma segunda medida hidrodinâmica é realizada mapeandose a migração de um complexo por uma coluna de cromatografia de filtração em gel ver Figura 89B tanto a forma aproximada de um complexo quanto sua massa molecular podem ser calculadas A massa molecular também pode ser determinada mais diretamente utilizandose uma ultracentrífuga analítica um aparelho complexo que permite que medidas da ab sorbância proteica de uma amostra sejam realizadas enquanto ela é submetida a forças centrífugas Nessa abordagem a amostra é centrifugada até atingir o equilíbrio onde a força centrífuga sobre um complexo proteico se equilibra exatamente com sua tendência a difundir Como seu ponto de equilíbrio é dependente na massa molecular do comple xo mas não na sua forma particular a massa molecular pode ser diretamente calculada A espectrometria de massa fornece um método altamente sensível para identificar proteínas desconhecidas Um problema frequente na biologia celular e bioquímica é a identificação de uma pro teína ou cojunto de proteínas obtidas por um dos processos de purificação discutidos nas páginas anteriores Como as sequências dos genomas da maioria dos organismos experimentais são agora conhecidas catálogos de todas as proteínas produzidas nes ses organismos estão disponíveis A tarefa de identificar uma proteína desconhecida ou Figura 817 Western blotting Todas as proteínas de células de tabaco em divisão em cultura foram inicialmente separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional Em A as posições das proteínas são reveladas por uma coloração sensível a proteínas Em B as proteínas separadas em um gel idêntico foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e expostas a um anticorpo que reconhece apenas aquelas proteínas fosforiladas nos resíduos de treonina durante a mitose As posições de poucas proteínas reconhecidas por esse anticorpo são reveladas por um anticorpo secundário ligado a uma enzima De JA Traas et al Plant J 2723732 1992 Com autoriza ção de Blackwell Publishing A B 456 PARTE III Formas de trabalhar com células um conjunto de proteínas desconhecidas se reduz a comparar algumas sequências de aminoácidos presentes na amostra desconhecida com genes conhecidos catalogados Essa tarefa agora é realizada quase que exclusivamente pelo uso da espectrometria de massa em conjunto com pesquisas de dados pelo computador As partículas carregadas têm uma dinâmica muito precisa quando submetidas a um campo elétrico ou magnético no vácuo A espectrometria de massa explora esse prin cípio para separar íons de acordo com a sua relação massacarga mz É uma técnica muito sensível Ela requer pouco material e é capaz de determinar a massa precisa de proteínas intactas e de peptídeos derivados delas por clivagem enzimática ou química As massas podem ser obtidas com bastante acuidade muitas vezes com um erro de me nos de uma parte em 1 milhão A espectrometria de massa é realizada utilizando instrumentos complexos com três principais componentes Figura 818A O primeiro é a fonte de íons que transfor ma minúsculas quantidades de uma amostra de peptídeo em moléculas de peptídeos individuais carregadas contendo gás Esses íons são acelerados por um campo elétrico para dentro do segundo componente o analisador de massa onde campos elétricos ou magnéticos são usados para separar os íons com base em suas relações massacarga Finalmente os íons separados colidem com um detector que gera um espectro de massa contendo uma série de picos que representam as massas das moléculas na amostra Existem vários tipos diferentes de espectrômetros de massa variando principal mente na natureza de suas fontes de íons e analisadores de massa Uma das fontes mais comuns de íons depende de uma técnica chamada ionização e dessorção a laser assistida por matriz MALDI do inglês matrixassisted laser desorption ionization Nessa aborda gem as proteínas na amostra são primeiramente clivadas em peptídeos menores por uma protease como a tripsina Esses peptídeos são misturados com um ácido orgânico e então colocados para secar sobre uma lâmina de metal ou cerâmica Um breve disparo de laser é Mistura peptídica Fonte de íons Fonte de íons Analisador de massa Detector Mistura peptídica Filtro de massa seleção de íon precursor Analisador de massa análise do produto dos íons Fragmentação Detector A ESPECTROMETRIA DE MASSA PADRÃO MS B ESPECTROMETRIA DE MASSA SEQUENCIAL MSMS MS1 MS2 Gás inerte 1000 2000 1500 2500 Relação massacarga mz Relação massacarga mz Abundância relativa 0 100 200 600 1000 Abundância relativa 0 100 Figura 818 O espectrômetro de massa A Espectrômetros de massa utilizados na biologia contêm uma fonte de íons que gera peptídeos gasosos ou outras moléculas sob condições que tornam a maioria das moléculas carregadas positivamente Os dois principais tipos de fontes de íons são MALDI e electrospray como descrito no texto Os íons são acelerados para dentro do analisador de massa que separa os íons com base na sua massa e carga por um dos três prin cipais métodos 1 Analisadores timeofflight TOF determinam a relação entre massa e carga de cada íon na mistura a partir da velocidade na qual viajam da fonte de íons até o detector 2 Filtros de massa quadrupolo contêm uma longa câmara revestida por quatro eletrodos que produzem campos elétricos osci lantes que controlam a trajetória dos íons por meio da variação das propriedades do campo elétrico por uma ampla extensão é permitida a passagem de um espectro de íons com relação massacarga específica pela câmara de um detector enquanto outros íons são descartados 3 Captura de íons ion traps possuem eletrodos na forma de anéis que produzem um campo elétrico tridimensional que aprisiona todos os íons em uma câmara circular as propriedades do cam po elétrico podem ser variadas por uma ampla extensão para ejetar um espectro de íons específicos para um detector B Espectrometria de massa sequencial normalmente envolve dois analisadores de massa separados por uma câmara de colisões contendo um gás inerte de alta energia O campo elétrico do primeiro analisador de massa é ajustado para selecionar um determinado íon chamado de íon precursor que então é direcionado para câmara de colisões A colisão do peptídeo com as moléculas de gás causa a fragmentação aleatória dos peptídeos principalmente nas ligações peptídicas resultando em uma mistura altamen te complexa de fragmentos que contêm um ou mais aminoácidos a partir do peptídeo original Então o segundo analisador de massa é utilizado para medir as massas dos fragmentos chamados produto ou íonsfilhos Com o auxílio de um computador o padrão dos fragmentos pode ser utilizado para deduzir a sequência de aminoácidos do peptídeo original CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 457 direcionado para a amostra produzindo uma nuvem gasosa de peptídeos ionizados cada um carregando uma ou mais cargas positivas Em muitos casos a fonte de íons MALDI é acoplada a um analisador de massa chamado de analisador timeofflight TOF que é uma câmara longa pela qual os peptídeos ionizados são acelerados por um campo elétrico em direção ao detector Sua massa e carga determinam o tempo que levam para alcançar o detector peptídeos grandes se movem mais lentamente e moléculas muito carregadas se movem mais de forma mais rápida Pela análise desses peptídeos ionizados que carregam uma única carga as massas precisas dos peptídeos presentes na amostra original podem ser determinadas Essa informação é então utilizada para analisar bancos de dados nos quais as massas de todas as proteínas e de todos os seus fragmentos peptídicos preditos foram organizadas a partir de sequências genômicas do organismo Uma combinação clara com uma determinada fase de leitura aberta frequentemente pode ser realizada sabendo se a massa de apenas alguns peptídeos derivados de uma proteína específica Utilizandose dois analisadores de massa em sequência um arranjo conheci do como MSMS Figura 818B é possível determinar diretamente as sequências de aminoácidos de peptídeos individuais em uma mistura complexa O instrumento MALDITOF descrito anteriormente não é o ideal para este método Em vez disto MSMS normalmente envolve uma fonte de íons electrospray que produz um feixe contínuo del gado de peptídeos que são ionizados e acelerados para dentro do primeiro analisador de massa O analisador de massa normalmente é um quadrupolo ou captura de íons que emprega grandes eletrodos para produzir campos elétricos oscilantes dentro da câmara que contém os íons Esses instrumentos atuam como filtros de massa o campo elétrico é ajustado por uma ampla faixa para selecionar um único íon de peptídeo e descartar todos os outros na mistura de peptídeos Na espectrometria de massa em sequência esse único íon é então exposto a um gás inerte de alta energia que colide com o peptídeo resultando na fragmentação principalmente nas ligações peptídicas Então o segundo analisador de massa determina as massas dos fragmentos peptídicos que podem ser utilizadas por métodos computacionais para determinar a sequência de aminoácidos do peptídeo original e assim identificar a proteína da qual ele foi originado A espectrometria de massa em sequência também é útil para detectar e mapear com precisão modificações póstraducionais das proteínas como fosforilações ou aceti lações Como essas modificações conduzem a um aumento de massa característico em um aminoácido eles são facilmente detectados durante a análise dos fragmentos pep tídicos no segundo analisador de massa e o local preciso da modificação muitas vezes pode ser deduzido a partir de um espectro de fragmentos peptídicos Uma técnica de espectrometria de massa bidimensional potente pode ser utiliza da para determinar todas as proteínas presentes em uma organela ou outra mistura com plexa de proteínas Primeiro a mistura de proteínas presente é digerida com tripsina para produzir pequenos peptídeos Depois esses peptídeos são separados por cromatografia líquida LC de alto desempenho Cada fração de peptídeos a partir da coluna cromato gráfica é injetada diretamente em uma fonte de íons electrospray em um espectrômetro de massa em sequência MSMS fornecendo a sequência de aminoácidos e modificações póstraducionais para cada peptídeo na mistura Esse método muitas vezes chamado de LCMSMS é utilizado para identificar centenas ou milhares de proteínas em misturas proteicas complexas a partir de organelas específicas ou de células inteiras Também pode ser utilizado para mapear todos os sítios de fosforilação na célula ou todas as proteínas marcadas por outras modificações póstraducionais como acetilação ou ubiquitinação Grupos de proteínas que interagem podem ser identificados por métodos bioquímicos Como a maioria das proteínas na célula funciona como parte de complexos com outras proteínas uma importante maneira para começar a caracterizar o papel biológico de uma proteína desconhecida é identificar todas as outras proteínas com as quais ela se liga especificamente Um método fundamental para identificar proteínas que se ligam umas às outras de maneira forte é a imunoprecipitação Uma proteínaalvo específica é imunoprecipitada a partir de lisados celulares utilizando anticorpos específicos acoplados a esferas como descrito anteriormente Se a proteínaalvo está associada de forma suficientemente forte 458 PARTE III Formas de trabalhar com células a outra proteína quando ela é capturada pelo anticorpo a proteína ligada também preci pita e pode ser identificada por espectrometria de massa Esse método é útil para iden tificar proteínas que fazem parte de um complexo dentro das células incluindo aquelas que interagem apenas de maneira transiente por exemplo quando moléculas de sina lização extracelulares estimulam as células discutido no Capítulo 15 Além de capturar complexos proteicos em colunas ou em tubos de ensaio pesqui sadores estão desenvolvendo arranjos de proteínas com alta densidade para investigar as interações proteicas Esses arranjos que contêm milhares de proteínas diferentes ou anticorpos distribuídos em uma lâmina de vidro imobilizados em minúsculos poços permitem que se pesquise as atividades bioquímicas e os perfis de ligação de um grande número de proteínas de uma só vez Por exemplo se incubarmos uma proteína marca da fluorescentemente com arranjos contendo milhares de proteínas imobilizadas cada ponto destes que permanece fluorescente após lavagem extensiva contém uma proteína que se liga de modo específico à proteína marcada Métodos ópticos podem monitorar as interações entre proteínas Uma vez que se sabe que duas proteínas ou uma proteína e uma molécula pequena se associam tornase importante caracterizar sua interação com mais detalhes As proteí nas podem se associar por mais ou menos tempo como as subunidades da RNApolime rase ou o proteassomo ou interagir em encontros transitórios que podem durar apenas poucos milissegundos como uma proteínacinase e seu substrato Para compreender como uma proteína funciona dentro de uma célula precisamos determinar com qual afinidade ela se liga a outras proteínas o quão rápido ela se dissocia e como modifica ções covalentes pequenas moléculas ou outras proteínas influenciam essas interações Como discutido no Capítulo 3 ver Figura 344 o grau de interação entre duas proteínas é determinado pelas velocidades nas quais elas se associam e dissociam Essas velocidades dependem respectivamente da constante de associação kon e da constante de dissociação koff A constante cinética koff é um número particularmente útil pois for nece informações valiosas sobre por quanto tempo duas proteínas permanecem unidas uma à outra A razão das duas constantes cinéticas konkoff gera outro número bastante útil chamado de constante de equilíbrio K também conhecida como Keq ou Ka o in verso desta é a constante de dissociação Kd mais comumente utilizada A constante de equilíbrio é útil como um indicador geral da afinidade da interação e pode ser utilizada para estimar a quantidade do complexo de ligação em diferentes concentrações das duas proteínas parceiras fornecendo desse modo informações sobre a importância da inte ração nas concentrações proteicas encontradas dentro da célula Uma ampla variedade de métodos pode ser utilizada para determinar as constan tes de ligação de um complexo de duas proteínas Em um experimento simples de liga ção de equilíbrio duas proteínas são misturadas em diferentes concentrações até alcan çarem o equilíbrio e a quantidade de complexo ligado é medida Metade do complexo proteico estará ligada a uma determinada concentração que é igual a Kd Os experimen tos de equilíbrio muitas vezes envolvem o uso de marcas radioativas ou fluorescentes em uma das proteínas parceiras acoplado a métodos bioquímicos ou ópticos para medir a quantidade da proteína ligada Em um experimento de ligação cinética mais complexo as constantes cinéticas são determinadas utilizando métodos rápidos que permitem a medida em tempo real da formação do complexo de ligação com o tempo para determi nar kon ou a dissociação de um complexo de ligação com o tempo para determinar koff Técnicas ópticas permitem medidas de ligação particularmente rápidas conve nientes e acuradas e em alguns casos as proteínas nem mesmo necessitam ser marca das Certos aminoácidos p ex triptofano exibem uma fluorescência fraca que pode ser detectada com fluorímetros sensíveis Em muitos casos a intensidade da fluorescência ou o espectro de emissão dos aminoácidos fluorescentes localizados em uma interface entre proteínas se modificará quando duas proteínas se associarem Quando é possível detectar essa alteração por fluorimetria essa técnica fornece uma medida simples e sen sível da ligação da proteína que é útil tanto nos experimentos de equilíbrio e cinética da ligação Uma técnica de ligação óptica relacionada mas com uso mais amplo é baseada em anisotropia de fluorescência uma alteração na luz polarizada que é emitida por uma proteína marcada fluorescentemente nos estados livres e ligados Figura 819 CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 461 Feixe de raios X Fonte de raios X Cristal de proteína Feixes difratados Padrão de difração de raios X obtido a partir do cristal de proteína Parada do feixe A B C D Figura 821 Cristalografia por raios X A Um feixe estreito de raios X é direcionado para um cristal bem organizado B Mostrado aqui está um cristal da proteína ribulose bifosfato carboxilase uma enzima com um papel central na fixação de CO2 durante a fotossíntese Os átomos no cristal espalham parte do feixe e as ondas dispersas intensi ficam umas às outras em determinados pontos aparecendo como um padrão de pontos de difração C Esse padrão de difração com a sequência de aminoácidos da proteína pode ser utilizado para produzir um modelo atômico D O modelo atômico completo é difícil de interpretar mas essa versão simplificada derivada dos dados de difração de raios X mostra as características da estrutura proteica claramente ahélices verde fitas b ver melho Os componentes representados em A até D não estão representados em escala B cortesia de C Branden C cortesia de J Hajdu e I Andersson D adaptado a partir do original fornecido por B Furugren A RMN pode ser utilizada para determinar a estrutura de proteínas em solução A espectroscopia por ressonância magnética nuclear RMN tem sido utilizada por vários anos para analisar a estrutura de pequenas moléculas pequenas proteínas ou do mínios proteicos Diferentemente da cristalografia por raios X a RMN não depende da disponibilidade de amostra cristalina Essa técnica simplesmente requer um pequeno volume de solução proteica concentrada que é submetida a um campo magnético forte de fato ela é a principal técnica que gera evidências detalhadas sobre a estrutura tridi mensional de moléculas em solução Certos núcleos atômicos particularmente o núcleo do hidrogênio têm um momen to magnético ou spin isto é eles possuem uma magnetização intrínseca como uma barra magnética O spin se alinha ao longo do campo magnético forte mas pode ser mudado para um estado excitado desalinhado em resposta a pulsos de radiofrequência RF apli cados de radiação eletromagnética Quando o núcleo de hidrogênio excitado retorna a seu estado alinhado ele emite a radiação RF que pode ser medida e representada como um espectro A natureza da radiação emitida depende do ambiente em que cada núcleo de hidrogênio se encontra e se um núcleo é excitado ele influencia a absorção e a emissão da radiação por outro núcleo localizado próximo a ele Consequentemente é possível por uma elaboração engenhosa da técnica de RMN básica conhecida como RMN bidimensio nal distinguir os sinais a partir do núcleo de hidrogênio em diferentes resíduos de ami noácidos e identificar e medir as pequenas mudanças nesses sinais que ocorrem quando os núcleos de hidrogênio estão próximos o suficiente para interagir Como o tamanho de tal mudança revela a distância entre o par de átomos de hidrogênio que estão interagindo a RMN pode fornecer informações sobre as distâncias entre as partes da molécula pro 462 PARTE III Formas de trabalhar com células teica Combinandose essa informação ao conhecimento da sequência de aminoácidos é possível em princípio computar a estrutura tridimensional da proteína Figura 822 Por razões técnicas a estrutura de pequenas proteínas de cerca de 20 mil dáltons ou menos pode ser mais prontamente determinada por espectroscopia de RMN A re solução diminui à medida que o tamanho de uma macromolécula aumenta Contudo avanços técnicos recentes elevaram o limite para cerca de 100 mil dáltons tornando dessa forma a maioria das proteínas acessível à análise estrutural por RMN Como estudos por RMN são realizados em solução esse método também oferece um meio conveniente de monitorar alterações na estrutura proteica por exemplo du rante o enovelamento da proteína ou quando a proteína se liga a outra molécula A RMN também é muito utilizada para investigar moléculas diferentes de proteínas sendo útil por exemplo como um método para determinar as estruturas tridimensionais de molé culas de RNA e as cadeias laterais complexas de carboidratos das glicoproteínas Um terceiro método para determinação da estrutura proteica e particularmente da estrutura de grandes complexos proteicos é a análise de uma única partícula por micros copia eletrônica Discutiremos essa abordagem no Capítulo 9 A sequência da proteína e sua estrutura fornecem informações sobre a função proteica Tendo discutido métodos para purificar e analisar proteínas voltamos para uma situa ção comum na biologia celular e molecular um pesquisador identificou um gene impor tante para um processo biológico mas não tem conhecimento direto das propriedades bioquímicas do seu produto proteico Graças à proliferação das sequências de proteínas e ácidos nucleicos que estão ca talogadas nos bancos de dados genômicos a função de um gene e a proteína por ele codificada pode muitas vezes ser predita simplesmente comparandose sua sequência com as dos genes anteriormente caracterizados Como a sequência de aminoácidos determina a estrutura proteica e a estrutura dita a função bioquímica as proteínas que compartilham uma sequência de aminoácidos similar normalmente têm a mesma estru tura e realizam funções bioquímicas semelhantes mesmo quando são encontradas em organismos pouco relacionados Na biologia celular moderna o estudo de uma proteína recémdescoberta normalmente inicia por uma procura por proteínas previamente ca racterizadas que são similares em suas sequências de aminoácidos A procura por genes ou proteínas similares em um conjunto de sequências conhe cidas normalmente é realizada pela internet e envolve simplesmente a seleção de um banco de dados e a entrada da sequência desejada Um programa de alinhamento de sequências o mais popular é o BLAST rastreia o banco de dados por sequências si milares deslizando a sequência submetida ao longo das sequências arquivadas até que Figura 822 Espectroscopia por RMN A Um exemplo dos dados da máquina de RMN Esse espectro bidimen sional de RMN é derivado do domínio Cterminal da enzima celulase Os pontos representam as interações entre átomos de hidrogênio que estão quase adjacentes na proteína e então refletem a distância que os separa Os métodos computa cionais complexos em conjunto com a sequência de aminoácidos conhecida per mitem que estruturas compatíveis possí veis sejam derivadas Em B 10 estruturas da enzima que satisfazem as restrições de distância igualmente estão representadas sobrepostas dando uma boa indicação da provável estrutura tridimensional Cortesia de P Kraulis A B CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 463 um grupo de resíduos se alinhe total ou parcialmente Figura 823 Tais comparações podem predizer as funções de proteínas individuais de famílias proteicas ou mesmo da maioria do complemento da proteína de um organismo recémsequenciado Como explicamos no Capítulo 3 várias proteínas que adotam a mesma conforma ção e têm funções relacionadas possuem uma relação muito distante para serem identi ficadas a partir de uma comparação de apenas sua sequência de aminoácidos ver Figura 313 Assim a capacidade de predizer com precisão a estrutura tridimensional de uma proteína a partir da sua sequência de aminoácidos melhoraria nossa habilidade de inferir uma função proteica a partir da informação da sequência no banco de dados genômico Em anos recentes o principal progresso tem sido realizado na predição da estrutura pre cisa de uma proteína Essas predições têm como base em parte nosso conhecimento de milhares de estruturas proteicas que já foram determinadas por cristalografia por difra ção de raios X e espectrometria RMN e em parte cálculos usando nosso conhecimen to sobre as forças físicas que atuam sobre os átomos Entretanto permanece o desafio substancial e importante para predizer as estruturas de proteínas que são grandes ou têm múltiplos domínios ou para predizer as estruturas com os níveis muito altos de resolução necessários para ajudar na descoberta de substâncias com base em computação Enquanto encontrar sequências e estruturas relacionadas para uma nova proteína fornece várias informações sobre sua função normalmente é necessário testar esses da dos por experimentação direta Entretanto os dados gerados a partir de comparações de sequências normalmente levam o pesquisador na direção correta e com isso o seu uso tornouse uma das estratégias mais importantes na biologia celular moderna Resumo Existem vários métodos para identificar proteínas e analisar suas propriedades bioquí micas estruturas e interações com outras proteínas Os inibidores de pequenas moléculas permitem o estudo das funções das proteínas nas quais eles atuam em células vivas Como as proteínas com estruturas similares frequentemente têm funções semelhantes a atividade bioquímica de uma proteína muitas vezes pode ser predita pesquisandose em bancos de dados proteínas já caracterizadas que são similares em suas sequências de aminoácidos ANÁLISE E MANIPULAÇÃO DE DNA Até o início da década de 1970 o DNA era a molécula biológica mais difícil de ser ana lisada Extremamente longa e quimicamente monótona a fita de nucleotídeos que for ma o material genético de um organismo somente podia ser examinada de forma indi reta pelo sequenciamento de proteína ou pela análise genética Atualmente a situação mudou de forma significativa Antes considerada a macromolécula da célula mais difí cil de ser analisada o DNA passou a ser a mais fácil Agora é possível determinar toda sequência nucleotídica do genoma bacteriano ou fúngico em uma questão de horas e a sequência do genoma de um indivíduo humano em menos de um dia Uma vez que a Figura 823 Resultados de uma aná lise por BLAST Bancos de dados de sequências podem ser pesquisados para encontrar sequências similares de ami noácidos ou de nucleotídeos Aqui uma busca por proteínas similares à proteína humana reguladora do ciclo celular Cdc2 Query localizou a Cdc2 de milho Sbjct que é idêntica em 68 à Cdc2 huma na na sua sequência de aminoácidos O alinhamento inicia no resíduo 57 da proteína Query sugerindo que a proteína humana tem uma região Nterminal que está ausente na proteína do milho Os blocos verdes indicam as diferenças na sequência e a barra amarela resume as similaridades quando as duas sequências de aminoácidos são idênticas o resíduo é mostrado as substituições similares de aminoácidos estão indicadas por um sinal de mais Apenas uma pequena lacuna foi introduzida indicada pela seta vermelha na posição 194 da sequência Query para alinhar as duas sequências ao máximo O escore de alinhamento Score que é expresso em dois tipos diferentes de unidades leva em conta as penalidades para substituições e lacunas quanto mais alto o escore de alinhamento melhor é a semelhança O significado do alinhamento está refletido no valor de Expectation E que representa quantas vezes se esperaria que ocorresse um alinhamento ao acaso Quanto menor o valor de E mais significa tiva é a semelhança o valor extremamente baixo aqui e 111 indica certa significância Os valores de E muito mais altos do que 01 provavelmente não refletem uma rela ção verdadeira Por exemplo um valor de E de 01 significa que existe uma chance de 1 em 10 de que tal alinhamento ocorra somente por acaso 464 PARTE III Formas de trabalhar com células sequência nucleotídica de um genoma é conhecida qualquer gene individual pode ser facilmente isolado e grandes quantidades do produto gênico seja RNA ou proteína po dem ser produzidas introduzindose o gene em bactérias ou células animais e induzindo estas células a superexpressar o gene estranho ou sintetizandose o produto gênico in vitro Dessa forma proteínas e moléculas de RNA que possam estar presentes em apenas minúsculas quantidades nas células vivas podem ser produzidas em grandes quantida des para análise bioquímica e estrutural Essa abordagem também pode ser utilizada para produzir grandes quantidades de proteínas humanas como insulina ou interferon ou proteínas da coagulação do sangue para uso como fármacos humanos Como veremos mais adiante neste capítulo também é possível aos cientistas alterar um gene isolado e transferilo de volta na linhagem germinativa de um animal ou planta de modo que se torne uma parte funcional e hereditária do genoma do organismo Dessa forma os papéis biológicos de qualquer gene podem ser acessados por meio da observação dos resultados da sua modificação em todo o organismo A habilidade em manipular o DNA com precisão em um tubo de ensaio ou orga nismo conhecida como tecnologia do DNA recombinante teve um impacto dramático em todos os aspectos da biologia celular e molecular permitindo que estudemos roti neiramente as células e suas macromoléculas de maneiras não imagináveis mesmo há 20 anos Entre essas técnicas estão as seguintes manipulações 1 Clivagem de DNA em sítios específicos por meio de nucleases de restrição que faci litaram muito o isolamento e a manipulação de partes individuais de um genoma 2 Ligação de DNA que torna possível unir moléculas de DNA a partir de fontes mui to diferentes 3 Clonagem de DNA pelo uso de vetores de clonagem ou pela reação em cadeia da polimerase na qual uma porção do genoma muitas vezes um gene individual é purificada separadamente do resto do genoma e repetidamente copiada para gerar vários bilhões de moléculas idênticas 4 Hibridização de ácidos nucleicos que torna possível identificar alguma sequência específica de DNA ou de RNA com grande precisão e sensibilidade com base em sua habilidade de se ligar seletivamente a uma sequência complementar de ácidos nucleicos 5 Síntese de DNA que torna possível sintetizar quimicamente moléculas de DNA com qualquer sequência de nucleotídeos independentemente de essa sequência ocorrer ou não na natureza 6 Determinação rápida da sequência de nucleotídeos de qualquer molécula de DNA ou RNA Nas próximas seções descreveremos cada uma dessas técnicas básicas que jun tas revolucionaram o estudo da biologia celular e molecular Nucleases de restrição cortam grandes moléculas de DNA em fragmentos específicos Diferentemente de uma proteína um gene não existe como uma entidade individual nas células mas sim como uma região pequena de uma molécula de DNA muito maior Embora a molécula de DNA na célula possa ser rompida aleatoriamente em peque nos pedaços por força mecânica um fragmento contendo um único gene no genoma de mamíferos continua sendo apenas um entre centenas de milhares de fragmentos de DNA ou até mais indistinguíveis pelo seu tamanho médio Como um desses gene pode ser separado de todos os outros Como todas as moléculas de DNA consistem em uma mistura aproximadamente igual dos mesmos quatro nucleotídeos elas não podem ser prontamente separadas como as proteínas podem de acordo com as suas cargas e pro priedades bioquímicas diferentes A solução desse problema começou a emergir com a descoberta das nucleases de restrição Essas enzimas que são purificadas a partir de bactérias cortam a duplahélice de DNA em sítios específicos definidos pela sequência de nucleotídeos local clivando desse modo uma longa molécula de DNA de fita dupla em fragmentos de tamanhos estritamente definidos 466 PARTE III Formas de trabalhar com células No caso de fragmentos de DNA menores do que 500 nucleotídeos de comprimento géis de poliacrilamida especialmente projetados permitem a separação de moléculas que di ferem apenas em um nucleotídeo no comprimento ver Figura 825C Uma variação da eletroforese em gel de agarose chamada eletroforese em gel de campo pulsado torna possível separar moléculas de DNA extremamente longas mesmo aquelas encontradas em cromossomos inteiros A eletroforese comum em gel falha em separar moléculas de DNA muito grandes pois o campo elétrico estacionário estica as moléculas de modo que elas migrem pelo gel na forma sinuosa em uma velocidade que é independente do seu comprimento Ao contrário na eletroforese de campo pulsado em gel a direção do campo elétrico se modifica periodicamente o que força a molécula a se reorientar antes de continuar a se mover sinuosamente através do gel Essa reorien tação leva muito mais tempo para as moléculas maiores de modo que as moléculas mais longas se movem mais lentamente do que as mais curtas Consequentemente cromos somos inteiros de bactérias ou de leveduras podem ser separados em bandas individuais em géis em campo pulsado podendo desse modo ser classificados e identificados com base no seu tamanho Figura 825D Embora um cromossomo típico de mamífero de 10 8 pares de nucleotídeos ainda seja muito longo para ser separado mesmo dessa forma longos segmentos maiores desses cromossomos são prontamente separados e identifi cados se o DNA cromossômico for previamente cortado com uma nucleasse de restrição selecionada para reconhecer sequências que ocorrem apenas raramente As bandas de DNA em géis de agarose ou de poliacrilamida são invisíveis a menos que o DNA seja marcado ou corado de alguma maneira Um método particularmente sensível para corar DNA é mergulhar o gel no corante brometo de etídio que fluoresce sob luz ultravioleta quando estiver ligado ao DNA ver Figura 825B e D Métodos ainda mais sensíveis incorporam um radioisótopo ou um marcador químico nas moléculas de DNA antes da eletroforese como descreveremos a seguir Figura 825 Moléculas de DNA podem ser separadas por tamanho utilizando ele troforese em gel A Ilustração esquemática comparando os resultados do corte da mesma molécula nesse caso o genoma de um vírus que infecta vespas com duas nucleases de restrição diferentes EcoRI centro e HindIII di reita Os fragmentos são então separados por eletroforese em gel usando uma matriz de gel de agarose Como os fragmentos maiores mi gram mais lentamente do que os menores as bandas na parte inferior do gel contêm os frag mentos de DNA menores Os tamanhos dos fragmentos podem ser estimados comparando os com um conjunto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos esquerda B Fotografia de um gel de agarose mostrando bandas de DNA que foram coradas com brometo de etídeo C Gel de poliacrilamida com pequenos poros foi utilizado para separar moléculas de DNA curtas que diferem por apenas um único nucleotídeo Mostrado aqui estão os resultados de uma reação didesóxi de sequenciamento explicada mais adiante neste capítulo Da esquerda para direita as bandas nas quatro canaletas foram produzidas pela adição de nucleotídeos terminadores de cadeia G A T e C ver Painel 81 As moléculas de DNA foram marcadas com 32P e a imagem mostrada foi produzida expondose o 32P do gel a um pedaço de filme fotográfico produzindo bandas escuras observadas quando o filme foi revelado D A técnica de eletroforese de cam po pulsado em gel de agarose foi utilizada para separar os 16 cromossomos diferentes da espé cie de levedura Saccharomyces cerevisiae que tem em média 220 mil a 25 milhões de pares de nucleotídeos O DNA foi corado como em B As moléculas de DNA tão grandes quanto 10 7 pares de nucleotídeos podem ser separa das dessa maneira B a partir de U Albrecht et al J Gen Virol 7533533363 1994 C cortesia de Leander Lauffer e Peter Walter D a partir de D Vollrath e RW Davis Nucleic Acids Res 1578657876 1987 Com permissão de Oxford University Press Gel de agarose DNA de fita dupla CORTE COM EcoRI CORTE COM HindIII A B C D 23 9 2 23 43 65 Pares de nucleotídeos x 1000 Direção da migração Abaixo Acima APLICAR DNA NO GEL E APLICAR TENSÃO Marcadores de tamanho de DNA Eletrodo negativo Eletrodo positivo Número dos cromossomos 610000 25 milhões 50 30 10 12 4 15 7 16 13 950000 Pares de nucleotídeos 2 14 10 11 5 8 9 3 6 1 220000 Nucleotídeos CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 469 preparadas para serem transitóriamente permeáveis a DNA À medida que essas células crescem e se dividem duplicando em número a cada 30 minutos os plasmídeos recom binantes também replicam para produzir um número enorme de cópias de DNA circular contendo o DNA estranho Figura 829 Uma vez que as células são rompidas e o DNA plasmidial é isolado o fragmento de DNA clonado pode ser prontamente recuperado cortandoo do DNA plasmidial com as mesmas nucleases de restrição que foram utiliza das para inserilo separandoo do DNA plasmidial por eletroforese em gel Juntas essas etapas permitem a amplificação e a purificação de qualquer segmento de DNA a partir do genoma de qualquer organismo Um vetor plasmidial particularmente útil tem como base o plasmídeo F que ocorre naturalmente de E coli Diferentemente de plasmídeos bacterianos menores o plasmídeo F e seu derivado o cromossomo artificial bacte riano BAC bacterial artificial chromosome está presente em apenas uma ou duas cópias por célula de E coli O fato de que BACs são mantidos em tais baixos números significa que podem manter de forma estável sequências de DNA bastante longas até 1 milhão de pares de nucleotídeos de comprimento Com apenas poucos BACs presentes por bactéria é menos provável que os fragmentos de DNA clonados se embaralhem por recombinação com sequências carregadas em outras cópias do plasmídeo Por causa da sua estabilidade capacidade em aceitar grandes insertos de DNA e fácil manipulação os BACs são atualmente o vetor preferido para manipular grandes fragmentos de DNA estranho Como veremos a seguir os BACs foram fundamentais na determinação da se quência de nucleotídeos completa do genoma humano Um genoma inteiro pode estar representado em uma biblioteca de DNA Muitas vezes é conveniente dividir o genoma em fragmentos menores e clonar cada frag mento separadamente usando um vetor plamidial Essa abordagem é útil pois permite aos cientistas trabalharem com facilidade com segmentos menores de um genoma em vez dos cromossomos complicados e inteiros Essa estratégia envolve a clivagem do DNA genômico em pequenos pedaços uti lizando uma nuclease de restrição ou em alguns casos pelo corte mecânico do DNA e ligação da coleção inteira dos fragmentos de DNA em vetores plasmidiais usando condições que favoreçam a inserção de um único fragmento de DNA em cada molécu la plasmidial Esses plasmídeos recombinantes são então introduzidos em E coli em uma concentração que assegura que apenas uma molécula de plasmídeo seja captada por cada bactéria A coleção de moléculas plamidiais clonadas é conhecida como uma biblioteca de DNA Como os fragmentos de DNA são derivados diretamente do DNA cromossômico do organismo de interesse a coleção resultante chamada biblioteca genômica representará o genoma inteiro daquele organismo Figura 830 dividida em dezenas de milhares de colônias bacterianas individuais Figura 829 Um fragmento de DNA pode ser replicado dentro de uma célula bacteriana Para clonar um deter minado fragmento de DNA primeiro ele é inserido em um vetor plasmidial como mostrado na Figura 827 O plasmídeo de DNA recombinante resultante é então introduzido em uma bactéria onde é repli cado vários milhões de vezes quando esta se multiplica Para simplificar o genoma da célula bacteriana não está representado Célula bacteriana DNA PLASMIDIAL RECOMBINANTE DE FITA DUPLA INTRODUZIDO EM UMA CÉLULA BACTERIANA Cultura de células produz centenas de milhões de novas bactérias Várias cópias do plasmídeo purificado isoladas a partir de células bacterianas rompidas Figura 830 Bibliotecas genômicas humanas contendo fragmentos de DNA que representam todo o genoma humano podem ser construídas utilizando nuclea ses de restrição e DNAligase Uma biblioteca genômica consiste em um conjunto de bactérias cada uma portando um fragmento de DNA humano diferente Para simplificar apenas os fragmentos de DNA coloridos são mostrados na biblioteca na realidade todos os fragmentos em cinza também estarão representados INTRODUÇÃO DOS PLASMÍDEOS EM BACTÉRIAS DNA de fita dupla humano Milhões de fragmentos de DNA genômico CLIVAGEM COM NUCLEASES DE RESTRIÇÃO FRAGMENTOS DE DNA INSERIDOS NOS PLASMÍDEOS Moléculas de DNA recombinante Biblioteca genômica de DNA humano CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 471 tecidos produzem conjuntos distintos de moléculas de mRNA uma biblioteca distinta de cDNA é obtida para cada tipo de célula utilizada para preparar a biblioteca Bibliotecas genômicas e de cDNA possuem diferentes vantagens e desvantagens As bibliotecas genômicas são especialmente úteis na determinação de sequências de nu cleotídeos de um genoma inteiro Por exemplo para determinar a sequência de nucleo tídeos do genoma humano este foi dividido em segmentos de aproximadamente 100 mil pares de nucleotídeos onde cada um foi inserido em um plasmídeo BAC e amplificado em E coli A biblioteca genômica resultante consistiu de dezenas de milhares de colônias bacterianas cada uma contendo um inserto de DNA humano diferente A sequência de nucleotídeos de cada inserto foi determinada separadamente e a sequência de todo o genoma foi montada a partir dos segmentos individuais A vantagem mais importante dos clones de cDNA comparada aos clones genô micos é que eles contêm a sequência codificadora ininterrupta de um gene Quando o objetivo da clonagem por exemplo é produzir a proteína em grandes quantidades por meio da expressão do gene em uma célula bacteriana ou levedura é preferível iniciar com cDNA As bibliotecas de cDNA e genômicas são fontes inesgotáveis amplamente compar tilhadas entre os pesquisadores Atualmente várias dessas bibliotecas estão disponíveis comercialmente Como a identidade de cada inserto em uma biblioteca muitas vezes é conhecida por meio do sequenciamento do inserto frequentemente é possível enco mendar determinada região de um cromossomo ou no caso de cDNA um gene com pleto sem íntrons que codifica uma proteína e obtêla pelo correio A clonagem de DNA usando bactérias revolucionou o estudo dos genomas e ainda é bastante utilizada atualmente Entretanto existe uma maneira ainda mais simples de Figura 832 Diferenças entre clones de cDNA e clones de DNA genômico derivados de uma mesma região do DNA Neste exemplo o gene A frequen temente não é transcrito enquanto o gene B frequentemente é transcrito e ambos os genes contêm íntrons laranja Na biblioteca de DNA genômico tanto os íntrons como o DNA não transcrito cinza estão incluídos nos clones e a maioria dos clones contém quando muito apenas parte da sequência codificadora de um gene vermelho Nos clones de cDNA as sequências de íntrons amarelo foram removidas pelo splicing de RNA durante a formação do mRNA azul e uma sequên cia codificadora contínua está presente em cada clone Como o gene B é transcrito mais abundantemente do que o gene A nas células das quais a biblioteca de cDNA foi feita ele está representado com muito mais frequência do que o gene A na bi blioteca de cDNA Em contraste A e B são representados igualmente na biblioteca de DNA genômico Gene A Gene B Gene A Gene B DNA cromossômico Transcritos de RNAs mRNAs BIBLIOTECA GENÔMICA DE DNA Fragmentos de DNA TRANSCRIÇÃO SPLICING DE RNA CLONAGEM DE DNA CLONAGEM DE DNA BIBLIOTECA DE cDNA PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA GENÔMICA PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA DE cDNA Éxon Íntron DNA não transcrito A B DIGESTÃO COM NUCLEASES DE RESTRIÇÃO PARA PRODUZIR FRAGMENTOS DE DNA TRATAMENTO COM TRANSCRIPTASE REVERSA E DNAPOLIMERASE PARA PRODUZIR CÓPIAS DE cDNA A PARTIR DE mRNAs Fragmentos de cDNA 472 PARTE III Formas de trabalhar com células clonar DNA que pode ser realizada totalmente in vitro Discutiremos essa abordagem chamada de reação em cadeia da polimerase a seguir Entretanto primeiro precisamos rever uma propriedade fundamental do DNA e RNA chamada de hibridização A hibridização fornece uma maneira simples mas poderosa para detectar sequências específicas de nucleotídeos Sob condições normais as duas fitas de DNA de uma duplahélice são mantidas unidas por ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares ver Figura 43 Mas essas ligações não covalentes relativamente fracas podem ser facilmente rompidas Essa desnaturação do DNA separará as duas fitas mas não rompe as ligações covalentes que ligam os nucleotídeos em cada fita Possivelmente a maneira mais simples de conseguir essa separação envolve o aquecimento do DNA até cerca de 90C Quando as condições são revertidas baixandose lentamente a temperatura as fitas complementares se unem prontamente para formar novamente a dupla hélice Essa hibridização ou rena turação do DNA é promovida pela reconstituição das ligações de hidrogênio entre os pares de base complementares Figura 833 Vimos no Capítulo 5 que a hibridização do DNA sustenta o processo crucial da recombinação homóloga ver Figura 547 Essa importante capacidade de uma molécula de ácido nucleico de fita simples DNA ou RNA de formar uma dupla hélice com uma molécula de fita simples de uma sequência complementar fornece uma técnica sensível e poderosa para detectar sequên cias nucleotídicas específicas Atualmente simplesmente se planeja uma molécula de DNA de fita simples curta chamada de sonda de DNA que é complementar à sequência de nucleotídeos de interesse Como as sequências nucleotídicas de tantos genomas são conhecidas e são armazenadas em bancos de dados publicamente acessíveis plane jar uma sonda para hibridizar em qualquer parte de uma genoma é simples As sondas são de fita simples normalmente com 30 nucleotídeos de comprimento e normalmente são sintetizadas quimicamente por um serviço comercial por alguns centavos de dólar por nucleotídeo Uma sequência de DNA de 30 nucleotídeos ocorrerá ao acaso apenas uma vez a cada 1 10 18 nucleotídeos 4 30 assim mesmo no genoma humano de 3 10 9 pares de nucleotídeos uma sonda de DNA planejada para parear com uma sequência de 30 nucleotídeos provavelmente não hibridizará ao acaso em qualquer outro local no genoma Isso é claro presumindose que a sequência complementar à sonda não ocorra muitas vezes no genoma condição que pode ser verificada previamente pela varredura da sequência genômica in silico utilizando um computador e planejando sondas que formem pares apenas em um local A hibridização pode ser estabelecida de tal forma que mesmo um único não pareamento previna a hibridização com sequências quase aci dentais A especificidade requintada da hibridização dos ácidos nucleicos pode ser facil mente apreciada no experimento de hibridização in situ no local em latim mostrado na Figura 834 Como veremos neste capítulo a hibridização de ácidos nucleicos possui Figura 833 Uma molécula de DNA pode sofrer desnaturação ou rena turação hibridização Para que duas moléculas fita simples hibridizem elas devem ter sequências nucleotídicas com plementares que permitam o pareamento das bases Neste exemplo as fitas em vermelho e cor de laranja são complemen tares entre elas e as fitas em azul e verde são complementares entre elas Embora a desnaturação por calor seja mostrada o DNA também pode ser renaturado após a desnaturação por tratamento alcalino I I II I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I III I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I II II I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Aqueci mento Resfriamento lento Duplahélice de DNA Desnaturação em fitas simples quebra das ligações de hidrogênio entre os pares de nucleotídeos Renaturação restaura as duplas hélices do DNA pares de nucleotídeos restaurados Figura 834 A hibridização in situ pode ser utilizada para localizar genes em cromossomos isolados Aqui seis sondas de DNA diferentes foram utilizadas para marcar as localizações de suas sequências nucleotídicas comple mentares no Cromossomo 5 humano isolado a partir de uma célula mitótica em metáfase ver Figura 459 e Painel 171 p 980981 As sondas de DNA foram marcadas com diferentes grupamentos químicos ver Figura 826B e foram detectadas usando anticorpos fluorescentes específicos para esses grupamentos O DNA cromossômico foi parcialmente desnaturado permitindo que as sondas formem pares de bases com suas sequências complementares Ambas as cópias materna e paterna do cromossomo 5 são mostradas alinhadas lado a lado Cada sonda gera dois pontos em cada cromossomo uma vez que cromossomos em mitose já replicaram seu DNA e assim cada cromos somo contêm duas hélices de DNA idênticas A técnica aqui empregada é chamada de hibridização de fluorescência in situ FISH fluorescence in situ hybridization Cortesia de David C Ward 474 PARTE III Formas de trabalhar com células todas as moléculas de DNA recémsintetizadas produzidas pela polimerase servem de molde para o próximo ciclo de replicação Figura 836 Por meio desse processo iterativo de amplificação muitas cópias da sequência original podem ser produzidas bilhões após cerca de 20 a 30 ciclos Atualmente a PCR é o método de escolha para clonar fragmentos de DNA relati vamente curtos digamos abaixo de 10 mil pares de nucleotídeos Cada ciclo demora aproximadamente apenas 5 minutos e a automação de todo o procedimento permite a clonagem na ausência de células de um fragmento de DNA em poucas horas O molde original para PCR pode ser DNA ou RNA dessa forma esse método pode ser utilizado para obter um clone genômico completo com íntrons e éxons ou uma cópia de cDNA de um mRNA Figura 837 A PCR também é utilizada para diagnóstico e aplicações forenses O método de PCR é extraordinariamente sensível e pode detectar uma única molécula de DNA em uma amostra se ao menos parte da sequência daquela molécula for conhe cida Os traços de RNA podem ser analisados da mesma maneira sendo transcritos pri meiro em DNA com a transcriptase reversa Por essas razões a PCR é frequentemente empregada para usos que vão além da simples clonagem Por exemplo o método pode ser utilizado para detectar patógenos invasores em estágios bastante iniciais da infecção Nesse caso sequências curtas complementares a um segmento do genoma do agentes infecciosos são utilizadas como iniciadores e após muitos ciclos de amplificação mes mo poucas cópias de uma bactéria invasora ou genoma viral em uma amostra de um paciente podem ser detectadas Figura 838 Para muitas infecções a PCR substituiu o TERCEIRO CICLO produz oito moléculas de DNA de fita dupla SEGUNDO CICLO produz quatro moléculas de DNA de fita dupla FINAL DO PRIMEIRO CICLO SÍNTESE DE DNA SÍNTESE DE DNA Produto do primeiro ciclo AQUECER PARA SEPARAR AS FITAS E RESFRIAR PARA ANELAR OS INICIADORES AQUECER PARA SEPARAR AS FITAS E RESFRIAR PARA ANELAR OS INICIADORES Figura 836 A PCR utiliza repetidos ciclos de separação das fitas hibridização e síntese para amplificar DNA Como o procedimento resumido na Figura 835 é repetido todas os fragmentos recémsintetizados servem como molde no próximo ciclo Uma vez que a polimerase e os oligonucleotídeos inicia dores permanecem na amostra após o primeiro ciclo a PCR simplesmente envolve o aquecimento e então o resfriamento da mesma amostra no mesmo tubo de ensaio repetidamente Cada ciclo duplica a quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior de modo que dentro de poucos ciclos o DNA predominante seja idêntico à sequência delimitada pelos dois iniciadores no molde original incluindo a sequência destes No exemplo aqui ilustrado três ciclos de reação produzem 16 cadeias de DNA 8 das quais em amarelo correspondem exatamente a uma ou a outra fita da sequência original Após mais de quatro ciclos 240 de 256 cadeias de DNA corresponderão exatamente à sequência original e após vários ciclos adicionais essencialmente todas as fitas de DNA terão esse comprimento Normalmente 20 a 30 ciclos são realizados para efetivamente clonar uma região de DNA iniciando a partir do DNA genômico o resto do geno ma permanece não amplificado e portanto sua concentração é negligenciável comparada com a da região amplificada Animação 82 CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 475 uso de antibióticos contra moléculas microbianas para detectar a presença do invasor Ela também é utilizada para verificar a autenticidade de uma fonte de alimento por exemplo se uma amostra de carne realmente vem de um bovino Finalmente a PCR atualmente é bastante utilizada na área forense A extrema sen sibilidade do método permite aos investigadores forenses isolar um DNA a partir de tra ços mínimos de sangue humano ou outro tecido para obter a impressão digital de DNA DNA fingerprint de uma pessoa que deixou a amostra para trás Com a possível exceção de gêmeos o genoma de cada ser humano difere na sequência de DNA daquele de qual Figura 837 A PCR pode ser utilizada para obter clones genômicos ou de cDNA A Para utilizar a PCR para clonar um segmento de DNA cromossômico o DNA genômico total é inicialmente purifi cado a partir de células Os iniciadores da PCR que flanqueiam a fita de DNA a ser clonada são adicionados e vários ciclos de PCR são completados ver Figura 836 Como apenas o DNA entre e incluído os iniciadores é amplificado a PCR provê uma maneira de obter de forma seletiva qualquer extensão de DNA cromossômico de forma efetivamente pura B Para uti lizar a PCR para obter um clone de cDNA de um gene o mRNA total é inicialmente purificado a partir das células O primeiro iniciador é adicionado à população de mRNAs e a transcriptase reversa é utilizada para produzir uma fita de DNA comple mentar à sequência de RNA específica de interesse O segundo iniciador é então adicionado e a molécula de DNA é ampli ficada em vários ciclos de PCR Células Isolamento do DNA Isolamento do mRNA Segmento de DNA a ser clonado Sequência de mRNA a ser clonada ADIÇÃO DO PRIMEIRO INICIADOR TRANSCRIPTASE REVERSA E DESOXIRRIBONUCLEOSÍDEOS TRIFOSFATOS SEPARAÇÃO DAS FITAS E ADIÇÃO DO SEGUNDO INICIADOR AMPLIFICAÇÃO POR PCR COM AMBOS INICIADORES PRESENTES AMPLIFICAÇÃO POR PCR mRNA DNA SEPARAÇÃO DAS FITAS E ADIÇÃO DOS INICIADORES Clones genômicos A Clones de cDNA B DNA cromossômico Amostra de sangue da pessoa infectada REMOÇÃO DAS CÉLULAS POR CENTRIFUGAÇÃO EXTRAÇÃO DE RNA Partícula de HIV rara no plasma da pessoa infectada RNA TRANSCRIÇÃO REVERSA E AMPLIFICAÇÃO POR PCR DO cDNA DE HIV ELETROFORESE EM GEL Controle utilizando sangue de uma pessoa não infectada Plasma Figura 838 A PCR pode ser utilizada para detectar a presença de um genoma viral em uma amostra de sangue Devido à sua capacidade em amplificar muito o sinal a partir de uma única molécula de ácido nucleico a PCR é um método extraordinariamente sensível para detectar quantidadestraço de vírus em uma amostra de sangue ou tecido sem a necessidade de purificar o vírus Para o HIV o vírus que causa Aids o geno ma é uma molécula de RNA de fita simples como ilustrado aqui Além do HIV muitos outros vírus que infectam os humanos atualmente são detectados dessa forma 476 PARTE III Formas de trabalhar com células Número de repetições 5 0 10 15 20 25 30 35 Três pares de cromossomos homólogos Indivíduo A Indivíduo B Indivíduo C Amostra forense F A B C F PCR PCR PCR PCR STR 1 STR 2 STR 3 B A Materno Paterno Sequências repetidas de um lócus STR Iniciadores da PCR SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR POR ELETROFORESE EM GEL ANÁLISE DE UM LÓCUS STR EM UM ÚNICO INDIVÍDUO Cromossomos homólogos Cromossomo materno Cromossomo paterno ELETROFORESE EM GEL Figura 839 A PCR é utilizada na ciência forense para distinguir um indivíduo de outro As sequências de DNA analisadas são repetições curtas em sequência STRs short tandem repeats compostas por sequências como CACACA ou GTGTGT As STRs são encontradas em várias posições lócus no ge noma humano O número de repetições em cada lócus STR é bastante variável na população variando de 4 a 40 em diferentes indivíduos Por causa da variabi lidade nessas sequências os indivíduos normalmente herdam um número diferente de repetições em cada lócus STR a partir de sua mãe e de seu pai portanto dois indivíduos não relacionados raramente contêm o mesmo par de sequências em um determinado lócus STR A A PCR utilizando iniciadores que reconhe cem sequências únicas em cada lado de um determinado lócus STR produzem um par de bandas de DNA amplificado a partir de cada indivíduo uma banda que representa a variante da STR materna e a outra que representa a variante da STR paterna O comprimento do DNA amplificado e portanto sua posição após a eletroforese em gel dependerá do número exato de repetições no lócus B No exemplo esquemático mostrado aqui os mesmos três loci são analisados em amostras a partir de três suspeitos indivíduos A B e C produzindo seis bandas para cada indivíduo Embora pessoas diferentes possam ter várias bandas em comum o padrão geral é bastante distinto para cada pessoa O padrão de bandas pode portanto servir como uma impressão digital do DNA para iden tificar um indivíduo de forma única A quarta canaleta F contém os produtos da mesma amplificação por PCR realizada com uma amostra de DNA forense hipotética que pode ter sido obtida a partir de um único fio de cabelo ou de uma mancha de sangue minúscula deixada na cena do crime Quanto mais lócus forem examinados maior confiabilidade se pode ter sobre os resultados Quando examinamos a variabilidade em 5 a 10 lócus STR diferentes a probabilidade de dois indivíduos ao acaso terem a mesma impressão digital é de aproximadamente 1 em 10 bilhões No caso aqui mostrado os indivíduos A e C podem ser eliminados das investigações enquanto B é um evidente suspeito Uma abordagem similar é utilizada rotineiramente para teste de paternidade CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 477 quer outra pessoa na Terra Utilizando pares iniciadores que têm como alvo sequências genômicas que são conhecidas por serem bastante variáveis na população humana a PCR torna possível gerar uma impressão digital de DNA distinta para qualquer indivíduo Figura 839 Tais análises forenses podem ser usadas não apenas para ajudar a identi ficar indivíduos que cometeram crimes mas também com a mesma importância para exonerar indivíduos que foram acusados injustamente Tanto o DNA como o RNA podem ser rapidamente sequenciados A maioria dos métodos atuais de manipulação do DNA RNA e proteínas baseiase no conhecimento prévio da sequência de nucleotídeos do genoma de interesse Mas como essas sequências foram determinadas pela primeira vez E como as novas moléculas de DNA e RNA são sequenciadas atualmente No final dos anos 1970 pesquisadores desen volveram algumas estratégias para determinar de forma simples e rápida a sequência de nucleotídeos de qualquer fragmento de DNA purificado O método que se tornou o mais amplamente utilizado é chamado de sequenciamento didesóxi ou sequenciamento de Sanger Painel 81 Esse método foi utilizado para determinar a sequência de nucleotí deos de vários genomas incluindo aqueles de E coli moscasdasfrutas vermes nema tódeos camundongos e humanos Hoje métodos mais baratos e rápidos são utilizados rotineiramente para sequenciar DNA e mesmo estratégias mais eficientes estão sendo desenvolvidas ver Painel 81 A sequência referência do genoma humano completada em 2003 custou mais de 1 bilhão de dólares e teve vários cientistas do mundo trabalhan do em conjunto por 13 anos O enorme progresso realizado na década passada tornou possível uma única pessoa completar a sequência de um genoma humano individual em menos de um dia Os métodos resumidos no Painel 81 para o sequenciamento rápido do DNA também podem ser aplicados para o RNA Embora métodos estejam sendo desenvolvidos para se quenciar o RNA diretamente é mais comum fazerse a conversão do RNA para o DNA com plementar usando transcriptase reversa e usar um dos métodos descritos para o sequen ciamento do DNA É importante lembrar que embora o genoma permaneça o mesmo de célula para célula e de tecido para tecido o RNA produzido a partir do genoma pode variar muito Veremos mais adiante neste capítulo que sequenciar o repertório inteiro de RNA de uma célula ou tecido conhecido como sequenciamento profundo de RNA ou RNAseq é uma maneira poderosa de compreender como a informação presente no genoma é utiliza da por diferentes células sob diferentes circunstâncias Na próxima seção veremos como o RNAseq também se tornou uma ferramenta valiosa para anotação de genomas Para serem úteis sequências genômicas devem ser anotadas Longas extensões de nucleotídeos ao primeiro olhar não revelam nada sobre como essa informação genética controla o desenvolvimento de um organismo vivo ou mesmo que tipos de moléculas de DNA proteína e RNA são produzidas por um genoma O processo de anotação do genoma tenta definir todos os genes tanto os que codificam como os que não codificam proteínas em um genoma e atribuir um papel para cada um O pro cesso também procura compreender tipos mais sutis de informação genômica como sequências reguladoras cis que especificam o momento e o local que determinado gene é expressado e se seu mRNA sofre splicing alternativo para produzir diferentes isoformas de proteínas Certamente essa é uma tarefa intimidadora e estamos longe de completá la para qualquer forma de vida mesmo para a bactéria mais simples Para vários or ganismos sabemos o número aproximado de genes e para organismos muito simples compreendemos as funções de cerca da metade dos seus genes Nesta seção discutiremos amplamente como os genes são identificados nas se quências genômicas e quais informações podemos reconhecer sobre seus papéis pela simples inspeção de suas sequências Mais adiante no capítulo nos concentramos no problema mais difícil o de determinar experimentalmente a função gênica 479 SEQUENCIANDO GENOMAS INTEIROS TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO DE SEGUNDA GERAÇÃO O método didesóxi tornou possível sequenciar os genomas de humanos e da maioria dos outros organismos discutidos neste livro Mas métodos mais novos desenvolvidos desde 2005 tornaram o sequenciamento de genomas ainda mais rápido e muito mais econômico Com esses métodos de sequenciamento chamados de métodos de segunda geração o custo do sequenciamento de DNA diminui drasticamente Sem surpresas o número de genomas que foram sequenciados aumentou muito Esses métodos rápidos permitem que múltiplos genomas sejam sequenciados em paralelo em questão de semanas permitindo aos investigadores examinar milhares de genomas individuais humanos catalogar as variações nas sequências de nucleotídeos de pessoas em volta do mundo e descobrir mutações que aumentam o risco de várias doenças do câncer ao autismo Esses métodos também tornaram possível determinar a sequência genômica de espécies extintas incluindo o homem de Neanderthal e o mamutelanudo Animação 83 Com o sequenciamento do genoma de várias espécies relacionadas também foi possível compreender a base molecular dos eventoschave evolutivos na árvore da vida como as invenções da multicelularidade visão e linguagem A capacidade de sequenciar rapidamente o DNA teve impactos muito maiores em todos os ramos da biologia e medicina é quase impossível imaginar onde estaríamos sem esse método O sequenciamento shotgun para determinar a sequência de nucleotídeos de um genoma inteiro o DNA genômico é primeiramente fragmentado em pedaços pequenos e uma biblioteca genômica é construída normalmente usando plasmídeos e bactérias ver Figura 830 No sequenciamento shotgun a sequência de nucleotídeos de dezenas de milhares de clones individuais é determinada a sequência genômica inteira é então reconstruída agrupando in silico a sequência de nucleotídeos de cada clone usando as sobreposições entre clones como guia O método shotgun funciona bem para genomas pequenos como aqueles de vírus e bactérias que não possuem DNA repetitivo Clones BAC a maioria dos genomas de plantas e animais é grande muitas vezes acima de 10 9 pares de nucleotídeos e contêm quantidades grandes de DNA repetitivo espalhado pelo genoma Como a sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA repetitivo irá sobrepor cada ocorrência de DNA repetido é difícil se não impossível agrupar os fragmentos em uma única ordem apenas pelo método shotgun Para contornar esse problema o genoma humano foi dividido inicialmente em fragmentos de DNA muito grandes cada um com aproximadamente 100 mil pares de nucleotídeos e clonado em BACs ver p 469 A ordem das BACs ao longo do cromossomo foi determinada pela comparação do padrão dos sítios de clivagem das enzimas de restrição em um determinado clone BAC com o do genoma inteiro Dessa forma determinado clone BAC pode ser mapeado por exemplo para o braço esquerdo Milhares de genomas de indivíduos humanos já foram sequenciados e não é necessário reconstruir cuidadosamente a ordem das leituras das sequências de DNA a cada vez elas são simplesmente agrupadas usando a ordem determinada a partir do projeto de sequenciamento do genoma humano original Por essa razão o ressequenciamento termo utilizado quando o genoma de uma espécie é sequenciado novamente mesmo sendo de um indivíduo diferente é muito mais fácil do que o sequenciamento original Fragmentação aleatória Sequência de uma fita dos fragmentos GTTCAGCATTG GCCATTAGTTCA GCCATTAGTTCAGCATTG Sequência original reconstruída com base na sobreposição de sequências Múltiplas cópias do genoma Sequências de dois fragmentos A A D B B A B C E C Padrão de restrição para clones BAC individuais Mapa de restrição de um segmento do genoma humano Sítios de clivagem para as endonucleases de restrição A B C D e E do cromossomo 3 humano Uma vez que uma coleção de clones BAC abrangendo todo o genoma foi obtida cada BAC foi sequenciado pelo método shotgun No final as sequências de todos os insertos de BAC foram agrupadas usando o conhecimento da posição de cada inserto de BAC no genoma humano Ao todo aproximadamente 30 mil clones BAC foram sequenciados para completar o genoma humano CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 483 genomas revele uma grande quantidade de informações sobre as relações entre genes e organismos ela frequentemente não fornece informação imediata sobre como esses genes funcionam ou sobre quais papéis eles têm na fisiologia de um organismo A comparação do complemento inteiro do gene de várias bactérias termofílicas por exemplo não revela por que essas bactérias se desenvolvem a temperaturas que excedem 70C Além disso o estu do do genoma da bactéria Deinococcus radiodurans incrivelmente resistente à radiação não explica como esse organismo pode sobreviver a uma descarga de radiação que pode despedaçar vidro Serão necessários estudos bioquímicos e genéticos adicionais como aqueles descritos em outras seções desse capítulo para determinar como os genes e as proteínas que eles produzem funcionam no contexto de organismos vivos A clonagem do DNA permite que qualquer proteína seja produzida em grandes quantidades Na última seção vimos como genes que codificam proteínas podem ser identificados nas sequências genômicas Utilizando o código genético desde que os limites dos íntrons e éxons sejam conhecidos a sequência de aminoácidos de qualquer proteína codificada em um genoma pode ser deduzida Como discutimos anteriormente esta sequência pode mui tas vezes fornecer informações importantes sobre a função da proteína caso seja similar à sequência de aminoácidos de uma proteína que já tenha sido estudada ver Figura 823 Embora essa estratégia muitas vezes tenha sucesso ela normalmente fornece apenas a fun ção bioquímica provável da proteína por exemplo se a proteína se assemelha a uma cinase ou uma protease Normalmente resta ao pesquisador verificar ou refutar essa atribuição e o mais importante descobrir a função biológica da proteína no organismo isto é para quais qualidades do organismo a cinase ou a protease contribuem e em quais vias moleculares ela funciona Atualmente a maioria das proteínas novas são descobertas pelo sequen ciamento do genoma e muitas vezes permanece um grande desafio certificar suas funções Uma abordagem importante na determinação da função gênica é alterar o gene ou em alguns casos seu padrão de expressão para colocar a cópia alterada de volta na linhagem germinativa do organismo e deduzir a função do gene normal pelas alte rações causadas por sua alteração Várias técnicas para implementar esta estratégia são discutidas na próxima na próxima seção deste capítulo Mas também é importante es tudar as propriedades bioquímicas e estruturais de um produto gênico como delineado na primeira parte deste capítulo Uma das contribuições mais importantes da clonagem de DNA para biologia celular e molecular é a capacidade de produzir qualquer proteína mesmo as mais raras em quantidades quase ilimitadas desde que o gene que codifica esta proteína seja conhecido Essa produção em larga escala normalmente é realizada em células vivas usando vetores de expressão Figura 841 Estes geralmente são plas mídeos que foram projetados para produzir uma grande quantidade de mRNA estável que pode ser traduzido de forma eficiente em proteína quando o plasmídeo é introdu zido em célula de bactéria levedura inseto ou mamífero Para prevenir que a grande quantidade da proteína estranha interfira com o crescimento da célula o vetor de ex pressão muitas vezes é projetado para retardar a síntese do mRNA estranho e da proteína até um pouco antes das células serem coletadas e rompidas Figura 842 Como a proteína desejada é produzida a partir de um vetor de expressão dentro de uma célula ela deve ser purificada das proteínas da célula hospedeira por cromatografia após o rompimento das células contudo como existem espécies abundantes nas células frequentemente 1 a 10 da proteína total a purificação geralmente é fácil de ser reali zada em apenas algumas etapas Como vimos na primeira parte deste capítulo vários ve Figura 841 Produção de grandes quantidades de uma proteína a partir de uma sequência de DNA que codifica uma proteína clonada em um vetor de expressão e introduzida em células Um vetor plas midial foi modificado para conter um promotor altamente ativo que causa a produção de grandes quantidades de mRNA a partir de um gene adjacente que codifica uma proteína inserido no vetor plasmidial Dependendo das características do vetor de clonagem o plasmídeo é introduzido em células de bactéria levedura inseto ou mamífero onde o gene inserido é transcrito de forma eficiente e traduzido em proteína Se o gene a ser supe rexpresso não tiver íntrons típico de genes de bactérias arqueias e eucariotos simples ele pode simplesmente ser clonado a partir do DNA genômico por PCR Para genes clonados a partir de animais e vegetais muitas vezes é mais conveniente obter o gene como cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA ver Figura 832 ou clonar diretamente por PCR a partir de RNA isolado do organismo ver Figura 837 Alternativamente o DNA que codi fica a proteína pode ser produzido por síntese química ver p 472 Sequência promotora CLIVAGEM DE DNA COM NUCLEASE DE RESTRIÇÃO INSERÇÃO DE SEQUÊNCIA DE DNA QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA INTRODUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE EM CÉLULAS mRNA superexpresso Vetor de expressão Proteína superexpressa 484 PARTE III Formas de trabalhar com células tores de expressão foram projetados para adicionar um marcador molecular um grupo de resíduos de histidina ou uma pequena proteína marcadora à proteína expressa para facilitar sua purificação por cromatografia de afinidade ver Figura 811 Uma variedade de vetores de expressão está disponível cada um modificado por engenharia genética para funcionar em um tipo de célula na qual a proteína deverá ser produzida Essa tecnologia também é utilizada para produzir grandes quantidades de várias proteínas úteis na saúde incluindo hormônios como a insulina e fatores de crescimen to utilizados como fármacos humanos e proteínas do envoltório viral para uso em vaci nas Os vetores de expressão também permitem aos cientistas produzir muitas proteínas de interesse biológico em quantidades suficientes para estudos estruturais detalhados Quase todas as estruturas proteicas tridimensionais descritas neste livro são de proteínas produzidas desta maneira Portanto as técnicas de DNA recombinante permitem aos cientistas transitar com facilidade de proteína para gene e viceversa de modo que as funções de ambos possam ser exploradas em múltiplas frentes Figura 843 Resumo A clonagem de DNA permite que uma cópia de qualquer parte específica de uma sequên cia de DNA ou de RNA seja selecionada a partir de milhões de outras sequências em uma célula e seja produzida em quantidades ilimitadas em uma forma pura As sequências de DNA podem ser amplificadas após clivagem do DNA cromossômico e inserção dos frag mentos de DNA resultantes no cromossomo de um elemento genético de autorreplicação como um plasmídeo A biblioteca de DNA genômico resultante é mantida em milhões de células bacterianas cada uma carregando um fragmento diferente de DNA clonado As células individuais dessa biblioteca são cultivadas para produzir grandes quantidades de um único fragmento de DNA clonado Evitando vetores de clonagem e células bacte rianas a reação em cadeia da polimerase PCR permite que a clonagem de DNA seja realizada diretamente com a DNA polimerase e oligonucleotídeos iniciadores de DNA contanto que a sequência de DNA de interesse já seja conhecida Os procedimentos utilizados para obter clones de DNA que correspondem na se quência a moléculas de mRNA são os mesmos com exceção que uma cópia de DNA da sequência de mRNA chamada de cDNA é inicialmente sintetizada Diferentemente dos clones de DNA genômico os clones de cDNA não têm sequências de íntrons sendo os clo nes de escolha para analisar o produto proteico de um gene As reações de hibridização dos ácidos nucleicos fornecem um meio sensível de detec tar alguma sequência nucleotídica de interesse A enorme especificidade dessa reação de hibridização permite que qualquer sequência nucleotídica de fita simples seja marcada com um radioisótopo ou composto químico e seja utilizada como sonda para identificar uma fita complementar até mesmo em uma célula ou em um extrato celular que contenha milhões de sequências de DNA ou de RNA diferentes A hibridização do DNA também tor Amostra coletada a 42ºC 25ºC DNA helicase Direção da eletroforese Figura 842 Produção de grandes quantidades de uma proteína utili zando um vetor plasmidial de expres são Neste exemplo um vetor de expres são que superexpressa uma DNAhelicase foi introduzido em uma bactéria Nesse ve tor de expressão a transcrição a partir des sa sequência codificadora está sob contro le de um promotor viral que se torna ativo apenas a uma temperatura de 37 C ou mais A proteína total da célula tanto de bactérias crescidas a 25 C não ocorre a produção da proteína helicase como após a incubação das mesmas bactérias a 42 C por até 2 horas a proteína helicase se tornou a espécie de proteína mais abun dante no extrato celular foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS Cortesia de Jack Barry Determinar a sequência de aminoácidos de um fragmento de peptídeo usando espectroscopia de massa Clonar por PCR Sintetizar iniciadores de DNA para PCR Introduzir em E coli ou outras células hospedeiras para produzir proteína Inserir região codificadora de proteína do gene em vetor de expressão a partir do clone de cDNA PROTEÍNA GENE ou cDNA Pesquisar banco de dados de DNA pela sequência gênica ANÁLISE POR RAIOS X OU RMN PARA DETERMINAR A ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL TESTES BIOQUÍMICOS PARA DETERMINAR A ATIVIDADE MANIPULAÇÃO E INTRODUÇÃO DO GENE ALTERADO NAS CÉLULAS OU ORGANISMO PARA ESTUDAR A FUNÇÃO Figura 843 Técnicas de DNA recombinante tornaram possível transitar experimentalmente de gene para proteína e de proteína para gene Se um gene foi identificado à direita sua sequência que codifica uma proteína pode ser inserida em um vetor de expressão para produzir grandes quantidades de proteína ver Figura 841 que então pode ser estudada bioquímica ou estruturalmente Se uma proteína foi purificada com base nas suas propriedades bioquímicas a espectrometria de massa ver Figura 818 pode ser utilizada para obter uma sequência de aminoácidos parcial que é utilizada para rastrear a sequência genômica na sequência nucleotídica completa O gene completo pode então ser clonado por PCR a partir do genoma sequenciado ver Figura 837 O gene também pode ser manipulado e introduzido em células ou organismos para estudar sua função um tópico abordado na próxima seção deste capítulo CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 485 na possível usar PCR para amplificar qualquer parte de qualquer genoma uma vez que sua sequência seja conhecida A sequência de nucleotídeos de qualquer genoma pode ser determinada de forma rápida e simples usando técnicas automatizadas com base em algumas estratégias dife rentes A comparação das sequências genômicas de diferentes organismos nos permite traçar as relações evolutivas entre genes e organismos e provou ser valiosa para descobrir novos genes e prever suas funções Tomadas em conjunto essas técnicas para análise e manipulação de DNA tornaram possível sequenciar identificar e isolar genes de vários organismos de interesse As tecnolo gias relacionadas permitiram aos cientistas produzir os produtos proteicos desses genes em grandes quantidades necessárias para uma análise detalhada de sua estrutura e função assim como para propósitos medicinais ESTUDO DA EXPRESSÃO E DA FUNÇÃO DE GENES Finalmente desejamos determinar como os genes e as proteínas que eles codificam funcionam no organismo intacto Embora possa parecer controverso uma das maneiras mais diretas de descobrir qual a função de um gene é observar o que acontece ao orga nismo quando ele é eliminado Estudar organismos mutantes que adquiriram alterações ou deleções em suas sequências de nucleotídeos é uma prática consagrada em biologia e forma a base do importante campo da genética Como as mutações podem interromper os processos celulares os mutantes frequentemente têm a chave para o entendimento da função do gene Na abordagem genética clássica iniciase isolando os mutantes que têm uma aparência interessante ou incomum moscasdasfrutas com olhos brancos ou asas enroladas por exemplo Trabalhando de trás para frente a partir do fenótipo a aparência ou o comportamento do indivíduo determinase então o genótipo do orga nismo a forma do gene responsável por aquela característica Painel 82 Atualmente com inúmeras sequências genômicas disponíveis a exploração da função dos genes frequentemente inicia com uma sequência de DNA Aqui o desafio é traduzir a sequência em uma função Uma abordagem discutida anteriormente no capítulo é pesquisar bancos de dados por proteínas bem caracterizadas que possuem sequências de aminoácidos similares à proteína codificada por um novo gene Daqui a proteína ou para genes que não codificam proteínas a molécula de RNA pode ser superexpressada e purificada e os métodos descritos na primeira parte deste capítulo podem ser empregados para se estudar sua estrutura tridimensional e suas propriedades bioquímicas Contudo para determinar diretamente o problema de como um gene fun ciona na célula ou no organismo a abordagem mais eficaz envolve o estudo de mutantes que não têm o gene ou expressam uma versão alterada dele A determinação de qual processo celular foi interrompido ou comprometido nesses mutantes com frequência oferece uma perspectiva do papel biológico do gene Nesta seção descreveremos algumas abordagens para determinar a função de um gene iniciando a partir de um indivíduo com um fenótipo interessante ou a partir de uma sequência de DNA Iniciaremos com uma abordagem genética clássica que começa com um rastreamento genético para isolar mutantes de interesse e então continua com a identificação do gene ou dos genes responsáveis pelo fenótipo observado Então descre veremos o conjunto de técnicas que são coletivamente chamadas de genética reversa em que se inicia com um gene ou uma sequência gênica e a partir disso tentase determi nar sua função Essa abordagem muitas vezes envolve algum trabalho de adivinhação a busca por sequências similares em outros organismos ou a determinação de quando e onde um gene é expressado assim como a geração de organismos mutantes e a carac terização de seu fenótipo A genética clássica inicia com a interrupção de um processo celular por mutagênese aleatória Antes do advento da tecnologia de clonagem de genes a maioria dos genes era identi ficada pelas anormalidades produzidas quando o gene era mutado De fato a ideia de gene era deduzida a partir da herança de tais anormalidades Essa abordagem genética clássica identificando os genes responsáveis por fenótipos mutantes é mais facilmente 486 PAINEl 82 Revisão da genética clássica GENES E FENÓTIPOS Gene uma unidade funcional hereditária normalmente correspondendo a um segmento de DNA que codifica uma única proteína Genoma toda a sequência de DNA de um organismo Lócus o sítio do gene no genoma Alelos formas alternativas de um gene Tipo selvagem o tipo normal que ocorre naturalmente Mutante difere do tipo selvagem devido a uma alteração genética uma mutação GENÓTIPO o conjunto específico de alelos que formam o genoma de um indivíduo FENÓTIPO a característica visível de um indivíduo O alelo A é dominante em relação ao a o alelo a é recessivo em relação ao A Homozigoto AA Heterozigoto aA Homozigoto aa No exemplo acima o fenótipo do heterozigoto é o mesmo do que o de um dos homozigotos nos casos em que ele é diferente de ambos os dois alelos são considerados codominantes Um conjunto de cromossomos diploides normais como visto em uma metáfase preparados pelo rompimento de uma célula em metáfase e coloração dos cromossomos dispersos No exemplo esquemático mostrado aqui existem três pares de autossomos cromossomos herdados simetricamente da mãe e do pai independentemente do sexo e dois cromossomos sexuais um X da mãe e um Y do pai Os números e os tipos de cromossomos sexuais e seu papel na determinação do sexo variam de uma classe de organismos para a outra como ocorre para o número de pares de autossomos CROMOSSOMOS Centrômero Um cromossomo no início do ciclo celular na fase G1 a barra única longa representa uma longa duplahélice de DNA Braço curto p Braço longo q Um cromossomo ao final do ciclo celular em metáfase ele é duplicado e condensado composto por duas cromátidesirmãs idênticas cada uma contendo uma duplahélice de DNA ligadas pelo centrômero Braço curto p Braço longo q Materno 1 Materno 3 Materno 2 Paterno 2 Paterno 1 Paterno 3 X Y Par de autossomos Cromossomos sexuais CICLO HAPLOIDEDIPLOIDE DA REPRODUÇÃO SEXUAL Mãe Pai DIPLOIDE MEIOSE HAPLOIDE Óvulo Espermatozoide FUSÃO SEXUAL FERTILIZAÇÃO DIPLOIDE Zigoto Para simplificação o esquema é mostrado para apenas um cromossomopar cromossômico Cromossomo materno Cromossomo paterno MEIOSE E RECOMBINAÇÃO GENÉTICA Cromossomo paterno a b Cromossomo materno A B Célula germinativa diploide Genótipo AB ab A b a B Local do entrecruzamento Genótipo Ab Gametas haploides óvulos ou espermatozoides MEIOSE E RECOMBINAÇÃO Quanto maior a distância entre dois lócus em um único cromossomo maior é a chance de eles serem separados por do entrecruzamento que ocorre em um sítio entre eles Se os dois genes são assim recombinados em x dos gametas dizse que eles são separados em um cromossomo por uma distância de mapa genético de x unidades de mapa ou x centimorgans Genótipo aB 487 TIPOS DE MUTAÇÕES MUTAÇÃO PONTUAL ocorre em um único sítio no genoma correspondendo a um único par de nucleotídeos ou a uma parte muito pequena de um único gene Mutação letal leva o organismo em desenvolvimento a morrer prematuramente Mutação condicional produz seu efeito fenotípico somente sob certas condições chamadas de condições restritivas Sob outras condições as condições permissivas o efeito não é visto Para uma mutação sensível à temperatura a condição restritiva tipicamente é a alta temperatura enquanto a condição permissiva é a baixa temperatura Mutação com perda de função reduz ou suprime a atividade do gene Esta é a classe mais comum de mutações As mutações com perda de função normalmente são recessivas o organismo pode funcionar normalmente enquanto manter pelo menos uma cópia normal do gene afetado Mutação nula é uma mutação com perda de função que suprime completamente a atividade do gene Mutação com ganho de função aumenta a atividade do gene ou o torna ativo em circunstâncias inapropriadas essas mutações normalmente são dominantes Mutação negativa dominante mutação de ação dominante que bloqueia a atividade do gene causando um fenótipo de perda de função mesmo na presença de uma cópia normal do gene Esse fenômeno ocorre quando o produto do gene mutante interfere com a função do produto do gene normal Mutação supressora suprime o efeito fenotípico de outra mutação de maneira que o mutante duplo parece normal Uma mutação supressora intragênica se estabelece em um gene afetado pela primeira mutação uma mutação supressora extragênica se estabelece em um segundo gene frequentemente um gene cujo produto interage diretamente com o produto do primeiro INVERSÃO inverte um segmento de um cromossomo DELEÇÃO elimina um segmento de um cromossomo TRANSLOCAÇÃO retira um segmento de um cromossomo e o liga a outro DOIS GENES OU UM Dadas duas mutações que produzem o mesmo fenótipo como poderemos saber se elas são mutações no mesmo gene Se as mutações são recessivas como é mais frequente a resposta pode ser encontrada por um teste de complementação No teste de complementação mais simples um indivíduo que é homozigoto para uma mutação é cruzado com um indivíduo que é homozigoto para a outra O fenótipo da descendência fornece a resposta para a pergunta a a COMPLEMENTAÇÃO MUTAÇÕES EM DOIS GENES DIFERENTES Mãe mutante homozigota b b Pai mutante homozigoto a A descendência híbrida apresenta um fenótipo normal uma cópia normal de cada gene está presente b NÃO COMPLEMENTAÇÃO DUAS MUTAÇÕES INDEPENDENTES NO MESMO GENE a1 Mãe mutante homozigota Pai mutante homozigoto A descendência híbrida apresenta um fenótipo mutante nenhuma cópia normal do gene mutado está presente a2 a2 a1 a2 a1 488 PARTE III Formas de trabalhar com células realizada em organismos que se reproduzem rapidamente e são sensíveis à manipulação genética como bactérias leveduras vermes nematódeos e moscasdasfrutas Embora mutações espontâneas possam às vezes ser encontradas pela análise de populações ex tremamente grandes milhares ou dezenas de milhares de organismos individuais o processo de isolar indivíduos mutantes é muito mais eficiente se gerarmos mutações com químicos ou radiação que danificam o DNA Tratando os organismos com tais mutagêni cos grandes números de indivíduos mutantes podem ser criados rapidamente e analisa dos quanto a um defeito específico de interesse como discutimos brevemente Uma abordagem alternativa para mutagênese química ou de radiação é chamada de mutagênese de inserção Esse método depende do fato de que o DNA exógeno inserido ao acaso no genoma pode produzir mutações se o fragmento inserido interromper um gene ou suas sequências reguladoras O DNA inserido cuja sequência é conhecida serve então como um marcador molecular que auxilia na identificação subsequente e na clo nagem do gene interrompido Figura 844 Na Drosophila o uso do elemento transpo nível P para inativar genes revolucionou o estudo de função gênica na moscadasfrutas Os elementos transponíveis ver Tabela 54 p 288 também vêm sendo utilizados para gerar mutações em bactérias leveduras camundongos e na planta Arabidopsis Os rastreamentos genéticos identificam mutantes com anormalidades específicas Uma vez que tenha sido produzida uma coleção de mutantes em um organismomodelo como levedura ou mosca geralmente devemse examinar milhares de indivíduos para achar o fenótipo de interesse alterado Tal procura é chamada de rastreamento gené tico e quanto maior o genoma menor é a probabilidade de que qualquer gene seja mutado Dessa maneira quanto maior o genoma do organismo maior é o trabalho de rastreamento O fenótipo pelo qual está sendo feito o rastreamento pode ser simples ou complexo Os fenótipos simples são mais fáceis de detectar podese rastrear vários orga nismos de forma rápida por exemplo para mutações que tornam impossível ao organis mo sobreviver na ausência de um determinado aminoácido ou nutriente Os fenótipos mais complexos como defeitos no aprendizado ou no comportamento podem exigir rastreamentos mais elaborados Figura 845 Mas mesmo os rastreamen tos genéticos que são utilizados para dissecar sistemas fisiológicos complexos podem ser simples no seu mecanismo genético o que permite o exame simultâneo de um grande número de mutantes Como um exemplo um rastreamento particularmente elegante foi projetado para procurar por genes envolvidos no processo visual do peixezebra A base para esse rastreamento que monitora a resposta do peixe ao movimento é a alteração no comportamento Os peixes do tipo selvagem tendem a nadar em direção a um movimento percebido enquanto os mutantes com defeitos no seu sistema visual nadam em direções variadas um comportamento que é facilmente detectado Um mutante descoberto nes se rastreamento é chamado de lakritz que não apresenta 80 das células ganglionais da retina as quais ajudam a liberar os sinais visuais do olho para o cérebro Como a organi zação celular da retina do peixezebra espelha a de todos os vertebrados o estudo desses mutantes pode também fornecer informações sobre o processamento visual em humanos Figura 844 Mutante de inserção da boca deleão Antirrhinum Uma mutação em um único gene que codifica uma proteína reguladora faz os brotos de folhas esquerda se desenvolverem no lugar das flores que ocorrem na planta normal direita A mutação faz as células adotarem uma característica que seria apropriada para uma parte diferente da planta normal em vez de uma flor as células produzem um broto de folha Cortesia de Enri co Coen e Rosemary Carpenter Figura 845 Fenótipo de comporta mento detectado em um rastreamento genético A Comportamento de C elegans do tipo selvagem na alimenta ção social Os vermes migram até encon trar seus vizinhos e iniciam a alimentação com bactérias B Os animais mutantes se alimentam sozinhos Cortesia de Cornelia Bargmann Cell 94 cover 1998 Com au torização de Elsevier 1 mm CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 489 Como defeitos em genes que são necessários para os processos celulares impor tantes síntese e processamento de RNA ou controle do ciclo celular por exemplo normalmente são letais a função desses genes com frequência é estudada em indivíduos com mutações condicionais Os indivíduos mutantes normalmente funcionam en quanto as condições permissivas prevalecerem mas demonstram uma função gênica anormal quando submetidos a condições não permissivas restritivas Em organismos com mutações sensíveis à temperatura por exemplo a anormalidade pode ser ativada ou inativada de forma experimental simplesmente alterandose a temperatura ambiente assim uma célula contendo uma mutação sensível à temperatura em um gene essencial para a sobrevivência morrerá a uma temperatura não permissiva mas crescerá normal mente a uma temperatura permissiva Figura 846 O gene sensível a temperatura em um destes mutantes normalmente contém uma mutação pontual que causa uma alte ração sutil no seu produto proteico por exemplo a proteína mutante pode funcionar normalmente a temperaturas baixas porém desnatura a temperaturas mais altas As mutações sensíveis à temperatura foram importantes para encontrar os genes bacterianos que codificam as proteínas necessárias à replicação de DNA Os mutantes foram identificados pelo rastreamento de populações de bactérias tratadas com muta gênicos por células que param de produzir DNA quando são aquecidas de 30C para 42C Esses mutantes foram usados mais tarde para identificar e caracterizar as proteínas de replicação de DNA correspondentes discutido no Capítulo 5 De forma semelhante rastreamentos por mutações sensíveis à temperatura levaram à identificação de várias proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular assim como a várias proteínas en volvidas no movimento de proteínas através da via secretora em levedura Abordagens de rastreamento relacionadas demonstraram a função de enzimas envolvidas nas prin cipais vias metabólicas de bactérias e de leveduras discutido no Capítulo 2 e identifi caram vários dos produtos gênicos responsáveis pelo desenvolvimento organizado do embrião da Drosophila discutido no Capítulo 21 Mutações podem causar a perda ou o ganho da função proteica As mutações gênicas geralmente são classificadas como com perda de função ou com ganho de função Uma mutação com perda de função resulta em um produto gênico que não funciona com baixa atividade assim ela pode revelar a função normal do gene A mutação com ganho de função resulta em um produto gênico que é muito ativo é ativo no momento ou local errado ou possui uma nova atividade Figura 847 Uma etapa inicial importante na análise genética de qualquer célula ou organismo mutante é determinar se a mutação causa uma perda ou um ganho de função Um teste padrão é determinar se a mutação é dominante ou recessiva Uma mutação dominante é aquela que continua causando o fenótipo mutante na presença de uma única cópia do gene tipo selvagem Uma mutação recessiva é aquela que não é mais capaz de causar o Figura 846 Rastreamento por mu tantes de bactérias ou de leveduras sensíveis à temperatura As células mutagenizadas são semeadas a uma temperatura permissiva Elas se dividem e formam colônias que são transferidas para duas placas de Petri idênticas por semeadura em réplica Uma dessas placas é incubada a uma temperatura permissiva e a outra a uma temperatura restritiva As células contendo uma mutação sensível à temperatura em um gene essencial para proliferação podem se dividir na tempe ratura permissiva normal mas falham em se dividir em temperaturas restritivas ele vadas As mutações desse tipo sensíveis à temperatura são especialmente úteis para identificar genes necessários para replica ção de DNA um processo essencial 23oC 36oC Células mutagenizadas proliferam e formam colônias a 23C Colônias replicadas para duas placas idênticas e incubadas a duas temperaturas diferentes Células mutantes proliferam e formam uma colônia a uma temperatura permissiva Células mutantes falham na proliferação e não formam uma colônia a uma temperatura restritiva Figura 847 Mutações gênicas que afetam seu produto proteico de dife rentes formas Neste exemplo a proteína do tipo selvagem tem uma função celular específica representada pelos raios em vermelho As mutações que eliminam essa função ou inativam a proteína a tempera turas mais altas são mostradas A proteína mutante condicional carrega uma subs tituição de aminoácido vermelho que previne seu enovelamento apropriado a 37 ºC mas permite que a proteína se enovele e funcione normalmente a 25 ºC Tais mutações condicionais sensíveis à temperatura são especialmente úteis para estudar genes essenciais o organismo pode crescer sob condição permissiva e então ser movido para uma condição não permissiva para estudar as consequências da perda do produto gênico Tipo selvagem Mutação com perda de função Mutação condicional com perda de função Deleção Mutação pontual Truncamento 37 oC 25 oC 490 PARTE III Formas de trabalhar com células fenótipo mutante na presença de uma única cópia do gene tipo selvagem Embora te nham sido descritos casos nos quais uma mutação com perda de função seja dominante ou uma mutação com ganho de função seja recessiva na maioria dos casos as mutações recessivas são com perda de função e as mutações dominantes são com ganho de fun ção É fácil determinar se uma mutação é dominante ou recessiva Fazse simplesmente o cruzamento de um mutante com o tipo selvagem para obter células ou organismos diploides A progênie do cruzamento será heterozigota para a mutação Se o fenótipo mutante não é mais observado podese concluir que a mutação é recessiva e provavel mente seja uma mutação com perda de função ver Painel 82 Testes de complementação revelam se dois mutantes estão no mesmo gene ou em genes diferentes Um rastreamento genético em larga escala pode encontrar várias mutações diferentes que apresentam o mesmo fenótipo Esses defeitos podem estar em diferentes genes que fun cionam no mesmo processo ou podem representar mutações diferentes no mesmo gene Formas alternativas do mesmo gene são conhecidas como alelos A diferença mais comum entre alelos é a substituição de um único par de nucleotídeo mas alelos diferentes também podem carregar deleções substituições e duplicações Então como podemos dizer se duas mutações que produzem o mesmo fenótipo ocorrem no mesmo gene ou em genes diferen tes Se as mutações são recessivas se por exemplo elas representam uma perda de função de um determinado gene um teste de complementação pode ser utilizado para verificar se as mutações estão no mesmo gene ou em genes diferentes Para testar a complementa ção em um organismo diploide um indivíduo que é homozigoto para uma mutação isto é possui dois alelos idênticos do gene mutante em questão é cruzado com um indivíduo que é homozigoto para a outra mutação Se as duas mutações estão no mesmo gene a des cendência mostra o fenótipo mutante pois elas continuam não tendo cópias normais do gene em questão Figura 848 Se ao contrário as mutações ocorrerem em genes diferen tes a descendência resultante mostra um fenótipo normal pois elas retêm uma cópia nor mal e uma cópia mutante de cada gene as mutações desse modo complementamse e reconstituem um fenótipo normal Os testes de complementação de mutantes identificados durante rastreamentos genéticos revelaram por exemplo que cinco genes diferentes são necessários para que as leveduras digiram o açúcar galactose que 20 genes são necessários para que E coli construa um flagelo funcional que 48 genes estão envolvidos na agregação de partículas virais do bacteriófago T4 e que centenas de genes estão envolvidos no desen volvimento de um nematódeo adulto a partir de um ovo fertilizado Os produtos dos genes podem ser ordenados em vias por análise de epistasia Uma vez que um conjunto de genes envolvidos em um processo biológico específico foi identificado o próximo passo muitas vezes é determinar em que ordem os genes funcio nam A ordem dos genes é mais fácil de ser explicada para vias metabólicas nas quais por exemplo a enzima A é necessária para produzir o substrato para a enzima B Nesse caso diríamos que o gene que codifica a enzima A atua antes a montante do gene que codifica a enzima B na via De forma similar se uma proteína regula a atividade de outra proteína diríamos que o primeiro gene atua antes do segundo A ordem dos genes pode em vários casos ser determinada puramente por análise genética sem qualquer conhe cimento sobre o mecanismo de ação dos produtos gênicos envolvidos Suponha que tenhamos um processo biossintético que consiste em uma sequência de etapas de modo que a realização da etapa B seja condicional ao término da etapa A precedente suponha também que o gene A seja necessário para a etapa A e o gene B seja necessário para a etapa B Então uma mutação nula uma mutação que abole a fun ção no gene A irá interromper o processo na etapa A independentemente de o gene B ser funcional ou não enquanto uma mutação nula no gene B causa uma interrupção na etapa B apenas se o gene A ainda for ativo Em tal caso dizse que o gene A é epistático ao gene B Comparandose os fenótipos das diferentes combinações de mutações podemos descobrir a ordem na qual os genes atuam Esse tipo de análise é chamado de análise de epistasia Como um exemplo a via de secreção de proteínas em leveduras foi estudada Figura 848 Um teste de complementa ção pode revelar que as mutações em dois genes diferentes são responsáveis pelo mesmo fenótipo anormal Quando uma ave albina branca de uma linhagem é cruzada com uma albina de uma linhagem diferente os descendentes resultantes abai xo têm a coloração normal Essa restauração da plumagem do tipo selvagem indica que as duas aves brancas não possuem cor por causa de mutações recessivas em genes dife rentes De W Bateson Mendels Principles of Heredity 1st ed Cambridge UK Cambridge University Press 1913 CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 491 dessa forma Diferentes mutações nessa via fazem as proteínas se acumularem de forma aberrante no retículo endoplasmático RE ou no aparelho de Golgi Quando uma célula de levedura é modificada para carregar tanto uma mutação que bloqueia o processamen to proteico no RE como uma mutação que bloqueia o processamento no aparelho de Gol gi as proteínas se acumulam no RE Isso indica que as proteínas devem passar pelo RE antes de serem enviadas para o Golgi antes da secreção Figura 849 Mais estritamente uma análise de epistasia pode apenas fornecer informação sobre a ordem gênica em uma via quando ambas as mutações são alelos nulos Quando as mutações retêm uma função parcial as suas interações de epistasia podem ser difíceis de serem interpretadas Às vezes um mutante duplo apresentará um fenótipo novo ou mais grave do que cada mutante sozinho Esse tipo de interação genética é chamado de fenótipo sintético e se o fenótipo for a morte do organismo ele é chamado de letalidade sintética Na maio ria dos casos um fenótipo sintético indica que dois genes agem em duas vias paralelas diferentes cada um sendo capaz de mediar o mesmo processo celular Assim quando ambas as vias são interrompidas no mutante duplo o processo todo falha e o fenótipo sintético é observado Mutações responsáveis por um fenótipo podem ser identificadas pela análise do DNA Uma vez que uma coleção de organismos mutantes com fenótipos interessantes foi ob tida a próxima tarefa é identificar o gene ou genes responsáveis pelo fenótipo alterado Se o fenótipo foi produzido por mutagênese de inserção a localização do gene interrom pido é bastante simples Os fragmentos de DNA contendo a inserção p ex um trans póson ou um retrovírus são amplificados por PCR e a sequência de nucleotídeos do DNA nas regiões adjacentes é determinada O gene afetado pela inserção pode então ser identificado por uma varredura com o auxílio de um computador da sequência ge nômica completa do organismo Se um químico que causa danos ao DNA foi utilizado para gerar as mutações a identificação do gene inativado muitas vezes é mais trabalhosa mas existem várias es tratégias poderosas disponíveis Se o tamanho do genoma do organismo for pequeno p ex para bactérias ou eucariotos simples é possível simplesmente determinar a se quência genômica do organismo mutante e identificar o gene afetado por comparação com a sequência do tipo selvagem Por causa do acúmulo contínuo de mutações neutras provavelmente existirão diferenças entre as duas sequências genômicas além da mutação responsável pelo fenótipo Uma maneira de provar que uma mutação é a causadora é introduzir a suposta mutação de volta no organismo normal e determinar se ela causa ou não o fenótipo mutante Discutiremos como isso é realizado mais adiante neste capítulo O sequenciamento de DNA rápido e barato tem revolucionado os estudos genéticos humanos Rastreamentos genéticos em organismosmodelo experimentais tem tido espetacular sucesso na identificação de genes e seu relacionamento com vários fenótipos incluin do vários que são conservados entre estes organismos e humanos Mas como podemos estudar os humanos diretamente Eles não se reproduzem de forma rápida não podem ser tratados com mutagênicos e se tiverem um defeito em um processo essencial como a replicação do DNA morreriam muito antes do nascimento Figura 849 Utilização da genética para determinar a ordem das fun ções dos genes Em células normais as proteínas secretoras são concentradas em vesículas que se fusionam com a membra na plasmática para secretar seu conteúdo no meio extracelular Dois mutantes A e B falham em secretar as proteínas No mutante A as proteínas secretadas se acumulam no RE No mutante B as proteínas secretadas se acumulam no Golgi No mutante duplo AB as proteínas se acumulam no RE isso indica que o gene defectivo no mutante A atua antes do gene defectivo no mutante B na via secretora Proteína secretada Célula normal Proteína se acumula no RE Mutante secretor A Mutante secretor B RE Aparelho de Golgi Vesículas secretoras Proteína se acumula no aparelho de Golgi Mutante duplo AB Proteína se acumula no RE Proteína secretada 492 PARTE III Formas de trabalhar com células Apesar de suas limitações comparadas aos organismosmodelo os humanos estão se tornando sujeitos atrativos para os estudos genéticos Como a população humana é muito grande mutações espontâneas não letais surgiram em todos os genes humanos diversas vezes Uma proporção substancial permanece no genoma dos humanos nos dias atuais As mais prejudiciais destas mutações são descobertas quando os indivíduos mutantes chamam a atenção por necessitarem de cuidados médicos Com os avanços recentes que permitiram o sequenciamento dos genomas huma nos inteiros de forma barata e rápida agora podemos identificar tais mutações e estu dar sua evolução e hereditariedade de maneiras impossíveis mesmo há poucos anos Por meio da comparação de milhares de genomas humanos de todo mundo podemos começar a identificar diretamente as diferenças de DNA que distinguem um indivíduo de outro Essas diferenças guardam indícios das nossas origens evolutivas e podem ser usadas para explorar a origem das doenças Blocos ligados de polimorfismos têm sido passados adiante a partir de nossos ancestrais Quando comparamos as sequências de múltiplos genomas humanos observamos que quaisquer dois indivíduos se diferenciarão em aproximadamente 1 par de nucleotídeos em 1000 A maioria dessas variações são comuns e relativamente inofensivas Quando duas variantes de sequências coexistem na população e ambas são comuns as variantes são chamadas de polimorfismos A maioria dos polimorfismos são devidos à substitui ção de um único nucleotídeo denominados polimorfismos de um único nucleotídeo ou SNPs singlenucleotide polymorphisms Figura 850 O restante é devido em grande parte a inserções ou deleções chamadas indels quando a alteração é pequena ou varia ções do número de cópias CNVs copy number variations quando a alteração é grande Embora estas variantes comuns possam ser encontradas pelo genoma elas não estão espalhadas aleatoriamente ou mesmo de forma independente Em vez disso elas ten dem a se encontrar em grupos chamados blocos haplótipos combinações de polimor fismos que são herdados como uma unidade Para compreender por que tal bloco haplótipo existe precisamos considerar nossa história evolutiva Acreditase que os humanos modernos tenham expandido a partir de uma população relativamente pequena talvez em torno de 10 mil indivíduos que exis tiam na África há cerca de 60 mil anos Entre esse pequeno grupo de nossos ancestrais alguns indivíduos devem ter carregado um conjunto de variantes genéticas e outros um conjunto diferente Os cromossomos de um humano moderno representam uma combinação embaralhada de segmentos de cromossomos de diferentes membros desse pequeno grupo ancestral de pessoas Como apenas cerca de 2 mil gerações nos sepa ram deles grandes segmentos desses cromossomos ancestrais passaram dos pais para os filhos sem serem separados pelos eventos de recombinação que ocorrem durante a meiose Como descrito no Capítulo 5 apenas poucas trocas ocorrem entre cada conjun to de cromossomos homólogos durante cada meiose ver Figura 553 Como resultado certos conjuntos de sequências de DNA e seus polimorfismos asso ciados foram herdados em grupos ligados com poucos rearranjos genéticos ao longo das gerações Esses são os blocos haplótipos Como genes que existem em formas alélicas dife Indivíduo A G C A T G C Indivíduo B A T T A A T Indivíduo C A T A T A T Indivíduo D G C A T A T T A G C C G T A T A T A T A T A T A T A C G G C C G G C C G G C C G T A C G T A C G T A C G T A SNP1 SNP2 SNP3 1000 pares de nucleotídeos Figura 850 Polimorfismos de um único nucleotídeo SNPs são sítios no genoma onde duas ou mais va riantes de um nucleotídeo são comuns na população A maioria destas variações no genoma humano ocorre em locais onde elas não afetam de forma significativa a função do gene CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 493 rentes os blocos haplótipos também se apresentam em um número limitado de variantes que são comuns na população humana cada um representando uma combinação de poli morfismos de DNA passada adiante a partir de um determinado ancestral há muito tempo Polimorfismos podem ajudar a identificar mutações associadas a doenças As mutações que dão origem de forma reproduzível a anormalidades raras mas clara mente definidas como albinismo hemofilia ou surdez congênita podem muitas vezes ser identificadas por estudos das famílias afetadas Tais distúrbios de um único gene ou monogênicos muitas vezes são referidos como mendelianos pois seu padrão de here ditariedade é fácil de rastrear Além disso os indivíduos que herdam a mutação causa dora exibirão a anormalidade independentemente dos fatores ambientais como dieta ou exercício Mas para muitas doenças comuns as raízes genéticas são mais complexas Em vez de um único alelo de um único gene tais distúrbios provêm de uma combinação de contribuições a partir de múltiplos genes E com frequência os fatores ambientais têm influências fortes sobre a gravidade do distúrbio Para essas condições multigêni cas como diabetes ou artrite os estudos da população muitas vezes são úteis no rastrea mento dos genes que aumentam o risco de desenvolver a doença Nos estudos de populações os investigadores coletam amostras de DNA de um grande número de pessoas que tem a doença e as comparam com amostras de um grupo de pessoas que não tem a doença Eles procuram por variantes SNPs por exemplo que são mais comuns entre as pessoas que têm a doença Como as sequências de DNA que estão próximas em um cromossomo tendem a ser herdadas juntas a presença de tais SNPs poderia indicar que um alelo que aumenta o risco da doença poderia estar localizado nas proximidades Figura 851 Embora em princípio a doença pudesse ser causada pela própria SNP é muito mais provável que o culpado seja uma alteração que apenas está ligada à SNP como parte de um bloco haplótipo Tais estudos de associação genômica ampla têm sido utilizados para identificar genes que predispõe indivíduos a doenças comuns incluindo diabetes doença da artéria coroná ria artrite reumatoide e mesmo depressão Para muitas dessas condições os polimorfismos de DNA identificaram apenas um aumento leve no risco das doenças Além disso os fato res ambientais p ex dieta exercícios têm um papel importante no início e gravidade da doença No entanto a identificação dos genes afetados por estes polimorfismos está levando ao entendimento do mecanismo de algumas de nossas doenças mais comuns A genômica está acelerando a descoberta de mutações raras que nos predispõem a sérias doenças As variantes genéticas que até agora nos ajudaram a identificar alguns genes que aumen tam nosso risco por doenças são comuns Elas surgiram há muito tempo no nosso passa Figura 851 Genes que afetam o risco de desenvolver uma doença comum muitas vezes podem ser rastreados por meio da sua ligação às SNPs Aqui os padrões de SNPs são comparados entre os dois conjuntos de indivíduos um conjunto de controles saudáveis e um conjunto de afetados por uma determi nada doença comum Um segmento de um cromossomo típico é mostrado Para a maioria dos sítios polimórficos nesse seg mento é uma questão aleatória para um indivíduo ter uma variante SNP barras ver ticais vermelhas ou outra barras verticais azuis essa mesma aleatoriedade é obser vada tanto para o grupocontrole como para os indivíduos afetados Entretanto na parte do cromossomo sombreada em cinzaescuro observase uma tendência a maioria dos indivíduos normais pos suem variantes SNP azuis enquanto os indivíduos afetados possuem variantes SNP vermelhas Isso sugere que esta re gião contém ou é próxima a um gene que está geneticamente ligado a essas variantes SNP vermelhas e que predispõe os indivíduos à doença O uso de controles cuidadosamente selecionados e milhares de indivíduos afetados essa abordagem pode ajudar a rastrear genes relacionados a doenças mesmo que estes confiram apenas um leve aumento no risco de de senvolver a doença Indivíduo A B C D E Indivíduos saudáveis Indivíduo A B C D E Indivíduos afetados 494 PARTE III Formas de trabalhar com células do evolutivo e agora estão presentes de uma forma ou outra em uma porção substancial da população 1 ou mais Acreditase que tais polimorfismos representem 90 das dife renças entre o genoma de uma pessoa e o de outra Mas quando tentamos conectar estas variantes comuns com as diferenças na susceptibilidade pelas doenças ou outras caracte rísticas hereditárias como a altura observamos que elas não tem todo este poder de pre visão como esperávamos dessa forma por exemplo a maioria confere aumentos relativa mente pequenos menos de duas vezes no risco de desenvolver uma doença comum Em contraste com o polimorfismo as variantes raras de DNA aquelas muito menos frequentes em humanos do que as SNPs podem ter grandes efeitos sobre o risco de desen volver algumas doenças comuns Por exemplo tem sido observado que algumas mutações com perda de função cada uma rara individualmente aumentam bastante a predisposição ao autismo e à esquizofrenia Muitas destas são mutações de novo que surgiram esponta neamente nas células da linhagem germinativa de um dos pais O fato de que essas muta ções surgem espontaneamente com alguma frequência poderia ajudar a explicar por que estes distúrbios comuns cada um observado em cerca de 1 da população permanecem conosco mesmo que os indivíduos afetados deixem poucos ou nenhum descendente Es sas mutações raras podem surgir em qualquer um de centenas de genes diferentes o que poderia explicar muito sobre a variabilidade clínica do autismo e da esquizofrenia Como eles são mantidos raros por seleção natural a maioria dessas variantes com muito efeito sobre o risco seriam perdidas nos estudos de associação genômica ampla Agora que o sequenciamento de DNA se tornou rápido e barato a maneira mais eficiente e econômica para identificar essas mutações raras de grande efeito é sequen ciar os genomas dos indivíduos afetados junto ao dos pais e irmãos como controle A genética reversa começa com um gene conhecido e determina quais processos celulares requerem sua função Como vimos a genética clássica inicia com um fenótipo mutante ou no caso dos humanos uma variedade de características e identifica as mutações e consequentemente os genes responsáveis por ele A tecnologia de DNA recombinante tornou possível um tipo diferente de abordagem genética uma que é amplamente utilizada em uma variedade de espécies tratáveis geneticamente Em vez de iniciar com um organismo mutante e utilizálo para identificar um gene e sua proteína um pesquisador pode iniciar com um determinado gene e fazer mutações nele criando células ou organismos para analisar a função do gene Como a nova abordagem reverte a direção tradicional da descoberta genética iniciando a partir de genes até mutações e não ao contrário ela é comumente denominada genética re versa E como o genoma do organismo é alterado deliberadamente de uma determinada forma essa abordagem também é chamada de engenharia do genoma ou edição do genoma Deveremos ver neste capítulo que essa abordagem pode ser escalonada de modo que con juntos inteiros de organismos possam ser criados cada um com um gene diferente alterado Existem algumas formas para que um gene de interesse possa ser alterado Na mais simples o gene pode simplesmente ser deletado do genoma apesar de que em um or ganismo diploide isso necessite que ambas as cópias uma em cada cromossomo homó logo sejam deletadas Embora um pouco contra intuitiva uma das melhores maneiras de descobrir a função de um gene é observar os efeitos decorrentes da sua ausência Tais nocautes gênicos são especialmente úteis se o gene não é essencial Por meio da genética reversa o gene em questão mesmo sendo essencial também pode ser substituído por um que é expressado no tecido errado ou no momento errado do desenvolvimento esse tipo de manipulação muitas vezes fornece informações importantes para a função normal do gene Por exemplo um gene de interesse pode ser modificado para ter sua expressão controlada pelo pesquisador Figura 852 Finalmente genes também podem ser modificados gene ticamente de modo que sejam expressados normalmente na maioria dos tipos celulares e tecidos mas deletados em certos tipos celulares ou tecidos selecionados pelo pesquisador ver Figura 566 Essa abordagem é especialmente útil quando um gene tem diferentes pa péis em diferentes tecidos Também é possível realizar alterações sutis em um gene Muitas vezes é útil fazer alterações leves na estrutura de uma proteína de modo que se possa começar a dissecar as porções de uma proteína que são importantes para sua função A atividade de uma enzima por exemplo pode ser estudada alterandose apenas um único aminoácido no CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 495 seu sítio ativo Também é possível por meio de engenharia do genoma criar novos tipos de proteínas em um animal Por exemplo um gene pode ser fusionado a uma proteína fluorescente Quando esse gene alterado é introduzido no genoma a proteína pode ser rastreada no organismo vivo por meio do monitoramento da sua fluorescência Genes alterados podem ser criados de várias maneiras Talvez o mais simples seja sintetizar quimicamente o DNA que compõe o gene Desta forma o pesquisador pode es pecificar qualquer tipo de variante do gene normal Também é possível construir genes alterados usando tecnologia de DNA recombinante como descrito anteriormente neste capítulo Uma vez obtidos genes alterados podem ser introduzidos em células de várias maneiras O DNA pode ser microinjetado em células de mamíferos com uma micropipeta de vidro ou introduzido por um vírus que foi alterado para carregar genes estranhos Nas plantas os genes são frequentemente introduzidos por uma técnica chamada bombarde amento de partículas amostras de DNA são colocadas sobre minúsculas esferas de ouro e então literalmente bombardeadas na parede celular com uma arma especialmente mo dificada A eletroporação é o método de escolha para introduzir DNA em bactérias e em algumas outras células Nessa técnica um choque elétrico breve torna a membrana celular temporariamente permeável permitindo que o DNA estranho entre no citoplasma Por ser mais útil para os pesquisadores o gene alterado uma vez introduzido na célula deve recombinar com o genoma da célula de modo que o gene normal seja substituído Em organismos simples como as bactérias e leveduras este processo ocorre com alta frequência usando a própria maquinaria de recombinação homóloga da célula como descrito no Capítulo 5 Em organismos mais complexos que possuem programas de desenvolvimento elaborados o procedimento é mais complicado pois o gene altera do deve ser introduzido na linhagem germinativa como descreveremos a seguir Animais e plantas podem ser geneticamente modificados Os animais e as plantas que foram modificados geneticamente por inserção deleção ou substituição gênica são chamados de organismos transgênicos e quaisquer genes es tranhos ou modificados que são adicionados são chamados de transgenes Mais adiante neste capítulo discutiremos plantas transgênicas e agora concentraremos nossa discussão nos camundongos transgênicos uma vez que um enorme progresso está ocorrendo nessa área Se uma molécula de DNA carregando um gene de camundongo mutado é transferida para uma célula de camundongo ela muitas vezes se insere nos cromossomos de forma aleatória mas foram desenvolvidos métodos para direcionar o gene mutante para subs tituir o gene normal por recombinação homóloga Explorando esses eventos de inserção gênica gene targeting qualquer gene específico pode ser alterado ou inativado em uma célula de camundongo por uma substituição direta do gene No caso em que ambas as có pias do gene de interesse são completamente inativadas ou deletadas o animal resultante é chamado de camundongo nocaute A técnica está resumida na Figura 853 GENE ATIVO Gene X GENE INATIVO Gene X Domínio de ligação ao DNA do repressor Tet Sequências reguladoras cisatuantes para repressor Tet Domínio ativador da transcrição Doxiciclina A B Figura 852 Genes modificados por engenharia genética podem ser ativados ou inativados com pequenas moléculas Aqui a porção de uma proteína bacteriana repressor de tetraciclina Tet que se liga ao DNA foi fusionada a uma porção do ativador transcricional de mamíferos e expressado em células de mamíferos em cultura O gene X modificado presente no lugar do gene normal tem sua região de controle gênico normal substituída por sequências reguladoras cisatuantes reconhecidas pelo repressor de tetraciclina Na ausência de doxiciclina uma versão particularmente estável da tetraciclina o gene modificado é expresso na presença de doxiciclina o gene é inativa do pois o fármaco faz o repressor de tetraciclina se dissociar do DNA Essa estratégia também pode ser usada em camundongos por meio da incorporação dos genes modificados na linhagem germinativa Em vários tecidos o gene pode ser ativado ou inativado pela simples adição ou remoção de doxiciclina na água dos animais Se a construção do repressor de tetraciclina estiver localizada sob o controle de uma região de controle de um gene específico de tecido o gene modificado por engenharia genética será ativado apenas naquele tecido 496 PARTE III Formas de trabalhar com células A habilidade em preparar camundongos transgênicos deficientes de um gene nor mal conhecido é um grande avanço e a técnica tem sido utilizada para determinar as funções de muitos genes de camundongos Figura 854 Se o gene atua no início do de senvolvimento o camundongo nocaute normalmente morrerá antes de tornarse adulto Esses defeitos letais podem ser cuidadosamente analisados para ajudar a determinar a função do gene ausente Como descrito no Capítulo 5 um tipo especialmente útil de animal transgênico se aproveita de um sistema de recombinação sítio específico para remover e assim inativar o genealvo em um determinado local ou em um determina do momento ver Figura 566 Nesse caso o genealvo nas células ES é substituído por uma versão totalmente funcional do gene que é flanqueada por um par das sequências curtas de DNA chamadas de sítios lox reconhecidos pela proteína recombinase Cre Os camundongos transgênicos que resultam são fenotipicamente normais Então eles são cruzados com camundongos transgênicos que expressam o gene da recombinase Cre sob o controle de um promotor induzível Nas células ou nos tecidos específicos nos quais Cre é ativado ele catalisa a recombinação entre as sequências lox removendo um genealvo e eliminando sua atividade ver Figura 225 Figura 853 Resumo dos procedimen tos utilizados para a realização de substituições de genes em camundon gos Na primeira etapa A uma versão alterada do gene é introduzida em células ES célulastronco embrionárias em cultu ra Essas células são discutidas em detalhes no Capítulo 22 Apenas algumas células ES terão seus genes normais correspon dentes substituídos pelo gene alterado pelo evento de recombinação homóloga Essas células podem ser identificadas por PCR e cultivadas para produzir vários des cendentes cada um carregando um gene alterado no lugar de um dos seus dois ge nes normais correspondentes Na próxima etapa do procedimento B as células ES alteradas são injetadas em um embrião de camundongo muito jovem as células são incorporadas no embrião em crescimento e um camundongo produzido por um embrião como este irá conter algumas cé lulas somáticas indicadas em laranja que carregam o gene alterado Alguns desses camundongos também irão conter células da linhagem germinativa que possuem o gene alterado quando cruzado com um camundongo normal alguns camundon gos dessa progênie irão conter uma cópia do gene alterado em todas as suas células Os camundongos com o transgene na sua linhagem germinativa são cruza dos para produzir tanto animais machos como fêmeas cada um heterozigoto para a substituição gênica ie eles têm uma cópia normal e uma mutante do gene Quando esses dois camundongos são cru zados não mostrado um quarto de sua progênie será homozigoto para o gene alterado CAMUNDONGO TRANSGÊNICO COM UMA CÓPIA DO GENEALVO SUBSTITUÍDA PELO GENE ALTERADO NA LINHAGEM GERMINATIVA AS CÉLULAS SOMÁTICAS DA PROGÊNIE SÃO TESTADAS PARA A PRESENÇA DO GENE ALTERADO E O CAMUNDONGO SELECIONADO É CRUZADO PARA TESTAR A PRESENÇA DO GENE NAS CÉLULAS DA LINHAGEM GERMINATIVA NASCIMENTO Camundongo fêmea FAZ O CRUZAMENTO ESPERA TRÊS DIAS E COLETA DOS EMBRIÕES JOVENS EMBRIÃO JOVEM HÍBRIDO PARCIALMENTE FORMADO A PARTIR DAS CÉLULAS ES INTRODUÇÃO DO EMBRIÃO JOVEM HÍBRIDO EM UM CAMUNDONGO PSEUDOGESTANTE Embrião jovem isolado Células ES crescendo em cultura A B Versão alterada do genealvo construída por engenharia genética IINTRODUÇÃO DE UM FRAGMENTO DE DNA CONTENDO O GENE ALTERADO EM VÁRIAS CÉLULAS TESTE PARA A RARA COLÔNIA NA QUAL O FRAGMENTO DE DNA SUBSTITUIU UMA CÓPIA DO GENE NORMAL PROLIFERAÇÃO DE CADA CÉLULA PARA FORMAR UMA COLÔNIA Células ES com uma cópia do genealvo substituída pelo gene mutante INJEÇÃO DAS CÉLULAS ES NO EMBRIÃO JOVEM CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 497 O sistema bacteriano CRISPR foi adaptado para editar genomas em uma ampla variedade de espécies Uma das dificuldades em fazer um camundongo transgênico pelo procedimento recém descrito é que a molécula de DNA introduzida carregando o gene alterado experi mentalmente muitas vezes se insere de forma aleatória no genoma e portanto muitas células ES devem ser rastreadas individualmente para encontrar uma que tenha a subs tituição gênica correta O uso criativo do sistema CRISPR descoberto nas bactérias como uma defesa contra os vírus resolveu esse problema Como descrito no Capítulo 7 o sistema CRISPR utiliza uma sequência de RNA guia para se ligar ao DNA de fita dupla por pareamento de bases complementares que então ele cliva ver Figura 778 O gene que codifica o componentechave desse sistema a proteína bacteriana Cas9 foi transferido para uma variedade de organismos onde ele simplifica muito o processo de produzir organismos transgênicos Figura 855A e B A estratégia básica é a seguinte a proteína Cas9 é ex pressada em células ES junto com um RNA guia desenhado pelo pesquisador para se ligar a uma determinada localização no genoma A Cas9 e o RNA guia se associam o complexo é trazido até a sequênciaalvo no genoma e a proteína Cas9 faz uma quebra na dupla fita Como vimos no Capítulo 5 as quebras da dupla fita muitas vezes são repa radas por recombinação homóloga aqui o molde escolhido pela célula para reparar o dano é muitas vezes o gene alterado que é introduzido nas células ES pelo pesquisador Dessa forma o gene normal pode ser danificado de forma seletiva pelo sistema CRISPR e substituído com alta eficiência pelo gene alterado experimentalmente O sistema CRISPR possui uma variedade de outros usos Sua força está na sua ha bilidade de ligar a Cas9 a milhares de posições diferentes dentro do genoma pelas regras simples do pareamento de bases complementares Assim se uma proteína Cas9 inati va cataliticamente é fusionada a um ativador ou repressor transcricional é possível em princípio ativar ou inativar qualquer gene Figura 855C e D O sistema CRISPR tem várias vantagens sobre outras estratégias para manipular a expressão gênica experimentalmente Primeiro é relativamente fácil para um pesquisa Figura 854 Um camundongo trans gênico modificado para expressar uma DNAhelicase mutante apresenta envelhecimento precoce A helicase codificada pelo gene Xpd está envolvida tanto na transcrição como no reparo do DNA Comparado com um camundongo tipo selvagem da mesma idade A um ca mundongo transgênico que expressa uma versão defeituosa de Xpd B exibe vários dos sintomas de envelhecimento precoce incluindo osteoporose emagrecimento cabelos grisalhos infertilidade e tempo de vida reduzido A mutação em Xpd usada aqui prejudica a atividade da helicase e imita a mutação que nos humanos causa tricotiodistrofia um distúrbio caracteri zado por cabelos frágeis anormalidades esqueléticas e uma expectativa de vida muito reduzida Esses resultados indicam que um acúmulo de danos no DNA pode contribuir para o processo de envelhe cimento tanto em humanos como em camundongos A partir de J de Boer et al Science 29612761279 2002 Com permissão de AAAS A B Figura 855 Uso de CRISPR para estu dar a função gênica em uma ampla va riedade de espécies A A proteína Cas9 expressada artificialmente nas espécies de interesse se liga a um RNAguia de senhado pelo pesquisador e também ex pressado A porção do RNA em azulclaro é necessária para associações com Cas9 a porção em azulescuro é especificada pelo pesquisador para se ligar em uma posição do genoma A única outra exigência é que a sequência genômica adjacente inclua um PAM do inglês protospacer adjacent mo tif curto motivo protoespaçador adjacen te que é necessário para que a Cas9 clive o DNA Como descrito no Capítulo 7 essa sequência é como o sistema CRISPR nas bactérias distingue seu próprio genoma do genoma dos vírus invasores B Quando induzido a realizar quebras na fita dupla o sistema CRISPR melhora muito a habi lidade de substituir um gene endógeno por um gene alterado experimentalmente uma vez que o gene alterado seja usado para reparar a quebra na dupla fita C D Com o uso de uma forma mutante de Cas9 que não pode mais clivar DNA Cas9 pode ser utilizada para ativar um gene normalmente dormente C ou ina tivar um gene expressado ativamente D Adaptada a partir de P Mali et al Nat Methods 10957963 2013 Com permis são de Macmillan Publishers Ltd Quebra da fita dupla 3 3 5 DNA genômico de fita dupla Proteína Cas9 Sítio de clivagem Sítio de clivagem Sequência PAM RNAguia Domínio de ativação Domínio repressor GENE ATIVO GENE INATIVO A B C D 498 PARTE III Formas de trabalhar com células dor desenhar o RNAguia ele simplesmente segue a convenção do pareamento de ba ses padrão Segundo o gene a ser controlado não precisa ser modificado a estratégia CRISPR explora sequências de DNA já presentes no genoma Terceiro numerosos genes podem ser controlados de forma simultânea Cas9 deve ser expressada apenas uma vez mas muitos RNAsguia podem ser expressados na mesma célula essa estratégia permite ao pesquisador ativar ou inativar um conjunto inteiro de genes de uma só vez A exportação do sistema CRISPR de bactéria para praticamente todos os outros orga nismos incluindo camundongos peixezebra vermes moscas arroz e trigo revolucionou o estudo da função gênica Assim como a descoberta das enzimas de restrição esse avanço proveio dos cientistas estudando um fenômeno fascinante nas bactérias sem inicialmente saber o enorme impacto que estas descobertas teriam em todos os aspectos da biologia Grandes coleções de mutações feitas por engenharia genética fornecem uma ferramenta para examinar a função de cada gene em um organismo Esforços colaborativos extensos produziram bibliotecas abrangentes de mutações em uma variedade de organismosmodelo incluindo S cerevisiae C elegans Drosophila Arabidopsis e mesmo camundongos O objetivo final em cada caso é produzir uma coleção de cepas mutantes nas quais cada gene no organismo foi deletado sistemati camente ou alterado de maneira que possa ser interrompido condicionalmente As co leções desse tipo fornecem uma fonte incalculável para investigar a função dos genes em uma escala genômica Por exemplo uma grande coleção de organismos mutantes pode ser rastreada para um determinado fenótipo Assim como as abordagens genéticas clássicas descritas anteriormente esta é uma das maneiras mais poderosas de identifi car os genes responsáveis por um determinado fenótipo Entretanto diferentemente da abordagem genética clássica o conjunto de mutantes é préconstruído de modo que não há necessidade de se depender de eventos ao acaso como mutações espontâneas ou inserções de transpósons Além disso cada uma das mutações individuais dentro da coleção muitas vezes é construída para conter um código de barras molecular distinto na forma de uma sequência de DNA única designada para identificar o gene alterado de forma rápida e rotineira Figura 856 Em S cerevisiae a tarefa de gerar um conjunto completo de 6 mil mutantes cada um com apenas um gene inativado foi realizada alguns anos atrás Como cada cepa Sequência homóloga ao gene alvo X de levedura Gene marcador selecionável Sequência única código de barras Cromossomo de levedura Genealvo X de levedura RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA O genealvo X é substituído pelo gene marcador selecionável e a sequência código de barras associada Figura 856 Produzindo coleções com código de barras de organismos mutantes A Uma construção de deleção para uso em leveduras contém sequências de DNA vermelho homólogas a cada extremidade do genealvo X um gene marcador selecionável azul e uma única sequência código de barras com aproximada mente 20 pares de nucleotídeos de comprimento verde Esse DNA é introduzido em leveduras nas quais pron tamente substitui o genealvo por recombinação homóloga As células que carregam uma substituição gênica com sucesso são identificadas pela expressão de um gene marcador selecionável normalmente um gene que fornece resistência a um fármaco Utilizandose uma coleção de tais construções cada uma específica para um gene uma biblioteca de mutantes de leveduras foi construída contendo um mutante para cada gene Os genes essenciais não podem ser estudados dessa forma uma vez que sua deleção do genoma faz as células morre rem Nesse caso o genealvo é substituído por uma versão do gene que pode ser regulada pelo pesquisador ver Figura 852 Então o gene pode ser inativado e o seu efeito pode ser monitorado antes que a célula morra CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 499 mutante possui uma sequência de código de barras individual embebida no seu ge noma uma grande mistura de cepas modificadas por engenharia genética pode ser crescida sob várias condições teste seletivas como privação nutritiva mudança de temperatura ou presença de vários fármacos e as células que sobrevivem podem ser rapidamente identificadas por meio da única sequência marcadora presente nos seus genomas Ao determinar como cada mutante na mistura irá progredir podese começar a discernir quais genes são essenciais úteis ou irrelevantes para crescer sob várias con dições Figura 857 Os resultados obtidos ao examinar as bibliotecas mutantes podem ser considerá veis Por exemplo o estudo de uma grande coleção de mutantes em Mycoplasma genita lium o organismo com o menor genoma conhecido identificou o mínimo de comple mentos de genes essenciais à vida da célula O crescimento sob condições de laboratório requer cerca de três quartos dos 480 genes que codificam proteínas em M genitalium Aproximadamente 100 desses genes essenciais não têm função conhecida o que sugere que um número surpreendente dos mecanismos moleculares básicos que são a base da vida ainda deverá ser descoberto As coleções de organismos mutantes também estão disponíveis para várias espé cies animais e de plantas Por exemplo é possível encomendar por telefone ou email de um consórcio de pesquisadores um mutante de deleção ou inserção de quase todos genes codificadores em Drosophila Da mesma forma existe um conjunto quase com pleto de mutantes para a planta modelo Arabidopsis E a adaptação do sistema CRIS PR para uso em camundongos significa que no futuro próximo esperamos poder ser capazes de ativar e inativar à vontade cada gene no genoma de camundongo Embora ainda sejamos desconhecedores da função da maioria dos genes na maior parte dos or ganismos essas tecnologias permitem uma exploração da função gênica em uma escala que não era imaginável uma década atrás A interferência de RNA é uma maneira simples e rápida de testar a função do gene Embora o nocaute ou expressão condicional de um gene em um organismo e o estudo das suas consequências seja a abordagem mais poderosa para compreender as funções do gene a interferência de RNA RNAi é uma abordagem alternativa particularmente conveniente Como discutido no Capítulo 7 esse método explora o mecanismo natural utilizado em várias plantas animais e fungos para protegerse contra vírus e elementos transponíveis A técnica introduz uma molécula de fita dupla de RNA cuja sequência de nucleotídeos combina com parte do gene a ser inativado em uma célula ou organismo Após o processamento do RNA ele se hibridiza com o RNA do genealvo mRNA ou RNA não codificador e reduz sua expressão pelo mecanismo mostrado na Figura 775 O RNAi é frequentemente usado para inativar genes em Drosophila e linhagens de cultura de células de mamíferos Para isso um conjunto de 15 mil moléculas de RNAi de Drosophila uma para cada gene codificador permite aos cientistas em alguns meses testar o papel de cada gene da mosca em um processo que pode ser monitorado usando se células em cultura O RNAi também foi bastante utilizado para estudar a função gêni ca em organismos inteiros incluindo o nematódeo C elegans Quando trabalhamos com Figura 857 Rastreamentos do genoma usando um grande conjunto de leveduras mutantes por deleção com código de barras Um grande conjunto de leveduras mu tantes cada uma com um gene diferente deletado e presentes em quantidades iguais é cultivado sob condições selecionadas pelo pesquisador Alguns mutantes azul cresceram normalmente mas outros mostraram um crescimento reduzido laranja e verde ou não cresceram vermelho A viabilidade de cada mutante é determinada experimentalmen te da forma a seguir Depois de completada a fase de crescimento o DNA genômico isolado a partir de uma mistura de cepas é purificado e a abundância relativa de cada mutante é determinada pela quantificação do nível do código de barras combinado com cada deleção Isso pode ser realizado sequenciandose o DNA genômico do conjunto ou hibridizandoo em microarranjos ver Figura 864 que contêm oligonucleotídeos de DNA complementares a cada código de barras Dessa forma a contribuição de cada gene para o crescimento sob condições específicas pode ser rapidamente constatada Esse tipo de estudo revelou que dos aproximadamente 6 mil genes codificadores na levedura apenas cerca de mil são essenciais sob condições de crescimento padrão Cultivo das células em condições escolhidas Purificação do DNA genômico Análise da abundância relativa de cada código de barras Código de barras Conjunto de leveduras mutantes com código de barras cada uma com um gene diferente deletado 1 2 3 4 Mutantes de deleção Taxa de crescimento CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 501 RNAi p ex neurônios em nematódeos Um outro problema resulta de vários or ganismos conterem grandes famílias gênicas cujos membros exibem similaridade nas sequências Portanto RNAi às vezes produz efeitos de além do alvo inativando genes relacionados além dos genesalvo Uma estratégia para evitar esse problema é utilizar múltiplas moléculas pequenas de RNA que pareiam com diferentes regiões do mesmo gene No final os resultados de qualquer experimento de RNAi devem ser vistos como um forte indício mas não necessariamente uma prova de função gênica normal Genesrepórter revelam quando e onde um gene é expresso Na seção anterior discutimos como as abordagens genéticas podem ser utilizadas para acessar a função gênica em células em cultura ou ainda melhor no organismo intacto Embora essa informação seja crucial para compreender a função gênica ela normal mente não revela os mecanismos moleculares pelos quais o produto gênico trabalha na célula Por exemplo a genética por si só raramente nos informa todos os locais no orga nismo onde o gene é expressado ou como sua expressão é controlada Ela não neces sariamente revela se o gene atua no núcleo citosol superfície da célula ou em um dos numerosos outros compartimentos da célula E não revela como um produto gênico pode alterar sua localização ou seu padrão de expressão quando o meio externo da cé lula é modificado Pistaschave para a função gênica podem ser obtidas simplesmente observandose quando e onde um gene é expressado Uma variedade de abordagens a maioria envolvendo alguma forma de engenharia genética pode facilmente prover essa informação crítica Como discutido em detalhes no Capítulo 7 sequências reguladoras de DNA cisatuantes localizadas antes ou depois da região codificadora controlam a transcrição gênica Essas sequências reguladoras que determinam precisamente quando e onde o gene é expresso podem ser facilmente estudadas colocandose um generepórter sob seu controle e introduzindose essas moléculas de DNA recombinante nas células Figu ra 860 Dessa forma o padrão normal de expressão de um gene pode ser determinado assim como a contribuição das sequências reguladoras cisatuantes individuais no esta belecimento desse padrão ver também Figura 729 Figura 860 Utilização de uma proteínarepórter para determinar o padrão de expressão de um gene A Neste exemplo a sequência codifica dora para a proteína X é substituída pela sequência codificadora para a proteína repórter Y Os padrões de expressão para X e Y são os mesmos B Vários fragmentos de DNA contendo sequências reguladoras cisatuantes candidatas são adicionados em combinações para produ zir moléculasteste de DNA que codificam o generepórter Y Então essas moléculas de DNA recombinante são testadas para a expressão após sua introdução em vários tipos diferentes de células de mamíferos Os resultados estão resumidos em C Para experimentos em células eucari óticas duas proteínasrepórter comumente utilizadas são as enzimas bgalactosidase bgal ver Figura 728 e a proteína verde fluorescente GFP ver Figura 922 Sequência codificadora para a proteína X 1 2 3 Sequências reguladoras cisatuantes de DNA que determinam a expressão do gene X Sítio de início para a síntese de RNA Padrão de expressão do gene X normal A B C D E F Sequência codificadora para a proteínarepórter Y Padrão de expressão do generepórter Y Células 1 2 3 3 2 1 2 1 A MOLÉCULAS INICIAIS DE DNA B MOLÉCULASTESTE DE DNA C CONCLUSÕES A sequência reguladora cisatuante 3 normalmente ativa o gene X na célula B A sequência reguladora cisatuante 2 normalmente ativa o gene X nas células D E e F A sequência reguladora cisatuante 1 normalmente inativa o gene X na célula D PADRÃO DE EXPRESSÃO DO GENEREPÓRTER Y PADRÃO DE EXPRESSÃO DO GENE X Normal Recombinante A B C D E F Células CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 503 deos é proporcional à abundância das espécies de RNA Mas esse método é limitado aos RNAs que são expressos em níveis razoavelmente altos e é difícil quantificar ou mesmo identificar RNAs raros Um método mais acurado baseiase nos princípios da PCR Figu ra 863 Chamada RTPCR reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa quantitativa esse método inicia com uma população total de moléculas de RNA purifi cadas a partir de um tecido ou cultura de células É importante que nenhum DNA esteja presente na preparação ele deve ser retirado ou degradado enzimaticamente Dois inicia dores de DNA que pareiam especificamente com o mRNA de interesse são adicionados com a transcriptase reversa ao DNApolimerase e aos quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato necessários para a síntese O primeiro ciclo de síntese é a transcrição reversa do RNA em DNA usando um desses iniciadores Depois uma série de ciclos de aquecimento e resfriamento permite a amplificação daquela fita de DNA por PCR ver Figura 836 A parte quantitativa desse método tem como base uma relação direta entre a velocidade em que o produto de PCR é gerado e a concentração original das espécies de mRNA de inte resse Pela adição de corantes químicos na PCR que fluorescem apenas quando ligados a uma fita dupla de DNA uma medida simples de fluorescência pode ser utilizada para rastrear o progresso da reação e dessa forma deduzir com acuidade a concentração inicial do mRNA que é amplificado Embora pareça complicada essa técnica de RTPCR é relati vamente rápida e simples para ser realizada no laboratório ela é atualmente o método de escolha para quantificar os níveis de mRNA de forma acurada a partir de qualquer gene Análises de mRNAs por microarranjo ou RNAseq fornecem informações sobre a expressão em um momento específico Como discutido no Capítulo 7 uma célula expressa apenas um subconjunto de vários milhares de genes disponíveis no seu genoma além disso esses subconjuntos diferem de um tipo de célula para outro ou na mesma célula de um meio para outro Uma ma neira de determinar quais genes estão sendo expressos por uma população de células ou um tecido é analisar quais mRNAs estão sendo produzidos A primeira ferramenta que ajudou os pesquisadores a analisar simultaneamente os milhares de RNAs diferentes produzidos pelas células ou tecidos foi o microarranjo de DNA Desenvolvido nos anos de 1990 os microarranjos de DNA são lâminas de vi dro de microscópio que contêm centenas de milhares de fragmentos de DNA cada um servindo de sonda para o mRNA produzido por um gene específico Tais microarranjos permitem aos investigadores monitorar a expressão de cada gene em um genoma em um único experimento Para a análise os mRNAs são extraídos das células ou tecidos e convertidos em cDNAs ver Figura 831 Os cDNAs são marcados fluorescentemente e hibridizados a fragmentos ligados ao microarranjo Então um microscópio de fluores cência automatizado determina quais mRNAs estão presentes na amostra original com base nas posições do arranjo às quais os cDNAs estão ligados Figura 864 Embora os microarranjos sejam relativamente baratos e fáceis de usar eles têm uma desvantagem óbvia as sequências das amostras de mRNA a serem analisadas de vem ser conhecidas antes e representadas por uma sonda correspondente no arranjo Com o desenvolvimento das tecnologias de sequenciamento melhoradas os pesquisa dores utilizam cada vez mais RNAseq discutido anteriormente como uma abordagem mais direta para catalogar os RNAs produzidos por uma célula Por exemplo essa abor dagem pode detectar prontamente o splicing alternativo do RNA edição do RNA e vários RNAs não codificadores produzidos a partir de um genoma complexo Os microarranjos de DNA e as análises RNAseq têm sido utilizados para examinar tudo desde as mudanças na expressão gênica que fazem os morangos amadurecerem Figura 862 A hibridização in situ para mRNAs tem sido utilizada para gerar um atlas da expressão gênica no cérebro de camundongos Esta imagem gerada por computador mostra a expressão de alguns mRNAs dife rentes específicos para uma área do cérebro associada com a aprendizagem e a memória Mapas similares de padrões de expressão de todos os genes conhecidos no cérebro de camundongo estão compilados no projeto do atlas de cérebro disponível online A partir de M Hawrylycz et al PLoS Comput Biol 7e1001065 2011 Tempo número de ciclos de PCR Fluorescência Figura 863 Os níveis de RNA podem ser medidos por RTPCR quantitativa A fluorescência medida é gerada por um corante que fluoresce apenas quando ligado a produtos de DNA de fita dupla da RTPCR ver Figura 836 A amostra vermelha tem uma concentração maior do mRNA quantificada do que a amostra azul uma vez que ela requer menos ciclos de PCR para atingir a mesma metade de con centração máxima do DNA de fita dupla Com base nessa diferença as quantidades relativas do mRNA nas duas amostras po dem ser precisamente determinadas 2 mm 504 PARTE III Formas de trabalhar com células até as assinaturas da expressão gênica de diferentes tipos de células de câncer humano ou desde mudanças que ocorrem conforme as células progridem pelo ciclo celular até aquelas produzidas em resposta a mudanças repentinas na temperatura Na verdade como essas abordagens permitem o monitoramento simultâneo de um grande número de RNAs elas podem detectar mudanças sutis em uma célula mudanças que podem não ser manifestadas em sua aparência ou em seu comportamento Estudos gerais de expressão gênica também fornecem informação útil para pre dizer a função gênica Anteriormente neste capítulo discutimos como a identifica ção de proteínas que interagem pode gerar informações sobre a função da proteína Um princípio semelhante também é verdadeiro para genes uma informação sobre a função gênica pode ser deduzida pela identificação dos genes que compartilham seu padrão de expressão Utilizandose uma abordagem chamada de análise de agrupa mentos podemse identificar grupos de genes que são regulados de forma coordenada Os genes que são ativados ou inativados em conjunto sob circunstâncias diferentes pro vavelmente trabalham em conjunto na célula eles podem codificar para proteínas que são parte da mesma máquina multiproteica ou para proteínas que estão envolvidas em uma atividade coordenada complexa como a replicação do DNA ou o splicing do RNA Caracterizar um gene cuja função é desconhecida pelo seu agrupamento com genes co nhecidos que compartilham seu comportamento transcricional é às vezes chamado de culpa pela associação A análise de agrupamentos tem sido utilizada para analisar os perfis da expressão gênica que fundamentam vários processos biológicos interessantes incluindo a cicatrização de feridas em humanos Figura 865 Figura 864 Os microarranjos de DNA são utilizados para analisar a produção de milhares de mRNAs diferentes em um único experimento Neste exemplo o mRNA é coletado a partir de duas amostras de células diferentes por exemplo células tratadas com um hormônio e células do mesmo tipo não tratadas para permitir uma comparação direta dos genes específicos expressados sob ambas as condições Os mRNAs são convertidos em cDNAs que são marcados com um corante vermelho fluorescente para uma amostra e um corante verde fluorescente para outra As amostras marcadas são misturadas e hibridizadas com o microarranjo Cada ponto microscópico no microarranjo é uma molécula de DNA de 50 nucleotídeos de sequência definida produzidas por síntese química e adicionadas ao arranjo A sequência de DNA representada por cada ponto é diferente e as centenas de milhares desses pontos são projetados para cobrir a sequência do genoma A sequência de DNA de cada ponto é acompanhada pelo computador Após a incubação o arranjo é lavado e a fluorescência é varrida Apenas uma pequena proporção do microarranjo repre sentando 676 genes é mostrada Os pontos vermelhos indicam que o gene na amostra 1 é expressado em nível mais alto do que o gene correspondente na amostra 2 e os pontos ver des indicam o oposto Os pontos amarelos revelam genes que são expressos em níveis iguais em ambas as amostras de células A intensidade da fluorescência fornece uma estimativa de quanto RNA de um gene está presente Os pontos escuros indicam pouca ou nenhuma expressão do gene cuja sonda está localizada naquela posição do arranjo LAVAGEM VARREDURA POR SINAIS VERMELHOS E VERDES E COMBINAÇÃO DAS IMAGENS Pequena região do microarranjo representando 676 genes mRNA da amostra 1 mRNA da amostra 2 HIBRIDIZAÇÃO COM MICROARRANJO Converter para cDNA marcação com fluorocromo vermelho Converter para cDNA marcação com fluorocromo verde Genes de cicatrização Genes do ciclo celular 0 15 min 30 min 1 h 2 h 3 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h Genes da biossíntese de colesterol Tempo Figura 865 Utilização da análise de agrupamentos para identificar grupos de genes que são regulados de forma coordenada Os genes que possuem o mesmo padrão de expressão provavelmente estão envolvidos em vias ou processos comuns Para fazer uma análise de agrupamento os dados de RNAseq ou microarranjos são obtidos a partir de amostras de células expostas a várias condições diferentes e os genes que mostram mudanças coordenadas no seu padrão de expressão são agrupados Neste experimento os fibroblastos humanos foram privados de soro por 48 horas o soro foi então adicionado à cultura no tempo 0 e as células foram coletadas para análise do microarranjo em diferentes tempos Dos 8600 genes mostrados aqui cada um representado por uma linha vertical fina pouco mais de 300 mostraram três vezes ou mais variação nos seus padrões de expressão em resposta à reintrodução do soro Aqui o vermelho indica um aumento na expressão o verde uma diminuição na expressão Tendo como base os resultados de vários outros experimentos os 8600 genes foram agrupados com base nos padrões similares de expressão Os resultados dessa análise mostram que os genes envolvidos na cicatrização são ativados em resposta ao soro enquanto os genes envolvidos na regulação da progressão do ciclo celular e da biossíntese de colesterol são inativados A partir de MB Eisen et al Proc Natl Acad Sci USA 941486314868 1998 Com permissão de National Academy of Sciences CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 505 A imunoprecipitação da cromatina genômica ampla identifica sítios no genoma ocupados por reguladores da transcrição Discutimos algumas estratégias para medir os níveis de RNAs individuais em uma célula e monitorar alterações em seus níveis em resposta a sinais externos Mas essa informa ção não nos informa como tais alterações foram provocadas Vimos no Capítulo 7 que os reguladores da transcrição por se ligarem a sequências reguladoras cis no DNA são responsáveis por restabelecer e alterar os padrões da transcrição Normalmente essas proteínas não ocupam todas as suas sequências cis reguladoras potenciais no genoma sob todas condições Por exemplo em alguns tipos de células a proteína reguladora pode não ser expressada ou ela pode estar presente mas não ter uma proteína parceira obrigatória ou ela pode ser excluída do núcleo até que um sinal apropriado seja rece bido a partir do meio da célula Mesmo se a proteína estiver presente no núcleo e for competente para se ligar ao DNA outros reguladores da transcrição ou componentes da cromatina podem ocupar sequências de DNA que se sobrepõem e assim ocluir algumas das suas sequências reguladoras cis no genoma A imunoprecipitação da cromatina fornece uma maneira para determinar expe rimentalmente todas as sequências cis reguladoras em um genoma que são ocupadas por um determinado regulador da transcrição sob um conjunto particular de condições Figura 866 Nessa metodologia as proteínas são covalentemente ligadas ao DNA nas células vivas as células são lisadas e o DNA é mecanicamente quebrado em fragmentos pequenos Os anticorpos direcionados contra um determinado regulador da transcrição são então utilizados para purificar o DNA que se tornou covalentemente ligado àquela proteína na célula Esse DNA então é sequenciado usando os métodos rápidos discuti dos anteriormente a localização precisa de cada fragmento de DNA precipitado ao lon go do genoma é determinada por meio da comparação da sua sequência de DNA com a sequência genômica inteira Figura 867 Dessa forma todos os sítios ocupados pelo regulador da transcrição na amostra de células podem ser mapeados no genoma das cé lulas ver Figura 737 Em combinação com a informação do microarranjo ou RNAseq a imunoprecipitação da cromatina pode identificar o reguladorchave da transcrição res ponsável por especificar um determinado padrão de expressão gênica A imunoprecipitação da cromatina também pode ser utilizada para deduzir as sequências reguladoras cis reconhecidas por um determinado regulador da transcri ção Aqui todas as sequências de DNA precipitadas pelo regulador são arranjadas pelo computador e as características em comum são tabuladas para produzir o es pectro de sequências reguladoras cis reconhecidas pela proteína ver Figura 79A A imunoprecipitação da cromatina também é usada rotineiramente para identificar as posições ao longo do genoma que estão ligadas pelos vários tipos de histonas modi ficadas discutido no Capítulo 4 Nesse caso são empregados anticorpos específicos para determinada modificação da histona ver Figura 867 A variação da técnica tam bém pode ser utilizada para mapear posições dos cromossomos que estão fisicamente próximos ver Figura 448 O perfil de ribossomos revela quais mRNAs estão sendo traduzidos na célula Nas seções anteriores discutimos algumas maneiras de como os níveis de RNA podem ser monitorados nas células Mas para os mRNAs isso representa apenas uma etapa na expressão gênica e muitas vezes estamos mais interessados no nível final da proteína produzida pelo gene Como descrito na primeira parte do capítulo métodos de espectro metria de massa podem ser utilizados para monitorar os níveis de todas as proteínas na célula incluindo formas modificadas das proteínas Entretanto se quisermos compreen der como a síntese das proteínas é controlada pela célula precisamos considerar a etapa de tradução da expressão gênica Figura 866 Imunoprecipitação da cromatina Esse método permite a identificação de todos os sítios que um regulador da transcrição ocupa em um genoma in vivo As identidades dos fragmentos de DNA precipitados e amplificados são determinadas por sequenciamento Gene 1 Gene 2 LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS AO DNA COM FORMALDEÍDO LISE DAS CÉLULAS QUEBRA DO DNA EM PEQUENOS FRAGMENTOS 200 NUCLEOTÍDEOS AMPLIFICAÇÃO DO DNA PRECIPITADA POR PCR REVERSÃO DAS LIGAÇÕES POR FORMALDEÍDO REMOÇÃO DA PROTEÍNA PRECIPITAÇÃO DO DNA USANDO ANTICORPOS CONTRA O REGULADOR DA TRANSCRIÇÃO A Vários outros fragmentos de DNA que abrangem o restante do genoma DNA CORRESPONDENTE A ESSAS POSIÇÕES NO GENOMA QUE ERAM OCUPADAS PELO REGULADOR DA TRANSCRIÇÃO A NAS CÉLULAS Regulador da transcrição A Regulador da transcrição B X X X Célula viva 506 PARTE III Formas de trabalhar com células Uma abordagem chamada de perfil de ribossomos fornece um mapa instantâneo da posição dos ribossomos em cada mRNA na célula e desse modo identifica aque les mRNAs que estão sendo traduzidos ativamente Para realizar isso o RNA total de uma linhagem celular ou tecido é exposto a RNAses sob condições nas quais aquelas sequências de RNA protegidas pelos ribossomos são poupadas Os RNAs protegidos são liberados dos ribossomos convertidos em DNA e a sequência de nucleotídeos de cada um é determinada Figura 868 Quando essas sequências são mapeadas no genoma a posição dos ribossomos em cada espécie de mRNA pode ser verificada O perfil de ribossomos revelou muitos casos nos quais os mRNAs são abundantes mas não são traduzidos até que as células recebam um sinal externo Também mostrou que várias fases de leitura aberta ORFs que eram muito pequenas para serem anotadas como genes são traduzidas ativamente e provavelmente codificam proteínas funcionais embora muito pequenas Figura 869 Finalmente o perfil de ribossomos revelou de que maneiras as células alteram de forma rápida e global seus padrões de tradução em reposta a uma mudança súbita na temperatura disponibilidade de nutrientes ou estres se químico Métodos de DNA recombinante revolucionaram a saúde humana Vimos que as metodologias de ácidos nucleicos desenvolvidas nos últimos 40 anos alte raram completamente a maneira como a biologia celular e molecular são estudadas Mas elas também tiveram um profundo efeito no nosso cotidiano Vários fármacos humanos em uso rotineiro p ex insulina hormônio de crescimento humano fatores de coagula ção do sangue e interferon tem como base a clonagem de genes humanos e a expressão das proteínas codificadas em grandes quantidades Como o sequenciamento de DNA con tinua a diminuir de custo mais e mais indivíduos escolhem ter seu genoma sequenciado essa informação pode ser utilizada para prever a susceptibilidade a doenças muitas vezes com a opção de minimizar esta possibilidade pelo comportamento adequado ou predizer a maneira como um indivíduo responderá a determinado fármaco O genoma de células tumorais de um indivíduo pode ser sequenciado para determinar o melhor tipo de trata mento anticâncer E mutações que causam câncer ou aumentam muito o risco de doença continuam a ser identificadas a um ritmo sem precedentes Utilizando as tecnologias de DNA recombinante discutidas neste capítulo essas mutações podem então ser introdu zidas em animais como camundongos que podem ser estudados no laboratório Os ani mais transgênicos resultantes que muitas vezes mimetizam algumas das anormalidades Figura 867 Resultados de algumas imunoprecipitações da cromatina mos trando as proteínas ligadas à região controle que regula a expressão do gene Oct4 Nesta série de experimentos com imunoprecipitação da cromatina an ticorpos direcionados contra um regulador da transcrição primeiros três painéis ou uma determinada modificação da histona quarto painel foram usados para preci pitar o DNA ligado por ligação cruzada O DNA precipitado foi sequenciado e as posições ao longo do genoma foram mapeadas Apenas uma pequena parte do genoma de camundongo contendo o gene Oct4 está mostrada Os resultados mostram que nas célulastronco embrio nárias analisadas nesses experimentos Oct4 se liga cadeia acima do seu próprio gene e que Sox2 e Nanog estão ligadas nas proximidades Oct4 Sox2 e Nanog são reguladoreschave nas célulastronco embrionárias discutido no Capítulo 22 e esse experimento revela a posição no ge noma pela qual eles exercem seus efeitos na expressão de Oct4 No quarto painel são mostradas as posições de uma modi ficação na histona associada com genes transcritos ativamente ver Figura 439 Finalmente o painel inferior mostra o RNA produzido a partir do gene Oct4 sob as mesmas condições utilizadas para as imunoprecipitações da cromatina Observe que os íntrons e éxons são relativamente fáceis de identificar a partir desses dados de RNAseq Oct4 Sox2 Nanog H3K4trimetil RNA 5000 pares de nucleotídeos Número de leituras de sequências Gene Oct4 Sequências reguladoras cis DNA genômico Éxon Íntron CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 507 fenotípicas associadas com a condição nos pacientes podem ser utilizados para explorar a base celular e molecular da doença e para identificar fármacos que poderiam ser poten cialmente usados de forma terapêutica nos humanos As plantas transgênicas são importantes para a agricultura Embora a tendência seja pensar em pesquisa de DNA recombinante em termos de biolo gia animal essas técnicas também tiveram um impacto profundo no estudo de plantas Na verdade certas características das plantas as tornam especialmente acessíveis para métodos de DNA recombinante Quando um pedaço de tecido vegetal é cultivado em um meio estéril contendo nu trientes e reguladores de crescimento adequados algumas das células são estimuladas a proliferar indefinidamente de uma maneira desorganizada produzindo uma massa de células relativamente indiferenciadas chamada de calo Se os nutrientes e regula dores do crescimento forem manipulados com cuidado podese induzir a formação de um broto dentro do calo e em muitas espécies uma planta inteira pode ser regenerada a partir destes brotos Em algumas plantas incluindo tabaco petúnia cenoura batatas e Arabidopsis uma única célula a partir desse broto conhecida como uma célula totipo tente pode crescer até um pequeno aglomerado de células a partir do qual uma planta Figura 868 Perfil de ribossomos O RNA é purificado a partir de células e digerido com uma RNAse para deixar ape nas aquelas porções dos mRNAs que estão protegidas pela ligação de um ribossomo Esses segmentos curtos de RNA protegido aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento são convertidos em DNA e sequenciados A informação resultante é mostrada como o número de leituras de sequências ao longo de cada posição do genoma No diagrama estão mostrados os dados para apenas um gene cujo mRNA está sendo traduzido de maneira eficiente O perfil de ribossomos fornece esse tipo de informação para cada mRNA produzido pela célula UGA AAAAAAAAAAAA AUG UGA AAAAAAAAAAAA AUG UGA AAAAAAAAAAAA AUG UGA AAAAAAAAAAAA AUG Digestão por nucleasse Remover os ribossomos Converter RNA em DNA e sequenciar Mapear as leituras de sequências no genoma Posição ao longo do genoma Gene sendo ativamente transcrito e traduzido Número de leituras Figura 869 O perfil de ribossomos pode identificar novos genes Este experimento mostra a descoberta de um gene previamente não reconhecido um que codifica uma proteína de apenas 20 aminoácidos No topo é mostrada a porção de um genoma viral com dois genes previamente anotados Abaixo estão os resultados de um experimento de perfil de ribossomos mostrado na mesma secção do genoma depois que o vírus foi infectado nas células humanas Os resulta dos mostram que o gene da esquerda não é expressado sob essas condições o gene da direita é expressado em baixos níveis e um gene previamente não reconhecido que está localizado entre os outros dois é expressado em níveis altos 200 pares de nucleotídeos Gene conhecido Gene conhecido ORF descoberta por perfil de ribossomos que codifica uma proteína de 20 aminoácidos Número de leituras Posição ao longo do genoma 508 PARTE III Formas de trabalhar com células inteira pode ser regenerada ver Figura 72B Assim como camundongos mutantes po dem ser derivados por manipulação genética das célulastronco embrionárias em cul tura as plantas transgênicas podem ser criadas a partir de células vegetais transfectadas com DNA em cultura Figura 870 A capacidade de produzir plantas transgênicas acelerou muito o progresso da bio logia celular de plantas em várias áreas Ela teve um papel importante por exemplo no isolamento de receptores de reguladores de crescimento e na análise dos mecanismos de morfogênese de expressão gênica em plantas Essas técnicas também abriram várias novas possibilidades na agricultura que puderam beneficiar tanto o produtor como o consumidor Elas tornaram possível por exemplo modificar a razão de lipídeos amido e proteínas em sementes conferir às plantas resistência a pestes e a vírus e criar plantas modificadas que toleram hábitats extremos como pântanos salgados ou solos alagados Uma variedade de arroz foi modificada geneticamente para produzir bcaroteno o pre cursor da vitamina A A substituição do arroz convencional esse arroz dourado assim chamado por causa da sua cor levemente amarela poderia ajudar a aliviar a deficiência grave de vitamina A que causa cegueira em milhares de crianças no mundo em desen volvimento a cada ano Resumo A genética e a engenharia genética fornecem ferramentas poderosas para compreender a função de genes individuais em células e organismos Na abordagem genética clássica a mutagênese aleatória está associada com o rastreamento para identificar mutantes que são deficientes em um processo biológico particular Esses mutantes são então utilizados para localizar e estudar os genes responsáveis pelo processo A função gênica também pode ser determinada por técnicas de genética reversa Podem ser utilizados métodos de engenharia genética para alterar genes e reinserilos em um cromossomo da célula de maneira que ele se torne uma parte permanente do genoma Se a célula utilizada para a transferência do gene é um óvulo fertilizado em um animal ou uma célula vegetal totipotente em cultura podem ser produzidos organismos transgê nicos que expressam o gene mutante e o passam a sua progênie Especialmente importante para a biologia celular e molecular é a habilidade de alterar células e organismos de ma neiras muito específicas permitindo o discernimento do efeito na célula ou no organismo de uma alteração projetada em uma única proteína ou molécula de RNA Por exemplo os Figura 870 As plantas transgênicas podem ser produzidas usando técni cas de DNA recombinante otimizadas para plantas Um disco é cortado de uma folha e incubado em uma cultura de Agrobacterium que carrega um plasmídeo recombinante com um marcador de sele ção e o gene desejado modificado gene ticamente As células vegetais danificadas nas extremidades do disco liberam subs tâncias que atraem a bactéria que injeta seu DNA nas células da planta Apenas aquelas células vegetais que incorporam o DNA apropriado e expressam o gene com o marcador selecionado sobrevivem e pro liferam formando um calo A manipula ção dos fatores de crescimento fornecidos ao calo o induzem a formar brotos que subsequentemente criam raízes e crescem até plantas adultas que carregam o gene modificado Discos removidos da folha do tabaco Discos da folha incubados com Agrobacterium modificado geneticamente durante 24 h Meio de seleção que permite que apenas as células vegetais que adquiriram DNA da bactéria proliferem Calo Meio de indução de brotos Broto Transferência do broto para um meio indutor de raízes Crescimento da muda enraizada Planta de tabaco adulta carregando o transgene originalmente presente no plasmídeo bacteriano CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 509 genomas podem ser alterados de modo que a expressão de qualquer gene pode ser induzi da ou inibida por pesquisadores Vários desses métodos estão sendo difundidos para investigar a função gênica em uma escala genômica A geração de bibliotecas mutantes nas quais cada gene em um organismo foi sistematicamente deletado interrompido ou tornado controlável pelo pes quisador fornece ferramentas valiosas para explorar o papel de cada gene na colaboração molecular complexa que dá origem à vida As tecnologias como RNAseq e microarranjos de DNA podem monitorar a expressão de dezenas de milhares de genes simultaneamente fornecendo informações detalhadas sobre os padrões dinâmicos da expressão gênica que sustentam os complexos processos celulares ANÁLISE MATEMÁTICA DAS FUNÇÕES CELULARES Os experimentos quantitativos combinados com teoria matemática marcam o início da ciência moderna Galileu Kepler Newton e seus contemporâneos fizeram mais do que estabelecer algumas leis de mecânica e oferecer uma explicação para os movimentos dos planetas em torno do Sol eles mostraram como uma abordagem matemática quantita tiva poderia fornecer uma compreensão aprofundada e precisa ao menos para sistemas físicos que nunca se sonhou ser possível O que é que dá à matemática esse poder quase mágico para explicar o mundo na tural e por que a matemática teve um papel tão mais importante na parte das ciências físicas do que na biologia O que os biólogos precisam saber sobre matemática A matemática pode ser vista como uma ferramenta para derivar consequências lógicas a partir de proposições Ela difere do raciocínio intuitivo lógico na sua insistên cia sobre a lógica acurada e rigorosa e o tratamento preciso da informação quantitativa Se as proposições iniciais estiverem corretas então as deduções traçadas a partir de las pela matemática serão verdadeiras A força surpreendente da matemática provém da dimensão das linhas de raciocínio que a lógica rigorosa e argumentos matemáticos tornam possíveis e da imprevisibilidade das conclusões que podem ser obtidas muitas vezes revelando conexões que de outro modo não teriam sido deduzidas Revertendo o argumento a matemática fornece uma maneira de testar hipóteses experimentais se o raciocínio matemático a partir de uma determinada hipótese conduz a uma predição que não é verdadeira então a hipótese não é verdadeira Evidentemente a matemática não é muito útil a não ser que possamos moldar nos sas ideias nossa hipótese inicial sobre o determinado sistema de uma forma quantitativa precisa Uma hipótese matemática construída sobre um conjunto fraco ou mesmo ruim muito complicado ou vago de proposições provavelmente nos enganaria Para que a ma temática seja útil devemos focar nossas análises em subsistemas simples nos quais po demos selecionar parâmetros quantitativos chave e moldar hipóteses bem definidas Essa abordagem tem sido utilizada com grande sucesso na física por séculos no entanto seu uso é menos comum na biologia Mas os tempos estão mudando e cada vez mais está se tornando possível para os biólogos explorar o poder da análise matemática quantitativa Nesta seção final do nosso capítulo de métodos não tentamos ensinar aos leitores cada maneira na qual a matemática pode ser aplicada proveitosamente aos problemas biológicos Em vez disso simplesmente ajudamos a dar um sentido no que a matemática e as abordagens quantitativas podem fazer por nós na biologia moderna Daremos en foque principalmente aos princípios importantes que a matemática nos ensina sobre a dinâmica das interações moleculares e como a matemática pode revelar características surpreendentes e úteis de sistemas complexos contendo retroalimentação Ilustraremos esses princípios usando a regulação da expressão gênica por reguladores da transcrição como aqueles discutidos no Capítulo 7 Os mesmos princípios se aplicam aos sistemas póstranscricionais que controlam a sinalização celular Capítulo 15 o controle do ciclo celular Capítulo 17 e essencialmente todos os processos celulares Redes reguladoras dependem de interações moleculares A função e regulação celulares dependem de interações transientes entre milhares de macromoléculas diferentes na célula Frequentemente resumimos essas interações nes te livro com desenhos esquemáticos Esses diagramas são úteis mas uma visão completa 510 PARTE III Formas de trabalhar com células requer um nível de compreensão quantitativo mais profundo Para acessar o impacto biológico de qualquer interação na célula de forma significativa precisamos conhecer em termos precisos como as moléculas interagem como elas catalisam reações e o mais importante como os comportamentos das moléculas mudam com o tempo Se um de senho mostra que a proteína A ativa a proteína B por exemplo não podemos julgar a im portância desta interação sem detalhes quantitativos sobre as concentrações afinidades e comportamentos cinéticos das proteínas A e B Iniciaremos pela definição de dois tipos de interação reguladora em nossos esque mas uma designando inibição e a outra ativação Se a proteína produto do gene X é um repressor da transcrição que inibe a expressão do gene Z descrevemos o relacionamento como uma linha vermelha com uma barra na ponta desenhada entre os genes X e Z Figura 871 Se a proteína produto do gene Y é um ativador da transcrição que induz a expressão do gene Z então desenhamos uma seta verde entre os genes Y e Z A regulação da expressão de um gene por outro é mais complicada do que uma simples seta os conectando e um completo entendimento dessa regulação requer que separemos os processos bioquímicos subjacentes A Figura 872A esquematiza algumas das etapas bioquímicas na ativação da expressão gênica por um ativador da transcri ção Um gene codificando um ativador denominado gene A produzirá seu produto a proteína A via um RNA intermediário Essa proteína A se ligará então a pX o promotor regulador do gene X para formar o complexo ApX Uma vez que o complexo ApX se for ma ele estimula a produção de um transcrito de RNA que subsequentemente é traduzi do para produzir a proteína X Aqui daremos enfoque na interação da ligação central desse sistema regulador a interação entre a proteína A e o promotor pX Qualquer molécula de proteína A que está ligada a pX pode ser dissociada dela As etapas representadas pela seta verde de ativação na Figura 872A incluem tanto a ligação de A a pX e a dissociação do complexo ApX para formar novamente A e pX como ilustrado pela notação na Figura 872B Essa notação da reação é mais informativa do que o diagrama nas nossas figuras mas tem suas próprias limitações Suponha que a concentração de A aumente por um fator de 10 como resposta GENE Z GENE Y GENE Z GENE X Figura 871 Diagramas que resumem as relações bioquímicas Aqui um sim ples desenho indica que o gene X reprime o gene Z esquerda enquanto o gene Y ativa o gene Z direita Figura 872 Uma interação transcricio nal simples A Genes A e X produzem cada um uma proteína com o produto do gene A servindo como um ativador da transcrição para estimular a expressão do gene X Como indicado pela seta verde o estímulo depende em parte da ligação da proteína A à região promotora do gene X designada pX B A ligação da proteína A ao promotor do gene é determinada pelas concentrações de duas parceiras de ligação chamadas A e pX em unidades de mollitro ou M a constante de as sociação kon em unidades de s 1 M 1 e a constante de dissociação koff em unidades de s 1 C No estado estacionário as taxas de associação e dissociação são iguais e a concentração do complexo ligado é deter minada pela Equação 81 na qual as duas constantes são combinadas na constante de equilíbrio K D A Equação 82 pode ser derivada para calcular a concentração do complexo ligado em estado estacioná rio a uma concentração total conhecida do promotor pX T E O rearranjo da Equa ção 82 gera a Equação 83 que permite o cálculo da fração do promotor pX que está ocupada pela proteína A A GENE A DNA GENE X DNA RNA Proteína ativadora da transcrição X Proteína ESTÍMULO ATIVADOR SÚBITO A RNA A Promotor pX Taxa de associação do complexo konApX A pX ApX Taxa de dissociação do complexo koff ApX kon koff Em estado estacionário kon ApX koff ApX ApX ApX KApX Equação 81 B C koff kon pX pX ApX ApX KApX ApX ApX1 KA KApX ApX substituindo pX da equação acima na Equação 81 temos Equação 82 D Fração ligada Equação 83 E T T T pX pX T T KA 1 KA KA 1 KA ApX CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 511 a um estímulo do meio ambiente Se A aumenta intuitivamente sabemos que ApX tam bém deveria aumentar mas não podemos determinar a quantidade do aumento sem informações adicionais Precisamos conhecer a afinidade da interação da ligação e as concentrações dos componentes Com essa informação em mãos podemos derivar a resposta Como discutido anteriormente e no Capítulo 3 ver Figura 344 sabemos que a formação de um complexo entre os dois parceiros de ligação como A e pX depende de uma constante kon que descreve quantas colisões produtivas ocorrem por unidade de tempo por proteína a uma determinada concentração de pX A taxa de associação do complexo iguala o produto dessa constante kon e as concentrações de A e pX ver Figura 872B A dissociação do complexo ocorre a uma koff multiplicada pela concentração do complexo A constante koff pode diferir em ordens de magnitude para diferentes sequên cias de DNA pois depende da força das ligações não covalentes formadas entre A e pX Estamos interessados principalmente em entender a quantidade do complexo pro motor ligado em equilíbrio ou estado estacionário onde a taxa de associação do complexo se iguala à taxa de dissociação do complexo Sob essas condições a concentração do com plexo promotor é especificada por uma equação simples que combina as duas constantes em uma única constante de equilíbrio K konkoff Equação 81 Figura 872C K às vezes é chamada de constante de associação Ka Quanto maior a constante K mais forte é a interação entre A e pX ver Figura 344 A recíproca de K é a constante de dissociação Kd Para calcular a concentração do complexo promotor no estado estacionário utili zando a Equação 81 precisamos considerar outra complicação tanto A como pX exis tem em duas formas livre em solução e ligada uma a outra Na maioria dos casos sabe mos a concentração total de pX e não as concentrações livres ou ligadas assim devemos achar uma maneira de usar a concentração total nos nossos cálculos Para isso primeiro especificamos que a concentração total de pX pX T é a soma das concentrações das for mas livres pX e ligadas ApX Figura 872D Isso leva a uma nova equação que nos permite utilizar pX T para calcular a concentração do complexo promotor no estado esta cionário o ApX Equação 82 Figura 872D A proteína A também existe em duas formas livre A e ligada a pX ApX Em uma célula existem geralmente uma ou duas cópias de pX assumindo que exista apenas um gene X por genoma haploide e múltiplas cópias de A Como resultado pode mos assumir com segurança que do ponto de vista de A ApX é desprezível em relação ao total A T Isso significa que A A T e podemos colocar os valores do total A T na Equação 82 sem incorrer um erro apreciável no cálculo de ApX Agora estamos prontos para determinar os efeitos do aumento da concentração de A Suponha que K 10 8 M 1 um valor típico para muitas dessas interações A con centração inicial de A é A T 10 9 M e pX T 10 10 M assumindo que existe uma cópia do gene X em uma célula de levedura haploide por exemplo com um volume de cerca de 2 10 14 L Utilizando a Equação 82 observamos que um aumento de 10 vezes na concentração de A causa o aumento da quantidade do complexo promotor ApX em 55 vezes de 009 10 10 M para 05 10 10 M no estado estacionário Os efeitos de um au mento de 10 vezes na concentração de A irá variar dramaticamente dependendo da sua concentração inicial em relação à constante de equilíbrio Apenas através dessa abor dagem matemática podemos alcançar uma compreensão detalhada do que serão esses efeitos e qual o impacto que eles terão na resposta biológica Para avaliar o impacto biológico de uma alteração nos níveis do ativador da trans crição em vários casos também é importante determinar a fração do promotor do gene alvo que está ligada pelo ativador uma vez que esse número será diretamente propor cional à atividade do promotor do gene No nosso caso podemos calcular a fração do promotor do gene X pX que tem proteína A ligada a ele por meio do rearranjo da Equa ção 82 Equação 83 Figura 872E Essa fração pode ser vista como a probabilidade do promotor pX estar ocupado em média ao longo do tempo Ela também é igual a ocupa ção média através de uma grande população de células em qualquer instante Quando não existe proteína A presente pX sempre está livre a fração ligada é zero e a transcrição está inativa Quando A 1K o promotor pX tem uma chance de 50 de estar ocupado Quando A excede muito a 1K a fração ligada é quase igual a 1 significando que pX está totalmente ocupado e a transcrição é máxima 512 PARTE III Formas de trabalhar com células Equações diferenciais nos ajudam a predizer o comportamento transitório As informações mais importantes e básicas das quais nós biólogos dependemos da ma temática se referem ao comportamento dos sistemas reguladores com o tempo Este é o tema central da dinâmica e foi para a solução dos problemas na dinâmica que as técni cas de cálculos foram desenvolvidas por Newton e Leibniz no século XVII Brevemente o problema geral é o seguinte se nos são dadas as taxas de alteração de um conjunto de variáveis que caracterizam o sistema a qualquer instante como podemos computar seu estado futuro O problema se torna especialmente interessante e as predições muitas vezes extraordinárias quando as próprias taxas de alteração dependem dos valores das variáveis de estado como nos sistemas com retroalimentação Vamos voltar para Equação 82 Figura 872D que nos mostra que quando A altera ApX em estado estacionário também altera para uma nova concentração que podemos calcular com precisão Entretanto ApX não altera de modo instantâneo para este valor Se pretendemos compreender o comportamento desse sistema com detalhes também precisamos perguntar quanto tempo levará para que ApX chegue ao seu novo valor em estado estacionário na célula A Equação 82 não pode responder esta questão Precisamos utilizar equações diferenciais A estratégia mais comum para resolver esse problema é utilizar equações diferen ciais comuns As equações que descrevem as reações bioquímicas têm uma premissa sim ples a taxa de alteração na concentração de qualquer espécie molecular X ie dXdt é dada pelo equilíbrio da taxa de seu aparecimento com aquela do seu desaparecimento Para nosso exemplo a taxa de alteração na concentração do complexo promotor ligado ApX é determinada pelas taxas de associação e dissociação do complexo Podemos incorporar estas taxas na equação diferencial mostrada na Figura 873A Equação 84 Quando A altera a Equação 84 pode ser resolvida para gerar a concentração de ApX em função do tempo Observe que quando kon ApX koff ApX então dApXdt 0 e ApX não varia Nesse ponto o sistema alcançou o estado estacionário O cálculo de todos os valores de ApX em função do tempo usando a Equação 84 nos permite determinar a taxa na qual ApX alcança seu valor de estado estacionário Como esse valor é alcançado assintóticamente muitas vezes ele é mais útil para compa rar os tempos necessários para chegar a 50 90 ou 99 desse novo estado estacionário A maneira mais simples para determinar esses valores é resolver a Equação 84 com um método chamado de integração numérica que envolve adicionar valores para todos os parâmetros kon koff etc e então usar um computador para determinar os valores de ApX com o tempo iniciando a partir de uma determinada concentração inicial de A e pX Para kon 05 10 7 s 1 M 1 koff 05 10 1 s 1 K 10 8 M 1 como acima e pX T 10 10 M leva cerca de 5 20 e 40 segundos para ApX alcançar 50 90 e 99 do novo valor em esta do estacionário após uma repentina alteração de 10 vezes em A Figura 873B Assim um salto repentino em A não possui efeitos instantâneos como pode ter sido assumido a partir da observação do desenho na Figura 872A Portanto as equações diferenciais nos permitem compreender a dinâmica tran siente das reações bioquímicas Essa ferramenta é crítica para obter uma compreensão mais profunda do comportamento celular em parte porque ela nos permite determinar a dependência da dinâmica dentro das células dos parâmetros que são específicos para a determinada molécula envolvida Por exemplo se dobrarmos os valores de kon e koff en 0 2 5 10 20 30 40 05 15 25 35 45 Tempo segundos ApX múltiplos do valor inicial A B FRAÇÃO LIGADA AO PROMOTOR APÓS UM AUMENTO DE 10 VEZES EM A taxa associação do complexo taxa de dissociação do complexo dApX dt kon ApX koff ApX Equação 84 dApX dt Figura 873 Utilização de equações diferenciais para estudar a dinâmica e o comportamento de um sistema biológico em estado estacionário A A Equação 84 é uma equação diferen cial comum para calcular a taxa de altera ção na formação de complexo do promo tor ligado em resposta a uma alteração em outros componentes B Formação de ApX após um aumento de 10 vezes em A como determinado na solução da Equação 84 Em azul está a solução correspondente a kon 05 10 7 s 1 M 1 e koff 05 10 1 s 1 Nesse caso ApX leva cerca de 5 20 e 40 segundos para alcan çar 50 90 e 99 do novo valor em estado estacionário Para a curva em vermelho os valores de kon e koff são dobrados e o siste ma alcança o mesmo estado estacionário mais rapidamente 514 PARTE III Formas de trabalhar com células exemplo a taxa de degradação da proteína X depende do seu tempo de vida médio tX que leva em consideração a degradação ativa assim como sua diluição a medida que a célula cresce A taxa de degradação depende da concentração da proteína X e é calculada pela divisão dessa concentração pelo tempo de vida Figura 874A Com equações para taxas de produção e degradação em mãos podemos agora gerar uma equação diferencial para determinar a taxa de alteração da proteína X em fun ção do tempo Equação 85 Figura 874B Essa equação pode ser resolvida por méto dos numéricos mencionados anteriormente De acordo com a solução dessa equação quando a transcrição inicia a concentração da proteína X se eleva ao nível do estado estacionário no qual a concentração de X não se modifica mais isto é sua taxa de al teração é zero Quando isso ocorre o rearranjo da Equação 85 gera uma equação que pode ser usada para determinar o valor de X no estado estacionário Xst Equação 86 Figura 874C Um conceito importante emerge da matemática a concentração de um produto gênico no estado estacionário é diretamente proporcional ao seu tempo de vida Se o tempo de vida dobrar a concentração da proteína também duplica O tempo necessário para alcançar o estado estacionário depende do tempo de vida da proteína Podemos observar na Equação 86 ver Figura 874C que quando a concentração da proteína A aumenta a proteína X aumenta para um novo valor de estado estacionário Xst Mas isso não pode ocorrer de forma instantânea Em vez disso alterações em X alteram di namicamente de acordo com a solução da sua equação de taxa diferencial Equação 85 A solução dessa equação revela que a concentração de X em função do tempo está relaciona da a sua concentração em estado estacionário de acordo com a equação na Figura 874D Mais uma vez a matemática descobre um conceito simples porém importante e que não é intuitivamente óbvio seguido do aumento súbito em A X aumenta para um novo estado estacionário a uma taxa exponencial que está inversamente relacionada a seu tempo de vida quanto mais rápido o X for degradado menos tempo leva para alcançar seu novo valor de estado estacionário Figura 874E O tempo de resposta mais rápido vem com um custo metabólico mais alto uma vez que proteínas com um tempo de resposta rápido devem ser produzidas e degradadas a uma taxa alta Para proteínas que não são processadas de for ma rápida o tempo de resposta é muito longo e a concentração da proteína é determinada principalmente pela diluição que resulta do crescimento e divisão celular Os métodos quantitativos para repressores e ativadores da transcrição são similares O controle positivo não é o único mecanismo que as células usam para regular a expres são dos seus genes Como discutimos no Capítulo 7 as células também inativam genes ativamente muitas vezes empregando proteínas repressoras da transcrição que se ligam a sítios específicos nos genesalvo bloqueando dessa forma o acesso da RNApolimera se Podemos analisar a função desses repressores pelos mesmos métodos quantitativos descritos anteriormente para os ativadores da transcrição Se uma proteína repressora R se liga a uma região reguladora do gene X e reprime sua transcrição então a fração dos sítios de ligação do gene ocupada pelo repressor é especificada pela mesma equação que usamos anteriormente para o ativador da transcrição Figura 875A Entretanto nesse caso a RNA polimerase só pode se ligar ao promotor e transcrever o gene quando o DNA estiver livre Portanto a quantidade de interesse é a fração não ligada que pode ser vista como a probabilidade de o sítio estar livre média dos eventos de ligação e dissociação Quando a concentração do repressor é zero a fração não ligada é 1 e o promotor está totalmente ativo quando a concentração do repressor excede muito a 1K a fração não ligada se aproxima de zero As Figuras 875B e C comparam essas relações para um ati vador da transcrição e um repressor da transcrição Podemos criar uma equação diferencial que fornece a taxa de alteração na pro teína X quando ocorrem alterações nas concentrações do repressor Equação 87 Figura 875D Assim como no caso do ativador da transcrição a concentração da proteína X em estado estacionário aumenta conforme seu tempo de vida aumenta mas diminui à medida que a concentração do repressor da transcrição aumenta 516 PARTE III Formas de trabalhar com células juntas para descrever o comportamento de A e R em função do tempo para qualquer valor de estímulo Como antes inserimos os valores para os parâmetros bR tR etc e então usamos um computador para determinar os valores de A e R em função do tempo depois que um estímulo repentino ative o gene A O resultado revela propriedades importantes da retroalimentação negativa Pri meiro bastante surpreendente a retroalimentação negativa aumenta a velocidade de resposta aos estímulos ativadores Como mostrado na Figura 876C o sistema com re troalimentação negativa alcança seu novo estado estacionário de forma mais rápida do que o sistema sem retroalimentação Segundo a retroalimentação negativa é útil para proteger as células de perturba ções que surgem continuamente no meio ambiente da célula devido a variações alea tórias no nascimento e morte de moléculas ou a flutuações nas variáveis do meio como temperatura e suprimentos nutricionais Vamos imaginar por exemplo que bA a cons tante de transcrição para o gene A flutue em 25 do seu valor e questionar se e o quanto os níveis da proteína R são afetados Os resultados mostrados na Figura 877 revelam que uma alteração em bA causa uma mudança menor no valor do estado estacionário de R quando a rede tem uma retroalimentação negativa A retroalimentação negativa com retardo pode induzir oscilações Um fenômeno interessante ocorre quando um ciclo de retroalimentação negativa contém algum mecanismo de retardo que atrasa o sinal de retroalimentação do ciclo em vez de gerar um novo estado estacionário como no ciclo de retroalimentação negativa rápida um ciclo com retardo gera pulsos ou oscilações nos níveis de seus componentes Isso pode ser observado por exemplo se o número de componentes em um ciclo de retroalimenta ção negativa aumenta o que leva a atrasos no tempo necessários para que o ciclo de sinais seja completado A Figura 878 compara o comportamento de dois motivos de rede um com retroalimentação negativa de três estágios e outro com cinco estágios Utilizando os mesmos parâmetros cinéticos em cada estágio nos dois ciclos foi observado que surgem oscilações estáveis no ciclo mais longo enquanto no ciclo mais curto os mesmos parâme tros levaram a uma convergência relativamente rápida para um estado estacionário estável As alterações nos parâmetros de um ciclo de retroalimentação negativa com retardo afinidades de ligação taxas de transcrição ou estabilidade de proteína por exemplo podem alterar a amplitude e o período de oscilações fornecendo um mecanismo versátil extraordinário para gerar todos os tipos de oscilações que podem ser usadas para vários propósitos na célula Ainda várias oscilações que ocorrem naturalmente incluindo as os cilações no cálcio descritas no Capítulo 15 e a rede do ciclo celular descrita no Capítulo 17 utilizam a retroalimentação negativa com retardo como base para oscilações biologica mente importantes Entretanto acreditase que nem todas as oscilações observadas nas células tenham uma função As oscilações se tornam inevitáveis em uma via bioquímica multicompetente altamente complexa como a glicólise simplesmente devido ao grande número de ciclos de retroalimentação que parecem ser necessários para sua regulação A ligação ao DNA por um repressor ou um ativador pode ser cooperativa Até agora demos enfoque na ligação de um único regulador da transcrição a um único sítio em um promotor gênico Entretanto vários promotores contêm múltiplos sítios de Figura 877 O efeito de flutuações nas constantes cinéticas em um sistema com retroalimentação negativa com parado a um sem retroalimentação O gráfico à esquerda representa os níveis da proteína R após um súbito estímulo ativador de acordo com o esquema regu lador na Figura 876A e determinado pela solução do conjunto de equações 88 ver Figura 876B Uma perturbação foi indu zida por uma alteração em bA de 4 Mmin linha vermelha para 3 Mmin linha azul O gráfico à direita mostra os resultados quando a retroalimentação negativa foi removida O sistema com retroalimentação negativa desvia menos da sua operação normal quando ocorre a alteração de b do que o sistema sem retroalimentação Observe que como na Figura 876C o sistema com retroalimentação negativa também chega ao seu estado estacionário de forma mais rápida Tempo Tempo Concentração da proteína R Concentração da proteína R COM RETROALIMENTAÇÃO SEM RETROALIMENTAÇÃO CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 517 ligação adjacentes para o mesmo regulador da transcrição e não é incomum para esses reguladores interagirem entre si no DNA para formar dímeros ou oligômeros maiores Essas interações podem resultar em uma forma cooperativa de ligação ao DNA tal como o aumento da afinidade de ligação ao DNA em concentrações mais altas do regulador da transcrição A cooperatividade produz uma resposta transcricional mais acentua da para concentrações crescentes do regulador do que a resposta que pode ser gerada pela ligação de uma proteína monomérica a um único sítio Uma resposta transcricional acentuada desse tipo quando presente em conjunção com a retroalimentação positiva é um importante componente para produzir sistemas com a capacidade de troca entre diferentes estados fenotípicos discretos Para começar a compreender como isso ocorre precisamos modificar nossas equações para incluir a cooperatividade Os eventos de ligação cooperativa podem produzir relações acentuadas em forma de S ou sigmoides entre a concentração da proteína reguladora e a quantidade ligada ao DNA ver Figura 1516 Nesse caso um número chamado de coeficiente de Hill h descreve o grau de cooperatividade e podemos incluir esse coeficiente nas nossas equa ções para calcular a fração ligada do promotor Figura 879A Conforme o coeficiente de Hill aumenta a dependência da ligação na concentração da proteína se torna maior Figura 879B Em princípio o coeficiente de Hill é similar ao número de moléculas que precisam se associar para gerar uma reação Entretanto na prática a cooperatividade raramente é completa e o coeficiente de Hill não chega a esse número Figura 878 Oscilações que surgem a partir da retroalimentação negativa com retardo É menos provável um circui to transcricional com três componentes A B oscilar do que um circuito trans cricional com cinco componentes C D Aqui X azulclaro Y azulescuro e Z marrom representam as proteínas regu ladoras da transcrição Para as simulações em B e D o sistema foi iniciado a partir de condições iniciais aleatórias para X Y e Z As oscilações foram produzidas por um atraso induzido conforme o sinal propaga pelo ciclo V GENE V W GENE W X GENE X Y GENE Y Z GENE Z X GENE X Y GENE Y Z GENE Z C A Tempo Concentração da proteína X Y Z ESTÍMULO ATIVADOR ESTÍMULO ATIVADOR D B Tempo Concentração da proteína Figura 879 Como a ligação cooperati va das proteínas reguladoras da trans crição afeta a fração de promotores ligados A A cooperatividade é incor porada nos nossos modelos matemáticos pela inclusão do coeficiente de Hill h nas equações usadas anteriormente para de terminar a fração ligada de promotor ver Figuras 872E e 875A Quando h é 1 as equações mostradas aqui se tornam idên ticas às equações utilizadas anteriormente e não existe cooperatividade B O painel da esquerda retrata o repressor da trans crição ligado de forma cooperativa Relem bre da Figura 875B que a atividade gênica é proporcional ao ativador ligado painel da esquerda ou ao repressor não ligado painel da direita Observe que a curvatu ra dos gráficos se torna mais acentuada à medida que o coeficiente de Hill aumenta 0 05 05 1 Concentração da proteína A Concentração da proteína R Fração ligada 1KA h1 h2 h6 0 1 Fração não ligada 1KR h1 h3 h2 h3 h6 ATIVADOR REPRESSOR B A Fração ligada 1 KAAh para ativadores ou KAAh para repressores 1 KRRh KRRh 518 PARTE III Formas de trabalhar com células A retroalimentação positiva é importante para respostas tudo ou nada e biestabilidade Agora veremos a retroalimentação positiva e suas importantes consequências Primei ramente e antes de tudo a retroalimentação positiva pode tornar um sistema biestável permitindo que ele persista em dois ou mais estados estacionários alternativos A ideia é simples e pode ser exprimida fazendose uma analogia com uma vela que pode existir em um estado aceso ou em um apagado O estado aceso é mantido por retroalimentação positiva o calor gerado pela queima mantém a chama acesa O estado apagado é manti do pela ausência desse sinal de retroalimentação enquanto nenhum calor suficiente for aplicado a vela permanecerá apagada Para sistemas biológicos como para a vela a biestabilidade tem um importante corolário significa que o sistema tem memória de tal forma que seu estado presente depende de sua história Se iniciarmos com o sistema em um estado inativo e gradual mente aumentarmos a concentração da proteína ativadora chegará a um ponto no qual o autoestímulo se torna autossustentado a chama da vela e o sistema se move rapida mente para um estado ativado Se agora intervirmos para diminuir o nível do ativador chegará um ponto em que a mesma alteração ocorre ao contrário e o sistema se move rapidamente de volta para um estado inativado Mas os pontos de transição entre os es tados ativado e inativado são diferentes e dessa forma o estado atual do sistema depen de da rota que foi tomada no passado um fenômeno chamado histerese Um caso simples de retroalimentação positiva pode ser observado em um sistema regulador no qual a um regulador da transcrição ativa direta ou indiretamente sua pró pria expressão como na Figura 880A A retroalimentação positiva também pode sur gir em um circuito com vários repressores ou ativadores intermediários contanto que o efeito total das interações seja a ativação Figura 880B e C Para ilustrar como a retroalimentação positiva pode gerar estados estáveis vamos dar enfoque em um ciclo de retroalimentação positiva simples contendo dois represso res X e Y onde um inibe a expressão do outro Figura 881A Como vimos no conjun to de equações 88 Figura 876B anteriormente podemos criar equações diferenciais descrevendo a taxa de alteração de X e Y conjunto de equações 89 Figura 881B Ainda podemos modificar essas equações para incluir cooperatividade pela adição dos coeficientes de Hill Como fizemos anteriormente podemos criar equações para calcular as concentrações de X e Y quando o sistema alcança o estado estacionário ie quan do dXdt 0 e dYdt 0 Equações 810 e 811 Figura 881C As Equações 810 e 811 podem ser usadas para realizar um procedimento mate mático intrigante chamado análise de inclinação nula Essas equações definem as re lações entre a concentração de X no estado estacionário Xst e a concentração de Y no estado estacionário Yst que devem ser satisfeitas simultaneamente Podemos inserir valores diferentes para Yst na Equação 810 e calcular o Xst correspondente para um desses valores Podemos fazer um gráfico com Xst em função de Yst Depois podemos repetir o processo variando Xst na Equação 811 para fazer um gráfico do Yst resultan te As intersecções desses dois gráficos determinam o estado estacionário teoricamente possível do sistema Para sistemas nos quais os coeficientes de Hill hX e hY são muito maiores do que 1 as linhas nos dois gráficos se intersectam em três posições Figura 881D Em outros sistemas que possuem o mesmo rearranjo de reguladores porém parâmetros diferentes pode haver somente uma intersecção indicando a presença de apenas um único estado estacionário Por exemplo quando existe uma baixa coopera Figura 880 A retroalimentação po sitiva de um gene sobre si mesmo por meio de uma série de interações conectadas Uma sequência de qualquer comprimento de ativadores e repressores pode ser conectada para produzir um ciclo de retroalimentação positiva enquanto o sinal total for positivo Como o negativo de um negativo é positivo não apenas os circuitos A e B mas também o circuito C criam uma retroalimentação positiva X Y GENE Y GENE X X Y GENE Y GENE X B X GENE X A C ESTÍMULO ATIVADOR ESTÍMULO ATIVADOR ESTÍMULO ATIVADOR 520 PARTE III Formas de trabalhar com células mudar para o estado estacionário alternativo Dessa forma esse sistema pode variar de um estado estacionário estável para outro submetendose o sistema a um estímulo ou a uma perturbação que é grande o suficiente para tornar o outro estado estacionário mais atrativo Em termos mais gerais cada estado estacionário estável possui uma região de atração correspondente que pode ser intuitivamente imaginada como uma série de perturbações de X ou Y nesse exemplo para as quais as trajetórias dinâmicas con vergem de volta ao estado estacionário particular em vez de trocar para o outro estado O conceito de uma região de atração tem implicações interessantes para a transmis são dos estados transcricionais e a taxa de transição entre eles Se a região de atração ao redor de um estado de um estado estacionário for grande por exemplo então a maioria das células na população assumirá esse estado em particular Além disso esse estado provavel mente será transmitido para as célulasfilhas uma vez que perturbações mínimas como aquelas que resultam de uma distribuição assimétrica de moléculas durante a divisão celu lar raramente serão suficientes para induzir a troca de um estado estacionário para outro Deveríamos esperar que o uso da retroalimentação positiva acoplado à cooperatividade muitas vezes esteja associado a sistemas que requerem uma memória celular estável A robustez é uma característica importante das redes biológicas Os sistemas reguladores biológicos frequentemente são expostos a variações frequen tes e às vezes extremas nas condições externas ou nas concentrações ou atividades de componenteschave A capacidade desses sistemas em funcionar normalmente em face a tais perturbações é chamada de robustez Se compreendermos um sistema comple xo de modo que possamos reproduzir seu comportamento com um modelo computa cional então a robustez do sistema pode ser acessada determinando o quão bem suas funções normais persistem após alterações nos vários parâmetros como as constantes e concentrações de componentes Já vimos por exemplo como a presença da retroali mentação negativa reduz a sensibilidade do estado estacionário a alterações nos valores dos parâmetros do sistema ver Figura 877 Considerações sobre a robustez também se aplicam a comportamentos dinâmicos Assim por exemplo quando discutimos a retroalimentação negativa descrevemos como o comportamento de um sistema tende a se tornar mais oscilante na medida em que aumenta o número de componentes que constituem um ciclo de retroalimentação Se usarmos diferentes valores de parâmetros nos modelos derivados para sistemas como aqueles na Figura 878 observaremos que o sistema com ciclos mais longos tende a exibir oscilações estáveis dentro de um espec tro bem mais amplo de parâmetros indicando que esse sistema fornece um oscilador mais robusto Podemos realizar cálculos similares para determinar a capacidade de di ferentes sistemas de alcançar a biestabilidade robusta que surge a partir da retroalimen tação positiva Portanto um dos benefícios dos modelos computacionais é que eles nos permitem testar a robustez de redes biológicas de maneira sistemática e rigorosa Dois reguladores da transcrição que se ligam ao mesmo promotor gênico podem exercer controle combinatório Até agora discutimos como um regulador da transcrição pode modular o nível de ex pressão de um gene Entretanto a maioria dos genes é controlada por mais de um tipo de regulador da transcrição fornecendo um controle combinatório que permite que dois ou mais estímulos influenciem a expressão do gene Podemos usar métodos computacio nais para desvendar algumas das características reguladoras importantes dos sistemas de controle combinatoriais Considere um gene cujo promotor contém sítios de ligação para duas proteínas re guladoras A e R que se ligam a seus sítios individuais de forma independente Existem quatro configurações de possíveis ligações Figura 883A Suponha que A seja um ativador da transcrição R é um repressor da transcrição e o gene é ativado apenas quando A estiver ligado e R não estiver Aprendemos anteriormente que a probabilidade de A estar ligado e a probabilidade de R não estar pode ser determinada pelas equações na Figura 884A O produto dessas duas probabilidades nos dá a probabilidade da ativação gênica Este exemplo ilustra uma função lógica E NÃO A e não R ver Figura 883A A ativação máxima desse gene ocorre quando A é alto e R é zero Entretanto níveis CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 521 intermediários de ativação gênica também são possíveis dependendo do nível de A e R e também das afinidades de ligação de A e R por seus respectivos sítios ie KA e KR Quando KA KR mesmo uma pequena concentração de A é capaz de superar a repres são por R Ao contrário se KA KR então muito mais A é necessário para ativar o gene Figura 884B e C Várias outras funções lógicas podem governar a regulação gênica combinatória Por exemplo uma lógica E controla resultados quando dois ativadores A1 e A2 são necessários para que um gene seja transcrito Figuras 883B e 884D Em células de E coli o gene AraJ controla alguns aspectos do metabolismo do açúcar arabinose sua expressão requer dois reguladores da transcrição um ativado pela arabinose e o outro ativado pela pequena molécula cAMP Figura 884E Uma interação de estimulação intermitente incoerente gera pulsos Imagine que um sinal estimulador súbito ative imediatamente um ativador A da trans crição e que o mesmo sinal estimulador induza a síntese muito mais lenta de um repres sor da transcrição proteína R que atua no mesmo gene X Se A e R controlam a expressão Figura 883 Controle combinatório da expressão gênica Existem várias manei ras pelas quais a expressão gênica pode ser controlada por dois reguladores da transcrição Para definir precisamente a re lação entre os dois estímulos e o resultado da expressão gênica um circuito regulador muitas vezes é descrito como um tipo es pecífico de controlador lógico termo em prestado do desenho de circuitos eletrôni cos Um exemplo simples é o controlador lógico OU não mostrado aqui no qual um gene é controlado por dois ativadores da transcrição e um ou outro pode ativar a expressão gênica A Em um sistema com um ativador A e um repressor R se a transcrição for ativada apenas quando A estiver ligado e R não estiver então o resultado é do tipo E NÃO Vimos um exemplo dessa lógica no Capítulo 7 Figura 715 B Um controlador E resulta quan do dois ativadores da transcrição A1 e A2 são necessários para ativar um gene R R A A INATIVO INATIVO INATIVO GENE ATIVADO R R A A GENE GENE GENE A1 A1 A2 A2 INATIVO INATIVO INATIVO GENE ATIVADO GENE GENE GENE A2 A1 A1 A2 Lógica E Lógica E NÃO A B Figura 884 Como o produto quantita tivo de um gene depende tanto da ló gica combinatória como das afinidades dos reguladores da transcrição A Em um sistema regulador gênico como o ilustrado na Figura 883A as frações dos promotores ligados ao ativador A e não ligados ao repressor R são determinados como mostrado aqui O produto dessas probabilidades fornece a probabilidade PA R de que o promotor gênico esteja ativo BE Nesses quatro painéis vermelho indica uma expressão gênica alta e azul indica uma expressão gênica baixa B e C retratam a expressão gênica do siste ma descrito no painel A Os dois painéis demonstram como o sistema se comporta quando as afinidades relativas dos dois re guladores da transcrição alteram de acordo com o indicado acima de cada painel D A expressão gênica em um caso onde o gene só é ativado na presença de altos níveis de ambos os estímulos ativadores A1 e A2 como mostrado na Figura 883B E Dados experimentais que mos tram a expressão medida de um gene de E coli que é regulado combinatoriamente por dois estímulos arabinose e cAMP Observe a semelhança com o painel D E adaptado a partir de S Kaplan et al Mol Cell 29786792 2008 KA KR KA KR B A D E C 20 6 1 002 13 43 Arabinose mM cAMP mM VALORES EXPERIMENTAIS Concentração de R Concentração de A Concentração de R Concentração de A Concentração de A1 Concentração de A2 Fração de A ligada 1 KAA KAA 1 KAA 1 KAA KRR KAKRAR KAA Fração de R não ligada PAR 1 KRR 1 1 KRR 1 KAA 522 PARTE III Formas de trabalhar com células gênica pela função lógica E NÃO como aquela descrita anteriormente nossa intuição nos diz que este sistema deveria ser capaz de gerar um pulso de transcrição quando A é ativado e R está ausente a transcrição do gene X iniciará e levará a um aumento na concentração da proteína X mas então a transcrição será inativada quando a concen tração de R aumentar até um valor suficientemente alto Arranjos desse tipo são comuns na célula Em E coli por exemplo os genes meta bólicos da galactose são regulados positivamente pela proteína ativadora de catabólitos CAP que é ativada em altos níveis de cAMP Os mesmos genes são reprimidos pela pro teína repressora GalS que é codificada por um gene cuja transcrição provavelmente seja ativada pela CAP Portanto um aumento no estímulo cAMP ativa A CAP e a transcrição dos genes da galactose inicia Mas a ativação de A também causa um acúmulo subsequen te de R GalS que faz os mesmos genes serem reprimidos após um intervalo de tempo Isso resulta em um motivo de estimulação intermitente incoerente Figura 885A A resposta do motivo de estimulação intermitente incoerente varia dependen do dos parâmetros do sistema Suponha por exemplo que a proteína A ativadora da transcrição se ligue de forma mais fraca à região reguladora do gene do que à proteína R repressora da transcrição KA KR Nesse caso haverá uma explosão transiente da pro teína sintetizada pelo gene afetado gene X em reposta a um estímulo ativador súbito Figura 885B Em contraste a resposta será mais sustentável se KA for muito maior do que KR pois a repressão será muito fraca para superar a ativação do gene Figura 885C Outras propriedades dessa rede como a dependência da amplitude do pulso pelas vá rias constantes no sistema podem ser exploradas com as mesmas ferramentas compu tacionais Portanto nossa suposição intuitiva sobre como este sistema se comportaria estava apenas parcialmente correta mesmo o sistema mais simples de redes depende de forças de interação precisas demonstrando novamente por que a matemática é necessá ria para completar a representação dos sistemas Uma interação de estimulação intermitente coerente detecta estímulos persistentes Na bactéria E coli o açúcar arabinose apenas é consumido quando o açúcar de prefe rência glicose estiver escasso A estratégia que as células utilizam para determinar a presença de arabinose e a ausência de glicose envolve um arranjo de estimulação inter mitente que é diferente do recémdescrito Nesse caso a depleção de glicose causa um aumento de cAMP que é percebido pela proteína ativadora da transcrição CAP como descrito anteriormente Entretanto nesse caso CAP também induz a síntese de um se gundo ativador da transcrição AraC Ambas as proteínas ativadoras são necessárias para ativar os genes metabólicos da arabinose a função lógica E na Figura 883B Esse arranjo conhecido como motivo de estimulação intermitente coerente possui as características interessantes ilustradas na Figura 886 Imagine que dois ativadores A1 e A2 são necessários para iniciar a transcrição gênica O estímulo da rede ativa A1 direta mente mas apenas ativa A2 por essa ativação de A1 Portanto para que uma proteína seja sintetizada a partir desse gene são necessários estímulos longos para permitir que tanto A1 como A2 sejam produzidas na forma ativa Pulsos breves de estímulos são ignorados Figura 885 Como um motivo de estimulação intermitente incoerente pode gerar um pulso breve de ativa ção gênica em resposta a um estímulo permanente A Diagrama de um motivo de estimulação intermitente incoerente no qual o ativador A e o repressor R da transcrição controlam a expressão do gene X usando a lógica E NÃO da Figura 883A B Quando KA KR esse motivo gera um pulso de expressão da proteína X de modo que a expressão diminua mesmo que o estímulo permaneça alto C Quan do KA KR o mesmo motivo responde a um estímulo permanente gerando uma expressão contínua A A X R A ESTÍMULO ATIVADOR SÚBITO A Inativo Ativação gênica rápida Repressão gênica lenta A B C GENE X Tempo Proteína A Proteína R Proteína A Proteína R Tempo Produção da proteína X Produção da proteína X Estímulo ativador súbito Estímulo ativador súbito Taxa de síntese proteica Taxa de síntese proteica KA KR KA KR CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 523 ou produzem pequenos resultados A necessidade de um estímulo longo é importante se garantias sobre um sinal são necessárias antes que um programa celular dispendioso seja acionado Por exemplo a glicose é o açúcar com o qual células de E coli crescem melhor Antes das células ativarem o metabolismo da arabinose no exemplo anterior poderia ser benéfico ter certeza que a glicose foi esgotada um pulso CAP sustentado em vez de indu zir o programa da arabinose durante uma flutuação transiente de glicose A mesma rede pode se comportar de formas diferentes em células diferentes devido aos efeitos estocásticos Até este ponto assumimos que todas as células em uma população produzem compor tamentos idênticos se elas contiverem a mesma rede Entretanto é importante levar em conta o fato que as células muitas vezes mostram uma individualidade considerável nas suas respostas Considere uma situação na qual uma única célulamãe se divide em duas células filhas de igual volume Se a célulamãe possui apenas uma molécula de determi nada proteína então apenas uma das filhas a herdará As filhas embora geneticamente idênticas são diferentes Essa variabilidade é mais pronunciada para moléculas que es tão presentes em pequeno número Apesar disso mesmo quando existem várias cópias de uma determinada proteína ou RNA é muito improvável que ambas as célulasfilhas recebam exatamente o mesmo número de moléculas Essa é apenas uma ilustração de uma característica universal das células seus com portamentos muitas vezes são estocásticos significando que elas apresentam variabilida de no seu conteúdo proteico e por isso exibem variações nos fenótipos Além dessa divisão assimétrica das moléculas após a divisão celular a variabilidade pode originar de várias reações químicas Imagine por exemplo que nossa célulamãe contenha um circuito re gulador gênico simples com um ciclo de retroalimentação positiva como aquele mostrado na Figura 880B Mesmo que ambas as célulasfilhas recebam uma cópia desse circuito incluindo uma cópia da proteína ativadora inicial da transcrição existirá variabilidade no tempo necessário para a ligação do promotor e será estatisticamente quase impossível para os genes nas duas célulasfilhas serem ativados precisamente no mesmo momento Se o sistema é biestável e equilibrado próximo ao ponto de troca então a variabilidade na resposta poderá inverter em apenas uma célulafilha Assim duas célulasfilhas que nas ceram idênticas podem adquirir ao acaso uma diferença dramática no fenótipo Em termos mais gerais as populações isogênicas de células crescidas no mesmo meio apresentam diversidade no tamanho forma posição do ciclo celular e expressão gênica Essas diferenças surgem pois reações químicas ocorrem por colisões probabilís ticas entre moléculas que se movimentam aleatoriamente com cada evento resultando em alterações no número total de espécies moleculares disponíveis O efeito amplificado das flutuações em um reagente molecular ou os efeitos compostos das flutuações por vários reagentes moleculares muitas vezes acumula como um fenótipo observável Isso pode dotar uma célula com individualidade e gerar uma variabilidade não genética de célula para célula em uma população A variabilidade não genética pode ser estudada no laboratório por medidas em uma única célula de proteínas fluorescentes expressadas a partir de genes sob controle Figura 886 Como um motivo de estimulação intermitente coerente res ponde a vários estímulos A Diagrama de um motivo de estimulação intermitente coerente no qual os ativadores da trans crição A1 e A2 juntos ativam a expressão do gene X usando a lógica E da Figura 883B B A resposta a um estímulo breve pode ser fraca como mostrado ou não existente Isso permite que o motivo igno re flutuações aleatórias na concentração das moléculas de sinalização C Um estímulo prolongado produz uma resposta forte que pode ser inativada rapidamente X ESTÍMULO ATIVADOR SÚBITO A1 A1 A2 A1 Inativo Ligação rápida de A1 Ligação retardada de A2 A B C GENE X Tempo Tempo Estímulo pulsado Proteína A1 Proteína A1 Proteína A2 Proteína A2 Produção da proteína X Produção da proteína X Estímulo prolongado A1 524 PARTE III Formas de trabalhar com células de um promotor específico As células vivas podem ser dispostas em uma lâmina e ob servadas por um microscópio de fluorescência revelando a variabilidade espetacular nos níveis de expressão proteica Figura 887 Outra abordagem é utilizar citometria de fluxo que funciona passandose uma suspensão diluída de células por um ilumi nador e medindose a fluorescência das células individuais à medida que elas passam pelo detector ver Figura 82 Os valores de fluorescência podem ser representados em histogramas que revelam a variabilidade em um processo através de uma população de células com um histograma amplo indicando uma maior variabilidade Várias abordagens computacionais podem ser usadas para modelar as reações nas células Demos um enfoque principalmente no uso de equações diferenciais comuns para mo delar a dinâmica de circuitos reguladores simples Esses são modelos determinísticos pois não incorporam variabilidade estocástica e sempre produzirão o mesmo resultado a partir de um conjunto específico de parâmetros Como vimos tais modelos podem for necer informações úteis particularmente na análise mecanística detalhada de pequenos circuitos reguladores Entretanto outros tipos de abordagens computacionais também são necessárias para compreender a grande complexidade do comportamento celular Os modelos estocásticos por exemplo tentam explicar os problemas muito importantes da variabilidade aleatória nas redes moleculares Esses modelos não fornecem predições determinísticas sobre o comportamento das moléculas em vez disso eles incorporam variações aleatórias em números e interações de moléculas e o propósito desses mode los é obter um melhor entendimento da probabilidade do sistema existir em um certo estado com o tempo Várias outras estratégias de modelagem têm sido ou estão sendo desenvolvidas As redes booleanas são usadas para análise qualitativa das redes reguladoras gênicas complexas contendo grandes números de componentes que interagem Nesses mode los cada molécula é um nó que pode existir no estado ativo ou inativo afetando dessa forma o estado dos nós ao qual está ligada Os modelos desse tipo fornecem dados sobre o fluxo da informação pela rede e eles foram úteis em nos ajudar a entender a comple xa rede reguladora de genes que controla o desenvolvimento inicial do ouriço do mar ver Figura 743 Portanto as redes booleanas reduzem as redes complexas a uma forma bastante simplificada e potencialmente imprecisa No outro extremo estão simulações baseadas em agentes nas quais milhares de moléculas ou agentes em um sistema são modeladas individualmente e seus prováveis comportamentos e interações entre si com o tempo são calculadas com base nos comportamentos físicos e químicos previstos muitas vezes considerando a variação estocástica As abordagens baseadas em agentes requerem computadores mas tem o potencial de gerar simulações de sistemas biológi cos reais muito semelhantes à vida Métodos estatísticos são cruciais para a análise de dados biológicos A dinâmica as equações diferenciais e a modelagem teórica não são as únicas áreas da matemática úteis à biologia Outras ramificações são igualmente importantes para os biólogos A estatística a matemática dos processos probabilísticos e conjuntos de dados aleatórios é uma parte sem escapatória da vida de cada biólogo Isso é verdadeiro de duas maneiras principais Primeiro equipamentos de medi ção imperfeitos e outros erros geram ruído experimental em seus dados Segundo todos os processos biológicos celulares dependem do comportamento estocástico de molé culas individuais como recém discutimos e isso resulta em ruído biológico nos nossos resultados Como frente a todos estes ruídos chegamos à conclusão sobre a verdade da hipótese A resposta é a análise estatística que mostra como mover de um nível de descrição para outro a partir de um conjunto de pontos de dados de indivíduos erráticos para uma descrição mais simples das característicaschave dos dados A estatística nos ensina que quanto mais vezes repetirmos nossas medições me lhor e mais refinadas serão as conclusões que podemos tirar Dadas várias repetições tornase possível descrever nossos dados em termos de variáveis que resumem as carac Figura 887 Diferentes níveis de ex pressão gênica em células individuais dentro de uma população da bactéria E coli Para esses experimentos duas proteínarepórter diferentes uma fluores cendo em verde a outra em vermelho controladas por uma cópia do mesmo promotor foram introduzidas em todas as bactérias Algumas células expressam apenas uma cópia do gene e dessa forma aparecem ou em vermelho ou em verde enquanto outras expressam ambas as có pias do gene e assim aparecem amarelas O experimento revela níveis variados de fluorescência indicando diversos níveis de expressão gênica dentro de uma popula ção de células aparentemente uniforme A partir de MB Elowitz et al Science 29711831186 2002 Com permissão de AAAS CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 525 terísticas do objeto de estudo o valor médio da variável medida obtido a partir dos pon tos de dados a magnitude do ruído o desviopadrão do conjunto de pontos de dados o erro provável em nossa estimativa de valor médio o erro padrão da média e para especialistas os detalhes da distribuição da probabilidade descrevendo a probabilidade de uma medida individual gerar um determinado valor Para todas essas condições a estatística fornece protocolos e fórmulas quantitativas que os biólogos precisam com preender se quiserem obter conclusões rigorosas com base em resultados variáveis Resumo A análise matemática quantitativa pode fornecer uma dimensão extra poderosa na nos sa compreensão sobre a regulação e função celular Os sistemas reguladores muitas vezes dependem das interações macromoleculares e análises matemáticas da dinâmica dessas interações podem revelar dados importantes sobre a importância das afinidades de liga ção e estabilidade de proteínas na geração de sinais de transcrição ou outros Os sistemas reguladores muitas vezes utilizam motivos de rede que geram comportamentos úteis um ciclo de retroalimentação negativa rápida minimiza a resposta a sinais de estímulo um ciclo de retroalimentação negativa com retardo cria um oscilador bioquímico uma retroalimentação positiva gera um sistema que alterna entre dois estados estáveis e mo tivos de estimulação intermitente estabelecem sistemas que geram pulsos transientes de sinais ou respondem apenas a impulsos persistentes O comportamento dinâmico desses motivos de rede pode ser dissecado em detalhes com modelagem matemática estocástica e determinística o QuE NÃo SABEMoS Muitas das ferramentas que revolu cionaram a tecnologia do DNA foram descobertas por cientistas estudando problemas biológicos básicos que não tinham aplicações óbvias Quais são as melhores estratégias para assegurar que essas tecnologias crucialmente impor tantes continuem a ser descobertas À medida que os custos do sequen ciamento de DNA diminuem e a quantidade de dados de sequências acumulam como vamos continuar a acompanhar e analisar significativa mente essa vasta quantidade de infor mações Quais novas questões essas informações permitirão responder Podemos desenvolver ferramentas para analisar cada uma das modifica ções póstranscricionais nas proteínas em células vivas assim como acompa nhar todas as modificações em tempo real Podemos desenvolver modelos mate máticos para descrever com precisão a enorme complexidade das redes celu lares e predizer componentes e meca nismos não descobertos TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 81 Uma vez que um anticorpo monoclonal reconhece um sítio antigênico específico epítopo ele se liga apenas à proteína específica contra a qual ele foi feito 82 Dado o inexorável progresso da tecnologia parece ine vitável que a sensibilidade de detecção de moléculas irá ul trapassar o nível de yoctomol 10 24 mol 83 Se cada ciclo de PCR dobra a quantidade de DNA sintetizado no ciclo anterior então 10 ciclos gerarão 10 3 ve zes de amplificação 20 ciclos gerarão 10 6 vezes e 30 ciclos 10 9 vezes 84 Para julgar a importância biológica de uma interação entre a proteína A e a proteína B precisamos saber detalhes quantitativos sobre suas concentrações afinidades e com portamentos cinéticos 85 A taxa de alteração na concentração de qualquer es pécie molecular X é dada pelo equilíbrio entre sua taxa de aparecimento e sua taxa de desaparecimento 86 Após um aumento súbito na transcrição uma proteína com uma taxa baixa de degradação alcançará um novo nível de estado estacionário com mais rapidez do que uma pro teína com uma taxa rápida de degradação Discuta as questões a seguir 87 Uma etapa comum no isolamento de células a partir de uma amostra de tecido animal é tratálo com tripsina cola genase e EDTA Por que esse tratamento é necessário e para que serve cada componente Por que esse tratamento não mata as células 88 A tropomiosina com 93 kD sedimenta a 26S enquanto a proteína de 65 kD hemoglobina sedimenta a 43S O coe ficiente de sedimentação S é uma medida linear da taxa de sedimentação Essas duas proteínas estão representadas em escala na Figura Q81 Como a proteína maior sedimenta mais lentamente do que a menor Você pode imaginar alguma ana logia do cotidiano que pode lhe ajudar com esse problema Tropomiosina Hemoglobina Figura Q81 Modelos em escala da tropomiosina e hemoglobina CAPíTulo 8 Analisando células moléculas e sistemas 527 X GENE X GENE Y Y Z GENE Z ESTÍMULO ATIVADOR A X GENE X GENE Y Y Z GENE Z ESTÍMULO ATIVADOR B X GENE X GENE Y Y Z GENE Z ESTÍMULO ATIVADOR C X GENE X GENE Y Y Z GENE Z ESTÍMULO ATIVADOR D Figura Q85 Motivos de rede compostos de ativadores e repressores da transcrição 818 Imagine que uma perturbação aleatória posicione um sistema biestável precisamente no limite entre dois esta dos estacionários no ponto laranja na Figura Q86 Como o sistema responderia Concentração de Y Concentração de X 2 33 1 Figura Q86 Perturbações em um sistema biestável Como mostrado pelas linhas verdes após a perturbação 1 o sistema retorna para seu estado estável original ponto verde à esquerda e após a perturbação 2 o sistema se move para o outro estado estável ponto verde à direita A perturbação 3 move o sistema para a ligação precisa entre os dois estados estáveis ponto laranja 819 Uma análise detalhada da região reguladora do ópe ron Lac revelou uma complexidade surpreendente Em vez de existir um sítio de ligação único para o repressor Lac como poderia ser esperado existem três sítios chamados de operadores O1 O2 e O3 arranjados ao longo do DNA como mostrado na Figura Q87 Para investigar as funções desses três sítios você faz uma série de construtos nos quais vá rias combinações de sítios de operadores estão presentes Você examina sua capacidade de reprimir a expressão de b galactosidase usando formas tetraméricas tipo selvagem ou diméricas mutantes do repressor Lac A forma dimé rica do repressor pode se ligar a um único operador com a mesma afinidade do tetrâmero com cada monômero se ligando a uma metade do operador O tetrâmero a forma normalmente expressa nas células pode se ligar a dois sí tios de forma simultânea Quando você mede a repressão da expressão da bgalactosidase você encontra os resul tados mostrados na Figura Q87 com os números maiores indicando uma repressão mais efetiva A Qual sítio do operador é o mais importante para repres são Como você pode explicar B As combinações dos sítios do operador Figura Q87 construções 1 2 3 e 5 aumentam substancialmente a re pressão pelo repressor dimérico As combinações dos sítios do operador aumentam substancialmente a repressão pelo repressor tetramérico Se os dois repressores se compor tam de maneira diferentes ofereça uma explicação para a diferença C O repressor do tipo selvagem se liga a O3 de forma muito fraca quando este está sozinho sobre um segmento de DNA Entretanto se O1 for incluído no mesmo segmento de DNA o repressor se liga a O3 bastante bem Como isso acontece O3 O1 O2 O3 O1 O1 O2 O1 O3 O2 O3 O2 92 pb 401 pb 2mer 4mer 110 90 80 60 1 1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 8 6700 3900 1400 140 5 2 1 1 Figura Q87 A repressão da bgalactosidase por regiões promotoras que contêm diferentes combinações de sítios de ligação do repressor Lac A se paração de pares de bases pb de três sítios do operador está mostrada Os números à direita se referem ao nível de repressão com números mais altos indicando uma repressão mais efetiva pelos repressores diméricos 2mer ou tetraméricos 4mer A partir de S Oehler et al EMBO J 9973979 1990 Com permissão de John Wiley e Sons 528 PARTE III Formas de trabalhar com células REFERÊNCIAS Gerais Ausubel FM Brent R Kingston RE et al eds 2002 Short Protocols in Molecular Biology 5th ed New York Wiley Brown TA 2007 Genomes 3 New York Garland Science Publishing Spector DL Goldman RD Leinwand LA eds 1998 Cells A Laboratory Manual Cold Spring Harbor NY Cold Spring Harbor Laboratory Press Watson JD Berry A 2008 DNA The Secret of Life New York Alfred A Knopf Watson JD Myers RM Caudy AA 2007 Recombinant DNA Genes and Genomes 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principais métodos em microscopia utilizados para estudar as células A microscopia óptica será nosso ponto de partida pois a biologia celular iniciou com o microscópio óptico e ele continua sendo uma ferramenta indispensável O desenvolvimento de métodos para marcação específica e obtenção de imagem dos constituintes celulares individuais e a reconstrução da sua arquitetura tridimensional significou que longe de cair em desuso a importância da microscopia óptica continua a aumentar Uma vantagem da microsco pia óptica é que a luz é relativamente não destrutiva Pela marcação dos componentes celulares específicos com sondas fluorescentes como proteínas intrinsecamente fluo rescentes podemos observar o movimento a dinâmica e as interações nas células vivas Embora a microscopia óptica convencional seja limitada em resolução pelo comprimen to de onda da luz novos métodos contornam tal limitação de forma inteligente e permi tem que a posição de mesmo uma única molécula seja mapeada Por meio do uso de um feixe de elétrons em vez de luz visível a microscopia eletrônica pode captar imagens do interior das células e de seus componentes macromoleculares em uma resolução quase atômica e em três dimensões Este capítulo foi planejado como uma referência em vez de uma introdução para os capítulos que seguem os leitores podem querer consultálo à medida que encontram aplicações de microscopia para os problemas biológicos básicos nas últimas páginas do livro VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS AO MICROSCÓPIO ÓPTICO Uma célula animal típica tem de 10 a 20 m de diâmetro cerca de um quinto do tama nho do menor objeto que normalmente conseguimos ver a olho nu Somente depois que bons microscópios ópticos tornaramse disponíveis no início do século XIX Schleiden e Schwann propuseram que todos os tecidos vegetais e animais são agregados de células individuais A sua proposta em 1838 conhecida como doutrina celular marca o nasci mento formal da biologia celular As células animais não são apenas minúsculas mas também incolores e trans parentes A descoberta das suas principais características internas então dependeu do desenvolvimento no final do século XIX de uma grande variedade de corantes que fornecessem contraste suficiente para tornar essas características visíveis De modo se melhante a introdução do microscópio eletrônico cada vez mais potente no início da década de 1940 exigiu o desenvolvimento de novas técnicas para preservar e corar célu las antes que a total complexidade da sua delicada estrutura interna pudesse começar a emergir Até hoje a microscopia frequentemente depende tanto das técnicas para prepa rar a amostra como do desempenho do próprio microscópio Portanto nas discussões a seguir consideraremos tanto os instrumentos como a preparação da amostra começan do com o microscópio óptico As imagens na Figura 91 ilustram a progressão em etapas desde um polegar até um grupo de átomos Cada imagem sucessiva representa um aumento de dez vezes na magnitude O olho nu poderia ver características nos dois primeiros painéis o micros cópio óptico nos permite ver detalhes que correspondem ao quarto ou quinto painel e o microscópio eletrônico ao sétimo ou oitavo painel A Figura 92 mostra os tamanhos de várias estruturas celulares e subcelulares e as variações de tamanho que diferentes tipos de microscópios podem visualizar 532 PARTE III Formas de trabalhar com células O limite de separação pelo qual dois objetos ainda podem ser distinguidos o assim chamado limite de resolução depende tanto do comprimento de onda da luz quanto da abertura numérica do sistema de lentes utilizado A abertura numérica afe ta a capacidade de regular a entrada de luz das lentes e está relacionada ao ângulo do cone de luz incidente e ao índice de refração do meio onde as lentes estão funcionando quanto mais o microscópio abrir seus olhos assim dizendo com mais nitidez ele pode ver Figura 96 O índice de refração é a proporção entre a velocidade da luz no vácuo e a velocidade da luz em determinado meio transparente Por exemplo para a água esse índice é de 133 significando que a luz viaja 133 vez mais devagar na água do que no vácuo Nas melhores condições com luz violeta comprimento de onda 04 m e uma abertura numérica de 14 o microscópio óptico básico pode alcançar teoricamente um limite de resolução de cerca de 02 m ou 200 nm Essa resolução foi alcançada por al guns fabricantes de microscópios no final do século XIX e é rotineiramente equiparada nas indústrias contemporâneas de microscópios Embora seja possível aumentar uma imagem o quanto quisermos por exemplo por sua projeção em uma tela não é pos sível em um microscópio óptico convencional distinguir entre dois objetos que estejam separados por menos de 02 m eles aparecerão como um único objeto Entretanto é importante distinguir entre resolução e detecção Se um pequeno objeto abaixo do limi te de resolução emite luz própria então ainda seremos capazes de vêlo ou detectálo Desse modo podemos visualizar um único microtúbulo marcado fluorescentemente mesmo que ele seja cerca de dez vezes mais fino do que o limite de resolução do micros cópio óptico Contudo efeitos de difração farão ele aparecer borrado e com no mínimo 02 m de espessura ver Figura 916 Da mesma forma podemos ver estrelas à noi te mesmo que seus diâmetros sejam bem mais abaixo da resolução angular de nossos olhos nus todas parecem similares pontos de luz levemente borrados diferindo apenas em sua cor e brilho O ruído fotônico cria limites adicionais para resolução quando os níveis de luz são baixos Qualquer imagem tanto produzida por um microscópio eletrônico quanto por um mi croscópio óptico é composta de partículas elétrons ou fótons que atingem um de tector de qualquer tipo Mas essas partículas são controladas por mecânica quântica de maneira que as quantidades que alcançam o detector são previstas apenas em um sentido estatístico Amostras finitas coletadas pela obtenção de imagens por um limita do período de tempo ie fotografias instantâneas mostrarão variações aleatórias fo tografias instantâneas sucessivas da mesma cena não serão exatamente idênticas Além disso cada método de detecção possui um nível de sinal ou ruído de fundo adicionando à incerteza estatística Com uma iluminação brilhante correspondendo a números mui to grandes de fótons ou elétrons as características da amostra na imagem são determi nadas com acuidade com base na distribuição dessas partículas no detector Entretanto com números menores de partículas os detalhes estruturais da amostra são ocultados pelas flutuações estatísticas nos números de partículas detectadas em cada região o que Figura 94 Interferência entre ondas de luz Quando duas ondas de luz se combinam em fase a amplitude da onda resultante é maior e a luminosidade é aumentada Duas ondas de luz que estão fora de fase anulamse parcialmente e produzem uma onda cuja amplitude e portanto luminosidade é reduzida DUAS ONDAS EM FASE DUAS ONDAS FORA DE FASE CLARO ESCURO A B Figura 95 Efeitos de uma borda e de um ponto de luz A Os efeitos de interferência ou bandas claras e escuras observados em grande aumento quando a luz de um determinado comprimento de onda passa pela borda de um objeto sóli do colocado entre a fonte de luz e o ob servador B A imagem de um ponto fonte de luz A difração se espalha na forma de um complexopadrão circular cuja largura depende da abertura numérica do sistema óptico quanto menor a abertura maior mais borrada é a imagem difratada Dois pontos podem ser resolvidos quando o centro da imagem de um deles estiver localizado no primeiro anel escuro na ima gem do outro isso é usado para definir o limite da resolução 534 PARTE III Formas de trabalhar com células como a mitose e a migração celular Uma vez que vários movimentos celulares são mui to lentos para serem visualizados em tempo real muitas vezes é útil realizar filmes em lapso de tempo nos quais a câmera registra imagens sucessivas separadas por um curto intervalo de tempo de modo que quando uma série dos registros resultantes é mostrada em uma velocidade normal os eventos aparecem bastante acelerados As imagens podem ser intensificadas e analisadas por técnicas digitais Recentemente os sistemas eletrônicos ou digitais de imagem e a tecnologia de pro cessamento de imagens associada tiveram um maior impacto na microscopia óptica Algumas limitações práticas dos microscópios relacionadas a imperfeições do sistema óptico foram em grande parte superadas Os sistemas de imagem eletrônica também contornaram duas limitações fundamentais do olho humano o olho não pode ver bem com luminosidade muito diminuída e não pode perceber pequenas diferenças de intensidade de luz contra um fundo luminoso Para aumentar nossa capacidade de observar células nessas condições difíceis podemos acoplar uma câmera digital sen sível a um microscópio Essas câmeras detectam luz por meio de dispositivos de carga acoplada CCDs ou de sensores de óxido metálico semicondutores complementares de alta sensibilidade CMOS similares àqueles encontrados em câmeras digitais Tais sensores de imagem são dez vezes mais sensíveis do que o olho humano e podem de tectar 100 vezes mais níveis de intensidade Então é possível observar as células por longos períodos a níveis muito baixos de luminosidade evitando assim os efeitos danosos da luz intensa prolongada e do calor Tais câmeras de luz baixa são espe cialmente importantes para visualizar moléculas fluorescentes nas células vivas como explicado a seguir Como as imagens produzidas pelas câmeras digitais estão na forma eletrônica elas podem ser processadas de várias maneiras para extrair a informação latente Tal processamento de imagem torna possível compensar vários defeitos de óptica dos mi croscópios Além disso por meio do processamento digital da imagem o contraste pode ser bastante aumentado para contornar as limitações do olho na detecção de pequenas Luz incidente branca Luz incidente branca A C Luz incidente oblíqua B Corte corado da célula Célula não corada Ondas fora de fase geram contraste quando combinadas Ondas em fase Apenas os raios de luz espalhados entram na objetiva Figura 97 Contraste na microscopia óptica A A parte corada da célula absorverá luz de alguns comprimentos de onda que dependem do corante mas permitirá que outros comprimentos de onda passem por ela Assim uma imagem colorida da célula é obtida sendo visível no microscópio óptico normal de campo claro B No microscópio de campo escuro raios oblíquos de luz focados sobre a amostra não entram na lente objetiva mas a luz que é espalhada por componentes na célula viva pode ser reunida para produzir uma imagem brilhante sobre um fundo escuro C A luz que passa através da célula viva não corada sofre poucas modificações na amplitude e os detalhes estruturais não podem ser vistos mesmo que a imagem seja muito aumentada Entretanto a fase da luz é alterada por sua passagem através das partes mais espessas ou mais densas da célula e pequenas diferenças de fase podem se tornar visíveis explorandose os efeitos de interferência com o uso de um microscópio de contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial CAPÍTULO 9 Visualização de células 537 permite apenas a passagem de comprimentos de onda que excitem um determinado corante fluorescente enquanto o segundo filtro bloqueia a passagem dessa luz permi tindo somente a passagem daqueles comprimentos de onda emitidos quando o corante fluoresce Figura 912B A microscopia de fluorescência é mais utilizada para detectar proteínas específi cas ou outras moléculas em células e tecidos Uma técnica muito eficaz e bastante usa da é acoplar corantes fluorescentes a moléculas de anticorpos que então servem como reagentes para coloração altamente específicos e versáteis que se ligam de forma seletiva a determinadas macromoléculas as quais eles reconhecem nas células ou na matriz ex tracelular Dois corantes fluorescentes que têm sido comumente usados para esse pro pósito são a fluoresceína que emite uma fluorescência verde intensa quando excitada com luz azul e a rodamina que emite uma fluorescência vermelha quando excitada com luz amareloesverdeada Figura 913 Acoplandose um anticorpo à fluoresceína e outro à rodamina as distribuições de diferentes moléculas podem ser comparadas em uma mesma célula as duas moléculas são visualizadas separadamente ao microscópio alterandose os dois conjuntos de filtros cada um específico para cada corante Como mostrado na Figura 914 três corantes fluorescentes podem ser usados da mesma ma neira para distinguir três tipos de moléculas na mesma célula Muitos corantes fluores centes mais novos como Cy3 Cy5 e Alexa foram desenvolvidos especificamente para microscopia de fluorescência ver Figura 913 mas como muitos fluorocromos orgâ ESTADO BASAL Ocular Lente objetiva Objeto 2 Espelho separador de raios reflete luz abaixo de 510 nm mas transmite luz acima de 510 nm 3 Segundo filtro de barreira elimina sinais fluorescentes indesejáveis passando a emissão verde específica da fluoresceína entre 520 e 560 nm 1 Primeiro filtro de barreira deixa passar apenas luz azul com um comprimento de onda entre 450 e 490 nm 1 3 2 FONTE DE LUZ Absorção do fóton Emissão do fóton a um comprimento de onda mais longo ESTADO EXCITADO Energia do elétron orbital no fluoróforo A B Figura 912 Fluorescência e microscópio de fluorescência A Um elétron orbital de uma molécula de fluorocromo pode ser levado a um estado exci tado depois da absorção de um fóton A fluorescência ocorre quando o elétron retorna ao seu estado basal e emite um fóton de luz a um comprimento de onda mais longo Muita exposição à luz ou muito brilho também podem destruir uma molécula de fluorocromo em um processo chamado fotoclareamen to B No microscópio de fluorescência um conjunto de filtros consiste em dois filtros de barreira 1 e 3 e um espelho dicroico separador de raios 2 Este exemplo mostra o conjunto de filtros para a detecção da molécula fluorescente fluoresceína Lentes objetivas com alta abertura numérica são especialmente importantes nesse tipo de microscopia pois em uma dada magnitude a luminosidade da imagem fluorescente é proporcional à quarta potência da abertura numérica ver também Figura 96 Figura 913 Sondas fluorescentes Os comprimentos de onda máximos de excitação e emissão de várias sondas fluorescentes normalmente utilizadas estão mostrados em rela ção às cores correspondentes do espectro O fóton emitido por uma molécula fluorescente é necessariamente de menor energia comprimento de onda mais longo do que o fóton absorvido e isso explica a diferença entre os picos de excitação e emissão CFP GFP YFP e RFP são proteínas fluorescentes azul verde amarela e vermelha respectivamente O DAPI é bastante usado como uma sonda de DNA fluorescente geral que absorve luz ultraviole ta e fluoresce azulbrilhante FITC é uma abreviação para isotiocianato de fluoresceína um derivado amplamente utilizado da fluoresceína que fluoresce verdebrilhante As outras sondas em geral são todas usadas para marcar fluorescentemente anticorpos e outras proteínas O uso de proteínas fluorescentes será discutido mais adiante neste capítulo DAPI GFP CFP FITC Cy3 YFP Rodamina B RFP Alexa 568 Cy5 EMISSÃO EXCITAÇÃO 420 nm 460 nm 500 nm 540 nm 580 nm 620 nm 660 nm 542 PARTE III Formas de trabalhar com células O microscópio confocal tem sido utilizado para resolver a estrutura de inúmeros objetos tridimensionais complexos Figura 920C incluindo as redes de fibras citoes queléticas no citoplasma e os arranjos de cromossomos e de genes no núcleo Os méritos relativos dos métodos de deconvolução e da microscopia confocal para a microscopia óptica tridimensional dependem da amostra da qual está sendo obtida a ima gem Os microscópios confocais tendem a ser melhores para amostras mais espessas com níveis altos de luz fora de foco Eles também costumam ser mais fáceis de usar do que os sis temas de deconvolução e as secções ópticas finais podem ser vistas rapidamente Por outro lado as câmeras CCD resfriadas ou CMOS utilizadas para sistemas de deconvolução são extremamente eficientes em coletar pequenas quantidades de luz podendo ser usadas para gerar imagens tridimensionais detalhadas de amostras que são coradas muito fracamente ou que são muito fáceis de danificar pela luz brilhante usada na microscopia confocal Entretanto ambos os métodos têm outra desvantagem nenhum deles é bom para lidar com amostras muito espessas Os métodos de deconvolução tornamse rapidamen te ineficazes a uma profundidade de cerca de 40 m em uma amostra ao passo que os microscópios confocais podem obter imagens somente até uma profundidade de cerca de 150 m Microscópios especiais podem agora obter vantagem da maneira pela qual as moléculas fluorescentes são excitadas a fim de obterem maiores detalhes em uma amos tra As moléculas fluorescentes normalmente são excitadas por um único fóton de alta energia de comprimento de onda mais curto do que o da luz emitida mas podem além disso ser excitadas pela absorção de dois ou mais fótons de energia mais baixa con tanto que ambos cheguem com uma diferença máxima de um fentossegundo entre eles O uso dessa excitação de comprimento de onda mais longo tem algumas vantagens im portantes Além de reduzir o ruído de fundo a luz vermelha ou próxima ao infravermelho pode penetrar mais profundamente na amostra Microscópios multifótons construídos para tirar vantagem desse efeito dois fótons podem obter imagens nítidas às vezes mes mo a uma profundidade de 250 m em uma amostra Isso é particularmente interessante para estudos de células vivas sobretudo na obtenção de imagens da atividade dinâmica de sinapses e neurônios logo abaixo da superfície de cérebros vivos Figura 921 Proteínas individuais podem ser marcadas fluorescentemente nas células e nos organismos vivos Até mesmo as estruturas celulares mais estáveis devem ser formadas dissociadas e re organizadas durante o ciclo de vida celular Outras estruturas muitas vezes enormes na escala molecular alteramse movemse e se reorganizam à medida que a célula conduz seus processos internos e responde ao seu ambiente Estruturas complexas e muito or ganizadas de uma maquinaria molecular movem os componentes em torno da célula controlando o tráfego para dentro e para fora do núcleo de uma organela para outra e para dentro e para fora da própria célula Várias técnicas foram desenvolvidas para visualizar os componentes específicos envolvidos em tal fenômeno dinâmico Muitos desses métodos usam proteínas fluores centes e requerem um acerto entre preservação estrutural e marcação eficiente Todas as moléculas fluorescentes discutidas até agora são produzidas fora das células e então introduzidas artificialmente nelas Mas o uso de genes que codificam moléculas protei Figura 921 Obtenção de imagem por multifótons A luz infravermelha a laser causa menos danos às célu las vivas do que a luz visível e pode penetrar mais profundamente permitindo aos microscopistas obterem ima gens mais detalhadas dos tecidos vivos O efeito de dois fótons em que um fluorocromo pode ser excitado por dois fótons infravermelhos coincidentes em vez de um único fóton de alta energia permitenos obter imagens a 05 mm de profundidade do córtex de um cérebro de camundongo vivo Um corante cuja fluorescência muda com a concentração de cálcio revela sinapses ativas amarelo nas espinhas dendríticas vermelho que mudam em função do tempo neste caso há uma diferença de um dia entre cada imagem Cortesia de Thomas Oertner e Karel Svoboda CAPÍTULO 9 Visualização de células 543 cas que são fluorescentes de maneira inerente também permite a criação de organismos e linhagens celulares que produzem suas próprias marcas visíveis sem a introdução de moléculas estranhas Essas exibicionistas celulares expõem seus trabalhos internos em cor fluorescente brilhante Muito importante entre as proteínas fluorescentes utilizadas por biólogos celulares para esses propósitos é a proteína verde fluorescente GFP green fluorescent protein isolada da águaviva Aequorea victoria Essa proteína é codificada por um único gene que pode ser clonado e introduzido em células de outras espécies A proteína recém traduzida não é fluorescente mas dentro de mais ou menos 1 hora menos para alguns alelos do gene mais para outros ela sofre uma modificação póstraducional autocata lisada para gerar um fluorocromo eficiente protegido dentro de uma proteína em forma de barril que agora fluoresce quando iluminada de maneira apropriada com luz azul Figura 922 A mutagênese sítiodirecionada extensiva realizada na sequência gênica original resultou em variantes múltiplas que podem ser usadas de forma eficaz em or ganismos desde animais e plantas até fungos e micróbios A eficiência de fluorescência também foi melhorada e variantes foram geradas com um espectro de absorção e emis são alterado do azulverde como a proteína azul fluorescente BFP até o vermelho Descobriuse p ex em corais que outras proteínas fluorescentes relacionadas também estendem sua faixa de emissão até a região vermelha do espectro como a proteína ver melha fluorescente RFP Um dos usos mais simples da GFP é como molécularepórter uma sonda fluores cente para monitorar a expressão gênica Um organismo transgênico pode ser obtido com uma sequência codificadora para GFP colocada sob o controle transcricional do promotor pertencente a um gene de interesse mostrando visivelmente o padrão de ex pressão do gene no organismo vivo Figura 923 Em outra aplicação um sinal de loca lização do peptídeo pode ser adicionado à GFP para direcionála a um compartimento celular específico como o retículo endoplasmático ou a mitocôndria iluminando essas organelas de maneira que elas possam ser observadas enquanto vivas ver Figura 1231 A sequência de DNA codificadora para GFP também pode ser inserida no início ou no final de um gene para outra proteína gerando um produto quimérico que consiste naquele da proteína com o domínio da GFP ligado Em vários casos essa proteína fusio nada com GFP se comporta da mesma maneira que a proteína original revelando dire tamente sua localização e suas atividades por meio da sua fluorescência codificada ge neticamente Figura 924 Com frequência é possível provar que a proteína fusionada à GFP é funcionalmente equivalente à proteína não fusionada utilizandoa por exemplo para resgatar um mutante deficiente da proteína A marcação com GFP é a maneira mais clara e mais inequívoca de mostrar a distribuição e a dinâmica de uma proteína em um organismo vivo Figura 925 e ver Animação 168 A dinâmica das proteínas pode ser acompanhada em células vivas As proteínas fluorescentes estão sendo exploradas não apenas para determinar o local em uma célula onde uma proteína específica está localizada mas também para observar suas propriedades cinéticas e se ela interage com outras moléculas Descreveremos três técnicas nas quais as proteínas fluorescentes são utilizadas dessa maneira Primeiro as interações entre uma proteína e outra podem ser monitoradas pela transferência de energia por ressonância de fluorescência também chamada de transferência de energia por ressonância de Förster ambas abreviadas FRET Nes sa técnica duas moléculas de interesse são marcadas cada uma com um fluorocromo diferente escolhido de modo que o espectro de emissão de um fluorocromo o doador N C Figura 922 Proteína verde fluorescen te GFP A estrutura da GFP mostrada aqui esquematicamente destaca as 11 fitas b que formam as aduelas de um barril No centro do barril está o cromóforo verdeescuro formado após a tradução a partir das cadeias laterais protuberantes de três resíduos de aminoácidos De M Ormö et al Science 2731392 1395 1996 Com permissão de AAAS Figura 923 A proteína verde fluorescente GFP usada como repórter Para este experimento realizado na moscadasfrutas o gene para GFP foi ligado utilizandose técnicas de DNA recombinante a um promotor de mosca que é ativo apenas em um grupo especializado de neurônios Esta imagem de um embrião de mosca vivo foi obtida por um microscópio de fluorescência e mostra aproximadamente 20 neurônios cada um com longas projeções axônios e dendritos que se comunicam com outras células não fluorescentes Esses neurônios estão localizados logo abaixo da superfície do animal e permitem que ele perceba o ambiente adjacente De WB Grueber et al Curr Biol 13618626 2003 Com permissão de Elsevier CAPÍTULO 9 Visualização de células 549 imagem para medir características de escala molecular em uma superfície Quando utilizada para isso a sonda é varrida sobre a superfície movendose para cima e para baixo o quanto for necessário para manter uma força de interação constante com a su perfície revelando assimquaisquer objetos como proteínas ou outras moléculas que possam estar presentes na superfície que seria de outra forma plana Figura 933B e C No entanto a AFM não se restringe a simplesmente obter imagens da superfície ela também pode ser usada para captar e mover moléculas individuais que se ligam à sonda com alta afinidade Usandose essa tecnologia as propriedades mecânicas de moléculas proteicas individuais podem ser medidas com detalhes Por exemplo a AFM tem sido usada para desnaturar uma molécula proteica individual com o objetivo de medir a energia do enovelamento do domínio Figura 933D Técnicas de fluorescência de superresolução podem ultrapassar a resolução limitada por difração As variações na microscopia óptica que descrevemos até agora estão todas condicio nadas aos limites da resolução da difração clássica descrita antes isto é para cerca de 200 nm ver Figura 96 Ainda várias estruturas celulares desde os poros nucleares até os nucleossomos e fossas cobertas por clatrina são muito menores do que esse limite e portanto não podem ser visualizadas pela microscopia óptica convencional Entretanto algumas abordagens hoje disponíveis ultrapassam o limite imposto pela difração da luz B C 100 nm 1000 800 600 400 200 0 0 100 200 300 Extensão nm Laser Fotodiodo detector Detector e eletrônicos de retroalimentação Braço cantilever flexível Ponta do aparelho AFM esticando uma molécula ligada a um substrato p ex mica A D 28 nm Força pN Figura 933 Moléculas individuais podem ser visualizadas e manipuladas por microscopia de força atômica A Diagrama esquemático dos componenteschave de um microscópio de força atômica AFM mostrando a sonda sensor ligada a uma extremidade de uma molécula proteica individual como no experimento descrito em D B e C Um AFM no modo de imagem criou estas imagens de uma molécula de DNA heteroduplex individual com um dímero da proteína MutS regiões brancas maiores ligada próximo ao centro no local do par de base inserido incorretamente MutS é a primeira proteína que se liga a DNA quando o processo de reparo do par errado é iniciado ver Figura 519 Os pontos brancos menores são moléculas individuais de estreptavidina utilizadas para marcar as duas extremidades de cada molécula D Titina é uma grande molécula proteica que supre o músculo com sua elasticidade passiva ver Figura 1634 A extensibilidade dessa proteína pode ser testada diretamente usandose uma proteína curta produzida artificialmente que contém oito domínios de imunoglobulinas Ig repetidos de uma região da proteína titina Neste expe rimento a ponta da AFM é usada para pinçar e esticar progressivamente uma única molécula até que ela por fim se rompa Quando uma força é aplicada cada domínio Ig repentinamente começa a se desnaturar e a força necessária em cada caso cerca de 200 pN pode ser obtida A região da curva de forçaextensão mostrada em verde capta o evento de desenovelamento sequencial para cada um dos oito domínios da proteína B e C de Y Jiang e PE Marszalek EMBO J 3028812893 2011 Reimpresso com permissão de John Wiley Sons D adaptado de WA Linke et al J Struct Biol 137194205 2002 Com permissão de Elsevier CAPÍTULO 9 Visualização de células 551 Para conseguir superar o limite da difração as duas outras técnicas de superre solução exploram aspectos da função de espalhamento de um ponto uma propriedade do sistema óptico mencionado antes A função de espalhamento de um ponto é a distri buição da intensidade da luz dentro da imagem tridimensional borrada que é formada quando um único ponto de fonte de luz é focado com uma lente Em vez de ser idêntica à fonte de luz a imagem tem uma distribuição de intensidade que é descrita aproxima damente por uma distribuição de Gauss que por sua vez determina a resolução do sis tema de lentes Figura 936 Dois pontos que estão mais próximos do que a largura na metade da altura máxima desta distribuição serão difíceis de serem resolvidos pois suas imagens se sobrepõem muito ver Figura 936C Na microscopia de fluorescência a luz de excitação é focada em um ponto da amostra pela lente objetiva que então captura os fótons emitidos por qualquer mo lécula fluorescente que o feixe originou a partir de um estado basal para um estado excitado Como o ponto de excitação está disperso de acordo com a função de espa lhamento de um ponto as moléculas fluorescentes que estão mais próximas do que cerca de 200 nm terão sua imagem como um único ponto borrado Uma abordagem para aumentar a resolução é trocar todas as moléculas fluorescentes na periferia do ponto de excitação disperso de volta para seu estado basal ou para um estado onde eles não fluorescem mais de maneira normal deixando apenas aqueles mais centrais para serem registrados Isso pode ser feito na prática por meio da adição de um segun do feixe de laser muito brilhante que envolve o feixe de excitação O comprimento de onda e a intensidade desse segundo feixe são ajustados para que as moléculas fluores centes sejam desligadas em toda parte exceto na região central da função de espalha mento de um ponto uma região que pode ser tão pequena como 20 nm de diâmetro Figura 937 As sondas fluorescentes utilizadas devem estar em uma classe especial que é fotocomutável sua emissão pode ser ligada ou desligada reversivelmente com luzes de diferentes comprimentos de onda Como a amostra é varrida com esse arranjo de laser moléculas fluorescentes são ligadas e desligadas e a pequena função de espa lhamento de um ponto em cada localização é registrada O limite de difração é rompi do pois a técnica assegura que moléculas similares porém muito próximas estão em um dos dois estados diferentes o fluorescente ou o escuro Tal abordagem é chamada de microscopia de depleção de emissão estimulada STED stimulated emission deple tion microscopy e vários microscópios usando versões do método geral estão agora sendo bastante empregados Resoluções de 20 nm foram obtidas em amostras biológi cas e resoluções ainda maiores foram conseguidas com amostras não biológicas ver Figura 937 A superresolução também pode ser obtida usando métodos de localização de moléculas individuais Se obtivermos a imagem de uma molécula fluorescente individual a imagem aparecerá como um disco circular borrado mas se fótons suficientes contribuírem para tal ima gem o centro matemático preciso da imagem similar a um disco poderá ser determina do com bastante acuidade muitas vezes em poucos nanômetros Mas o problema com uma amostra que contém um grande número de moléculas fluorescentes adjacentes Figura 936 A função de espalhamen to de um ponto de uma lente deter mina a resolução A Quando um ponto fonte de luz é focado por um sistema de lentes os efeitos da difração significam que em vez de se obter uma imagem de um ponto a luz é espalhada em todas as dimensões B No plano da imagem a dis tribuição da luz aproximase à distribuição de Gauss cuja largura na metade do máxi mo da altura sob condições ideais é cerca de 200 nm C Dois pontos fonte que estão separados por cerca de 200 nm ain da podem ser distinguidos como objetos separados na imagem mas se estiverem um pouco mais próximos do que isso suas imagens irão se sobrepor e não poderão ser resolvidas 200 nm 200 nm 200 nm z y y x x x x Intensidade Intensidade Ponto original de luz Lente Imagem do ponto original limitada por difração A B C 554 PARTE III Formas de trabalhar com células localizar moléculas específicas nas células em um microscópio de fluorescência As células vivas podem ser vistas em microscópios de contraste de fase de contraste de interferência diferencial de campo escuro ou de campo claro Todas as formas de microscopia óptica são facilitadas pelas técnicas de processamento eletrônico de imagem que aumentam a sensibilidade e aperfeiçoam a imagem Tanto a microscopia confocal como a deconvo lução de imagem fornecem secções ópticas finas e podem ser utilizadas para reconstruir imagens tridimensionais Atualmente existem técnicas disponíveis para detectar medir e monitorar quase qualquer molécula em uma célula viva Os corantes indicadores fluorescentes podem ser introduzidos para medir as concentrações de íons específicos em células individuais ou em partes diferentes de uma célula Praticamente qualquer proteína de interesse pode ser modificada por engenharia genética na forma de uma proteína de fusão fluorescente e então sua imagem pode ser captada em células vivas por microscopia de fluorescência O comportamento dinâmico e as interações de várias moléculas podem ser acompanha dos em células vivas por variações no uso de proteínasalvo fluorescentes em alguns casos ao nível de moléculas individuais Várias técnicas de superresolução podem ultrapassar o limite de difração e permitem a visualização de moléculas individuais separadas por distâncias de apenas 20 nm VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS E MOLÉCULAS AO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO A microscopia óptica é limitada na fineza dos detalhes que ela pode revelar Microscó pios que utilizam outros tipos de radiação em particular microscópios eletrônicos podem resolver estruturas muito menores do que as possíveis com luz visível Essa re solução mais alta tem um custo a preparação da amostra para microscopia eletrônica é mais complexa e é mais difícil de se ter certeza de que a imagem visualizada correspon de precisamente à estrutura viva original Entretanto é possível usar um congelamento muito rápido para preservar fielmente estruturas para microscopia eletrônica A análise da imagem digital pode ser empregada para reconstruir objetos tridimensionais pela combinação de informações de várias partículas individuais ou a partir de múltiplas imagens de um único objeto Juntas essas abordagens estendem a resolução e a área da microscopia eletrônica até o ponto no qual podemos obter imagens fiéis das estruturas de macromoléculas individuais e dos complexos que elas formam O microscópio eletrônico resolve os detalhes estruturais da célula A relação formal entre o limite de difração para a resolução e o comprimento de onda da radiação de iluminação ver Figura 96 se mantém verdadeira para qualquer forma de radiação independentemente de ser um feixe de luz ou um feixe de elétrons Com elétrons no entanto o limite de resolução é muito pequeno O comprimento de onda de um elétron diminui com o aumento da sua velocidade Em um microscópio eletrô nico com uma voltagem de aceleração de 100000 V o comprimento de onda de um elé tron é de 0004 nm Teoricamente a resolução de um microscópio desses deveria ser de cerca de 0002 nm 100 mil vezes maior do que a do microscópio óptico Entretanto como as distorções de uma lente de elétrons são consideravelmente mais difíceis de corrigir do que aquelas de vidro o poder de resolução prático dos microscópios eletrônicos moder nos é de cerca de 005 nm 05 Å Figura 940 mesmo com processamentos de imagem cuidadosos para corrigir as distorções das lentes Isso acontece porque apenas o centro das lentes de elétrons pode ser utilizado e a abertura numérica efetiva é minúscula Ade mais os problemas na preparação de amostra no contraste e nos danos causados pela ra diação em geral têm limitado a resolução efetiva normal para materiais biológicos para 1 nm 10 Å Contudo esse valor é cerca de 200 vezes melhor do que a resolução do micros cópio óptico Além disso o desempenho dos microscópios eletrônicos foi melhorado pe las fontes de iluminação por elétrons chamadas de canhões de emissão de campo Essas fontes muito brilhantes e confiáveis melhoram substancialmente a resolução alcançada No princípio global o microscópio eletrônico de transmissão TEM transmission electron microscope é semelhante a um microscópio óptico embora seja muito maior 014 nm Figura 940 A resolução do microscópio eletrônico Esta micrografia eletrônica de transmissão de uma monocamada de grafeno resolve os átomos de carbono individuais como pontos brilhantes em uma trama hexagonal O grafeno é um plano atômico único isolado do grafite e forma a base dos nanotubos de carbono A distância entre os átomos de car bono adjacentes ligados é 014 nm 14 Å Tal resolução apenas pode ser obtida em um mi croscópio eletrônico de transmissão construído especialmente no qual todas as distorções das lentes são cuidadosamente corrigidas e com amostras otimizadas elas não podem ser obtidas com a maioria das amostras biológicas convencionais De A Dato et al Chem Com mun 4060956097 2009 Com permissão de The Royal Society of Chemistry CAPÍTULO 9 Visualização de células 555 e invertido Figura 941 A fonte de iluminação é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de cerca de 2 m de altura Como os elétrons são espalhados por colisões com moléculas de ar o ar precisa primeiro ser bombeado para fora da coluna para criar vácuo Os elétrons são então acelerados a partir do fila mento por um ânodo próximo e atravessam um pequeno orifício para formar um feixe de elétrons que desce pela coluna Bobinas magnéticas colocadas em intervalos ao lon go da coluna convergem o feixe de elétrons assim como as lentes de vidro convergem a luz no microscópio óptico A amostra é colocada no vácuo por meio de uma câmara de compressão na trajetória do feixe de elétrons Como na microscopia óptica a amostra em geral é corada neste caso com material eletrodenso Alguns dos elétrons que atra vessam a amostra são espalhados pelas estruturas coradas com material eletrodenso o restante é focado para formar uma imagem de maneira análoga ao processo de formação de uma imagem no microscópio óptico A imagem pode ser observada em uma tela fos forescente ou gravada com uma câmera digital de alta resolução Como os elétrons dis persos são desviados do feixe as regiões densas da amostra são destacadas como áreas de fluxo reduzido de elétrons que parecem escuras Amostras biológicas exigem preparação especial para microscopia eletrônica No início de sua aplicação a materiais biológicos o microscópio eletrônico revelou mui tas estruturas nunca antes imaginadas nas células Mas antes que tais descobertas pu dessem ser feitas os microscopistas eletrônicos tiveram que desenvolver novos proces sos para fixar cortar e corar os tecidos Como a amostra é exposta a alto vácuo no microscópio eletrônico o tecido vivo normalmente é morto e preservado pela fixação inicialmente com glutaraldeído que faz as moléculas de proteína formarem ligações covalentes cruzadas com molé culas adjacentes e depois com tetróxido de ósmio que se liga e estabiliza as bicama das lipídicas assim como as proteínas Figura 942 Como os elétrons têm poder de penetração muito baixo os tecidos fixados em geral devem ser cortados em secções extremamente finas 25 a 100 nm de espessura cerca de 1200 da espessura de uma única célula antes de serem visualizados Isso é alcançado desidratando a amostra permeandoa com uma resina monomérica que polimeriza para formar um bloco sóli do de plástico então cortando o bloco com uma faca de vidro muito fino ou diamante em um micrótomo especial As secções finas resultantes livres de água e outros solven tes voláteis são colocadas em uma pequena grade de metal para serem visualizadas ao microscópio Figura 943 Figura 941 As principais caracte rísticas de um microscópio óptico e de um microscópio eletrônico de transmissão Estas ilustrações enfa tizam as semelhanças entre eles En quanto as lentes do microscópio óptico são feitas de vidro as do microscópio eletrônico são bobinas magnéticas O microscópio eletrônico exige que a amostra seja colocada no vácuo A fotografia mostra um microscópio eletrônico de transmissão em uso Fotografia cortesia de JEOL Ltd Lente do condensador Lente do condensador Amostra Amostra Lente objetiva Visualização direta ou câmera digital Canhão de elétrons Lente ocular Lente do projetor Tela para visualização ou câmera digital Microscópio óptico Fonte de luz Microscópio eletrônico de transmissão C CH2 CH2 CH2 C O H O H O O O O Os Glutaraldeído Tetróxido de ósmio Figura 942 Dois fixadores químicos comuns utilizados para microscopia eletrônica Os dois grupos aldeído reati vos do glutaraldeído permitem a formação de ligação cruzada com vários tipos de moléculas formando ligações covalentes entre elas O tetróxido de ósmio forma complexos intercruzados com vários com postos orgânicos e fica reduzido durante o processo Esta reação é especialmente útil para a fixação de membranas celulares uma vez que ligações duplas CC presen tes em vários ácidos graxos reagem com o tetróxido de ósmio 556 PARTE III Formas de trabalhar com células As etapas para preparar o material biológico para microscopia eletrônica são de safiadoras Como podemos nos certificar de que a imagem da amostra fixada desidra tada e revestida por resina mantém qualquer relação com o delicado sistema biológico aquoso presente na célula viva As melhores abordagens atuais para esse problema de pendem do congelamento rápido Se um sistema aquoso é resfriado rápido o suficiente e para uma temperatura baixa o suficiente a água e os outros componentes não têm tem po para se rearranjar ou cristalizar em gelo Em vez disso a água é superresfriada em um estado rígido mas não cristalino um vidro chamado de gelo vítreo Esse estado pode ser alcançado jogandose a amostra em cima de um bloco de cobre polido e resfriado por hélio líquido mergulhandoa em um líquido refrigerador ou pulverizandoa com um jato de um líquido refrigerador como propano líquido ou resfriandoa sob alta pressão Algumas amostras congeladas rapidamente podem ser examinadas diretamente ao microscópio eletrônico utilizandose um suporte de amostra especial gelado Em ou tros casos o bloco congelado pode ser fraturado para revelar superfícies celulares inter nas ou o gelo ao redor pode ser sublimado para expor superfícies externas Entretanto muitas vezes queremos examinar secções finas Portanto um consenso é congelar rapi damente o tecido substituir a água por solventes orgânicos embeber o tecido em resina plástica e por fim cortar secções e corar Embora tecnicamente ainda difícil tal aborda gem estabiliza e preserva o tecido em uma condição muito semelhante ao seu estado original em vida Figura 944 A clareza da imagem em uma micrografia eletrônica depende de se ter densidades de elétrons contrastantes dentro da amostra A densidade de elétrons por sua vez depen de do número atômico dos átomos que estão presentes quanto mais alto o número atô mico mais elétrons são espalhados e mais escura é aquela parte da imagem Os tecidos biológicos são compostos em sua maior parte de átomos de número atômico muito baixo principalmente carbono oxigênio nitrogênio e hidrogênio Para tornálos visíveis os te cidos costumam ser impregnados antes ou depois do seccionamento com sais de metais pesados como urânio chumbo e ósmio O grau de impregnação ou coloração com esses sais varia para diferentes constituintes celulares Os lipídeos por exemplo tendem a corar mais forte após a fixação com ósmio revelando a localização das membranas celulares Macromoléculas específicas podem ser localizadas por microscopia eletrônica de imunolocalização com ouro Vimos como os anticorpos podem ser utilizados em conjunto com a microscopia de fluorescência para localizar macromoléculas específicas Um método análogo micros 3 mm Grade de cobre coberta com carbono eou filme plástico Amostra em uma série de secções finas Figura 943 A grade de metal que suporta as finas secções de uma amostra em um microscópio eletrônico de transmissão Figura 944 Secção fina de uma célula Esta secção fina pertence a uma célula de levedura que foi rapidamente congelada e teve seu gelo vítreo substituído por solventes orgânicos e então por resina plástica Núcleo mitocôndrias parede celular aparelho de Golgi e ribossomos podem ser todos prontamente visualizados em um estado que provavelmente seja o mais parecido possível com o real Cortesia de Andrew Staehelin Parede celular Aparelho de Golgi Núcleo Mitocôndria Ribossomos 100 nm 558 PARTE III Formas de trabalhar com células gem por TEM também pode ser enganadora de maneira oposta pela sobreposição de objetos que se localizam em diferentes profundidades Por causa da grande profundidade de campo dos microscópios eletrônicos todas as partes da amostra tridimensional estão focadas e a imagem resultante é uma projeção uma sobreposição de camadas da estrutura ao longo da direção de visão A informação perdida na terceira dimensão pode ser recuperada se tivermos vistas da mesma amostra a partir de direções diferentes Os métodos computacionais para essa técnica são bas tante utilizados nas varreduras TC médicas Em uma TC o equipamento de imagem é movido em torno do paciente para gerar as diferentes vistas Em uma tomografia por microscópio eletrônico EM electronmicroscope o suporte da amostra é inclinado no microscópio alcançando o mesmo resultado Dessa maneira podese chegar a uma re construção tridimensional em uma orientaçãopadrão escolhida combinandose vistas diferentes de um único objeto Cada orientação terá muito ruído mas combinandoas em três dimensões e fazendo uma média o ruído pode ser bastante diminuído Inician do com secções plásticas espessas do material fixado as reconstruções tridimensionais ou tomogramas são extensivamente empregadas para descrever a anatomia detalhada de regiões específicas da célula como o aparelho de Golgi Figura 947 ou o citoes queleto Cada vez mais os microscopistas também estão aplicando a tomografia por EM em secções hidratadas congeladas não marcadas e mesmo células ou organelas inteiras congeladas Figura 948 A microscopia eletrônica é uma metodologia robusta desde a escala de uma simples molécula até a de uma célula inteira Imagens de superfícies podem ser obtidas por microscopia eletrônica de varredura Um microscópio eletrônico de varredura SEM scanning electron microscope produz diretamente uma imagem da estrutura tridimensional da superfície de uma amostra O SEM costuma ser menor mais simples e mais barato do que um microscópio eletrôni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 946 Reconstrução tridimensional a partir de cortes em série Finas secções individuais no microscópio eletrônico às vezes levam a uma impressão errônea Neste exem plo a maioria dos cortes através de uma célula contendo uma mitocôndria ramificada parece conter duas ou três mitocôndrias individuais compare com a Figura 944 Além disso os cortes 4 e 7 podem ser interpretados como uma mitocôndria em processo de divisão A forma tridimensional real pode ser recons truída a partir de um conjunto completo de cortes em série Figura 947 Tomografia por microscópio eletrônico EM Amostras que foram rapida mente congeladas e então tiveram suas partes congeladas substituídas e fixadas em plástico preservam sua estrutura em uma condição que é muito semelhante ao seu estado original em vida Animação 92 Este exemplo mostra a estrutura tridimensional do aparelho de Golgi de uma célula de rim de rato Várias secções es pessas 250 nm da célula foram posicionadas em um microscópio eletrônico de alta volta gem ao longo de dois eixos diferentes e cerca de 160 ângulos diferentes foram armazenados Os dados digitais permitem que finas secções individuais do conjunto completo de dados tridimensional ou tomograma sejam visualiza das por exemplo secções em série cada uma de apenas 4 nm de espessura são mostradas em A e B Há pouquíssimas variações de uma secção para outra mas usandose o conjunto de todos os dados e corandose as membranas manualmente B podese obter uma recons trução tridimensional em uma resolução de cerca de 7 nm do aparelho de Golgi completo e de suas vesículas associadas C De MS La dinsky et al JCell Biol 14411351149 1999 Com permissão dos autores A B C 250 nm CAPÍTULO 9 Visualização de células 559 co de transmissão Enquanto o TEM utiliza os elétrons que atravessaram a amostra para formar uma imagem o SEM usa os elétrons que são espalhados ou emitidos a partir da superfície da amostra A amostra a ser examinada é fixada desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado De modo alternativo ela pode ser congelada rapida mente e então transferida para uma câmara resfriada de amostra para exame direto no microscópio Muitas vezes uma planta inteira ou um pequeno animal podem ser colo cados no microscópio com pouca preparação Figura 949 A amostra é escaneada com um feixe muito estreito de elétrons A quantidade de elétrons espalhados ou emitidos quando esse feixe primário bombardeia cada ponto sucessivo da superfície metálica é medida e utilizada para controlar a intensidade de um segundo feixe que se movimenta em sincronia com o primeiro e forma a imagem em uma tela de computador Por fim é constituída uma imagem bastante ampliada da superfície como um todo Figura 950 A técnica do SEM propicia uma grande profundidade de foco além disso como a quantidade de dispersão de elétrons depende do ângulo da superfície relativa ao feixe a imagem tem partes claras e sombras que lhe conferem uma aparência tridimensio nal ver Figura 949 e Figura 951 Entretanto apenas as características da superfície podem ser examinadas e na maioria das formas de SEM a resolução alcançável não é muito alta cerca de 10 nm com uma magnificação efetiva de até 20 mil vezes Como resultado a técnica costuma ser utilizada para estudar células e tecidos intactos em vez de organelas subcelulares ver Animação 213 No entanto SEMs com alta resolução fo ram desenvolvidos recentemente com um canhão de emissão de campo luminoso como fonte de elétrons Esse tipo de SEM pode produzir imagens que competem com a resolu ção possível com um TEM Figura 952 A coloração negativa e a microscopia crioeletrônica permitem que as macromoléculas sejam visualizadas com alta resolução Se forem revestidas com um metal pesado para proporcionar contraste macromoléculas isoladas como DNA ou grandes proteínas podem ser visualizadas prontamente em um microscópio eletrônico mas a coloração negativa permite que detalhes mais delicados sejam visualizados Nessa técnica as moléculas são sustentadas por um filme delgado de carbono e misturadas com uma solução concentrada de um sal de metal pesado como acetato de uranila Após a amostra ter secado uma camada muito fina do sal do metal cobre todo o filme de carbono exceto onde ele foi excluído pela presença de uma macro molécula adsorvida Como as macromoléculas permitem que os elétrons passem muito mais facilmente do que a coloração de metal pesado circundante é criada uma imagem Figura 948 Combinação da tomogra fia crioeletrônica e reconstrução de partículas simples Pequenas amostras rapidamente congeladas não fixadas podem ser examinadas enquanto ainda congeladas Neste exemplo os pequenos núcleos da ameba Dictyostelium foram gentilmente isolados e então rapidamente congelados antes que uma série inclinada de imagens fosse registrada com a ajuda de um estágio de inclinação do microscó pio Estas imagens digitais são combinadas por tomografia por EM para produzir um tomograma tridimensional Duas secções digitais finas 10 nm mostram por meio deste tomograma vistas de cima A e vistas laterais B de poros nucleares indivi duais setas brancas C No modelo tridi mensional C a superfície dos poros azul pode ser visualizada embebida no envelo pe nuclear amarelo A partir de uma série de tomogramas foi possível extrair grupos de dados para aproximadamente 300 po ros nucleares individuais cujas estruturas puderam então ser unificadas usandose técnicas de reconstrução de partículas simples A vista da superfície obtida de um desses poros reconstruídos é mostrada D a partir da face nuclear e E na secção transversal compare com a Figura 128 O complexo do poro está corado em azul e o revestimento nuclear em marrom De M Beck et al Science 30613871390 2004 Com permissão de AAAS 500 nm 200 nm 50 nm A B D E C 1 mm Figura 949 Flor ou espiga de trigo em desenvolvimento Esta delicada flor foi congelada rapidamente coberta com um fino filme de metal e examinada no seu estado congelado com um SEM Esta micrografia de baixa magnitude demons tra a grande profundidade de foco de um SEM Cortesia de Kim Findlay CAPÍTULO 9 Visualização de células 561 microscópio onde ela pode ser visualizada diretamente sem fixação coloração ou secagem Ao contrário da coloração negativa na qual o que é visto é o contorno de exclusão de colo ração em torno da partícula a microscopia crioeletrônica hidratada produz uma imagem da própria estrutura macromolecular Entretanto o contraste nessa imagem é bastante baixo e para extrair a maior quantidade de informação estrutural técnicas especiais de processa mento de imagem devem ser usadas como descreveremos a seguir Imagens múltiplas podem ser combinadas para aumentar a resolução Como vimos anteriormente p 532 o ruído é importante na microscopia óptica em ní veis baixos de luz mas é um problema particularmente grave para a microscopia eletrô nica de macromoléculas não coradas Uma molécula de proteína pode tolerar uma dose de apenas algumas dezenas de elétrons por nanômetro quadrado sem ser danificada e essa dose é de uma ordem de magnitude abaixo da que é necessária para definir uma imagem de resolução atômica A solução é obter imagens de várias moléculas idênticas possivelmente dezenas de milhares de imagens individuais e combinálas para produzir uma média das ima gens revelando detalhes estruturais que estão escondidos pelo ruído na imagem origi nal Esse processo é chamado de reconstrução de partículas simples Contudo antes de combinar todas as imagens individuais elas devem ser alinhadas umas com as ou tras Às vezes é possível induzir proteínas e complexos a formar arranjos cristalinos nos quais cada molécula é mantida na mesma orientação em uma rede regular Nesse caso o problema do alinhamento é facilmente resolvido e várias estruturas de proteínas foram determinadas com resolução atômica por esse tipo de cristalografia eletrônica Em prin cípio no entanto os arranjos cristalinos não são absolutamente necessários Com o auxí lio de um computador as imagens digitais das moléculas distribuídas de modo aleatório e não alinhadas podem ser processadas e combinadas para gerar reconstruções de alta resolução ver Animação 131 Embora estruturas que têm alguma simetria intrínseca tornem a tarefa do alinhamento mais fácil e mais exata essa técnica também tem sido utilizada para objetos sem simetria como ribossomos A Figura 954 mostra a estrutura Figura 952 Poro nuclear Imagens de envelopes nucleares rapidamente congelados foram obtidas em um SEM com alta resolução equipado com um canhão de emissão de campo como fonte de elétrons Estas imagens de cada lado do poro nuclear representam o limite de resolução do SEM compare com a Figura 128 Cortesia de Martin Goldeberg e Terry Allen CITOSOL Poro nuclear NÚCLEO 50 nm Figura 953 Filamentos de actina cora dos negativamente Nesta micrografia eletrônica de transmissão cada filamento tem cerca de 8 nm de diâmetro e visto em detalhe parece ser composto por uma cadeia helicoidal de moléculas Cortesia de Roger Craig 100 nm O QUE NÃO SABEMOS Conhecemos os detalhes de vários processos celulares como replica ção de DNA e transcrição e tradu ção de RNA mas seremos capazes algum dia de visualizar tal proces so molecular em ação nas células Seremos capazes algum dia de visualizar estruturas intracelulares a uma resolução do microscópio eletrônico em células vivas Como podemos melhorar a cris talização e as técnicas de micros copia crioeletrônica de partículas individuais para obter estruturas de alta resolução de todos os canais de membrana e transpor tadores importantes Que novos conceitos essas estruturas podem revelar 562 PARTE III Formas de trabalhar com células do capsídeo proteico dentro do vírus da imunodeficiência humana HIV que foi deter minada a uma alta resolução por meio de combinação de várias partículas múltiplas imagens e modelagem molecular Uma resolução de 03 nm foi conseguida por microscopia eletrônica o suficiente para se começar a ver arranjos atômicos internos em uma proteína e competir com a cristalografia de raios X em resolução Embora a microscopia eletrônica provavelmen te não substitua a cristalografia de raios X discutida no Capítulo 8 como método para determinar estruturas macromoleculares ela tem algumas vantagens muito claras Pri meiro ela absolutamente não requer amostras cristalinas Segundo ela pode lidar com complexos extremamente grandes estruturas que podem ser muito grandes ou muito variáveis para cristalizar satisfatoriamente Terceiro ela permite a análise rápida de dife rentes conformações de complexos proteicos A análise de estruturas macromoleculares complexas e grandes é facilitada con sideravelmente se a estrutura atômica de uma ou mais subunidades é conhecida por exemplo a partir da cristalografia de raios X Modelos moleculares podem então ser encaixados matematicamente no envelope da estrutura determinada a uma resolu ção menor usando o microscópio eletrônico ver Figuras 1616D e 1646 A Figura 955 mostra a estrutura de um ribossomo com a localização de um fator de liberação ligado determinada dessa forma ver também Figura 672 Resumo Revelar a estrutura detalhada das membranas e das organelas requer a mais alta resolu ção alcançável em um microscópio eletrônico de transmissão Macromoléculas específi cas podem ser identificadas após serem marcadas com ouro coloidal ligado a anticorpos Imagens tridimensionais das superfícies das células e dos tecidos podem ser obtidas por microscopia eletrônica de varredura As formas de moléculas isoladas podem ser pron tamente determinadas por técnicas de microscopia eletrônica envolvendo o congelamen to rápido ou coloração negativa A tomografia eletrônica e a reconstrução de partículas individuais utilizam manipulações computacionais de dados obtidos a partir de imagens múltiplas e ângulos de visão múltiplos para produzir reconstruções detalhadas dos com plexos macromoleculares e moleculares A resolução obtida com esses modelos significa Figura 954 Reconstrução de partículas simples A estrutura de um capsídeo com pleto do vírus da imunodeficiência humana HIV foi determinada por uma combinação de microscopia crioeletrônica determina ção da estrutura proteica e modelagem A Uma única secção de 4 nm de um modelo tomográfico por EM ver também Figura 948 de uma partícula intacta de HIV com seu envelope externo de mem brana e seu capsídeo proteico irregular interno que abriga seu genoma de RNA B A microscopia eletrônica de subunida des de capsídeo que se associam em um tubo helicoidal pode ser usada para derivar um mapa de densidade de elétrons a uma resolução de 8 nm na qual detalhes dos hexâmetros podem ser claramente visuali zados C Usando as coordenadas atômi cas conhecidas de uma única subunidade de hexâmero a estrutura foi modelada em um mapa de densidade de elétrons a partir de B D Reconstrução molecular de todo o capsídeo do HIV com base nas estruturas detalhadas mostradas em A e C Este capsídeo contém 216 hexâmeros azul e 12 pentâmeros amarelo Adaptada de G Zhao et al Nature 497643646 2013 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd C código PDB 3J34 Envelope da membrana Capsídeo do HIV Capsídeo do HIV 50 nm 20 nm A B C D Hexâmero Pentâmero Figura 955 Reconstrução de partí culas simples e ajuste da modelagem molecular Ribossomos bacterianos com e sem o fator de liberação necessário para a liberação do peptídeo a partir do ribossomo foram usados aqui para deri var mapas de microscopia crioeletrônica tridimensionais de alta resolução a uma resolução melhor do que 1 nm Imagens de aproximadamente 20 mil ribossomos individuais preservados em gelo foram usadas para produzir as reconstruções de partículas simples A A subunidade ribossômica 30S amarelo e a subunidade 50S azul podem ser distinguidas da den sidade de elétrons adicional que pode ser atribuída ao fator de liberação RF2 roxo B A estrutura molecular conhecida de RF2 modelada na densidade de elétrons de A De UBS Rawat et al Nature 4218790 2003 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd A B CAPÍTULO 9 Visualização de células 563 que as estruturas atômicas de macromoléculas individuais muitas vezes podem ser en caixadas nas imagens derivadas por microscopia eletrônica Dessa forma o TEM é cada vez mais capaz de preencher a lacuna entre estruturas determinadas por cristalografia de difração de raios X e aquelas determinadas com o microscópio óptico TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 91 Como a duplahélice de DNA tem apenas 2 nm de lar gura muito abaixo do limite da resolução do microscópio óptico é impossível ver cromossomos em células vivas sem colorações especiais 92 Uma molécula fluorescente tendo absorvido um úni co fóton de luz em um comprimento de onda sempre o emi te em um comprimento maior Discuta as questões a seguir 93 Os diagramas na Figura Q91 mostram os caminhos dos raios de luz passando por uma amostra com uma lente seca e com uma lente de imersão no óleo Ofereça uma explicação para o motivo pelo qual as lentes de imersão no óleo deveriam resultar em uma resolução melhor Ar vidro e óleo têm índi ces de refração de 100 151 e 151 respectivamente Lente objetiva Ar LENTE SECA Óleo LENTE DE IMERSÃO NO ÓLEO Lâmina de cobertura Figura Q91 Caminhos dos raios de luz pelas lentes seca e de imersão no óleo O círculo vermelho na origem dos raios de luz é a amostra 94 A Figura Q92 mostra um diagrama do olho humano Os índices de refração dos componentes no caminho da luz são córnea 138 humor aquoso 133 lentes cristalinas 141 e humor vítreo 138 Onde a refração principal o foco prin cipal ocorre Qual o papel que você supõe para as lentes Córnea Lente Humor aquoso Humor vítreo Retina Íris Figura Q92 Diagra ma do olho humano 95 Por que os humanos enxergam tão pouco embaixo da água E por que óculos de proteção ajudam 96 Explique a diferença entre resolução e magnificação 97 Anticorpos que se ligam a proteínas específicas são ferramentas importantes para definir a localização de molé culas nas células A sensibilidade do anticorpo primário o anticorpo que reage com a moléculaalvo muitas vezes é aumentada pelo uso de anticorpos secundários marcados que se ligam a ele Quais são as vantagens e desvantagens de usar anticorpos secundários ligados a marcadores fluo rescentes versus aqueles ligados a enzimas 98 A Figura Q93 mostra uma série de proteínas de fluo rescência modificadas que emitem luz em uma variedade de cores Como você supõe que o mesmo cromóforo possa fluo rescer em tantos comprimentos de onda diferentes Figura Q93 Um arcoíris de cores produzido por proteínas de fluorescência modificadas Cortesia de Nathan Shaner Paul Steinbach e Roger Tsien 99 Considere um detector de fluorescência projetado para determinar a localização celular de proteínas tirosinas cinase ativas Uma proteína azul ciano fluorescente azul esverdeado CFP e uma proteína amarela fluorescente YFP foram fusionadas a cada extremidade do domínio proteico híbrido O segmento da proteína híbrida possui um peptídeo substrato reconhecido pela proteína tirosina cinase Abl e um domínio de ligação da fosfotirosina Figura Q94A A estimulação do domínio CFP não causa a emissão pelo domínio YFP quando os domínios estão separados En tretanto quando os domínios CFP e YFP são aproximados a transferência de energia por ressonância de fluorescência FRET permite a excitação de CFP para estimular a emissão por YFP A FRET destacase experimentalmente como um A REPÓRTER B FRET YFP Peptídeo substrato Proteína de ligação à fosfotirosina 434 nm 476 nm Tempo horas YFPCFP 0 5 10 15 20 25 11 10 12 13 Abl ATP Sem Abl ou ATP Fosfatase CFP Figura Q94 Proteínarepórter fluorescente projetada para detectar a fosfo rilação da tirosina A Estrutura do domínio da proteínarepórter Quatro do mínios estão indicados CFP YFP peptídeo substrato de tirosinacinase e um domínio de ligação à fosfotirosina B Ensaio de FRET YFPCFP é normalizado para 10 no tempo zero A proteínarepórter foi incubada na presença ou ausência de Abl e ATP pelos tempos indicados A seta indica o momento da adição de uma tirosinafosfatase De AY Ting KH Kain RL Klemke e RY Tsien Proc Natl Acad Sci USA 981500315008 2001 Com permissão de National Academy of Sciences 564 PARTE III Formas de trabalhar com células aumento na relação entre emissão a 526 nm versus 476 nm YFPCFP quando CFP é excitada por uma luz 434 de nm A incubação da proteínarepórter com a proteína tirosinacinase Abl na presença de ATP produziu um au mento na emissão de YFPCFP Figura Q94B Na au sência de ATP ou da proteína Abl não ocorreu FRET A FRET também foi eliminada pela adição de uma tirosina fosfatase Figura Q94B Descreva da melhor forma que você puder como a proteínarepórter detecta a proteína tirosinacinase Abl ativa REFERÊNCIAS Gerais Celis JE Carter N Simons K et al eds 2005 Cell Biology A Laboratory Handbook 3rd ed San Diego Academic Press Volume 3 of this fourvolume set covers the practicalities of most of the current light and electron imaging methods that are used in cell biology Pawley BP ed 2006 Handbook of Biological Confocal Microscopy 3rd ed New York Springer Science Wayne R 2014 Light and Video Microscopy San Diego Academic Press Visualização de células ao microscópio óptico Adams MC Salmon WC Gupton SL et al 2003 A highspeed 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estabelecidos pelas atividades das proteínas especializadas da membrana podem ser usados para sintetizar ATP coordenar o transporte de solutos selecionados através da membrana ou como nos músculos e nervos produzir e transmitir impul sos elétricos Em todas as células a membrana plasmática também contém proteínas que atuam como sensores de sinais externos permitindo que as células mudem seu comportamento em resposta aos sinais ambientais incluindo aqueles de outras células Essas proteínas sensoriais ou receptoras transferem informação em vez de moléculas através da membrana Apesar de suas funções distintas todas as membranas biológicas possuem uma estrutura geral comum cada uma é constituída por uma fina película de moléculas de lipídeos e proteínas unidas principalmente por interações não covalentes Figura 101 As membranas celulares são estruturas dinâmicas fluidas e a maioria de suas molé culas movese no plano da membrana As moléculas lipídicas são organizadas como Molécula lipídica B Molécula proteica Bicamada lipídica 5 nm A Figura 101 Duas visões de uma membrana celular A Mi crografia eletrônica de um segmento da membrana plasmática de uma hemácia humana observada em corte transversal mos trando a estrutura de sua bicamada B Representação esque mática tridimensional de uma membrana celular e a distribuição geral de seus componentes lipídicos e proteicos A cortesia de Daniel S Friend 566 PARTE IV Organização interna da célula uma camada dupla contínua de cerca de 5 nm de espessura Essa bicamada lipídica proporciona a estrutura fluida básica da membrana e atua como uma barreira relativa mente impermeável à passagem da maioria das moléculas solúveis em água A maioria das proteínas de membrana atravessam a bicamada lipídica e medeiam quase todas as funções da membrana incluindo o transporte de moléculas específicas através dessa bicamada e a catálise de reações associadas à membrana como a síntese de ATP Na membrana plasmática algumas proteínas transmembrana atuam como ligações estru turais que conectam o citoesqueleto através da bicamada lipídica à matriz extracelu lar ou a uma célula adjacente enquanto outras atuam como receptores para detectar e transduzir sinais químicos do ambiente celular Existem muitas proteínas de membrana diferentes que permitem que a célula funcione e interaja com seu ambiente e estimase que cerca de 30 das proteínas codificadas pelo genoma de uma célula animal sejam proteínas de membrana Neste capítulo estudaremos a estrutura e a organização dos dois principais consti tuintes das membranas biológicas os lipídeos e as proteínas Embora salientemos prin cipalmente a membrana plasmática a maioria dos conceitos discutidos também é apli cável às várias membranas internas de células eucarióticas As funções das membranas celulares serão consideradas nos últimos capítulos seu papel na conversão de energia e síntese de ATP por exemplo será discutido no Capítulo 14 seu papel no transporte trans membrana de pequenas moléculas no Capítulo 11 seu papel na sinalização celular e adesão celular nos Capítulos 15 e 19 respectivamente Nos Capítulos 12 e 13 discutire mos as membranas internas das células e o tráfego de proteínas através delas e entre elas BICAMADA LIPÍDICA A bicamada lipídica forma a estrutura básica de todas as membranas celulares Ela é facilmente observada por microscopia eletrônica e sua estrutura de camada dupla é atribuível exclusivamente a propriedades especiais das moléculas lipídicas as quais se reúnem espontaneamente em bicamadas mesmo sob condições artificiais simples Nesta seção discutiremos os diferentes tipos de moléculas lipídicas encontradas nas membranas celulares e as propriedades gerais das bicamadas lipídicas Fosfoglicerídeos esfingolipídeos e esterois são os principais lipídeos das membranas celulares As moléculas lipídicas constituem cerca de 50 da massa da maioria das membranas das células animais e quase todo o restante são proteínas Há aproximadamente 5 10 6 moléculas lipídicas em uma área de 1 m 1 m de bicamada lipídica ou cerca de 10 9 moléculas lipídicas na membrana plasmática de uma pequena célula animal To das as moléculas lipídicas da membrana plasmática são anfifílicas isto é possuem uma extremidade hidrofílica que ama água ou polar e uma extremidade hidrofóbica que teme a água ou apolar Os mais abundantes lipídeos da membrana são os fosfolipídeos Eles possuem um grupamento da cabeça polar contendo um grupo fosfato e duas caudas hidrocarbonadas hidrofóbicas Nos animais nas plantas e nas células bacterianas as caudas normalmente são ácidos graxos e podem diferir em comprimento normalmente elas contêm entre 14 e 24 átomos de carbono Geralmente uma cauda possui uma ou mais ligações duplas cisatuantes ie ela é insaturada enquanto a outra cauda não possui essa ligação ie ela é saturada Como mostra a Figura 102 cada ligação dupla cisatuante cria uma pequena dobra na cauda As diferenças no comprimento e na saturação das caudas e dos ácidos graxos influenciam como as moléculas fosfolipídicas encaixamse umas nas outras afetando a fluidez da membrana como discutiremos mais adiante Os principais fosfolipídeos da maioria das membranas das células animais são fosfoglicerídeos os quais possuem uma cadeia principal de glicerol de três carbonos ver Figura 102 Duas longas cadeias de ácidos graxos são unidas por pontes ésteres aos átomos de carbono adjacentes do glicerol e o terceiro átomo de carbono do glicerol está ligado a um grupo fosfato que por sua vez é ligado a um entre vários tipos de grupa mentos de cabeças Combinando diferentes ácidos graxos e grupamentos de cabeças as CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 567 células produzem diferentes fosfoglicerídeos A fosfatidiletanolamina a fosfatidilserina e a fosfatidilcolina são os mais abundantes fosfoglicerídeos das membranas das células de mamíferos Figura 103AC Outra importante classe de fosfolipídeos são os esfingolipídeos que são constituí dos por esfingosina no lugar do glicerol Figura 103DE A esfingosina é uma longa cadeia acil com um grupo amino NH2 e dois grupos hidroxila OH em uma extremida de Na esfingomielina o esfingolipídeo mais comum uma cauda de ácido graxo é liga da ao grupo amino e um grupo fosfocolina é ligado ao grupo hidroxila terminal Juntos os fosfolipídeos fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e esfingomielina constituem mais da metade da massa de lipídeos da maioria das membranas celulares de mamíferos ver Tabela 101 p 571 COLINA FOSFATO GLICEROL CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CAUDA DE ÁCIDO GRAXO Grupamento da cabeça hidrofílica Caudas hidrofóbicas A B CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 O C O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH O C O CH CH2 O P O O CH2 CH2 NCH33 O CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 Ligação dupla cisatuante Cabeça hidrofílica Caudas hidrofóbicas D C 1 2 Figura 102 Partes de uma típica molécula de fosfolipídeo Este exemplo é de uma fos fatidilcolina representada esquematicamente A por uma fórmula B por um modelo de preenchimento espacial C Animação 101 e por um símbolo D NH3 CH2 CH2 O NH3 C CH2 O H COO N CH2 CH2 O CH3 CH3 CH3 N CH2 CH2 O CH3 CH3 CH3 P O O O CH2 CH CH2 O O C O O C P O O O CH2 CH CH2 O O C O O C P O O O CH2 CH CH2 O O C O O C P O O O CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CAUDA DE ÁCIDO GRAXO Fosfatidiletanolamina Fosfatidilserina Fosfatidilcolina Esfingomielina Esfingosina CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CH2 CH CH CADEIA DE GORDURA CADEIA DE GORDURA CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CH CH NH O C OH HC CH CH NH3 CH2 OH OH A B C D E CH Figura 103 Os quatro principais fosfolipíde os das membranas plasmáticas de mamífe ros Observe que os diferentes grupamentos de cabeças estão representados em cores diferentes As moléculas lipídicas mostradas em AC são fosfoglicerídeos os quais são derivados do glice rol A molécula em D é a esfingomielina a qual é derivada da esfingosina E sendo portanto um esfingolipídeo Observe que somente a fosfatidilserina possui carga total negativa cuja importância discutiremos mais adiante os outros três são eletricamente neutros em pH fisiológico carregando portanto uma carga negativa e uma carga positiva 568 PARTE IV Organização interna da célula Além dos fosfolipídeos a bicamada lipídica de muitas membranas celulares con tém glicolipídeos e colesterol Os glicolipídeos assemelhamse aos esfingolipídeos mas no lugar do grupo fosfato ligado à cabeça possui um açúcar Veremos os glicolipídeos mais adiante A membrana plasmática eucariótica contém especialmente grandes quantida des de colesterol até 1 molécula para cada molécula de fosfolipídeo O colesterol é um esterol Ele contém uma estrutura em anel rígida a qual se liga a um único grupo hidroxila polar e a uma pequena cadeia de hidrocarbono apolar Figura 104 As moléculas de colesterol orientamse na bicamada com seu grupo hidroxila próximo aos grupamentos de cabeças polares das moléculas de fosfolipídeos adjacentes Figura 105 Os fosfolipídeos formam bicamadas espontaneamente A forma e a natureza anfifílica das moléculas de fosfolipídeos causam a formação de bi camadas de forma espontânea em ambientes aquosos Como discutido no Capítulo 2 as moléculas hidrofílicas dissolvemse facilmente em água porque contêm grupos po lares carregados ou não carregados que podem formar interações eletrostáticas favorá veis ou ligações de hidrogênio com as moléculas de água Figura 106A As moléculas hidrofóbicas por outro lado são insolúveis em água porque todos ou quase todos os seus átomos são apolares e não carregados e portanto não podem formar interações energeticamente favoráveis com as moléculas de água Se dispersos na água irão forçar as moléculas de água adjacentes a se reorganizarem em estruturas semelhantes a gelo que envolvem as moléculas hidrofóbicas Figura 106B Sua formação aumenta com a energia livre porque essas estruturas de cadeias de cristais são mais organizadas do que as moléculas de água circundantes Entretanto o custo dessa energia livre é minimiza do se as moléculas hidrofóbicas ou as porções hidrofóbicas das moléculas anfifílicas agruparemse e assim um menor número de moléculas de água é afetado Quando as moléculas anfifílicas são expostas a um ambiente aquoso elas irão se comportar como se espera de acordo com o que foi discutido anteriormente Elas se agregam de modo espontâneo escondendo suas caudas hidrofóbicas no interior onde ficam protegidas da água expondo suas cabeças hidrofílicas para a água Dependendo de sua forma elas podem fazer isso de duas maneiras podem formar micelas esféricas com as caudas para dentro ou formar folhas de camadas duplas ou bicamadas com as caudas hidrofóbicas para o interior entre as cabeças hidrofílicas Figura 107 As mesmas forças que fazem os fosfolipídeos formarem as bicamadas também proporcionam uma propriedade de autosselamento Uma pequena fenda na bicamada cria uma borda livre em contato com água e devido ao fato de serem energeticamen te desfavoráveis os lipídeos tendem a se rearranjar espontaneamente para eliminar a borda livre Nas membranas plasmáticas eucarióticas as fendas maiores são reparadas pela fusão de vesículas intracelulares A proibição das bordas livres tem profundas con sequências a única forma de uma bicamada evitar a existência de bordas é pelo fecha mento sobre si mesma formando um compartimento fechado Figura 108 Esse com B CH CH OH A Estrutura rígida do anel esteroide Cauda hidrocarbonada apolar Grupamento da cabeça polar C CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH2 CH2 CH3 Figura 104 Estrutura do colesterol O colesterol está representado em A por uma fórmula química em B por um esquema e em C por um modelo de preenchimento espacial Grupamentos de cabeça polar Região enrijecida pelo colesterol Região mais fluida 0 1 2 3 nm Figura 105 O colesterol em uma bicamada lipídica Representação esquemática em esca la de uma molécula de colesterol interagindo com duas moléculas de fosfolipídeo em uma monocamada de uma bicamada lipídica 570 PARTE IV Organização interna da célula nitróxido NO o qual contém um elétron não pareado cuja rotação cria um sinal pa ramagnético que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância rotacional ESR eletron spin resonance cujos princípios são similares aos da ressonância magnética nuclear RMN apresentado no Capítulo 8 O movimento e a orientação de um lipídeo marcado na bicamada podem ser deduzidos a partir do espectro de ESR Tais estudos mostraram que as moléculas fosfolipídicas nas bicamadas sintéticas raramente migram de um lado para outro da monocamada também chamada de folheto Esse processo denominado flipflop retornar ocorre em poucas horas em qualquer molécula em bora o colesterol seja uma exceção a essa regra e pode retornar rapidamente Por outro lado moléculas lipídicas trocam de lugar rapidamente com suas vizinhas dentro de uma mesma monocamada cerca de 10 7 vezes por segundo Isso origina uma rápida difu são lateral com um coeficiente de difusão D de cerca de 10 8 cm 2s que significa que uma molécula lipídica média difunde o comprimento de uma célula bacteriana grande 2 m em cerca de 1 segundo Esses estudos também mostraram que moléculas lipídi cas giram rapidamente ao redor de seu eixo maior e suas cadeias de hidrocarbonos são flexíveis Simulações em computador mostraram que as moléculas lipídicas são muito desorganizadas nas bicamadas sintéticas apresentando uma superfície irregular com espaços variáveis e as cabeças orientadas para a fase aquosa de um lado da bicamada Figura 1010 Estudos similares de mobilidade foram realizados com moléculas de lipídeos mar cadas em membranas biológicas isoladas e em células vivas e apresentaram resultados similares àqueles obtidos nas bicamadas sintéticas Foi demonstrado que o componente lipídico de uma membrana biológica é um líquido bidimensional no qual as moléculas constituintes estão livres para se mover lateralmente Como em uma bicamada sinté tica moléculas individuais de fosfolipídeos normalmente estão confinadas à sua pró pria monocamada Esse confinamento cria um problema para sua síntese As moléculas de fosfolipídeos são manufaturadas em apenas uma monocamada de uma membrana principalmente na monocamada citosólica da membrana do RE Se nenhuma dessas moléculas recémformadas migra imediatamente para a monocamada não citosólica não poderá ser formada uma nova bicamada lipídica O problema pode ser resolvido por uma classe especial de proteínas de membrana denominadas translocadoras de fosfoli pídeos ou flipases as quais catalisam o rápido flipflop dos fosfolipídeos de uma camada para outra como apresentado no Capítulo 12 Apesar da fluidez da bicamada lipídica os lipossomos não se fusionam esponta neamente uns com os outros quando em suspensão na água A fusão não ocorre porque os grupamentos das cabeças lipídicas polares ligam as moléculas de água as quais pre cisam ser deslocadas da bicamada de dois lipossomos diferentes para que ocorra a fusão A camada de proteção aquosa que mantém os lipossomos isolados também insuflam as B A Água Água 25 nm 50 nm Figura 109 Lipossomos A Micrografia eletrônica de lipossomos vesículas fosfolipí dicas sintéticas não coradas e não fixadas em água que foram rapidamente congeladas em nitrogênio líquido B Representação gráfica de um pequeno lipossomo esférico visto em corte transversal Normalmente os lipossomos são usados como modelos de mem brana em estudos experimentais principalmente para estudar proteínas incorporadas nas membranas A de P Frederik e D Hubert Methods Enzymol 391431448 2005 Com permissão de Elsevier Figura 1010 Mobilidade das molécu las de fosfolipídeo em uma bicamada lipídica artificial Iniciando com um mo delo de cem moléculas de fosfatidilcolina organizadas em uma bicamada regular o computador calcula a posição de cada átomo após 300 picossegundos de estí mulo A partir destes cálculos teóricos surge um modelo de bicamada lipídica que considera quase todas as proprieda des mensuráveis de uma bicamada lipídica sintética incluindo espessura número de moléculas lipídicas por área de membrana profundidade de penetração na água e irregularidades das duas superfícies Observe que as caudas em uma monoca mada podem interagir com as da outra monocamada se forem longas o suficien te B As diferentes movimentações de uma molécula lipídica em uma bicamada A baseado em SW Chiu et al Biophys J 6912301245 1995 Com permissão da Biophysical Society A B Flexão Rotação Difusão lateral Flipflop ocorre raramente Caudas de ácidos graxos Grupamentos de cabeças lipídicas Moléculas de água CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 571 membranas internas das células eucarióticas impedindo a fusão descontrolada man tendo a integralidade da compartimentalização das organelas circundadas por mem branas Todos os eventos de fusão de membrana celular são catalisados por proteínas de fusão rigidamente controladas que forçam a aproximação das membranas adequadas expulsando a camada de água que mantém as bicamadas distantes umas das outras como veremos no Capítulo 13 A fluidez de uma bicamada lipídica depende de sua composição A fluidez das membranas celulares tem que ser precisamente regulada Por exemplo certos processos de transporte através das membranas e atividades enzimáticas cessam quando a viscosidade é aumentada experimentalmente acima de um nível limítrofe A fluidez de uma bicamada lipídica depende de sua composição e de sua tempera tura como é facilmente demonstrado em estudos de bicamadas lipídicas sintéticas Uma bicamada sintética feita de um único tipo de fosfolipídeo muda do estado líquido para um estado cristalino rígido ou gel bidimensional em uma temperatura característica Essa mudança de estado é denominada transição de fase e a temperatura na qual isso ocorre é mais baixa ie a membrana tornase mais difícil de congelar se as cadeias de hidrocarbonos forem curtas ou possuírem ligações duplas Uma cadeia curta reduz a tendência das caudas hidrocarbonadas de interagirem umas com as outras na mesma camada ou na monocamada oposta e as ligações duplas cisatuantes produzem torções nas cadeias que as tornam mais difíceis de se agruparem de modo que a membrana se torna mais fluida a baixas temperaturas Figura 1011 As bactérias leveduras e ou tros organismos cujas temperaturas flutuam com a do ambiente ajustam a composição de ácidos graxos das suas membranas lipídicas para manter uma fluidez relativamente constante Quando a temperatura baixa por exemplo as células desses organismos sin tetizam ácidos graxos com mais ligações duplas cisatuantes evitando assim a redução da fluidez da bicamada que de outra forma ocorreria devido à queda na temperatura O colesterol modula as propriedades da bicamada lipídica Quando misturado com fosfolipídeos aumenta a propriedade de barreira permeável da bicamada lipídica O colesterol se insere na bicamada com o grupo hidroxila próximo às cabeças polares dos fosfolipídeos de modo que seus rígidos anéis esteroides interajam e parcialmente imobilizem aquelas regiões de hidrocarbonos próximas aos grupamentos de cabeças po lares ver Figura 105 e Animação 103 Reduzindo a mobilidade dos primeiros grupos CH2 das cadeias das moléculas de fosfolipídeos o colesterol torna a bicamada lipídica menos deformável nesta região reduzindo a permeabilidade da bicamada a pequenas moléculas solúveis em água Embora o colesterol aumente o empacotamento dos lipí deos na bicamada isto não torna as membranas menos fluidas Às altas concentrações encontradas na maioria das membranas plasmáticas dos eucariotos o colesterol tam bém impede que as cadeias de hidrocarbonos agrupemse e cristalizem A Tabela 101 compara a composição lipídica de várias membranas biológicas Observe que a membrana plasmática bacteriana é composta com frequência por um tipo principal de fosfolipídeo e não contém colesterol Normalmente nas arqueias os Cadeias de hidrocarbonos insaturados com ligações duplas cisatuantes Cadeias de hidrocarbonos saturados Figura 1011 A influência de ligações duplas cisatuantes nas cadeias de hi drocarbonos As ligações duplas dificultam o agrupamento das cadeias tornando mais difícil de congelar a bicamada lipídica Além disso devido às cadeias de hidrocarbonos de lipídeos insaturados estarem mais distantes as bicamadas lipídicas por eles formadas são mais delgadas do que as bicamadas formadas por lipídeos saturados TABELA 101 Composição aproximada dos lipídeos de diferentes membranas celulares lipídeo Porcentagem total de lipídeos por peso Membrana plasmática de um hepatócito Membrana plasmática de um eritrócito Mielina Mitocôndria membranas interna e externa Retículo endoplasmático Bactéria E coli Colesterol 17 23 22 3 6 0 Fosfatidiletanolamina 7 18 15 28 17 70 Fosfatidilserina 4 7 9 2 5 Traços Fosfatidilcolina 24 17 10 44 40 0 Esfingomielina 19 18 8 0 5 0 Glicolipídeos 7 3 28 Traços Traços 0 Outros 22 14 8 23 27 30 CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 573 das células vivas organizando e concentrando as proteínas de membrana para o trans porte nas vesículas discutido no Capítulo 13 ou para trabalharem juntas na reunião das proteínas quando convertem sinais extracelulares em intracelulares discutido no Capítulo 15 As gotas lipídicas são circundadas por uma monocamada fosfolipídica A maioria das células armazena um excesso de lipídeos como gotas lipídicas de onde pode ser obtida a matériaprima para a síntese de membranas ou uma fonte de alimento As células de gordura também denominadas adipócitos são especializadas no armaze namento de lipídeos Elas contêm grandes gotas lipídicas que preenchem quase todo o citoplasma A maioria dos outros tipos celulares possuem muitas gotas lipídicas peque nas com tamanho e quantidades variáveis conforme seu estado metabólico Os ácidos graxos podem ser liberados das gotas lipídicas quando necessário e exportados para outras células pela corrente sanguínea As gotas lipídicas armazenam lipídeos neutros como triacilglicerídeos e ésteres de colesterol os quais são sintetizados de ácidos graxos e colesterol por enzimas na membrana do RE Elas são moléculas exclusivamente hi drofóbicas e agregamse em gotas tridimensionais em vez de em bicamadas pois esses lipídeos não contêm grupamentos de cabeças hidrofílicas As gotas lipídicas são organelas únicas pois são circundadas por uma única cama da de fosfolipídeos a qual contém uma grande variedade de proteínas Algumas dessas proteínas são enzimas envolvidas no metabolismo dos lipídeos mas a função da maio ria delas é desconhecida As gotas lipídicas se formam rapidamente quando as células são expostas a altas concentrações de ácidos graxos Acreditase que elas se formem de regiões discretas na membrana do RE onde estão concentradas muitas enzimas do me tabolismo dos lipídeos A Figura 1014 mostra um modelo de como as gotas lipídicas podem formar e adquirir sua monocamada circundante de fosfolipídeos e proteínas A assimetria da bicamada lipídica é funcionalmente importante As composições de lipídeos das duas monocamadas da bicamada lipídica de muitas membranas são surpreendentemente distintas Na membrana dos glóbulos vermelhos Figura 1013 Modelo de um domínio de balsa As interações fracas proteína proteína proteínalipídeo e lipídeolipídeo se reforçam mutuamente distribuindo os componentes em domínios de balsas O colesterol esfingolipídeos glicolipídeos proteínas ancoradas ao glicosilfosfa tidilinositol GPI e algumas proteínas transmembrana estão concentradas nesses domínios Observe que devido a sua composição os domínios de balsas apresentam um espessamento da mem brana Mais adiante veremos os glicolipí deos as proteínas ancoradas ao GPI e os oligossacarídeos conectores Adaptada de D Lingwood and K Simons Science 3274650 2010 Colesterol Glicoproteína transmembrana Proteína ancorada ao GPI Oligossacarídeo conector Glicolipídeo CITOSOL Domínio de balsa Bicamada lipídica Figura 1014 Modelo para a formação de gotas lipídicas Os lipídeos neutros são depositados entre as duas monocama das da membrana do RE Ali eles se agre gam em gotas tridimensionais que brotam e se destacam da membrana do RE com uma única organela circundada por uma monocamada fosfolipídica e proteínas associadas Adaptada de S Martin e RG Parton Nat Rev Mol Cell Biol 7373 378 2006 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Bicamada fosfolipídica Monocamada fosfolipídica Triacilgliceróis e ésteres de colesterol Proteínas associadas Retículo endoplasmático 574 PARTE IV Organização interna da célula humanos eritrócitos por exemplo quase todas as moléculas de fosfolipídeos que pos suem colina CH33N CH2CH2OH em seu grupamentos de cabeças fosfatidilcolina e esfingomielina estão na monocamada externa enquanto quase todas que contêm um grupo amino primário terminal fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina estão na mono camada interna Figura 1015 Há uma significativa diferença nas cargas entre as duas metades da bicamada porque a fosfatidilserina negativamente carregada está localiza da na monocamada interna No Capítulo 12 discutiremos como os fosfolipídeos translo cadores ligados à membrana produzem e mantêm a assimetria lipídica A assimetria lipídica é funcionalmente importante em especial na conversão de sinais extracelulares em sinais intracelulares discutido no Capítulo 15 Muitas proteí nas citosólicas se ligam a grupamentos de cabeças lipídicas específicos encontrados na monocamada do citosol da bicamada lipídica A enzima proteínacinase C PKC por exemplo que é ativada em resposta a vários sinais extracelulares ligase à porção cito plasmática da membrana plasmática onde a fosfatidilserina está concentrada e requer esses fosfolipídeos negativamente carregados para sua atividade Em outros casos grupamentos de cabeças lipídicas específicos primeiramente devem ser modificados para criar sítios de ligação de proteínas em regiões e em mo mentos determinados Um exemplo é o fosfatidilinositol PI um dos fosfolipídeos se cundários que estão concentrados na monocamada citosólica da membrana celular ver Figura 1310AC Várias cinases lipídicas podem adicionar grupos fosfato em po sições distintas no anel inositol criando sítios de ligação que recrutam proteínas espe cíficas do citosol para a membrana Um exemplo importante de tal cinase lipídica é a fosfoinositídeo 3cinase PI 3cinase a qual é ativada em resposta a sinais extracelulares e auxilia no recrutamento de proteínas sinalizadoras intracelulares para a porção cito sólica da membrana plasmática ver Figura 1553 Cinases lipídicas similares fosfori lam os fosfolipídeos inositol na membrana intracelular auxiliando no recrutamento de proteínas que guiam o transporte de membrana Os fosfolipídeos na membrana plasmática ainda são usados de outra forma para converter sinais extracelulares em intracelulares A membrana plasmática contém várias fosfolipases que são ativadas por sinais extracelulares para clivar moléculas fosfolipídicas específicas gerando fragmentos dessas moléculas que atuam como mediadores celula res de vida curta Por exemplo a fosfolipase C cliva um fosfolipídeo inositol da mono camada citosólica da membrana plasmática para gerar dois fragmentos um dos quais permanece na membrana e auxilia a ativação da PKC enquanto o outro é liberado para o citosol e estimula a liberação da Ca 2 do RE ver Figura 1528 Os animais exploram a assimetria dos fosfolipídeos de sua membrana plasmáti ca para distinguir entre células vivas e células mortas Quando uma célula animal sofre apoptose uma forma de morte celular programada discutida no Capítulo 18 a fosfa tidilserina que normalmente está confinada à monocamada citosólica ou interna da bicamada lipídica da membrana plasmática rapidamente se transloca para a monoca mada extracelular ou externa A fosfatidilserina exposta na superfície celular sinaliza para as células vizinhas como os macrófagos para fagocitar e digerir a célula morta Acreditase que a translocação da fosfatidilserina nas células apoptóticas ocorra por meio de dois mecanismos 1 Inativação do translocador de fosfolipídeo que normalmente transporta esse lipí deo da monocamada externa para a monocamada interna 2 Ativação da scramblase de scramble embaralhar que transfere os fosfolipídeos de forma inespecífica nas duas direções entre as duas monocamadas Figura 1015 Distribuição assimétrica de fosfolipídeos e glicolipídeos na bicamada lipídica de eritrócitos huma nos As cores usadas para os grupamentos de cabeças polares dos fosfolipídeos são as mesmas introduzidas na Figura 103 Além disso os glicolipídeos estão representados com os grupamentos de cabeças polares em forma hexagonal azul O colesterol não mostrado se distribui da mesma for ma nas duas monocamadas ESPAÇO EXTRACELULAR CITOSOL Bicamada lipídica CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 575 Os glicolipídeos são encontrados na superfície de todas as membranas plasmáticas eucarióticas As moléculas lipídicas que contêm açúcar denominadas glicolipídeos possuem uma simetria exagerada em sua distribuição na membrana Essas moléculas seja na mem brana plasmática ou nas membranas intracelulares são encontradas exclusivamente na monocamada mais distante do citosol Nas células animais elas são constituídas de esfingosina exatamente como a esfingomielina ver Figura 103 Essas intrigantes moléculas tendem a se associar parcialmente através de ligações de hidrogênio entre seus açúcares e parcialmente através de forças de van der Waals entre suas longas e re tas cadeias de hidrocarbonos as quais fazem se dividirem em fases de balsas lipídicas ver Figura 1013 A distribuição assimétrica dos glicolipídeos na bicamada resulta da adição de grupos de açúcares às moléculas lipídicas no lúmen do aparelho de Golgi Assim o compartimento no qual eles são produzidos é topologicamente equivalente ao exterior da célula discutido no Capítulo 12 Assim que são liberados na membrana plasmática os grupos de açúcares são expostos na superfície celular ver Figura 1015 onde desempenham importantes papéis nas interações da célula com suas vizinhas Os glicolipídeos provavelmente ocorrem em todas as membranas plasmáticas das células eucarióticas nas quais geralmente constituem cerca de 5 das moléculas lipí dicas da monocamada externa Eles também são encontrados em algumas membranas intracelulares O mais complexo dos glicolipídeos os gangliosídeos contém oligossa carídeos com uma ou mais porção de ácido siálico que confere aos gangliosídeos uma carga negativa Figura 1016 O mais abundante entre os mais de 40 diferentes ganglio sídeos já identificados está localizado na membrana plasmática das células nervosas na qual os gangliosídeos constituem 5 a 10 da massa total de lipídeo Também são encon trados em menores quantidades nos outros tipos celulares As sugestões com relação à função dos glicolipídeos provêm de sua localização Na membrana plasmática das células epiteliais por exemplo os glicolipídeos estão con finados na superfície apical exposta onde podem auxiliar a proteger a membrana contra as graves condições frequentemente ali encontradas como baixo pH e altas concen trações de enzimas degradantes Os glicolipídeos carregados como os gangliosídeos podem ser importantes devido aos seus efeitos elétricos Sua presença altera o campo elétrico através da membrana e a concentração de íons principalmente Ca 2 na super fície da membrana Os glicolipídeos também atuam nos processos de reconhecimento celular nos quais as proteínas ligadoras de carboidratos ligadas à membrana lectinas Gal Glc Gal NANA Gal COO OH H H H OH H H HN C CH3 O CHOH CHOH CH2OH A Galactocerebrosídeo B Gangliosídeo GM1 C Um ácido siálico NANA O CH2 CH CH CADEIA DE GORDURA CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CH CH NH O C O CH2 CH CH CADEIA DE GORDURA CAUDA DE ÁCIDO GRAXO CH CH NH O C OH OH GalNAc R R O Figura 1016 Moléculas de glicolipídeos A O galactocerebrosídeo é considerado um glicolipídeo neutro porque o açúcar que forma o grupamento da sua cabeça não é carregado B Um gangliosídeo sempre contém uma porção ou mais de ácido siálico com carga negativa Há vários tipos de ácido siálico nas células humanas grande parte é ácido Nacetilneuramínico ou NANA cuja estrutura está apresentada em C Enquanto em bactérias e plantas quase todos os gli colipídeos são derivados do glicerol como a maioria dos fosfolipídeos nas células animais quase todos os glicolipídeos têm como base a esfingosina como é o caso da esfingomie lina ver Figura 103 Gal galactose Glc glicose GalNAc Nacetilgalatosamina estes três açúcares não são carregados 576 PARTE IV Organização interna da célula se ligam aos grupos de açúcares de glicolipídeos e glicoproteínas no processo de adesão célulacélula discutido no Capítulo 19 Camundongos mutantes deficientes de todos os gangliosídeos complexos apresentam anormalidades no sistema nervoso incluindo degeneração axonal e redução da mielinização Alguns glicolipídeos são a porta de entrada para determinadas toxinas bacterianas e vírus O gangliosídeo GM1 ver Figura 1016 por exemplo atua como um receptor de super fície celular para a toxina bacteriana que causa a diarreia debilitante da cólera As toxinas da cólera se ligam e entram somente naquelas células que possuem GM1 em sua superfície incluindo as células epiteliais intestinais Sua entrada na célula causa um aumento na con centração do AMP cíclico intracelular discutido no Capítulo 15 que por sua vez provoca um grande efluxo de Cl levando a secreção de Na K HCO3 e água no intestino O polio mavírus também entra na célula após inicialmente se ligar aos gangliosídeos Resumo As membranas biológicas consistem em uma camada dupla contínua de moléculas lipí dicas onde as proteínas de membrana ficam embebidas Essa bicamada lipídica é fluida com moléculas lipídicas individuais capazes de difundiremse rapidamente dentro de sua própria monocamada As moléculas lipídicas de membrana são anfifílicas Quando co locadas em água elas se reúnem espontaneamente em bicamadas as quais formam um compartimento fechado Embora as membranas celulares contenham centenas de espécies diferentes de lipídeos a membrana plasmática das células animais contém três classes principais os fosfolipídeos o colesterol e os glicolipídeos Os fosfolipídeos são classificados em duas cate gorias de acordo com sua cadeia principal os fosfoglicerídeos e os esfingolipídeos A com posição de lipídeos das monocamadas interna e externa são diferentes refletindo as dis tintas funções das duas faces da membrana celular Diferentes misturas de lipídeos são encontradas na membrana das células de diferentes tipos bem como nas várias membra nas de uma única célula eucariótica Os fosfolipídeos inositol são uma classe secundária de fosfolipídeos os quais no folheto citosólico da bicamada lipídica da membrana plas mática desempenham uma importante função na sinalização intracelular em resposta a sinais extracelulares cinases lipídicas específicas fosforilam os grupamentos de cabeças desses lipídeos para formar sítios de ancoragem para proteínas sinalizadoras citosólicas enquanto fosfolipases específicas clivam determinados fosfolipídeos inositol para gerar pequenas moléculas de sinalização intracelular PROTEÍNAS DE MEMBRANA Embora a bicamada lipídica forneça a estrutura básica das membranas biológicas as pro teínas de membrana desempenham a maioria das funções específicas da membrana e portanto fornecem a cada tipo de membrana celular suas características e propriedades funcionais Como consequência as quantidades e os tipos de proteínas das membranas são altamente variáveis Na membrana de mielina que atua principalmente como isolan te elétrico do axônio da célula nervosa menos de 25 da massa da membrana são cons tituídos por proteína Por outro lado nas membranas envolvidas com a produção de ATP como a membrana interna das mitocôndrias e dos cloroplastos aproximadamente 75 são proteínas Uma membrana plasmática típica possui uma quantidade intermediária de proteínas com cerca de metade de sua massa Contudo sempre há mais moléculas lipídicas do que moléculas de proteína nas membranas celulares pois as moléculas lipí dicas são pequenas quando comparadas com as moléculas de proteína cerca de 50 mo léculas lipídicas para cada molécula de proteína nas membranas celulares que possuem massa de proteína de 50 As proteínas de membrana variam amplamente em estrutura e no modo como se associam com a bicamada lipídica refletindo suas funções distintas As proteínas de membrana podem se associar à bicamada lipídica de várias maneiras A Figura 1017 mostra as diferentes formas pelas quais as proteínas podem se associar à membrana Como seus vizinhos lipídicos essas proteínas de membrana são anfifílicas CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 577 possuindo uma região hidrofóbica e uma hidrofílica Muitas proteínas de membrana atra vessam a bicamada lipídica e portanto são denominadas proteínas transmembrana com uma porção em cada um dos lados Figura 1017 exemplos 1 2 e 3 Suas regiões hi drofóbicas passam pela membrana e interagem com as caudas hidrofóbicas das moléculas lipídicas do interior da bicamada onde são mantidas fora da água Suas regiões hidrofílicas estão expostas à água nos dois lados da membrana A ligação covalente da cadeia de ácidos graxos que se inserem na monocamada citosólica da bicamada lipídica aumenta a hidrofo bicidade de algumas dessas proteínas transmembrana ver Figura 1017 exemplo 1 Outras proteínas de membrana estão localizadas inteiramente no citosol e estão anexadas à monocamada citosólica da bicamada lipídica tanto por uma ahélice anfifí lica exposta na superfície da proteína Figura 1017 exemplo 4 quanto por uma ou mais cadeias lipídicas covalentemente ligadas Figura 1017 exemplo 5 Ainda outras pro teínas de membrana estão totalmente expostas na superfície externa da célula ligada à bicamada lipídica somente por uma ligação covalente por meio de um oligossacarídeo específico à um lipídeo de ancoragem na monocamada externa da membrana plasmá tica Figura 1017 exemplo 6 As proteínas ligadas aos lipídeos no exemplo 5 da Figura 1017 são constituídas de proteínas solúveis no citosol e estão subsequentemente ancoradas às membranas por uma ligação covalente ao grupo lipídico Entretanto as proteínas do exemplo 6 são constituídas de proteínas que passam uma única vez pela membrana produzidas no RE Quando ainda no RE o segmento transmembrana da proteína é liberado por clivagem e uma âncora de glicosilfosfatidilinositol GPI é adicionada deixando a proteína ligada à superfície não citosólica da membrana do RE somente por essa âncora discutida no Capítulo 12 Finalmente as vesículas de transporte levam a proteína para a membrana plasmática discutido no capítulo 13 As proteínas associadas à membrana não se estendem para o interior hidrofóbi co da bicamada lipídica ao contrário desses exemplos elas ficam ligadas a uma das faces da membrana por meio de interações não covalentes com outras proteínas da membra na Figura 1017 exemplos 7 e 8 Muitas das proteínas deste tipo podem ser liberadas da membrana por procedimentos de extração suaves como a exposição a forças iônicas muito altas ou muito baixas ou a pH extremo que interferem nas interações proteína proteína mas deixam a bicamada lipídica intacta Essas proteínas normalmente são re feridas como proteínas periféricas de membrana As proteínas transmembrana e muitas proteínas mantidas na bicamada lipídica por grupos lipídicos ou regiões de polipeptíde os hidrofóbicos que se inserem no centro hidrofóbico da bicamada lipídica não podem ser liberadas dessa forma As âncoras lipídicas controlam a localização de algumas proteínas de sinalização na membrana O modo como as proteínas de membrana estão associadas à bicamada lipídica reflete a função da proteína Somente as proteínas transmembrana podem atuar nos dois lados COOH NH2 1 2 3 4 5 6 7 8 CITOSOL Bicamada lipídica P P Figura 1017 Várias maneiras pelas quais as proteínas se associam à bica mada lipídica Acreditase que a maioria das proteínas de membrana atravesse a bicamada como uma única ahélice 1 como múltiplas ahélices 2 ou como uma folha b um barril b 3 Algumas dessas proteínas de passagem única e passagem múltipla possuem cadeias de ácidos graxos covalentemente ligadas in seridas na monocamada lipídica citosólica 1 Outras proteínas de membrana estão expostas em apenas um lado da mem brana 4 Algumas delas estão ancoradas na superfície citosólica por uma ahélice anfifílica que divide a monocamada cito sólica da bicamada lipídica através da face hidrofóbica da hélice 5 Outras estão ligadas à bicamada apenas por uma cadeia lipídica covalentemente ligada uma ca mada de ácido graxo ou um grupo prenila ver Figura 1018 à monocamada cito sólica ou por meio de um oligossacarídeo ligante ao fosfatidilinositol à monocama da não citosólica denominado âncora de GPI 78 Finalmente proteínas associadas à membrana são ligadas à membrana so mente por interações não covalentes com outras proteínas da membrana A maneira como essa estrutura 5 é formada está ilustrada na Figura 1018 enquanto o modo como a âncora de GPI 6 é formada é mostrada na Figura 1252 Os detalhes de como as proteínas da membrana associamse à bicamada lipídica serão dis cutidos no Capítulo 12 578 PARTE IV Organização interna da célula da bicamada ou transportar moléculas através dela Os receptores de superfície celu lar por exemplo são geralmente proteínas transmembrana que ligam moléculas sina lizadoras do espaço extracelular e geram sinais intracelulares diferentes do lado oposto da membrana plasmática Para transferir uma pequena molécula hidrofílica através da membrana uma proteína de transporte de membrana deve proporcionar uma via para a molécula atravessar a barreira permeável hidrofóbica da bicamada lipídica A arquitetu ra molecular de proteínas que cruzam a membrana várias vezes Figura 1017 exemplos 2 e 3 é ideal para essa função como será discutido no Capítulo 11 Por outro lado proteínas que atuam em um único lado da bicamada lipídica com frequência estão associadas exclusivamente a um dos lados da monocamada lipídica ou a um domínio da proteína daquele lado Algumas proteínas de sinalização intracelular por exemplo que auxiliam na transmissão dos sinais extracelulares para o interior das células são ligadas à porção citosólica da membrana plasmática por um ou mais grupos lipídicos ligados covalentemente os quais podem ser cadeias de ácidos graxos ou grupos prenila Figura 1018 Em alguns casos o ácido mirístico um ácido graxo saturado de 14 carbonos é adicionado na porção Nterminal do grupo amino da proteína durante sua síntese em um ribossomo Todos os membros da família Src de tirosinascinase cito plasmáticas discutido no Capítulo 15 são miristoilados dessa forma A ligação à mem brana através de uma única âncora de lipídeo não é muito forte então um segundo grupo lipídico frequentemente é adicionado ancorando a proteína mais firmemente à membrana Para a maioria das cinases Src uma segunda modificação lipídica é a ligação de um ácido palmítico um ácido graxo saturado de 16 carbonos a uma cadeia lateral de cisteína da proteína Essa modificação ocorre em resposta a um sinal extracelular que auxilia a recrutar a cinase para a membrana plasmática Quando a via de sinalização é desligada o ácido palmítico é removido permitindo que a cinase volte ao citosol Outras proteínas de sinalização intracelular como as pequenas GTPases da família Ras discuti da no Capítulo 15 usam uma combinação de ligação de grupo prenila e ácido palmítico para recrutar as proteínas para a membrana plasmática Muitas proteínas se ligam temporariamente à membrana Algumas são as clássicas proteínas periféricas de membrana que se associam às membranas por interações regula das proteínaproteína Outras passam por uma transição de proteína solúvel para proteína de membrana por meio de uma alteração conformacional que expõe um peptídeo hidro fóbico ou lipídeo de ancoragem covalentemente ligado Muitas das pequenas GTPases da família de proteínas Rab que regulam o tráfego de membrana intracelular discutido no Capítulo 13 por exemplo mudam dependendo do nucleotídeo que está ligado à proteína No seu estado ligado à GDP elas são solúveis e livres no citosol ao passo que no seu es tado ligado à GTP sua âncora lipídica fica exposta e as prende nas membranas Em um H N C O S CH2 CH2 C O O CITOSOL Bicamada lipídica Ligação amida entre o grupo aminoterminal e o ácido mirístico Ligação tioéster entre uma cisteína e o grupo prenila Ligação tio éster entre uma cisteína e o grupo palmítico A B C O C O CH3 D Âncora miristoil C O O E Âncora palmitoil F Âncora farnesila C H CH2 S C O Figura 1018 Ligação de proteínas de membrana por meio de uma cadeia de ácido graxo ou de um grupo prenila A ligação covalente de um dos tipos de lipídeos pode auxiliar na localização de proteínas solúveis em água para a membra na após sua síntese no citosol A Uma das cadeias de ácido graxo ácido mirístico é ligada a uma glicina Nterminal por uma ligação amida B Uma cadeia de ácido graxo ácido palmítico é ligada por uma ligação tioéster a uma cisteína C Um grupo prenila farnesila ou um mais longo o geranilgeranila é ligado por uma ligação tioéster a um resíduo de cisteína inicialmente localizado a quatro resíduos da extremidade Cterminal da proteína Após a prenilação os três últimos aminoácidos são clivados e o novo Cterminal é metilado antes da inserção da âncora na membrana não mostrado A estrutura das âncoras lipídicas são apresentadas abaixo D uma âncora miristoil derivada de uma cadeia de ácido graxo saturado com 14 carbonos E uma âncora palmitoil uma cadeia de ácido graxo saturado com 16 carbonos e F uma âncora farnesila uma cadeia hidrocarbona da de 15 carbonos insaturados CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 579 momento elas são proteínas de membrana e no outro são proteínas solúveis Essas inte rações dinâmicas expandem muito o repertório das funções da membrana A cadeia polipeptídica cruza a bicamada lipídica em uma conformação de ahélice na maioria das proteínas transmembrana Uma proteína transmembrana sempre possui uma orientação única na membrana Isso reflete a maneira assimétrica como ela se insere na bicamada lipídica no RE durante sua biossíntese discutido no Capítulo 12 e as diferentes funções de seus domínios citosó licos e não citosólicos Esses domínios são separados por segmentos de cadeias poli peptídicas que atravessam a membrana os quais contatam o ambiente hidrofóbico da bicamada lipídica e são compostos principalmente por aminoácidos com cadeias late rais apolares Todas as ligações peptídicas da bicamada são dirigidas para a formação de ligações de hidrogênio pois as ligações peptídicas são polares e há ausência de água As ligações de hidrogênio entre as ligações peptídicas são maximizadas se a cadeia poli peptídica formar uma ahélice irregular na região que cruza a bicamada e esta é a forma como a maioria dos segmentos de cadeias polipeptídicas que cruzam a membrana atra vessam a bicamada Figura 1019 Nas proteínas transmembrana de passagem única a cadeia polipeptídica cru za apenas uma vez ver Figura 1017 exemplo 1 enquanto nas proteínas transmem brana de passagem múltipla a cadeia polipeptídica cruza a membrana várias vezes ver Figura 1017 exemplo 2 Uma alternativa para que as ligações peptídicas da bica mada lipídica supram suas necessidades de ligações de hidrogênio é o arranjo das ca deias polipeptídicas em múltiplas fitas transmembrana ordenadas como folhas b em forma de cilindro por isso denominadas barris b ver Figura 1017 exemplo 3 Essa arquitetura proteica é observada nas proteínas porinas que iremos discutir mais adiante O progresso da cristalografia por raios X de proteínas de membrana permitiu de terminar a estrutura tridimensional de muitas dessas proteínas As estruturas confirma ram que frequentemente é possível predizer a partir da sequência de aminoácidos da proteína qual parte da cadeia polipeptídica se estende através da bicamada lipídica Segmentos contendo 20 a 30 aminoácidos com alto grau de hidrofobicidade são longos o suficiente para atravessar a bicamada como uma ahélice e frequentemente podem ser identificados em gráficos de hidropatia Figura 1020 A partir desses gráficos estima Figura 1019 Segmento de uma cadeia polipeptídica que atravessa a membrana na bicamada lipídica como uma ahélice Está apresentado somente a cadeia princi pal de carbono a da cadeia polipeptídica com os aminoácidos hidrofóbicos em verde e amarelo O segmento polipeptídico mostrado é parte de um centro reativo fotossintético bacteriano cuja estrutura foi determinada por difração de raios X Dados baseados em J Deisenhofer et al Nature 318618624 1985 e H Michel et al EMBO J 51149 1158 1986 SER GLY HIS PHE ILE GLY PHE GLY PHE GLY GLY HIS ALA TYR CYS ALA ALA ALA LEU LEU THR 200 ESPAÇO EXTRACELULAR 220 CITOSOL Núcleo hidrofóbico da bicamada lipídica 0 Índice de hidropatia 0 Índice de hidropatia 0 50 100 Número de aminoácidos 0 100 200 Número de aminoácidos H2N COOH H2N COOH A GLICOFORINA B BACTERIORRODOPSINA 1 1 2 3 4 5 6 7 Figura 1020 Gráfico de hidropatia para localizar possíveis segmentos de ahélice em uma cadeia polipeptídica que atravessa a membrana A energia livre necessária para transferir segmentos sucessivos de uma cadeia polipeptídica de um solvente apolar para a água é calcula da a partir da composição de aminoácidos de cada segmento usandose os dados obtidos a partir de modelos compostos Esses cálculos são feitos para segmentos de um tamanho fixo normalmente cerca de 10 a 20 aminoácidos cada um deles iniciando no aminoácido imediatamente sucessivo da cadeia O índice de hidro patia do segmento é plotado no eixo Y como uma função de sua localização na cadeia Um valor positivo indica que existe a necessidade de energia livre para transferir o segmento para a água ie o segmento é hidrofóbico e o valor marcado é um índice da quantidade de energia necessária No índice de hidro patia aparecem picos nas regiões de segmentos hidrofóbicos da sequência de aminoácidos A e B Gráficos de hidropa tia para duas proteínas de membrana que serão apresentadas mais adiante neste capítulo A glicoforina A possui uma única ahélice que atravessa a membrana e um pico correspondente no gráfico de hidropatia A bacteriorrodopsina B possui sete ahélices transmembrana e sete picos correspondentes no gráfico de hidropatia A adaptada de D Eisenberg Annu Rev Biochem 53595624 1984 Com permis são de Annual Reviews 580 PARTE IV Organização interna da célula se que cerca de 30 das proteínas de um organismo sejam transmembrana enfatizando sua importância Os gráficos de hidropatia não podem identificar os segmentos trans membrana em forma de barril b pois 10 aminoácidos ou menos já são suficientes para atravessar a bicamada lipídica como uma fita b estendida e somente alguns aminoáci dos das cadeias laterais são hidrofóbicos A força para maximizar as ligações de hidrogênio na ausência de água significa que uma cadeia polipeptídica que entra na bicamada lipídica provavelmente passe inteira mente através dela antes de mudar de direção pois a flexão da cadeia requer a perda de interações regulares das ligações de hidrogênio As proteínas transmembrana de passa gem múltipla também podem conter regiões que se enovelam na membrana de qualquer lado encaixandose nos espaços entre as ahélices da membrana sem fazer contato com o centro hidrofóbico da bicamada lipídica Devido ao fato de tais regiões interagirem so mente com outras regiões polipeptídicas elas não precisam maximizar as ligações de hi drogênio e portanto podem formar várias estruturas secundárias incluindo hélices que se estendem somente parcialmente através da bicamada lipídica Figura 1021 Tais re giões são importantes para a função de algumas proteínas transmembrana incluindo as proteínas que formam os canais de água e canais iônicos cujas regiões contribuem para as paredes dos poros que atravessam a membrana e conferem a especificidade de subs trato nesses canais como discutido no Capítulo 11 Essas regiões não podem ser identifi cadas nos gráficos de hidropatia e são somente observadas por cristalografia de raios X ou cristalografia eletrônica uma técnica similar à difração de raios X mas realizada em um arranjo bidimensional de proteínas da estrutura tridimensional da proteína As ahélices transmembrana frequentemente interagem umas com as outras As ahélices transmembrana de muitas proteínas de membrana de passagem única não contribuem para o enovelamento dos domínios das proteínas nos dois lados da mem brana Como consequência frequentemente é possível planejar células para produzir apenas domínios citosólicos ou extracelulares dessas proteínas como moléculas solúveis em água Esta estratégia tem sido valiosa para o estudo das estruturas e funções desses domínios principalmente dos domínios das proteínas receptores transmembrana dis cutido no capítulo 15 Uma ahélice transmembrana mesmo de proteínas de passagem única frequentemente faz mais do que apenas ancorar a proteína à bicamada lipídica Muitas proteínas de uma única passagem transmembrana formam homo ou heterodí meros que são unidos por fortes interações não covalentes e altamente específicas entre as duas ahélices transmembrana A sequência de aminoácidos hidrofóbicos dessas hé lices contém a informação que coordena a interação proteínaproteína Igualmente as ahélices transmembrana nas proteínas transmembrana de passa gem múltipla ocupam posições específicas na estrutura enovelada da proteína que são determinadas pelas interações entre as hélices vizinhas Essas interações são cruciais para a estrutura e a função de muitos canais e transportadores que movem as moléculas através de membranas celulares Nessas proteínas hélices transmembrana vizinhas da estrutura enovelada da pro teína protegem muitas das outras hélices transmembrana dos lipídeos da membrana Por que então essas hélices protegidas são compostas principalmente por aminoácidos hi drofóbicos A resposta reside no modo pelo qual as proteínas de passagem múltipla estão integradas à membrana durante sua biossíntese Como discutiremos no Capítulo 12 as ahélices transmembrana são inseridas sequencialmente na bicamada lipídica por uma proteína translocadora Após deixar a translocadora cada hélice é transientemente circun dada por lipídeos o que requer que a hélice seja hidrofóbica É somente quando a proteína se enovela em sua estrutura final que ocorre o contato entre as hélices adjacentes e o con tato proteínaproteína substitui alguns dos contatos proteínalipídeo Figura 1022 Alguns barris b formam grandes canais As proteínas de passagem múltipla pela membrana que possuem seus segmentos trans membrana arranjados na forma de barris b e não na forma de ahélice são comparati C N Figura 1021 Duas ahélices curtas do canal de água aquaporina cada uma se estendendo somente até a metade da bicamada lipídica Na membrana plasmática quatro monômeros um dos quais está representado aqui formam um tetrâmero Cada monômero possui um poro hidrofílico em seu centro o que permite que as moléculas de água atravessem a membrana em uma única fila ver Figura 1120 e Animação 116 As duas pequenas hélices coloridas estão imersas em uma interface formada por in terações proteínaproteína O mecanismo pelo qual o canal permite a passagem de moléculas de água é discutido com mais detalhes no Capítulo 11 CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 581 vamente rígidas e portanto tendem a formar cristais facilmente quando isoladas Assim algumas delas estão entre as primeiras estruturas de proteínas de passagem múltipla transmembrana a serem determinadas por cristalografia de raios X O número de fitas nos barris b variam amplamente entre 8 e 22 fitas Figura 1023 As proteínas na forma de barris b são abundantes na membrana externa das bac térias mitocôndrias e cloroplastos Algumas são proteínas formadoras de poros os quais criam canais cheios de água permitindo que pequenas moléculas hidrofílicas seleciona das atravessem a membrana As porinas são exemplos bem estudados exemplo 3 da Fi gura 1023C Muitos barris de porinas são formados por 16 fitas antiparalelas de folhas b enroladas em uma estrutura cilíndrica As cadeias laterais de aminoácidos polares reves tem o canal aquoso na região interna enquanto as cadeias laterais apolares projetamse para o exterior do barril para interagirem com o centro hidrofóbico da bicamada lipídica As alças da cadeia polipeptídica frequentemente projetamse para o lúmen do canal es treitandoo de modo que somente determinados solutos podem passar Algumas porinas são portanto altamente seletivas a maltoporina por exemplo preferencialmente permi te que a maltose ou os oligômeros de maltose atravessem a membrana externa da E coli A proteína FepA é um exemplo mais complexo de uma proteína de transporte de barril b Figura 1023D Ela transporta íons ferro através da membrana externa bacte riana Ela é formada por 22 fitas b e um grande domínio globular que preenche com pletamente o interior do barril Os íons ferro se ligam a esse domínio por meio de um mecanismo desconhecido que move ou altera sua conformação para transferir o ferro através da membrana Nem todas as proteínas de barril b são proteínas de transporte Algumas formam pequenos barris completamente preenchidos por cadeias laterais de aminoácidos que se projetam para o centro Essas proteínas atuam como receptores ou enzimas Figu Figura 1022 Etapas do enovelamento de uma proteína transmembrana de passagem múltipla Quando uma ahélice transmembrana recémsintetizada é libera da na bicamada lipídica ela é inicialmente circundada por moléculas lipídicas Com o enovelamento da proteína o contato entre as hélices desloca algumas moléculas lipídi cas que circundam as hélices Proteína transmembrana de passagem múltipla recémsintetizada Proteína de membrana enovelada Bicamada lipídica OmpA 8 fitas OMPLA 12 fitas Porina 16 fitas 2 nm FepA 22 fitas PERIPLASMA ESPAÇO EXTRA CELULAR A B C D Bicamada lipídica Figura 1023 Barris b formados por diferentes números de fitas b A A proteína OmpA de E coli atua como um receptor para um vírus bacteriano B A proteína OMPLA de E coli é uma en zima uma lipase que hidrolisa moléculas lipídicas Os aminoácidos que catalisam a reação enzimática apresentados em ver melho projetamse para fora da superfície do barril C A porina da bactéria Rhodo bacter capsulatus forma um poro através da membrana repleto de água O diâmetro do canal é restrito pelas alças apresen tadas em azul que se posicionam para o interior do canal D A proteína FepA de E coli transporta íons ferro O interior do barril é preenchido por um domínio de uma proteína globular apresentada em azul que contém o sítio de ligação do íon ferro não mostrado CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 583 quados para atuar no processo de reconhecimento celular Como discutimos no Capí tulo 19 as lectinas ligadas à membrana plasmática que reconhecem oligossacarídeos específicos nas glicoproteínas e glicolipídeos da superfície celular medeiam diversos processos temporários de adesão célulacélula incluindo aqueles que ocorrem nas res postas inflamatórias e recirculação dos linfócitos ver Figura 1928 As proteínas de membrana podem ser solubilizadas e purificadas em detergentes Em geral somente os agentes que rompem as associações hidrofóbicas e destroem a bi camada lipídica podem solubilizar proteínas de membrana Os agentes mais úteis entre eles são os detergentes que são pequenas moléculas anfifílicas de estrutura variável Animação 104 Os detergentes são mais solúveis em água do que os lipídeos Suas extremidades polares hidrofílicas podem ser carregadas iônicas como no dodecil sulfato de sódio SDS sodium dodecyl sulfate ou não carregadas não iônicas como no octilglicosídeo e no Triton Figura 1026A Em baixas concentrações os detergentes são monoméricos em solução mas quando suas concentrações são aumentadas acima do limiar o que é denominado concentração micelar crítica CMC eles se agregam forman do micelas Figura 1026BD Acima da CMC as moléculas de detergente difundemse de forma rápida para dentro e para fora das micelas mantendo a concentração do mo nômero em solução constante independentemente do número de micelas presentes Tanto a CMC quanto o número médio de moléculas de detergente em uma micela são propriedades características de cada detergente mas também dependem da tempera tura do pH e da concentração de sais As soluções de detergente são portanto sistemas complexos e difíceis de serem estudados Figura 1025 A camada de carboidrato da superfície celular A Esta micrografia eletrônica da superfície de um linfócito corado com vermelho de rutênio enfatiza a espessa camada rica em carboidrato que reveste a célula B A camada de carboi drato é formada pelas cadeias laterais dos oligosssacarídeos dos glicolipídeos e das glicoproteínas de membrana e das cadeias de polissacarídeos dos proteoglicanos da membrana Além disso as glicoproteínas e os proteoglicanos adsorvidos não mos trados contribuem para a camada de car boidratos em muitas células Observe que todos os carboidratos estão na superfície não citosólica da membrana A cortesia de Audrey M Glauert e GMW Cook Camada de carboidrato Citosol Núcleo Membrana plasmática 200 nm Bicamada lipídica Camada de carboidrato resíduo de açúcar Glicoproteína transmembrana Glicoproteína adsorvida Glicolipídeo Proteoglicano transmembrana CITOSOL A B CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 585 a remoção dos lipídeos mas não desenovelam as proteínas Se a concentração de deter gente de uma solução de proteínas de membrana solubilizadas é reduzida p ex por diluição as proteínas de membrana não permanecem solúveis Na presença de um ex cesso de moléculas de fosfolipídeos em tal solução contudo as proteínas de membrana incorporamse em pequenos lipossomos que se formam espontaneamente Dessa for ma sistemas de proteínas de membrana funcionalmente ativas podem ser reconstituí dos de componentes purificados proporcionando um poderoso meio para a análise da atividade dos transportadores de membrana canais iônicos receptores de sinalização e assim por diante Figura 1028 Tal reconstituição funcional por exemplo fornece pro vas da hipótese de que as enzimas que produzem ATP ATP sintase usam os gradientes de H nas mitocôndrias cloroplastos e membranas bactérias para produzir ATP Figura 1027 Solubilização de uma proteína de membrana com um deter gente não iônico suave O detergente rompe a bicamada lipídica e solubiliza as proteínas como complexos detergente lipídeoproteína Os fosfolipídeos da membrana também são solubilizados pelo detergente como as micelas detergente lipídeo Micelas detergente lipídeo solúveis em água Complexo detergentelipídeoproteína solúvel em água Proteína de membrana na bicamada lipídica Monômeros de detergente Micelas de detergente Cauda hidrofóbica Cabeça hidrofílica Figura 1028 Uso de detergentes não iônicos suaves para solubilizar purifi car e reconstituir sistemas de proteínas de membranas funcionais Neste exem plo as moléculas da bomba de Na K são purificadas e incorporadas em vesículas de fosfolipídeos Essa bomba está presente na membrana plasmática da maioria das células animais onde usa a energia da hidrólise do ATP para expulsar o Na da célula e deixar o K entrar como discutido no Capítulo 11 Bomba de NaK Bicamada lipídica Micelas de detergente monômeros Proteínas de membrana solubilizadas Micelas detergentelipídeo Micelas de detergente monômeros ADIÇÃO DE FOSFOLIPÍDEOS misturados com detergente REMOÇÃO DO DETERGENTE Bomba de NaK funcional incorporada na vesícula do fosfolipídeo PURIFICAÇÃO DA BOMBA DE NaK CITOSOL ATP ADP Na K 586 PARTE IV Organização interna da célula As proteínas de membrana também podem ser reconstituídas a partir de detergen te em solução em nanodiscos que são pequenos segmentos de membrana de tamanho uniforme circundados por um cinturão de proteínas que cobre as bordas expostas da bicamada para manter o segmento em solução Figura 1029 O cinturão é derivado de lipoproteínas de alta densidade HDLs que mantêm os lipídeos solúveis para o trans porte no sangue Nos nanodiscos as proteínas de membrana de interesse podem ser estudadas em seu ambiente lipídico natural e fica acessível nos dois lados da bicamada o que é útil por exemplo para os experimentos com a ligação de ligantes As proteínas dos nanodiscos também podem ser analisadas por microscopia eletrônica de partícu las únicas para determinar sua estrutura Por meio dessa técnica que está sendo rapida mente aprimorada discutida no Capítulo 9 a estrutura de uma proteína de membrana pode ser determinada em alta resolução sem a necessidade de cristalizar a proteína de interesse em um padrão regular o que normalmente é difícil de se obter para proteínas de membrana Os detergentes também desempenham um papel crucial na purificação e na cris talização de proteínas de membrana O desenvolvimento de novos detergentes e novos sistemas de expressão que produzem grandes quantidades de proteínas de membrana a partir de clones de cDNA levou ao rápido aumento do número de estruturas tridi mensionais de membrana e proteínas de membrana conhecidos embora ainda sejam poucos quando comparados com as estruturas conhecidas dos complexos de proteínas e proteínas solúveis em água A bacteriorrodopsina é uma bomba de prótons H dirigida por luz que atravessa a bicamada lipídica como sete ahélices No Capítulo 11 consideraremos como as proteínas de membrana de passagem múltipla medeiam o transporte seletivo de pequenas moléculas hidrofílicas através da membra na celular No entanto o entendimento detalhado de como a proteína de transporte de membrana atua requer uma informação precisa sobre sua estrutura tridimensional na bicamada A bacteriorrodopsina foi a primeira proteína de transporte de membrana cuja estrutura foi determinada e permanece o protótipo de muitas proteínas de multipassa gem pela membrana com estrutura similar A membrana púrpura da arqueia Halobacterium salinarum é uma região espe cializada da membrana plasmática que contém uma única espécie de molécula proteica a bacteriorrodopsina Figura 1030A A proteína atua como uma bomba de H ativada pela luz que transfere H para fora da célula da arqueia Como as moléculas da bacterior rodopsina são densamente empacotadas e organizadas como um cristal bidimensional planar Figura 1030B e C foi possível determinar sua estrutura tridimensional combi nando a microscopia eletrônica com a análise da difração eletrônica um procedimento denominado cristalografia de elétrons mencionado anteriormente Esse método tem Figura 1029 Modelo de uma proteína de membrana reconstituída em nano disco Quando o detergente é removido de uma solução contendo proteínas de passagem múltipla na membrana lipídeos e uma subunidade proteica da lipoproteína de alta densidade HDL as proteínas da membrana tornamse embebidas em uma pequena mancha da bicamada lipídica que é circundada por um cinturão da pro teína HDL Nesses nanodiscos as bordas hidrofóbicas da mancha da bicamada são protegidas por esse cinturão de proteínas que os torna solúveis em água Cinturão de lipoproteína de alta densidade Fosfolipídeos Nanodisco 5 nm Proteína de membrana no nanodisco CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 587 permitido visualizar as primeiras estruturas de muitas proteínas de membrana que eram difíceis de cristalizar a partir de soluções com detergentes Depois disso a estrutura da bacteriorrodopsina foi confirmada e aprimorada para altíssima resolução por cristalo grafia de raios X Cada molécula de bacteriorrodopsina é enovelada em sete ahélices transmembra na bastante próximas e contém um único grupo de absorção de luz ou cromóforo neste caso o retinal que confere a cor púrpura à proteína O retinal é a vitamina A na forma de aldeído idêntico ao cromóforo encontrado na rodopsina das células fotorreceptoras dos olhos dos vertebrados discutido no Capítulo 15 O retinal está covalentemente ligado à cadeia lateral de uma lisina da proteína bacteriorrodopsina Quando ativado por um único fóton de luz o cromóforo excitado muda sua forma e causa uma série de mudanças conformacionais na proteína resultando na transferência de um H do interior para o exterior da célula Figura 1031A Sob luz intensa cada molécula de bacteriorrodopsina pode bombear várias centenas de prótons por segundo A transferência de prótons esti mulada pela luz estabelece um gradiente de H através da membrana plasmática que por sua vez estimula a produção de ATP por uma segunda proteína da membrana plasmática da célula A energia armazenada no gradiente de H também conduz outros processos que requerem energia na célula Assim a bacteriorrodopsina converte a energia solar em um gradiente de prótons o qual fornece energia para a arqueia A estrutura cristalina de alta resolução da bacteriorrodopsina revelou muitas mo léculas lipídicas ligadas em locais específicos na superfície da proteína Figura 1031B ESPAÇO EXTRA CELULAR Centro hidrofóbico da bicamada lipídica 3 nm A CITOSOL Retinal ligado a uma lisina HOOC H H NH2 4 5 2 3 1 B Manchas de moléculas de bacteriorrodopsina Molécula única de bacteriorrodopsina A B D C 50 nm 1 nm Figura 1030 Manchas da membrana púrpura a qual contém bacteriorro dopsina na arqueia Halobacterium salinarum A Essas arqueias vivem em poças de água salgada onde estão expostas à luz solar Elas desenvolveram uma variedade de proteínas ativadas pela luz incluindo a bacteriorrodopsina a qual é uma bomba de H da membrana plas mática ativada pela luz B As moléculas de bacteriorrodopsina das manchas da membrana púrpura são bem empacotadas em arranjos cristalinos bidimensionais C Detalhe da superfície de moléculas visua lizado por microscopia de força atômica Com essa técnica podemse observar as moléculas de bacteriorrodopsina indivi duais D Esboço da localização aproxima da do monômero de bacteriorrodopsina e das ahélices na imagem apresentada em C BC cortesia de Dieter Oesterhelt D PDB código 2BRD Figura 1031 Estrutura tridimensional da molécula de bacteriorrodopsina Animação 105 A A cadeia polipep tídica atravessa a bicamada lipídica sete vezes como uma ahélice São mostrados a localização do cromóforo retinal roxo e o provável caminho percorrido pelos H durante o ciclo de bombeamento ativado pela luz A primeira e fundamental etapa é a passagem do H do cromóforo pela cadeia lateral do ácido aspártico 85 ver melho localizado adjacente ao cromóforo que ocorre quando da absorção de um fóton pelo cromóforo Subsequentemente outras transferências de H indicadas em ordem numérica e utilizando as cadeias la terais dos aminoácidos hidrofílicos que for mam uma passagem através da membra na completam o ciclo de bombeamento e a enzima retorna ao seu estado inicial Código de cores ácido glutâmico laranja ácido aspártico vermelho arginina azul B Estrutura cristalina em alta resolução da bacteriorrodopsina mostra muitas molé culas de lipídeos amarelo com as cabeças vermelhas que estão fortemente ligadas a locais específicos na superfície da proteína A adaptada de H Luecke et al Science 286255261 1999 Com permissão de AAAS B de H Luecke et al J Mol Biol 291899911 1999 Com permissão de Academic Press 588 PARTE IV Organização interna da célula Acreditase que interações com lipídeos específicos auxiliem a estabilizar muitas proteí nas de membrana as quais atuam melhor e às vezes cristalizam mais facilmente se al guns dos lipídeos permanecem ligados durante a extração com detergente ou se lipídeos específicos são novamente adicionados à proteína nas soluções com detergente A espe cificidade dessas interações proteínalipídeo explica por que as membranas eucarióticas contêm tal variedade de lipídeos com as cabeças diferindo em tamanho forma e carga Podemos imaginar os lipídeos de membrana como constituindo um solvente bidimen sional para as proteínas na membrana assim como a água é o solvente tridimensional para as proteínas em solução aquosa Algumas proteínas de membrana podem atuar so mente na presença de grupos específicos de cabeças lipídicas assim como muitas enzi mas em soluções aquosas precisam de um determinado íon para sua atividade A bacteriorrodopsina é um membro de uma grande superfamília de proteínas de membrana com estruturas semelhantes mas funções e orientações distintas Por exemplo a rodopsina nos bastonetes da retina de vertebrados e de muitas proteínas receptoras de superfície celular que ligam moléculas sinalizadoras extracelulares também são compostas por sete ahélices transmembrana Essas proteínas atuam como transdutoras de sinais ao invés de transportadoras cada uma responde a um sinal extracelular pela ativação de uma proteína de ligação ao GTP proteína G no interior da célula e portanto são chamadas re ceptores acoplados à proteína G GPCRs Gproteincoupled receptors como será discutido no Capítulo 15 ver Figura 156B Embora as estruturas da bacteriorrodopsina e dos GPCRs sejam muito similares eles não apresentam similaridade em sua sequência e provavel mente pertencem a dois ramos evolutivamente distintos de uma família proteica ancestral Uma classe de proteínas de membrana relacionadas as rodopsinas de canais que as algas verdes utilizam para detectar formam canais iônicos quando absorvem um fóton Quando projetadas para serem expressas no cérebro de animais elas tornamse ferramentas valio sas na neurobiologia porque permitem que neurônios específicos sejam estimulados expe rimentalmente ao serem iluminados como veremos no Capítulo 11 Figura 1132 As proteínas de membrana frequentemente atuam como grandes complexos Muitas proteínas de membrana atuam como parte de complexos com múltiplos compo nentes muitos dos quais tem sido estudado por cristalografia de raios X Um deles é o centro de reação fotossintética bacteriano que foi o primeiro complexo de proteínas de membrana a ser cristalizado e analisado por difração de raios X No Capítulo 14 discutiremos como tal complexo fotossintético atua para capturar a energia da luz usandoa para bombear pró tons através da membrana Muitos dos complexos proteicos de membrana envolvidos na fotossíntese na bomba de prótons e no transporte de elétrons são centros de reação ainda maiores do que o fotossintético O enorme complexo fotossistema II da cianobactéria por exemplo contém 19 subunidades proteicas e mais de 60 hélices transmembrana ver Figura 1449 As proteínas de membrana são frequentemente organizadas em grandes comple xos não somente para captar várias formas de energia mas também para a transdução de sinais extracelulares em sinais intracelulares discutido no Capítulo 15 Muitas proteínas de membrana difundemse no plano da membrana Como a maioria dos lipídeos de membrana as proteínas de membrana não saltam flip flop através da bicamada lipídica mas giram sobre um eixo perpendicular ao plano da bicamada difusão rotacional Além disso muitas proteínas de membrana são capazes de se mover lateralmente dentro da membrana difusão lateral A primeira evidência direta de que algumas proteínas de membrana plasmática se movem no plano da mem brana é decorrente de um experimento com células de camundongos artificialmente fusionadas com células humanas para produzir células híbridas heterocariontes Dois anticorpos marcados diferentemente foram usados para distinguir proteínas selecio nadas da membrana plasmática de camundongo e humana Apesar de inicialmente as proteínas de camundongo e humanas estarem confinadas às suas próprias metades no heterocarionte recémformado os dois conjuntos de proteínas se difundiram e se mis turaram em toda a superfície da célula em aproximadamente meia hora Figura 1032 CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 589 As taxas de difusão lateral das proteínas de membrana podem ser medidas utilizan dose a técnica de recuperação da fluorescência após fotoclareamento FRAP fluorescence recovery after photobleaching O método normalmente envolve a marcação da proteína de membrana de interesse com um grupamento fluorescente específico Isso pode ser feito tanto com um ligante fluorescente como um anticorpo marcado com um fluoróforo que se liga à proteína de interesse quanto com a tecnologia do DNA recombinante para expressar a proteína fusionada a uma proteína fluorescente como a proteína verde fluorescente GFP green fluorescent protein discutido no Capítulo 9 Então o grupamento fluorescente é clareado em uma pequena área da membrana por um feixe de laser e medese o tempo que as proteínas de membrana adjacentes carregando ligantes não clareados ou a GFP levam para se difundir para dentro da área clareada Figura 1033 A partir das análises por FRAP podemos estimar o coeficiente de difusão de uma proteína de superfície celular marcada As medições de proteínas cuja difusão seja minimamente impedida indicam que as membranas celulares possuem uma viscosidade semelhante ao azeite de oliva Uma desvantagem da técnica de FRAP é que ela monitora o movimento de gran des populações de moléculas em uma área relativamente grande da membrana e não é possível seguir moléculas de proteínas individuais Por exemplo se a proteína não mi gra para a área clareada não é possível afirmar se a molécula é imóvel ou se seus mo vimentos estão restritos a uma pequena região da membrana talvez por proteínas do citoesqueleto Técnicas de rastreamento de uma única partícula resolvem esse proble ma marcando moléculas de membrana individuais com anticorpos ligados a corantes fluorescentes ou a pequenas partículas de ouro e seguindo seu movimento por vídeo microscopia Utilizandose o rastreamento de uma única partícula podese registrar a via de difusão de uma única molécula de proteína de membrana por um determinado período de tempo Os resultados obtidos usandose todas estas técnicas indicaram que as proteínas de membrana plasmática diferem amplamente com relação a suas caracte rísticas de difusão como veremos a seguir Célula híbrida recémfusionada Difusão das proteínas plasmáticas da membrana com o tempo Proteínas da célula de camundongo Proteínas da célula humana Figura 1032 Experimento demons trando a mistura de proteínas da membrana plasmática em células híbri das de camundongohumanas Neste experimento uma célula humana e uma célula de camundongo são fusionadas para criar uma célula híbrida que foi corada com dois anticorpos marcados com fluoróforos Um anticorpo marcado com corante verde detecta proteína da membrana plasmática de camundongo e o outro anticorpo marcado com corante vermelho detecta proteínas da membrana plasmática humana Quando as células são coradas imediatamente após a fusão as proteínas da membrana plasmática humana e de camundongos ainda estão nos domínios originais da célula humana e de camundongo respectivamente Entre tanto após um curto período as proteínas da membrana plasmática se difundem por toda a superfície celular e se misturam completamente De LD Frye e M Edidi ne J Cell Sci 7319335 1970 Com per missão de The Company of Biologists Figura 1033 Medindo a taxa de difusão lateral de uma proteína de membrana por recuperação da fluorescência após clareamento Uma proteína de interesse específica pode ser expressa como uma proteína de fusão com a proteína verde fluorescente GFP que é intrinsecamente fluorescente As molé culas fluorescentes são clareadas em uma pequena área usando um feixe de laser A intensidade da fluorescência é recupe rada à medida que as moléculas clareadas difundemse para fora e as moléculas não clareadas difundemse para dentro da área irradiada aqui apresentadas como uma vista lateral e superior O coeficiente de difusão é calculado com base em um gráfico da taxa de recuperação quanto maior o coeficiente de difusão da proteína de membrana mais rápida a recuperação Animação 106 CLAREAMENTO COM UM FEIXE DE LASER RECUPERAÇÃO CLAREAMENTO RECUPERAÇÃO Tempo Fluorescência na área clareada Área clareada 590 PARTE IV Organização interna da célula As células podem confinar proteínas e lipídeos em domínios específicos em uma membrana O reconhecimento de que as membranas biológicas são fluidos bidimensionais foi o principal avanço para o entendimento da estrutura e da função das membranas En tretanto ficou claro que a descrição da membrana como um grande mar de lipídeos onde todas as proteínas flutuam livremente é extremamente simplificada A maioria das células confinam as proteínas de membrana em regiões específicas na bicamada lipí dica contínua Já discutimos como as moléculas de bacteriorrodopsina da membrana púrpura da Halobacterium se organizam em grandes cristais bidimensionais nos quais as moléculas de proteínas individuais estão relativamente fixas umas às outras ver Fi gura 1030 Os complexos das ATP sintases da membrana mitocondrial interna também se associam em longas linhas duplas como veremos no Capítulo 14 ver Figura 1432 Grandes agregados desse tipo se difundem lentamente Em células epiteliais como aquelas que revestem o intestino ou os túbulos renais determinadas enzimas e proteínas de transporte da membrana plasmática estão con finadas na superfície apical da célula enquanto outras estão confinadas na superfície lateral e basal Figura 1034 Essa distribuição assimétrica das proteínas de membrana frequentemente é essencial para as funções do epitélio como será discutido no Capítu lo 11 ver Figura 1111 A composição de lipídeos desses dois domínios de membrana também é diferente demonstrando que as células epiteliais podem impedir a difusão dos lipídeos e de moléculas de proteína entre os domínios Acreditase que as barreiras formadas por um tipo específico de junção intercelular denominada junção compacta discutida no Capítulo 19 ver Figura 1918 mantenham a separação das moléculas de proteína e de lipídeos Claramente as proteínas de membrana que formam essas jun ções intercelulares não podem se difundir lateralmente nas membranas que interagem Uma célula também pode criar domínios de membrana sem usar as junções inter celulares Como já vimos acreditase que a regulação das interações proteínaproteína na membrana cria domínios de balsas em nanoescala que atuam na sinalização e tráfe go de membrana Um exemplo extremo é observado no espermatozoide de mamíferos uma célula única formada por várias partes distintas estrutural e funcionalmente cober ta por uma membrana plasmática contínua Quando um espermatozoide é examinado por meio de microscopia de fluorescência com vários anticorpos cada um reagindo com uma determinada molécula da superfície observase que a membrana consiste em pelo menos três domínios distintos Figura 1035 Algumas das moléculas da membrana são capazes de se difundir livremente dentro dos limites do seu próprio domínio A nature za molecular da barreira que impede que as moléculas deixem seus domínios não é conhecida Várias outras células possuem barreiras similares na membrana que restrin Lâmina basal Proteína B Junção compacta Proteína A Membrana plasmática apical Membrana plasmática lateral Membrana plasmática basal Figura 1034 Como as moléculas de membrana podem estar restritas a um determinado domínio de membrana Nesta representação de uma célula epitelial a proteína A no domínio apical da membrana plasmá tica e a proteína B nos domínios laterais e basais podem se difundir lateralmente em seu próprio domínio mas são impedidas de entrarem nos outros domínios pelo menos parcialmente devido às junções especializadas célulacélula denominadas junções compactas As moléculas de lipídeos da monocamada externa da membrana plasmática extracelular são igualmente capazes de se difundir entre os dois domínios entretanto os lipídeos na monocamada interna citosólica são capazes de fazêlo não mostrado A lâmina basal é um fino tapete de matriz extracelular que separa as camadas epiteliais dos outros tecidos discutido no Capítulo 19 594 PARTE IV Organização interna da célula 1 Algumas inserem domínios proteicos hidrofóbicos ou ligam âncoras lipídicas em um dos folhetos da bicamada lipídica O aumento da área de somente um dos fo lhetos da bicamada causa uma curvatura na membrana Figura 1040B Acre ditase que as proteínas que moldam a sinuosa rede dos estreitos túbulos do RE atuem dessa maneira 2 Algumas proteínas de curvatura da membrana formam rígidos arcabouços que de formam a membrana ou estabilizam uma membrana já curvada Figura 1040C As proteínas de revestimento que moldam as vesículas que brotam no transporte intracelular pertencem a essa classe 3 Algumas proteínas de curvatura da membrana causam agregação dos lipídeos de membrana induzindo uma curvatura A capacidade de um lipídeo em induzir uma curvatura positiva ou negativa na membrana é determinada por áreas relativamen te transversais de seus grupamentos de cabeça e suas caudas hidrocarbonadas Por exemplo o grande grupamento de cabeça dos fosfoinositídeos torna essas molécu las lipídicas em forma de cunha e seu acúmulo em um domínio de um folheto da bicamada e portanto induzindo a curvatura positiva Figura 1040D Ao contrário as fosfolipases que removem os grupamentos das cabeças lipídicas produzem uma forma inversa induzindo uma curvatura negativa Com frequência diferentes proteínas de curvatura da membrana contri buem para atingir uma determinada curvatura como no modelamento das vesí culas de transporte em brotamento como veremos no Capítulo 13 Resumo Enquanto a bicamada lipídica determina a estrutura básica das membranas biológicas as proteínas são responsáveis pela maioria das funções da membrana servindo como receptores específicos enzimas transportadores e assim por diante As proteínas transmembrana atra vessam a bicamada lipídica Algumas dessas proteínas de membrana são proteínas de passa gem única nas quais a cadeia polipeptídica atravessa a bicamada como uma única ahélice Outras são proteínas de passagem múltipla nas quais a cadeia polipeptídica cruza a bicama da múltiplas vezes seja como uma série de ahélices ou como folhas b arranjadas na forma de um barril Todas as proteínas responsáveis pelo transporte de íons e de pequenas moléculas solúveis em água pela membrana são de passagem múltipla Algumas proteínas de membra na não atravessam a bicamada mas se ligam em um dos lados da membrana Algumas es tão ligadas na porção citosólica por uma ahélice anfipática na proteína de superfície ou por uma ligação covalente de uma ou mais cadeias lipídicas outras estão ligadas na porção não citosólica por uma âncora GPI Algumas proteínas associadas à membrana estão ligadas por meio de interações não covalentes com as proteínas transmembrana Na membrana plasmá tica de todas as células eucarióticas a maioria das proteínas expostas na superfície celular e algumas moléculas de lipídeos da monocamada externa possuem cadeias de oligossacarídeos covalentemente ligadas a elas Como as moléculas de lipídeo da bicamada muitas proteínas de membrana são capazes de se difundir rapidamente no plano da membrana Entretanto as células possuem maneiras de imobilizar proteínas específicas da membrana bem como formas de manter confinadas tanto as proteínas da membrana quanto as moléculas lipídicas em domínios específicos na bicamada lipídica contínua A associação dinâmica das proteínas de curvatura da membrana conferem suas características e formas tridimensionais B A C D Figura 1040 Três maneiras pelas quais as membranas são moldadas pelas proteínas de curvatura da membrana As bicamadas lipídicas estão em cinza e as proteínas em verde A Bicamada sem proteína ligada B Uma região hidrofóbica da proteína pode se inserir como uma cunha em uma monocamada separando os grupamentos das cabeças lipídicas Tais regiões podem ser hélices anfifílicas como apresentado na figura ou grampos hidrofóbicos C A superfície curva de proteínas pode se ligar aos grupamentos das cabeças lipídicas e de formar a membrana ou estabilizar a curvatura D Uma proteína pode se ligar a um grupo de lipídeos que possuem grupamentos de cabeças grandes portanto dobrando a membrana Adaptada de WA Prinz e JE Hinshaw Crit Rev Biochem Mol Biol 44278291 2009 o QuE NÃo SABEMoS Devido à alta complexidade da composição lipídica das membra nas celulares quais são as varia ções das diferentes membranas das organelas das células animais Quais são as consequências fun cionais dessas diferenças e qual a função das espécies de lipídeos menos frequentes A tendência biofísica dos lipídeos é de se dividirem em fases sepa radas dentro da bicamada lipídi ca funcionalmente utilizada nas membranas celulares Se sim como isso é regulado e quais fun ções da membrana são controla das Como as moléculas lipídicas espe cíficas se associam com as proteí nas de membrana para regular sua função Considerando que foram deter minadas as estruturas de apenas uma pequena fração de todas as proteínas de membrana que novos princípios da estrutura de membranas ainda precisam ser descobertos CAPíTulo 10 Estrutura da membrana 595 TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 101 Embora as moléculas lipídicas sejam livres para se di fundirem no plano da bicamada elas não podem girar flip flop através da bicamada a não ser que enzimas catalisado ras denominadas translocadoras de fosfolipídeos estejam presentes na membrana 102 Todos os carboidratos da membrana plasmática po sicionamse para fora da superfície externa da célula e todos os carboidratos da membrana interna posicionamse para o citosol 103 Embora os domínios de membrana sejam bem conhe cidos não há exemplos até o momento de domínios de mem brana que se diferenciem em sua composição de lipídeos Discuta as questões a seguir 104 Quando a bicamada lipídica é rompida por que ela não se recupera formando uma hemimicela protegendo suas extremidades como mostra a Figura Q101 Rompimento na bicamada Proteção com hemimicela Figura Q101 Rompimento da bicamada lipídica fechado com uma possível proteção de hemimicela 105 A margarina é produzida com óleo vegetal por um processo químico Você acredita que esse processo conver ta ácido graxo saturado em ácido graxo insaturado ou vice versa Justifique sua resposta 106 Se uma balsa lipídica normalmente possui 70 nm de diâmetro e cada molécula lipídica possui um diâmetro de 05 nm quantas moléculas lipídicas deverão estar presen tes em uma balsa lipídica composta somente por lipídeos A uma taxa de 50 moléculas lipídicas por molécula de proteína 50 de proteína por massa quantas proteínas deverão es tar presentes em uma balsa lipídica típica Ignore a perda de lipídeos da balsa necessária para acomodar as proteínas 107 As proteínas de membrana monoméricas de pas sagem única atravessam a membrana como uma única ahélice que possui propriedades químicas característi cas na região da bicamada Qual das três sequências de 20 aminoácidos descritas a seguir é a candidata mais provável para tal segmento de membrana Explique a razão da sua escolha Ver no final do livro o código de uma letra para os aminoácidos FAMILY VW é um mnemônico conveniente para os aminoácidos hidrofóbicos A I T L I Y F G V M A G V I G T I L L I S B I T P I Y F G P M A G V I G T P L L I S C I T E I Y F G R M A G V I G T D L L I S 108 Você está estudando a ligação das proteínas na por ção citoplasmática de células cultivadas de neuroblastoma e encontrou um método que fornece uma boa quantidade de vesículas do avesso da membrana plasmática Infelizmen te sua preparação estava contaminada com quantidades variáveis de vesículas da forma normal Nada que você tenha tentado evitou esse problema Um amigo sugeriu que você passasse suas vesículas em uma coluna de afinidade consti tuída por lectina ligada a contas sólidas Qual a razão para a sugestão de seu amigo 109 A glicoporina uma proteína da membrana plasmá tica dos eritrócitos existe normalmente como um homodí mero unido por interações entre seus domínios transmem brana Como os domínios transmembrana são hidrofóbicos como podem se associar entre si tão especificamente 1010 Três mecanismos pelos quais as proteínas que se li gam à membrana curvam a membrana estão ilustrados na Figura Q102A B e C Como apresentado cada uma dessas proteínas citosólicas de curvatura da membrana irão induzir uma invaginação na membrana plasmática Tipos similares de proteínas citosólicas podem induzir uma protrusão da membrana plasmática Figura Q102D Quais Explique como elas atuam A B C D CITOSOL ESPAÇO EXTRACELULAR Protrusão Figura Q102 A curvatura da membrana plasmática pelas proteínas citosó licas A Inserção de um dedo da proteína no folheto citosólico da mem brana B A ligação dos lipídeos na superfície curvada de uma proteína de ligação à membrana C A ligação de proteínas de membrana aos lipídeos da membrana com grupamentos de cabeças grandes D Segmento da membrana plasmática mostrando uma protrusão 596 PARTE IV Organização interna da célula REFERÊNCIAS Gerais Bretscher MS 1973 Membrane structure some general principles Science 181 622629 Edidin M 2003 Lipids on the frontier a century of cellmembrane bilayers Nat Rev Mol Cell Biol 4 414418 Goñi FM 2014 The basic structure and dynamics of cell membranes an update of the SingerNicolson model Biochim Biophys Acta 1838 14671476 Lipowsky R 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No entanto para fazer uso dessa barreira as células tiveram que desenvolver meios para transferir moléculas hidrossolúveis específicas e íons atra vés das suas membranas para ingerir nutrientes essenciais excretar produtos metabóli cos tóxicos e regular concentrações intracelulares de íons As células utilizam proteínas de transporte de membrana especializadas para desempenhar tais funções A importân cia do transporte de pequenas moléculas é evidenciada pelo grande número de genes existente em todos os organismos que codificam as proteínas envolvidas no transporte através da membrana correspondendo a 15 a 30 das proteínas de membrana em todas as células Algumas células de mamíferos como neurônios e células renais empregam até dois terços de seu consumo de energia metabólica nesses processos de transporte As células também podem transferir macromoléculas ou mesmo grandes partícu las através de suas membranas mas os mecanismos envolvidos na maioria desses casos são diferentes daqueles usados para transferir pequenas moléculas sendo discutidos nos Capítulos 12 e 13 Começamos este capítulo examinando alguns princípios gerais de como pequenas moléculas hidrossolúveis atravessam membranas celulares A seguir consideraremos uma de cada vez as duas principais classes de proteínas de membrana que medeiam esse tráfego transmembrana transportadoras que sofrem alterações sequenciais de conformação para o transporte de moléculas pequenas específicas através das membra nas e de canal que formam poros estreitos que permitem o movimento passivo trans membrana predominantemente de água e de pequenos íons inorgânicos Proteínas transportadoras podem estar acopladas a uma fonte de energia para catalisar transporte ativo que junto à permeabilidade passiva seletiva gera grandes diferenças na compo sição do citosol quando comparada à composição dos fluidos extra ou intracelulares Tabela 111 ou dos fluidos existentes no interior das organelas delimitadas por mem brana Pelo fato de gerarem diferenças na concentração iônica inorgânica através da bi camada lipídica as membranas celulares podem armazenar energia potencial na forma de gradientes eletroquímicos os quais são utilizados para acionar vários processos de transporte para enviar sinais elétricos em células eletricamente excitáveis e nas mito côndrias nos cloroplastos e nas bactérias para produzir a maior parte do ATP celular Concentraremos nossa discussão sobretudo no transporte através da membrana plas mática mas mecanismos semelhantes operam através das outras membranas das célu las eucarióticas como discutido em capítulos subsequentes Na última parte do capítulo concentramonos principalmente nas funções dos ca nais iônicos em neurônios células nervosas Nessas células os canais proteicos se en contram em seu mais alto nível de sofisticação permitindo o estabelecimento das redes de neurônios que levam a cabo todas as impressionantes tarefas das quais seu cérebro é capaz PRINCÍPIOS DO TRANSPORTE DE MEMBRANA Começamos esta seção descrevendo as propriedades das permeabilidade das bicama das lipídicas sintéticas livres de proteínas A seguir apresentamos alguns dos termos 598 PARTE IV Organização interna da célula empregados para descrever as diversas formas de transporte de membrana e algumas estratégias usadas para caracterizar as proteínas e os processos envolvidos As bicamadas lipídicas livres de proteínas são impermeáveis a íons Se fornecido tempo suficiente praticamente qualquer molécula se difundirá através de uma bicamada lipídica livre de proteínas a favor de seu gradiente de concentração A taxa em que acontece essa difusão todavia varia muito dependendo em parte do tamanho da molécula mas sobretudo da sua hidrofobicidade relativa solubilidade em lipídeos Em geral quanto menores e mais hidrofóbicas ou apolares mais facilmente as moléculas se difundirão através da bicamada lipídica As moléculas pequenas apolares como O2 e CO2 facilmente dissolvemse em bicamadas lipídicas e portanto difundemse rapidamen te através delas As pequenas moléculas polares sem carga como água ou ureia também se difundem através da bicamada embora muito mais lentamente Figura 111 e ver Anima ção 103 Em contraste as bicamadas lipídicas são essencialmente impermeáveis a molé culas carregadas íons não importando o tamanho a carga e o alto grau de hidratação de tais moléculas impedemnas de penetrar a fase hidrocarbônica da bicamada Figura 112 Existem duas classes principais de proteínas de transporte de membrana transportadoras e de canal Semelhante às bicamadas lipídicas sintéticas as membranas celulares permitem a pas sagem de pequenas moléculas apolares por difusão As membranas celulares todavia também devem permitir a passagem de várias moléculas polares como íons açúcares aminoácidos nucleotídeos água e muitos metabólitos celulares que atravessam muito lentamente bicamadas lipídicas sintéticas Algumas proteínas de transporte de mem brana especiais são responsáveis pela transferência de tais solutos através das membra nas celulares Essas proteínas ocorrem em muitas formas e em todos os tipos de membra nas biológicas Cada proteína costuma transportar apenas um tipo específico de molécula ou algumas vezes uma classe de moléculas como íons açúcares ou aminoácidos A especificidade das proteínas de transporte de membrana foi demonstrada na década de 1950 por estudos que indicaram que bactérias com uma mutação em um único gene eram incapazes de transportar açúcares através da sua membrana plasmática Hoje sabe mos que seres humanos com mutações semelhantes sofrem de vários tipos de doenças hereditárias que afetam o transporte de solutos específicos ou classes de solutos no rim no intestino ou em muitos outros tipos celulares Os indivíduos com a doença genética cistinúria por exemplo são incapazes de transportar certos aminoácidos incluindo a cistina o dímero de cisteína ligado por dissulfeto da urina ou do intestino para o sangue o acúmulo de cistina resultante na urina leva à formação de cálculos renais de cistina TABELA 111 Comparação da concentração de íons inorgânicos no interior e no exterior de células mamíferas típicas Componente Concentração citoplasmática mM Concentração extracelular mM Cátions Na 515 145 K 140 5 Mg 2 05 12 Ca 2 10 4 12 H 7 10 5 10 72 M ou pH 72 4 10 5 10 74 M ou pH 74 Ânions Cl 515 110 A célula deve conter quantidades iguais de cargas positivas e negativas ie ser eletricamente neutra Assim além do Cl a célula contém muitos outros ânions não listados nesta tabela De fato a maioria dos constituintes celulares é negativamente carregada HCO3 PO4 3 ácidos nucleicos metabólitos portando fosfato e grupos car boxila etc As concentrações de Ca 2 e Mg 2 fornecidas referemse a íons livres apesar de existir um total de cer ca de 20 mM de Mg 2 e 1 a 2 mM de Ca 2 nas células ambos os íons estão em geral ligados a outras substâncias como proteínas nucleotídeos livres RNA etc e no caso do Ca 2 estocados no interior de diversas organelas O2 CO2 N2 Hormônios esteroides H2O Ureia Glicerol NH3 Glicose Sacarose H Na HCO3 K Ca2 CI Mg2 ÍONS GRANDES MOLÉCULAS POLARES NÃO CARREGADAS PEQUENAS MOLÉCULAS POLARES NÃO CARREGADAS MOLÉCULAS HIDROFÓBICAS Bicamada lipídica sintética Figura 111 Permeabilidade relativa de uma bicamada lipídica sintética a diferen tes classes de moléculas Quanto menor a molécula e mais importante quanto menos fortemente ela se associa à água mais rápido a molécula difundese através da bicamada CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 599 Todas as proteínas de transporte de membrana que foram estudadas em detalhe são proteínas de membrana de passagem múltipla isto é sua cadeia polipeptídica atra vessa múltiplas vezes a bicamada lipídica Pelo fato de formarem uma passagem revesti da por proteínas através da membrana tais proteínas permitem que solutos hidrofílicos específicos atravessem a membrana sem que entrem em contato direto com o interior hidrofóbico da bicamada lipídica As proteínas transportadoras e as proteínas de canal são as duas principais classes de proteínas de transporte de membrana Figura 113 As proteínas transportadoras também chamadas de carreadoras ou permeases ligamse ao soluto específico a ser transportado e sofrem uma série de alterações de conformação que levam à exposição alternada dos sítios de ligação ao soluto em um dos lados da membrana e a seguir no outro lado para transferir o soluto através desta As proteínas de canal em contraste interagem muito mais fracamente com o soluto a ser transportado Elas formam poros contínuos e que atravessam a bicamada lipídica Quando abertos esses poros permitem a passagem de solutos específicos como íons inorgânicos de tamanho e carga adequa dos e em alguns casos de pequenas moléculas como água glicerol e amônia através da membrana Não é surpreendente que o transporte por meio de proteínas de canal ocorra a uma velocidade muito mais rápida do que o transporte mediado por proteínas trans portadoras Apesar de a água ser capaz de difundirse lentamente através de bicamadas lipídicas sintéticas as células usam proteínas de canais específicas denominadas ca nais de água ou aquaporinas que aumentam enormemente a permeabilidade de suas membranas à água como será discutido adiante O transporte ativo é mediado por proteínas transportadoras acopladas a uma fonte de energia Todas as proteínas de canal e muitas proteínas transportadoras somente permitem a passagem passiva dos solutos pela membrana morro abaixo um processo denomi nado transporte passivo No caso de transporte de uma única molécula sem carga é a diferença na sua concentração nos dois lados da membrana seu gradiente de con centração que conduz o transporte passivo e determina sua direção Figura 114A Se no entanto o soluto porta uma carga líquida tanto seu gradiente de concentração como a diferença de potencial elétrico através da membrana o potencial de membrana influenciarão seu transporte O gradiente de concentração e o gradiente elétrico podem ser combinados para formar uma força motriz líquida o gradiente eletroquímico para cada soluto carregado Figura 114B Discutiremos gradientes eletroquímicos com mais detalhes no Capítulo 14 De fato quase todas as membranas plasmáticas apresen tam um potencial elétrico ie uma voltagem através delas com o interior geralmente negativo em relação ao exterior Esse potencial favorece a entrada de íons carregados positivamente na célula mas se opõe à entrada de íons carregados negativamente ver Figura 114B ele também se opõe ao efluxo de íons carregados positivamente Figura 112 Coeficientes de permeabilidade para a passagem de diferentes molé culas através de bicamadas lipídicas sintéticas A taxa de fluxo de um soluto através da bicamada é diretamente proporcional à diferença na sua concentração em ambos os lados da membrana A multiplicação dessa diferença de concentração em molcm 3 pelo coeficiente de permeabilidade em cms dá o fluxo de um soluto em mols por segundo por centímetro quadrado de membrana Uma diferença de concentração de triptofano de 10 4molcm 3 10 4mol 10 3 L 01 M por exemplo levará a um fluxo de 10 4molcm 3 10 7 cms 10 11mols através de 1 cm 2 de membrana bicamada ou 6 10 4 moléculass através de 1 m 2 de bicamada 10 14 10 12 10 10 10 8 10 6 10 4 10 2 1 102 H2O O2 Ureia Glicerol Triptofano Glicose CI K Na Baixa permeabilidade Alta permeabilidade Coeficiente de permeabilidade cms Figura 113 Proteínas transportadoras e proteínas de canal A Uma proteína transportadora alterna entre duas confor mações de tal forma que o sítio de ligação ao soluto sequencialmente é acessível em um lado da bicamada e então no outro B Em contraste uma proteína de canal forma um poro através da bicamada para poder difundir solutos específicos de for ma passiva Sítio de ligação ao soluto Soluto A PROTEÍNA TRANSPORTADORA B PROTEÍNA DE CANAL Bicamada lipídica 600 PARTE IV Organização interna da célula Como ilustrado na Figura 114A além do transporte passivo as células precisam ser capazes de bombear ativamente determinados solutos através da membrana morro acima em sentido contrário a seus gradientes eletroquímicos Este transporte ativo é mediado por transportadoras cuja capacidade de bombeamento é direcional por serem fortemente acopladas a uma fonte de energia metabólica como um gradiente iônico ou a hidrólise de ATP conforme será discutido mais adiante O movimento de pequenas moléculas através de membranas mediado por transportadoras pode ser tanto ativo quanto passivo ao passo que o movimento mediado por canais será sempre passivo ver Figura 114A Resumo As bicamadas lipídicas são praticamente impermeáveis à maioria das moléculas polares Para transportar pequenas moléculas hidrossolúveis para o interior ou para o exterior das células ou para os compartimentos intracelulares envoltos por membrana as membranas celulares contêm várias proteínas de transporte cada qual responsável pela transferência de um soluto ou de uma classe de solutos em particular através da membrana Existem duas classes de proteínas de transporte de membrana transportadoras e de canal Ambas for mam caminhos proteicos através da bicamada lipídica Enquanto o transporte por transpor tadores pode ser ativo ou passivo o fluxo de soluto pelas proteínas de canal é sempre passivo Tanto o transporte de íons ativo quanto o passivo é influenciado pelo gradiente de concen tração desses íons e pelo potencial de membrana ou seja pelo seu gradiente eletroquímico PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS E O TRANSPORTE ATIVO DE MEMBRANA O processo pelo qual uma proteína transportadora transfere uma molécula de soluto através da bicamada lipídica assemelhase a uma reação enzimasubstrato e em muitos aspectos os transportadores comportamse como enzimas Ao contrário da simples rea ção enzimasubstrato no entanto o soluto transportado não é modificado pela proteína transportadora mas sim liberado de forma inalterada no outro lado da membrana Cada tipo de proteína transportadora tem um ou mais sítios de ligação específi cos para seu soluto substrato Elas transportam o soluto através da bicamada lipídica via uma série de alterações reversíveis de conformação que alternadamente expõem o Figura 114 Diferentes formas de transporte através da membrana e a influência da membrana O transporte passivo na direção de um gradiente de concentração ou gradiente eletroquími co ver abaixo em B ocorre de maneira espontânea por difusão diretamente através da bicamada lipídica ou via canais ou transportadoras passivas Em contraste o transporte ativo requer uma entrada de energia metabólica e é sempre mediado por transportadoras que bombeiam o soluto em sentido contrário ao gradien te de concentração ou eletroquímico B O gradiente eletroquímico de um solu to com carga um íon afeta seu transpor te Esse gradiente combina o potencial de membrana e o gradiente de concentração do soluto Os gradientes químico e elétrico podem atuar de forma aditiva aumentan do as forças que direcionam um íon atra vés da membrana no centro ou podem trabalhar um contra o outro à direita Bicamada lipídica Difusão simples Mediado por canal Mediado por transportador ENERGIA Gradiente de concentração TRANSPORTE PASSIVO EXTERIOR INTERIOR A B TRANSPORTE ATIVO Gradiente de concentração sem potencial de membrana Gradiente eletroquímico com um potencial de membrana CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 601 sítio de ligação ao soluto em um lado e em outro da membrana mas nunca em ambos os lados ao mesmo tempo A transição ocorre via um estado intermediário no qual o soluto encontrase inacessível ou ocluído em relação a ambos os lados da membrana Figura 115 Quando o transportador está saturado ou seja quando todos os sítios de ligação ao soluto estão ocupados a velocidade ou taxa de transporte é máxima Essa taxa denominada Vmáx V referindose à velocidade é característica para cada car reador específico A Vmáx indica a taxa na qual um carreador pode alternar entre seus estados conformacionais Além disso cada proteína transportadora tem uma afinidade característica por seu soluto refletida no Km da reação que é igual à concentração do soluto quando a taxa de transporte é metade do seu valor máximo Figura 116 Como ocorre com as enzimas a ligação do soluto pode ser bloqueada por inibidores competiti vos que competem pelo mesmo sítio de ligação podendo ou não ser transportados ou por inibidores não competitivos que se ligam em qualquer outra parte do transportador e alteram sua estrutura Como discutido brevemente é necessária apenas uma modificação relativamente pequena do modelo mostrado na Figura 115 para ligar uma proteína transportadora a uma fonte de energia visando bombear um soluto morro acima contra seu gradiente ele troquímico As células realizam tal transporte ativo de três principais formas Figura 117 1 Os transportadores acoplados vinculam a energia estocada em gradientes de con centração para acoplar o transporte através da membrana de um soluto na direção de seu gradiente ao transporte de outro soluto no sentido contrário ao seu 2 As bombas dirigidas por ATP acoplam o transporte contra o gradiente à hidrólise de ATP 3 As bombas dirigidas por luz ou reações redox encontradas em bactérias arqueias mitocôndrias e cloroplastos acoplam o transporte no sentido do gradiente à ener gia obtida da luz como no caso da bacteriorrodopsina discutida no Capítulo 10 ou obtida de uma reação redox como no caso da citocromo c oxidase discutida no Capítulo 14 Comparações entre sequências de aminoácidos e estruturas tridimensionais su gerem que em muitos casos existem fortes semelhanças na estrutura entre proteínas transportadoras que medeiam transporte ativo e aquelas que medeiam transporte passi vo Alguns transportadores bacterianos por exemplo que utilizam energia armazenada no gradiente de H através da membrana plasmática para sustentar a captação ativa de diversos açúcares são estruturalmente semelhantes aos transportadores que medeiam o transporte passivo de glicose na maioria das células animais Isso sugere a existência de uma relação evolutiva entre diferentes proteínas transportadoras Dada a importância de pequenos metabólitos e açúcares como fonte de energia não é de se surpreender que a superfamília de transportadores seja antiga Iniciaremos nossa discussão a respeito do transporte ativo através da membrana considerando uma classe de transportadores acoplados direcionados por gradientes de concentrações iônicas Essas proteínas desempenham um papel essencial no transporte de pequenos metabólitos através de membranas em todas as células Discutiremos en tão bombas dirigidas por ATP incluindo a bomba de Na K encontrada na membrana plasmática da maioria das células animais Exemplos da terceira classe de bombas de transporte ativo dirigidas por luz ou reações redox são apresentados e discutidos no Capítulo 14 Figura 115 Um modelo de como uma alteração de conformação em um transportador medeia o movimento passivo de um soluto O transportador está ilustrado em três estados conforma cionais no estado aberto para fora os sítios de ligação ao soluto estão expostos para a parte externa da membrana no estado ocluído esses sítios estão inaces síveis independentemente do lado da membrana considerado e no estado aberto para dentro os sítios ficam expos tos para o lado interno da membrana As transições entre os estados ocorrem de modo aleatório Elas são completamente reversíveis e não dependem do fato de o sítio de ligação ao soluto estar ocupado Dessa forma se a concentração de soluto for maior na parte externa da bicamada uma quantidade maior de soluto se ligará ao transportador na conformação aberta para o exterior em comparação à con formação aberta para o interior e como consequência ocorrerá um balanço resul tando em transporte de soluto no sentido de seu gradiente de concentração ou se o soluto for um íon no sentido de seu gradiente eletroquímico ABERTO PARA DENTRO OCLUÍDO FECHADO ABERTO PARA FORA EXTERIOR INTERIOR Soluto Gradiente de concentração Bicamada lipídica Vmáx 12Vmáx Difusão mediada por transportador Difusão simples e transporte mediado por canal Km Concentração da molécula transportada Velocidade do transporte Figura 116 A cinética da difusão simples comparada à difusão mediada por trans portador Enquanto a taxa de difusão no transporte mediado por canais é diretamente proporcional à concentração do soluto den tro dos limites físicos impostos pela área de superfície total ou pela disponibilidade total de canais a taxa de difusão mediada por transportadores alcança um máximo Vmáx quando o transportador chega à saturação A concentração do soluto quando a taxa de transporte está na metade do seu valor máxi mo aproximase da constante de ligação Km do transportador para o soluto e é análoga ao Km de uma enzima para o seu substrato O grá fico se aplica a um transportador que carrega um único soluto a cinética do transporte aco plado ou do transporte de dois ou mais solutos é mais complexa e exibe um comportamento cooperativo 602 PARTE IV Organização interna da célula O transporte ativo pode ser dirigido por gradientes de concentração de íons Algumas proteínas transportadoras simples e passivamente transportam um único solu to de um lado a outro da membrana sob uma taxa determinada por seus Vmáx e Km elas são denominadas uniportes Outras atuam como transportadores acoplados nos quais a transferência de um soluto é estritamente dependente do transporte de um segundo O transporte acoplado envolve a transferência simultânea de um segundo soluto na mesma direção realizado pelos simportes também chamados de cotransportadores ou a transferência de um segundo soluto na direção oposta realizado por antiportes também chamados de permutadores Figura 118 A forte associação entre o transporte de dois solutos permite a esses transportado res acoplados captar a energia armazenada no gradiente eletroquímico de um soluto em geral um íon inorgânico para transportar o outro Dessa forma a energia livre liberada durante o movimento de um íon inorgânico a favor de um gradiente eletroquímico é utilizada como a força motriz para bombear outros solutos morro acima contra seus gradientes eletroquímicos Essa estratégia pode atuar em duas direções alguns trans portadores acoplados atuam como simportes outros como antiportes Na membrana plasmática de células animais o Na é o íon habitualmente cotransportado porque o seu gradiente eletroquímico fornece uma grande força motriz para o transporte ativo de uma segunda molécula O Na que entra na célula durante o transporte acoplado é subsequentemente bombeado para fora por uma bomba de Na K dirigida por ATP na membrana plasmática como discutiremos adiante a qual por manter o gradiente de Na indiretamente controla o transporte acoplado Dizse de transportadores acoplados mediados por íons como o que acabamos de descrever que eles medeiam o transpor te ativo secundário Em contraste dizse que as bombas dirigidas por ATP medeiam o transporte ativo primário pois nestas a energia livre da hidrólise de ATP é usada direta mente para dirigir o transporte de um soluto contra seu gradiente de concentração As células epiteliais intestinais e renais contêm uma ampla variedade de sistemas simporte dirigidos pelo gradiente de Na através da membrana plasmática Cada simporte dirigido por Na é específico em relação à importação de um pequeno grupo de açúcares ou aminoácidos relacionados para o interior da célula Devido ao fato de que o Na tende a mo LUZ TRANSPORTADOR ACOPLADO BOMBA DIRIGIDA POR ATP BOMBA DIRIGIDA POR LUZ P ATP ADP Gradiente eletroquímico Bicamada lipídica Figura 117 Três maneiras de dirigir o transporte ativo A molécula ativamente transportada é ilustrada em laranja e a fonte de energia é mostrada em vermelho O transporte ativo mediado pelas reações redox é apresentado no Capítulo 14 ver Figuras 1418 e 1419 Figura 118 Este diagrama esquemá tico mostra proteínas transportadoras atuando como uniportes simportes e antiportes Animação 111 UNIPORTE SIMPORTE ANTIPORTE Bicamada lipídica Molécula transportada Íon cotransportado Transporte acoplado CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 603 verse para o interior da célula a favor do seu gradiente eletroquímico o açúcar ou o amino ácido é de certa forma arrastado para dentro da célula com ele Quanto maior o gradiente eletroquímico de Na mais soluto será bombeado para dentro da célula Figura 119 Os neurotransmissores liberados por neurônios como sinalização nas sinapses conforme discutido a seguir são recuperados por simportes de Na após sua liberação Estes transpor tadores de neurotransmissores são importantes alvos para drogas estimulantes como a co caína e antidepressivos os inibem e consequentemente prolongam a sinalização mediada pelos neurotransmissores os quais não são removidos de maneira eficiente Apesar de sua grande diversidade os transportadores compartilham características estruturais que podem explicar seu funcionamento e sua evolução Os transportadores em geral são formados por feixes de 10 ou mais ahélices que atravessam a membrana Os sítios de ligação para íons e para os solutos estão localizados a meio caminho dentro da membra na onde algumas hélices apresentam quebras ou distorções e cadeias laterais de aminoá cidos e átomos da cadeia principal polipeptídica os formam Nas conformações aberta para o exterior e aberta para o interior os sítios de ligação estão acessíveis via uma passagem que os conecta com um dos lados da membrana mas não com o outro Ao alternar entre as duas conformações a proteína transportadora adota transitoriamente uma conformação fecha da na qual ambas as passagens para o exterior estão fechadas isso impede que o íon dire cionador e que o soluto transportado atravessem desacompanhados a membrana o que representaria uma depleção desnecessária de energia celular Visto que apenas transpor tadores com ambos os sítios de ligação adequadamente ocupados conseguem alterar sua conformação é assegurado um acoplamento estrito entre o transporte do íon e do soluto Assim como as enzimas os transportadores podem atuar no sentido reverso se os gradientes de íons e solutos forem ajustados experimentalmente de forma adequada Essa simetria química está espelhada em sua estrutura física Análises cristalográficas revelaram que transportadores são construídos a partir de repetições invertidas o empa cotamento das ahélices transmembrana em uma das metades do feixe de hélices é es truturalmente similar ao empacotamento da outra metade mas ambas as porções estão invertidas na membrana uma em relação à outra Assim dizse que os transportadores são pseudossimétricos e as passagens que se abrem e fecham para cada um dos lados da membrana possuem uma geometria bastante semelhante permitindo que os sítios centrais de ligação ao íon e ao soluto estejam acessíveis alternadamente em relação ao lado da membrana Figura 1110 Acreditase que ambas as porções do transportador tenham evoluído por duplicação gênica a partir de uma proteína ancestral menor Gradiente eletroquímico de Na Gradiente de concentração de glicose Glicose Na CITOSOL ESPAÇO EXTRACELULAR Vazio ocluído Aberto para fora Ocupado ocluído Aberto para dentro Vazio ocluído Membrana plasmática Figura 119 Mecanismo do transporte de glicose direcionado por um gradiente de Na Como no modelo ilustrado na Figura 115 o transportador alterna entre os estados aberto para fora e aberto para dentro via um estado intermediário ocluído A ligação de Na e glicose é cooperativa ou seja a ligação de qualquer uma das moléculas aumenta a afinidade da proteína pela outra Visto que a concentração de Na é muito maior no espaço extracelular em compa ração ao citosol a chance de que a glicose se ligue ao transportador no estado aberto voltado para o exterior é maior A transição para o estado ocluído ocorre apenas quando tanto o Na quanto a glicose estão ligados suas interações precisas nos sítios de ligação do soluto estabilizam ligeiramente o estado ocluído e como resultado tornam essa transição energeticamente favorável Flutuações estocásticas provocadas por energia térmica direcionam aleatoriamente o trans portador para uma conformação aberta para fora ou aberta para dentro Se o complexo se abrir para fora nada acontecerá No entanto caso o complexo se abra para dentro da membrana o Na rapidamente se dissociará no ambiente de baixa concentração de Na do citosol Quando o Na é perdido a dissociação de glicose será favorecida devido à cooperatividade da ligação entre os dois solutos O resultado geral é o transporte líquido de Na e de glicose para dentro da célula Visto que o estado ocluído não é formado quando apenas um dos solutos está ligado o transportador só alterará sua conformação quando estiver total mente ocupado ou completamente vazio assegurando dessa forma um acoplamento total do transporte de Na e glicose 604 PARTE IV Organização interna da célula Alguns outros tipos de importantes proteínas de transporte de membrana também são formados a partir de repetições invertidas Os exemplos também incluem proteínas de canal como o canal de água aquaporina discutido mais adiante e o canal Sec61 através do qual polipeptídeos recémsintetizados são transportados para o interior do retículo endoplasmático discutido no Capítulo 12 Acreditase que esses canais tenham evoluído a partir de transportadores acoplados nos quais o sistema de controle da aber tura foi perdido permitindo que eles permanecessem abertos simultaneamente para ambos os lados da membrana o que resultou na existência de um caminho contínuo através da membrana Em bactérias leveduras e plantas assim como em diversas organelas envoltas por membranas de células animais a maioria dos sistemas de transporte acionados por íons depende de gradientes de H e não de gradientes de Na refletindo a predominância de bombas de H nessas membranas Um gradiente eletroquímico de H através da mem brana plasmática bacteriana por exemplo dirige o transporte ativo de diversos açúcares e aminoácidos para o interior da membrana As proteínas transportadoras na membrana plasmática regulam o pH citosólico A maioria das proteínas opera de forma excelente em um pH específico As enzimas lisossômicas por exemplo funcionam melhor no pH baixo cerca de 5 encontrado nos lisossomos enquanto as enzimas citosólicas atuam melhor no pH próximo ao neutro em torno de 72 encontrado no citosol É portanto fundamental que as células sejam capazes de controlar o pH de seus compartimentos intracelulares A maioria das células possui um ou mais tipos de antiportes dirigidos por Na na sua membrana plasmática que auxiliam na manutenção do pH citosólico em torno de 72 Essas proteínas transportadoras utilizam a energia armazenada no gradiente de Na para bombear para fora o excesso de H que tenha penetrado na célula ou que tenha sido produzido por meio de reações formadoras de ácido Dois mecanismos são usados ou o H é diretamente transportado para fora da célula ou HCO3 é internalizado para neutra lizar o H no citosol seguindo a reação HCO3 H H2O CO2 Um dos antiportes que utiliza o primeiro mecanismo é o permutador Na H que acopla um influxo de Na a um efluxo de H Outro que emprega uma combinação dos dois mecanismos é um permu tador Cl HCO3 dirigido por Na que acopla um influxo de Na e HCO3 a um efluxo de Cl e H de tal forma que NaHCO3 entra e HCl sai O permutador Cl HCO3 dirigido por Na é duas vezes mais efetivo do que o permutador Na H visto que ele bombeia um H para fora e neutraliza outro para cada Na que entra na célula Se HCO3 está disponível como costuma ser o caso este antiporte é a proteína transportadora mais importante na regulação do pH citosólico O pH do interior da célula regula ambos os permutadores quando o pH citosólico diminui ambos os permutadores aumentam suas atividades Um permutador Cl HCO3 independente de Na ajusta o pH citosólico na direção reversa Assim como os transportadores dependentes de Na o permutador Cl HCO3 independente de Na é regulado pelo pH mas a atividade permutadora aumenta com o Figura 1110 Os transportadores são construídos a partir de repetições invertidas A Representação de LeuT um simporte bacteriano leucinaNa rela cionado a transportadores de neurotrans missores humanos como o transportador da serotonina A região central do trans portador é formada de dois feixes cada um composto por cinco ahélices azul e amarelo As hélices ilustradas em cinza são distintas nos diferentes membros desta família de transportadores e acreditase que desempenhem funções reguladoras as quais são específicas para um transpor tador em particular B As regiões centrais dos feixes estão empacotadas sob um arranjo similar ilustrado como uma mão sendo o polegar a representação da hélice interrompida mas o segundo feixe está invertido em relação ao primeiro A pseu dossimetria estrutural do transportador reflete sua simetria funcional o transpor tador pode atuar em ambas as direções dependendo do sentido do gradiente iônico Adaptada de KR Vinothkumar e R Henderson Q Rev Biophys 4365158 2010 Com permissão de Cambridge Uni versity Press Código PDB 3F3E N C Região central conservada pseudossimétrica A Leucina Na B N C CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 605 aumento da alcalinidade citosólica O movimento de HCO3 nesse caso normalmente é para fora da célula a favor do seu gradiente eletroquímico o que diminui o pH do cito sol Um permutador Cl HCO3 independente de Na presente na membrana de eritróci tos denominado proteína banda 3 ver Figura 1038 facilita a descarga rápida de CO2 e de HCO3 conforme as células passam pelos capilares no pulmão O pH intracelular não é inteiramente regulado por transportadores na membrana plasmática bombas de H dirigidas por ATP são usadas para controlar o pH de diversos compartimentos intracelulares Como discutido no Capítulo 13 bombas de H mantêm o pH baixo nos lisossomos bem como nos endossomos e nas vesículas secretoras Essas bombas de H utilizam a energia de hidrólise de ATP para bombear H do citosol para o interior dessas organelas Uma distribuição assimétrica de proteínas transportadoras nas células epiteliais está por trás do transporte transcelular de solutos Em células epiteliais como aquelas envolvidas na absorção de nutrientes no intestino as proteínas transportadoras estão distribuídas de maneira não uniforme na membra na plasmática e portanto contribuem para o transporte transcelular dos solutos ab sorvidos Por meio das ações das proteínas transportadoras nessas células os solutos são transportados pela camada de células epiteliais para o líquido extracelular a partir de onde passarão à corrente sanguínea Como mostrado na Figura 1111 os simpor tes ligados a Na localizados no domínio apical de absorção da membrana plasmática transportam ativamente nutrientes para a célula formando gradientes de concentração substanciais para esses solutos através da membrana plasmática Uniportes nos domí nios basal e lateral basolateral permitem que nutrientes saiam passivamente da célula seguindo esses gradientes de concentração Em muitas dessas células epiteliais a área de membrana plasmática é extrema mente aumentada pela formação de milhares de microvilosidades que se estendem como finas projeções em forma de dedo a partir da superfície apical de cada célula Tais microvilosidades podem aumentar a área total de absorção de uma célula em mais de 25 vezes aumentando portanto sua capacidade de transporte Figura 1111 Transporte transcelular O transporte transcelular de glicose através de uma célula epitelial intestinal depende da distribuição não uniforme das proteínas de transporte na membrana plasmática celular O processo mostrado aqui resulta no transporte de glicose do lúmen intes tinal para o líquido extracelular a partir de onde passa para o sangue A glicose é bombeada para o interior da célula através do domínio apical da membrana por um simporte de glicose movido por Na A gli cose sai da célula seguindo seu gradiente de concentração por movimento passivo através de um uniporte de glicose nos domínios de membrana basal e laterais O gradiente de Na que dirige o simporte de glicose é mantido por uma bomba de Na K nos domínios de membrana basal e lateral os quais mantêm baixas as concen trações internas de Na Animação 112 As células adjacentes são conectadas por junções compactas impermeáveis que possuem uma dupla função no processo de transporte ilustrado elas impedem a passagem de solutos pelo epitélio entre as células permitindo a manutenção de um gradiente de concentração de glicose através da camada de células ver Figura 1918 Elas também atuam como barrei ras cercas de difusão dentro da mem brana plasmática auxiliando a limitar as várias proteínas transportadoras aos seus respectivos domínios na membrana ver Figura 1034 Simporte de glicose dirigido por Na Transportador mediando o transporte passivo de glicose Lúmen intestinal Microvilosidades no domínio apical Junções compactas Epitélio intestinal Líquido extracelular Domínio basal Domínio lateral Alta concentração de glicose Baixa concentração de glicose Baixa concentração de glicose Bomba de NaK Glicose Glicose Glicose LÚMEN INTESTINAL LÍQUIDO EXTRACELULAR Na Na Na K 606 PARTE IV Organização interna da célula Como vimos os gradientes de íons desempenham um papel fundamental con duzindo vários processos essenciais de transporte nas células As bombas de íons que utilizam a energia de hidrólise de ATP estabelecem e mantêm esses gradientes como discutiremos a seguir Existem três classes de bombas dirigidas por ATP As bombas dirigidas por ATP frequentemente são denominadas ATPases transportado ras pois hidrolisam ATP em ADP e fosfato e usam a energia liberada para bombear íons ou outros solutos através de uma membrana Existem três principais classes de bombas dirigidas por ATP Figura 1112 e representantes de cada uma dessas classes são en contrados em todas as células de eucariotos e procariotos 1 Bombas tipo P são estrutural e funcionalmente relacionadas a proteínas trans membrana de passagem múltipla Elas são denominadas tipo P pois se autofos forilam do inglês phosphorylate durante o ciclo de bombeamento Essa classe inclui diversas bombas de íons que são responsáveis pelo estabelecimento e pela manutenção de gradientes de Na K H e Ca 2 através das membranas celulares 2 Transportadores ABC ATPbinding cassette transporters distinguemse estrutu ralmente das ATPases do tipo P e bombeiam principalmente moléculas pequenas através das membranas celulares 3 Bombas tipo V são máquinas proteicas semelhantes a turbinas construídas a par tir de múltiplas subunidades diferentes A bomba de próton tipo V transfere H para o interior de organelas como os lisossomos vesículas sinápticas e vacúolos de plantas ou leveduras V vacuolar para acidificar o interior dessas organelas ver Figura 1337 Estruturalmente relacionada às bombas tipo V existe uma família distinta de ATPases tipo F comumente denominadas de ATPsintases devido ao fato de atuarem de modo reverso em vez de usarem a hidrólise de ATP para dirigir o transporte de H elas usam o gradiente de H através da membrana para direcionar a síntese de ATP a partir de ADP e fosfato ver Figura 1430 As ATPsintases são encontradas na mem brana plasmática de bactérias na membrana interna de mitocôndrias e na membrana tilacoide dos cloroplastos O gradiente de H é gerado durante as etapas de transporte de elétrons da fosforilação oxidativa em bactérias aeróbicas e na mitocôndria durante a fotossíntese em cloroplastos ou na bomba de H dirigida por luz bacteriorrodopsina em Halobacterium Discutiremos algumas dessas proteínas em detalhes no Capítulo 14 No restante desta seção discutiremos as bombas do tipo P e os transportadores ABC Uma bomba ATPase tipo P bombeia Ca 2 para o interior do retículo sarcoplasmático em células musculares As células eucarióticas mantêm concentrações muito baixas de Ca 2 livre no seu citosol cerca de 10 7 M em comparação com as concentrações extracelulares de Ca 2 muito ATP ATP ATP ADP ADP ADP ATP ADP H H H H H Pi Pi Pi ATP ADP Pi ou ou ou Íons Molécula pequena Bomba de prótons tipo V ATPsintase tipo F Transportador ABC Bomba tipo P P CITOSOL Na K Ca Bicamada lipídica Figura 1112 Três tipos de bombas dirigidas por ATP Da mesma forma que uma enzima todas as bombas dirigidas por ATP podem atuar em ambas as dire ções dependendo dos gradientes eletro químicos de seus solutos e da razão entre ATPADP Quando a razão ATPADP é alta elas hidrolisam ATP quando a razão ATP ADP é baixa elas podem sintetizar ATP A ATPase tipo F da mitocôndria normalmen te atua em seu modo reverso para fazer a maior parte do ATP celular CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 607 mais altas em torno de 10 3 M Assim mesmo um pequeno influxo de Ca 2 aumenta de modo significativo a concentração de Ca 2 livre no citosol e o fluxo de Ca 2 a favor do seu gradiente acentuado de concentração em resposta a sinais extracelulares é uma manei ra de transmitir esses sinais rapidamente através da membrana plasmática discutido no Capítulo 15 A manutenção de um gradiente acentuado de Ca 2 através da membra na plasmática é portanto importante para a célula O gradiente de Ca 2 é mantido por transportadores de Ca 2 na membrana plasmática que bombeiam Ca 2 ativamente para fora da célula Um desses transportadores é uma ATPase de Ca 2 do tipo P o outro é um antiporte denominado permutador Na Ca 2 que é dirigido pelo gradiente eletroquí mico de Na discutido no Capítulo 15 A bomba de Ca 2 ou Ca 2ATPase na membrana do retículo sarcoplasmático RS de células da musculatura esquelética é uma ATPase de transporte tipo T bastante co nhecida O RS é um tipo especializado de retículo endoplasmático que forma uma rede de sacos tubulares no citoplasma de células musculares e serve como um estoque in tracelular de Ca 2 Quando um potencial de ação despolariza a membrana plasmática da célula muscular o Ca 2 é liberado do RS para o citosol por meio de canais de liberação de Ca 2 estimulando a contração muscular discutido nos Capítulos 15 e 16 A bomba de Ca 2 que responde por cerca de 90 das proteínas de membrana do RS é responsável pela movimentação de Ca 2 do citosol de volta ao RS O retículo endoplasmático de células não musculares contém uma bomba de Ca 2 semelhante porém em menores quantidades Estudos enzimáticos e análises das estruturas tridimensionais de intermediários do transporte da bomba de Ca 2 do RS e de bombas relacionadas revelaram o mecanismo molecular das ATPases do tipo P em detalhes Todas elas possuem estruturas similares com 10 ahélices transmembrana conectadas a três domínios citosólicos Figura 1113 Na bomba de Ca 2 cadeias laterais de aminoácidos que se projetam a partir das héli ces transmembrana formam dois sítios de ligação para Ca 2 centralmente posicionados Como ilustrado na Figura 1114 no estado da bomba não fosforilada ligada a ATP esses sítios de ligação são acessíveis apenas a partir do lado citosólico da membrana do RS A ligação de Ca 2 dispara uma série de alterações conformacionais que fecha a passagem para o citosol e ativa uma reação de fosfotransferência na qual o fosfato terminal do ATP é transferido para um aspartato que é altamente conservado entre todas as ATPases do tipo P A seguir o ADP se dissocia e é substituído por um ATP novo provocando outra alteração na conformação que abre a passagem para o lúmen do RS através da qual os dois íons de Ca 2 saem Eles são substituídos por dois íons de H e por uma molécula de água que estabilizam os sítios de ligação a Ca 2 vazios e fecham a passagem para o lúmen do RS A hidrólise de uma ligação fraca aspartatofosforil faz a bomba retornar à sua con formação inicial e o ciclo pode ser reiniciado A autofosforilação transitória da bomba durante seu ciclo é uma característica essencial de todas as bombas do tipo P Figura 1113 A estrutura da bomba de Ca 2 do retículo sarcoplasmático O modelo em fitas à esquerda derivado de uma análise cristalográfica de raios X mostra a bomba em seu estado fosfori lado ligado a ATP Os três domínios cito sólicos globulares da bomba o domínio de ligação a nucleotídeo verdeescuro o domínio ativador azul e o domínio de fosforilação vermelho também ilustrados esquematicamente à direita sofrem uma dramática alteração de conformação du rante o ciclo de bombeamento Tais alte rações por sua vez alteram o arranjo das hélices transmembrana o que permite a liberação do Ca 2 a partir de sua cavidade de ligação para o lúmen do RS Anima ção 113 Código PDB 3B9B Domínio de ligação ao nucleotídeo Domínio ativador Domínio de fosforilação Ácido aspártico fosforilado CITOSOL LÚMEN DO RETÍCULO SARCOPLASMÁTICO Cavidade de ligação do cálcio ATP Fosfato P ATP Membrana do RS 2Ca2 608 PARTE IV Organização interna da célula A bomba de Na K da membrana plasmática estabelece gradientes de Na e K através da membrana plasmática A concentração de K costuma ser 10 a 30 vezes maior no interior celular do que no exte rior enquanto o contrário é verdadeiro para o Na ver Tabela 111 p 598 Uma bomba de Na K ou ATPase Na K encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais mantém essas diferenças de concentração Assim como a bomba de Ca 2 a bomba de Na K pertence à família das ATPases do tipo P e opera como um antiporte dirigida por ATP bombeando ativamente Na para fora da célula em sentido contrário a seu gradiente eletroquímico e bombeando o K para o interior da célula Figura 1115 Mencionamos antes que o gradiente de Na produzido pela bomba de Na K con trola o transporte da maioria dos nutrientes para células animais e também desempenha um papel fundamental na regulação do pH citosólico Uma célula animal típica dire ciona cerca de um terço de sua energia para o funcionamento dessa bomba e a bomba consome ainda mais energia em células neuronais e em células dedicadas a processos de transporte como as células que formam os túbulos renais Visto que a bomba de Na K leva três íons positivamente carregados para fora da célula a cada dois íons que ela internaliza ela é eletrogênica ela induz a formação de uma corrente elétrica líquida através da membrana com tendência de criação de um potencial elétrico onde o interior da célula apresentase negativo em relação ao exterior Esse efeito eletrogênico da bomba no entanto raramente contribui mais do que 10 Figura 1114 O ciclo de bombeamento da bomba de Ca 2 do retículo sarco plasmático O bombeamento de íons ocorre ao longo de uma série de passos compostos por alterações conforma cionais na qual movimentos dos três domínios citosólicos da bomba o domínio de ligação a nucleotídeo N o domínio de fosforilação P e o domínio ativador A estão mecanicamente acoplados aos movimentos das ahélices transmem brana O movimento das hélices abre e fecha passagens através das quais o Ca 2 penetra a partir do citosol e se liga a dois sítios de ligação a Ca 2 centralmente posi cionados A seguir os dois Ca 2 saem para o lúmen do RS e são substituídos por dois H os quais são transportados na direção oposta A fosforilação dependente de Ca 2 e a desfosforilação dependente de H do ácido aspártico são etapas universalmente conservadas no ciclo da reação de todas as bombas tipo P elas fazem as transições de conformação ocorrerem de modo ordena do permitindo que as proteínas realizem trabalho útil Adaptada de C Toyoshima et al Nature 432361368 2004 and JV Møller et al Q Rev Bio phys 43501566 2010 ATP ATP ATP ATP ATP ATP ADP ADP P P P P Pi 2H 2H 2Ca2 CITOSOL LÚMEN DO RETÍCULO SARCOPLASMÁTICO 2Ca2 N P A 1 2 3 4 5 6 ATP ADP 3 2 P CITOSOL Gradiente eletroquímico de K Gradiente eletroquímico de Na K Na Membrana plasmática Figura 1115 O funcionamento da bomba de Na K Esta ATPase do tipo P bombeia Na ativamente para fora da cé lula e K para dentro em sentido contrário a seus gradientes eletroquímicos Ela é estruturalmente bastante similar à ATPase Ca 2 diferindo entretanto em relação à sua seletividade por íons para cada molé cula de ATP hidrolisada pela bomba três Na são bombeados para fora e dois K são bombeados para dentro Assim como a bomba de Ca 2 um aspartato é fosfo rilado e desfosforilado durante o ciclo de bombeamento Animação 114 CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 609 para o potencial de membrana Os 90 restantes como discutiremos adiante depen dem apenas indiretamente da bomba de Na K Os transportadores ABC constituem a maior família de proteínas de transporte de membrana O último tipo de transportador ATPase que iremos discutir corresponde à família dos trans portadores ABC assim denominada pelo fato de cada um de seus membros conter dois do mínios ATPase altamente conservados ou cassetesde ligação ao ATP ATPbinding casset tes na face citosólica da membrana A ligação de ATP aproxima os dois domínios ATPase e a hidrólise de ATP leva à sua dissociação Figura 1116 Esses movimentos dos domínios citosólicos são transmitidos para os segmentos transmembrana dando origem a ciclos de alterações na conformação que expõem alternadamente os sítios de ligação a soluto em uma face da membrana e a seguir na face oposta da mesma forma que vimos para as outras transportadoras Assim os transportadores ABC recolhem a energia liberada pela ligação e hidrólise de ATP para coordenar o transporte de solutos através da bicamada O transporte é direcional rumo ao interior ou ao exterior dependendo da ocorrência de uma alteração de conformação específica no sítio de ligação ao soluto que está associada à hidrólise de ATP ver Figura 1116 Os transportadores ABC constituem a maior das famílias de proteínas de transporte de membrana e têm grande importância clínica A primeira dessas proteínas a ser caracteri zada foi encontrada em bactérias Já mencionamos que as membranas plasmáticas de todas as bactérias contêm transportadores que utilizam o gradiente de H através da membrana para ativamente transportar uma ampla variedade de nutrientes para o interior da célula Além disso as bactérias usam transportadores ABC para a importação de algumas molé culas pequenas Em bactérias como E coli que possui membranas duplas Figura 1117 os transportadores ABC estão localizados na membrana interna e um mecanismo auxiliar opera para a captura e entrega dos nutrientes aos transportadores Figura 1118 Em E coli 78 genes o que representa incríveis 5 dos genes bacterianos codifi cam transportadores ABC e os genomas de animais possuem um número ainda maior desses genes Apesar de se acreditar que cada transportador seja específico em relação a uma molécula ou classe de moléculas em particular a variedade de substratos transpor Figura 1116 O transporte de peque nas moléculas por um típico trans portador ABC Os transportadores ABC são constituídos por múltiplos domínios Em geral dois domínios hidrofóbicos cada um dos quais formado a partir de seis ahélices que atravessam a membrana formam em conjunto uma via para a translocação e determinam a especifici dade do soluto Dois domínios ATPase mergulham no citosol Em alguns casos as duas metades do transportador são formadas por um único polipeptídeo ao passo que em outros casos elas são formadas a partir de dois ou mais polipep tídeos distintos que se organizam sob uma estrutura similar Sem a ligação de um ATP o transportador expõe o sítio de ligação ao soluto em uma das faces da membrana A ligação de ATP induz uma alteração na conformação que expõe o sítio de ligação ao soluto à face oposta da membrana a hidrólise de ATP seguida pela dissociação do ADP faz o transportador retornar à conformação original A maior parte dos transportadores ABC atua de forma uni direcional A Tanto transportadores ABC de importação quanto de exportação são encontrados em bactérias um ABC de im portação está ilustrado nesta figura A es trutura cristalográfica de um transportador ABC bacteriano está ilustrada na Figura 376 B Em eucariotos a maioria dos transportadores ABC exporta substâncias do citosol para o espaço extracelular ou do citosol para compartimentos intracelulares ligados a membranas como o retículo endoplasmático ou da matriz mitocondrial para o citosol CITOSOL ATP ATP ATP ADP Pi 2 2 Pequena molécula do soluto Domínios ATPase CITOSOL ATP ATP ATP ADP Pi 2 2 Pequena molécula do soluto Domínios ATPase A UM TRANSPORTADOR ABC BACTERIANO B UM TRANSPORTADOR ABC EUCARIÓTICO Sítio de ligação ao soluto Domínios hidrofóbicos 610 PARTE IV Organização interna da célula tados por essa superfamília é ampla e inclui íons inorgânicos aminoácidos mono e po lissacarídeos peptídeos lipídeos drogas e em alguns casos mesmo proteínas maiores do que as próprias transportadoras Os primeiros transportadores ABC eucarióticos identificados foram descobertos devido à sua habilidade em bombear drogas hidrofóbicas para fora do citosol Um desses transportadores é a proteína de resistência a múltiplas drogas MDR também chamada de glicoproteína P Ela está presente em níveis elevados em diversas células cancerosas hu manas e torna as células resistentes simultaneamente a uma variedade de fármacos citotó xicos quimicamente não relacionados que são bastante usados na quimioterapia contra o câncer O tratamento com qualquer um desses fármacos pode resultar na sobrevivência se letiva e no crescimento exacerbado das células cancerosas que superexpressam a proteína transportadora MDR Essas células são capazes de bombear de maneira eficiente o fármaco para o exterior da célula e são portanto relativamente resistentes aos efeitos tóxicos dos fármacos Animação 115 A seleção de células cancerosas resistentes a um fármaco pode como resultado levar à resistência a uma ampla variedade de fármacos anticancerígenos Alguns estudos indicam que até 40 dos cânceres humanos desenvolvem resistência a múltiplos fármacos sendo este um grande obstáculo na batalha contra o câncer Um fenômeno relacionado e igualmente sinistro ocorre no protista Plasmodium falciparum que causa a malária Mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas com esse parasita que continua a ser uma causa principal de morte matando quase 1 milhão de pessoas a cada ano O desenvolvimento de resistência ao fármaco an timalárico cloroquina tem impedido o controle da malária Os P falciparum resistentes têm uma amplificação em um gene que codifica um transportador ABC que bombeia cloroquina para o exterior de suas células Figura 1117 Pequena secção da mem brana dupla de uma bactéria E coli A membrana interna é a membrana plasmática celular Entre as membranas interna e externa há uma camada de peptidoglicano rígido fortemente poroso composta de proteína e de polissacarí deo que constituem a parede celular bacteriana Ela está aderida a moléculas de lipoproteína na membrana externa e preenche o espaço periplasmático somen te uma pequena porção da camada de peptidoglicanos é mostrada Esse espaço contém também vários tipos de moléculas de proteínas solúveis As linhas tracejadas mostradas em verde na parte superior representam as cadeias polissacarídicas das moléculas lipopolissacarídicas especiais que formam a monocamada externa da membrana externa para maior clareza são mostradas apenas algumas dessas ca deias As bactérias com membranas duplas são denominadas Gramnegativas pois não retêm o corante azulescuro utilizado na coloração de Gram As bactérias com membranas únicas mas com paredes ce lulares de peptidoglicanos espessas como estafilococos e estreptococos retêm o corante azul e portanto são denominadas Grampositivas sua membrana única é análoga à membrana interna plasmática das bactérias Gramnegativas CITOSOL Bicamada lipídica externa Espaço periplasmático Bicamada lipídica interna 25 nm Lipopolissacarídeo Porina Lipoproteína Peptidoglicano Proteína solúvel no espaço periplasmático Transportador ABC Figura 1118 O sistema auxiliar de transporte associado a transpor tadoras ATPases em bactérias com membranas duplas O soluto difundese através de canais proteicos porinas na membrana externa e ligase à proteína periplasmática de ligação ao substrato que o entrega ao transportador ABC que por sua vez bombeia o substrato através da membrana plasmática O peptidoglicano está omitido para simplificação sua estru tura porosa permite que as proteínas de ligação a substrato e solutos hidrossolúveis movamse através dele por difusão MEMBRANA EXTERNA ESPAÇO PERI PLASMÁTICO MEMBRANA INTERNA PLASMÁTICA EXTERIOR DA CÉLULA CITOSOL Proteína periplasmática de ligação ao substrato ligada ao soluto Proteína periplasmática de ligação ao substrato ligada ao soluto substrato livre de soluto Transportador ABC Porina Soluto CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 611 Na maioria das células de vertebrados um transportador ABC na membrana do re tículo endoplasmático RE denominado transportador associado ao processamento de antígeno ou transportador TAP bombeia ativamente uma ampla gama de peptídeos do citosol para o lúmen do RE Esses peptídeos são produzidos mediante degradação proteica nos proteassomos discutido no Capítulo 6 Eles são transportados a partir do RE para a superfície celular onde são exibidos para reconhecimento pelos linfócitos T citotóxicos os quais matam a célula se os fragmentos derivarem de um vírus ou de outros microrganis mos que estejam escondidos no citosol de uma célula infectada discutido no Capítulo 24 Outro membro da família de transportadores ABC é o regulador da condutância trans membrana da fibrose cística CFTR do inglês cystic fibrosis transmembrane conductance re gulator que foi descoberto por meio de estudos da doença genética comum fibrose císti ca Essa doença é causada por uma mutação no gene que codifica o CFTR uma proteína transportadora de Cl da membrana plasmática de células epiteliais O CFTR regula as con centrações iônicas em líquidos extracelulares especialmente nos pulmões Um em cada 27 indivíduos brancos é portador de um gene que codifica uma forma mutante dessa proteína em 1 a cada 2900 pessoas ambas as cópias do gene apresentam a mutação causando a doença Ao contrário de outros transportadores ABC a ligação e a hidrólise de ATP na pro teína CFTR não controlam o processo de transporte Em vez disso elas controlam a abertura e o fechamento de um canal contínuo que fornece um conduto passivo para que o Cl possa se mover no sentido do seu gradiente eletroquímico Assim algumas proteínas ABC podem atuar como transportadoras e outras como canais controlados Resumo As proteínas transportadoras ligam solutos específicos e os transferem através da bicamada lipídica sofrendo mudanças conformacionais que alternadamente expõem o sítio de ligação a soluto em um lado da membrana e então em outro Algumas proteínas transportadoras trans portam um único soluto morro abaixo enquanto outras podem atuar como bombas para transportar um soluto morro acima contra seu gradiente eletroquímico utilizando energia fornecida pela hidrólise de ATP por um fluxo a favor do gradiente de outro soluto como Na ou H ou pela luz para coordenar a série de mudanças conformacionais necessárias de ma neira ordenada As proteínas transportadoras pertencem a um pequeno número de famílias Cada família evoluiu a partir de uma proteína ancestral comum e todos os seus membros operam mediante um mecanismo semelhante A família de ATPases transportadoras do tipo P que inclui a bomba de Ca 2 e a bomba de Na K é um exemplo importante cada uma dessas ATPases sequencialmente fosforila e desfosforila a si própria durante o ciclo de bom beamento A superfamília de transportadores ABC é a maior família de proteínas de trans porte de membrana e apresenta grande importância clínica Nessa família estão incluídas as proteínas responsáveis pela fibrose cística pela resistência a fármacos em células cancerosas e em parasitas que causam a malária e pelo bombeamento de peptídeos derivados de pató genos no RE para que os linfócitos citotóxicos reconheçam a superfície de células infectadas PROTEÍNAS DE CANAL E AS PROPRIEDADES ELÉTRICAS DAS MEMBRANAS Diferentemente das proteínas transportadoras os canais formam poros que atravessam a membrana Uma classe de proteínas de canal encontrada em quase todos os animais forma junções do tipo fenda gap junctions entre células adjacentes cada membrana plasmática contribui igualmente para a formação do canal que conecta o citoplasma das duas células Esses canais são discutidos no Capítulo 19 e não serão mais considerados aqui Tanto as junções do tipo fenda quanto as porinas os canais nas membranas exter nas de bactérias de mitocôndrias e de cloroplastos discutidos no Capítulo 10 apre sentam poros relativamente grandes e permissivos e seria desastroso se conectassem diretamente o interior de uma célula com o espaço extracelular De fato muitas toxinas bacterianas fazem exatamente isso para matar outras células discutido no Capítulo 24 Em contraste a maioria dos canais na membrana plasmática de células animais e vegetais que conectam o citosol ao exterior celular possui necessariamente poros es treitos fortemente seletivos que podem abrir e fechar rapidamente Uma vez que essas 612 PARTE IV Organização interna da célula proteínas estão envolvidas de modo específico no transporte de íons inorgânicos elas são referidas como canais iônicos No caso de eficiência do transporte os canais iônicos apresentam uma vantagem sobre as proteínas transportadoras até 100 milhões de íons podem passar através de um canal aberto a cada segundo uma velocidade 10 5 vezes maior do que a maior velocidade de transporte conhecida para uma proteína transpor tadora Entretanto como discutido antes os canais não podem ser acoplados a uma fon te de energia para realizar transporte ativo logo o transporte que é mediado por eles é sempre passivo morro abaixo Assim a função dos canais iônicos é permitir a difusão rápida de íons inorgânicos específicos sobretudo Na K Ca 2 ou C a favor dos seus gradientes eletroquímicos através da bicamada lipídica Nesta seção veremos que a ha bilidade de controlar o fluxo de íons por esses canais é essencial para muitas funções celulares As células nervosas neurônios em particular são especialistas no uso de ca nais iônicos e consideraremos como elas utilizam muitos canais diferentes para receber conduzir e transmitir sinais Antes de discutirmos os canais iônicos no entanto conside raremos brevemente os canais de água aquaporinas já mencionados As aquaporinas são permeáveis à água mas impermeáveis a íons Visto que as células são constituídas predominantemente por água em geral cerca de 70 de seu peso o movimento da água através das membranas celulares é de vital importân cia As células também contêm uma concentração alta de solutos incluindo numerosas moléculas orgânicas carregadas negativamente confinadas no interior celular chamados ânions fixos e os cátions que as acompanham e que são necessários para o balanço de cargas Isso cria um gradiente osmótico que é majoritariamente balanceado por um gra diente osmótico oposto devido à alta concentração de íons inorgânicos sobretudo Na e Cl no líquido extracelular A pequena força osmótica remanescente tende a puxar água para o interior da célula fazendo esta inchar até que as forças alcancem um equilíbrio Vis to que todas as membranas biológicas são moderadamente permeáveis à água ver Figura 112 o volume celular alcança o equilíbrio em poucos minutos ou menos em resposta a um gradiente osmótico Na maioria das células animais no entanto a osmose desempe nha apenas um pequeno papel na regulação do volume celular Isso ocorre porque a maior parte do citoplasma está sob um estado semelhante a um gel e resiste a grandes alterações em seu volume em resposta a alterações na osmolaridade Além da difusão direta da água através da bicamada lipídica algumas células pro carióticas e eucarióticas possuem canais de água ou aquaporinas inseridos em suas membranas plasmáticas para permitir um movimento mais rápido da água As aqua porinas são particularmente abundantes em células de animais que devem transportar água em taxas elevadas como células epiteliais do rim ou células exócrinas que devem transportar ou secretar respectivamente grandes volumes de fluidos Figura 1119 As aquaporinas devem resolver um problema que é o oposto daquele enfrentado pelos canais iônicos Para evitar a disrupção de gradientes iônicos através das membra nas elas devem permitir a rápida passagem de moléculas de água ao mesmo tempo em que devem impedir completamente a passagem de íons A estrutura tridimensional da aquaporina revela como ela atinge essa incrível seletividade Os canais possuem um poro estreito que permite que as moléculas de água atravessem em fila única seguindo o cami nho de oxigênios carbonila que revestem um dos lados do poro Figura 1120A e B Ami noácidos hidrofóbicos revestem o outro lado do poro O poro é demasiadamente estreito para que qualquer íon hidratado possa penetrar e o custo energético de desidratação de Figura 1119 O papel das aquaporinas na secreção de fluidos As células que revestem os ductos de glândulas exócri nas como as encontradas no pâncreas e no fígado e nas glândulas mamárias sudoríparas e salivares secretam grandes volumes de fluidos corporais Essas células estão organizadas nas camadas epiteliais de tal forma que a membrana plasmática de sua cabeça esteja voltada para o lúmen do ducto Bombas de íons e canais situa dos na membrana plasmática apical e ba solateral movem íons sobretudo Na e Cl para o lúmen do ducto criando um gra diente osmótico entre o tecido adjacente e o ducto As moléculas de água rapidamen te seguem o gradiente osmótico através das aquaporinas que estão presentes em grande densidade tanto na membrana apical quanto na basolateral Aquaporinas Ducto Água Íons Bombas e canais de íons Membrana apical Membrana basolateral Fluido CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 613 um íon é enorme pois a parede hidrofóbica do poro não pode interagir com um íon desi dratado para compensar a perda de água Esse desenho estrutural explica facilmente por que as aquaporinas são incapazes de transportar íons K Na Ca 2 ou Cl Esses canais são também impermeáveis à H que está predominantemente presente nas células sob a forma de H3O Esses íons hidrônios difundemse extremamente rápido através da água usando um mecanismo de revezamento molecular que requer a formação e a quebra de ligações de hidrogênio entre moléculas adjacentes de água Figura 1120C As aqua porinas contêm duas asparaginas estrategicamente posicionadas que se ligam ao átomo de oxigênio da molécula central da fila de moléculas de água que estão atravessando o poro impondo uma bipolaridade sobre a coluna de moléculas de água como um todo Figura 1120C e D Isso torna impossível que uma sequência de formação e quebras de ligações de hidrogênio ilustrada na Figura 1120C passe através da molécula central de água ligada à asparagina Visto que ambas as valências desse oxigênio central estão indisponíveis para ligações de hidrogênio a molécula central de água não pode participar do revezamento do H tornando o poro impermeável ao H Agora nos concentraremos nos canais iônicos o assunto do restante deste capítulo Os canais iônicos são íonseletivos e alternam entre os estados aberto e fechado Duas propriedades importantes distinguem os canais iônicos dos poros aquosos Primei ro eles mostram seletividade a íons permitindo a passagem de alguns íons inorgânicos mas não de outros Isso sugere que seus poros devam ser estreitos o suficiente em deter minados pontos para forçar os íons permeáveis a um contato íntimo com as paredes do canal de tal forma que somente os íons de tamanho e carga apropriados possam passar Os íons permeáveis devem perder todas ou a maioria das moléculas de água associadas a eles para passar geralmente em fila única através da parte mais estreita do canal a qual é chamada de filtro de seletividade o que limita sua taxa de passagem Figura 1121 Figura 1120 A estrutura das aqua porinas A Diagrama em fitas de um monômero de aquaporina Na membrana as aquaporinas formam tetrâmeros e cada monômero contém um poro aquoso em sua região central não mostrado Cada canal individual de aquaporina é capaz de permitir a passagem de 10 9moléculas de água por segundo B Um corte longitu dinal através de um monômero de aqua porina mostrando em plano o centro do poro Uma das faces do poro é revestida por aminoácidos hidrofílicos que forne cem ligações de hidrogênio transitórias para as moléculas de água essas ligações auxiliam no estabelecimento de uma fila linear de moléculas de água que transitam orientadas através do poro C e D Um modelo que explica por que as aquapori nas são impermeáveis a H C Na água o H se difunde de forma extremamente rápida por meio de sua passagem de uma molécula de água para a outra D Grupa mentos carbonila CO revestem a face hidrofílica do poro e alinham as moléculas de água e duas asparaginas estrategica mente posicionadas no centro ajudam a sustentar a molécula de água central de tal forma que ambas as valências de seu oxigênio estão ocupadas Esse arranjo bipolariza as moléculas da coluna de água como um todo cada molécula de água atuando como aceptora de uma ligação de hidrogênio em relação à sua vizinha mais próxima Animação 116 A e B adaptadas de RM Stroud et al Curr Opin Struct Biol13424431 2003 Com permissão de Elsevier H H O C O C O C O C O C O C H N D C A B Asn H N Asn Asn Asn Molécula de água Bicamada lipídica Bicamada lipídica Portão Filtro de seletividade FECHADO ABERTO Figura 1121 Canal iônico típico que alterna entre as conformações aberta e fechada O canal iônico aqui ilustrado em corte forma um poro através da bica mada lipídica apenas quando se encontra na conformação aberta O poro afunila para dimensões atômicas em uma região o filtro de seletividade em que a sele tividade iônica do canal é basicamente determinada Outra região do canal forma o portão controlador 614 PARTE IV Organização interna da célula Assim conforme as concentrações iônicas aumentam o fluxo de íons através de um canal aumenta de maneira proporcional e então estabiliza saturação em uma taxa máxima A segunda distinção importante entre os canais iônicos e os poros aquosos é que os canais iônicos não estão continuamente abertos Em vez de estarem sempre abertos eles são controlados gated o que lhes permite abrir por um breve tempo e então fechar nova mente Além disso sob estímulo químico ou elétrico prolongado a maioria dos canais iô nicos passa para um estado fechado dessensibilizado ou inativado onde eles permane cem refratários para posterior abertura até a remoção do estímulo como discutido adiante Na maioria dos casos o canal se abre em resposta a um estímulo específico Como ilustrado na Figura 1122 os principais tipos de estímulos conhecidos por provocar a abertura de canais iônicos são uma mudança na voltagem através da membrana canais controlados por voltagem um estresse mecânico canais controlados mecanicamente ou a ligação de um ligante canais controlados por ligante O ligante pode ser tanto um mediador extrace lular especificamente um neurotransmissor canais controlados por transmissor quanto um mediador intracelular como um íon canais controlados por íons ou um nucleotídeo canais controlados por nucleotídeos A atividade de muitos canais iônicos é regulada além disso por fosforilação e desfosforilação de uma proteína esse tipo de regulação de canal é discutido no Capítulo 15 junto com canais iônicos controlados por nucleotídeos Mais de cem tipos de canais iônicos foram identificados até o momento e novos tipos ainda estão sendo adicionados à lista cada um deles caracterizado pelos íons que conduz pelo mecanismo por meio do qual é controlado e por sua abundância e localização na cé lula e em células específicas Os canais iônicos são responsáveis pela excitabilidade elétrica de células musculares e medeiam a maioria das formas de sinalização elétrica no sistema nervoso Um único neurônio costuma conter dez ou mais tipos de canais iônicos localiza dos em diferentes domínios da sua membrana plasmática Contudo os canais iônicos não estão restritos a células excitáveis eletricamente Eles estão presentes em todas as células animais e são encontrados em células vegetais e microrganismos eles propagam a respos ta de fechamento de folha da planta mimosa sensitiva por exemplo Animação 117 e permitem que o organismo unicelular Paramecium reverta sua direção após uma colisão Canais iônicos predominantemente permeáveis a K são encontrados na mem brana plasmática de quase todas as células Um importante subconjunto de canais de K está aberto mesmo em células não estimuladas ou em repouso e estes são portan to denominados canais de escape de K Embora tal termo seja utilizado para nomear muitos canais distintos de K que diferem em relação ao tipo celular esses diferentes canais servem a um propósito comum ao tornarem a membrana plasmática muito mais permeável ao K do que a outros íons eles desempenham um papel essencial para a ma nutenção do potencial de membrana através de todas as membranas plasmáticas como discutiremos a seguir FECHADO ABERTO Controlado por voltagem Controlado por ligante ligante extracelular Controlado por ligante ligante intracelular Controlado mecanicamente CITOSOL CITOSOL Figura 1122 O controle de canais iônicos Esta representação esquemática ilustra vários tipos de estímulos que abrem canais iônicos Os canais controlados mecanicamente costumam apresentar extensões citoplasmáti cas não representadas que conectam o canal ao citoesqueleto CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 615 O potencial de membrana em células animais depende principalmente dos canais de escape de K e do gradiente de K através da membrana plasmática Um potencial de membrana originase quando existe uma diferença na carga elétrica entre os dois lados de uma membrana devido a um leve excesso de íons positivos sobre os negativos em um lado e a um leve déficit no outro Tais diferenças de carga podem resultar tanto de bombeamento eletrogênico ativo ver p 608 quanto de difusão passiva de íons Como discutido no Capítulo 14 a maior parte do potencial de membrana de uma mitocôndria é gerada por bombas eletrogênicas de H na membrana mitocondrial interna As bombas eletrogênicas também geram a maior parte do potencial elétrico através da membrana plasmática em plantas e em fungos Em células animais típicas entretanto os movimentos passivos de íons contribuem com a maior parte do potencial elétrico através da membrana plasmática Como explicado antes devido à atuação de uma bomba de Na K existe pouco Na dentro da célula e outros cátions inorgânicos extracelulares devem estar em abun dância tal que ocorra um balanço da carga carreada pelos ânions celulares fixos as mo léculas orgânicas negativamente carregadas que estão confinadas no interior da célula A manutenção do equilíbrio é realizada predominantemente pelo K que é bombeado ativamente para dentro da célula pela bomba de Na K e que pode também moverse livremente para o interior ou para o exterior pelos canais de escape de K na membrana plasmática Por causa da presença desses canais o K quase alcança o equilíbrio onde uma força elétrica exercida por um excesso de cargas negativas que atraem K para a célula contrabalança a tendência de escape do K para fora a favor do seu gradiente de concentração O potencial de membrana da membrana plasmática é a manifestação dessa força elétrica e seu valor de equilíbrio pode ser calculado a partir da magnitude do gradiente de concentração de K A discussão a seguir pode auxiliar a compreensão desse mecanismo Suponha que não exista inicialmente um gradiente de voltagem através da mem brana plasmática o potencial de membrana é zero mas que a concentração de K é alta no interior e baixa no exterior celular O K tenderá a deixar a célula pelos canais de escape de K movido pelo seu gradiente de concentração Como o K movese para fora cada íon deixa para trás uma carga negativa não equilibrada criando portanto um campo elétrico ou potencial de membrana que tenderá a oporse a mais efluxo de K O efluxo líquido de K é interrompido quando o potencial de membrana atinge um valor no qual essa força elétrica motriz no K equilibra exatamente o efeito do seu gradiente de concentração ou seja quando o gradiente eletroquímico do K é zero Embora os íons Cl também se equilibrem através da membrana o potencial de membrana deixa a maior parte desses íons no exterior celular pois sua carga é negativa A condição de equilíbrio na qual não existe fluxo líquido de íons através da mem brana plasmática define o potencial de repouso de membrana para essa célula idea lizada Uma fórmula simples porém muito importante a equação de Nernst expressa quantitativamente a condição de equilíbrio e como explicado no Painel 111 torna pos sível calcular o potencial de repouso de membrana teórico se a razão das concentrações interna e externa é conhecida Como a membrana plasmática de uma célula real não é permeável exclusivamente a K e Cl entretanto o real potencial de repouso de membra na não é exatamente igual ao previsto pela equação de Nernst para K ou Cl O potencial de repouso decai lentamente quando a bomba de Na K é interrompida O movimento de apenas um número muito pequeno de íons através da membrana plasmática por canais iônicos é suficiente para estabelecer o potencial de membrana Assim podese pensar no potencial de membrana como formado de movimentos de carga que praticamente não afetam as concentrações de íons e que resulta em uma pe quena diferença no número de íons positivos e negativos nos dois lados da membrana Figura 1123 Além disso esses movimentos de carga em geral são rápidos ocorrendo em poucos milissegundos ou menos CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 617 Considere a alteração no potencial de membrana em uma célula real se a bomba de Na K for inativada de maneira brusca Imediatamente ocorrerá uma leve queda no potencial de membrana Isso ocorre porque a bomba é eletrogênica e quando ativa tem uma pequena contribuição direta para o potencial de membrana pelo bombeamento de três Na para fora da célula para cada dois K que são bombeados para o interior ver Fi gura 1115 No entanto o desligamento da bomba não elimina o principal componente do potencial de repouso que é gerado pelo mecanismo de equilíbrio de K recémdes crito Esse componente do potencial de membrana persiste enquanto a concentração de Na estiver baixa no interior da célula e a concentração de K estiver alta em geral por vários minutos Contudo a membrana plasmática é relativamente permeável a todos os pequenos íons incluindo o Na Portanto sem a bomba de Na K os gradientes de íons gerados pelo bombeamento por fim diminuirão e o potencial de membrana esta belecido pela difusão através dos canais de escape de K também diminuirá Conforme o Na penetra a célula alcançará um novo estado de repouso onde Na K e Cl estarão em equilíbrio através da membrana O potencial de membrana nesse estado será muito menor do que era na célula normal com uma bomba de Na K ativa O potencial de repouso de uma célula animal varia entre 20 mV e 120 mV de pendendo do organismo e do tipo celular Embora o gradiente de K tenha sempre uma influência predominante nesse potencial os gradientes de outros íons e os efeitos de desequilíbrio das bombas de íons também têm um efeito significativo quanto mais per meável for a membrana a um determinado íon mais fortemente o potencial de mem brana tende a ser dirigido para o valor de equilíbrio desse íon Como consequência mudanças na permeabilidade de uma membrana a íons podem provocar mudanças sig nificativas no potencial de membrana Esse é um dos princípioschave que relaciona a excitabilidade elétrica das células às atividades de canais iônicos Para compreender como os canais iônicos selecionam seus íons e como eles abrem e fecham é necessário conhecer sua estrutura atômica O primeiro canal iônico a ser cristalizado e estudado por difração de raios X foi um canal de K bacteriano Os detalhes da sua estrutura revolucionaram o nosso entendimento sobre os canais iônicos A estrutura tridimensional de um canal de K bacteriano mostra como um canal iônico pode funcionar A incrível habilidade dos canais iônicos de combinar seletividade iônica fina e uma alta condutância tem intrigado os cientistas Os canais de escape de K por exemplo condu zem K 10 mil vezes mais rápido do que Na embora os dois íons sejam esferas sem ca racterísticas distintivas com diâmetros similares 0133 nm e 0095 nm respectivamen te Uma substituição de um único aminoácido no poro de um canal de K de uma célula animal pode resultar em uma perda de seletividade iônica e morte celular A seletividade normal pelo K não pode ser explicada pelo tamanho do poro pois o Na é menor do que o K Além disso a alta velocidade de condutância é incompatível com a possibilidade de o canal ter sítios seletivos de ligação a K com alta afinidade uma vez que a ligação de íons K em tais sítios tornaria muito lenta sua passagem Figura 1123 As bases iônicas de um potencial de membrana Um pequeno fluxo de íons inorgânicos através de um canal iônico carrega carga suficiente para provocar uma grande alteração no potencial de membrana Os íons que dão origem ao potencial de membrana estão em uma fina camada 1 nm superficial próxima à membrana lá mantidos por atração elétrica aos seus contraíons com carga oposta do outro lado da membrana Para uma célula típica 1 microcoulomb de carga 6 x 10 12 íons monovalentes por centímetro quadrado de membrana trans ferido de um lado para o outro da mem brana altera o potencial de membrana em aproximadamente 1 V Isso significa por exemplo que em uma célula esférica de 10 m de diâmetro o número de íons K que deve fluir para o exterior para alterar o potencial de membrana em 100 mV é de apenas cerca de 1100000 do número to tal de íons K no citosol Essa quantidade é tão pequena que as concentrações intra celulares de K permanecem praticamente inalteradas Balanço exato de cargas em cada lado da membrana potencial de membrana 0 Uma pequena porção dos íons positivos em vermelho cruza a membrana da direita para a esquerda deixando seus contraíons em vermelho para trás isso gera um potencial de membrana diferente de zero CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 619 Diversos outros canais iônicos operam usando princípios similares as hélices que controlam os canais são acopladas alostericamente a domínios que formam a via condu tora dos íons e uma alteração na conformação do portão controlador em resposta por exemplo à ligação de um ligante ou a um potencial de membrana alterado provoca como efeito carona uma alteração na conformação da via condutora abrindoa ou bloqueandoa Canais mecanossensíveis protegem as células de bactérias contra pressões osmóticas extremas Todos os organismos de bactérias unicelulares a animais e plantas multicelulares devem ser capazes de perceber e responder a forças mecânicas provenientes do ambiente exter no como som toque pressão forças de estiramento e gravidade e a forças provenientes de seu ambiente interno como pressão osmótica e dobramento da membrana Sabese que diversas proteínas são capazes de responder a tais forças mecânicas e um amplo subconjunto dessas proteínas foi identificado como possíveis canais mecanossensíveis apesar de poucas delas terem sido de fato associadas diretamente a canais de íons meca nicamente ativados Uma das razões para essa lacuna em nosso conhecimento é que em geral esses canais são extremamente raros Células ciliadas auditivas da cóclea em hu manos por exemplo contêm canais de íons controlados mecanicamente extremamente sensíveis mas acreditase que cada uma das cerca de 15 mil células ciliadas individuais tenha apenas de 50 a 100 desses canais Animação 119 Dificuldades adicionais surgem do fato de que os mecanismos de controle dos vários tipos de canais mecanossensíveis re querem muitas vezes que o canal esteja inserido em arquiteturas e estruturas complexas que necessitam de uma conexão à matriz extracelular ou ao citoesqueleto características estas difíceis de reconstituir em modelos experimentais O estudo de receptores meca nossensíveis é um campo de ativa investigação Figura 1125 Especificidade do filtro de seletividade ao K em um canal de K As ilustrações mostram íons K e Na no vestíbulo A e no filtro de seletividade B do poro visto em secção transversal No vestíbulo os íons estão hidratados No filtro de seletividade eles perderam a água e os oxigênios carbonila estão posi cionados para acomodar um íon K desi dratado A desidratação do íon K requer energia que é precisamente balanceada pela energia obtida a partir da interação do íon com todos os oxigênios carbonila que servem como substitutos das molécu las de água Pelo fato de os íons Na serem pequenos demais para interagir com os oxigênios eles podem entrar no filtro de seletividade somente com grande gasto energético Portanto o filtro seleciona íons K com alta especificidade A adaptada de Y Zhou et al Nature 4144348 2001 Com permissão de Macmillan Pu blishers Ltd O O O O O O O O O O O O H H H H H H H H A Íon no vestíbulo B Íon no filtro de seletividade O O O O H H H H H H H H K K Na Na Figura 1126 Modelo para o controle de um canal de K bacteriano O canal é visto em secção transversal Para adotar a conformação fechada as quatro hélices transmembrana internas que revestem o poro na face citosólica do filtro de seletivi dade ver Figura 1124 rearranjamse para fechar a entrada citosólica para o canal Adaptada de E Perozo et al Science 2857378 1999 Poro iônico Hélice interna FECHADO ABERTO 620 PARTE IV Organização interna da célula Uma classe de canais mecanossensíveis bastante estudada é encontrada na mem brana plasmática de bactérias Esses canais abrem em resposta ao estiramento mecâ nico da bicamada lipídica na qual estão inseridos Quando uma bactéria vivencia um ambiente externo de baixa força iônica condições hipotônicas como a água da chuva a célula incha conforme a água penetra nela devido a um aumento na pressão osmótica Se a pressão alcança níveis perigosamente elevados a célula abre canais mecanossen síveis que permitem a saída de pequenas moléculas Bactérias colocadas experimental mente em água fresca podem rapidamente perder dessa maneira mais de 95 de suas moléculas pequenas incluindo aminoácidos açúcares e íons potássio No entanto elas mantêm suas macromoléculas internamente e em segurança e dessa forma podem ra pidamente se recuperar após o retorno das condições ambientais à normalidade O controle por estímulos mecânicos foi demonstrado usando técnicas biofísicas nas quais a força era exercida sobre bicamadas lipídicas puras contendo canais meca nossensíveis bacterianos aplicando por exemplo força de sucção com o uso de uma micropipeta Essas medidas demonstraram que a célula possui vários canais diferen tes que se abrem sob diferentes níveis de pressão O canal mecanossensível de peque na condutância denominado canal MscS abrese sob pressões baixas e moderadas Figura 1127 Ele é composto por sete subunidades idênticas que no estado aberto formam um poro de aproximadamente 13 nm de diâmetro grande o suficiente apenas para a passagem de moléculas pequenas e íons Grandes domínios citoplasmáticos li mitam o tamanho das moléculas que podem chegar ao poro O canal mecanossensível de grande condutância denominado canal MscL alcança mais de 3 nm de diâmetro quando a pressão se eleva a ponto de a célula poder estourar A função de uma célula nervosa depende de sua estrutura alongada As células que fazem um uso mais sofisticado de canais são os neurônios Antes de dis cutirmos como tais células usam os canais faremos uma breve descrição da organização de um neurônio característico A tarefa fundamental de um neurônio ou célula nervosa é receber conduzir e transmitir sinais Para desempenhar essas funções os neurônios costumam ser extre mamente longos Em humanos por exemplo um único neurônio estendendose desde Figura 1127 A estrutura de canais mecanossensíveis Estão ilustradas as estruturas cristalográficas de MscS em sua conformação A fechada e B aberta As vistas laterais painéis inferiores mos tram a proteína inteira incluindo o grande domínio intracelular As vistas de cima painéis superiores mostram apenas os domínios transmembrana A estrutura aberta ocupa mais espaço na bicamada lipídica e é favorecida energeticamente quando uma membrana é esticada Isso pode explicar por que os canais MscS abremse quando pressão se acumula no interior da célula Códigos PDB 2OAU 2VV5 CITOSOL CITOSOL A B FECHADO ABERTO CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 621 a medula espinal até um músculo no pé pode alcançar até 1 metro de comprimento Cada neurônio consiste em um corpo celular contendo o núcleo e uma série de peque nos processos protuberâncias finas irradiandose a partir do corpo Em geral um longo axônio conduz sinais do corpo celular para alvos distantes e vários dendritos curtos e ramificados estendemse do corpo celular como antenas fornecendo uma grande área de superfície para a recepção de sinais dos axônios de outros neurônios Figura 1128 apesar de o próprio corpo celular também receber tais sinais Um axônio típico divide se na sua extremidade mais distante em muitas ramificações passando sua mensagem para muitas célulasalvo simultaneamente Do mesmo modo o grau de ramificação dos dendritos pode ser muito grande em alguns casos suficiente para receber mais de 100 mil sinais de input em um único neurônio Apesar dos diferentes significados dos sinais transmitidos pelas diferentes classes de neurônios a forma do sinal é sempre a mesma consistindo em mudanças no poten cial elétrico através da membrana plasmática do neurônio O sinal se propaga porque um distúrbio elétrico produzido em uma parte da membrana é transmitido para outras par tes Tal distúrbio tornase mais fraco com o aumento da distância da sua fonte a menos que seja despendida energia para amplificálo ao longo da sua trajetória Em distâncias curtas essa atenuação não é importante de fato muitos neurônios pequenos conduzem seus sinais passivamente sem amplificação Para comunicação a longa distância entre tanto tal propagação passiva não é adequada Assim os neurônios maiores empregam um mecanismo de sinalização ativa que é uma das suas características mais marcantes Um estímulo elétrico que excede certo limiar de força desencadeia uma explosão de ati vidade elétrica que é propagada rapidamente ao longo da membrana plasmática do neu rônio e é mantida por amplificação automática por todo o caminho Essa onda de excita ção elétrica conhecida como potencial de ação ou impulso nervoso pode carregar uma mensagem sem atenuação de uma extremidade à outra de um neurônio a velocidades de 100 metros por segundo ou mais Os potenciais de ação são a consequência direta das propriedades dos canais de cátions controlados por voltagem como veremos agora Os canais de cátion controlados por voltagem geram potenciais de ação em células eletricamente excitáveis A membrana plasmática de todas as células eletricamente excitáveis não apenas dos neurônios mas também das células musculares endócrinas e dos óvulos contém ca nais de cátion controlados por voltagem responsáveis pela geração de potenciais de ação Um potencial de ação é desencadeado por uma despolarização da membrana plasmática ou seja por uma alteração no potencial de membrana para um valor me nos negativo em seu interior Veremos adiante como a ação de um neurotransmissor provoca despolarização Em células nervosas e musculoesqueléticas um estímulo que cause suficiente despolarização prontamente provoca a abertura de canais de Na con trolados por voltagem permitindo a entrada de uma pequena quantidade de Na na célula a favor do seu gradiente eletroquímico O influxo de cargas positivas despolari za ainda mais a membrana abrindo portanto mais canais de Na os quais admitem mais íons Na desencadeando mais despolarização Tal processo de autoamplificação Figura 1128 Um típico neurônio de vertebrado As setas indicam a dire ção em que os sinais são transmitidos O axônio único conduz sinais para longe do corpo celular enquanto os múltiplos dendritos e o corpo celular recebem sinais dos axônios de outros neurônios Os terminais axônicos findam nos dendri tos ou no corpo celular de outros neurô nios ou em outros tipos celulares como células musculares ou glandulares Corpo celular Dendritos Axônio menos de 1 mm a mais de 1 m de comprimento Ramos terminais do axônio 622 PARTE IV Organização interna da célula um exemplo da retroalimentação positiva discutida nos Capítulos 8 e 15 continua até que em uma fração de milissegundos o potencial elétrico local nessa região da mem brana tenha se deslocado do seu valor de repouso de aproximadamente 70 mV no axô nio gigante de lula cerca de 40 mV em humanos para quase tanto quanto o potencial de equilíbrio do Na de aproximadamente 50 mV ver Painel 111 p 616 Nesse ponto quando a força motriz eletroquímica líquida para o fluxo de Na é quase zero a célula atingiria um novo estado de repouso com todos os seus canais de Na permanentemente abertos se a conformação de abertura do canal fosse estável Dois mecanismos atuam em conjunto para salvar a célula de tal espasmo elétrico permanente os canais Na são automaticamente inativados e canais de K controlados por voltagem abremse para restaurar o potencial de membrana ao seu valor negativo inicial O canal de Na é construído a partir de uma cadeia polipeptídica única que contém quatro domínios estruturalmente muito semelhantes Acreditase que esses domínios tenham evoluído por duplicação gênica seguida de fusão em um único grande gene Figura 1129A Em bactérias de fato o canal de Na é um tetrâmero de quatro cadeias polipeptídicas idênticas apoiando tal ideia evolutiva Cada domínio contribui para o canal central o que é bastante semelhante ao que acontece com o canal de K Cada domínio também contém um sensor de voltagem que se caracteriza por uma hélice transmembrana incomum S4 que contém muitos aminoácidos positivamente carregados Conforme a membrana se despolariza as hé lices S4 sofrem uma força de atração eletrostática que as atrai para o lado extracelular da membrana plasmática então negativamente carregado A mudança conformacional resultante abre o canal A estrutura de um canal de Na controlado por voltagem bacte riano fornece indicações de como os elementos estruturais são arranjados na membrana Figura 1129B e C Os canais de Na também possuem um mecanismo automático de inativação que fecha rapidamente os canais mesmo que a membrana ainda esteja despolarizada Figura 1129 Modelos estruturais de canais de Na controlados por volta gem A O canal em células animais é construído a partir de uma cadeia polipep tídica única que contém quatro domínios homólogos Cada domínio contém duas ahélices transmembrana verde que envolvem o poro condutor de íon central Elas são separadas por sequências azul que formam o filtro de seletividade Quatro ahélices adicionais cinza e verme lho em cada domínio constituem o sensor de voltagem As hélices S4 vermelho são características pelo fato de conterem argininas positivamente carregadas em abundância Um portão de inativação que faz parte de uma alça flexível que conecta o terceiro e quarto domínios age como um tampão que obstrui o poro no estado inativado do canal como ilustrado na Figura 1130 B Vistas laterais e superior de uma proteína de canal bacteriana ho móloga mostrando seu arranjo no interior da membrana C Um corte transversal do domínio do poro do canal mostrado em B mostrando entradas laterais através das quais a cavidade central é acessível a partir da região hidrofóbica da bicamada lipídica Em cristais foi observada a intru são do poro por cadeias acil dos lipídeos Esses acessos laterais são grandes o sufi ciente para permitir a entrada de peque nos fármacos hidrofóbicos bloqueadores de poro comumente usados como anes tésicos e bloqueadores da condutância de íons Código PDB 3RVZ Sensores de voltagem Canal central A C B N C Filtro de seletividade Portão de inativação Portal lateral Portal lateral Canal central VISTA LATERAL VISTA DE CIMA Poro Hélice S4 CITOSOL CITOSOL Bicamada lipídica Sensores de voltagem CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 623 ver Figura 1130 Os canais de Na permanecem nesse estado inativado incapazes de reabrirem até que o potencial de membrana retorne a seu valor negativo inicial O tem po necessário para um número suficiente de canais de Na se recuperarem da inativação e darem suporte a um novo potencial de ação denominado período refratário limita a taxa de pulsos repetitivos de um neurônio O ciclo desde o estímulo inicial até o retorno ao estado de repouso original leva poucos milissegundos O canal de Na pode portanto existir em três estados distintos fechado aberto e inativado que contribuem para a elevação e queda do potencial de ação Figura 1130 Essa descrição de um potencial de ação aplicase apenas a uma região pequena da membrana plasmática A despolarização autoamplificante da região entretanto é suficiente para despolarizar regiões adjacentes da membrana que então passam pelo mesmo ciclo Dessa forma o potencial de ação propagase como uma onda que viaja a partir do sítio inicial de despolarização para envolver a membrana plasmática inteira como ilustrado na Figura 1131 O uso de canalrodopsinas revolucionou o estudo dos circuitos neurais As canalrodopsinas são canais de íon fotossensíveis que se abrem em resposta à luz Eles evoluíram como receptores sensoriais em algas verdes fotossintéticas para permitir que as algas migrassem em direção à luz A estrutura da canalrodopsina é bastante se melhante à da bacteriorrodopsina ver Figura 1031 Ela contém um grupo retinal ligado covalentemente que absorve luz e sofre uma reação de isomerização que induz uma al teração na conformação da proteína abrindo um canal iônico na membrana plasmática Em contraste com a bacteriorrodopsina que é uma bomba de prótons dirigida por luz a canalrodopsina é um canal catiônico dirigido por luz Com o uso de técnicas de engenharia genética a canalrodopsina pode ser expres sa em praticamente qualquer tipo celular de vertebrados ou invertebrados Os pesqui sadores inicialmente introduziram o gene em neurônios em cultura e mostraram que pulsos flashes de luz eram capazes de levar à ativação da canalrodopsina e induzir os neurônios a disparar potenciais de ação Visto que a frequência dos flashes de luz deter mina a frequência dos potenciais de ação é possível controlar a frequência dos pulsos neuronais com uma precisão de milissegundos C B 0 1 2 0 1 2 0 50 50 Fechado Aberto Inativado Fechado Tempo milissegundos Corrente estimuladora Potencial de membrana mV A Membrana plasmática em repouso Membrana despolarizada ABERTO INATIVADO FECHADO ESPAÇO EXTRACELULAR CYTOSOL Canal de Na controlado por voltagem Membrana refratária Figura 1130 Canais de Na e um potencial de ação A Um potencial de ação é desencadeado por um breve pulso de corrente que B despolariza parcial mente a membrana como mostrado no gráfico do potencial de membrana versus tempo A curva verde mostra como o potencial de membrana poderia sim plesmente ter relaxado novamente para o valor de repouso após o estímulo de despolarização inicial se não houvesse canais de Na controlados por voltagem na membrana A curva vermelha mostra o curso do potencial de ação que é causado pela abertura e subsequente inativação dos canais de Na controlados por vol tagem Os estados dos canais de Na estão indicados em B A membrana não pode disparar um segundo potencial de ação enquanto o canal de Na não tiver retornado do estado inativado para a conformação fechada até que isso aconteça a membrana estará refratária ao estímulo C Os três estados do canal de Na Quando a membrana está em repouso fortemente polarizada a conformação fechada do canal apresenta a menor energia livre sendo portanto mais estável quando a membrana é despolarizada a energia da conformação aberta é menor assim o canal apresenta uma alta probabilidade de abrir No entanto a energia livre da conformação inativada é ainda menor portanto após um período aleatoriamente variável gasto no estado aberto o canal tornase inativado Assim a conformação aberta corresponde a um estado metaestável que pode existir apenas transitoriamente quando a membrana despolariza Animação 1110 624 PARTE IV Organização interna da célula Logo neurobiólogos usaram essa abordagem para ativar neurônios específicos do cérebro de animaismodelo usados em experimentos Usando um minúsculo cabo de fibra óptica implantado próximo à região cerebral relevante eles puderam pulsar luz para ati var especificamente os neurônios que continham canalrodopsina induzindoos a disparar seus potenciais de ação Um grupo de pesquisadores expressou canalrodopsina em um subgrupo de neurônios de camundongos que se acreditava estarem envolvidos em com portamentos de agressividade quando essas células foram ativadas por luz o camundongo imediatamente atacou toda e qualquer coisa presente em seu ambiente inclusive outros camundongos e mesmo uma luva de látex inflada Figura 1132 quando a luz foi desliga da os neurônios silenciaramse e o comportamento do camundongo retornou ao normal Figura 1131 Propagação de um potencial de ação ao longo de um axônio A As volta gens que podem ser registradas a partir de um conjunto de eletrodos intracelulares colocados em intervalos ao longo do axônio B As altera ções nos canais de Na e os fluxos de corrente setas vermelhas curvas que dão origem a um potencial de ação em movimento A região do axônio com uma membrana despolarizada está sombreada em azul Observe que uma vez que um potencial de ação começa a progredir ele deve continuar na mesma direção apenas distanciandose do local de despolarização pois a inativação do canal de Na impede que a des polarização retroceda Axônio 0 1 2 3 A B Tempo milissegundos V1 V2 V3 V1 V2 V3 Na Na Na Na FECHADO INATIVADO ABERTO FECHADO Membrana plasmática do axônio CANAIS DE Na Axônio no tempo 0 disparo do potencial de ação Axônio no tempo 1 milissegundo Na Na Na Na FECHADO INATIVADO ABERTO FECHADO CANAIS DE Na REPOLARIZADO DESPOLARIZADO REPOUSO PROPAGAÇÃO PROPAGAÇÃO PROPAGAÇÃO REPOLARIZADO DESPOLARIZADO REPOUSO LUZ ACESA LUZ APAGADA LUZ APAGADA Figura 1132 Controle optogenético dos neurônios de agressão em camun dongos vivos Um gene que codifica a canalrodopsina foi introduzido em uma subpopulação de neurônios no hipotálamo de um camundongo Quando os neurô nios foram expostos ao piscar de uma luz azul pelo uso de um pequeno cabo de fi bras ópticas anteriormente implantado os canais de canalrodopsina se abriram des polarizando e ativando as células Quando a luz foi ligada o camundongo imediata mente tornouse agressivo e atacou a luva de borracha inflada quando a luz foi desli gada seu comportamento imediatamente voltou ao normal Animação 1111 De D Lin et al Nature 470221226 2011 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 627 Os canais de cátion controlados por voltagem são evolutiva e estruturalmente relacionados Os canais de Na não são o único tipo de canal catiônico controlado por voltagem que pode gerar um potencial de ação Os potenciais de ação em algumas células musculares óvulos e células endócrinas por exemplo dependem de canais de Ca 2 controlados por voltagem em vez de canais de Na Há uma quantidade surpreendente de diversidade estrutural e funcional dentro de cada uma das diferentes classes de canais de cátion controlados por voltagem ge rada tanto por múltiplos genes quanto pelo splicing alternativo de transcritos de RNA produzidos a partir de um mesmo gene No entanto as sequências de aminoácidos dos canais de Na K e Ca 2 conhecidos mostram fortes semelhanças sugerindo que eles pertençam a uma grande superfamília de proteínas evolutiva e estruturalmente relacio nadas e que compartilhem muitos princípios estruturais Enquanto a levedura unice lular S cerevisiae contém um único gene que codifica um canal de K controlado por voltagem o genoma do nematódeo C elegans contém 68 genes que codificam diferentes embora relacionados canais de K Essa complexidade indica que mesmo um sistema nervoso simples composto de apenas 302 neurônios utiliza um grande número de ca nais iônicos diferentes para computar suas respostas Os humanos que herdam genes mutantes para canais iônicos podem sofrer de di versas doenças neuronais musculares cardíacas ou que afetam o cérebro dependen do do tipo de célula que normalmente conteria o canal expresso pelo gene mutante As mutações em genes que codificam canais de Na controlados por voltagem em célu las musculoesqueléticas por exemplo podem causar miotonia uma condição na qual o relaxamento muscular após uma contração voluntária é fortemente retardado cau sando espasmos musculares dolorosos Em alguns casos isso ocorre devido a uma falha na inativação dos canais como resultado a entrada de Na persiste após o término do potencial de ação e reinicia repetidamente a despolarização da membrana e a contra ção muscular De modo similar mutações que afetam canais de Na ou de K no cérebro podem causar epilepsia na qual pulsos excessivos e sincronizados de grandes grupos de células nervosas causam eventos epilépticos convulsões ou desmaios A combinação particular de canais de íons condutores de Na K e Ca 2 expressos em um neurônio determina em grande parte como a célula dispara sequências repetiti vas de potencial de ação Algumas células nervosas podem repetir os potenciais de ação até 300 vezes por segundo outros neurônios pulsam em rajadas curtas de potenciais de ação separadas por períodos de silêncio outros ainda raramente pulsam mais do que um potencial de ação por vez Há uma incrível diversidade de neurônios no cérebro Diferentes tipos de neurônios apresentam propriedades de disparo características e estáveis Estimase que o cérebro humano contenha cerca de 10 11 neurônios e 10 14 conexões si nápticas Para tornar as coisas ainda mais complexas os circuitos neurais são continua mente moldados em resposta às experiências sendo modificados conforme aprendemos e armazenamos memórias e irreversivelmente alterados pela gradual perda de neurô nios e suas conexões à medida que envelhecemos Como um sistema tão complexo pode ser sujeito a tantas alterações e ainda assim continuar a funcionar de forma estável Uma teoria recente sugere que os neurônios individuais são dispositivos autoajustáveis cons tantemente ajustando a expressão de canais iônicos e receptores de neurotransmissores a fim de manter um funcionamento estável Como isso poderia funcionar Os neurônios podem ser classificados funcionalmente em diferentes tipos em parte com base na sua propensão em disparar potenciais de ação e em seu padrão de pulso Por exemplo alguns neurônios disparam potenciais de ação frequentemente enquanto outros pulsam raramente As propriedades de pulso de cada tipo de neurônio são determinadas em grande parte pelos canais de íon que a célula expressa O número de canais iônicos na membrana de um neurônio não é fixo conforme as condições mudam um neurônio pode modificar o número de canais despolarizantes Na e Ca 2 e hiperpolarizantes K e man ter suas proporções ajustadas a fim de manter seu comportamento de pulso característico 40 90 0 1 0 1 0 1 0 0 40 80 Tempo milissegundos A Potencial de membrana mV B Corrente na região pA C Corrente agregada Figura 1135 Medidas de patchclamp para um único canal de Na controlado por voltagem Uma região diminuta da membrana plasmática foi destacada de uma célula muscu lar embrionária de rato como na Figura 1134 A A membrana foi despolarizada por uma mudança abrupta de potencial de 90 para cerca de 40 mV B Três registros de correntes de três experimentos realizados na mesma porção de membrana Cada ciclo de corrente em B representa a abertura e o fechamento de um único canal Uma comparação dos três registros mostra que apesar de a duração de abertura e fechamento de canal variar muito a taxa na qual a corrente flui através de um canal aberto sua condutância é praticamente constante As pequenas flutuações observadas nos registros de correntes são de modo geral originárias de interferência elétrica no equipa mento de registro O fluxo de corrente na cé lula medido em picoamperes pA é mostrado como uma deflexão descendente da curva Por convenção o potencial elétrico no exterior da célula é definido como igual a zero C A soma das correntes medidas em 144 repetições do mesmo experimento Essa corrente agregada é equivalente à corrente normal de Na que po deria ser observada fluindo por uma região de membrana relativamente grande contendo 144 canais Uma comparação de B e C mostra que a cinética das correntes agregadas reflete a probabilidade de que qualquer canal individual esteja no estado aberto essa probabilidade diminui com o tempo à medida que os canais adotam sua conformação inativa na membrana despolarizada Dados de J Patlak e R Horn J Gen Physiol79333351 1982 Com permis são de The Rockefeller University Press CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 629 dessas sinapses químicas é muito mais versátil e adaptável do que o acoplamento elétrico direto por junções do tipo fenda nas sinapses elétricas discutido no Capítulo 19 as quais também são utilizadas pelos neurônios porém em menor frequência Os canais de íon controlados por transmissores também denominados re ceptores ionotrópicos são construídos de forma a rapidamente converter sinais quí micos extracelulares em sinais elétricos nas sinapses químicas Os canais estão con centrados em uma região especializada da membrana plasmática póssináptica na sinapse e abrem transitoriamente em resposta à ligação de moléculas neurotransmisso ras dessa forma produzindo uma pequena mudança de permeabilidade na membrana ver Figura 1136A Diferentemente dos canais controlados por voltagem responsáveis por potenciais de ação os canais controlados por transmissor são relativamente insensí veis ao potencial de membrana e portanto não podem produzir uma excitação autoam plificável Em vez disso eles produzem aumentos de permeabilidade local e portanto mudanças de potencial de membrana graduadas de acordo com a quantidade de neuro transmissor liberado na sinapse e o seu tempo de persistência na sinapse Um potencial de ação poderá ser acionado apenas se a soma das pequenas despolarizações neste sítio for capaz de abrir um número suficiente de canais de cátion controlados por voltagem na proximidade Isso pode exigir a abertura de canais iônicos controlados por transmissores em diversas sinapses nas proximidades do neurônioalvo As sinapses químicas podem ser excitatórias ou inibitórias Os canais iônicos controlados por transmissor diferem entre si de várias formas importan tes Primeiro como receptores eles apresentam sítios de ligação altamente seletivos para o neurotransmissor liberado a partir do terminal nervoso présináptico Segundo como ca nais eles são seletivos ao tipo de íon que cruzará a membrana plasmática isso determina a natureza da resposta póssináptica Os neurotransmissores excitatórios abrem canais de cátion provocando um influxo de Na e em muitos casos de Ca 2 que despolariza a mem brana póssináptica em direção ao potencial limiar para disparar um potencial de ação Os neurotransmissores inibitórios ao contrário abrem canais de Cl ou canais de K e isso suprime o pulso pois dificulta que os neurotransmissores excitatórios despolarizarem a membrana póssináptica Muitos transmissores podem ser excitatórios ou inibitórios de pendendo de onde são liberados com quais receptores eles se ligam e das condições iônicas que encontram A acetilcolina por exemplo pode excitar ou inibir dependendo do tipo de receptores de acetilcolina aos quais se liga Geralmente entretanto a acetilcolina o gluta mato e a serotonina são usados como transmissores excitatórios e o ácido aminobutírico GABA e a glicina são usados como transmissores inibitórios O glutamato por exemplo medeia a maior parte da sinalização excitatória no cérebro dos vertebrados Já discutimos como a abertura de canais de Na ou Ca 2 despolariza a membrana A abertura de canais de K tem o efeito oposto pois o gradiente de concentração de K está na direção contrária alta concentração no interior da célula e baixa no exterior A abertura dos canais de K tende a manter a célula próxima ao potencial de equilíbrio para K que como discutido antes é normalmente perto do potencial de repouso de mem brana porque no repouso os canais de K representam o principal tipo de canal aberto Quando canais de K adicionais são abertos tornase mais difícil afastar a célula do esta do de repouso Podemos entender o efeito da abertura de canais de Cl de modo similar A concentração de Cl é muito maior no exterior celular de que no interior ver Tabela 111 p 598 mas seu influxo é contraposto pelo potencial de membrana De fato para muitos neurônios o potencial de equilíbrio para o Cl é próximo ao potencial de repouso ou ainda mais negativo Por essa razão a abertura de canais de Cl tende a tamponar o poten cial de membrana conforme a membrana começa a despolarizar mais íons Cl carrega dos negativamente entram na célula e se contrapõem à despolarização Assim a abertura de canais de Cl torna mais difícil a despolarização da membrana e como consequência a excitação celular Algumas toxinas poderosas agem bloqueando a ação de neurotrans missores inibitórios a estricnina por exemplo ligase aos receptores de glicina e impede sua ação inibitória provocando espasmos musculares convulsões e morte No entanto nem toda sinalização química no sistema nervoso opera por meio des ses canais iônicos controlados por ligantes ionotrópicos Na verdade a maioria das mo léculas de neurotransmissores secretadas por terminais nervosos incluindo uma grande 632 PARTE IV Organização interna da célula Muitos fármacos psicoativos atuam nas sinapses Canais de íon controlados por transmissores são há muito tempo importantes alvos de fármacos Um cirurgião pode por exemplo promover o relaxamento muscular durante uma operação bloqueando os receptores de acetilcolina em células de músculo esque lético com curare uma droga de origem vegetal originalmente utilizada por indígenas sulamericanos na ponta de suas flechas de caça A maioria dos fármacos usados no tratamento da insônia da ansiedade da depressão e da esquizofrenia exerce seus efei tos nas sinapses químicas e muitos deles atuam pela ligação a canais controlados por transmissor Barbitúricos tranquilizantes como o diazepam e comprimidos para dormir como o zolpidem por exemplo ligamse a receptores de GABA potencializando a ação inibitória do GABA pois permitem que menores concentrações desse neurotransmissor sejam capazes de abrir canais de Cl Nossa crescente compreensão da biologia molecular de canais iônicos deverá permitir o desenvolvimento de uma nova geração de fármacos psicoativos que atuará ainda mais seletivamente para aliviar o fardo das doenças mentais Além dos canais iônicos muitos outros componentes da maquinaria de sinaliza ção sináptica são alvos potenciais para fármacos psicoativos Como mencionado antes após a liberação na fenda sináptica muitos neurotransmissores são eliminados por me canismos de reabsorção mediados por simportes dirigidos por Na A inibição desses transportadores prolonga o efeito do neurotransmissor reforçando assim a transmis são sináptica Muitos medicamentos antidepressivos incluindo a fluoxetina inibem a reabsorção de serotonina outros inibem a reabsorção de serotonina e de norepinefrina Os canais iônicos são as unidades moleculares básicas a partir das quais são construídos os dispositivos neuronais para sinalização e computação Para vislumbrar quão sofisticados esses dispositivos podem ser consideraremos vários exemplos que de monstram como a atividade coordenada de grupos de canais iônicos permite que você se mova sinta ou tenha recordações A transmissão neuromuscular envolve a ativação sequencial de cinco conjuntos diferentes de canais iônicos O processo descrito a seguir no qual um impulso nervoso estimula a contração de uma célula muscular ilustra a importância dos canais iônicos para células eletricamente excitáveis Essa resposta aparentemente simples requer a ativação sequencial de pelo menos cinco conjuntos diferentes de canais iônicos em um intervalo de poucos milisse gundos Figura 1139 1 O processo é iniciado quando um impulso nervoso atinge o terminal nervoso e despolariza a membrana plasmática do terminal A despolarização abre tempora Figura 1139 Sistema de canais iônicos em uma junção neuromuscular Esses canais iônicos controlados são essenciais para o estímulo da contração muscular por um impulso nervoso Os vários canais es tão numerados na sequência na qual são ativados como descrito no texto 1 2 3 4 5 Canal de Na controlado por voltagem Na Na Canais de Ca2 controlados por voltagem Ca2 Ca2 Canal de cátion controlado por acetilcolina Acetilcolina na vesícula sináptica Terminal nervoso Impulso nervoso Retículo sarcoplasmático Canal de liberação de Ca2 JUNÇÃO NEUROMUSCULAR EM REPOUSO JUNÇÃO NEUROMUSCULAR ATIVADA CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 633 riamente canais de Ca 2 controlados por voltagem nessa membrana présináptica Como a concentração de Ca 2 no exterior celular é mais de mil vezes maior do que a concentração de Ca 2 livre no interior da célula o Ca 2 flui para o terminal ner voso O aumento na concentração de Ca 2 no citosol do terminal nervoso desenca deia a liberação local de acetilcolina por exocitose na fenda sináptica 2 A acetilcolina liberada ligase a receptores de acetilcolina na membrana plasmáti ca da célula muscular abrindo temporariamente os canais catiônicos a eles asso ciados O influxo de Na resultante induz uma despolarização local da membrana 3 A despolarização local abre canais de Na controlados por voltagem nessa mem brana permitindo a entrada de mais Na que despolariza ainda mais a membrana Como consequência os canais de Na controlados por voltagem adjacentes abrem se e é provocada uma despolarização autopropagada um potencial de ação que se espalha envolvendo a membrana plasmática inteira ver Figura 1131 4 A despolarização generalizada da membrana plasmática da célula muscular ativa canais de Ca 2 controlados por voltagem nos túbulos transversais túbulos T dis cutidos no Capítulo 16 dessa membrana 5 Isso por sua vez faz os canais de liberação de Ca 2 em uma região adjacente à membrana do retículo sarcoplasmático RS abrirem transitoriamente e liberarem o Ca 2 estocado no RS para o interior do citosol O túbulo T e as membranas do RS estão proximamente associados com os dois tipos de canais unidos em uma estrutura especializada na qual a ativação do canal de Ca 2 controlado por volta gem na membrana plasmática do túbulo T provoca uma mudança conformacional do canal que é transmitida mecanicamente para o canal de liberação de Ca 2 na membrana do RS abrindoo e permitindo que o Ca 2 flua do lúmen do RS para o citoplasma ver Figura 1635 Esse aumento repentino na concentração de Ca 2 citosólico provoca a contração das miofibrilas na célula muscular Se o início da contração muscular por um neurônio motor é complexo uma inter conexão de canais iônicos ainda mais sofisticada é necessária para um neurônio integrar um grande número de sinais recebidos nas sinapses e computar uma resposta apropria da como discutiremos a seguir Neurônios individuais são dispositivos computacionais complexos No sistema nervoso central um único neurônio pode receber informação de milhares de outros neurônios e pode por sua vez formar sinapses com milhares de outras células Vários milhares de terminais nervosos por exemplo fazem sinapses em um neurônio motor médio na medula espinal cobrindo quase completamente seu corpo celular e dendritos Figura 1140 Algumas dessas sinapses transmitem sinais do cérebro ou da medula espinal outras trazem informações sensoriais dos músculos ou da pele O neu rônio motor deve combinar a informação recebida de todas essas fontes e reagir dispa rando potenciais de ação ao longo do seu axônio ou permanecendo em repouso Das muitas sinapses em um neurônio algumas tendem a excitálo e outras a inibilo O neurotransmissor liberado em uma sinapse excitatória causa uma pequena despolarização na membrana póssináptica denominada potencial póssináptico PPS excitatório enquanto o neurotransmissor liberado na sinapse inibitória em geral causa uma pequena hiperpolarização denominada PPS inibitório A membrana plasmática dos dendritos e do corpo celular da maioria dos neurônios contém relativamente baixa densidade de canais de Na controlados por voltagem e um PPS excitatório individual costuma ser muito pequeno para induzir um potencial de ação Em vez disso cada sinal recebido inicia um PPS local que diminui com a distância relativa ao local da sinapse Se os sinais chegam de forma simultânea em várias sinapses na mesma região da árvore dendrítica o PPS total na região será aproximadamente a soma dos PPSs individuais com PPSs inibitórios contribuindo negativamente no somatório Os PPSs de cada região vizinha espalhamse passivamente e convergem no corpo celular Para a transmissão de longa distância a magnitude combinada do PPS é então traduzida ou codificada na frequência de pulsos do potencial de ação quanto maior a estimulação despolarização maior será a frequência de potenciais de ação 634 PARTE IV Organização interna da célula A computação neuronal requer uma combinação de pelo menos três tipos de canais de K A intensidade da estimulação que um neurônio recebe é codificada pelo neurônio em uma frequência do potencial de ação para transmissão de longa distância A codificação ocorre em uma região especializada da membrana axonal conhecida como o segmento inicial ou cone axônico na junção do axônio e do corpo da célula ver Figura 1140 Essa membrana é rica em canais de Na controlados por voltagem mas ela também con tém pelo menos quatro outras classes de canais iônicos três seletivos para K e um sele tivo para Ca 2 que contribuem para a função de codificação do cone axônico As três va riedades de canais de K apresentam propriedades diferentes vamos nos referir a esses canais como canais de K tardios precoces ou de rápida inativação e ativados por Ca 2 Para entender a necessidade de múltiplos tipos de canais consideraremos primei ro o que poderia acontecer se os únicos canais iônicos controlados por voltagem presen tes na célula nervosa fossem os canais de Na Abaixo de um certo limiar de estimulação sináptica a despolarização da membrana do segmento inicial seria insuficiente para gerar um potencial de ação Com estimulação gradualmente crescente o limiar seria ul trapassado os canais de Na se abririam e um potencial de ação dispararia O potencial de ação poderia ser interrompido por inativação dos canais de Na Antes que outro po tencial de ação pudesse disparar esses canais teriam que se recuperar de sua inativação No entanto isso exigiria um retorno da voltagem de membrana para um valor bastante negativo o que não ocorreria enquanto o forte estímulo despolarizante dos PPSs fosse mantido Um tipo adicional de canal é necessário portanto para repolarizar a membra na após cada potencial de ação a fim de preparar a célula para um novo pulso Essa tarefa é realizada pelos canais de K tardios discutidos previamente em rela ção à propagação do potencial de ação ver Figura 1131 Eles são controlados por volta gem mas em função da sua cinética mais lenta eles abrem apenas durante a fase de de clínio do potencial de ação quando os canais de Na estão inativos Sua abertura permite um efluxo de K que faz a membrana retornar ao potencial de equilíbrio do K o qual é tão negativo que os canais de Na rapidamente se recuperam do estado inativado A re polarização da membrana também causa o fechamento dos canais de K tardios O cone axonal segmento inicial agora está reajustado de modo que o estímulo despolarizante Dendritos Dendrito Terminais nervosos présinápticos Axônio Bainha de mielina 01 mm B Segmento inicial A Figura 1140 Um neurônio motor na medula espinal A Milhares de termi nais nervosos formam sinapses no corpo celular e nos dendritos Eles trazem sinais de outras partes do organismo para con trolar os pulsos ou disparos de potenciais de ação ao longo do axônio único dessa grande célula B Fotomicrografia de fluorescência mostrando um corpo celular do neurônio e seus dendritos corados com um anticorpo fluorescente que reconhece uma proteína do citoesqueleto verde que não está presente nos axônios Milhares de terminais de axônios vermelho de outras células nervosas não visíveis fazem si napse no corpo celular e nos dendritos os terminais estão corados com um anticorpo fluorescente que reconhece uma proteína nas vesículas sinápticas B cortesia de Olaf Mundigl e Pietro de Camilli CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 635 dos sinais sinápticos recebidos pode disparar outro potencial de ação Dessa forma a es timulação sustentada dos dendritos e do corpo celular leva a pulsos repetitivos do axônio Entretanto a simples emissão de pulsos repetitivos por si só não é suficiente A frequência dos pulsos tem que refletir a intensidade do estímulo e um sistema simples de canais de Na e de canais de K tardios é inadequado para esse propósito Abaixo de um certo limiar de estímulo estável a célula não pulsará acima desse nível limiar ela subitamente começará a pulsar sob frequência relativamente rápida Os canais de K de rápida inativação ou precoces resolvem esse problema Eles também são controla dos por voltagem e abrem quando a membrana é despolarizada mas sua sensibilidade de voltagem específica e cinética de inativação são tais que eles atuam para reduzir a taxa de pulso em níveis de estímulo que estão pouco acima do limiar requisitado para o pulso Assim eles eliminam a descontinuidade na relação entre a taxa de pulsos e a intensidade do estímulo O resultado é uma velocidade de pulsos proporcional à força do estímulo despolarizante em uma faixa muito ampla Figura 1141 O processo de codificação é modulado ainda por outros dois tipos de canais iôni cos do segmento inicial que já foram mencionados canais de Ca 2 controlados por vol tagem e canais de K ativados por Ca 2 Eles atuam em conjunto para diminuir a resposta da célula a um estímulo prolongado constante um processo denominado adaptação Esses canais de Ca 2 são semelhantes aos canais de Ca 2 que medeiam a liberação de neurotransmissores a partir dos terminais axônicos présinápticos eles abrem quando um potencial de ação dispara ou pulsa transitoriamente permitindo que Ca 2 entre no citosol do axônio no segmento inicial O canal de K ativado por Ca 2 abre em resposta a uma concentração elevada de Ca 2 na face citoplasmática do canal Figura 1142 Um estímulo despolarizante forte e prolongado irá desencadear uma longa série de potenciais de ação cada um deles per mitindo um breve influxo de Ca 2 através dos canais de Ca 2 controlados por voltagem de tal forma que a concentração de Ca 2 local citosólica gradualmente se acumula a um nível alto o suficiente para abrir os canais de K ativados por Ca 2 Visto que o resultante aumento da permeabilidade da membrana ao K torna a membrana mais difícil de des polarizar o espaçamento entre um potencial de ação e o seguinte é aumentado Dessa forma um neurônio que é estimulado de modo contínuo por um período prolongado tornase gradualmente menos responsivo ao estímulo constante Tal adaptação que também pode ocorrer por outros mecanismos permite que um neurônio de fato o sistema nervoso em geral reaja sensivelmente a mudanças mes mo que elas ocorram em uma situação de alto background de estímulo constante Essa é uma das estratégias computacionais que nos auxilia por exemplo a sentir um leve toque no ombro e no entanto ignorar a pressão constante de nossas roupas Discutiremos a adaptação como uma característica geral em processos de sinalização celular em mais detalhes no Capítulo 15 Outros neurônios fazem considerações diferentes reagindo de diversas formas às suas entradas sinápticas de acordo com os distintos conjuntos de canais iônicos exis tentes em sua membrana Há várias centenas de genes que codificam canais iônicos no genoma humano dos quais cerca de 150 representam canais controlados por voltagem Complexidade adicional é introduzida pelo splicing alternativo dos transcritos de RNA e 100 200 100 200 PPS combinado PPS combinado 100 200 0 70 100 200 0 70 50 0 Limiar Magnitude do PPS combinado Frequência de pulsos potenciais de ação por segundo Tempo milissegundos Tempo milissegundos mV Potencial de membrana do axônio mV A B C Figura 1141 A magnitude do poten cial póssináptico PPS combinado é refletida na frequência de pulsos de potencial de ação A combinação de PPSs excitatórios e inibitórios produz um PPS combinado no segmento inicial Uma comparação de A e B mostra como a frequência de pulsos de um axônio au menta com um aumento do PPS combina do enquanto C resume a relação geral 636 PARTE IV Organização interna da célula pelo arranjo das diversas subunidades do canal em diferentes combinações Além disso canais iônicos são seletivamente posicionados em diferentes locais na membrana plas mática de um neurônio Alguns canais de K e Ca 2 estão concentrados nos dendritos e participam no processamento dos sinais de entrada que um neurônio recebe Como já vimos outros canais iônicos estão localizados no segmento inicial do axônio onde eles controlam o pulsar do potencial de ação e alguns canais controlados por ligantes estão distribuídos pelo corpo celular e dependendo de sua ocupação pelo ligante modulam a sensibilidade geral da célula às entradas sinápticas A multiplicidade de canais iônicos e suas localizações evidentemente permitem que cada um dos muitos tipos de neurônios possa ajustar seu comportamento elétrico para as tarefas específicas a serem executadas Uma das propriedades cruciais do sistema nervoso é a sua capacidade de aprender e lembrar Essa propriedade depende em parte da capacidade de sinapses individuais fortalecerem ou enfraquecerem de acordo com seu uso um processo chamado de plas ticidade sináptica Terminaremos este capítulo considerando um tipo incrível de canal iônico que tem um papel especial em algumas formas de plasticidade sináptica Ele está localizado em muitas sinapses excitatórias no sistema nervoso central onde é controla do tanto por voltagem quanto pelo neurotransmissor excitatório glutamato Ele também é o sítio de ação do fármaco psicoativo fenciclidina conhecido como pódeanjo A potencialização de longo prazo LTP no hipocampo de mamíferos depende da entrada de Ca 2 pelos canais receptores NMDA Quase todos os animais podem aprender mas os mamíferos parecem aprender excepcio nalmente bem ou assim gostamos de pensar No cérebro de um mamífero a região deno minada hipocampo apresenta um papel especial no aprendizado Quando ela é destruída em ambos os lados do cérebro a capacidade de formar novas memórias é praticamente perdida embora a memória previamente estabelecida permaneça Algumas sinapses no hi pocampo mostram uma impressionante forma de plasticidade sináptica com uso repetido enquanto potenciais de ação únicos ocasionais nas células présinápticas não deixam um rastro duradouro uma pequena explosão de pulsos repetitivos provoca potencialização de longo prazo LTP do inglês longterm potentiation de tal forma que potenciais de ação únicos subsequentes nas células présinápticas evocam uma resposta bastante aumentada nas células póssinápticas O efeito dura horas dias ou semanas de acordo com o número e a intensidade das sequências de pulsos repetitivos Somente as sinapses que foram ativadas exibem LTP as sinapses que permaneceram em repouso na mesma célula póssináptica não são afetadas Entretanto enquanto a célula está recebendo uma sequência de estimu lação repetitiva via um conjunto de sinapses se um potencial de ação isolado é liberado em outra sinapse na sua superfície essa última sinapse também sofrerá LTP mesmo conside randose que um potencial de ação único liberado no mesmo local em outro momento não tenha deixado efeito duradouro A regra fundamental em tais eventos parece ser que a LTP ocorre em qualquer oca sião quando uma célula présináptica pulsa uma ou mais vezes em um momento em que a membrana póssináptica está fortemente despolarizada quer por pulsos repetiti vos recentes da mesma célula présináptica quer por outros motivos Essa regra reflete o comportamento de uma classe específica de canais iônicos na membrana póssinápti ca O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central de mamíferos e os canais iônicos controlados por glutamato são os mais comuns de todos os canais controlados por neurotransmissor no cérebro No hipocampo como em ou tras partes a maioria das correntes despolarizantes responsáveis por PPSs excitatórios é carreada pelos canais iônicos controlados por glutamato denominados receptores AMPA que operam da formapadrão Figura 1143 Mas a corrente possui além disso um segundo e mais intrigante componente que é mediado por uma subclasse separada de canais iônicos controlados por glutamato conhecidos como receptores NMDA as sim chamados porque são seletivamente ativados pelo análogo artificial de glutamato NmetilDaspartato Os canais receptores NMDA são duplamente controlados abrindo apenas quando duas condições são simultaneamente satisfeitas o glutamato deve estar ligado ao receptor e a membrana deve estar fortemente despolarizada A segunda con dição é necessária para a liberação do Mg 2 que em geral bloqueia o canal em repouso CITOSOL 5 nm K Domínio controlado por Ca2 Domínio controlado por voltagem Poro Figura 1142 Estrutura de um canal de K ativado por Ca 2 O canal contém quatro subunidades idênticas que são mostradas em cores diferentes para maior clareza Ele é controlado tanto por voltagem quanto por Ca 2 A estrutura mostrada é composta das porções citosólicas e de membrana do canal cristalografadas separadamente Códigos PDB 2R99 1LNQ Canal 5 nm Domínio de ligação ao glutamato CITOSOL Domínio do poro Figura 1143 A estrutura do receptor AMPA Este receptor de glutamato ionotrópico nomeado a partir do análogo de glutamato ácido propiônico aamino3hidróxi5metil4 isoxazol é o mediador mais comum da trans missão sináptica excitatória rápida no sistema nervoso central Código PDB 3KG2 CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 637 Isso significa que os receptores NMDA normalmente são ativados apenas quando os re ceptores AMPA também são ativados e despolarizam a membrana Os receptores NMDA são essenciais para a LTP Quando eles são seletivamente bloqueados com um inibidor específico ou inativados geneticamente a LTP não ocorre embora a transmissão sináp tica comum continue indicando a importância dos receptores NMDA para indução de LTP Esses animais apresentam déficits específicos nas suas capacidades de aprendiza do mas comportamse quase normalmente quanto a outros aspectos Como os receptores NMDA medeiam a LTP A resposta é que esses canais quan do abertos são fortemente permeáveis ao Ca 2 que atua como um sinal intracelular na célula póssináptica acionando uma cascata de mudanças que são responsáveis pela LTP Assim a LTP é evitada quando os níveis de Ca 2 são mantidos artificialmente baixos na célula póssináptica pela injeção do quelante de Ca 2 EGTA nessa célula e pode ser induzida aumentandose artificialmente os níveis de Ca 2 intracelular Entre as mudan ças de longo prazo que aumentam a sensibilidade da célula póssináptica ao glutama to está a inserção de novos receptores AMPA na membrana plasmática Figura 1144 Em algumas formas de LTP ocorrem alterações também na célula présináptica para que ela libere mais glutamato do que o normal quando ela é ativada posteriormente Se as sinapses fossem capazes apenas de LTP elas rapidamente tornarseiam satu radas e portanto teriam um valor limitado como um dispositivo de armazenamento de informações Na verdade elas também exibem depressão de longo prazo LTD do inglês longterm depression com efeito de longa duração na redução do número de recepto res AMPA na membrana póssináptica Isso é alcançado pela degradação dos receptores AMPA após sua endocitose seletiva Surpreendentemente a LTD também requer a ativa ção de receptores NMDA e a elevação de Ca 2 Como o Ca 2 induz efeitos opostos em uma mesma sinapse A verdade é que esse controle bidirecional da intensidade sináptica de pende da magnitude da elevação dos níveis de Ca 2 altos níveis de Ca 2 ativam proteínas cinase e LTP ao passo que níveis moderados de Ca 2 ativam proteínasfosfatase e LTD Há evidências de que os receptores NMDA têm um importante papel na plastici dade sináptica e na aprendizagem em outras partes do cérebro assim como no hipo campo Além disso eles têm um papel fundamental no ajuste de padrões anatômicos de conexões sinápticas à luz da experiência durante o desenvolvimento do sistema nervoso Assim os neurotransmissores liberados nas sinapses além de liberarem sinais elé tricos temporários também podem alterar as concentrações de mediadores intracelula res que causam mudanças duradouras na eficácia da transmissão sináptica No entanto ainda é incerto como essas mudanças perduram por semanas meses ou uma vida intei ra em face da reposição normal dos constituintes celulares Resumo Os canais iônicos formam poros aquosos através da bicamada lipídica e permitem que os íons inorgânicos de tamanho e carga apropriados cruzem a membrana a favor de seus gradientes eletroquímicos em taxas em torno de mil vezes maiores do que aquelas atingi das por qualquer transportador conhecido Os canais são controlados e em geral abrem temporariamente em resposta a uma perturbação específica na membrana como uma Célula présináptica Célula póssináptica Glutamato Receptor NMDA Mg2 Receptor AMPA Membrana polarizada O glutamato liberado pelo terminal nervoso présináptico ativado abre canais de receptores AMPA permitindo influxo de Na que despolariza a membrana póssináptica Membrana despolarizada Ca2 Na A despolarização remove o bloqueio de Mg2 do canal de receptor NMDA que com glutamato ligado permite a entrada de Ca2 na célula póssináptica O Ca2 aumentado no citosol induz a célula póssináptica a inserir novos receptores AMPA na membrana plasmática aumentando a sensibilidade celular ao glutamato Figura 1144 Eventos de sinaliza ção na potencialização de longo prazo Embora não estejam ilustradas alterações de melhoria de transmissão também podem ocorrer nos terminais nervosos présinápticos em LTP os quais podem ser induzidos por sinais retrógra dos da célula póssináptica CAPÍTULO 11 Transporte de membrana de pequenas moléculas e propriedades elétricas das membranas 639 aceleração referente à gravidade de um corpo em queda livre no vácuo Na água no entanto um íon se move em velocidade constante dentro de um campo elétrico Por que isso acontece 119 Em um subgrupo de canais de K controlados por vol tagem o Nterminal de cada subunidade age como uma bola amarrada à extremidade de uma corrente que obstrui a ex tremidade citoplasmática dos poros logo depois que ele abre inativando assim o canal Esse modelo de bola e corrente para a rápida inativação de canais de K controlados por volta gem foi elegantemente demonstrado pelo canal de K shaker da Drosophila melanogaster O canal de K shaker da Drosophila recebeu este nome a partir da forma mutante que apresenta comportamento excitável mesmo moscas anestesiadas per manecem com tremores A deleção do aminoácido Ntermi nal do canal shaker normal dá origem a um canal que abre em resposta à despolarização da membrana mas que permanece aberto em vez de fechar rapidamente como sua versão normal Um peptídeo MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ que correspon de à porção Nterminal deletada pode inativar a abertura do canal se usado em concentração de 100 M A concentração de peptídeo livre 100 M necessária para inativar o canal defeituoso de K é de alguma forma se melhante à concentração local do peptídeo ligado à molécu la modelo de bola e corrente que normalmente existe no canal Suponha que a bola acorrentada possa explorar uma semiesfera volume 23πr 3 com um raio de 214 nm que é o comprimento de uma corrente polipeptídica Figura Q112 Calcule a concentração relativa a uma bola nessa semiesfera Compare esse valor com a concentração de pep tídeo livre necessária para inativar o canal 214 nm Figura Q112 Uma bola ligada por uma corrente a um canal de K controlado por voltagem 1110 O axônio gigante da lula Figura Q113 ocupa uma posição única na história da nossa compreensão do poten cial de membrana celular e ação dos neurônios Quando um eletrodo é inserido em um axônio gigante intacto o poten cial de membrana registra 70 mV Quando o axônio sus penso em uma solução de água do mar é estimulado para a condução de impulso nervoso o potencial de membrana é transitoriamente alterado de 70 mV para 40 mV Figura Q113 A lula Loligo Esta lula tem aproximadamente 15 cm de com primento Para íons univalentes e a 20C 293 K a equação de Nernst equivale a V 58 mV log C0Ci onde C0 e Ci correspondem às concentrações externas e in ternas respectivamente Usando essa equação calcule o potencial através da membrana em repouso 1 assumindo que ele é devido uni camente ao K e 2 assumindo que ele é devido unicamente ao Na As concentrações de Na e K no citosol do axônio e na água do mar são indicadas na Tabela Q111 Que re sultado está mais próximo do potencial de repouso medido Que resultado está mais próximo do potencial de ação me dido Explique por que seus resultados se aproximam dos potenciais de ação e repouso medidos 1111 Canais de cátion controlados por acetilcolina na junção neuromuscular abrem em resposta à acetilcolina li berada pelo terminal nervoso e permitem que íons Na pe netrem na célula muscular o que provoca a despolarização da membrana e consequentemente leva à contração mus cular A Medidas de patchclamp mostraram que os músculos de ratos jovens têm canais de cátion que respondem à ace tilcolina Figura Q114 Quantos tipos de canal existem ali Como você pode afirmar isso B Calcule para cada tipo de canal o número de íons que entram em 1 milissegundo 1 ampere equivale a uma cor rente de 1 coulomb por segundo 1 pA é igual a 10 12 ampe res Um íon com uma única carga como o Na possui carga de 16 10 9 coulombs 2 pA 40 ms Figura Q114 Medidas de patchclamp de canais de cátion controlados por acetilcolina em músculo de ratos jovens TABELA Q111 Composição iônica da água do mar e do citosol em um axônio gigante de lula Íon Citosol Água do mar Na 65 mM 430 mM K 344 mM 9 mM 640 PARTE IV Organização interna da célula REFERÊNCIAS Gerais Engel A Gaub HE 2008 Structure and mechanics of membrane proteins Annu Rev Biochem 77 127148 Hille B 2001 Ionic Channels of Excitable Membranes 3rd ed Sunderland MA Sinauer Stein WD 2014 Channels Carriers and Pumps An Introduction to Membrane Transport 2nd ed San Diego CA Academic 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distribuição complexos transportam produtos específicos de um compartimento a outro Para entender a célula eucariótica é essencial conhecer como a célula cria e mantém esses compartimentos o que ocorre em cada um deles e como as moléculas se movem entre eles As proteínas conferem características estruturais e propriedades funcionais a cada compartimento Elas catalisam as reações que lá ocorrem e transportam seletivamente pequenas moléculas para dentro ou para fora do compartimento Para organelas envol tas por membrana as proteínas também servem como marcadores de superfície organe laespecíficos que direcionam novas remessas de proteínas e lipídeos para as organelas apropriadas Uma célula animal contém em torno de 10 bilhões 10 10 de moléculas proteicas de talvez 10 mil tipos e a síntese de quase todas elas começa no citosol o espaço do lado de fora das organelas delimitadas por membrana Cada proteína recémsintetizada é en tão entregue especificamente à organela que dela necessite O transporte intracelular de proteínas é o tema central deste capítulo e do próximo Ao acompanhar o tráfego das proteínas de um compartimento a outro podemos começar a entender o labirinto con fuso de membranas intracelulares COMPARTIMENTALIZAÇÃO DAS CÉLULAS Neste breve resumo dos compartimentos celulares e das relações entre eles organiza mos conceitualmente as organelas em um pequeno número de famílias distintas discu timos como as proteínas são direcionadas a organelas específicas e explicamos como as proteínas atravessam as membranas das organelas Todas as células eucarióticas têm o mesmo conjunto básico de organelas envoltas por membranas Muitos processos bioquímicos vitais ocorrem dentro das membranas ou em sua super fície Enzimas aderidas à membrana por exemplo catalisam o metabolismo de lipídeos e tanto a fosforilação oxidativa como a fotossíntese necessitam de uma membrana para acoplar o transporte de H à síntese de ATP Além de proporcionar um aumento na área de membranas para abrigar reações bioquímicas os sistemas de membranas intrace lulares formam compartimentos fechados que são separados do citosol criando assim espaços aquosos funcionalmente especializados dentro da célula Nesses espaços sub conjuntos de moléculas proteínas reagentes íons são concentrados para otimizar as reações bioquímicas nas quais participam Como a bicamada lipídica das membranas celulares é impermeável a muitas moléculas hidrofílicas a membrana de uma organela deve conter proteínas de transporte de membrana para a importação e a exportação de metabólitos específicos Cada membrana de organela deve ser dotada também de um mecanismo para a importação e a incorporação na organela de proteínas específicas que a tornam única A Figura 121 ilustra os principais compartimentos intracelulares comuns às célu las eucarióticas O núcleo contém o genoma além do DNA mitocondrial e de cloroplas tos e é o sítio principal de síntese de DNA e RNA O citoplasma circundante consiste no citosol e nas organelas citoplasmáticas nele imersas O citosol que representa um pouco mais da metade do volume total da célula é o principal sítio de síntese e degradação de CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 643 membrana plasmática é apenas uma membrana menor na maioria das células eucarió ticas Figura 122 A abundância e a forma das organelas envoltas por membrana são reguladas em função das necessidades da célula Isso é particularmente aparente em células que são altamente especializadas e como resultado dependem de certas organelas específicas As células plasmáticas por exemplo que secretam seu próprio peso continuamente em moléculas de anticorpos na corrente sanguínea contêm uma quantidade enorme ampli ficada de RE rugoso que é encontrado em enormes e achatadas camadas Células espe cializadas na síntese de lipídeos também expandem seu RE mas nesse caso a organela forma uma rede de túbulos contorcidos Além disso organelas envoltas por membrana costumam ser encontradas em posições características no citoplasma Na maioria das células por exemplo o aparelho de Golgi está localizado próximo ao núcleo enquanto a rede de túbulos do RE estendese do núcleo por todo o citosol Essas distribuições ca racterísticas dependem das interações das organelas com o citoesqueleto A localização de ambos RE e aparelho de Golgi por exemplo depende do conjunto intacto de micro túbulos se os microtúbulos forem despolimerizados experimentalmente com um fár maco o aparelho de Golgi fragmentase e é disperso pela célula e a rede de RE colapsa para o centro da célula discutido no Capítulo 16 O tamanho a forma a composição e a localização são igualmente importantes e regulam características que fundamentalmen te contribuem para a função dessas organelas A origem evolutiva pode ajudar a explicar a relação topológica das organelas Para entender a relação entre os compartimentos das células é interessante entender como eles teriam evoluído Os precursores das primeiras células eucarióticas são consi derados células relativamente simples parecidas com células bacterianas ou procarió ticas que possuem uma membrana plasmática mas não membranas internas Em tais células a membrana plasmática realiza todas as funções dependentes de membrana incluindo o bombeamento de íons a síntese de ATP a secreção de proteína e a síntese de lipídeos As células eucarióticas atuais típicas são de 10 a 30 vezes maiores em di mensão linear e de 1000 a 10000 vezes maiores em volume do que uma bactéria típica como Escherichia coli A profusão de membranas internas pode ser vista em parte como uma adaptação a esse aumento de tamanho a célula eucariótica tem uma razão muito TABELA 122 Quantidades relativas de tipos de membranas em dois tipos de células eucarióticas Tipo de membrana Percentual da membrana celular total Hepatócito Célula exócrina pancreática Membrana plasmática 2 5 Membrana do RE rugoso 35 60 Membrana do RE liso 16 1 Membrana do aparelho de Golgi 7 10 Mitocôndria Membrana externa 7 4 Membrana interna 32 17 Núcleo Membrana interna 02 07 Membrana das vesículas secretoras Não determinado 3 Membrana do lisossomo 04 Não determinado Membrana do peroxissomo 04 Não determinado Membrana do endossomo 04 Não determinado Essas duas células têm tamanhos muito diferentes um hepatócito médio tem volume de cerca de 5000 m 3 em comparação com 1000 m 3 da célula pancreática exócrina As áreas de membrana celular total são estima das em cerca de 110000 m 2 e 13000 m 2 respectivamente TABELA 121 Volumes relativos ocupados pelos principais compartimentos intracelulares em uma célula do fígado hepatócito Compartimento intracelular Percentual do volume celular total Citosol 54 Mitocôndria 22 Cisternas do RE rugoso 9 Cisternas do RE liso mais cisterna de Golgi 6 Núcleo 6 Peroxissomos 1 Lisossomos 1 Endossomos 1 CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 645 As proteínas podem moverse entre os compartimentos de diferentes maneiras A síntese de todas as proteínas começa em ribossomos no citosol exceto as poucas pro teínas que são sintetizadas nos ribossomos das mitocôndrias e dos plastídIos Seu des tino subsequente depende da sua sequência de aminoácidos a qual pode conter sinais de endereçamento que direcionam seu envio a locais fora do citosol ou a superfícies de organelas Algumas proteínas não possuem um sinal de endereçamento e consequen temente permanecem no citosol como residentes permanentes Muitas outras todavia apresentam sinais de endereçamento específicos que direcionam seu transporte do ci tosol ao núcleo ao RE às mitocôndrias aos plastídios ou aos peroxissomos os sinais de endereçamento também podem orientar o transporte de proteínas do RE a outros destinos na célula Para entender os princípios gerais pelos quais os sinais de endereçamento ope ram é importante distinguir três caminhos fundamentalmente diferentes pelos quais as proteínas se movem de um compartimento a outro Esses três mecanismos são descritos a seguir e os passos de transporte nos quais eles operam são delineados na Figura 125 Discutimos os primeiros dois mecanismos transporte fechado e transporte transmem brana neste capítulo e o terceiro transporte vesicular setas verdes na Figura 125 no Capítulo 13 1 No transporte controlado por comportas proteínas e moléculas de RNA se mo vimentam entre o citosol e o núcleo através de complexos do poro nuclear no en Figura 123 Uma via sugerida para a evolução de células eucarióticas e suas membranas internas Como discutido no Capítulo 1 existem evidências de que o genoma nuclear em células eucarióticas evoluiu a partir de uma arqueia ancestral Por exemplo homólogos claros entre actinas tubulinas histonas e o sistema de replicação do DNA nuclear são encontra dos em arqueias mas não em bactérias Então acreditase agora que as primeiras células eucarióticas surgiram quando uma arqueia anaeróbica ancestral uniuse com uma bactéria aeróbica cerca de 16 bilhão de anos atrás Tal como indicado o envelope nuclear pode ter se originado a partir de uma invaginação da membrana plasmática dessa arqueia ancestral uma invaginação que protegeu seu cromosso mo permitindo ainda o acesso do DNA ao citosol conforme necessário para o DNA para dirigir a síntese de proteínas Esse envelope pode ter sido mais tarde comple tamente comprimido para fora da mem brana plasmática de modo a produzir um compartimento nuclear separado rodeado por uma dupla membrana Visto que essa dupla membrana é atravessada por com plexos de poro nuclear o compartimento nuclear é topologicamente equivalente ao citosol Em contrapartida o lúmen do RE é contínuo com o espaço entre as membranas nucleares interna e externa e topologicamente equivalente ao espaço extracelular ver Figura 124 Adaptada de J Martijn e TJG Ettema Biochem Soc Trans 411 451457 2013 Desenvolvimento do envelope nuclear Mitocôndria Promitocôndria BACTÉRIA AERÓBICA SENDO TOMADA INTACTA PARA VIVER SIMBIOTICAMENTE COMO UMA PROMITOCÔNDRIA MEMBRANAS CERCAM CADA VEZ MAIS O CROMOSSOMO DE ARQUEIAS ANAERÓBICAS PARA PROTEGÊLO Membrana plasmática Parede celular DNA genômico de arqueia Citosol Núcleo Retículo endoplasmático O DESENVOLVIMENTO DE MÚLTIPLAS MITOCÔNDRIAS FORNECE ENERGIA PARA A EVOLUÇÃO DE SISTEMAS DE MEMBRANAS ADICIONAIS E CÉLULAS MUITO MAIORES A FAGOCITOSE E A DIGESTÃO DE OUTROS PROCARIOTOS BACTÉRIAS E ARQUEIAS AUMENTAM GRANDEMENTE A TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES ACELERANDO O PROCESSO EVOLUTIVO A PERDA DA PAREDE CELULAR RÍGIDA EM UMA ARQUEIA ANAERÓBICA ANCESTRAL FACILITA A TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES AS PRIMEIRAS CÉLULAS EUCARIÓTICAS SÃO AERÓBICAS 646 PARTE IV Organização interna da célula velope nuclear Os complexos do poro nuclear funcionam como canais seletivos que auxiliam o transporte ativo de macromoléculas específicas e conjuntos macro moleculares entre os dois espaços equivalentes topologicamente embora também permitam a difusão livre de pequenas moléculas 2 Na translocação de proteínas translocadores de proteínas transmembrana trans portam diretamente proteínas específicas através da membrana do citosol para um espaço que é topologicamente diferente A molécula de proteína transportada em geral precisa desdobrarse para passar pelo translocador O transporte inicial das proteínas selecionadas do citosol para o lúmen do RE ou para a mitocôndria por exemplo ocorre dessa forma Proteínas integrais da membrana costumam usar os mesmos translocadores que deslocam apenas parcialmente essas proteínas atra vés da membrana tornandose então incorporadas à bicamada lipídica 3 No transporte vesicular intermediários de transporte envoltos por membrana vesículas de transporte esféricas que podem ser pequenas ou grandes fragmentos de organelas com forma irregular levam proteínas de um compartimento topolo gicamente equivalente a outro As vesículas e os fragmentos de transporte são car regados com uma leva de moléculas derivadas do lúmen de um compartimento à medida que se desprendem da sua membrana o conteúdo é descarregado em um segundo compartimento por fusão com a membrana que o envolve Figura 126 A transferência de proteínas solúveis do RE ao aparelho de Golgi por exemplo ocorre dessa maneira Devido ao fato de as proteínas transportadas não cruzarem uma membrana o transporte vesicular pode mover proteínas somente entre com partimentos topologicamente equivalentes ver Figura 124 Cada uma das formas de transferência de proteínas normalmente é guiada por sinais de endereçamento na proteína transportada que são reconhecidos pelos recep tores de endereçamento complementares Se uma proteína grande deve ser importada pelo núcleo por exemplo ela deve possuir um sinal de endereçamento que é reco nhecido por proteínas receptoras que a guiam ao longo do complexo do poro nuclear Se uma proteína deve ser transferida diretamente através da membrana ela deve ter Figura 124 Compartimentos topo logicamente equivalentes nas vias secretora e endocítica em uma célula eucariótica Os compartimentos são tidos como topologicamente equivalentes se puderem comunicarse uns com os outros no sentido de que as moléculas podem circular de um para outro sem precisar atravessar a membrana Os espaços topo logicamente equivalentes são mostrados em vermelho A As moléculas podem ser transportadas de um compartimento para outro topologicamente equivalente por ve sículas que brotam de um compartimento e se fundem com outro B Em princípio os ciclos de formação de membrana e fusão permitem ao lúmen de qualquer organela mostrada comunicarse um com o outro e com o exterior celular por meio de vesículas de transporte As setas azuis indicam a extensa rede de vias de tráfego para o exterior e para o interior discutido no Capítulo 13 Algumas organelas em particular as mitocôndrias e em células vegetais os plastídios não estão envolvi das nessa comunicação e estão isoladas do tráfego vesicular entre as organelas aqui mostradas Lisossomo RE rugoso Membrana nuclear interna Membrana nuclear externa Envelope nuclear Aparelho de Golgi Endossomo Vesícula secretora Núcleo Membrana plasmática Molécula carregada A B Figura 125 Um roteiro simplificado do tráfego de proteínas em uma célula eu cariótica As proteínas podem moverse de um compartimento a outro por transporte controlado por comportas vermelho por translocação de proteínas azul ou por trans porte vesicular verde Os sinais que direcionam o movimento de uma dada proteína ao longo do sistema e portanto determinam sua localização final na célula estão contidos na sequência de aminoácidos de cada proteína A jornada começa com a síntese de uma proteína em um ribossomo no citosol e para muitas proteínas termina quando a proteína alcança seu destino final Outras proteínas trafegam entre o núcleo e o citosol Em cada estação intermediária retângulos uma decisão é tomada quanto à retenção da proteína naquele compartimento ou à continuação do seu transporte Um sinal de ende reçamento pode direcionar tanto a retenção como a saída de um compartimento Iremos nos referir a esta figura frequentemente como um guia neste capítulo e no próximo destacando em cor a via particular sendo discutida NÚCLEO PEROXISSOMOS MITOCÔNDRIAS PLASTÍDIOS RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO LEGENDA transporte controlado por comportas transporte transmembrana transporte vesicular CITOSOL EXTERIOR DA CÉLULA GOLGI ENDOSSOMO TARDIO LISOSSOMO ENDOSSOMO PRIMÁRIO VESÍCULAS SECRETORAS CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 647 um sinal de endereçamento que é reconhecido pelo translocador Da mesma forma se uma proteína deve ser carregada em um certo tipo de vesícula ou retida em certas organelas um receptor complementar na membrana apropriada deve reconhecer seu sinal de endereçamento As sequênciassinal e os receptores de endereçamento direcionam proteínas aos destinos celulares corretos A maioria dos sinais de endereçamento de proteínas envolvidos no transporte trans membrana encontrase em uma sequência de aminoácidos em geral um trecho de 15 a 60 resíduos Tais sequênciassinal são frequentemente encontradas na porção Nter minal da cadeia polipeptídica e em muitos casos peptidasessinal especializadas remo vem a sequênciasinal da proteína finalizada uma vez que o processo de endereçamento está completo Sequênciassinal também podem ser extensões internas de aminoácidos as quais permanecem como parte da proteína Tais sinais são usados em transportes controlados por comportas para dentro do núcleo Os sinais de endereçamento podem ser compostos por múltiplas sequências de aminoácidos internas que formam um ar ranjo específico tridimensional de átomos na superfície das proteínas tais regiõessinal são algumas vezes usados para a importação nuclear e em transporte vesicular Cada sequênciasinal especifica um destino particular na célula As proteínas des tinadas para transferência ao RE em geral possuem uma sequênciasinal na sua região Nterminal a qual inclui como característica uma sequência composta de cerca de 5 a 10 aminoácidos hidrofóbicos Muitas dessas proteínas passarão do RE para o aparelho de Golgi mas aquelas com uma sequênciasinal específica de quatro aminoácidos na sua região Cterminal são reconhecidas como residentes no RE e retornam a ele As pro teínas destinadas às mitocôndrias têm sequênciassinal de outro tipo ainda nas quais aminoácidos carregados positivamente se alternam com aminoácidos hidrofóbicos Por fim muitas proteínas destinadas aos peroxissomos têm um peptídeosinal de três ami noácidos característicos na sua região Cterminal A Tabela 123 apresenta algumas sequênciassinal específicas Experimentos nos quais o peptídeo é transferido de uma proteína para outra por técnicas de enge nharia genética têm demonstrado a importância de cada uma dessas sequências para a proteínaalvo Colocando a sequência sinal Nterminal do RE no começo de uma proteína citosólica por exemplo a proteína é redirecionada para o RE a remoção ou mutação na sequênciasinal de uma proteína do RE causa sua retenção no citosol As sequênciassinal são por conseguinte tanto necessárias como suficientes para o ende reçamento de proteínas Embora suas sequências de aminoácidos possam variar mui to as sequênciassinal das proteínas que têm o mesmo destino são funcionalmente intercambiáveis propriedades físicas como a hidrofobicidade em geral parecem ser mais importantes no processo de reconhecimento de sinal do que a exata sequência de aminoácidos As sequênciassinal são reconhecidas pelos receptores de endereçamento com plementares que guiam proteínas ao seu destino apropriado onde os receptores des carregam suas cargas Os receptores funcionam cataliticamente depois de completar uma rodada de entrega eles retornam ao seu ponto de origem para serem reutilizados Muitos receptores de endereçamento reconhecem classes de proteínas mais do que pro teínas específicas Eles podem portanto ser vistos como sistemas de transporte públi co dedicados à entrega de numerosos componentes diferentes à sua localização correta dentro da célula Figura 126 Brotamento e fusão de vesículas durante o transporte vesicular As vesículas de transporte formamse brotam em um compartimento doador e fundemse com outro compartimento topologicamente equivalente alvo No processo os compo nentes solúveis pontos vermelhos são transferidos de lúmen para lúmen Note que a membrana também é transferida e que a orientação original tanto de proteínas como de lipídeos da membrana do compartimento doador é preservada na membrana do compar timentoalvo Assim as proteínas de membrana retêm sua orientação assimétrica com os mesmos domínios sempre orientados para o citosol COMPARTIMENTO DOADOR COMPARTIMENTO ALVO Vesícula de transporte no citoplasma Vesícula brotando com conteúdo selecionado para transporte BROTAMENTO FUSÃO Bicamada lipídica Proteína de membrana Conteúdo luminal 648 PARTE IV Organização interna da célula A maioria das organelas não pode ser construída de novo elas necessitam de informações presentes na própria organela Quando uma célula se reproduz por divisão ela precisa duplicar suas organelas além dos seus cromossomos Em geral as células realizam essa tarefa com um aumento das organelas existentes por incorporação de novas moléculas as organelas aumentadas então dividemse e são distribuídas às duas célulasfilhas Assim cada célulafilha herda de sua mãe um conjunto completo de membranas celulares especializadas Essa heran ça é essencial uma vez que a célula não produz tais membranas do zero Se o RE fosse completamente removido da célula por exemplo como a célula poderia reconstruílo Como discutiremos mais adiante as proteínas de membrana que definem o RE e reali zam muitas das suas funções são produto do RE Um novo RE não pode ser feito sem um RE já existente ou pelo menos sem uma membrana que contenha especificamente as proteínas translocadoras requeridas para importar proteínas selecionadas do citosol ao RE incluindo os próprios translocadores específicos do RE O mesmo é verdade para mitocôndrias e plastídios Portanto parece que as informações necessárias à construção de organelas não residem exclusivamente no DNA que especifica as proteínas das organelas A infor mação na forma de pelo menos uma proteína distinta preexistente na membrana da organela também é necessária e essa informação é passada da célula parental às célulasfilhas na forma da própria organela Provavelmente tal informação seja essencial à propagação da organização da célula em compartimentos assim como a informação no DNA é essencial à propagação dos nucleotídeos e das sequências de aminoácidos da célula Como se discute em mais detalhes no Capítulo 13 no entanto do RE brotam ve sículas de transporte em um fluxo constante que incorporam apenas um subconjunto de proteínas do RE possuindo portanto uma composição diferente do próprio RE De modo similar da membrana plasmática constantemente brotam vários tipos de vesícu las endocíticas especializadas Assim algumas organelas podem formarse de outras or ganelas e não precisam ser herdadas no processo de divisão celular Resumo As células eucarióticas contêm organelas delimitadas por membranas intracelulares que totalizam quase metade do volume total das células As principais que estão presentes em todas as células eucarióticas são o retículo endoplasmático o aparelho de Golgi o núcleo as mitocôndrias os lisossomos os endossomos e os peroxissomos as células vegetais tam bém contêm plastídios como cloroplastos Essas organelas contêm distintos conjuntos de proteínas as quais medeiam cada função única das organelas TABELA 123 Algumas sequênciassinal típicas Função da sequênciasinal Exemplo de sequênciasinal Importar para o núcleo ProProLysLysLysArgLysVal Exportar do núcleo MetGluGluLeuSerGlnAlaLeuAlaSerSerPhe Importar para a mitocôndria H3NMetLeuSerLeuArgGlnSerIleArgPhePheLysProAlaThrArgThrLeuCysSerSerArgTyrLeu Leu Importar para o plastídio H3NMetValAlaMetAlaMetAlaSerLeuGlnSerSerMetSerSerLeuSerLeuSerSerAsnSerPheLeu GlyGlnProLeuSerProIleThrLeuSerProPheLeuGlnGly Importar para os peroxissomos SerLysLeuCOO Importar para o RE H3NMetMetSerPheValSerLeuLeuLeuValGlyIleLeuPheTrpAlaThrGluAlaGluGlnLeuThrLys CysGluValPheGln Retornar ao RE LysAspGluLeuCOO Alguns aspectos característicos das diferentes classes de sequênciassinal estão destacados em cores diferentes Quando sua importância para a função da se quênciasinal é conhecida os aminoácidos carregados positivamente são mostrados em vermelho e os carregados negativamente em verde Do mesmo modo os aminoácidos hidrofóbicos importantes são mostrados em laranja e os aminoácidos hidroxilados em azul H3N indica a região Nterminal de uma proteína COO indica a região Cterminal CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 649 Cada proteína organelar recémsintetizada deve encontrar seu caminho a partir de um ribossomo no citosol onde a proteína é sintetizada até a organela onde exercerá sua função A proteína segue uma via específica guiada por sinais de endereçamento em sua sequência de aminoácidos que funcionam como sequênciassinal ou regiõessinal Os sinais de endereçamento são reconhecidos pelos receptores de endereçamento comple mentares que entregam a proteína à organelaalvo apropriada As proteínas com função citosólica não contêm sinais de endereçamento e permanecem no citosol depois de serem sintetizadas Durante a divisão celular as organelas como o RE e as mitocôndrias são distribuí das a cada célulafilha Essas organelas contêm informações necessárias à sua montagem e então não podem ser feitas de novo TRANSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE O NÚCLEO E O CITOSOL O envelope nuclear encerra o DNA e define o compartimento nuclear Esse envelo pe consiste em duas membranas concêntricas penetradas pelos complexos do poro nuclear Figura 127 Embora as membranas interna e externa sejam contínuas elas mantêm composições proteicas distintas A membrana nuclear interna contém pro teínas que atuam como sítios de ligação para cromossomos e para a lâmina nuclear uma malha proteica que fornece suporte estrutural para o envelope nuclear a lâmina também atua como um sítio de ancoragem para cromossomos e citoesqueleto cito plasmático via complexos proteicos que cruzam o envelope nuclear A membrana interna é circundada pela membrana nuclear externa a qual é contínua com a mem brana do RE Assim como a membrana do RE discutida mais adiante a membrana nuclear externa apresenta ribossomos envolvidos na síntese de proteínas As proteínas sintetizadas nesses ribossomos são transportadas para o espaço entre as membranas nucleares interna e externa o espaço perinuclear o qual é contínuo com o lúmen do RE ver Figura 127 O tráfego bidirecional ocorre continuamente entre o citosol e o núcleo As muitas proteínas com função nuclear incluindo histonas DNApolimerases e RNApolime rases reguladores de transcrição e proteínas de processamento de RNA são seleti vamente importadas do citosol onde são sintetizadas para o compartimento nuclear Ao mesmo tempo quase todos os RNAs incluindo mRNAs rRNAs tRNAs miRNAs e snRNAs são sintetizados no compartimento nuclear e então exportados para o citosol Assim como o processo de importação o processo de exportação é seletivo os mRNAs por exemplo são exportados somente após sofrerem modificação apropriada pelas rea ções de processamento de RNA no núcleo Em alguns casos o processo de transporte é complexo As proteínas ribossômicas por exemplo são sintetizadas no citosol e impor tadas para o núcleo onde se ligam ao RNA ribossômico rRNA recémtranscrito for mando partículas Essas partículas são então exportadas para o citosol onde são ligadas aos ribossomos Cada um desses passos requer transporte seletivo através do envelope nuclear Os complexos do poro nuclear perfuram o envelope nuclear Os grandes e elaborados complexos do poro nuclear NPCs de nuclear pore complexes perfuram o envelope nuclear em todas as células eucarióticas Cada NPC é composto de um conjunto de cerca de 30 diferentes proteínas ou nucleoporinas Refletindo o alto grau de simetria interna cada nucleoporina está presente em cópias múltiplas resultando em 500 a 1000 moléculas de proteínas no NPC totalmente montado com uma massa estimada de 66 milhões de dáltons em leveduras e 125 milhões de dáltons em vertebrados Figura 12 8 A maioria das nucleoporinas é composta de domínios proteicos repetitivos de poucos tipos diferentes os quais evoluíram por meio de uma vasta duplicação gênica Algumas das nucleoporinas de suporte ver Figura 128 são estruturalmente relacionadas ao complexo de proteínas de revestimento da vesícula como a clatrina e COPII do coatômero discutido no Capítulo 13 que formam vesículas transportadoras uma proteína é usada como uma NÚCLEO PEROXISSOMOS MITOCÔNDRIAS PLASTÍDIOS RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO EXTERIOR DA CÉLULA GOLGI ENDOSSOMO TARDIO LISOSSOMO ENDOSSOMO PRIMÁRIO VESÍCULAS SECRETORAS CITOSOL 650 PARTE IV Organização interna da célula unidade fundamental comum tanto em NPCs quanto em revestimentos de vesículas Essas semelhanças sugerem uma origem evolutiva comum para os NPCs e os revestimentos de vesículas eles podem ter derivado de um módulo proteico primitivo de curvatura de mem brana que ajudou a dar forma aos sistemas de membranas elaborados das células eucarióti cas e que nas células atuais estabiliza as curvas acentuadas da membrana necessárias para formar o poro nuclear O envelope nuclear de uma célula típica de mamífero contém 3 mil a 4 mil NPCs embora o número varie grandemente de poucas centenas em células da glia a quase 20 mil em neurônios de Purkinje O tráfego total que passa através de cada NPC é enor me cada NPC pode transportar até mil macromoléculas por segundo e em ambas as direções ao mesmo tempo Não se sabe como o fluxo bidirecional de macromoléculas é coordenado para evitar congestionamento e colisões Cada NPC contém canais aquosos através dos quais pequenas moléculas solúveis em água podem difundirse passivamente O tamanho efetivo desses canais foi determi nado pela injeção no citosol de moléculas marcadas solúveis em água e de diferentes ta manhos e então pela medida de sua taxa de difusão para o núcleo Pequenas moléculas 5 mil dáltons ou menos difundemse tão rapidamente que o envelope nuclear pode ser considerado livremente permeável a elas Grandes proteínas entretanto difundemse de maneira muito mais lenta e quanto maior a proteína mais lentamente ela passa através dos NPCs Proteínas maiores do que 60 mil dáltons não podem entrar por difusão passiva O tamanholimite para difusão livre é resultado da estrutura do NPC ver Figura 128 O canal de nucleoporinas com extensas regiões não estruturadas forma um emaranhado desordenado muito parecido com uma cama de algas no oceano que restringe a difusão de grandes macromoléculas enquanto permite a passagem de pequenas moléculas Uma vez que muitas proteínas celulares são demasiadamente grandes para pas sar por difusão através dos NPCs o compartimento nuclear e o citosol podem manter diferentes composições de proteínas Os ribossomos citosólicos maduros por exemplo possuem cerca de 30 nm de diâmetro e assim não podem difundirse através dos canais de NPC restringindo a síntese de proteína ao citosol Contudo de que forma o núcleo exporta subunidades ribossômicas recémsintetizadas ou importa grandes moléculas como DNApolimerases e RNApolimerases que possuem subunidades de 100 mil a 200 mil dáltons Como discutiremos a seguir essas e muitas outras proteínas transpor tadoras e moléculas de RNA se ligam a proteínas receptoras específicas que ativamente passam grandes moléculas através de NPCs Mesmo pequenas proteínas como histonas costumam usar mecanismos mediados por receptores para atravessar o NPC aumen tando dessa maneira a eficiência do transporte Sinais de localização nuclear direcionam as proteínas nucleares ao núcleo Quando as proteínas são extraídas experimentalmente do núcleo e reintroduzidas no cito sol mesmo aquelas muito grandes se reacumulam de maneira eficiente no núcleo Sinais de endereçamento chamados de sinais de localização nuclear NLSs de nuclear locali zation signals são responsáveis pela seletividade desse processo nuclear de importação Utilizando a tecnologia do DNA recombinante esses sinais foram definidos de modo preciso tanto para numerosas proteínas nucleares quanto para proteínas que en tram apenas transitoriamente no núcleo Figura 129 Em muitas proteínas nucleares os sinais consistem em uma ou duas sequências curtas ricas em aminoácidos carregados positivamente lisina e arginina ver Tabela 123 p 648 com a sequência exata variando para diferentes proteínas Outras proteínas nucleares contêm diferentes sinais alguns dos quais ainda não foram caracterizados Os sinais de localização nuclear podem estar situados praticamente em qualquer lu gar na sequência de aminoácidos e supostamente formam alças ou regiões na superfície da proteína Muitos funcionam mesmo quando estão ligados como curtos peptídeos a cadeias laterais de lisina na superfície da proteína citosólica sugerindo que a localização exata do sinal dentro da sequência de aminoácidos de uma proteína nuclear não é importante Além disso contanto que uma das subunidades da proteína de um complexo multicomponente exponha um sinal de localização nuclear o complexo inteiro será importado para o núcleo Envelope nuclear Membrana nuclear interna Membrana nuclear externa Membrana do RE Lúmen do RE Espaço perinuclear Poros nucleares Lâmina nuclear Figura 127 Envelope nuclear O envelope de dupla membrana é atravessado por poros nos quais os complexos do poro nuclear não mostrados são posicionados A membrana nuclear externa é contínua com o retículo endoplasmático RE Os ribossomos que em geral estão aderidos à superfície citosólica da membrana do RE e da membrana nuclear externa não são mostrados A lâmina nuclear é uma malha proteica fibrosa logo abaixo da membrana interna 652 PARTE IV Organização interna da célula tadas para o núcleo por um NPC quando estão em conformação completamente eno velada Da mesma forma uma subunidade ribossômica recémformada é transportada para fora do núcleo como uma partícula já montada Ao contrário as proteínas devem ser extensivamente desenoveladas durante seu transporte para a maioria das outras or ganelas como discutiremos adiante Os receptores de importação nuclear ligamse tanto a sinais de localização nuclear quanto a proteínas NPC Para iniciar a importação nuclear a maioria dos sinais de localização nuclear deve ser re conhecida pelos receptores de importação nuclear algumas vezes chamados de importi nas muitos dos quais são codificados por uma família de genes relacionados Cada mem bro da família codifica uma proteína receptora que pode se ligar e transportar subconjuntos de proteínascarga contendo o sinal de localização nuclear apropriado Figura 1211A Os receptores de importação nuclear nem sempre se ligam diretamente a proteínas nucleares As proteínas adaptadoras adicionais podem formar pontes entre os receptores de importa ção e os sinais de localização nuclear nas proteínas a serem transportadas Figura 1211B Algumas proteínas adaptadoras são estruturalmente relacionadas aos receptores de im portação nuclear sugerindo uma origem evolutiva comum O uso de uma variedade de receptores de importação e de adaptadores permite que a célula reconheça o amplo reper tório de sinais de localização nuclear exibidos pelas proteínas nucleares Os receptores de importação são proteínas citosólicas solúveis que se ligam tanto no sinal de localização nuclear da proteínacarga quanto nas sequências repetidas fenila laninaglicina FG nos domínios não estruturados do canal de nucleoporinas alinhados no centro do poro As repetições FG também são encontradas nas fibrilas citoplasmáticas e nucleares Acreditase que as repetições FG no emaranhado não estruturado do poro fazem o dever em dobro Elas interagem fracamente resultando em uma proteína com propriedades semelhantes a um gel que impõe uma barreira de permeabilidade a gran des macromoléculas e servem como local de ancoragem para os receptores nucleares de importação Repetições FG alinham o caminho ao longo dos NPCs tomados pelos recep tores de importação e suas proteínascarga ligadas De acordo com um modelo de trans porte nuclear complexos receptorcarga se movimentam ao longo da via de transporte li gandose dissociandose e então religandose repetidas vezes às sequências adjacentes contendo repetições FG Dessa forma os complexos podem saltar de uma nucleoporina para outra para atravessar o interior emaranhado do NPC de maneira aleatória Como os receptores de importação se ligam às repetições FG durante o caminho eles poderiam in terromper as interações entre as repetições e localmente dissolver o gel proteico do ema ranhado que preenche os poros permitindo a passagem do complexo receptorcarga Uma vez no núcleo os receptores de importação dissociamse da sua carga e retornam ao citosol Como veremos essa dissociação ocorre apenas no lado nuclear do NPC confe rindo desse modo direcionalidade ao processo de importação A exportação nuclear funciona como a importação nuclear mas de modo inverso A exportação de grandes moléculas do núcleo como novas subunidades ribossômicas e moléculas de RNA ocorre por meio de NPCs e também depende de um sistema sele Figura 129 Função de um sinal de localização nuclear Micrografias de imunofluorescência mostrando a localiza ção celular do antígeno T do vírus SV40 contendo ou não uma pequena sequência que serve como um sinal de localização nuclear A A proteína antígeno T normal contém a sequência rica em lisina indicada e é importada ao seu sítio de ação no nú cleo como indicado por imunofluorescên cia com anticorpos contra o antígeno T B O antígeno T com um sinal de localização nuclear alterado uma treonina no lugar de uma lisina permanece no citosol De D Kalderon B Roberts W Richardson e A Smith Cell 39499509 1984 Com permissão de Elsevier Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Pro Lys Thr Lys Arg Lys Val A LOCALIZAÇÃO DO ANTÍGENO T CONTENDO SEU SINAL DE IMPORTAÇÃO NUCLEAR NORMAL B LOCALIZAÇÃO DO ANTÍGENO T CONTENDO UM SINAL DE IMPORTAÇÃO NUCLEAR MUTADO 100 nm Citosol Núcleo Envelope nuclear A B C D Figura 1210 Visualização da impor tação ativa através dos NPCs Esta série de micrografias eletrônicas mostra esferas coloidais de ouro pontas de setas envoltas por peptídeos contendo sinais de localização nuclear penetrando o núcleo pelos NPCs As partículas de ouro foram injetadas no citosol de células vivas as quais foram fixadas e preparadas para micrografia eletrônica em vários tempos após a injeção A Nos momentos iniciais as partículas de ouro são visualizadas nas proximidades das fibrilas citosólicas dos NPCs B C Elas são então visualizadas no centro dos NPCs exclusivamente na face citosólica D Elas então localizamse na face nuclear Essas partículas de ouro são muito maiores em diâmetro do que os ca nais de difusão no NPC e são importadas por transporte ativo De N Panté e U Aebi Science 27317291732 1996 Com permissão de AAAS CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 653 tivo de transporte O sistema de transporte se baseia nos sinais de exportação nuclear nas macromoléculas a serem exportadas assim como nos receptores de exportação nuclear complementares ou exportinas Esses receptores ligamse tanto ao sinal de ex portação quanto às proteínas NPC para guiar sua carga através do NPC ao citosol Muitos receptores de exportação nuclear são estruturalmente relacionados aos re ceptores de importação nuclear e são codificados pela mesma família de genes dos recep tores de transporte nuclear ou carioferinas Em leveduras existem 14 genes que codi ficam carioferinas em células animais o número é significativamente maior Com base apenas na sequência de aminoácidos em geral não é possível distinguir se um membro da família atua como um receptor de importação ou de exportação nuclear Como poderia ser esperado portanto os sistemas de transporte de importação e de exportação funcionam de modo similar mas em direções opostas os receptores de importação ligam suas moléculas carga no citosol liberamnas no núcleo e são então exportados ao citosol para serem reuti lizados enquanto os receptores de exportação funcionam de modo inverso A GTPase Ran impõe a direcionalidade no transporte através dos NPCs A importação de proteínas nucleares através dos NPCs concentra proteínas específicas no núcleo aumentando portanto a ordem na célula A célula mantém esse processo de ordem pelo aproveitamento da energia armazenada em gradientes de concentração na forma ligada ao GTP da GTPase Ran monomérica a qual é necessária tanto para a im portação quanto para a exportação nuclear Assim como outras GTPases a Ran é um interruptor molecular que pode existir em dois estados conformacionais dependendo de o GDP ou o GTP estar ligado discutido no Capítulo 3 A conversão entre os dois estados é desencadeada por duas proteínas regula doras Ranespecíficas uma proteína ativadora de GTPase GAP GTPaseactivating pro tein citosólica que aciona a hidrólise de GTP e assim converte RanGTP em RanGDP e um fator de troca de guanina GEF guanine exchange factor nuclear que promove a troca de GDP para GTP e assim converte RanGDP em RanGTP Visto que o RanGAP está lo calizado no citosol e o RanGEF está localizado no núcleo ancorado à cromatina o citosol contém principalmente RanGDP e o núcleo contém sobretudo RanGTP Figura 1212 Figura 1211 Receptores de importa ção nuclear importinas A Receptores de importação nuclear diferentes ligamse a diferentes sinais de localização nuclear e desse modo a diferentes proteínas carga B A proteínacarga 4 requer uma proteína adaptadora para ligação ao seu receptor de importação nuclear Os adap tadores são estruturalmente relacionados aos receptores de importação nuclear e reconhecem sinais de localização nuclear nas proteínascarga Eles também contêm um sinal de localização nuclear que os liga a um receptor de importação mas esse si nal fica exposto somente quando eles são carregados com uma proteínacarga Proteínacarga 1 Receptor de importação nuclear Sinais de localização nuclear Proteínacarga 2 Proteínacarga 3 Proteína carga 4 Receptor de importação nuclear A B Proteína adaptadora de importação nuclear Figura 1212 Compartimentalização de RanGDP e de RanGTP A localização de RanGDP no citosol e RanGTP no núcleo resulta da localização das duas proteínas reguladoras Ran proteína Ran ativadora de GTPase RanGAP localizada no citosol e fator Ran de troca de nucleotídeos de guanina RanGEF que se liga à cromatina e portanto está localizado no núcleo A RanGDP é importada para o nú cleo por seu próprio receptor de importa ção que é específico para a conformação de Ran ligada a GDP O receptor RanGDP não é relacionado estruturalmente à prin cipal família de receptores de transporte nuclear Contudo ele também se liga às repetições FG nas nucleoporinas do canal NPC NÚCLEO CITOSOL RanGAP Cromatina RanGTP RanGDP RanGEF GTP GTP GDP GDP Pi 654 PARTE IV Organização interna da célula Esse gradiente das duas formas conformacionais de Ran dirige o transporte nu clear na direção apropriada O acoplamento de receptores de importação nuclear nas repetições FG no lado citosólico do NPC por exemplo ocorre somente quando esses receptores estão ligados à carga proteica apropriada Receptores de importação facili tados pela ligação à repetição FG entram então no canal Se atingirem o lado nuclear do complexo do poro RanGTP ligase a eles e se chegarem carregados com molécu lascarga a ligação de RanGTP faz os receptores de importação liberarem sua carga Figura 1213A Como RanGDP no citosol não se liga a receptores de importação ou exportação o descarregamento ocorre apenas no lado nuclear do NPC Dessa maneira a localização nuclear de RanGTP cria a direcionalidade do processo de im portação Depois de descarregar sua carga no núcleo o receptor de importação vazio com RanGTP ligado é transportado de volta ao citosol através do complexo do poro Lá Ran GAP estimula RanGTP a hidrolisar seu GTP ligado convertendoo assim a RanGDP o qual dissociase do receptor O receptor está pronto então para outro ciclo de impor tação nuclear A exportação nuclear ocorre por um mecanismo similar exceto pelo fato de que RanGTP no núcleo promove a ligação da carga ao receptor de exportação ao invés de promover a dissociação da carga Uma vez que o receptor de exportação se movimenta através do poro para o citosol ele encontra RanGAP que induz o receptor a hidrolisar seu GTP a GDP Como resultado o receptor de exportação libera sua carga e RanGDP no citosol Os receptores de exportação livres retornam ao núcleo para completar o ciclo Figura 1213B O transporte através de NPCs pode ser regulado pelo controle do acesso à maquinaria de transporte Algumas proteínas contêm tanto sinais de localização quanto de exportação nuclear Es sas proteínas trafegam continuamente entre o núcleo e o citosol As taxas relativas de suas importação e exportação determinam a localização do estado estacionário de tais proteínas vaivém se a taxa de importação excede a taxa de exportação uma proteína poderia estar localizada principalmente no núcleo pelo contrário se a taxa de exporta ção excede a taxa de importação essa proteína estaria localizada sobretudo no citosol Assim alterando a velocidade de importação e a de exportação ou ambas a localização de uma proteína pode mudar Figura 1213 Como a hidrólise de GTP por Ran no citosol fornece direciona lidade para o transporte nuclear O movimento de receptores de transporte nuclear carregados através do NPC pode ocorrer por difusão guiada ao longo das repetições FG presentes nas proteínas NPC A localização diferencial de RanGTP no núcleo e de RanGDP no citosol propi cia direcionalidade setas vermelhas tanto para a importação nuclear A quanto para a exportação nuclear B A hidrólise de GTP para produzir RanGDP é mediada por RanGAP no lado citosólico do NPC ver Figura 1212 RanGDP DISSOCIASE DOS RECEPTORES RanGTP LIGASE AOS RECEPTORES Receptor de importação nuclear Receptor de exportação nuclear Proteína com sinal de localização nuclear carga CITOSOL Fibrila citosólica NÚCLEO RanGTP Proteína com sinal de exportação nuclear carga RanGTP RanGDP Carga liberada no citosol RanGDP Carga liberada no núcleo IMPORTAÇÃO NUCLEAR A B EXPORTAÇÃO NUCLEAR Pi Pi CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 657 dade dos cromossomos de receptores de importação nuclear Proteínas do NPC livres anexamse à superfície cromossômica onde são incorporadas em novos NPCs Ao mes mo tempo proteínas da membrana nuclear interna e laminas desfosforiladas ligamse à cromatina Membranas do RE envolvem grupos de cromossomos até que formem um firme envelope nuclear Animação 122 Durante esse processo os NPCs iniciam ativa mente a reimportação de proteínas que contêm sinais de localização nuclear Uma vez que o envelope nuclear inicialmente está próximo à superfície dos cromossomos o nú cleo recémformado exclui todas as proteínas exceto aquelas primeiramente ligadas aos cromossomos mitóticos e aquelas que são seletivamente importadas através dos NPCs Desse modo todas as outras grandes proteínas incluindo os ribossomos são mantidas fora do núcleo recémmontado Como discutido no Capítulo 17 a nuvem de RanGTP ao redor da cromatina tam bém é importante na montagem do eixo mitótico nas células em divisão Resumo O envelope nuclear consiste em uma membrana interna e uma membrana externa que são contínuas uma com a outra e com a membrana do RE e o espaço entre a membrana nuclear interna e externa é contínuo com o lúmen do RE As moléculas de RNA que são sintetizadas no núcleo e as subunidades ribossômicas nele montadas são exportadas ao citosol ao contrário todas as proteínas com função no núcleo são sintetizadas no citosol e então importadas O extenso tráfego de materiais entre o núcleo e o citosol ocorre através dos complexos do poro nuclear NPCs os quais constituem uma passagem direta pelo en velope nuclear Pequenas moléculas se difundem passivamente através dos NPCs porém grandes macromoléculas são ativamente transportadas Proteínas contendo sinais de localização nuclear são ativamente transportadas para o núcleo pelos NPCs enquanto proteínas contendo sinais de exportação nuclear são transportadas para fora do núcleo no citosol Algumas proteínas incluindo os recepto Laminas Complexo do poro nuclear DNA Membrana nuclear interna Membrana nuclear externa Envelope nuclear FOSFORILAÇÃO DE LAMINAS E PROTEÍNAS NPC DESFOSFORILAÇÃO DE LAMINAS FUSÃO DE CROMOSSOMOS ENVOLTOS FUSÃO DE FRAGMENTOS DO ENVELOPE NUCLEAR Fragmento do envelope nuclear Cromossomo duplicado Cromossomofilho Laminas fosforiladas INTERFASE DO NÚCLEO TELÓFASE INICIAL PRÓFASE TELÓFASE TARDIA Proteínas do complexo do poro nuclear P P P P P P P P P P P P P P P P Figura 1218 Quebra e remontagem do envelope e da lâmina nuclear durante a mitose A fosforilação das laminas desencadeia a desagregação da lâmina nuclear causando quebra do enve lope nuclear A desfosforilação das laminas reverte o processo Um ciclo análogo de fosforilação e desfosforilação ocorre para algumas nucleoporinas e proteínas da membrana nuclear interna e algumas des sas desfosforilações também estão envol vidas no processo de remontagem Como indicado o envelope nuclear inicialmente se remodela ao redor dos cromossomos filho que estão se descondensando Por fim com o progresso da descondensação essas estruturas fusionamse para formar um único núcleo completo A quebra mitótica do envelope nuclear ocorre em todas as células de metazoários Contudo em muitas outras espécies como leveduras o envelope nu clear permanece intacto durante a mitose e o núcleo se divide por fissão 658 PARTE IV Organização interna da célula res de importação e de exportação nuclear trafegam continuamente entre o citosol e o núcleo A GTPase Ran monomérica fornece tanto energia quanto direcionalidade para o transporte nuclear Células regulam o transporte de proteínas nucleares e moléculas de RNA pelos NPCs controlando o acesso dessas moléculas à maquinaria de transporte O RNA mensageiro recémtranscrito e o RNA ribossômico são exportados do núcleo como parte de um grande complexo ribonucleoproteico Como os sinais de localização nuclear não são removidos as proteínas nucleares podem ser repetidamente importadas como é necessário toda vez que o núcleo se reorganiza após a mitose TRANSPORTE DE PROTEÍNAS PARA MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS Mitocôndrias e cloroplastos uma forma especializada de plastídios em algas verdes e células de plantas são organelas delimitadas por dupla membrana Elas se espe cializaram na síntese de ATP utilizando energia oriunda do transporte de elétrons e da fosforilação oxidativa nas mitocôndrias e da fotossíntese nos cloroplastos dis cutida no Capítulo 14 Embora ambas as organelas contenham seu próprio DNA os ribossomos e outros componentes necessários à síntese de proteínas a maioria das suas proteínas é codificada no núcleo celular e importada do citosol Cada proteína importada deve atingir o subcompartimento organelar específico no qual exerce sua função Existem diferentes subcompartimentos na mitocôndria Figura 1219A o espaço da matriz interna e o espaço intermembrana que é contínuo ao espaço das cristas Es ses compartimentos são formados pelas duas membranas mitocondriais concêntricas a membrana interna que envolve o espaço da matriz e forma extensas invaginações as cristas e a membrana externa que está em contato com o citosol Complexos proteicos fornecem ligações nas junções onde as cristas invaginam e dividem a membrana interna em dois domínios um domínio da membrana interna que envolve o espaço da crista e outro domínio que encosta na membrana externa Os cloroplastos também têm uma membrana interna e externa que delimita o espaço intermembrana e o estroma que é o equivalente em cloroplastos ao espaço da matriz mitocondrial Figura 1219B Eles possuem um subcompartimento adicional o espaço tilacoide que é circundado pela membrana tilacoide A membrana tilacoide deriva da membrana interna que durante o desenvolvimento do plastídio é comprimida tornandose descontínua Cada um dos subcompartimentos nas mitocôndrias e nos cloroplastos contém um conjunto distinto de proteínas Novas mitocôndrias e cloroplastos são produzidos pelo crescimento de organelas preexistentes seguidos de fissão discutido no Capítulo 14 Seu crescimento depende principalmente da importação de proteínas do citosol Isso requer que as proteínas se jam translocadas através de várias membranas sucessivas e terminem no local apropria do O processo de movimento de proteínas através de membranas é chamado de translo cação de proteínas Esta seção explica como isso ocorre Figura 1219 Subcompartimentos de mitocôndrias e de cloroplastos Ao contrário das cristas mitocondriais A os tilacoides dos cloroplastos B não estão conectados à sua membrana interna e por conseguinte formam um compartimento vedado com um espaço interno separado A MITOCÔNDRIA B CLOROPLASTO Membrana externa Espaço da matriz Espaço intermembrana Espaço da crista Membrana interna Membrana externa Estroma espaço da matriz Espaço intermembrana Membrana interna Membrana tilacoide Espaço tilacoide NÚCLEO PEROXISSOMOS MITOCÔNDRIAS PLASTÍDIOS RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO EXTERIOR DA CÉLULA GOLGI ENDOSSOMO TARDIO LISOSSOMO ENDOSSOMO PRIMÁRIO VESÍCULAS SECRETORAS CITOSOL CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 659 A translocação para dentro da mitocôndria depende de sequênciassinal e de translocadores de proteína As proteínas importadas para as mitocôndrias em geral são captadas do citosol den tro de segundos ou minutos após sua liberação pelos ribossomos Então ao contrário da translocação de proteínas para o RE que com frequência ocorre simultaneamente com a tradução pelo ribossomo ancorado na membrana do RE rugoso descrito mais adiante proteínas mitocondriais são primeiro totalmente sintetizadas como proteínas precursoras mitocondriais no citosol e então translocadas para a mitocôndria por um mecanismo póstraducional Uma ou mais sequênciassinal dirigem todas as proteínas precursoras mitocondriais para o seu subcompartimento mitocondrial apropriado Muitas proteínas que entram no espaço da matriz possuem uma sequênciasinal na sua região Nterminal que é rapidamente removida por uma peptidase após a importação Outras proteínas importadas incluindo todas as proteínas da membrana externa muitas da membrana interna e proteínas do espaço intermembrana possuem sequênciassinal internas que não são removidas As sequênciassinal são necessárias e suficientes para a localização correta das proteínas quando técnicas de engenharia genética são usadas para ligar tais sinais a proteínas citosólicas esses sinais dirigirem a proteína ao subcom partimento mitocondrial correto As sequênciassinal que direcionam proteínas precursoras para dentro do espaço da matriz mitocondrial são mais bem entendidas Elas formam uma ahélice anfifílica na qual resíduos carregados positivamente se agrupam em um lado da hélice enquanto resíduos hidrofóbicos não carregados se agrupam no lado oposto Proteínas receptoras específicas que iniciam a translocação de proteínas reconhecem essa configuração além da sequência precisa de aminoácidos da sequênciasinal Figura 1220 Complexos proteicos com várias subunidades atuam como translocadores de proteínas fazendo a mediação do movimento de proteínas através das membranas mi tocondriais O complexo TOM transfere proteínas através da membrana externa e dois complexos TIM TIM23 e TIM22 transferem proteínas através da membrana interna Figura 1221 Esses complexos contêm alguns componentes que atuam como recep tores para proteínas precursoras mitocondriais e outros componentes que formam os canais de translocação O complexo TOM é necessário à importação de todas as proteínas mitocondriais codificadas no núcleo Inicialmente ele transporta a sequênciasinal dessas proteínas para o espaço intermembrana e ajuda a inserir proteínas transmembrana na membrana externa As proteínas barril b que são particularmente abundantes na membrana ex terna são então transferidas por um translocador adicional o complexo SAM que as auxilia no dobramento apropriado na membrana externa O complexo TIM23 transpor ta algumas dessas proteínas para o espaço da matriz e auxilia na inserção de proteínas transmembrana na membrana interna O complexo TIM22 medeia a inserção de uma subclasse de proteínas da membrana interna incluindo a proteína transportadora que transporta ADP ATP e fosfato para dentro e fora da mitocôndria Ainda um terceiro Figura 1220 Sequênciasinal para im portação de proteínas mitocondriais A citocromo oxidase é um grande complexo multiproteico localizado na membrana mitocondrial interna onde atua como enzima final na cadeia transportadora de elétrons discutido no Capítulo 14 A Os primeiros 18 aminoácidos do precursor da subunidade IV dessa enzima servem como uma sequênciasinal para importação da subunidade na mitocôndria B Quando a sequênciasinal é enovelada como uma ahélice os aminoácidos carregados posi tivamente vermelho são vistos agrupados em uma das faces da hélice enquanto os apolares verde são agrupados predomi nantemente na face oposta Aminoácidos polares não carregados são sombreados de laranja átomos de nitrogênio na cadeia lateral de Arg e Gln são coloridos em azul Sequênciassinal que dirigem proteínas para o espaço da matriz sempre têm o potencial de formar tais ahélices anfifíli cas que são reconhecidas por proteínas receptoras específicas na superfície mito condrial C A estrutura da sequênciasinal da álcool desidrogenase outra enzima da matriz mitocondrial ligada a um receptor de importação cinza foi determinada por meio de ressonância magnética nuclear A ahélice anfifílica ligase com sua face hidrofóbica a uma fenda hidrofílica no receptor Código PDB 1OM2 Leu Met NH3 Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg Thr 1 18 B A C 660 PARTE IV Organização interna da célula translocador de proteína na membrana mitocondrial interna o complexo OXA medeia a inserção de proteínas da membrana interna que são sintetizadas no interior das mi tocôndrias Ele também auxilia na inserção de algumas proteínas de membrana inter na importadas que são inicialmente transportadas para o espaço da matriz por outros complexos As proteínas precursoras mitocondriais são importadas como cadeias polipeptídicas desenoveladas Quase tudo o que conhecemos sobre mecanismos moleculares de importação de pro teínas nas mitocôndrias foi obtido a partir de análises de sistemas de translocação re constituídos livres de células nos quais as mitocôndrias purificadas em um tubo teste importam proteínas precursoras mitocondriais radioativas Trocando as condições de incubação é possível estabelecer os requisitos bioquímicos para o transporte As proteínas precursoras mitocondriais não se enovelam em sua estrutura nati va logo depois de serem sintetizadas em vez disso elas permanecem desenoveladas por meio de interações com outras proteínas no citosol Algumas dessas proteínas são proteínas chaperonas gerais pertencentes à família hsp70 conforme discutido no Capí tulo 6 enquanto outras são dedicadas a proteínas precursoras mitocondriais e ligam se diretamente em suas sequênciassinal Todas essas proteínas de interação auxiliam na prevenção de agregação ou no enovelamento espontâneo das proteínas precursoras antes da sua interação com o complexo TOM na membrana mitocondrial externa Como um passo inicial no processo de importação os receptores de importação do complexo TOM ligamse a sequênciassinal de proteínas precursoras mitocondriais As proteínas de interação são então removidas e a cadeia polipeptídica desenovelada é encaminha da primeiro a sequênciasinal para o canal de translocação Em princípio uma proteína pode atingir o espaço da matriz mitocondrial cru zando as duas membranas uma de cada vez ou ambas de uma só vez Para distinguir entre essas duas possibilidades um sistema de importação mitocondrial livre de cé lulas foi resfriado a uma baixa temperatura imobilizando as proteínas em uma etapa intermediária no processo de translocação O resultado é que proteínas que se acumu laram não tinham sua sequênciasinal Nterminal indicando que sua região Nterminal deveria estar no espaço da matriz onde a peptidasesinal está localizada mas a maior parte da proteína pode sofrer ataque de fora da mitocôndria por enzimas proteolíticas adicionadas externamente Claramente as proteínas precursoras podem atravessar am bas as membranas mitocondriais de uma só vez para entrar na matriz Figura 1222 O complexo TOM primeiramente transporta o sinal de localização mitocondrial através da membrana externa para o espaço intermembrana onde se liga ao complexo TIM abrin Figura 1221 Proteínas translocadoras nas membranas mitocondriais Os complexos TOM TIM SAM e OXA são agregados de proteínas multiméricas de membrana que catalisam a translocação de proteínas através das membranas mito condriais Os componentes proteicos dos complexos TIM22 e TIM23 que revestem o canal de importação são estruturalmente relacionados sugerindo uma origem evo lutiva comum dos dois complexos TIM No lado da matriz o complexo TIM23 está ligado a um complexo proteico multiméri co contendo hsp70 mitocondrial que atua como um importador de ATPase usando a hidrólise de ATP para empurrar proteínas através do poro Em células animais exis tem variações sutis na composição das su bunidades dos complexos de translocação que adaptam a maquinaria de importação mitocondrial para as suas necessidades particulares de tipos celulares especializa dos SAM maquinaria montagem e ende reçamento OXA atividade da citocromo oxidase TIM translocador da membrana mitocondrial interna TOM translocador da membrana mitocondrial externa Receptores COMPLEXO TOM COMPLEXO SAM COMPLEXO TIM23 COMPLEXO TIM22 COMPLEXO OXA CITOSOL ESPAÇO DA MATRIZ ESPAÇO INTERMEMBRANA Canal de translocação Membrana mitocondrial externa Membrana mitocondrial interna ATPase de importação CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 661 do o canal no complexo A cadeia polipeptídica é então translocada para o espaço da matriz ou inserida na membrana interna Embora as funções dos complexos TOM e TIM em geral sejam acopladas para translocar proteínas através de ambas as membranas ao mesmo tempo os dois tipos de proteínas translocadoras podem atuar independentemente Em membranas externas isoladas por exemplo o complexo TOM pode translocar a sequênciasinal das proteínas precursoras através da membrana Da mesma forma as mitocôndrias com membranas externas desagregadas experimentalmente e portanto com o complexo TIM23 exposto na sua superfície importam proteínas precursoras para o espaço da matriz com eficiência A hidrólise de ATP e um potencial de membrana dirigem a importação de proteínas para o espaço da matriz O transporte direcional requer energia que na maioria dos sistemas biológicos é suprida pela hidrólise de ATP A importação de proteínas para a mitocôndria é sus tentada pela hidrólise de ATP em dois sítios diferentes um fora da mitocôndria e um no espaço da matriz Além disso outra fonte de energia para importação de proteínas é necessária que é o potencial de membrana através da membrana mitocondrial in terna Figura 1223 A primeira demanda de energia ocorre no estágio inicial do processo de transloca ção quando a proteína precursora desenovelada associada a proteínas chaperonas in terage com os receptores de importação do complexo TOM Como discutido no Capítulo 6 a ligação e a liberação de polipeptídeos recémsintetizados das proteínas chaperonas necessita da hidrólise do ATP Figura 1222 Importação de proteína pelas mitocôndrias A sequênciasinal Nterminal da proteína precursora mito condrial é reconhecida pelos receptores do complexo TOM A proteína é então translocada através do complexo TIM23 atravessando transitoriamente ambas as membranas mitocondriais Animação 123 A sequênciasinal é clivada por uma peptidasesinal no espaço da matriz para formar a proteína madura A sequência sinal livre é então rapidamente degradada não mostrado INSERÇÃO NA MEMBRANA PELO COMPLEXO TOM Proteína precursora Sequênciasinal LIGAÇÃO AOS RECEPTORES DE IMPORTAÇÃO Proteína receptora no complexo TOM Membrana mitocondrial externa Membrana mitocondrial interna CITOSOL ESPAÇO DA MATRIZ Peptídeosinal clivado Proteína mitocondrial madura Complexo TOM Complexo TIM23 CLIVAGEM PELA PEPTIDASESINAL TRANSLOCAÇÃO PARA A MATRIZ PELO COMPLEXO TIM23 2 3 1 Chaperonas hsp70 citosólicas CITOSOL ESPAÇO DA MATRIZ Membrana mitocondrial interna Proteína receptora no complexo TOM Complexo TIM23 Potencial de membrana Membrana mitocondrial externa Modificação conformacional energiadependente na ATPase de importação Hsp70 mitocondrial parte da ATPase de importação ATP ADP ATP ADP Pi Pi Figura 1223 Papel da energia na importação de proteínas para o espaço da matriz mitocondrial 1 A chaperona hsp70 citosólica ligada é liberada da proteína precursora em uma etapa que depende da hidrólise de ATP Após a inserção inicial da sequênciasinal e das porções adjacentes da cadeia polipeptídica no canal de translocação do complexo TOM a sequênciasinal interage com o complexo TIM 2 A sequênciasinal é então translocada para o espaço da matriz em um processo que necessita da energia de um potencial de membrana através da membrana interna 3 A hsp70 mitocondrial que é parte de um impor tante complexo ATPase ligase a regiões da cadeia polipeptídica que ficam expostas no espaço da matriz puxando a proteína através do canal de translocação usando a energia da hidrólise do ATP 662 PARTE IV Organização interna da célula Uma vez que a sequênciasinal tenha passado pelo complexo TOM e se ligado a um dos complexos TIM a continuidade do transporte pelos canais de translocação TIM neces sita de um potencial de membrana o qual é um componente de eletricidade do gradiente eletroquímico de H através da membrana interna ver Figura 114 O bombeamento de H da matriz para o espaço intermembrana dirigido pelo processo de transporte de elétrons na membrana interna discutido no Capítulo 14 mantém o gradiente eletroquímico A ener gia do gradiente eletroquímico de H através da membrana interna portanto não apenas fornece a maior parte da síntese de ATP da célula mas também dirige a translocação das sequênciassinal carregadas positivamente por meio dos complexos TIM por eletroforese As proteínas hsp70 mitocondriais também têm um papel crucial no processo de importação Mitocôndrias contendo formas mutantes da proteína falham em importar proteínas precursoras A hsp70 mitocondrial é parte de um agregado proteico de múlti plas subunidades que se encontra ligado ao complexo TIM23 pelo lado da matriz e age como um motor para puxar proteínas precursoras para o espaço da matriz Como os primos citosólicos as hsp70 mitocondriais têm uma alta afinidade pelas cadeias po lipeptídicas desenoveladas e ligamse firmemente a uma cadeia de proteína importada assim que ela emerge do translocador TIM no espaço da matriz A hsp70 sofre então uma modificação conformacional e libera a cadeia proteica em uma etapa ATPdependente exercendo uma força do tipo arrancandopuxando na proteína a ser importada Esse ci clo de ligação dirigido por energia e a sua subsequente liberação fornece a força motriz necessária para que a importação da proteína seja completada depois que esta tenha sido inicialmente inserida no complexo TIM23 ver Figura 1223 Após a interação inicial com hsp70 mitocondriais muitas proteínas importadas da matriz são transferidas para outra proteína chaperona a hsp60 mitocondrial Como discutido no Capítulo 6 as proteínas hsp60 auxiliam cadeias polipeptídicas desenovela das a se enovelarem pela sua ligação e liberação por meio de ciclos de hidrólise de ATP Bactérias e mitocôndrias usam mecanismos similares para inserir porinas em suas membranas externas A membrana mitocondrial externa assim como a membrana externa de bactérias Gram negativas ver Figura 1117 contém proteínas barril b em abundância denominadas po rinas sendo portanto livremente permeável a íons inorgânicos e metabólitos mas não à maioria das proteínas Ao contrário de outras proteínas de membranas externas que são ancoradas na membrana por meio de regiões helicoidais transmembrana o complexo TOM não pode integrar porinas na bicamada lipídica Em vez disso as porinas são primei ramente transportadas em sua forma desenovelada para o espaço intermembrana onde se ligam transitoriamente a proteínas chaperonas especializadas que as mantêm não agre gadas Figura 1224A Ambas se ligam então ao complexo SAM na membrana externa inserindo a proteína na membrana externa auxiliando o seu enovelamento apropriado Uma das subunidades centrais do complexo SAM é homóloga à proteína de mem brana externa bacteriana que auxilia a inserir proteínas barril b na membrana externa do espaço periplasmático bacteriano o equivalente do espaço intermembrana na mitocôn Figura 1224 Integração de porinas nas membranas mitocondrial e bacte riana externas A Após a translocação através do complexo TOM na membrana mitocondrial externa proteínas barril b ligamse a chaperonas no espaço inter membrana O complexo SAM insere então a cadeia polipeptídica não enovelada na membrana externa e auxilia no dobra mento da cadeia B O complexo BAM estruturalmente relacionado na membra na externa de bactérias Gramnegativas catalisa a inserção de proteínas barril b e dobramento ver Figura 1117 CITOSOL CITOSOL ESPAÇO INTERMEMBRANA ESPAÇO DA MATRIZ A B COMPLEXO TOM COMPLEXO SAM Complexo BAM Proteína totalmente enovelada Chaperonas Chaperonas periplasmáticas Sec IINSERÇÃO NA MEMBRANA BACTERIANA EXTERNA TRANSLOCAÇÃO ATRAVÉS DA MEMBRANA PLASMÁTICA INTERNA Membrana mitocondrial externa CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 663 dria Figura 1224B Essa via conservada para inserção de proteínas barril b também ressalta a origem endossimbiótica da mitocôndria O transporte para a membrana mitocondrial interna e para o espaço intermembrana ocorre por meio de diversas vias O mesmo mecanismo que transporta as proteínas para a matriz usando os transportado res TOM e TIM23 ver Figura 1222 também faz a mediação do transporte inicial de mui tas proteínas destinadas à membrana mitocondrial interna ou ao espaço intermembra na Na via de translocação mais comum apenas a sequênciasinal na região Nterminal da proteína transportada realmente entra no espaço da matriz Figura 1225A Uma sequência hidrofóbica de aminoácidos colocada estrategicamente após a sequência sinal Nterminal atua como uma sequência de parada de transferência impedindo a translocação adicional através da membrana interna O restante da proteína atravessa então a membrana externa através do complexo TOM no espaço intermembrana a se quênciasinal é clivada na matriz e a sequência hidrofóbica liberada de TIM23 perma nece ancorada na membrana interna Sítio de clivagem Sequência sinal Segunda sequênciasinal B Sequênciasinal A Sequência de parada de transferência Proteína do espaço intermembrana Proteína reduzida a ser importada Clivagem por uma protease C D E CITOSOL Proteína da membrana interna Proteína da membrana interna Complexo TOM Complexo TIM23 Complexo OXA ESPAÇO DA MATRIZ SÍNTESE DE PROTEÍNAS MITOCONDRIAIS Sítio de clivagem Chaperonas no espaço intermembrana Proteína de membrana interna COMPLEXO TIM22 SH SH SH SH SH SH S S S SH S S S S S SH RECONHECIMENTO E OXIDAÇÃO POR Mia40 REOXIDAÇÃO PELA CADEIA RESPIRATÓRIA TRANSLOCAÇÃO ATRAVÉS DA MEMBRANA EXTERNA REDUÇÃO DE Mia40 OXIDAÇÃO DA PROTEÍNA IMPORTADA Mia40 Complexo TOM Figura 1225 Importação de proteínas do citosol para a membrana mitocondrial interna ou para o espaço intermembrana A A sequênciasinal Nterminal vermelho inicia a importação para o espaço da matriz ver Figura 1222 Uma sequência hidrofóbica azul que se sucede à sequênciasinal para a matriz ligase ao translocador TIM23 laranja na membrana interna e interrompe a translocação A proteína restante é então puxada para o espaço intermembrana através do translocador TOM na membrana externa e a sequência hidrofóbica é liberada na membrana interna ancorando aí a proteína B Uma segunda via de integração de proteínas na membrana interna primeiro entrega a proteína completa no espaço da matriz A clivagem da sequênciasinal vermelho usada para a translocação inicial expõe uma sequênciasinal hidrofóbica adjacente azul no novo Nterminal Esse sinal dirige então a proteína para a membrana interna usando a mesma via dependente de OXA que insere proteínas que são codificadas pelo genoma de mitocôndrias e traduzidas no espaço da matriz C Algumas proteínas solúveis do espaço intermembrana também podem utilizar as vias mostradas em A e B antes de serem liberadas no espaço intermembrana por uma segunda peptidasesinal que tem seu sítio ativo no espaço intermembrana e remove a sequênciasinal hidrofóbica D Algumas proteínas solúveis do espaço intermembrana tornamse oxidadas pela proteína Mia40 do inglês mitochondrial intermembrane space assembly agregado do espaço intermembrana mitocondrial durante a importação Mia40 forma um intermediário covalente através de pontes dissulfeto intermolecu lares que ajudam a puxar a proteína transportada através do complexo TOM A proteína Mia40 tornase reduzida nesse processo e então é reoxidada pela cadeia transportadora de elétrons de modo que pode catalisar a próxima rodada de importação E Proteínas de passagem múltipla na membrana interna que funcionam como transportadores de metabólitos contêm sequênciassinal internas e serpenteiam através do complexo TOM como uma alça Eles ligam se então a chaperonas no espaço intermembrana guiando as proteínas ao complexo TIM22 O complexo TIM22 é especializado na inserção de proteínas de passagem múltipla da membrana interna 664 PARTE IV Organização interna da célula Em outra via de transporte para a membrana interna ou o espaço intermembra na o complexo TIM23 inicialmente transloca a proteína inteira para o espaço da matriz Figura 1225B Uma vez que a sequênciasinal Nterminal foi removida pela peptida sesinal da matriz a sequência hidrofóbica permanece exposta no novo Nterminal Essa sequênciasinal guia a proteína para o complexo OXA que insere a proteína na mem brana interna Como mencionado antes o complexo OXA é primeiramente utilizado para inserir proteínas codificadas e traduzidas na mitocôndria na membrana interna e apenas poucas proteínas importadas usam essa via Translocadores intimamente rela cionados ao complexo OXA são encontrados nas membranas plasmáticas de bactérias e em membranas tilacoides de cloroplastos onde inserem proteínas de membrana por um mecanismo similar Muitas proteínas que usam essas vias para a membrana interna permanecem an coradas nas vias por meio de suas sequênciassinal hidrofóbicas ver Figura 1225A B Outras entretanto são liberadas no espaço intermembrana por uma protease que remo ve a âncora da membrana Figura 1225C Muitas dessas proteínas clivadas permane cem ligadas na superfície externa da membrana interna como subunidades periféricas de complexos proteicos que também contêm proteínas transmembrana Certas proteínas do espaço intermembrana que contêm resíduos de cisteína são importadas ainda por outra via Essas proteínas formam uma ponte dissulfeto covalente transitória com a proteína Mia40 Figura 1225D As proteínas importadas são então liberadas em uma forma oxidada contendo pontes dissulfeto intracadeia Mia40 tornase reduzida no processo e é então reoxidada ao transferir elétrons para a cadeia transporta dora de elétrons na membrana mitocondrial interna Dessa maneira a energia armaze nada no potencial redox da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial é aproveita da para dirigir a importação de proteínas As mitocôndrias são o principal sítio de síntese de ATP na célula mas também contêm muitas enzimas metabólicas como as do ciclo do ácido cítrico Assim além de proteínas as mitocôndrias também devem transportar pequenos metabólitos através de suas membranas Enquanto a membrana externa contém porinas que tornam a mem brana livremente permeável a pequenas moléculas a membrana interna não as con tém Em vez disso o transporte de um grande número de pequenas moléculas através da membrana interna é mediado por uma família de proteínas transportadoras metabó litoespecíficas Em células de levedura essas proteínas transportadoras compreendem uma família de 35 proteínas diferentes das quais as mais abundantes são aquelas que transportam ADP ATP e fosfato Essas proteínas transportadoras da membrana interna são proteínas transmembrana de passagem múltipla que não apresentam sequências sinal cliváveis nas suas regiões Nterminais mas em vez disso contêm sequênciassinal internas Elas atravessam o complexo TOM na membrana externa e são guiadas por cha peronas do espaço intermembrana ao complexo TIM22 que as insere na membrana in terna por meio de um processo que necessita de um potencial de membrana mas não de hsp70 ou ATP mitocondriais Figura 1225E O particionamento energeticamente favorável das regiões hidrofóbicas transmembrana na membrana interna provavelmente dirige esse processo Duas sequênciassinal direcionam proteínas para a membrana tilacoide em cloroplastos O transporte de proteínas para cloroplastos assemelhase ao transporte para mitocôn drias Ambos os processos ocorrem de modo póstraducional utilizam complexos de translocação separados em cada membrana necessitam de energia e usam sequências sinal Nterminais anfifílicas que são removidas após a utilização Com exceção de algu mas moléculas chaperonas no entanto os componentes proteicos que formam os com plexos de translocação são diferentes Além disso enquanto as mitocôndrias utilizam o gradiente eletroquímico de H através da sua membrana interna para dirigir o transpor te os cloroplastos que apresentam um gradiente eletroquímico de H através de suas membranas tilacoides mas não em sua membrana interna empregam a hidrólise de GTP e de ATP para importação através da sua membrana dupla As semelhanças funcio CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 665 nais podem portanto ser resultado de evolução convergente refletindo as necessidades comuns para a translocação pelo sistema de membrana dupla Embora as sequênciassinal para a importação em cloroplastos assemelhemse su perficialmente àquelas para a importação em mitocôndrias tanto as mitocôndrias como os cloroplastos estão presentes nas mesmas células vegetais e assim as proteínas devem escolher entre as duas organelas de maneira apropriada Em plantas por exemplo uma enzima bacteriana pode ser direcionada especificamente para mitocôndrias se ela for ligada de forma experimental a uma sequênciasinal Nterminal de uma proteína mito condrial a mesma enzima unida a uma sequênciasinal Nterminal de uma proteína de cloroplasto acumulase em cloroplastos As diferentes sequênciassinal podem portan to ser distinguidas pelos receptores de importação em cada organela Os cloroplastos apresentam um compartimento extra envolto por membranas o tilacoide Muitas proteínas de cloroplastos incluindo as subunidades proteicas do sistema fotossintético e da ATPsintase discutido no Capítulo 14 são localizadas na membrana tilacoide Assim como os precursores de algumas proteínas mitocondriais os precursores dessas proteínas são translocados do citosol para o seu destino final em duas etapas Primeiro eles atravessam a dupla membrana para o espaço da matriz cha mado de estroma nos cloroplastos e então eles ou integram a membrana tilacoide ou translocamse para o espaço tilacoide Figura 1226A Os precursores dessas proteínas possuem uma sequênciasinal tilacoide hidrofóbica seguindo a sequênciasinal Nter minal do cloroplasto Após a sequênciasinal Nterminal ter sido utilizada para importar a proteína no estroma ela é removida por uma peptidasesinal do estroma expondo a sequênciasinal tilacoide que inicia então o transporte através da membrana tilacoide Existem pelo menos quatro vias por meio das quais as proteínas atravessam ou tornam Figura 1226 Translocação de uma proteína precursora no espaço tila coide de cloroplastos A A proteína precursora contém uma sequênciasinal do cloroplasto Nterminal vermelho imedia tamente seguida de uma sequênciasinal tilacoide marrom A sequênciasinal do cloroplasto inicia a translocação no estro ma por um mecanismo semelhante àquele usado por proteínas precursoras mitocon driais de translocação no espaço da ma triz embora os complexos translocadores TOC e TIC sejam diferentes A sequência sinal é clivada expondo a sequênciasinal tilacoide que inicia a translocação através da membrana tilacoide B A translocação para o espaço tilacoide ou membrana tilacoide pode ocorrer por uma de pelo menos quatro vias 1 uma via Sec assim chamada porque utiliza componentes que são homólogos de proteínas Sec que me deiam a translocação de proteínas através da membrana plasmática bacteriana dis cutido adiante 2 uma via tipo SRP assim denominada porque usa uma partícula de reconhecimento de sinal homóloga de cloroplasto ou SRP discutido adiante 3 uma via TAT translocação de duas argininas de twin arginine translocation assim chamada porque duas argininas são cruciais nas sequênciassinal que dirigem proteínas nessa via a qual depende de um gradiente de H através da membrana tilacoide e 4 uma via de inserção es pontânea que parece não necessitar de translocador de proteínas CITOSOL ESTROMA TRANSLOCAÇÃO GTP OU ATP DEPENDENTE NO ESTROMA Sequênciasinal tilacoide exposta QUATRO VIAS PARA TRANSLOCAR PROTEÍNAS NO ESPAÇO TILACOIDE Membrana tilacoide Proteína madura no espaço tilacoide Membrana externa do cloroplasto Complexo TOC Complexo TIC Membrana interna do cloroplasto Proteína tilacoide precursora Sequência sinal tilacoide Sequência sinal do cloroplasto Proteína receptora no complexo TOC A B 1 2 4 3 Membrana tilacoide Espaço tilacoide Necessidade energética ATP gradiente eletroquímico de H ATP gradiente eletroquímico de H Gradiente eletroquímico de H Nenhuma Via Sec Via tipo SRP Via TAT Inserção espontânea CLIVAGEM DA SEQUÊNCIA SINAL DO CLOROPLASTO TILACOIDE TILACOIDE ESTROMA 666 PARTE IV Organização interna da célula se integradas na membrana tilacoide diferenciadas pelas suas necessidades por dife rentes chaperonas do estroma ou pela fonte de energia usada Figura 1226B Resumo Embora as mitocôndrias e os cloroplastos tenham seus próprios sistemas genéticos eles pro duzem apenas uma pequena porção de suas proteínas As duas organelas importam do ci tosol a maioria das suas proteínas utilizando mecanismos semelhantes Em ambos os casos as proteínas são importadas no estado desenovelado tanto através da membrana externa quanto da membrana interna simultaneamente para o espaço da matriz ou estroma A hi drólise de ATP e um potencial de membrana através da membrana interna dirigem a trans locação para a mitocôndria enquanto a translocação em cloroplastos é dirigida somente pela hidrólise de GTP e de ATP As proteínas chaperonas da família hsp70 citosólica mantêm as proteínas precursoras em um estado desenovelado e um segundo conjunto de proteínas hsp70 no espaço da matriz ou no estroma puxa a cadeia polipeptídica importada para a organela Apenas as proteínas que contêm uma sequênciasinal específica são translocadas A sequênciasinal em geral está localizada na região Nterminal e é clivada depois de ser importada ou internalizada e retida Os transportes para a membrana interna algumas vezes usam uma segunda sequênciasinal hidrofóbica que é exposta quando a primeira se quênciasinal é removida Em cloroplastos a importação do estroma para o tilacoide pode ocorrer por várias vias que diferem pelas chaperonas e pela fonte de energia usadas PEROXISSOMOS Os peroxissomos diferem das mitocôndrias e dos cloroplastos em muitos aspectos Mais notavelmente eles são envolvidos por uma única membrana e não possuem DNA ou ribossomos Assim por não serem dotados de genoma todas as suas proteínas são co dificadas no núcleo Os peroxissomos obtêm muitas das suas proteínas por importação seletiva do citosol embora algumas delas entrem na membrana dos peroxissomos por meio do RE Uma vez que não discutiremos os peroxissomos em outro local consideraremos algumas das funções dessa família distinta de organelas antes de discutir sua biossíntese Quase todas as células eucarióticas possuem peroxissomos Eles contêm enzimas oxida tivas como catalase e urato oxidase em concentrações tão elevadas que em algumas cé lulas os peroxissomos salientamse em micrografias eletrônicas por causa da presença de um núcleo cristaloide Figura 1227 Assim como as mitocôndrias os peroxissomos são os principais sítios de utilização de oxigênio Uma hipótese é que os peroxissomos sejam um vestígio de uma organela ancestral que realizava todo o metabolismo de oxigênio nos ancestrais primitivos das cé lulas eucarióticas Quando o oxigênio produzido pelas bactérias fotossintéticas começou a se acumular na atmosfera ele pode ter sido fortemente tóxico à maioria das células Os peroxissomos podem ter servido para reduzir a concentração de oxigênio intracelular enquanto também usavam sua reatividade química para fazer reações oxidativas úteis De acordo com esse ponto de vista o desenvolvimento posterior das mitocôndrias tornou os peroxissomos bastante obsoletos porque muitas das mesmas reações as quais foram inicialmente conduzidas nos peroxissomos sem produção de energia foram agora aco pladas com a formação de ATP por meio da fosforilação oxidativa As reações oxidativas realizadas pelos peroxissomos nas células atuais poderiam parcialmente ser portanto aquelas cujas funções importantes não foram incorporadas pelas mitocôndrias Os peroxissomos utilizam oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio para realizar reações oxidativas Os peroxissomos são assim denominados porque costumam conter uma ou mais enzi mas que empregam oxigênio molecular para remover átomos de hidrogênio de substra tos orgânicos específicos designados aqui como R em uma reação oxidativa que produz peróxido de hidrogênio H2O2 RH2 O2 n R H2O2 NÚCLEO PEROXISSOMOS MITOCÔNDRIAS PLASTÍDIOS RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO EXTERIOR DA CÉLULA GOLGI ENDOSSOMO TARDIO LISOSSOMO ENDOSSOMO PRIMÁRIO VESÍCULAS SECRETORAS CITOSOL CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 667 A catalase utiliza o H2O2 gerado por outras enzimas na organela para oxidar uma variedade de outros substratos incluindo ácido fórmico formaldeído e álcool pela reação peroxidativa H2O2 RH2 R 2H2O Esse tipo de reação oxidativa é particu larmente importante nas células do fígado e do rim nas quais os peroxissomos destoxifi cam várias moléculas tóxicas que entram na corrente sanguínea Cerca de 25 do etanol que bebemos é oxidado a acetaldeído dessa forma Além disso quando um excesso de H2O2 acumulase na célula a catalase o converte em H2O por meio da reação 2H2O2 2H2O O2 A principal função das reações oxidativas realizadas nos peroxissomos é a quebra de moléculas de ácido graxo O processo denominado boxidação encurta as cadeias alquil dos ácidos graxos sequencialmente em blocos de dois átomos de carbono por vez convertendo assim os ácidos graxos em acetilCoA acetilcoenzima A Os peroxisso mos exportam então acetilCoA ao citosol para utilizála em reações biossintéticas Nas células de mamíferos a boxidação ocorre nas mitocôndrias e nos peroxissomos em leveduras e nas células vegetais entretanto essa reação essencial ocorre exclusivamente nos peroxissomos Uma função biossintética essencial dos peroxissomos animais é catalisar as pri meiras reações na formação de plasmalogênios que são a classe mais abundante de fos folipídeos na mielina Figura 1228 A deficiência de plasmalogênios causa anomalias profundas na mielinização dos axônios das células nervosas sendo essa uma das razões por que muitos distúrbios peroxissômicos levam a doenças neurológicas Os peroxissomos são organelas de grande diversidade e mesmo em vários tipos celulares de um único organismo podem conter diferentes conjuntos de enzimas Eles também podem adaptarse de forma notável a mudanças de condições As células de levedura crescidas em açúcar por exemplo têm poucos peroxissomos pequenos Mas quando algumas leveduras são crescidas em metanol numerosos e grandes peroxis somos são formados para oxidar o metanol e quando crescem em ácidos graxos elas desenvolvem numerosos e grandes peroxissomos que quebram os ácidos graxos em acetilCoA pela boxidação Os peroxissomos são importantes também em plantas Dois tipos de peroxissomos de plantas têm sido bastante estudados Um tipo está presente nas folhas onde partici pa na fotorrespiração discutida no Capítulo 14 Figura 1229A O outro tipo de pero xissomo está presente em sementes em germinação nas quais ele converte os ácidos graxos armazenados nas sementes oleaginosas em açúcares necessários ao crescimento da planta jovem Pelo fato de essa conversão de gorduras em açúcares ser realizada por uma série de reações conhecidas como o ciclo glioxilato esses peroxissomos também são chamados de glioxissomos Figura 1229B No ciclo glioxilato duas moléculas de acetilCoA produzidas por quebra do ácido graxo no peroxissomo são utilizadas para a síntese de ácido succínico que é liberado do peroxissomo e convertido em glicose no citosol O ciclo glioxilato não ocorre em células animais portanto os animais são incapa zes de converter ácidos graxos de gorduras em carboidratos Uma sequênciasinal curta direciona a importação de proteínas aos peroxissomos Uma sequência específica de três aminoácidos SerLysLeu localizados na região Cterminal de muitas proteínas dos peroxissomos atua como um sinal de importação ver Tabela 123 p 648 Outras proteínas peroxissômicas contêm uma sequênciasinal próxima à região Nterminal Se uma dessas sequências está ligada a uma proteína ci tosólica a proteína é importada para peroxissomos Os sinais de importação são pri meiro reconhecidos pelos receptores solúveis de proteínas no citosol Várias proteínas distintas chamadas de peroxinas participam no processo de importação que é movido por hidrólise de ATP Um complexo de pelo menos seis diferentes peroxinas forma uma proteína translocadora na membrana do peroxissomo Mesmo proteínas oligoméricas não precisam ser desdobradas para que sejam importadas Acreditase que o poro for mado pelo transportador seja dinâmico em suas dimensões adaptando seu tamanho às moléculascarga a serem transportadas permitindo a passagem de cada molécula 200 nm Figura 1227 Micrografia eletrônica de três peroxissomos em uma célula de fígado de rato As inclusões paracristalinas eletrodensas são compostas principalmente da enzima urato oxidase Cortesia de Daniel S Friend CH2 CH2 NH3 CH2 CH2 CH CH CH2n CH3 CH2n CH3 CH CH2 O O O O O O O P C Figura 1228 Estrutura de um plasmalo gênio Os plasmalogênios são bastante abun dantes nas bainhas de mielina que envolvem os axônios das células nervosas Eles correspon dem a cerca de 80 a 90 dos fosfolipídeos da membrana de mielina Além de uma cabeça de etanolamina e um ácido graxo de cadeia longa ligado à mesma cadeia principal de glicerol fosfato utilizado para fosfolipídeos os plasmalogênios contêm um álcool graxo pouco comum que está ligado por uma ligação éter parte inferior à esquerda 672 PARTE IV Organização interna da célula encontrados na superfície externa de tal forma que o interior do microssomo é bioqui micamente equivalente ao lúmen do RE Figura 1234A Muitas vesículas de tamanho similar ao dos microssomos rugosos porém des providas de ribossomos aderidos também são encontradas nesses homogenados Tais microssomos lisos são derivados em parte de porções lisas do RE e em parte de frag mentos vesiculados da membrana plasmática do aparelho de Golgi dos endossomos e das mitocôndrias a proporção dependendo do tecido Então enquanto microssomos rugosos são claramente derivados de porções do RE rugoso não é fácil separar micros somos lisos derivados de organelas diferentes Os microssomos preparados de células do fígado ou de células do músculo são uma exceção Devido às grandes quantidades pouco comuns de RE liso ou retículo sarcoplasmático respectivamente muitos dos microsso mos lisos nos homogenados desses tecidos são derivados do RE liso ou do retículo sarco plasmático Os ribossomos aderidos à membrana tornam os microssomos rugosos mais densos do que os microssomos lisos Como resultado os microssomos lisos e rugosos podem ser separados uns dos outros por centrifugação de equilíbrio Figura 1234B Os microssomos têm sido inestimáveis na elucidação de aspectos moleculares da função do RE como discutiremos a seguir As sequênciassinal foram descobertas primeiro em proteínas importadas para o RE rugoso O RE captura proteínas selecionadas do citosol assim que elas são sintetizadas Essas proteínas são de dois tipos proteínas transmembrana que são apenas parcialmente translocadas através da membrana do RE e tornamse embutidas na membrana e proteínas solúveis em água que são totalmente translocadas através da membrana do RE e liberadas no lúmen do RE Algumas das proteínas transmembrana funcionam no RE mas muitas são destinadas à membrana plasmática ou à membrana de outra organela As proteínas solúveis em água são destinadas tanto à secreção quanto à residência no lúmen do RE ou de outra organela Todas essas proteínas apesar do seu subsequente destino são dirigidas para a membrana do RE por uma sequênciasinal do RE a qual inicia a sua translocação por um mecanismo comum As sequênciassinal e a estratégia de sequênciasinal para endereçamento de proteínas foram descobertas no início dos anos de 1970 em proteínas secretadas trans locadas através da membrana do RE como um primeiro passo de sua liberação final da célula No experimentochave o mRNA codificando a proteína secretada foi traduzido por ribossomos in vitro Quando os microssomos foram omitidos desse sistema livre de células a proteína sintetizada foi levemente maior do que a proteína normal secreta da Na presença de microssomos derivados do RE rugoso todavia foi produzida uma proteína de tamanho correto De acordo com a hipótese do sinal a diferença no tamanho reflete a presença inicial de uma sequênciasinal que direciona a proteína secretada à membrana do RE e é então clivada por uma peptidasesinal na membrana do RE antes RE rugoso Homogeneização RE liso Microssomos rugosos e lisos Tubo com gradiente de concentração de sacarose crescente Os microssomos lisos têm baixa densidade e param de sedimentar flutuando em baixas concentrações de sacarose Os microssomos rugosos têm alta densidade e param de sedimentar flutuando em altas concentrações de sacarose Centri fugação 200 nm B A Figura 1234 Isolamento dos micros somos rugosos e lisos do RE A Uma micrografia eletrônica de secção fina de uma fração purificada do RE rugoso revela abundância de vesículas contendo ribosso mos B Quando sedimentados por meio de um gradiente de sacarose os dois tipos de microssomos separamse um do outro de acordo com suas diferentes densidades Note que a fração lisa também irá conter material não derivado do RE A cortesia de George Palade 674 PARTE IV Organização interna da célula hidrolases secretadas e lisossômicas que poderiam causar danos ao citosol entretanto as células que secretam grandes quantidades de hidrolases tomam a precaução extra de possuir altas concentrações de inibidores de hidrolases no seu citosol A pausa também assegura que grandes porções de proteína que poderiam enovelarse em uma estrutura compacta não sejam originadas antes de chegarem ao translocador na membrana do RE Então ao contrário da importação póstraducional de proteínas em mitocôndrias e cloroplastos proteínas chaperonas não são necessárias para capturar proteínas não enoveladas Quando uma sequênciasinal se liga a SRP expõe um sítio de ligação para o recep tor SRP ver Figura 1236B C que é um complexo proteico transmembrana na mem brana do RE rugoso A ligação de SRP ao seu receptor traz o complexo ribossomoSRP a um translocador proteico não ocupado na mesma membrana A SRP e o receptor SRP são então liberados e o translocador transfere a cadeia polipeptídica crescente através da membrana Figura 1237 Subunidade ribossômica menor Subunidade ribossômica menor Subunidade ribossômica maior Subunidade ribossômica maior Dobradiça Sequênciasinal ligada à SRP Receptor de SRP Partícula de reconhecimento de sinal SRP A B C Sequênciasinal da cadeia polipetídica crescente Sítio de ligação do fator de alongamento Dobradiça Domínio da pausa traducional Bolsão de ligação da sequênciasinal Molécula de RNA da SRP SRP LÚMEN DO RE Figura 1236 Partícula de reconhecimento de sinal SRP A A SRP de mamíferos é um complexo ribonucleoproteico do tipo haste contendo seis subunidades proteicas marrom e uma molécula de RNA azul O RNA da SRP forma uma cadeia principal que acopla o domínio proteico contendo o bolsão de ligação à sequênciasinal ao domínio responsável pela pausa de tradução As estruturas cristalinas de diversas partes de SRPs de espécies diferentes são montadas aqui em um modelo composto para se apro ximar da estrutura de uma SRP completa B O esboço tridimensional da SRP ligado a um ribossomo foi determinado por microscopia crioeletrônica A SRP ligase à subunidade maior do ribossomo de modo que sua sequênciasinal de ligação está posicionada perto do sítio de saída da cadeia polipeptídica crescente e seu domínio de pausa traducional está posicionado na interface entre as subunidades ribossômicas onde interfere na ligação do fator de alongamento C Quando a sequênciasinal surge do ribossomo e se liga na SRP uma modificação conformacional na SRP expõe um sítio de ligação para o receptor de SRP B adaptada de M Halic et al Nature 427808814 2004 Com permissão de Macmillan Publishers Ltd Figura 1237 Como a sequênciasinal do RE e a SRP direcionam os ribosso mos à membrana do RE A SRP e seu receptor agem em conjunto A SRP ligase à sequênciasinal do RE exposta e ao ribos somo induzindo portanto uma pausa na tradução O receptor SRP na membrana do RE que nas células animais é composto de duas cadeias polipeptídicas diferentes ligase ao complexo SRPribossomo e di recionao ao translocador Em uma reação pouco conhecida a SRP e seu receptor são então liberados deixando o ribossomo ligado ao translocador na membrana do RE O translocador insere a cadeia polipep tídica na membrana e a transfere através da bicamada lipídica Uma vez que uma das proteínas SRP e ambas as cadeias do receptor SRP contêm domínios de ligação a GTP supõese que as mudanças confor macionais que ocorrem durante os ciclos de ligação e hidrólise do GTP discutido no Capítulo 15 garantam que a liberação de SRP ocorra somente após o ribossomo es tar adequadamente associado ao translo cador na membrana do RE O translocador permanece fechado até que o ribossomo tenha se ligado mantendo a barreira de permeabilidade da membrana do RE em todos os momentos RECONHECIMENTO CITOSOL LÚMEN DO RE ALVO RECICLAGEM LIBERAÇÃO Sequência sinal do peptídeo crescente SRP A ligação da SRP ao peptídeosinal provoca uma pausa na tradução Receptor de SRP na membrana do RE rugoso Proteína translocadora N A tradução continua e começa a translocação CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 677 conjunto inclua outros complexos de membrana que se associam com o translocador como enzimas que modificam a cadeia polipeptídica crescente incluindo a transferase de oligossacarídeos e a peptidasesinal O conjunto de um translocador com esses com ponentes acessórios é chamado de translócon A translocação através da membrana do RE nem sempre necessita do alongamento da cadeia polipeptídica em andamento Como vimos a translocação de proteínas para as mitocôndrias os cloroplastos e os pe roxissomos ocorre de modo póstraducional depois que a proteína foi sintetizada e libe rada no citosol enquanto a translocação através da membrana do RE em geral ocorre durante a tradução cotraducionalmente Esse fato explica por que os ribossomos são ligados ao RE mas não são ligados a outras organelas Algumas proteínas no entanto são importadas para o RE depois de completada sua síntese demonstrando que o transporte nem sempre requer tradução em anda mento A translocação póstraducional de proteínas é especialmente comum através da membrana do RE em células de levedura e através da membrana plasmática bacteriana a qual se acredita ser evolutivamente relacionada ao RE Para atuar na translocação póstraducional o translocador do RE necessita de proteínas acessórias que coloquem a cadeia polipeptídica no poro e sustentem o transporte Figura 1241 Em bactérias uma proteína motriz de translocação a ATPase SecA ligase ao lado citosólico do trans locador onde desencadeia mudanças conformacionais cíclicas sustentadas por hidróli se de ATP Cada vez que um ATP é hidrolisado uma porção da proteína SecA inserese no poro do translocador impelindo um curto segmento da proteína transportada com ela Como resultado desse mecanismo de catraca a ATPase SecA empurra a cadeia polipep tídica da proteína transportada através da membrana As células eucarióticas utilizam um conjunto diferente de proteínas acessórias que se associam ao complexo Sec61 Essas proteínas atravessam a membrana do RE e usam um pequeno domínio localizado no lado do lúmen da membrana do RE para depositar uma proteína chaperona do tipo hsp70 denominada BiP de binding protein na cadeia polipeptídica à medida que esta emerge do poro para o lúmen do RE Ciclos ATPdependentes de ligação e liberação de BiP dirigem a translocação unidirecional como já descrito para proteínas hsp70 mitocondriais que puxam proteínas através de membranas mitocondriais As proteínas que são transportadas para o RE por um mecanismo póstraducional são primeiramente liberadas no citosol onde se ligam a proteínas chaperonas evitando o seu enovelamento por ligação como discutido antes para as proteínas cujo destino são as mitocôndrias e os cloroplastos Em proteínas transmembrana de passagem única somente uma sequênciasinal interna do RE permanece na bicamada lipídica como uma ahélice que atravessa a membrana A sequênciasinal RE da cadeia polipeptídica crescente parece disparar a abertura do poro na proteína translocadora Sec61 depois que a sequênciasinal é liberada da SRP e a cadeia crescente tenha alcançado um tamanho suficiente a sequênciasinal ligase a um sítio específico dentro do poro abrindo dessa maneira o poro Uma sequência sinal do RE é portanto reconhecida duas vezes primeiro por uma SRP no citosol e Figura 1240 Um ribossomo verde ligado a um translocador proteico do RE azul A Reconstrução da vista lateral do complexo a partir de imagens de microscopia eletrônica B Uma visão do translocador observada do lúmen do RE O translocador contém Sec61 proteínas acessórias e o detergente usado na preparação Domínios de proteínas acessórias se estendem através da membrana e formam uma saliência C Uma representação esquemática de um ribossomo aderido à membrana ligado ao translo cador indicando a localização do túnel na subunidade ribossômica maior pelo qual a cadeia polipeptídica crescente sai do ribossomo O mRNA não mostrado poderia estar localizado entre as subunidades pequena e grande do ribossomo Adaptada de JF Mé nétret et al J Mol Biol 348445457 2005 Com permissão de Academic Press Subunidade ribossômica menor Subunidade ribossômica maior Proteína translocadora na membrana do RE A C Canal condutor de proteína na subunidade ribossômica maior B LÚMEN DO RE LÚMEN DO RE 678 PARTE IV Organização interna da célula então por um sítio de ligação no poro da proteína translocadora onde serve como um sinal de início de transferência ou peptídeo de início de transferência que abre o poro p ex ver na Figura 1235 como funciona para uma proteína solúvel O reconhe cimento duplo pode auxiliar assegurando que apenas proteínas apropriadas entrem no lúmen do RE Enquanto ligada no poro de translocação a sequênciasinal está em contato não apenas com o complexo Sec61 que forma as paredes do poro mas também ao longo da linha de junção lateral com o centro hidrofóbico da bicamada lipídica Isso foi mos trado em experimentos de ligação química nos quais a sequênciasinal e cadeias de hidrocarbonetos de lipídeos foram covalentemente unidas Quando a cadeia polipep tídica nascente tiver crescido o suficiente a peptidasesinal do RE cliva a sequência sinal e a libera do poro na membrana onde é rapidamente degradada a aminoácidos por outras proteases na membrana do RE Para liberar a sequênciasinal na membra na o translocador abre lateralmente ao longo da junção ver Figuras 1235 e 1239 O translocador pode então tomar duas direções abrirse para formar um poro através da membrana a fim de deixar porções hidrofílicas de proteínas na bicamada lipídi ca e abrirse lateralmente dentro da membrana para deixar porções hidrofóbicas de proteínas na bicamada lipídica A saída lateral do poro é um passo essencial durante a integração de proteínas transmembrana A integração de proteínas de membrana exige que algumas partes da cadeia poli peptídica sejam transportadas através da bicamada lipídica enquanto outras não Ape sar dessa complexidade adicional todos os modos de inserção de proteínas de membra na podem ser considerados como simples variantes da sequência de eventos descrita antes para transferir uma proteína solúvel no lúmen do RE Começaremos descrevendo as três maneiras pelas quais as proteínas transmembrana de passagem única ver Fi gura 1017 são inseridas na membrana do RE CITOSOL LÚMEN DO RE CITOSOL ESPAÇO EXTRACELULAR CITOSOL LÚMEN DO RE TRANSLOCAÇÃO COTRADUCIONAL TRANSLOCAÇÃO PÓSTRADUCIONAL ATPase SecA Complexo SecY Complexo Sec62 63 71 72 BiP SRP Receptor de SRP BACTÉRIAS ARQUEIAS EUCARIOTOS EUCARIOTOS BACTÉRIAS A B C Complexo Sec61 ATP ADP ATP ADP Sequênciasinal do RE Pi Pi Membrana plasmática interna bacteriana mRNA Figura 1241 Três maneiras pelas quais a translocação de proteínas pode ser dirigida através de translocadores estruturalmente semelhantes A Translocação cotraducional O ribossomo é conduzido à membrana pela SRP e pelo receptor SRP e então estabelece uma forte associação com a proteína translocadora Sec61 A cadeia polipeptídica crescente é conduzida através da membrana assim que é sintetizada Não é necessário energia adicional uma vez que o único caminho disponível para a cadeia crescente é cruzar a membrana B A translocação póstradu cional em células eucarióticas necessita de um complexo adicional composto das proteínas Sec62 Sec63 Sec71 e Sec72 que são ligadas ao trans locador Sec61 e depositam moléculas BiP na cadeia translocada assim que ela surge do translocador no lúmen do RE Os ciclos de ligação de BiP e de liberação movidos por ATP puxam a proteína para o lúmen um mecanismo que se assemelha ao modelo de catraca térmica para importação mitocondrial na Figura 1223 C Translocação póstraducional em bactérias A cadeia polipeptídica completa é dirigida do lado citosólico para o homólogo bacteriano do complexo Sec61 chamado complexo SecY na bactéria na membrana plasmática pela ATPase SecA As mudanças confor macionais possibilitadas pela hidrólise de ATP são responsáveis pelo movimento tipo pistão na SecA cada ciclo impelindo cerca de 20 aminoácidos da cadeia proteica pelo poro do translocador A via Sec usada para transporte de proteínas através da membrana tilacoide em cloroplastos utiliza um mecanismo semelhante ver Figura 1226B Enquanto o translocador Sec61 SRP e receptor de SRP são encontrados em todos os organismos SecA é encontrado exclusivamente em bactérias e o complexo Sec62 63 71 e 72 é encontrado exclusivamente em células eucarióticas Adaptada de P Walter e AE Johnson Annu Rev Cell Biol 1087119 1994 Com permissão de Annual Reviews CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 679 No caso mais simples uma sequênciasinal Nterminal inicia a translocação como para uma proteína solúvel mas um segmento hidrofóbico adicional na cadeia polipeptí dica interrompe o processo de transferência antes que a cadeia inteira seja transportada Esse sinal de parada da transferência ancora a proteína na membrana depois que a sequênciasinal do RE o sinal de início da transferência tenha sido clivada e liberada do translocador Figura 1242 A sequência de parada da transferência é transferida para a bicamada pelo mecanismo de controle lateral onde permanece como um único segmento ahélice atravessando a membrana com a região Nterminal da proteína no lado do lúmen da membrana e a região Cterminal no lado citosólico Nos outros dois casos a sequênciasinal é interna em vez de ser na extremidade Nterminal da proteína Como uma sequênciasinal Nterminal do RE a SRP ligase a uma sequênciasinal interna mediante reconhecimento hidrofóbico de características da ahélice A SRP leva o ribossomo que está sintetizando a proteína para a membrana do RE e a sequênciasinal do RE serve então como um sinal de início da transferência que inicia a translocação da proteína Após a liberação do translocador a sequência in terna de início da transferência permanece na bicamada lipídica como uma ahélice que atravessa a membrana uma única vez As sequências internas de início da transferência podem ligarse ao aparato de transporte em uma de duas orientações por sua vez essa orientação da sequência de início de transferência determina qual segmento da proteína aquele que precede ou o que segue a sequência de início da transferência é movido através da membrana para o lúmen do RE Em um caso a proteína de membrana resultante tem sua região Ctermi nal no lado do lúmen via A na Figura 1243 enquanto no outro a região Nterminal está situada no lado do lúmen via B na Figura 1243 A orientação da sequência de início da transferência depende da distribuição dos aminoácidos carregados adjacentes como descrito na legenda da figura As combinações de sinais de início e de parada da transferência determinam a topologia das proteínas transmembrana de passagem múltipla Nas proteínas transmembrana de passagem múltipla a cadeia polipeptídica passa para frente e para trás repetidamente ao longo da bicamada lipídica como uma ahé lice hidrofóbica ver Figura 1017 Acreditase que uma sequênciasinal interna sirva como um sinal de início de transferência nessas proteínas para iniciar a translocação Figura 1242 Como uma proteína transmembrana de passagem única com a sequênciasinal do RE clivada é integrada na membrana do RE Nessa proteína o processo de translocação co traducional é iniciado pela sequênciasinal Nterminal do RE vermelho que funciona como um sinal de início de transferência abrindo o translocador como na Figura 1235 Além dessa sequência de início de transferência contudo a proteína tam bém contém uma sequência de parada de transferência laranja quando essa sequência entra no translocador e interage com o sítio de ligação dentro do poro o translocador abre na fenda e descarrega a proteína lateralmente na bicamada lipídica onde a sequência de parada de transferência permanece para ancorar a proteína na membrana Nesta figura e nas duas figuras que seguem os ribossomos foram omitidos para maior clareza NH2 LÚMEN DO RE COOH Proteína transmembrana de passagem única madura na membrana do RE NH2 Sequência de parada de transferência Peptidase sinal Sequência de início de transferência CITOSOL 680 PARTE IV Organização interna da célula que continua até o translocador encontrar uma sequência de parada da transferência em proteínas transmembrana de duas passagens por exemplo o polipeptídeo pode em seguida ser liberado na bicamada Figura 1244 Em proteínas de passagem múltipla mais complexas nas quais muitas ahélices hidrofóbicas atravessam a bicamada uma segunda sequência de início da transferência reinicia a translocação mais adiante na ca deia polipeptídica até a próxima sequência de parada do transporte induzir a liberação do polipeptídeo e assim por diante para posteriores sequências de início e de parada da transferência Figura 1245 e Animação 125 Sequênciassinal hidrofóbicas de início e de parada de transferência agem para corrigir a topologia da proteína na membrana trancandoas como ahélices que atra vessam membrana e elas podem fazêlo em qualquer orientação Sabese que uma dada sequênciasinal hidrofóbica atuará como uma sequência de início ou de parada da transferência dependendo da sua localização na cadeia polipeptídica uma vez que sua função pode ser trocada pela mudança da sua localização na proteína utilizando técnicas de DNA recombinante Assim a distinção entre sequências de início e de pa rada da transferência resulta principalmente da sua ordem relativa na cadeia polipep tídica crescente Parece que a SRP inicia procurando por segmentos hidrofóbicos na região Nterminal de uma cadeia polipeptídica desenovelada e prossegue em direção à região Cterminal na direção em que a proteína é sintetizada Reconhecendo o primei ro segmento hidrofóbico apropriado para emergir do ribossomo a SRP ajusta a matriz de leitura se a translocação é iniciada o próximo segmento hidrofóbico apropriado é reconhecido como uma sequência de parada da transferência induzindo a região inter mediária da cadeia polipeptídica a passar pela membrana Um processo de varredura Figura 1243 Integração de uma proteína de membrana de passagem única com uma sequênciasinal interna na membrana do RE Uma sequência sinal do RE interna que atua como um sinal de início da transferência pode ligar se ao translocador em uma das duas vias levando a uma proteína de membrana que possui tanto seu Cterminal via A quanto seu Nterminal via B no lúmen do RE Proteínas são direcionadas às duas vias pelas características na cadeia polipeptí dica que flanqueia a sequência interna de início da transferência se existirem mais aminoácidos carregados positivamente logo antes do núcleo hidrofóbico da sequência de início da transferência do que após essa região a proteína de mem brana será inserida no translocador na orientação mostrada na via A enquanto se existirem mais aminoácidos carregados positivamente imediatamente após o nú cleo hidrofóbico da sequência de início da transferência do que antes dessa região a proteína de membrana será inserida no translocador na orientação mostrada na via B Devido ao fato de o transporte não poder iniciar antes que uma sequência de início da transferência apareça na superfí cie do ribossomo o transporte da porção Nterminal da proteína mostrada em B somente poderá ocorrer após ela ter sido completamente sintetizada Note que existem duas formas para inserir uma proteína transmembrana de passagem única cuja região Nterminal esteja localizada no lúmen do RE aquela mostrada na Figura 1242 e esta mostrada aqui em B Proteína transmembrana madura de passagem única na membrana do RE NH2 CITOSOL LÚMEN DO RE COOH NH2 NH2 NH2 A Proteína transmembrana madura de passagem única na membrana do RE CITOSOL LÚMEN DO RE COOH NH2 NH2 NH2 B CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 681 similar continua até que todas as regiões hidrofóbicas na proteína tenham sido inseridas na membrana como ahélices transmembrana Uma vez que as proteínas de membrana sempre estão inseridas no lado citosólico do RE dessa maneira programada todas as cópias da mesma cadeia polipeptídica terão a mesma orientação na bicamada lipídica Esse mecanismo gera uma assimetria na mem brana do RE na qual os domínios proteicos expostos em um dos lados são diferentes dos domínios expostos do outro Essa assimetria é mantida durante os muitos eventos de brotamento e de fusão que transportam as proteínas sintetizadas no RE a outras mem branas celulares discutido no Capítulo 13 Assim a maneira que uma proteína recém sintetizada é inserida na membrana do RE determina a orientação da proteína em todas as outras membranas Quando as proteínas são extraídas de uma membrana com detergente e então reconstituídas em vesículas lipídicas artificiais costuma ocorrer uma mistura aleatória de proteínas com orientações com o lado correto para fora e com o lado interno para fora Assim a assimetria proteica observada em membranas celulares parece não ser uma propriedade inerente às proteínas mas resulta somente do processo pelo qual as proteínas passam do citosol à membrana do RE Figura 1244 Integração de uma proteína de membrana de dupla pas sagem com uma sequênciasinal inter na na membrana do RE Nessa proteína uma sequênciasinal interna do RE atua como um sinal de início da transferência como na Figura 1243 e inicia a transfe rência da porção Cterminal da proteína No mesmo ponto após uma sequência de parada da transferência ter penetrado o translocador este libera a sequência late ralmente na membrana NH2 COOH Proteína transmembrana madura de dupla passagem na membrana do RE NH2 Sequência de parada de transferência LÚMEN DO RE CITOSOL Sítio de ligação ao peptídeo hidrofóbico de início de transferência Sítio de ligação ao peptídeo hidrofóbico de parada de transferência Proteína translocadora NH2 NH2 Sequência de início de transferência Figura 1245 Inserção da proteína de membrana de passagem múltipla ro dopsina na membrana do RE As rodopsinas são proteínas sensíveis à luz nos bastonetes fotorreceptores na retina dos mamíferos discutido no Capítulo 15 A Um gráfico de hidropatia ver Figura 1020 identifica sete pequenas regiões hidrofóbicas na rodopsina B A região hidrofóbica mais próxima da região N terminal serve como uma sequência de início da transferência que induz a porção anterior à região Nterminal da proteína a passar através da membrana do RE As sequências hidrofóbicas subsequentes fun cionam alternadamente como sequências de início e de parada da transferência As setas verdes indicam as porções da proteína que são inseridas no translocador C A rodopsina integrada final tem sua região Nterminal localizada no lúmen do RE e sua região Cterminal localizada no citosol Os hexágonos azuis representam oligossacarídeos ligados covalentemente 1 2 3 4 5 7 Número de aminoácidos 0 100 200 A C B NH2 COOH CITOSOL H2N Início Início Parada Início Parada Início Parada COOH Hidrofílico Hidrofóbico 6 LÚMEN 682 PARTE IV Organização interna da célula Proteínas ancoradas pela cauda são integradas na membrana do RE por um mecanismo especial Muitas proteínas de membrana importantes são ancoradas na membrana por uma ahélice hidrofóbica transmembrana Cterminal Essas proteínas ancoradas pela cauda no RE incluem um grande número de subunidades proteicas SNARE que dirigem o trá fego vesicular discutido no Capítulo 13 Quando tais proteínas ancoradas pela cauda se inserem na membrana do RE a partir do citosol apenas poucos aminoácidos que seguem a ahélice transmembrana na extremidade Cterminal são translocados para o lúmen do RE enquanto a maior parte da proteína permanece no citosol Devido à posição única da ahélice transmembrana na sequência proteica a tradução termina enquanto os aminoá cidos da porção Cterminal que irão formar a ahélice transmembrana ainda não emergi ram do túnel de saída do ribossomo O reconhecimento de SRP não é portanto possível Por muito tempo acreditouse que essas proteínas fossem liberadas do ribossomo e que a porção Cterminal hidrofóbica fosse espontaneamente incorporada na membrana do RE Tal mecanismo não poderia explicar entretanto por que as proteínas da cauda ancoradas no RE se inserem na membrana do RE seletivamente e não em todas as outras membranas da célula Está claro agora que uma maquinaria de direcionamento especializada está en volvida e que é abastecida pela hidrólise de ATP Figura 1246 Embora os componentes e detalhes difiram esse mecanismo de direcionamento póstraducional é conceitualmen te semelhante ao do direcionamento de proteínas dependente de SRP ver Figura 1237 Nem todas as proteínas ancoradas com cauda são inseridas no RE Algumas pro teínas contêm uma âncora de membrana Cterminal que possui uma informação adi cional de endereçamento que direciona a proteína para mitocôndrias ou peroxissomos Ainda não se sabe como essas proteínas são endereçadas As cadeias polipeptídicas transportadas enovelamse e são montadas no lúmen do RE rugoso Muitas das proteínas no lúmen do RE estão em trânsito en route a outros destinos ou tras contudo residem lá normalmente e estão presentes em altas concentrações Essas proteínas residentes no RE contêm um sinal de retenção no RE de quatro aminoácidos na sua região Cterminal que são responsáveis pela retenção da proteína no RE ver Ta bela 123 p 648 discutido no Capítulo 13 Algumas dessas proteínas atuam cataliti camente para auxiliar as muitas proteínas que são transportadas para o lúmen do RE a enovelarse e montarse corretamente Uma importante proteína residente no RE é a proteína dissulfeto isomerase PDI que catalisa a oxidação de grupos sulfidrila SH livres nas cisteínas para formar ligações dissulfeto SS Quase todas as cisteínas nos domínios proteicos expostos no espaço ex tracelular ou no lúmen das organelas em vias secretoras e endocíticas são ligadas por liga ções dissulfeto Ao contrário as ligações dissulfeto são raramente formadas em domínios expostos ao citosol em função da existência de um ambiente redutor no local Figura 1246 Mecanismo de inserção de proteínas ancoradas pela cauda Nessa via póstraducional para a in serção de proteínas do RE ancoradas pela cauda um complexo solúvel de préendereçamento captura a ahélice Cterminal hidrofóbica depois que ela emerge do túnel de saída ribossômico e a carrega na ATPase Get3 O complexo resultante é direcionado para a membrana do RE pela interação do receptor de Get1 Get2 que funciona como uma maquina ria de inserção de proteínas na membrana Depois que Get3 hidrolisa o ATP ligado a proteína ancorada pela cauda é liberada do receptor e inserida na membrana do RE A liberação de ADP e renovação do ATP liga do recicla Get3 de volta para o citosol RECONHECIMENTO ENDEREÇAMENTO RECICLAGEM LIBERAÇÃO ATP ATP ATP ADP Complexo préendereçamento N N N N C Proteína ancorada pela cauda ATPase Get3 Get1Get2 LÚMEN DO RE CITOSOL ATP Pi CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 683 Outra proteína residente no RE é a proteína chaperona BiP Já discutimos como a BiP atua para puxar proteínas de modo póstraducional para o RE por meio do transloca dor do RE Sec61 Como outras chaperonas discutidas no Capítulo 13 a BiP reconhece proteínas enoveladas incorretamente bem como subunidades proteicas que ainda não se agregaram aos seus complexos oligoméricos finais Para isso ela ligase à sequência de aminoácidos exposta que estaria de modo normal oculta no interior das cadeias polipeptídicas corretamente enoveladas ou agregadas Um exemplo de sítio de ligação a BiP é uma faixa de aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos alternados que normalmen te estariam embaixo de uma folha b com seu lado hidrofóbico orientado na direção do centro hidrofóbico da proteína enovelada A BiP ligada impede a agregação da proteína e auxilia na manutenção da proteína no RE e assim fora do aparelho de Golgi e das eta pas posteriores da via secretora Como alguns outros membros da família de proteínas chaperonas hsp70 que se ligam a proteínas não dobradas e facilitam sua importação para mitocôndrias e cloroplastos a BiP hidrolisa ATP para alternar entre estados de alta e baixa afinidade de ligação que lhe permitem segurar e soltar suas proteínas de substrato em um ciclo dinâmico A maioria das proteínas sintetizadas no RE rugoso é glicosilada pela adição de um oligossacarídeo comum ligado ao N A adição covalente de oligossacarídeos às proteínas é uma das principais funções bios sintéticas do RE Cerca de metade das proteínas solúveis e ligadas à membrana que são processadas no RE incluindo aquelas destinadas ao transporte para o aparelho de Gol gi lisossomos membrana plasmática ou espaço extracelular são glicoproteínas que sofrem modificações nesse caminho Muitas proteínas no citosol e núcleo são também glicosiladas mas não com oligossacarídeos elas carregam uma modificação com açúcar muito mais simples na qual um único grupo Nacetilglicosamina é adicionado a uma serina ou treonina da proteína Durante a forma mais comum de glicosilação da proteína no RE um oligossa carídeo precursor préformado composto de Nacetilglicosamina manose e glico se e contendo um total de 14 açúcares é transferido em bloco para proteínas Esse oligossacarídeo é transferido ao grupo NH2 da cadeia lateral de um aminoácido aspa ragina na proteína sendo por isso considerado ligado ao N ou ligado à asparagina Figura 1247A A transferência é catalisada por uma enzima ligada à membrana uma oligossacaril transferase que tem seu sítio ativo exposto no lado do lúmen da Proteína com sítio para Nglicosilação Oligossacarídeo ligado a lipídeo ancorado na membrana do RE Asn P P Oligossacaril transferase LÚMEN DO RE CITOSOL B A Nacetilglicosamina Manose Glicose Ser Thr Cadeia lateral da asparagina C C N X H O H CH2 C O NH NH2 COOH Figura 1247 Glicosilação de proteínas ligadas ao N no RE rugoso A Quase tão logo a cadeia polipeptídica penetre o lúmen do RE ela é glicosilada em resíduos de asparaginaalvo O oligossacarídeo precursor mostrado em cor está ligado apenas a asparaginas nas sequências AsnXSer e AsnXThr onde X é qual quer aminoácido exceto prolina Essas sequências ocorrem em uma frequência muito menor em glicoproteínas do que em proteínas citosólicas não glicosiladas Evidentemente essas sequências foram selecionadas durante a evolução de proteínas presumivelmente porque a glicosilação em muitos sítios poderia in terferir com o dobramento das proteínas Os cinco açúcares na caixa cinza formam a região central desse oligossacarídeo Para muitas glicoproteínas somente os açúcares centrais sobrevivem ao extenso processo de acabamento com oligossacarídeos que ocorre no aparelho de Golgi B O oligossacarídeo precursor é transferido de um lipídeo dolicol para uma aspargina como uma unidade intacta em uma reação catalisada por uma enzima transmembrana oligossacaril transferase Uma cópia dessa enzima encontrase associada a cada proteína translocadora na membrana do RE O translocador não é mostrado A oligossacaril transferase contém 13 ahélices transmembrana e um enorme domínio luminal do RE que contém seus sítios de ligação ao substrato A asparagina ligase ao túnel que penetra o interior da enzima Ali o grupo amino da asparagina é torcido para fora do plano que estabiliza as ligações amida pobre mente reativas ativandoo para a reação com o oligossacarídeo dolicol A estrutura mostrada é de um homólogo procarioto que se assemelha à subunidade catalítica da oligossacaril transferase de eucariotos Código PDB 3RCE 684 PARTE IV Organização interna da célula membrana do RE esse fato explica por que as proteínas citosólicas não são glico siladas dessa forma Uma molécula lipídica especial denominada dolicol abriga o oligossacarídeo precursor na membrana do RE O oligossacarídeo precursor é trans ferido para a asparaginaalvo em um único passo enzimático imediatamente de pois de o aminoácido ter alcançado o lúmen durante a translocação da proteína O oligossacarídeo precursor é ligado ao lipídeo dolicol por uma ligação pirofosfato de alta energia que providencia a energia de ativação para conduzir a reação de glico silação Figura 1247B Uma cópia da oligossacaril transferase é associada a cada proteína translocadora permitindo a ela procurar e glicosilar as cadeias polipeptídi cas que entram de maneira eficiente O oligossacarídeo precursor é construído açúcar por açúcar no lipídeo dolicol li gado à membrana e então transferido para uma proteína Os açúcares são primeiro ati vados no citosol pela formação de um intermediário açúcarnucleotídeo UDP ou GDP que então doa seu açúcar direta ou indiretamente ao lipídeo em uma sequência or denada Ao longo desse processo o oligossacarídeo ligado ao lipídeo é movido do lado citosólico para o lado do lúmen da membrana do RE Figura 1248 Toda a diversidade de estruturas de oligossacarídeos ligados ao N em glicopro teínas maduras resulta da modificação tardia do oligossacarídeo precursor original Enquanto ainda no RE três glicoses ver Figura 1247 e uma manose são rapidamente removidas dos oligossacarídeos da maioria das glicoproteínas Retornaremos à impor tância da retirada rápida de glicoses Essa poda ou processamento do oligossacarídeo continua no aparelho de Golgi como discutido no Capítulo 13 Os oligossacarídeos ligados ao N são de longe os mais comuns encontrados em 90 das glicoproteínas Com menos frequência os oligossacarídeos são ligados ao grupo hidroxila na cadeia lateral dos aminoácidos serina treonina ou hidroxilisina Um primei ro açúcar desses oligossacarídeos Oligados é adicionado no RE e o oligossacarídeo é então mais estendido no aparelho de Golgi ver Figura 1332 Figura 1248 Síntese do oligossa carídeo precursor ligado a lipídeo na membrana do RE rugoso O oligossa carídeo é montado açúcar por açúcar no carregador lipídico dolicol um poliisopre noide ver Painel 25 p 9899 O dolicol é longo e muito hidrofóbico suas 22 uni dades de cinco carbonos podem atravessar mais de três vezes a espessura de uma bicamada lipídica Assim o oligossacarídeo aderido é firmemente ancorado na mem brana O primeiro açúcar é ligado ao doli col por uma ponte pirofosfato Essa ponte de alta energia ativa o oligossacarídeo para sua eventual transferência do lipídeo para uma cadeia lateral da asparagina de um polipeptídeo crescente no lado do lúmen do RE rugoso Como indicado a síntese do oligossacarídeo iniciase no lado citosólico da membrana do RE e continua na face do lúmen após o lipídeo intermediário Man5GlcNAc2 ser inverti do através da bicamada por uma proteína translocadora que não é mostrada Todas as reações subsequentes de transferência de glicosil no lado do lúmen do RE envol vem transferência de dolicolPglicose e dolicolPmanose esses monossacarídeos ativados ligados a lipídeo são sintetizados a partir de dolicol fosfato e de UDPglicose ou de GDPmanose quando apropriado no lado citosólico do RE e então são invertidos através da membrana do RE GlcNAc Nacetilglicosamina Man mano se Glc glicose LÚMEN DO RE CITOSOL 2 GlcNAc GlcNAc2 GlcNAc2Man5 Man 5 5 GIRANDO NA MEMBRANA Glc Man9GlcNAc2 Man Man5GlcNAc2 4 X 3 X Glc3Man9GlcNAc2 Doador de manose produzido a partir de dolicol fosfato e GDPmanose Doador de glicose produzido a partir de dolicol fosfato e UDPglicose Bicamada lipídica da membrana do RE Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol Dolicol CTP CDP GDP GDP UDP UDP UMP P P P P P P P P P P P P P P P P P CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 685 Os oligossacarídeos são utilizados como rótulos para marcar o estado de enovelamento da proteína Tem sido longamente debatido por que a glicosilação é uma modificação comum das proteínas que entram no RE Uma observação particularmente intrigante reside no fato de que algumas proteínas necessitam de glicosilação ligada ao N para o enovelamento adequado no RE ainda que a localização precisa dos oligossacarídeos aderidos na su perfície da proteína não pareça ser importante Um indício para o papel da glicosilação no enovelamento da proteína deriva de estudos de duas proteínas chaperonas do RE denominadas calnexina e calreticulina pois necessitam de Ca 2 para suas atividades Essas chaperonas são proteínas de ligação de carboidratos ou lectinas que se ligam a oligossacarídeos nas proteínas que não estão completamente enoveladas e as retêm no RE Como outras chaperonas elas impedem que as proteínas enoveladas incompleta mente sofram agregação irreversível Tanto a calnexina quanto a calreticulina também promovem a associação de proteínas incompletamente enoveladas com outra chapero na do RE que se liga a cisteínas que ainda não formaram ligações dissulfeto Calnexina e calreticulina reconhecem oligossacarídeos ligados ao N que contêm uma única glicose terminal e portanto elas se ligam a proteínas apenas depois que duas das três glicoses do oligossacarídeo precursor tenham sido removidas durante o corte de glicose por glicosidases do RE Quando a terceira glicose é removida a glicoproteína dissociase da sua chaperona e pode deixar o RE Como então a calnexina e a calreticulina distinguem proteínas enoveladas das incompletamente enoveladas A resposta está ainda em outra enzima do RE a glicosil transferase que continua adicionando uma glicose àqueles oligossacarídeos que per deram sua última glicose Ela adiciona a glicose entretanto somente a oligossacarídeos que estão associados a proteínas desenoveladas Assim uma proteína desenovelada sofre ciclos contínuos de retirada de glicose por glicosidase e de adição pela glicosil transferase e mantém uma afinidade por calnexina e calreticulina até alcançar seu es tado de completo enovelamento Figura 1249 As proteínas enoveladas inadequadamente são exportadas do RE e degradadas no citosol Apesar de todo o auxílio das chaperonas muitas moléculas proteicas mais de 80 em algumas proteínas transportadas para o RE falham na tentativa de alcançar seu enove lamento adequado ou seu estado oligomérico Tais proteínas são exportadas de volta do RE para o citosol onde são degradadas em proteassomos discutido no Capítulo 6 Em muitas vias o mecanismo de retrotranslocação é similar a outros modos de translocação Figura 1249 Papel da glicosilação ligada ao N no enovelamento da proteína do RE A proteína chaperona ligada à membrana do RE calnexina ligase a proteínas incompletamente enoveladas contendo uma glicose ter minal nos oligossacarídeos ligados ao N mantendo a proteína no RE A remoção da glicose terminal por uma glicosidase libera a proteína da calnexina Uma glicosil transferase é a enzima fundamental que determina se a proteína está enovelada de forma adequada ou não se a proteína ainda está incompletamente enovelada a enzima transfere uma nova glicose da UDPglicose para o oligossacarídeo ligado ao N renovando a afinidade da proteína pela calnexina e retendoa no RE O ciclo se repete até a proteína ter se enovelado completamente A calreticulina atua de modo semelhante exceto pelo fato de que é uma proteína solúvel residente no RE Outra chaperona do RE a ERp57 não mostrada colabora com a calnexina e a calreticulina na retenção de proteínas eno veladas incompletamente no RE A ERp57 reconhece grupos sulfidrila livres que são um sinal de formação de pontes dissulfeto incompletas INCOMPLETAMENTE ENOVELADAS NORMALMENTE ENOVELADAS NÃO ENOVELADAS UDP glicose UDP Glicosil transferase SAÍDA DO RE Oligossacarídeo ligado ao N Oligossacarídeo precursor Calnexina LÚMEN DO RE CITOSOL Membrana do RE Glicosidase Glicose RECORTE DE GLICOSES 686 PARTE IV Organização interna da célula póstraducional Por exemplo assim como a translocação para mitocôndrias ou cloro plastos proteínas chaperonas são necessárias para manter a cadeia polipeptídica em um estado desenovelado antes e durante a translocação De maneira semelhante a fonte de energia é necessária para dar direcionalidade ao transporte e para puxar a proteína para o citosol Enfim um translocador é necessário A seleção de proteínas do RE para degradação é um processo desafiador proteínas mal enoveladas ou subunidades proteicas não montadas devem ser degradadas mas intermediários de dobramento de proteínas recémformadas não Os oligossacarídeos ligados ao N ajudam a fazer essa distinção o que serve como cronômetro da medida de quanto tempo uma proteína deve permanecer no RE O recorte de uma manose lenta em particular no núcleo do oligossacarídeo por uma enzima uma manosidase no RE cria uma nova estrutura de oligossacarídeos que as lectinas do RE luminal do aparelho de retrotranslocação reconhecem As proteínas que se dobram e saem do RE mais rá pido do que a manosidase podem remover sua manosealvo escapando portanto da degradação Além das lectinas no RE que reconhecem os oligossacarídeos chaperonas e pro teínas dissulfeto isomerase enzimas mencionadas antes que catalisam a formação e a quebra de ligações SS se associam a proteínas que devem ser degradadas As cha peronas impedem a agregação de proteínas mal enoveladas e as dissulfeto isomerases quebram ligações dissulfeto que podem ter sido formadas incorretamente e assim uma cadeia polipeptídica linear pode ser translocada de volta para o citosol Múltiplos complexos translocadores movimentam diferentes proteínas da mem brana ou lúmen do RE para o citosol Uma característica comum é que eles contêm uma enzima E3 ubiquitinaligase que anexa etiquetas de poliubiquitina nas proteínas dese noveladas assim que elas emergem para o citosol marcandoas para destruição Alimen tada pela energia derivada da hidrólise de ATP uma ATPase hexamérica da família de AAAATPases ver Figura 685 puxa a proteína mal enovelada através do translocador para o citosol Uma Nglicanase remove as cadeias de oligossacarídeos em bloco Guiado pela sua etiqueta de ubiquitina o polipeptídeo deglicosilado é rapidamente direcionado aos proteassomos onde é degradado Figura 1250 As proteínas mal enoveladas no RE ativam uma resposta à proteína desenovelada As células monitoram cuidadosamente a quantidade de proteínas mal enoveladas con tidas em vários compartimentos Um acúmulo dessas proteínas no citosol por exemplo desencadeia uma resposta ao choque térmico heatshock response discutido no Capítulo 6 que estimula a transcrição de genes que codificam chaperonas citosólicas que auxi liam no reenovelamento das proteínas De maneira similar um acúmulo de proteínas mal enoveladas no RE dispara uma resposta à proteína desenovelada o que inclui um aumento na transcrição de genes que codificam proteínas envolvidas na retrotransloca ção e degradação de proteínas no citosol chaperonas do RE e muitas outras proteínas que ajudam a aumentar a capacidade de dobramento de proteínas no RE Figura 1250 Exportação e degrada ção de proteínas do RE mal enovela das Proteínas solúveis mal enoveladas no lúmen do RE são reconhecidas e marcadas para um complexo translocador na mem brana do RE Elas primeiro interagem com chaperonas no lúmen do RE dissulfeto iso merases e lectinas Elas são então exporta das para o citosol através do translocador No citosol elas são ubiquitinadas deglico siladas e degradadas nos proteoassomos Proteínas de membrana mal enoveladas seguem uma via similar mas usam um translocador diferente AAAATPase S S ATP ADP Nglicanase Ubiquitina E3 ubiquitinaligase Cadeia poliubiquitina Lectina Proteína mal enovelada Chaperona Dissulfeto isomerase Complexo translocador de proteínas Proteassomo CITOSOL LÚMEN DO RE Pi CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 687 Como as proteínas mal enoveladas no RE sinalizam ao núcleo Existem três vias paralelas que executam a resposta à proteína desenovelada Figura 1251A A primeira via inicialmente descoberta em células de levedura é notável Uma pro teínacinase transmembrana no RE chamada de IRE1 é ativada por proteínas mal enoveladas que induzem a sua oligomerização e autofosforilação Alguns recepto rescinase de superfície na membrana plasmática são ativados de forma semelhante como discutido no Capítulo 15 A oligomerização e autofosforilação de IRE1 ativa um domínio da endorribonuclease na porção citosólica da mesma molécula que cliva uma molécula de mRNA citosólica específica em duas posições excisando um LÚMEN DO RE Membrana do RE Três sensores de proteínas mal enoveladas CITOSOL O SPLICING REGULADO DE mRNA INICIA A TRADUÇÃO DA A FOSFORILAÇÃO INATIVA O FATOR DE INÍCIO DA TRADUÇÃO PROTEÍNA REGULADORA DA TRANSCRIÇÃO 1 ATIVAÇÃO DE GENES PARA AUMENTAR A CAPACIDADE DE ENOVELAMENTO DE PROTEÍNAS NO RE A PROTEÓLISE REGULADA NO APARELHO DE GOLGI LIBERA A PROTEÍNA REGULADORA DA TRANSCRIÇÃO 3 TRADUÇÃO SELETIVA DA PROTEÍNA REGULADORA DA TRANSCRIÇÃO 2 REDUÇÃO DE PROTEÍNAS ENTRANDO NO RE A B IRE1 PERK ATF6 P P P P NÚCLEO CITOSOL 4 6 7 1 Chaperona do RE Poro nuclear Regulador da transcrição Proteínas mal enoveladas Proteínas mal enoveladas ligadas à chaperona 1 AS PROTEÍNAS MAL ENOVELADAS NO RE SINALIZAM A NECESSIDADE DE MAIS CHAPERONAS NO RE ELAS SE LIGAM E ATIVAM UMA CINASE TRANSMEMBRANA 2 A CINASE ATIVADA REVELA UMA ATIVIDADE ENDORRIBONUCLEASE 3 A ENDORRIBONUCLEASE CORTA MOLÉCULAS ESPECÍFICAS DE RNA EM DUAS POSIÇÕES REMOVENDO UM ÍNTRON 6 O REGULADOR DA TRANSCRIÇÃO ENTRA NO NÚCLEO E ATIVA GENES CODIFICANDO CHAPERONAS DO RE 7 CHAPERONAS SÃO PRODUZIDAS NO RE ONDE AJUDAM NO ENOVELAMENTO DE PROTEÍNAS 4 DOIS ÉXONS SÃO LIGADOS PARA FORMAR UM mRNA ATIVO 5 O mRNA É TRADUZIDO PARA PRODUZIR UM REGULADOR DA TRANSCRIÇÃO Proteínacinase transmembrana sensor LÚMEN DO RE 3 PrémRNA Íntron mRNA chaperona Gene da chaperona 2 Domínio ribonuclease P P 5 mRNA Éxon Éxon Domínio ribonuclease Domínio cinase Domínio cinase Figura 1251 A resposta à proteína desenovelada A Por três vias de sinali zação intracelular o acúmulo de proteínas mal enoveladas no lúmen do RE sinaliza ao núcleo para ativar a transcrição de genes que codificam proteínas que auxiliam a cé lula a conter as proteínas mal enoveladas no RE B O splicing regulado de RNA é o controlechave de regulação na via 1 de resposta à proteína desenovelada Animação 126 688 PARTE IV Organização interna da célula íntron Essa é a única exceção à regra de que os íntrons sofrem splicing enquanto o RNA ainda está no núcleo Os éxons separados são então unidos por uma RNAligase gerando um mRNA processado que é traduzido nos ribossomos para produzir uma proteína reguladora de transcrição A proteína migra ao núcleo e ativa a transcrição de genes codificadores de proteínas que ajudam a mediar a resposta à proteína deseno velada Figura 1251B Proteínas mal enoveladas também ativam uma segunda cinase transmembrana no RE PERK que inibe um fator de início da tradução pela sua fosforilação e redução da síntese de novas proteínas na célula Uma consequência da redução da síntese de proteínas é a redução do fluxo de proteínas no RE reduzindo então o carregamento de proteínas que precisam ser enoveladas lá Algumas proteínas entretanto são pre ferencialmente traduzidas quando os fatores de início da tradução são escassos dis cutido no Capítulo 7 p 424 e uma dessas é um regulador de transcrição que auxilia a ativação da transcrição de genes que codificam proteínas ativas na resposta à proteína desenovelada Por fim o terceiro regulador transcricional ATF6 é inicialmente sintetizado como uma proteína transmembrana do RE Uma vez que está incorporada na membrana do RE ela não pode ativar a transcrição de genes no núcleo Quando proteínas mal enove ladas acumulamse no RE contudo a proteína ATF6 é transportada para o aparelho de Golgi onde encontra proteases que clivam seus domínios citosólicos que podem agora migrar para o núcleo e ajudar a ativar a transcrição de genes que codificam proteínas en volvidas na resposta à proteína desenovelada Esse mecanismo é similar àquele descrito na Figura 1216 para ativação do regulador da transcrição que controla a biossíntese do colesterol A importância relativa de cada uma dessas três vias na resposta à proteína desenovelada difere em tipos celulares distintos permitindo que cada tipo celular possa adequar a resposta à proteína desenovelada Algumas proteínas de membrana adquirem uma âncora de glicosilfosfatidilinositol GPI ligada covalentemente Como discutido no Capítulo 10 várias enzimas citosólicas catalisam a adição cova lente de uma única cadeia de ácido graxo ou grupo prenila a proteínas selecionadas Os lipídeos anexados ajudam a direcionar e ancorar essas proteínas à membrana ce lular Um processo relacionado é catalisado por enzimas do RE que ligam covalente mente uma âncora de glicosilfosfatidilinositol GPI glycosylphosphatidylinositol à região Cterminal de algumas proteínas de membrana com destino à membrana plasmática Essa ligação é formada no lúmen do RE onde ao mesmo tempo o seg mento transmembrana da proteína é clivado Figura 1252 Um grande número de proteínas da membrana plasmática é modificado dessa forma Uma vez que são ade ridas ao exterior da membrana plasmática somente pelas suas âncoras de GPI elas podem em princípio ser liberadas das células na forma solúvel em resposta a sinais que ativam uma fosfolipase específica na membrana plasmática Os tripanossomos Figura 1252 Adesão de uma âncora de GPI a uma proteína no RE Proteínas ancoradas a GPI são direcionadas à mem brana do RE por uma sequênciasinal Nterminal não mostrado que é removida ver Figura 1242 Imediatamente após o término da síntese da proteína a proteína precursora permanece ancorada na mem brana do RE por uma sequência hidrofóbi ca Cterminal de 15 a 20 aminoácidos o restante da proteína está no lúmen do RE Em um intervalo de menos de 1 minuto uma enzima no RE excisa a proteína da sua região Cterminal ligada à membrana e simultaneamente adere a sua nova região Cterminal a um grupo amino em uma GPI intermediária présintetizada A cadeia de açúcar contém um inositol aderido ao lipídeo do qual a âncora de GPI deriva seu nome Ela é seguida por uma glicosamina e três manoses A manose terminal ligase a uma fosfoetanolamina que fornece o grupo amino para a ligação da proteína O sinal que especifica essa modificação está contido na sequência hidrofóbica Ctermi nal e em uns poucos aminoácidos adjacen tes a ela no lado do lúmen da membrana do RE se esse sinal é adicionado a outras proteínas elas também se modificam dessa forma Devido ao fato de a âncora de lipídeo estar covalentemente ligada a proteína permanece aderida à membrana com todos os seus aminoácidos expostos inicialmente no lúmen do RE e por fim no exterior da membrana plasmática H2N COOH Glicosilfosfatidilinositol COOH Peptídeo Cterminal clivado Proteína ligada à membrana pela âncora de GPI NH2 NH2 NH2 CITOSOL LÚMEN DO RE Inositol P P P P Etanolamina CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 689 parasitas por exemplo caso sejam atacados pelo sistema imune utilizam esse meca nismo para liberar seu revestimento de proteínas de superfície GPIancoradas As ân coras de GPI também são usadas para direcionar proteínas de membrana plasmática para balsas lipídicas e assim segregar as proteínas de outras proteínas de membrana ver Figura 1013 A maioria das bicamadas lipídicas é montada no RE A membrana do RE é o local de síntese de quase todas as principais classes de lipí deos da célula incluindo fosfolipídeos e colesterol necessários à produção de novas membranas celulares O principal fosfolipídeo sintetizado é a fosfatidilcolina também chamada de lecitina que pode ser formada em três etapas a partir de colina de dois ácidos graxos e de glicerol fosfato Figura 1253 Cada etapa é catalisada por enzimas na membrana do RE que têm seus sítios ativos voltados para o citosol onde são en contrados todos os metabólitos necessários Assim a síntese de fosfolipídeos ocorre exclusivamente no folheto citosólico da membrana do RE Devido ao fato de os ácidos graxos não serem solúveis em água eles são conduzidos dos seus sítios de síntese ao RE por proteínas de ligação a ácidos graxos no citosol Depois de chegarem na mem brana do RE e serem ativados com coenzima A CoA aciltransferases adicionam dois ácidos graxos sucessivamente ao glicerol fosfato para produzir ácido fosfatídico O ácido fosfatídico é suficientemente insolúvel em água para permanecer na bicamada lipídica e não pode ser extraído dela por proteínas de ligação a ácidos graxos Esse é então o primeiro passo para que a bicamada lipídica seja aumentada As etapas pos teriores determinam o grupo da cabeça de uma molécula de lipídeo recémformada e portanto a natureza química da bicamada mas não resultam em crescimento líquido da membrana Os outros dois principais fosfolipídeos fosfatidilserina e fosfatidileta nolamina ver Figura 103 assim como o menor fosfolipídeo fosfatidilinositol PI são todos sintetizados nessa via Como a síntese de fosfolipídeo ocorre no folheto citosólico da bicamada lipídica do RE é necessário que exista um mecanismo que transfira algumas das moléculas de fosfolipídeos recémformados para o folheto do lado do lúmen da bicamada Em bica madas lipídicas sintéticas lipídeos não se movem da forma flipflop ver Figura 1010 No RE todavia os fosfolipídeos equilibramse através da membrana em minutos o que é quase cem mil vezes mais rápido do que o flipflop retorno espontâneo Esse movimen to transbicamada rápido é mediado por um translocador de fosfolipídeos pobremente C O Ácido graxo C O Ácido graxo CH2 CH2 CH Colina Colina 5 4 CoA CoA CoA 2 CoA 2 Aciltrans ferase Fosfatase Colina fosfotransferase Glicerol 3fosfato LÚMEN DO RE Ácido fosfatídico Diacilglicerol Fosfatidilcolina O O C O Ácido graxo C O Ácido graxo CH2 CH2 OH CH O O CH2 CH2 CH OH OH OH OH C O Ácido graxo C O Ácido graxo C O Ácido graxo C O CH2 CH2 CH O O Ácido graxo C O Ácido graxo C O Ácido graxo OH C O Ácido graxo C C CMP 3 2 1 AcilCoAligase Proteína ligada ao ácido graxo Bicamada lipídica do RE CDPcolina P P P P P P Pi CITOSOL Figura 1253 Síntese de fosfatidilco lina Como ilustrado este fosfolipídeo é sintetizado a partir de glicerol3fosfato citidinadifosfocolina CDPcolina e ácidos graxos entregues ao RE por proteínas cito sólicas ligadas a ácidos graxos 690 PARTE IV Organização interna da célula caracterizado denominado embaralhador scramblase que de maneira não seletiva equilibra fosfolipídeos entre os dois folhetos da bicamada lipídica Figura 1254 Assim os diferentes tipos de fosfolipídeos parecem ser igualmente distribuídos entre os dois folhetos da membrana do RE A membrana plasmática contém um tipo diferente de translocador fosfolipí dico que pertence à família de transportadores de absorção do tipo P discutido no Capítulo 11 Essas flipases reconhecem especificamente fosfolipídeos que contêm gru pos amino livres nos seus grupos da cabeça fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina ver Figura 103 e os transfere a partir do meio extracelular para o folheto citosólico utili zando a energia da hidrólise do ATP A membrana plasmática portanto apresenta uma composição fosfolipídica altamente assimétrica que é ativamente mantida por flipases ver Figura 1015 A membrana plasmática também contém um misturador mas ao contrário do misturador do RE que é sempre ativo a enzima da membrana plasmática é regulada e ativada apenas em algumas situações como em apoptose e em plaquetas ati vadas onde age para cancelar a assimetria da bicamada lipídica a exposição resultante de fosfatidilserina na superfície de células apoptóticas serve como um sinal para células fagocíticas ingerirem e degradarem a célula morta O RE também produz colesterol e ceramida Figura 1255 A ceramida é sin tetizada pela condensação do aminoácido serina com um ácido graxo para formar o aminoálcool esfingosina ver Figura 103 um segundo ácido graxo é então adicionado covalentemente para formar a ceramida A ceramida é exportada ao aparelho de Gol gi onde serve como um precursor para a síntese de dois tipos de lipídeos as cadeias oligossacarídicas são adicionadas para formar glicoesfingolipídeos glicolipídeos ver Figura 1016 e os grupos da cabeça de fosfocolina são transferidos da fosfatidilcolina a outras moléculas de ceramida para formar esfingomielina discutido no Capítulo 10 Assim tanto os glicolipídeos quanto a esfingomielina são produzidos tardiamente no processo de síntese de membrana Pelo fato de serem produzidos por enzimas que têm seus sítios ativos expostos ao lúmen do Golgi e não serem substratos para transportado res de lipídeos são encontrados exclusivamente no folheto não citosólico da bicamada lipídica que os contém Figura 1254 Papel dos translocadores de fosfolipídeos na síntese da bicama da lipídica A Uma vez que novas molé culas de lipídeos são adicionadas somente à metade citosólica da bicamada da mem brana do RE e que as moléculas de lipídeos não se movem de maneira espontânea de uma monocamada à outra o trans locador de fosfolipídeo transmembrana chamado de misturador é necessário para transferir moléculas de lipídeo da metade citosólica à metade do lúmen de modo que a membrana desenvolvase como uma bicamada O misturador não é específico para grupos da cabeça de fosfolipídeo em particular e portanto equilibra os diferentes fosfolipídeos entre as duas monocamadas B Alimentada pela hidrólise de ATP uma flipase grupo da cabeçaespecífica na membrana plas mática move ativamente fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina direcionalmente do folheto extracelular ao citosólico criando a assimetria característica da bicamada li pídica da membrana plasmática de células animais ver Figura 1015 CITOSOL LÚMEN DO RE Bicamada lipídica do retículo endoplasmático Crescimento assimétrico da bicamada Crescimento simétrico de ambas as metades da bicamada A SÍNTESE DE FOSFOLIPÍDEOS SOMASE À METADE CITOSÓLICA DA BICAMADA A SCRAMBLASE CATALISA A TRANSFERÊNCIA DE MOLÉCULAS FOSFOLIPÍDICAS DO FOLHETO CITOSÓLICA PARA O FOLHETO DO LADO DO LÚMEN A MEMBRANA DO RE B MEMBRANA PLASMÁTICA EXTERIOR DA CÉLULA CITOSOL Bicamada lipídica assimétrica da membrana plasmática DISTRIBUIÇÃO DA NOVA MEMBRANA POR EXOCITOSE A FLIPASE CATALISA A LIBERAÇÃO DE FOSFOLIPÍDEOS ESPECÍFICOS PARA A MONOCAMADA CITOSÓLICA CH3 OH CH OH CH2 CH212 CH CH CH O NH CH216 CH3 C CERAMIDA Figura 1255 A estrutura da ceramida CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 691 Como discutido no Capítulo 13 a membrana plasmática e as membranas do apa relho de Golgi os lisossomos e os endossomos fazem parte de um sistema de membra nas que se comunica com o RE por meio do transporte de vesículas que transferem pro teínas e lipídeos As mitocôndrias e os plastídios todavia não pertencem a esse sistema e requerem portanto mecanismos diferentes para a importação de proteínas e lipídeos para o crescimento Já vimos que a maioria das proteínas nessas organelas é importada do citosol Embora as mitocôndrias modifiquem alguns dos lipídeos que importam não sintetizam lipídeos de novo antes seus lipídeos devem ser importados do RE direta ou indiretamente por meio de outras membranas celulares Em ambos os casos são neces sários mecanismos especiais para a transferência Os detalhes de como a distribuição dos lipídeos entre diferentes membranas é ca talisada e regulada não são conhecidos Proteínas carreadoras solúveis em água chama das de proteínas de troca de fosfolipídeos ou proteínas de transferência de fosfolipídeos transferem moléculas individuais de fosfolipídeos entre as membranas funcionando como proteínas de ligação a ácidos graxos que guiam os ácidos graxos através do citosol ver Figura 1254 Além disso as mitocôndrias são frequentemente vistas em estreita justaposição a membranas do RE em micrografias eletrônicas e complexas junções es pecíficas têm sido identificadas as quais mantêm o RE e as membranas mitocondriais externas em forte proximidade Acreditase que esses complexos juncionais forneçam mecanismos específicos de transferência de lipídeos dependentes de contato que ope ram entre essas membranas adjacentes Resumo A extensa rede do RE serve como uma fábrica para a produção de quase todos os lipídeos das células Além disso a maior porção da síntese de proteínas celulares ocorre na super fície citosólica do RE rugoso quase todas as proteínas destinadas à secreção ou ao próprio RE o aparelho de Golgi os lisossomos os endossomos e a membrana plasmática são im portadas primeiramente do citosol para o RE No lúmen do RE as proteínas enovelamse e se oligomerizam ligações dissulfeto são formadas e oligossacarídeos ligados ao N são adicionados A glicosilação ligada ao N é utilizada para indicar o grau do enovelamento proteico de tal modo que as proteínas deixam o RE apenas quando estão adequadamente enoveladas As proteínas que não se enovelam ou oligomerizam corretamente são trans portadas de volta ao citosol onde são desglicosiladas poliubiquitinadas e degradadas em proteassomos Se as proteínas mal enoveladas acumularemse extensivamente no RE elas desencadeiam uma resposta à proteína desenovelada que ativa genes apropriados no núcleo para auxiliar o RE a contornar o problema Apenas as proteínas que portam uma sequênciasinal especial do RE são impor tadas para ele A sequênciasinal é reconhecida por uma partícula de reconhecimento de sinal SRP que se liga à cadeia polipeptídica crescente e ao ribossomo e os direciona a uma proteína receptora na superfície citosólica da membrana do RE rugoso Essa li gação à membrana do RE inicia o processo de translocação que força uma alça da ca deia polipeptídica através da membrana do RE pelo poro hidrofílico de uma proteína translocadora As proteínas solúveis destinadas ao lúmen do RE para secreção ou transferência ao lúmen de outras organelas passam completamente para o lúmen do RE As proteínas transmembrana destinadas ao RE ou a outras membranas celulares são transportadas parcialmente através da membrana do RE e permanecem lá ancoradas por um ou mais segmentos de ahélice em sua cadeia polipeptídica que atravessam a membrana Essas porções hidrofóbicas da proteína podem atuar como sinais de início ou de parada da transferência durante o processo de translocação Quando um polipeptídeo contém múl tiplos sinais alternantes de início e de parada da transferência ele passará múltiplas ve zes para trás e para a frente através da bicamada como uma proteína transmembrana de passagem múltipla A assimetria da inserção da proteína e da glicosilação no RE estabelece a assi metria das membranas de todas as outras organelas que o RE supre com proteínas de membrana O QUE NÃO SABEMOS Como os receptores de importa ção nuclear lidam com o interior emaranhado semelhante a um gel do complexo de poro nuclear de maneira tão eficiente O complexo de poro nuclear é uma estrutura rígida ou ela pode ser expandida e contraída depen dendo da carga transportada Comparações de sequências mos tram que as sequênciassinal para uma proteína individual como a insulina são extremamente con servadas entre as espécies muito mais do que seria esperado a par tir do nosso entendimento atual de que tudo o que importa para a sua função são características es truturais gerais como hidrofobici dade Que outras funções podem sinalizar sequências que poderiam contribuir para a conservação evo lutiva da sequência Como são arranjados os polirri bossomos na membrana do retí culo endoplasmático para que o próximo ribossomo inicial possa encontrar um translocador deso cupado Por que a partícula de reconheci mento do sinal possui uma subu nidade de RNA indispensável 692 PARTE IV Organização interna da célula TESTE SEU CONHECIMENTO Quais afirmativas estão corretas Justifique 121 Assim como o lúmen do RE o interior do núcleo é to pologicamente equivalente ao exterior da célula 122 Os ribossomos ligados ao RE e livres que são estru tural e funcionalmente idênticos diferem apenas quanto às proteínas sintetizadas em um determinado momento 123 Para evitar as colisões inevitáveis que poderiam ocorrer se um tráfego de duas vias passasse em um único poro com plexos do poro nuclear especializados fazem a mediação da importação enquanto outros fazem a mediação da exportação 124 Os peroxissomos são encontrados em apenas poucos tipos especializados de células eucarióticas Discuta as questões a seguir 125 Qual o destino de uma proteína sem sinal de endere çamento 126 O RE rugoso é o local de síntese de muitas classes de proteínas de membrana Algumas dessas proteínas perma necem no RE enquanto outras são distribuídas para com partimentos como o aparelho de Golgi os lisossomos e a membrana plasmática Uma medida da dificuldade do pro blema da distribuição é o grau de purificação que deve ser alcançado durante o transporte do RE As proteínas a serem enviadas à membrana plasmática são comuns ou raras entre todas as proteínas de membrana do RE Algumas considerações permitem responder a essa questão Em uma célula em crescimento típica que está se dividindo uma vez a cada 24 horas o equivalente a 1 nova membrana plasmática deve transitar no RE a cada dia Se a membrana do RE é 20 vezes a área de uma membrana plas mática qual é a razão das proteínas da membrana plasmá tica com relação a outras proteínas de membrana no RE Suponha que todas as proteínas nas suas vias da membrana plasmática permanecem no RE por 30 minutos em média antes de saírem e que a razão entre proteínas e lipídeos no RE e membranas do plasma é a mesma 127 Antes de os complexos do poro nuclear serem bem entendidos não estava claro se as proteínas nucleares di fundiamse passivamente para o núcleo e acumulavamse lá pela ligação a residentes do núcleo como cromossomos ou se eram ativamente importadas e acumuladas apesar da sua afinidade pelos componentes nucleares Um experimento clássico que se voltou a esse proble ma usou muitas formas de nucleoplasmina radioativa que é uma proteína pentamérica grande envolvida na agregação da cromatina Nesse experimento tanto a proteína intacta quanto cabeças caudas ou cabeças com uma única cauda de nucleoplasmina foram injetadas no citoplasma de um oóci to ou núcleo de uma rã Figura Q121 Todas as formas de nucleoplasmina exceto cabeças acumularamse no núcleo quando injetadas no citoplasma e todas as formas foram re tidas no núcleo quando injetadas nele A Que porção da molécula de nucleoplasmina é responsá vel pela localização no núcleo B Como esses experimentos distinguem entre transpor te ativo no qual um sinal de localização nuclear dispara o transporte pelo complexo do poro nuclear e difusão passiva na qual o sítio de ligação para um componente nuclear per mite o acúmulo no núcleo 128 Supondo que 32 milhões de octâmeros de histonas são necessários para empacotar o genoma humano quantas mo léculas de histonas devem ser transportadas a cada segundo por complexo do poro nuclear em células cujo núcleo contém 3 mil poros nucleares e estão se dividindo uma vez por dia 129 O complexo do poro nuclear NPC cria uma barreira para a troca livre de moléculas entre o núcleo e o citosol mas de uma forma que permanece misteriosa Em leveduras por exemplo o poro central de NPC tem 35 nm de diâmetro e 30 nm de comprimento que é de certa forma menor que seu homólogo vertebrado Mesmo assim é grande o suficiente para acomodar praticamente todos os componentes do ci tosol Além disso o poro permite a difusão passiva de molé culas até 40 kD a entrada de alguma molécula maior precisa da ajuda de um receptor de importação nuclear A permea bilidade seletiva é controlada pelos componentes proteicos do NPC que têm a cauda polar não estruturada se estenden do para o poro central Essas caudas são caracterizadas por repetições dos aminoácidos hidrofóbicos fenilalanina F e glicina G periodicamente Em altas concentrações cerca de 50 mM domínios de repetições FG FGrepeats dessas proteínas podem formar um gel com uma malha de interações entre repetições de FG hi drofóbicas Figura Q122A Essas malhas permitem a lenta di fusão passiva de pequenas moléculas mas impedem a entrada de proteínas grandes como a proteína fluorescente mCherry fusionada com a proteína de ligação à maltose MBP Figura Q122B A fusão com MBP torna a proteína mCherry muito grande para entrar no núcleo por difusão passiva Contudo se o receptor de importação nuclear importina é fusionado com uma proteína similar MBPGFP a proteína fusionada importi naMBPGFP facilmente entra no gel Figura Q122B Preparação de nucleoplasmina Intacta Apenas cauda Uma cauda Apenas cabeça Injeção nuclear Injeção citoplásmática Figura Q121 Localização celular de nucleoplasmina e componentes de nu cleoplasmina injetados Diagramas esquemáticos de autorradiografias mos tram o citoplasma e o núcleo com a localização da nucleoplasmina indicada pelas áreas vermelhas CAPÍTULO 12 Compartimentos intracelulares e endereçamento de proteínas 693 A As repetições FG formam malhas in vitro apenas em concentrações relativamente altas 50 mM Seria essa a con centração razoável para as repetições FG no centro do NPC Em leveduras existem ao redor de 5 mil repetições FG em cada NPC Dadas as dimensões do poro nuclear de levedu ra 35 nm de diâmetro e 30 nm de comprimento calcule a concentração de repetições de FG no volume cilíndrico do poro Essa concentração é comparável àquela usada in vitro B Uma segunda questão é se a difusão de importinaMBP GFP por meio da malha de repetições FG é rápida o bastan te para a estimativa da eficiência do fluxo de materiais entre o núcleo e o citosol A partir de experimentos do tipo mos trado na Figura Q122B determinouse que o coeficiente de difusão D de importinaMBPGFP através do gel de repeti ções FG teria cerca de 01 m 2s A equação para difusão é t x 22D onde t é o tempo e x a distância Calcule o tempo que a difusão de importinaMBPGFP levaria para se difundir através do poro nuclear de levedura 30 nm se o poro con sistisse de um gel de repetições FG Será rápido o suficiente para as necessidades de uma célula eucariótica 1210 Os componentes dos complexos TIM proteínas translocadoras de múltiplas subunidades na membrana in terna da mitocôndria são muito menos abundantes do que aqueles do complexo TOM Eles foram inicialmente identifi cados pelo uso de truques genéticos O gene Ura3 de levedura cujo produto é uma enzima que normalmente está localizada no citosol onde é essen cial para a síntese da uracila foi modificado de modo que a proteína carrega um sinal de importação para a matriz mito condrial Uma população de células carregando o gene Ura3 modificado em vez do gene normal foi então cultivada na ausência de uracila Muitas células morreram mas as raras células que cresceram mostraram um defeito para a impor tação mitocondrial Explique como essa seleção identifica células com defeitos nos componentes necessários para a importação da matriz mitocondrial Por que células normais com o gene Ura3 modificado não cresceram na ausência de uracila Por que células que são defectivas para a importa ção mitocondrial crescem na ausência de uracila 1211 Se a enzima dihidrofolato redutase DHFR que normalmente está localizada no citosol foi modificada ge neticamente para carregar uma sequênciaalvo mitocon drial na sua porção Nterminal ela é importada de maneira eficiente para a mitocôndria Se a DHFR modificada é pri meiro incubada com metotrexato que se liga fortemente ao sítio ativo a enzima permanece no citosol Como você supõe que a ligação do metotrexato interfere na importação mitocondrial 1212 Por que as mitocôndrias necessitam de um trans locador especial para importar proteínas através da mem brana externa quando a membrana já possui grandes poros formados por porinas 1213 Examine a proteína transmembrana de passagem múltipla mostrada na Figura Q123 Qual seria o efeito se o primeiro segmento hidrofóbico transmembrana fosse con vertido em um segmento hidrofílico Esboce a disposição da proteína modificada na membrana do RE NH2 COOH CITOSOL LÚMEN DO RE 1 3 5 2 4 6 Figura Q123 Disposição de uma proteína transmembrana de passagem múltipla na membrana do RE Os hexágonos azuis representam oligossa carídeos ligados covalentemente As posições dos aminoácidos carregados positiva e negativamente flanqueiam o segundo segmento transmembrana como mostrado 1214 Todos os novos fosfolipídeos são adicionados ao fo lheto citosólico da membrana do RE ainda que essa mem brana tenha uma distribuição simétrica de diferentes fosfoli pídeos em seus dois folhetos Em contrapartida a membrana plásmatica que recebe todos os seus componentes de mem brana do RE tem uma distribuição muito assimétrica dos fosfolipídeos nos dois folhetos da bicamada lipídica Como essa simetria é gerada na membrana do RE e como a assi metria é gerada e mantida na membrana plasmática A B Solução MBPmCherry ImportinaMBPGFP Gel 30 s 30 s 10 min 10 min 30 min 30 min Figura Q122 Gel de repetições FG e a entrada de proteínas no núcleo A Desenhe a malha gel formada por interações emparelhadas entre as repe tições FG hidrofóbicas Para repetições FG separadas por 17 aminoácidos como é típico a rede formada pelas cadeias laterais de aminoácidos estendi dos poderia corresponder a cerca de 4 nm de um lado que poderia ser largo o suficiente para explicar a difusão passiva característica de proteínas através de poros nucleares B Difusão de MBPmCherry e importinaMBPGFP para o gel de repetições FG Em cada grupo a solução é mostrada à esquerda e o gel à direita As áreas mais claras indicam as regiões que contêm as proteínas fluorescentes 694 PARTE IV Organização interna da célula REFERÊNCIAS Gerais Palade G 1975 Intracellular aspects of the process of protein synthesis Science 189 347358 Compartimentalização das células Blobel G 1980 Intracellular protein topogenesis Proc Natl Acad Sci USA 77 14961500 Devos DP Gräf R Field MC 2014 Evolution of the nucleus Curr Opin Cell Biol 28 815 Warren G Wickner W 1996 Organelle inheritance Cell 84 395400 Transporte de moléculas entre o núcleo e o citosol Adam SA Gerace L 1991 Cytosolic proteins that specifically bind nuclear location signals are receptors for nuclear import Cell 66 837847 Burke B Stewart CL 2013 The nuclear lamins flexibility in function Nat Rev Mol Cell Biol 14 1324 Cole CN Scarcelli JJ 2006 Transport of messenger RNA from the nucleus to the cytoplasm Curr Opin Cell Biol 18 299306 Güttinger S Laurell E Kutay U 2009 Orchestrating nuclear envelope disassembly and reassembly during mitosis Nat Rev Mol Cell Biol 10 178191 Hetzer MW Wente SR 2009 Border control at the nucleus biogenesis and organization of the nuclear membrane and pore complexes Dev Cell 17 606616 Hoelz A Debler EW Blobel G 2011 The structure of the nuclear pore complex Annu Rev Biochem 80 613643 Hülsmann BB Labokha AA Görlich D 2012 The permeability of reconstituted nuclear pores provides direct evidence for the selective phase model Cell 150 738751 Köhler A Hurt E 2007 Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm Nat Rev Mol Cell Biol 8 761773 Rothballer A Kutay U 2013 Poring over pores nuclear pore complex insertion into the nuclear envelope Trends Biochem Sci 38 292301 StrambioDeCastilla C Niepel M Rout MP 2010 The nuclear pore complex bridging nuclear transport and gene regulation Nat Rev Mol Cell Biol 11 490501 Tran EJ Wente SR 2006 Dynamic nuclear pore complexes life on the edge Cell 125 10411053 Transporte de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos Chacinska A Koehler CM Milenkovic D et al 2009 Importing mitochondrial proteins machineries and mechanisms Cell 138 628644 Jarvis P Robinson C 2004 Mechanisms of protein import and routing in chloroplasts Curr Biol 14 R1064R1077 Kessler F Schnell DJ 2009 Chloroplast biogenesis diversity and regulation of the protein import apparatus Curr Opin Cell Biol 21 494500 Prakash S Matouschek A 2004 Protein unfolding in the cell Trends Biochem Sci 29 593600 Schleiff E Becker T 2011 Common ground for protein translocation access control for mitochondria and chloroplasts Nat Rev Mol Cell Biol 12 4859 Peroxissomos Dimitrov L Lam SK Schekman R 2013 The role of the endoplasmic reticulum in peroxisome biogenesis Cold Spring Harb Perspect Biol 5 a013243 Fujiki Y Yagita Y Matsuzaki T 2012 Peroxisome biogenesis disorders Biochim Biophys Acta 1822 13371342 Schliebs W Girzalsky W Erdmann R 2010 Peroxisomal protein import and ERAD variations on a common theme Nat Rev Mol Cell Biol 11 885890 Tabak HF Braakman I van der Zand A 2013 Peroxisome formation and maintenance are dependent on the endoplasmic reticulum Annu Rev Biochem 82 723744 Retículo endoplasmático Akopian D Shen K Zhang X Shan SO 2013 Signal recognition particle an essential proteintargeting machine Annu Rev Biochem 82 693721 Blobel G Dobberstein B 1975 Transfer of proteins across membranes I Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membranebound ribosomes of murine myeloma J Cell Biol 67 835851 Borgese N Mok W Kreibich G Sabatini DD 1974 Ribosomalmembrane interaction in vitro binding of ribosomes to microsomal membranes J Mol Biol 88 559580 Braakman I Bulleid NJ 2011 Protein folding and modification in the mammalian endoplasmic reticulum Annu Rev Biochem 80 7199 Brodsky JL Skach WR 2011 Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum recent lessons from yeast and mammalian cell systems Curr Opin Cell Biol 23 464475 Chen S Novick P FerroNovick S 2013 ER structure and function Curr Opin Cell Biol 25 428433 Clark MR 2011 Flippin lipids Nat Immunol 12 373375 Daleke DL 2003 Regulation of transbilayer plasma membrane phospholipid asymmetry J Lipid Res 44 233242 Deshaies RJ Sanders SL Feldheim DA Schekman R 1991 Assembly of yeast Sec proteins involved in translocation into the endoplasmic reticulum into a membranebound multisubunit complex Nature 349 806808 Gething MJ 1999 Role and regulation of the ER chaperone BiP Semin Cell Dev Biol 10 465472 Görlich D Prehn S Hartmann E et al 1992 A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation Cell 71 489503 Hegde RS Ploegh HL 2010 Quality and quantity control at the endoplasmic reticulum Curr Opin Cell Biol 22 437446 Hegde RS Keenan RJ 2011 Tailanchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum Nat Rev Mol Cell Biol 12 787798 Levine T Loewen C 2006 Interorganelle membrane contact sites through a glass darkly Curr Opin Cell Biol 18 371378 LópezMarqués RL Holthuis JCM Pomorski TG 2011 Pumping lipids with P4ATPases Biol Chem 392 6776 Mamathambika BS Bardwell JC 2008 Disulfidelinked protein folding pathways Annu Rev Cell Dev Biol 24 211235 Marciniak SJ Ron D 2006 Endoplasmic reticulum stress signaling in disease Physiol Rev 86 11331149 Milstein C Brownlee GG Harrison TM Mathews MB 1972 A possible precursor of immunoglobulin light chains Nat New Biol 239 117120 Park E Rapoport TA 2012 Mechanisms of Sec61SecYmediated protein translocation across membranes Annu Rev Biophys 41 2140 Römisch K 2005 Endoplasmic reticulumassociated degradation Annu Rev Cell Dev Biol 21 435456 Rowland AA Voeltz GK 2012 Endoplasmic reticulummitochondria contacts function of the junction Nat Rev Mol Cell Biol 13 607625 Trombetta ES Parodi AJ 2003 Quality control and protein folding in the secretory pathway Annu Rev Cell Dev Biol 19 649676 Tsai B Ye Y Rapoport TA 2002 Retrotranslocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol Nat Rev Mol Cell Biol 3 246255 Walter P Ron D 2011 The unfolded protein response from stress pathway to homeostatic regulation Science 334 10811086 von Heijne G 2011 Introduction to theme membrane protein folding and insertion Annu Rev Biochem 80 157160 NESTE CAPÍTULO MECANISMOS MOLECULARES DO TRANSPORTE DE MEMBRANA E MANUTENÇÃO DA DIVERSIDADE DE COMPARTIMENTOS TRANSPORTE DO RE ATRAVÉS DO APARELHO DE GOLGI TRANSPORTE DA REDE TRANS DE GOLGI PARA OS LISOSSOMOS TRANSPORTE DA MEMBRANA PLASMÁTICA PARA DENTRO DA CÉLULA ENDOCITOSE TRANSPORTE DA REDE TRANS DE GOLGI PARA O EXTERIOR DA CÉLULA EXOCITOSE CAPÍTULO 13 Tráfego intracelular de vesículas Toda célula deve alimentarse comunicarse com o mundo que a circunda e responder rapidamente às mudanças em seu ambiente Para auxiliar na realização dessas tarefas as células ajustam continuamente a composição da sua membrana plasmática e de seus compartimentos internos mediante respostas rápidas à necessidade Elas utilizam um elaborado sistema interno de membranas para adicionar e remover proteínas da superfí cie celular como receptores canais iônicos e transportadores Figura 131 Por meio do processo de exocitose a via secretora distribui proteínas recémsintetizadas carboidra tos e lipídeos para a membrana plasmática ou para o espaço extracelular Pelo processo inverso de endocitose as células removem componentes da membrana plasmática e os largam em compartimentos internos denominados endossomos de onde eles podem ser reciclados para as mesmas regiões ou para regiões diferentes da membrana plasmática ou podem ser entregues aos lisossomos para degradação As células também usam a en docitose para capturar nutrientes importantes como vitaminas colesterol e ferro estes são recolhidos junto com as macromoléculas às quais se ligam e são então movidos para os endossomos e lisossomos de onde podem ser transportados para dentro do ci toplasma para uso em vários processos biossintéticos O espaço interior ou lúmen de cada compartimento envolto por membrana ao longo das vias secretora e endocítica é equivalente ao lúmen da maioria dos outros com partimentos envolvidos por membranas e ao exterior da célula no sentido de que as proteínas podem transitar nesse espaço sem ter de atravessar uma membrana quando elas são passadas de um compartimento ao outro por meio de numerosos pacotes envol tos por membranas Esses pacotes são formados pelo compartimento do doador e são vesículas pequenas e esféricas vesículas maiores e irregulares ou túbulos Utilizaremos o termo vesícula transportadora para todas as formas desses pacotes Dentro de uma célula eucariótica as vesículas transportadoras brotam continua mente de uma membrana e se fundem com outra carregando componentes de mem brana e moléculas solúveis do lúmen que são referidos como carga Figura 132 Esse tráfego de vesículas flui ao longo de vias altamente organizadas e direcionadas que per mitem que a célula secrete alimentese e remodele sua membrana plasmática e orga nelas A via secretora direcionase para fora a partir do retículo endoplasmático RE na direção do aparelho de Golgi e da superfície celular com uma via lateral levando aos lisossomos enquanto a via endocítica direcionase para dentro a partir da membrana plasmática Em cada caso vias de recuperação fazem o balanço do fluxo de membranas entre os compartimentos na direção oposta trazendo membranas e proteínas seleciona das de volta ao compartimento de origem Figura 133 Figura 131 Exocitose e endocitose A Na exocitose uma vesícula transpor tadora se funde à membrana plasmática Seu conteúdo é liberado no espaço extracelular enquanto a membrana da vesícula vermelho tornase contínua à membrana plasmática B Na endocitose um fragmento da membrana plasmática vermelho é internalizado formando uma vesícula transportadora Seu conteúdo é derivado do espaço extracelular A Exocitose B Endocitose Membrana plasmática CITOSOL CITOSOL 696 PARTE IV Organização interna da célula Para executar a sua função cada vesícula transportadora que brota de um com partimento deve ser seletiva Ela deve captar apenas as moléculas apropriadas e deve se fundir somente com a membranaalvo apropriada Uma vesícula carregando carga do RE para o aparelho de Golgi por exemplo deve excluir a maioria das proteínas que devem ficar no RE e deve se fundir apenas com o aparelho de Golgi e não com qualquer outra organela Iniciamos este capítulo considerando os mecanismos moleculares de brotamento e de fusão que fundamentam todo o transporte de vesículas Discutimos então o pro blema fundamental de como no âmbito desse transporte a célula mantém as diferenças moleculares e funcionais entre seus compartimentos Finalmente consideramos a fun ção do aparelho de Golgi dos lisossomos das vesículas secretoras e dos endossomos à medida que traçamos as vias que conectam essas organelas Figura 132 Transporte por vesícula Vesículas transportadoras brotam de um compartimento e se fundem a outro À medida que fazem isso elas carregam materiais como carga a partir do lúmen espaço dentro de um compartimento envolto por membrana e membrana do compartimento doador para o lúmen e membrana do compartimentoalvo como mostrado FUSÃO LÚMEN CITOSOL COMPARTIMENTO DOADOR COMPARTIMENTO ALVO BROTAMENTO Moléculascarga LISOSSOMO Vesícula secretora Endossomo primário Endossomo de reciclagem Endossomo tardio Membrana plasmática Membrana plasmática Cisternas Aparelho de Golgi Envelope nuclear Retículo endoplasmático Lisossomo A B ENDOSSOMO DE RECICLAGEM ENDOSSOMO PRIMÁRIO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO GOLGI ENDOSSOMO TARDIO VESÍCULAS SECRETORAS CITOSOL CITOSOL EXTERIOR DA CÉLULA ESPAÇO EXTRACELULAR Vesícula endocítica Figura 133 Roteiro das vias secretora e endocítica A No roteiro esquematizado que foi introduzido no Capítulo 12 as vias endocítica e secretora estão ilustradas com setas verdes e vermelhas respectivamente Além disso as setas azuis indicam vias de recuperação para o fluxo retrógrado de componentes sele cionados B Os compartimentos da célula eucariótica envolvidos no transporte vesicular O lúmen de cada compartimento envolto por membrana é topologi camente equivalente ao lado externo da célula Todos os compartimentos mostrados comunicamse uns com os outros e com o lado externo da célula por meio de vesículas transportadoras Na via secretora setas vermelhas as moléculas proteicas são transportadas do RE para a membrana plasmática ou via endosso mos para os lisossomos Na via endocítica setas verdes as moléculas são ingeridas em vesículas endocíticas derivadas da membrana plasmática e entregues para endossomos primários e então via endossomos tardios para os lisossomos Muitas moléculas endocitadas são recuperadas de endossomos primários e devolvidas algumas via endossomos de reciclagem para a superfície celular para reúso semelhantemente algumas moléculas são recuperadas dos endossomos primário e tardio e devolvidas ao aparelho de Golgi e algumas são recuperadas do aparelho de Golgi e devolvidas ao RE Todas essas vias de recuperação estão mostradas com setas azuis como em A