Lista de Pirossequenciamento

1 Explique o princípio do pirossequenciamento e como essa tecnologia detecta a incorporação de nucleotídeos durante a síntese de DNA 2 Compare o pirossequenciamento com o método de Sanger no que diz respeito à sensibilidade velocidade e aplicação prática 3 Quais enzimas são essenciais no processo de pirossequenciamento e qual a função de cada uma delas 4 Cite ao menos duas limitações do pirossequenciamento e como essas limitações podem impactar a análise de dados genômicos 5 Descreva uma aplicação prática do pirossequenciamento na área da saúde ou da microbiologia e justifique a escolha dessa tecnologia 6 O que é um pirograma Como ele é interpretado 1 Explique o princípio do pirossequenciamento e como essa tecnologia detecta a incorporação de nucleotídeos durante a síntese de DNA O pirossequenciamento é um método de sequenciamento de DNA baseado na detecção enzimática da liberação de pirofosfato PPi durante a incorporação de nucleotídeos pela DNA polimerase Diferentemente do método de Sanger que utiliza terminadores de cadeia o pirossequenciamento detecta os eventos de síntese em tempo real por meio de uma reação em cascata luminosa O processo ocorre em várias etapas coordenadas 1 O DNA molde é amplificado e fixado em uma superfície sólida micropartículas ou microplacas 2 Um primer é hibridizado à sequência molde iniciando a extensão pela DNA polimerase 3 À medida que cada desoxinucleotídeo trifosfato dNTP é incorporado à cadeia complementar ocorre a liberação de um pirofosfato inorgânico PPi 4 O PPi liberado é convertido em adenosina trifosfato ATP pela ação da ATP sulfurilase utilizando adenosina 5fosfosulfato APS como substrato 5 O ATP formado alimenta a reação da luciferase que oxida a luciferina e emite luz emissão bioluminescente 6 A intensidade luminosa gerada é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados consecutivamente do mesmo tipo 7 Após cada ciclo a enzima apirase degrada nucleotídeos e ATP residuais reiniciando o sistema A leitura do sinal luminoso é registrada por um fotodetector e os picos de emissão compõem o pirograma representando a sequência em tempo real RONAGHI et al 1996 HALL 2007 2 Compare o pirossequenciamento com o método de Sanger no que diz respeito à sensibilidade velocidade e aplicação prática Característica Pirossequenciamento Método de Sanger Princípio Detecção luminosa da liberação de PPi em tempo real Interrupção da síntese por dideoxinucleotídeos Sensibilidade Alta detecta variantes de nucleotídeo único SNPs e pequenas mutações Boa porém limitada em misturas heterogêneas Velocidade Rápido reação e leitura simultâneas em minutos Lento requer eletroforese capilar e leitura posterior Leitura Quantitativa e em tempo real Terminal e dependente de fragmentação Aplicações Tipagem de SNPs análises metagenômicas mutações somáticas Clonagem sequenciamento de plasmídeos e genomas pequenos Custo Reagentes enzimáticos caros mas alta taxa de processamento Menor custo por amostra porém menor rendimento O pirossequenciamento oferece maior sensibilidade e rapidez enquanto o método de Sanger é mais robusto para leituras longas e análises confirmatórias AHMADIAN et al 2000 LIU et al 2012 3 Quais enzimas são essenciais no processo de pirossequenciamento e qual a função de cada uma delas O sistema de pirossequenciamento depende de um conjunto integrado de quatro enzimas que atuam de forma sequencial e sinérgica 1 DNA Polimerase Thermosequenase ou Klenow fragment Catalisa a adição de nucleotídeos complementares à fita molde liberando pirofosfato PPi a cada incorporação 2 ATP Sulfurilase Converte o PPi liberado em ATP utilizando APS adenosina 5 fosfosulfato como cofator Reação P Pi APS ATPSO4 2 3 Luciferase Utiliza o ATP gerado para oxidar luciferina em oxiluciferina liberando fótons de luz detectados por sensores ópticos LuciferinaATPO2Oxiluciferina AMPCO2Luz 4 Apirase Enzima hidrolítica que degrada nucleotídeos não incorporados e ATP excedente limpando o sistema para o próximo ciclo e evitando ruído de fundo Essas enzimas trabalham de modo cíclico garantindo alta precisão e sincronia no registro dos eventos de síntese RONAGHI et al 1998 LEAMON et al 2003 4 Cite ao menos duas limitações do pirossequenciamento e como essas limitações podem impactar a análise de dados genômicos 1 Erros em regiões homopoliméricas A técnica tem dificuldade em distinguir o número exato de bases consecutivas idênticas ex AAAA ou AAAAA pois o sinal luminoso pode saturar ou apresentar variação não linear Isso compromete a acurácia de leitura em genomas ricos em repetições simples 2 Alto custo operacional A dependência de múltiplas enzimas purificadas e substratos de alta pureza APS e luciferina eleva os custos de reação e limita o uso em larga escala 3 Leituras curtas O comprimento máximo de sequência obtida é de aproximadamente 300500 pb inferior ao de Sanger Isso restringe o uso em projetos de sequenciamento de genomas longos Essas limitações impactam principalmente estudos metagenômicos e análises de populações microbianas onde a precisão em regiões repetitivas é crítica LEAMON et al 2003 SHENDURE JI 2008 5 Descreva uma aplicação prática do pirossequenciamento na área da saúde ou da microbiologia e justifique a escolha dessa tecnologia Na saúde o pirossequenciamento é amplamente utilizado para a detecção de mutações somáticas em genes oncogênicos como KRAS BRAF EGFR e para tipagem de SNPs associados a doenças genéticas hereditárias Por exemplo a identificação da mutação V600E no gene BRAF em carcinomas colorretais permite orientar terapias alvo com inibidores específicos SERRANO et al 2009 Na microbiologia o método é aplicado na análise de comunidades bacterianas microbioma intestinal ambiental e hospitalar e na detecção de resistência antimicrobiana Sua alta sensibilidade permite a caracterização precisa de populações mistas e variantes de baixa abundância o que é essencial para vigilância epidemiológica e estudos de diversidade genética ANDERSEN et al 2016 A escolha dessa tecnologia se justifica por sua capacidade de quantificação em tempo real precisão em mutações pontuais e eficiência analítica em amostras complexas 5 O que é um pirograma Como ele é interpretado O pirograma é o registro gráfico resultante do pirossequenciamento Cada pico representa a emissão de luz durante a incorporação de nucleotídeos O eixo x indica a ordem dos nucleotídeos dispensados e o eixo y representa a intensidade luminosa em unidades relativas Altura do pico proporcional ao número de nucleotídeos idênticos incorporados Sequência determinada pela comparação direta entre os picos obtidos e a ordem de adição dos dNTPs Ruído de fundo corrigido pela ação da apirase e calibrado automaticamente A interpretação do pirograma permite reconstruir a sequência do DNA de forma quantitativa e imediata sendo a base da leitura automatizada nos equipamentos de pirossequenciamento RONAGHI et al 1998 LIU et al 2012 REFERÊNCIAS AHMADIAN A et al Singlenucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing Analytical Biochemistry v 280 p 103110 2000 ANDERSEN M R et al Pyrosequencing for microbial diversity studies strengths and pitfalls BMC Genomics v 17 p 114 2016 HALL N Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology The Journal of Experimental Biology v 210 p 15181525 2007 LEAMON J H et al Sequencing by synthesis pyrosequencing for smallscale analysis Methods in Molecular Biology v 255 p 143153 2003 LIU L et al Comparison of nextgeneration sequencing systems Journal of Biomedicine and Biotechnology v 2012 p 111 2012 RONAGHI M et al Realtime DNA sequencing using detection of pyrophosphate release Analytical Biochemistry v 242 p 8489 1996 RONAGHI M et al A sequencing method based on realtime pyrophosphate Science v 281 p 363365 1998 SERRANO M et al Clinical relevance of BRAF V600E mutation detection using pyrosequencing in colorectal cancer Clinical Cancer Research v 15 p 59385945 2009 SHENDURE J JI H Nextgeneration DNA sequencing Nature Biotechnology v 26 p 11351145 2008 1 Explique o princípio do pirossequenciamento e como essa tecnologia detecta a incorporação de nucleotídeos durante a síntese de DNA O pirossequenciamento é um método de sequenciamento de DNA baseado na detecção enzimática da liberação de pirofosfato PPi durante a incorporação de nucleotídeos pela DNA polimerase Diferentemente do método de Sanger que utiliza terminadores de cadeia o pirossequenciamento detecta os eventos de síntese em tempo real por meio de uma reação em cascata luminosa O processo ocorre em várias etapas coordenadas 1 O DNA molde é amplificado e fixado em uma superfície sólida micropartículas ou microplacas 2 Um primer é hibridizado à sequência molde iniciando a extensão pela DNA polimerase 3 À medida que cada desoxinucleotídeo trifosfato dNTP é incorporado à cadeia complementar ocorre a liberação de um pirofosfato inorgânico PPi 4 O PPi liberado é convertido em adenosina trifosfato ATP pela ação da ATP sulfurilase utilizando adenosina 5fosfosulfato APS como substrato 5 O ATP formado alimenta a reação da luciferase que oxida a luciferina e emite luz emissão bioluminescente 6 A intensidade luminosa gerada é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados consecutivamente do mesmo tipo 7 Após cada ciclo a enzima apirase degrada nucleotídeos e ATP residuais reiniciando o sistema A leitura do sinal luminoso é registrada por um fotodetector e os picos de emissão compõem o pirograma representando a sequência em tempo real RONAGHI et al 1996 HALL 2007 2 Compare o pirossequenciamento com o método de Sanger no que diz respeito à sensibilidade velocidade e aplicação prática Característica Pirossequenciamento Método de Sanger Princípio Detecção luminosa da liberação de PPi em tempo real Interrupção da síntese por dideoxinucleotídeos Sensibilidade Alta detecta variantes de nucleotídeo único SNPs e pequenas mutações Boa porém limitada em misturas heterogêneas Velocidade Rápido reação e leitura simultâneas em minutos Lento requer eletroforese capilar e leitura posterior Leitura Quantitativa e em tempo real Terminal e dependente de fragmentação Aplicações Tipagem de SNPs análises metagenômicas mutações somáticas Clonagem sequenciamento de plasmídeos e genomas pequenos Custo Reagentes enzimáticos caros mas alta taxa de processamento Menor custo por amostra porém menor rendimento O pirossequenciamento oferece maior sensibilidade e rapidez enquanto o método de Sanger é mais robusto para leituras longas e análises confirmatórias AHMADIAN et al 2000 LIU et al 2012 3 Quais enzimas são essenciais no processo de pirossequenciamento e qual a função de cada uma delas O sistema de pirossequenciamento depende de um conjunto integrado de quatro enzimas que atuam de forma sequencial e sinérgica 1 DNA Polimerase Thermosequenase ou Klenow fragment Catalisa a adição de nucleotídeos complementares à fita molde liberando pirofosfato PPi a cada incorporação 2 ATP Sulfurilase Converte o PPi liberado em ATP utilizando APS adenosina 5 fosfosulfato como cofator Reação 𝑃𝑃𝑖 𝐴𝑃𝑆 𝐴𝑇𝑃 𝑆𝑂4 2 3 Luciferase Utiliza o ATP gerado para oxidar luciferina em oxiluciferina liberando fótons de luz detectados por sensores ópticos 𝐿𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 𝐴𝑇𝑃 𝑂2 𝑂𝑥𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 𝐴𝑀𝑃 𝐶𝑂2 𝐿𝑢𝑧 4 Apirase Enzima hidrolítica que degrada nucleotídeos não incorporados e ATP excedente limpando o sistema para o próximo ciclo e evitando ruído de fundo Essas enzimas trabalham de modo cíclico garantindo alta precisão e sincronia no registro dos eventos de síntese RONAGHI et al 1998 LEAMON et al 2003 4 Cite ao menos duas limitações do pirossequenciamento e como essas limitações podem impactar a análise de dados genômicos 1 Erros em regiões homopoliméricas A técnica tem dificuldade em distinguir o número exato de bases consecutivas idênticas ex AAAA ou AAAAA pois o sinal luminoso pode saturar ou apresentar variação não linear Isso compromete a acurácia de leitura em genomas ricos em repetições simples 2 Alto custo operacional A dependência de múltiplas enzimas purificadas e substratos de alta pureza APS e luciferina eleva os custos de reação e limita o uso em larga escala 3 Leituras curtas O comprimento máximo de sequência obtida é de aproximadamente 300500 pb inferior ao de Sanger Isso restringe o uso em projetos de sequenciamento de genomas longos Essas limitações impactam principalmente estudos metagenômicos e análises de populações microbianas onde a precisão em regiões repetitivas é crítica LEAMON et al 2003 SHENDURE JI 2008 5 Descreva uma aplicação prática do pirossequenciamento na área da saúde ou da microbiologia e justifique a escolha dessa tecnologia Na saúde o pirossequenciamento é amplamente utilizado para a detecção de mutações somáticas em genes oncogênicos como KRAS BRAF EGFR e para tipagem de SNPs associados a doenças genéticas hereditárias Por exemplo a identificação da mutação V600E no gene BRAF em carcinomas colorretais permite orientar terapias alvo com inibidores específicos SERRANO et al 2009 Na microbiologia o método é aplicado na análise de comunidades bacterianas microbioma intestinal ambiental e hospitalar e na detecção de resistência antimicrobiana Sua alta sensibilidade permite a caracterização precisa de populações mistas e variantes de baixa abundância o que é essencial para vigilância epidemiológica e estudos de diversidade genética ANDERSEN et al 2016 A escolha dessa tecnologia se justifica por sua capacidade de quantificação em tempo real precisão em mutações pontuais e eficiência analítica em amostras complexas 5 O que é um pirograma Como ele é interpretado O pirograma é o registro gráfico resultante do pirossequenciamento Cada pico representa a emissão de luz durante a incorporação de nucleotídeos O eixo x indica a ordem dos nucleotídeos dispensados e o eixo y representa a intensidade luminosa em unidades relativas Altura do pico proporcional ao número de nucleotídeos idênticos incorporados Sequência determinada pela comparação direta entre os picos obtidos e a ordem de adição dos dNTPs Ruído de fundo corrigido pela ação da apirase e calibrado automaticamente A interpretação do pirograma permite reconstruir a sequência do DNA de forma quantitativa e imediata sendo a base da leitura automatizada nos equipamentos de pirossequenciamento RONAGHI et al 1998 LIU et al 2012 REFERÊNCIAS AHMADIAN A et al Singlenucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing Analytical Biochemistry v 280 p 103110 2000 ANDERSEN M R et al Pyrosequencing for microbial diversity studies strengths and pitfalls BMC Genomics v 17 p 114 2016 HALL N Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology The Journal of Experimental Biology v 210 p 15181525 2007 LEAMON J H et al Sequencing by synthesis pyrosequencing for smallscale analysis Methods in Molecular Biology v 255 p 143153 2003 LIU L et al Comparison of nextgeneration sequencing systems Journal of Biomedicine and Biotechnology v 2012 p 111 2012 RONAGHI M et al Realtime DNA sequencing using detection of pyrophosphate release Analytical Biochemistry v 242 p 8489 1996 RONAGHI M et al A sequencing method based on realtime pyrophosphate Science v 281 p 363365 1998 SERRANO M et al Clinical relevance of BRAF V600E mutation detection using pyrosequencing in colorectal cancer Clinical Cancer Research v 15 p 59385945 2009 SHENDURE J JI H Nextgeneration DNA sequencing Nature Biotechnology v 26 p 11351145 2008