Biologia Molecular Resumo Completo DNA RNA Transcrição e Replicação

Noemi C Baron Cozentino Doutoranda em Microbiologia Agropecuária Ms Microbiologia Aplicada Orientador Prof Dr Everlon Cid Rigobelo A Biologia Molecular É um ramo da Biologia que explora o estudo da vida em escalas moleculares Estuda as interações a função e a estrutura dos genes a nível molecular Está intimamente envolvida com a bioquímica pois as interações genéticas ocorrem a níveis de átomos e moléculas Visa o estudo dos processos de replicação transcrição tradução suas regulações e seus possíveis erros e características O Início Descoberta da molécula de DNA Estudo do núcleo de glóbulos brancos Nucleína molécula grande rica em P e N Johann F Miescher 1869 Nucleína tem bases nitrogenadas Albrecht Kossel 1880 Nucleína tem natureza ácida Ácido nucleico Richard Altmann 1889 Estrutura do nucleotídeos Ácidos nucleicos são polinucleotídeos Phoebus Levine e Walter Jacobs 1912 1944 Oswald Avery DNA É A MOLÉCULA QUE CONTÉM AS INFORMAÇÕES HEREDITÁRIAS Elucidação a partir de testes com Streptococcus pneumoniae Frederick Griffith 1928 Cientistas conheciam a composição do DNA mas não sabiam sua função Francis Crick e James Watson 7 de março de 1953 a molécula do DNA tem a estrutura de uma dupla A partir de então a biologia molecular tornouse de fato uma ciência que hoje após 63 anos de avanços traz à cena a transgênese a genômica e a possibilidade da clonagem reprodutiva Dupla hélice de nucleotídeos Fitas em sentido antiparalelo com sequência de pares de bases complementares Pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas AT CG Fita simples Ribose A U C e G Obtido pela transcrição do DNA Replicação do DNA Necessária para a divisão celular Processo semiconservativo Sentido 5 3 Replicação do DNA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Fragmento de Okazaki Replicação do DNA Procariotos x Eucariotos Leitura da informação genética contida no DNA nos genes Três tipos principais de RNA RNAm mensageiro informacional RNAr ribossômico funcional e estrutural RNAt transferência funcional Transcrição do DNA Síntese de RNA Genes são segmentos funcionais de DNA sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína Realizada pela RNA polimerase Transcrição do DNA Síntese de RNA RNAm policistrônico Em procariotos DNA monocistrônico Várias RNA polimerase I II e III Íntrons e éxons Processamento do RNAm Cap G metilada em 5 Splicing Cauda poli A Em Eucariotos Síntese de DNA in vitro PCR Science 1985 vol 230 n 4732 p 1350 1354 Kari B Mullis É um método de amplificação de criação de múltiplas cópias de DNA sem o uso de um organismos vivo O que é necessário para se fazer cópias de DNA in vitro 1 DNA molde 2 Iniciadores 3 DNA polimerase 4 Nucleotídeos 1 DNA Molde 2 Água 3 Tampão 4 MgCl2 5 Iniciadores primers 6 Nucleotídeos 7 DNA polimerase Termociclador Equipamento que realiza oscilações de temperatura em ciclos definidos para que a amplificação do DNA aconteça Iniciadores primers Em pares para cada gene Iniciador F Forward Iniciador R Reverse 5 3 3 5 Iniciador F Iniciador R Temperaturas no ciclo da PCR Taq Polimerase Taq Thermus aquaticus polimerase termoestável bactéria hipertermófila fontes hidrotermais Ciclos são repetidos de forma a obterse quantidade suficiente de DNA alvo amplificado 25 a 40 ciclos em média Milhares de cópias do DNA alvo ao final do processo Qualquer gene pode ser amplificado desde que os iniciadores corretos sejam utilizados Amplificação mais comum fins taxonômicos DNA ribossomal DNA ribossomal codifica RNA ribossomal Todos os seres vivos possuem ribossomos Genes amplificados na PCR DNA ribossomal rDNA procarioto gene mais utilizado 16S rDNA eucarioto genes mais utilizados ITS e 28S Iniciador Sequência 53 Referência ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al 1990 ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al 1990 ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC White et al 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al 1990 ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al 1990 ITS1F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes Bruns 1993 ITS4B CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes Bruns 1993 Separação de moléculas mediante sua migração em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho sendo que as de menor massa migram mais rapidamente É comumente utilizada para a separação de proteínas e ácidos nucleicos DNA e RNA É realizada em géis de poliacrilamida ou agarose Agarose polímero polissacarídico Dgalactose e 36anidroL galactopiranose Agarose gelifica não há polimerização de agarose no gel varia com a amostra em análise Equipamento Cuba de eletroforese Gel Agarose TBE Tris Ácido Bórico EDTA Preparo do gel Aplicação da amostra de DNA no Gel DNA Corante intercalante glicose Ligar à cuba à uma fonte de energia para aplicação do potencial Posicionar o gel na cuba e cobrir com TBE Eletroforese em gel de agarose Amostras de DNA Polo Negativo Gel de agarose imerso em solução Sentido da migração Polo Positivo Fragmentos de DNA separados pelo tamanho Os maiores em cima e os menores em baixo Início do procedimento Final do procedimento Visualização das bandas em transiluminador ultravioleta Os princípios são os mesmos da eletroforese em gel de agarose A poliacrilamida polimeriza acrilamida bisacrilamida Garante maior resolução na separação das bandas Géis verticais TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR BASEADAS NA UTILIZAÇÃO DA PCR TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR BASEADAS NA UTILIZAÇÃO DA PCR Sequenciamento de DNA Técnicas de fingerprinting genético Microssatélite RAPD DGGE ARDRA Sequenciamento de DNA Determinação da ordem precisa dos nucleotídeos em uma molécula de DNA Determinar a ordem das bases nitrogenadas Método tradicional Método Didesoxi de Sanger 1980 Frederick Sanger Novas reações de PCR porém com nucleotídeos normais e modificados Iniciadores unidirecionais primers F ou R Nucleotídeos modificados Didesoxinucleotídeos interrompem elongação da fita de DNA Marcados radioativamente httpswwwyoutubecomwatchve3UOaIXukeQ DNA molde Iniciador Taq polimerase dNtps nucleotídeos normais ddNtps modificados MgCl2 Tampão Eletroforese em gel de poliacrilamida Reações baseadas no método de Sanger polimerização em cadeia de uma fita simples Nucleotídeos modificados marcados com fluorescência distinta Não são necessárias quatro reações separadas todos os nucleotídeos em uma mesma reação Eletroforese capilar em gel capilar de poliacrilamida Leitura por espectroscopia de fluorescência laser Gera gráfico eletroferograma Método efetivo e muito utilizado Custo elevado Leitura de sequências longas em média até 2000 pares de bases Qualidade picos elevados e definidos Geralmente o início e fim das sequência são de baixa qualidade Análise das sequências de DNA Edição das sequências em softwares Bioedit Comparação das sequências com outras em bancos de dados NCBI Genbank Uso da ferramenta Blast Análise das sequências de DNA Os métodos de nova geração 2ª 3ª e 4ª gerações visam tornar o sequenciamento de DNA mais rápido mais barato mantendo a confiabilidade das sequências obtidas As tecnologias atuais permitem o sequenciamento de genomas completos de microorganismos em questão de horas Porém exigem o acoplamento de softwares e hardwares de grande capacidade de processamento Geram sequências curtas em grande quantidade Sequenciamento de DNA 1ª geração Sanger Automático 2ª geração 454Roche Illumina Solid 3ª geração PacBio 4ª geração Ion TorrentIon Proton Estão ligados ao desenvolvimento das técnicas de metagenômica Metagenômica Estudo do material genético genomas recuperados diretamente de amostras ambientais Métodos de fingerprinting genético O DNA tem a mesma composição química nos seres vivos o que muda é a sequência dos pares de bases As técnicas de fingerprinting visam elucidar essas diferenças mediante o uso da técnica de PCR associada à diversos aspectos metodológicos A visualização é feita em gel de agarose ou poliacrilamida Cada técnica leva à geração de padrões de bandas que variam entre os diferentes grupos de organismos Testes de paternidade Identificação criminal Análises forenses Identificação de doenças Análises em processos industriais Diferenciação de microorganismos Diversidade genética Comportamento ao longo do tempo Etc Podem ser baseados na técnica de PCR e no uso em conjunto da mesma com processos de restrição enzimática do DNA Etapas 1 Extração do DNA 2 Amplificação do DNA alvo marcadores genéticos eou digestão com enzimas de restrição 3 Visualização em gel de agarose ou poliacrilamida 4 Análise dos perfis de bandas Microssatélites são unidades de repetição de pares de bases do DNA Contém de 1 a 6 nucleotídeos repetidos in tandem por dezenas a centenas de vezes Existem em grande quantidade nos genomas eucariotos e também podem ser encontrados em procariotos Foram considerados DNA lixo Possuem altas taxas de mutação Formam padrões de distribuição específicos do DNA variação entre táxons Princípio da técnica Execução da técnica de PCR utilizando iniciadores para as regiões repetidas microssatélites contém entre 15 e 30 pares de bases GTG5 CTG5 ACG5 GACA4 Aplicação em gel de agarose ou poliacrilamida Gel de Microssatélite de isolados de Cladosporium sp Utilizando iniciador GACA4 Figure 1 DNA fingerprinting profiles amplified from 16 different common phytopathogenic fungal species using the two newly designed primers CTG5 and ACG5 Twenty μL of PCR products were separated by electrophoresis on a 15 agarose gel for 15 h at 70 Vcm2 Lanes 1 to 16 are Fusarium oxysporum f sp vasinfectum F solani F graminearum F culmorum F poae Macrophomina phaseolina Trichoderma harizinum Stagonospora nodorum Septoria tritici Pyrenophora tritici repentis P teres Pseudocercosporella herpotrichoides Penicillium sp Alternaria sp Cercospora beticola Chaetomium sp M is the 100bp DNA ladder Bahkali et al 2012 Princípio da técnica Utilização de iniciadores inespecíficos que se anelam em diversas regiões ao longo o DNA genômico Iniciadores curtos 8 a 12 pares de bases Para cada linhagemindivíduo a quantidade e o tamanho dos fragmentos de DNA amplificados oriundos do anelamento inespecífico será diferente Adzitey et al 2013 Representative RAPD agarose gel showing DNA fingerprints of Salmonella strains Lane 1 1 kb DNA ladder lanes 219 Salmonella strains isolated from ducks and their environmental samples lane 20 100 bp DNA ladder Muito utilizada na caracterização de comunidades microbianas Princípio da técnica PCR convencional com DNA genômico total extraído de amostras ambientais geralmente com iniciadores para DNA ribossomal Iniciadores com grampo GC Aplicação dos produtos de PCR em gel de poliacrilamida com agentes desnaturantes de DNA ureia e formamida em gradiente crescente Separação de fragmentos com diferença de um par de base Cada banda uma população Excisão das bandas sequenciamento DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Cells DNA extraction PCR PCR products Total DNA Checking the yield of PCR products using agarose gel electrophoresis Gradient gel Gradient gel electrophoresis DGGE or TGGE Gradiente de desnaturação Cutting the fragments out of the gel eluting the DNA and amplification with PCR without GCclamp Purification and sequencing of the fragments CTGAATCGTA Figure 1 Figure 1 PCRDGGE analysis of the predominant bacterial communities in vaginal swabs from bacterial vaginosis BV group and healthy women CN group A Each lane of the PCRDGGE gel represented one subject which was selected in its group at random M represents a marker constructed in this study with the identified bands to facilitate the interpretation of the figure Bands 1 Uncultured Sneathia sp 2 Fusobacterium nucleatum subsp nucleatum ATCC 25586 3 Clostridium thermocellum ATCC 27405 4 Lactobacillus iners 5 Clostridium acetobutylicum 6 Lactobacillus iners 7 Clostridium thermocellum ATCC 27405 8 Atopobium vaginae 9 uncultured Eggerthella sp 10 uncultured Megasphaera sp 11 Lactobacillus crispatus kong et al 2010 Estudo de comparação de populações microbianas em diferentes ambientes Estudo de populações microbianas em um mesmo ambiente ao longo do tempo Estudo de populações microbianas em ambientes submetidos à alterações ambientais Contaminação com poluentes Petróleo e derivados Agrotóxicos Corantes Etc Estudo de populações microbianas associadas à plantas Endofíticos Epifíticos Rizoféricos Micorrízicos Diferenciação entre isolados separação de espécies para identificação Princípio da técnica Realização de PCR convencional utilizando iniciadores para DNA ribossomal Após a PCR o DNA amplificado é submetido à digestão com enzimas de restrição Eletroforese em gel de agarose Padrões de banda diferentes indicam espécies diferentes Enzimas de restrição reconhecem sequências específicas do DNA e promovem a clivagem da molécula em tais pontos tesouras biológicas Pontos de clivagem sequências palindrômicas repetições invertidas de 4 a 8 pares de base Microrganismo Enzima Sequência Alvo Escherichia coli EcoRI Bacillus amyloliquefaciens H BamHI Bacillus globigii Bg111 Haemophilus aegyptius HaeII Haemophilus aegyptius Hind111 Providencia stuartii PstI Streptococcus albus G SalI Thermus aquaticus TaqI Brevibacterium albidum BalI Haemophilus aegyptius HaeIIl Serratia marcescens SmaI ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis RIBOPRINTING Cells Lysis DNA Extraction DNA Heat Denaturation Oligonucleotide Primers Small Subunit rRNA Gene Polymerase Chain Reaction Restriction Enzyme Digestion Gel Electrophoresis Tian et al 2009 Bactérias isoladas da rizosfera de plantas de tabaco OBRIGADA