Biologia Molecular Volume 2 Modulos 2 e 3 - Ana Beatriz Garcia e Jacyara M B Macedo

No text found in this image Módulos 2 e 3 Ana Beatriz Garcia Jacyara M B Macedo Volume 2 3ª edição Biologia Molecular Fundação CECIERJ Consórcio cederj Ana Beatriz Garcia Jacyara M B Macedo Volume 2 Módulos 2 e 3 3ª edição Biologia Molecular Apoio Material Didático ELABORAÇÃO DE CONTEÚDO Ana Beatriz Garcia Jacyara M B Macedo COORDENAÇÃO DE DESENVOLVIMENTO INSTRUCIONAL Cristine Costa Barreto COORDENAÇÃO DE LINGUAGEM Maria Angélica Alves DESENVOLVIMENTO INSTRUCIONAL E REVISÃO Ana Tereza de Andrade Anna Maria Osborne Carmen Irene Correia de Oliveira REVISÃO TÉCNICA Marta Abdala Referências Bibliográfi cas e catalogação na fonte de acordo com as normas da ABNT Copyright 2005 Fundação Cecierj Consórcio Cederj Nenhuma parte deste material poderá ser reproduzida transmitida e gravada por qualquer meio eletrônico mecânico por fotocópia e outros sem a prévia autorização por escrito da Fundação G216b Garcia Ana Beatriz Biologia molecular v2 Ana Beatriz Garcia 3ed Rio de Janeiro Fundação CECIERJ 2009 262p 19 x 265 cm ISBN 8576480603 1 Genética 2 Replicação de DNA 3 Informação gênica 4 Procariotos 5 Eucariotos I Macedo Jacyara MB II Título CDD 5728 20091 EDITORA Tereza Queiroz COORDENAÇÃO EDITORIAL Jane Castellani REVISÃO TIPOGRÁFICA Ana Tereza de Andrade Jane Castellani Kátia Ferreira dos Santos Marcia Pinheiro Sandra Valéria Oliveira COORDENAÇÃO DE PRODUÇÃO Jorge Moura PROGRAMAÇÃO VISUAL Andréa Dias Fiães Cristiane Matos Guimarães Márcia Valéria de Almeida Sanny Reis ILUSTRAÇÃO Eduardo Bordoni Fabiana Rocha Jefferson Caçador Morvan de Araújo Neto Sami Souza CAPA Fábio Muniz PRODUÇÃO GRÁFICA Andréa Dias Fiães Fábio Rapello Alencar Departamento de Produção Fundação Cecierj Consórcio Cederj Rua Visconde de Niterói 1364 Mangueira Rio de Janeiro RJ CEP 20943001 Tel 21 22994565 Fax 21 25680725 Presidente Masako Oya Masuda Vicepresidente Mirian Crapez Coordenação do Curso de Biologia UENF Milton Kanashiro UFRJ Ricardo Iglesias Rios UERJ Cibele Schwanke Universidades Consorciadas Governo do Estado do Rio de Janeiro Secretário de Estado de Ciência e Tecnologia Governador Alexandre Cardoso Sérgio Cabral Filho UENF UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO Reitor Almy Junior Cordeiro de Carvalho UERJ UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO Reitor Ricardo Vieiralves UNIRIO UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO Reitora Malvina Tania Tuttman UFRRJ UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO Reitor Ricardo Motta Miranda UFRJ UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Reitor Aloísio Teixeira UFF UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Reitor Roberto de Souza Salles No text found in this image Biologia Molecular SUMÁRIO Volume 2 Módulo 2 Aula 9 Como ocorre a replicação do DNA 7 Ana Beatriz Garcia Aula 10 O complexo maquinário de replicação e suas enzimas 19 Ana Beatriz Garcia Aula 11 O funcionamento do maquinário de replicação 37 Ana Beatriz Garcia Aula 12 Replicação de genomas lineares e organelas 55 Ana Beatriz Garcia Aula 13 Mutação e reparo do DNA 71 Jacyara M B Macedo Aula 14 Atividade presencial obrigatória Dinâmica DNA recombinante 111 Aula 15 Recombinação 113 Jacyara M B Macedo Aula 16 e 17 Estudo dirigido Atividade presencial obrigatória Engenharia Genética mitos e realidades 133 Aula 18 Elementos de transposição em procariotos 135 Ana Beatriz Garcia Aula 19 Elementos de transposição em eucariotos 153 Ana Beatriz Garcia Módulo 3 Aula 20 Fluxo de informação gênica transcrição em procariotos 169 Ana Beatriz Garcia Aula 21 Fluxo de informação gênica transcrição em eucariotos 187 Ana Beatriz Garcia Aula 22 Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons 203 Ana Beatriz Garcia Aula 23 Regulação da expressão gênica em procariotos 223 Ana Beatriz Garcia Gabarito 245 Tuttle UP 10 Layer Series Stopcock Manifolds Stopcock manifolds are primarily used to control flow of liquids and gases through tubing and pipelines and are especially suited for glove box or vacuum applications These manifolds eliminate the use of multiple fittings pipes valves and ball valves thus minimizing the number of potential leak points along the distribution lines Our manifolds are precision machined from one solid piece of tubing for maximum leak resistance and ease of cleaning Each valve has a PTFE plug and cover made of PTFE with a maximum temperature 400 F 204 C Shelf manifolds 3 5 7 and 9 ports Manifolds are epoxy painted a textured black finish in stock or available in clear anodized aluminum for vacuum applications Vacuum manifolds Vacuum rated manifolds available in 5 and 9 port sizes can be supplied with 14 SAE flare compression fitting or Swagelok tube compression fittings Pressure manifolds available by request Large bore manifolds Larger bore manifolds with 38 or 12 bore tubing are manufactured upon request Tube sizes Up to 38 bore made with 12 OD tubing standard ODbore 58 OD tubing with 38 bore available upon request 34 OD with 12 bore available upon request Overall length 6 inches long nominal on 9port manifolds and shorter for lesser ports Dimensions referenced to centers of stopcock fittings Valves are Tshaped with open ends stopcock lever Teflon plug with polyethylene cover Como ocorre a replicação do DNA Ao final desta aula você deverá ser capaz de Apresentar as importantes descobertas relacionadas ao mecanismo de duplicação do material genético chamado replicação Compreender a importância que esse mecanismo exerce sobre a perpetuação da vida de todos os seres objetivos 9 A U L A Prérequisitos Conhecimentos adquiridos nas aulas sobre estrutura do DNA 2 a 4 Módulo 1 C E D E R J 8 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 9 AULA 9 MÓDULO 2 Após a comprovação da natureza do material genético ou seja da descoberta de que o DNA é a molécula que armazena toda a informação que será utilizada pelo organismo para manifestar as suas características fenotípicas através da produção de proteínas surgiu o desafio de desvendar o mecanismo pelo qual essa informação é passada de uma célulamãe para uma célulafilha durante o processo de divisão celular Você deve estar lembrado de que o modelo desenvolvido por Watson e Crick em 1953 descreveu a molécula de DNA como uma duplahélice formada por fitas antiparalelas compostas pelos nucleotídeos A T G e C Deve lembrarse ainda de que as duas fitas permanecem ligadas através de ligações fracas do tipo pontes de hidrogênio formadas entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos sendo que a Adenina forma duas pontes de hidrogênio com a Timina e a Guanosina forma três pontes de hidrogênio com a Citosina Esse modelo mostrou ser ideal para o armazenamento e transmissão da informação genética mas você deve estar se perguntando o porquê desta afirmação Vamos observar o esquema apresentado na Figura 91 e acompanhar o raciocínio a seguir INTRODUÇÃO C E D E R J 8 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 9 AULA 9 MÓDULO 2 Figura 91 Quando duas fitas de DNA estão ligadas por pontes de hidrogênio as pontes podem ser rompidas Assim a base nitrogenada de cada nucleotídeo presente em cada uma das fitas apresenta a capacidade de formar pontes de hidrogênio com a base nitrogenada complementar de um outro nucleotídeo C E D E R J 10 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 11 AULA 9 MÓDULO 2 O DNA é composto por duas fitas complementares certo As ligações entre as duas fitas são do tipo pontes de hidrogênio que podem ser facilmente rompidas e restauradas conforme já estudamos na Bioquímica Muito bem então essa estrutura de duplahélice pode ser rompida com uma certa facilidade levando à formação de duas fitas simples Pois bem cada uma das bases nitrogenadas de cada um dos nucleotídeos presentes em cada uma das fitas separadas estão aptas a formar pontes de hidrogênio com as bases nitrogenadas de outros nucleotídeos Se houver uma Adenosina livre ela poderá formar duas pontes de hidrogênio com uma Timina Da mesma forma se houver uma Citosina livre ela poderá formar três pontes de hidrogênio com uma Guanosina e assim sucessivamente todas as bases poderão se ligar a novas bases de modo que duas novas duplahélices poderão ser formadas a partir de duas fitas simples Parece simples não é Esse mecanismo foi proposto por Watson e Crick na ocasião da divulgação da estrutura do DNA e recebeu o nome de replicação que implica a potencialidade de se produzir infinitas réplicas de um DNA a partir de uma única duplahélice Mais adiante veremos em detalhes como esse mecanismo ocorre Vejamos agora quais as possibilidades disso acontecer Em teoria a replicação do DNA poderia ocorrer de três diferentes maneiras conforme ilustrado na Figura 92 C E D E R J 10 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 11 AULA 9 MÓDULO 2 Figura 92 Os esquemas apresentam os três possíveis tipos de replicação a semi conservativa b conservativa e c dispersiva A replicação semiconservativa mostrada na Figura 92a modelo defendido por Watson e Crick implica na síntese de duas moléculasfilhas de DNA na qual a fita original da moléculamãe que foi utilizada como molde é mantida por isso é chamada semi que quer dizer metade e a segunda complementar corresponde à fitafilha sintetizada a partir do molde A replicação conservativa mostrada na Figura 92b implica na síntese de duas fitas complementares que usam a moléculamãe como molde mas após a síntese essas moléculas seriam separadas dos seus moldes e formariam uma nova molécula de modo que a moléculamãe manteria as duas fitas originais conservadas A replicação dispersiva por sua vez mostrada na Figura 92c implica na síntese de duas fitas complementares que usam a moléculamãe como molde mas após a síntese as moléculas resultantes seriam formadas pela junção de partes da fitamãe e partes da fita recémsintetizada gerando moléculas mistas C E D E R J 12 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 13 AULA 9 MÓDULO 2 O primeiro modelo parece o mais simples não é mesmo E também o mais óbvio por isso foi defendido por Watson e Crick logo no início A solução das dúvidas muitas vezes se encontra na realização de experimentos elegantes e inteligentes Acompanhe o que foi feito Em 1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl utilizaram a bactéria Escherichia coli para desvendar o modelo Os pesquisadores cultivaram Escherichia coli em meio contendo um isótopo de nitrogênio pesado N15 em substituição ao isótopo normal N14 As bases nitrogenadas do DNA possuem nitrogênio Assim o DNA das células que foram crescidas na presença de N15 apresentaram uma densidade maior do que o DNA das células crescidas na ausência de N15 Você deve estar pensando Mas como é que eles fizeram para separar o DNA mais denso do DNA menos denso E quem era quem Então vamos tentar entender explicando a técnica que foi utilizada Você pode acompanhar a explicação seguindo o esquema mostrado na Figura 93 C E D E R J 12 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 13 AULA 9 MÓDULO 2 Figura 93 Gradiente de equilíbrio de densidade de Cloreto de Césio A densidade da maioria dos DNAs é semelhante à densidade de soluções concentradas de sais pesados tais como Cloreto de Césio CsCl Por exemplo a densidade do CsCl a 6M é de cerca de 17 gcm3 e a densidade do DNA de Escherichia coli contendo N14 é de 1710 gcm3 A substituição de N14 por N15 aumenta a densidade do DNA para 1724 gcm3 Quando uma solução de CsCl a 6M é submetida à centrifugação em alta velocidade 30000 a 50000 revoluções por minuto durante 48 horas ocorre a formação de um gradiente de equilíbrio de densidade C E D E R J 14 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 15 AULA 9 MÓDULO 2 A força centrifugal causada pela centrifugação em alta velocidade sedimenta o sal no fundo do tubo Em contrapartida a força de difusão resulta no movimento de moléculas de sais de volta para a parte superior do tubo só que em concentração baixa Após um tempo longo de centrifugação o equilíbrio entre a força de centrifugação e difusão é atingido de modo que nesse momento existe um gradiente linear crescente de concentração de sal do topo para o fundo do tubo A densidade do CsCl a 6M é de cerca de 17 gcm3 no equilíbrio Após a centrifugação o gradiente linear de densidade irá variar de 165gcm3 no topo do tubo a cerca de 175 gcm3 no fundo do tubo Se houver DNA nessa solução de CsCl e conseqüentemente no gradiente o mesmo se moverá para uma posição na qual a densidade da solução de CsCl seja igual a dele Assim um DNA com densidade 171 gcm3 estará em uma posição diferente de um DNA com densidade 1724 gcm3 o que tornará possível a separação do DNA mais denso do DNA menos denso Voltemos agora para o experimento de Meselson e Stahl Após o cultivo das células durante algum tempo na presença de N15 todo o DNA estava mais pesado que o normal mais denso O próximo passo foi retirar todo o meio de cultura contendo N15 e adicionar meio de cultura contendo o N14 A Escherichia coli se divide a cada vinte minutos de modo que após cada divisão um ciclo de replicação do DNA está completo Assim coletando células em diferentes intervalos de tempo extraindo seu DNA e submetendoos ao gradiente já descrito foi possível desvendar como se dá o mecanismo de replicação Antes de chegarmos ao resultado final vamos analisar que modelos de replicação poderiam ser criados de acordo com os padrões que viessem a ser obtidos após o gradiente de equilíbrio de centrifugação Vamos acompanhar o esquema apresentado na Figura 94 e as explicações a seguir C E D E R J 14 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 15 AULA 9 MÓDULO 2 Figura 94 Padrões esperados para os diferentes tipos de replicação após o gradiente de equilíbrio de Césio Para a replicação semiconservativa mostrada na Figura 94a ao final do primeiro ciclo todas as moléculas apresentariam um peso intermediário resultante da presença de uma fita leve e uma fita pesada No final do segundo ciclo metade das moléculas apresentaria um peso intermediário uma fita leve e a outra fita pesada e a outra metade seria leve duas fitas leves O padrão esperado após a separação do DNA no gradiente de Cloreto de Césio seria o seguinte uma banda intermediária após o primeiro ciclo intermediária em que todas as moléculas apresentariam uma fita pesada e a outra fita leve duas bandas após o segundo ciclo uma leve duas moléculas leves e outra intermediária duas moléculas intermediárias C E D E R J 16 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 17 AULA 9 MÓDULO 2 Para a replicação conservativa mostrada na Figura 94b no final do primeiro ciclo metade das moléculas seria pesada conservadas e a outra metade seria leve replicadas a partir do molde pesado No final do segundo ciclo o mesmo padrão do primeiro ciclo seria esperado pois a moléculamãe sempre se conserva de modo que a molécula pesada seria a mesma usada como molde e conservada no primeiro ciclo o mesmo se repetindo após o segundo ciclo Dentre as moléculas leves uma delas seria a molécula gerada no primeiro ciclo e conservada e as outras duas leves seriam geradas a partir dos moldes uma leve conservada e uma pesada conservada O padrão esperado após a separação do DNA no gradiente de Cloreto de Césio seria o seguinte duas bandas após o primeiro ciclo uma molécula pesada e outra molécula leve duas bandas após o segundo ciclo três moléculas leves e uma molécula pesada Por último para a replicação dispersiva mostrada na Figura 94c no final do primeiro ciclo todas as moléculas seriam uma mistura entre as moléculas leves e pesadas O mesmo seria observado após o segundo ciclo O padrão esperado após a separação do DNA no gradiente de Cloreto de Césio seria o seguinte uma banda intermediária após o primeiro ciclo moléculas com partes mescladas uma banda após o segundo ciclo moléculas com partes mescladas O resultado obtido após o gradiente de equilíbrio de CsCl está ilustrado na Figura 95 Figura 95 O esquema apresenta o resultado observado no experimento Como controles nós podemos observar o DNA pesado contendo N15 e o DNA leve contendo N14 Após o primeiro ciclo houve o aparecimento de um tamanho intermediário entre N15N14 Após o segundo ciclo houve o aparecimento de um tamanho correspondente ao DNA leve contendo N14 e um tamanho intermediário entre N15N14 C E D E R J 16 Biologia Molecular Como ocorre a replicação do DNA C E D E R J 17 AULA 9 MÓDULO 2 A presença de uma banda intermediária após o primeiro ciclo de replicação indica que todas as moléculas de DNA contêm uma fita leve recémsintetizada e uma fita pesada proveniente da fita molde Após o segundo ciclo duas bandas foram observadas uma leve indicando a presença de DNA recémsintetizado a partir do molde obtido no primeiro ciclo e outra banda intermediária indicando a presença de DNA na qual uma das fitas contém nitrogênio pesado Esses resultados comprovaram que a replicação do DNA é semiconservativa Nesta aula você viu que o modelo proposto por Watson e Crick sugeriu um mecanismo de transmissão da informação genética contida no DNA através de um mecanismo conhecido como replicação Você viu ainda que a replicação do DNA é semiconservativa pois uma das fitas da nova molécula sintetizada é a mesma da moléculamãe que serviu de molde para a sua síntese R E S U M O EXERCÍCIOS 1 Você está convencido da importância do mecanismo de replicação do DNA Responda por quê 2 De que maneira o modelo de Watson e Crick indicou o possível mecanismo de duplicação da molécula do DNA 3 O que significa replicação semiconservativa AUTOAVALIAÇÃO Você não deve ter encontrado dificuldades para responder aos exercícios propostos Todas as respostas estão contidas no texto desta aula O estudo desse conteúdo é muito importante para a compreensão das próximas aulas nas quais falaremos sobre o maquinário de replicação Por isso bom estudo e até lá 1 Bill To Customer Name address Or Ship To address if different 2 Ship To Customer Name Address if different than Bill To 3 PO On Order 4 Terms 5 Ship Via 6 FOB Point 7 FOB Destination Freight Charge 8 Sold To 9 Date Ordered or Purchase Order No 10 Finished Goods Order No 11 Reason for Return 12 Reason for Disposition 13 Return Merchandise Authorization No 14 Authorized by 15 Called in by 16 Condition 17 Problems on Sales Order 18 Date Returned 19 Quantity Returned 20 Differential on Return 21 Purchase Order Returned 22 Remarks O complexo maquinário de replicação e suas enzimas Ao final desta aula você deverá ser capaz de Apresentar os diferentes componentes do maquinário de replicação Conhecer as diferentes enzimas envolvidas no processo de replicação e as suas respectivas funções objetivos 10 A U L A Prérequisitos Conhecimentos adquiridos na Aula 9 Material didático de Bioquímica para relembrar os conceitos de enzima reação covalente ligação fosfodiéster pontes de hidrogênio entre outros Material didático referente às aulas sobre estrutura dos cromossomos em vírus e procariotos e superespiralamento do DNA Módulo 1 Aulas 6 7 e 8 C E D E R J 20 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 21 AULA 10 MÓDULO 2 A importância do papel da replicação do DNA fica clara a partir da definição da sua função como molécula que armazena e transmite as informações que resultarão em todas as características de um organismo Já vimos que a replicação é semiconservativa mas como esse mecanismo importante e vital para a sobrevivência dos seres vivos é coordenado durante o processo de divisão celular para garantir que todas as célulasfilhas tenham o mesmo DNA que a célulamãe Vamos partir das definições mais simples até atingirmos os detalhes A unidade de DNA na qual ocorre um evento individual de replicação é chamada replicon Cada replicon é ativado uma vez e somente uma vez em cada ciclo celular O replicon é definido por possuir os elementos de controle necessários à replicação Ele possui uma origem na qual a replicação será iniciada e pode também conter uma região terminal onde a replicação termina O genoma dos procariotos constitui um único replicon responsável pela replicação de todo DNA cromossômico sendo considerado o maior replicon existente Mas existe um detalhe importante as bactérias podem conter informação genética adicional na forma de plasmídios Um plasmídio é um genoma circular autônomo que constitui um replicon separado Ele pode ser replicado ao mesmo tempo que o cromossomo ou não Muitos plasmídios se apresentam em cópias múltiplas dentro de uma única bactéria Da mesma maneira os fagos e vírus de DNA também constituem replicons capazes de ser ativados muitas vezes durante um ciclo de infecção Em contrapartida os cromossomos de eucariotos apresentam muitos replicons ou seja a replicação é iniciada simultaneamente em diferentes regiões do DNA Isso nos leva a pensar nos inúmeros mecanismos envolvidos no controle de iniciação síntese e finalização da replicação de genomas complexos da maioria dos eucariotos incluindo o homem De um modo geral uma molécula de DNA que está se replicando apresenta dois tipos de regiões uma que já foi replicada e outra que ainda está se replicando Se você observar a Figura 101 verá que quando o DNA está se replicando a região replicada aparece como um olho dentro do DNA não replicado Observe o formato da estrutura Ela não se parece com um olho INTRODUÇÃO C E D E R J 20 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 21 AULA 10 MÓDULO 2 Figura 101 O DNA replicado é visto como um olho de replicação cercado por DNA não replicado A região não replicada consiste em uma duplahélice parental já a região aberta corresponde às duas fitas que já foram replicadas Quando o replicon é circular a presença de um olho forma uma estrutura θ letra grega teta observada na Figura 102 pois a estrutura lembra o formato dessa letra grega Estas estruturas puderam ser definidas através de microscopia eletrônica Figura 102 O olho de repli cação forma uma estrutura θ no DNA circular C E D E R J 22 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 23 AULA 10 MÓDULO 2 O ponto no qual cada replicação ocorre é chamado forquilha de replicação Mais uma vez você verá que o nome da estrutura se deve ao seu formato A forquilha de replicação se move seqüencialmente ao longo do DNA a partir do seu ponto de origem A replicação pode ser unidirecional ou bidirecional A distinção entre os dois tipos se dá pela observação da formação de uma ou duas forquilhas de replicação a partir da origem o que pode ser observado no esquema da Figura 103 Figura 103 Os replicons podem ser unidirecionais ou bidirecionais Isso dependerá do número de forquilhas que são formadas a partir da origem Usandose técnicas de microscopia eletrônica foi possível demonstrar que a replicação é bidirecional para a maioria dos DNAs Você pode estar se perguntando Como se faz para definir processos o seu funcionamento e a sua regulação Pois muito bem A maior parte das informações relacionadas ao mecanismo de replicação do DNA foram obtidas em estudos utilizando a bactéria Escherichia coli e alguns vírus que facilitam a experimentação em laboratório bem como ao tamanho de seus genoma Usando esses organismos foi possível a obtenção de mutantes ou seja indivíduos que sofreram alteração no seu material genético e a posterior identificação dos genes que dão origem a proteínas específicas e conseqüentemente suas funções biológicas Você terá a oportunidade de estudar os mecanismos de mutação nas próximas aulas C E D E R J 22 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 23 AULA 10 MÓDULO 2 Além disso a possibilidade de reproduzir em tubos de ensaio o que nós chamamos experimentos in vitro um grande número de reações que ocorrem no organismo in vivo permitiu descobrir a função de diferentes enzimas envolvidas em inúmeros processos biológicos No entanto os pesquisadores devem tomar muito cuidado com as conclusões pois o comportamento in vitro pode não ser idêntico ao que ocorre no organismo vivo O MAQUINÁRIO DE REPLICAÇÃO Nesse tópico você estudará algumas das enzimas envolvidas no processo de replicação e poderá formar uma idéia da complexidade do maquinário As diferentes atividades enzimáticas estão envolvidas nas etapas de iniciação alongamento e terminação Vamos descrever o papel de cada uma dessas enzimas para facilitar a compreensão do processo de replicação como um todo Vamos começar falando sobre a enzima que sintetiza o DNA Uma enzima capaz de sintetizar uma nova fita de DNA utilizando uma outra fita como molde é chamada DNA polimerase Lembrese o DNA é um polímero composto por muitos nucleotídeos e assim a DNA polimerase é a enzima que constrói um polímero unindo os monômeros que são os nucleotídeos Existem enzimas que sintetizam DNA usando um RNA como molde transcriptase reversa encontrada em retrovírus e até mesmo enzimas que fazem DNA sem usar um molde transferase terminal Os eucariotos e procariotos possuem muitas enzimas com atividade de DNA polimerase no entanto somente algumas delas são responsáveis pela replicação propriamente dita sendo diferencialmente chamadas replicases As outras polimerases estão envolvidas em funções auxiliares tais como reparo que serão estudadas mais adiante C E D E R J 24 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 25 AULA 10 MÓDULO 2 DNA POLIMERASE I DE ESCHERICHIA COLI A DNA polimerase I de Escherichia coli foi a primeira DNA polimerase caracterizada em 1957 pelo pesquisador Arthur Kornberg Sabese que existem aproximadamente 400 moléculascélula A polimerase I de Escherichia coli é comumente chamada pol I A enzima é monomérica com massa molecular aproximada de 103 kDa 103000 gramas por mole A enzima requer o cátion divalente Mg como co fator para sua atividade Você já deve estar se perguntando Como é que essa enzima sintetiza DNA não é mesmo Então vejamos a seguir Nas aulas anteriores você já aprendeu que os precursores do DNA são os desoxirribonucleotídeos dATP dCTP dTTP e dGTP que são formados por uma pentose açúcar contendo 5 carbonos um grupamento fosfato trifosfato e uma base nitrogenada que os diferencia A T G e C A base nitrogenada está covalentemente ligada à pentose pelo carbono 1 primeiro carbono do açúcar no sentido horário já o grupamento fosfato está ligado ao carbono 5 quinto carbono do açúcar no sentido horário Existe um grupamento hidroxila OH livre no carbono 3 da pentose terceiro carbono do açúcar no sentido horário Na molécula do DNA vimos que o nucleotídeo se apresenta na forma de monofosfato e que sempre existe um fosfato livre na posição 5 do açúcar e um grupamento hidroxila livre na posição 3 do açúcar Quando o DNA é dupla fita o mesmo ocorre só que na direção oposta Por isso dizemos que a orientação do DNA é 5 3 A DNA polimerase atua justamente na incorporação de um novo nucleotídeo a um nucleotídeo já existente na molécula de DNA a partir da hidroxila livre na posição 3 Esta reação se dá através de um ataque nucleofílico que você já estudou na disciplina Bioquímica da hidroxila 3 sobre o átomo de fósforo interno presente no nucleotídeo precursor liberando um pirofosfato formando uma ligação fosfodiéster também estudado na disciplina Bioquímica C E D E R J 24 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 25 AULA 10 MÓDULO 2 A DNA polimerase não é capaz de adicionar um novo nucleotídeo se não houver um grupamento hidroxila livre Dessa forma dizemos que ela é dependente de um iniciador primer em inglês que lhe forneça uma hidroxila para que a reação aconteça A orientação da síntese é sempre 5 3 A incorporação de um nucleotídeo só ocorre através de uma reação entre o fosfato 5 do precursor e a hidroxila 3 Você pode observar a reação da DNA polimerase ilustrada na Figura 104 Figura 104 Mecanismo de ação da DNA polimerase O esquema ilustra uma cadeia na qual o nucleotídeo na extremidade 3 é um desoxiguanilato visto na aula sobre estrutura do DNA A DNA polimerase adiciona uma desoxitimidina monofosfato a partir do precursor desoxitimidina trifosfato à extremidade 3 da cadeia com a liberação de um pirofosfato C E D E R J 26 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 27 AULA 10 MÓDULO 2 Você deve ter em mente que o DNA sintetizado fica ligado covalentemente ao iniciador mas se liga ao molde somente pelas pontes de hidrogênio Assim o molde determina a especificidade do pareamento de acordo com o modelo de WatsonCrick Primeiro ocorre o pareamento de um nucleotídeo que contenha uma base complementar à base do nucleotídeo presente no molde posteriormente a DNA polimerase promove a ligação fosfodiéster Somente o fosfato α do dNTP é incorporado no novo DNA sintetizado É dessa forma então que todas as polimerases funcionam Na época da descoberta da pol I acreditavase que ela era a responsável pela replicação do genoma de Escherichia coli No entanto experimentos desenvolvidos in vitro demonstraram que a velocidade da síntese de DNA mediada pela pol I é de 20 nucleotídeossegundo muito mais lenta do que o valor de 1000 nucleotídeossegundo observado durante a replicação do DNA de Escherichia coli Em 1969 John Cairns isolou um mutante viável polA sem atividade da DNA pol I uma indicação de que pol I não é a principal enzima usada para replicar o DNA No entanto os mutantes polA apresentaram altos índices de mutação indicando uma deficiência no mecanismo de reparo do DNA ou seja embora a pol I tenha atividade de polimerase seu principal papel está envolvido com a correção de possíveis erros ocorridos durante o processo de replicação do DNA Você consegue compreender como é importante o estudo de mutantes Uma análise mais detalhada da pol I revelou que ela apresenta outras atividades Além de polimerase ela também apresenta atividades de exonuclease Uma nuclease é uma enzima que degrada ácidos nucléicos Uma exonuclease degrada ácidos nucléicos a partir de uma das duas extremidades 5 ou 3 enquanto uma endonuclease quebra internamente a molécula de DNA A pol I apresenta atividade exonucleásica 5 3 ou seja começa na extremidade 5 do DNA e apresenta também atividade exonucleásica 3 5 que remove nucleotídeos a partir da extremidade 3 do DNA C E D E R J 26 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 27 AULA 10 MÓDULO 2 Usando uma enzima chamada protease A que corta a pol I em dois fragmentos protéicos foi possível localizar as três atividades enzimáticas da proteína As atividades de polimerase 5 3 e exonuclease 3 5 estão contidas em um fragmento maior 68 kDa conhecido como fragmento KLENOW e a atividade de exonuclease 5 3 está em um fragmento menor 35 kDa A função de exonuclease 3 5 é a edição do DNA ou seja a remoção de nucleotídeos polimerizados incorretamente Este fato foi descoberto em mutantes mutator da DNA polimerase do fago T4 esses mutantes apresentaram atividade exonucleásica 3 5 reduzida Já um outro mutante antimutator tinha a atividade exonucleásica 3 5 aumentada No geral a atividade de exonuclease 3 5 aumenta a fidelidade na síntese do DNA em torno de 10 a 1000 vezes Assim quando a enzima polimerase sintetizando DNA na direção 5 3 adiciona acidentalmente uma base errada de DNA a atividade de verificação da exonuclease 3 5 remove o erro imediatamente O número de erros durante a síntese de DNA diminui consi deravelmente devido a dois sistemas de controle o sistema da regra de pareamento das bases reconhecido pelo sítio catalítico 5 3 e o sistema de verificação promovido pela exonuclease 3 5 O mecanismo de atuação da pol I na verificação e reparo durante a síntese de DNA será visto na próxima aula Você deve estar pensando Já que a pol I não é responsável pela replicação do cromossomo de Escherichia coli deve haver outra enzima responsável por isso Pois bem não existe somente uma mas duas outras DNA polimerases em Escherichia coli A DNA polimerase II e a DNA polimerase III A DNA polimerase II da mesma forma que a pol I é uma enzima de reparo embora apresente uma atividade menor do que a pol I Ela é um polipeptídeo monomérico com atividade de polimerase 5 3 e atividade de exonuclease 3 5 mas não apresenta atividade de exonuclease 5 3 KLENOW Este fragmento recebeu seu nome em homenagem ao pesquisador que o descobriu A subunidade Klenow da DNA polimerase é utilizada em laboratórios de Biologia Molecular para replicar DNA in vitro C E D E R J 28 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 29 AULA 10 MÓDULO 2 A DNA polimerase III é uma enzima multimérica formada por muitas subunidades diferentes Apresenta atividade de polimerase 5 3 e atividade de exonuclease 3 5 mas não apresenta atividade de exonuclease 5 3 A DNA polimerase III é a responsável pela replicação do cromossomo de Escherichia coli e por isso é diferencialmente chamada de replicase Você verá nos próximos tópicos os diferentes componentes da DNA polimerase III A REPLICASE EM ESCHERICHIA COLI Como vimos anteriormente a DNA polimerase III é uma enzima multimérica com uma massa molecular de 900 kDa quando encontrada na sua forma completa também conhecida como holoenzima Algumas subunidades apresentam função estrutural enquanto outras apresentam função catalítica A estrutura central mínima que apresenta atividade catalítica demonstrada in vitro contém três subunidades α alfa produto do gene dnaE ε épsilon produto do gene dnaQ e θ teta produto do gene holE A adição de uma quarta subunidade τ tau produto do gene X resulta na dimerização da estrutura central e aumenta a sua atividade catalítica A estrutura central só é capaz de sintetizar fitas curtas de DNA uma vez que ela se desprende facilmente da fita molde de DNA Uma outra subunidade β beta produto do gene dnaN da DNA polimerase III forma uma garra dimérica que impede que a estrutura central se desprenda do DNA molde E a complexidade não pára por aí Como você deve estar lembrado no início da aula vimos que existe a formação de uma forquilha durante a replicação de um DNA dupla fita Na verdade duas forquilhas porque a replicação é bidirecional Em cada forquilha pelo menos 20 polipeptídeos participam do processo Pois é preciso replicar as duas fitas não é mesmo Parece difícil de imaginar e muito pior de compreender como isso pode ser tão bem coordenado dentro da célula A complexidade estrutural da holoenzima DNA polimerase III está ilustrada na Figura 105 C E D E R J 28 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 29 AULA 10 MÓDULO 2 Figura 105 Estrutura da DNA polimerase III de Escherichia coli Os números apresentam suas massas em daltons α alfa β beta ε épsilon γ gama θ teta τ tau e δ sigma Observando a figura podemos encontrar os seguintes elementos 1 duas unidades centrais compostas pelas subunidades α alfa ε épsilon e θ teta que apresentam atividade catalítica 2 um componente dimérico τ tau que liga as duas unidades centrais catalíticas 3 dois componentes diméricos β beta cada um ligado a uma unidade central catalítica que por sua vez as mantêm ligadas ao DNA 4 um componente y gama composto pelas subunidades ψ δ e χ ligado a um componente dimérico β beta O acoplamento do complexo holoenzima DNA polimerase III se dá em diferentes etapas para que possa ligarse simultaneamente às duas fitas do DNA Para compreender o modelo você pode observar a Figura 106 e acompanhar a explicação que se segue C E D E R J 30 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 31 AULA 10 MÓDULO 2 Figura 106 O acoplamento da DNA polimerase III ocorre em estágios gerando um complexo enzimático que sintetiza DNA de ambas as fitas novas C E D E R J 30 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 31 AULA 10 MÓDULO 2 1 Um dímero β e o complexo γ reconhecem a região moldeiniciador no DNA molde formando um complexo de préiniciação Nesta reação o complexo γ cliva ATP e transfere as subunidades β para o molde O par de subunidades β forma uma garra em torno do DNA e garante a processividade ou seja garante que a região central catalítica fique presa ao DNA podendo assim sintetizálo O complexo γ é chamado carregadordisparador de garra β pois utiliza a hidrólise do ATP para dirigir a ligação da garra β ao DNA 2 A ligação ao DNA muda a conformação no sítio da subunidade β ligada ao complexo γ que como resultado apresenta forte afinidade pela região central catalítica Ocorre então a ligação e é desta forma que ocorre o contato com o DNA A região central catalítica contém subunidades α ε e θ A subunidade α tem habilidade de sintetizar DNA a subunidade ε apresenta atividade de exonuclease 3 5 verificação a subunidade θ está envolvida provavelmente no acoplamento do complexo 3 Um dímero τ se liga à região central catalítica da DNA polimerase e desempenha uma função dimerizante ligandose à região central catalítica de uma segunda DNA polimerase que por sua vez está associada a uma outra garra formada por duas subunidades β que por sua vez estará ligada à segunda fita do DNA A holoenzima DNA polimerase III é assimétrica pois contém somente um complexo γ responsável pela adição da garra β Uma explicação para essa assimetria será apresentada na próxima aula C E D E R J 32 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 33 AULA 10 MÓDULO 2 HELICASES PROTEÍNAS LIGANTES DE DNA FITA SIMPLES E TOPOISOMERASES Para que a replicação ocorra é necessário que as duas fitas da molécula parental sejam separadas durante a síntese de uma nova fita complementar Você já sabe que o DNA é uma espiral dupla Dessa forma a única maneira de abrir a estrutura é distorcendo a molécula giro por giro e posteriormente rompendo as pontes de hidrogênio Cada giro da molécula é composto de 10 pares de bases de modo que a molécula de DNA deve dar uma volta de 360o a cada 10 pares de bases para que a replicação aconteça Acompanhe o raciocínio que se segue Em Escherichia coli a velocidade de replicação é de cerca de 30000 nucleotídeos por minuto o que significa dizer que o DNA tem de ser girado 3000 vezes por minuto para facilitar o desenrolamento da molécula de DNA Esses números são surpreendentes você não acha A enzima DNA helicase separa as fitas de DNA utilizando a hidrólise de ATP como energia Uma helicase é geralmente multimérica na maioria das vezes hexamérica possuindo diferentes sítios de ligação ao DNA que permitem o seu deslocamento É provável que exista uma conformação que se liga ao DNA dupla fita e outra que se liga ao DNA simples fita A alternância entre essas duas conformações governa a abertura das fitas e requer a hidrólise de ATP A principal helicase de Escherichia coli é a DnaB Após a abertura das fitas a proteína SSB do inglês singlestrand binding que significa ligante de fita simples se liga ao DNA simples fita impedindo que a dupla fita seja novamente formada A SSB se liga como um monômero mas tipicamente de modo cooperativo ou seja a ligação de um monômero permite a ligação de um outro e depois outro até que toda a molécula de DNA fita simples esteja coberta com a SSB A ligação dessa proteína é fundamental para o início da replicação conforme veremos mais adiante Você deve estar lembrado que no início deste tópico nós mencionamos o número de giros que a molécula de DNA deve dar para que ele possa ser aberto e replicado Pois bem considerando a molécula duplahélice girando e sendo aberta pela DNA helicase a tendência do DNA que está mais à frente é de ficar superespiralado pois a estrutura vai ficando mais apertada C E D E R J 32 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 33 AULA 10 MÓDULO 2 Para entender o que acontece faça a experiência que se segue Pegue um pedaço de barbante de mais ou menos um metro de comprimento Dobre ao meio e prenda uma das extremidades com um clipe de papel Coloque um peso sobre essa parte apoiado em uma superfície firme de modo que ela fique presa Agora comece a girar o seu barbante dobrado em um único sentido até sentir que ele vai começar a se enrolar Pare nesse ponto e prenda a extremidade com um outro clipe de papel Repita o mesmo procedimento realizado com a outra ponta e coloque um peso impedindo que haja movimento Muito bem coloque um dedo em cada lado na parte central do seu barbante dobrado e enrolado e comece a puxar um pedaço do barbante para um lado e o outro para o lado oposto continue puxando e observe o que acontece O que aconteceu Se você conseguiu seguir as instruções poderá verificar que a partir do ponto de abertura dos dois barbantes a região enrolada que está mais adiante ficou bem mais apertada Se você continuar puxando vai perceber que em um determinado ponto você não consegue mais separar os dois barbantes Pois é exatamente isso que acontece com o DNA no momento da replicação Conforme as fitas vão se abrindo e sendo copiadas o DNA que está mais à frente na forquilha de replicação vai ficando cada vez mais compactado até chegar num ponto em que vai ocorrer a formação de superespiras e será impossível continuar rompendo as pontes de hidrogênio É um mecanismo semelhante ao que você já estudou nas aulas sobre estrutura de cromossomos em procariotos e eucariotos Então é necessário um mecanismo que coordene esse processo de modo que a replicação possa ocorrer ao longo de toda molécula de DNA Nessa etapa entram em ação enzimas conhecidas como topoisomerases as mesmas enzimas que participam do processo de superespiralamento do DNA O mecanismo de ação dessas enzimas já foi descrito anteriormente com detalhes Se você não se lembra pegue as Aulas 7 e 8 do Módulo 1 Durante a replicação do DNA somente um pequeno segmento de DNA em frente da forquilha de replicação precisa girar justamente o segmento que está acima da quebra promovida pela topoisomerase Na replicação de Escherichia coli a enzima envolvida é a DNA girase que é um tipo de topoisomerase II cujo mecanismo também já foi descrito C E D E R J 34 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 35 AULA 10 MÓDULO 2 É importante lembrar que a estrutura do genoma da bactéria é circular e se encontra superespiralado negativamente Esse superespiralamento é promovido pela DNA girase com energia proveniente de ATP A atividade da DNA girase apresenta uma solução para o problema da abertura das fitas do DNA Em vez de criar superespiras positivas na frente da forquilha de replicação através da abertura das fitas a replicação pode produzir DNA relaxado na frente da forquilha através da abertura de DNA que apresente superespiras negativas Uma vez reduzida a tensão das hélices durante a separação ou seja a separação das fitas é favorecida energeticamente o superespiralamento negativo atrás da forquilha pode direcionar o processo de separação das fitas Se isso ocorrer esse mecanismo explica a principal função da DNA girase durante o processo de replicação do DNA na bactéria Existem ainda outras proteínas envolvidas no processo de replicação mas elas serão descritas na próxima aula quando iremos estudar o mecanismo como um todo Na aula de hoje você teve a oportunidade de estudar as estruturas que são observadas no DNA durante o processo de replicação Vimos que os DNAs pequenos como vírus bactérias plasmídios apresentam um único replicon ou seja uma única unidade onde a replicação se inicia enquanto em genomas de eucariotos existem muitos replicons Nesses replicons ocorre a formação de duas forquilhas que garantem a replicação bidirecional do DNA Você também aprendeu sobre a DNA polimerase que é a enzima que sintetiza DNA Vimos que existem vários tipos de polimerases e que cada uma delas desempenha uma função particular A enzima responsável pela replicação replicase é composta por muitas subunidades cujo acoplamento permite a síntese de ambas as fitas de DNA ao mesmo tempo Por último você viu que outras proteínas participam do processo como a DNA helicase que rompe as pontes de hidrogênio e a SSB que se liga à DNA simples fita Também voltamos a falar sobre as topoisomerases que são responsáveis pelo relaxamento do DNA durante a replicação R E S U M O C E D E R J 34 Biologia Molecular O complexo maquinário de replicação e suas enzimas C E D E R J 35 AULA 10 MÓDULO 2 EXERCÍCIOS 1 Quais são as estruturas observadas na molécula de DNA durante o processo de replicação 2 Quais são as diferentes atividades encontradas na DNA polimerase I de Escherichia coli 3 Quais os componentes encontrados na holoenzima DNA polimerase III Explique a função de cada um deles 4 Qual a importância da DNA helicase e da SSB no mecanismo de replicação do DNA 5 Qual o papel da topoisomerase no mecanismo de replicação do DNA AUTOAVALIAÇÃO As respostas para os exercícios podem ser encontradas no texto É importante que você associe as informações desta aula com as adquiridas na aula anterior O nosso propósito é fornecer os elementos que fazem parte do maquinário e que você vá juntando as partes para compreender o mecanismo como um todo Na próxima aula vamos juntar as peças do quebracabeça por isso estude com carinho os conteúdos Até a próxima aula Ordering Information Catalog Number Description TKS10 MANIFOLD TITUBE 10 PORT 18 TUBING TKS20 MANIFOLD TITUBE 20 PORT 18 TUBING TKS50 MANIFOLD TITUBE 50 PORT 18 TUBING SW100 SWAGEL0K BASE 1000 SERIES SW200 SWAGELOK BASE 2000 SERIES SW300 SWAGELOK BASE 3000 SERIES SW400 SWAGELOK BASE 4000 SERIES SW1000 SWAgELOK BASE 10000 SERIES TUBE6 STL TUBE 316 X 6 STL TUBE12 STL TUBE 316 X 12 TUBE18 STL TUBE 316 X 18 TUBE24 STL TUBE 316 X 24 TUBE36 STL TUBE 316 X 36 OP 200 PACKAGE OF 200 OPERATION FILMS FOR XRAY OP 500 PACKAGE OF 500 OPERATION FILMS FOR XRAY Optional Accessories Universal Manifold Plate Set UMP1 One Plate for use with 20 Port 516 Type fittings UMP2 One Plate for use with 50 Port 516 Type fittings UMP3 One Plate for use with 50 Port Bulkhead 14 fittings NOTES Manifolds are manufactured to your specifications Manifolds can be dual channel if needed Manifolds have a maximum working pressure of 5000 PSI 345 Bars Tubing and Stop Cocks can be changed for alternate sizes Consult factory for specifications and details O funcionamento do maquinário de replicação Ao final desta aula você deverá ser capaz de Demonstrar a você como ocorre a replicação do DNA juntando os diferentes componentes descritos na aula anterior Compreender a regulação do maquinário em procariotos Discutir o que se conhece sobre o mecanismo de replicação em eucariotos objetivos 11 A U L A Prérequisitos Conteúdos abordados na aula anterior C E D E R J 38 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 39 AULA 11 MÓDULO 2 A estrutura antiparalela do DNA dupla hélice surge como um empecilho para o mecanismo de replicação Conforme visto nas aulas anteriores a forquilha de replicação é formada e a replicação ocorre bidirecionalmente e simultaneamente nas duas fitas a partir da origem de replicação Eis que surge o dilema A enzima DNA polimerase só realiza a adição de um novo nucleotídeo a partir de um molde de DNA na orientação 5 3 No momento em que as pontes de hidrogênio são rompidas ocorre a formação de duas fitas simples uma delas 5 3 e a outra 3 5 de modo que uma delas pode ser replicada Mas o que acontece com a outra fita Durante muitos anos os pesquisadores tentaram descobrir DNA polimerases que fizessem a síntese na orientação 3 5 No entanto isso não foi possível o que levou à conclusão de que o mecanismo de replicação era ainda mais complexo do que já se imaginava anteriormente O paradoxo foi resolvido com a demonstração de que uma das fitas do DNA é sintetizada de forma contínua enquanto a outra é sintetizada de forma descontínua A replicação descontínua pôde ser monitorada através de marcação com precursores de DNA radioativos Uma exposição por um curto intervalo de tempo demonstrou a formação de fragmentos correspondendo a um tamanho em torno de 1000 a 2000 pares de bases Após períodos mais longos observouse a formação de segmentos maiores de DNA Esses fragmentos receberam o nome de Okazaki Fragmentos de Okazaki em homenagem aos pesquisadores Reiji e Tuneko Okazaki que os descobriram A fita de DNA que é sintetizada de forma contínua recebe o nome de fita líder enquanto a fita que é sintetizada de forma descontínua recebe o nome de fita tardia Observe a Figura 111 e acompanhe a explicação INTRODUÇÃO C E D E R J 38 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 39 AULA 11 MÓDULO 2 Na fita líder a síntese de DNA pode proceder continuamente na orientação 5 3 conforme a dupla hélice parental vai se abrindo Na fita tardia uma parte de DNA fita simples deve estar exposta Um segmento é sintetizado na direção reversa relativo à forquilha de replicação Uma série desses fragmentos será sintetizada cada um deles na orientação 5 3 Então eles deverão ser ligados para criar uma fita tardia completa Uma outra observação importante é que a fita líder será a fita 3 5 pois ela permitirá que a fita complementar seja sintetizada na orientação 5 3 O esquema ilustrado na Figura 112 mostra exatamente o que ocorre a partir da origem de replicação com a formação das duas forquilhas na replicação bidirecional Figura 111 A fita líder é sintetizada continuamente enquanto a fita tardia é sintetizada descontinuamente Figura 112 Esquema ilustrando a síntese em duas forquilhas de replicação formadas a partir de uma única ori gem Observe que em ambas as fitas a partir da origem em uma direção a replicação é contínua e na direção oposta a replicação é descontínua C E D E R J 40 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 41 AULA 11 MÓDULO 2 Uma outra peculiaridade da DNA polimerase cria um novo desafio para o processo de replicação Você deve estar lembrado que a enzima só é capaz de sintetizar DNA na presença de um iniciador ou seja um nucleotídeo anterior que ofereça um grupamento OH livre para que possa haver a ligação fosfodiéster com o próximo nucleotídeo Ora ao romper a duplahélice nenhuma das duas fitas possui um iniciador Assim é necessário que ocorra a síntese de um iniciador para que a DNA polimerase possa atuar O processo é mediado por uma primase ou iniciase primase vem do inglês para síntese de primer que significa iniciador Essa enzima é uma RNA polimerase especial produto de um gene chamado dnaG Essa enzima é somente utilizada para sintetizar pequenos iniciadores de RNA durante o processo de replicação A primase dnaG se associa ao complexo de replicação e sintetiza um iniciador de 11 a 12 bases Em alguns casos o iniciador é fornecido por uma proteína como em alguns vírus que veremos na próxima aula Observe a Figura 113 e acompanhe a explicação que se segue Figura 113 A síntese dos fragmentos de Okazaki requer um iniciador a síntese do DNA a remoção do RNA o preenchimento da região após a remoção do RNA e a ligação dos fragmentos C E D E R J 40 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 41 AULA 11 MÓDULO 2 Na fita líder a primase atua uma única vez sintetiza o iniciador e a síntese prossegue normalmente Já na fita tardia a primase atua em cada um dos fragmentos de Okazaki que serão sintetizados A síntese da fita tardia deve envolver a síntese do iniciador de RNA a síntese do fragmento propriamente dito pela ação da DNA polimerase a remoção dos iniciadores de RNA e a substituição por uma seqüência de DNA a ligação covalente dos fragmentos de Okazaki adjacentes Como você pode observar o esquema sugere que a síntese de um fragmento de Okazaki termina justamente antes do ponto onde se encontra o iniciador de RNA do fragmento anterior A atividade de exonuclease 5 3 da pol I remove o iniciador de RNA enquanto simultaneamente preenche o espaço sintetizando DNA utilizando o hidroxila 3 livre deixado pelo fragmento de Okazaki anterior Em mamíferos a DNA polimerase não apresenta a atividade de exonuclease Então a remoção e o preenchimento são feitos em duas etapas independentes Primeiro a enzima RNAse H1 que apresenta especificidade por híbridos DNARNA promove uma clivagem endonucleásica depois uma exonuclease 5 3 chamada FEN1 remove o iniciador de RNA Uma vez que o RNA tenha sido removido e substituído os fragmentos de Okazaki adjacentes são unidos O grupamento 3 hidroxila de um fragmento é ligado ao grupamento fosfato do outro fragmento através de uma enzima chamada DNA LIGASE As ligases estão presentes em procariotos e eucariotos Você pode observar na ilustração da Figura 114 a reação catalisada pela DNA ligase DNA LIGASE Essa enzima é muito utilizada em laboratórios de Biologia Molecular para unir fragmentos de DNA de organismos diferentes dando origem a moléculas híbridas chamadas DNA recombinante C E D E R J 42 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 43 AULA 11 MÓDULO 2 Figura 114 A DNA ligase une os fragmentos de Okazaki selando cortes existentes entre os nucleotídeos utilizando um complexo intermediário enzimaAMP As ligases de Escherichia coli e do fago T4 fazem a ligação em duas etapas envolvendo um complexo enzimaAMP A enzima de Escherichia coli utiliza NAD nicotinamida adenina dinucleotídeo como cofator enquanto a enzima do fago T4 usa o ATP O AMP do complexo se liga ao fosfato 5 e então uma ligação fosfodiéster é formada com a hidroxila 3 liberando a enzima e o AMP Você deve ter notado que as informações que discutimos até o momento conseguiram esclarecer alguns pontos obscuros com relação à síntese do DNA principalmente aqueles provocados pelas exigências da enzima responsável pela síntese do DNA que é a DNA polimerase C E D E R J 42 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 43 AULA 11 MÓDULO 2 Você já deve ter notado também que existe um grande número de proteínas que participam no processo e que cada uma delas tem uma funçãochave para que o mecanismo cumpra o seu papel de copiar o DNA com fidelidade mantendo assim as características de um determinado genoma Todas essas informações foram necessárias para que nós pudéssemos trabalhar o mecanismo como um todo Agora nós vamos encaixar as peças e você verá como esse mecanismo é bonito embora seja extremamente complexo Nos próximos tópicos você verá como ocorre o início o alongamento e o término da replicação Usaremos o modelo estabelecido para o cromossomo circular de Escherichia coli pois conforme já falamos até o momento é o mecanismo melhor compreendido Posteriormente falaremos sobre a replicação em eucariotos INÍCIO DA REPLICAÇÃO Conforme vimos na aula anterior o cromossomo de Escherichia coli constitui um único replicon e conseqüentemente apresenta somente uma origem de replicação A origem de replicação em Escherichia coli é conhecida como oriC A oriC está representada na Figura 115 Figura 115 Origem de replicação oriC de Escherichia coli O esquema representa o segmento de 245 pares de bases que contém 3 repetições de 13 pares de bases 13 pb ricas em A T e 4 repetições de 9 pares de bases 9 pb As setas indicam a orientação das repetições A origem de replicação oriC corresponde a um segmento de DNA contendo 245 pares de bases Algumas seqüências conservadas foram caracterizadas na origem de replicação 4 repetições de 9 pares de bases indicadas pelas setas na região correspondente a essas repetições e 3 repetições de 13 pares de bases também indicadas por setas na figura C E D E R J 44 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 45 AULA 11 MÓDULO 2 A orientação o espaçamento e a seqüência das repetições de 9 pb são críticas para o funcionamento da oriC As repetições de 13 pb são ricas em A T sendo este fato também crucial para a função da oriC Observe o esquema da Figura 116 e acompanhe a explicação sobre os eventos que ocorrem na origem de replicação Figura 116 A ilustração apre senta os principais eventos que ocorrem na origem de replicação O primeiro passo é a ligação da proteína DnaA nas repetições de 9 pb presentes na oriC Posteriormente cerca de 20 a 40 monômeros de proteína DnaA são ligados cooperativamente A oriC se enrola sobre esse complexo de proteína DnaA Neste ponto a proteína DnaA irá atuar sobre as repetições de 13 pb situadas no lado esquerdo da oriC rompendo a dupla fita do DNA em cada uma dessas repetições formando um complexo aberto O fato de essas regiões serem ricas em A T facilita a abertura pois você deve estar lembrado que A se liga a T através de duas pontes de hidrogênio Esse processo requer ATP e a proteína bacteriana HU nós falamos dessa proteína na aula sobre estrutura dos cromossomos de procariotos Aula 6 Módulo 1 C E D E R J 44 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 45 AULA 11 MÓDULO 2 Duas outras proteínas chamadas DnaB e DnaC entram em ação formando um complexo no qual seis monômeros de DnaC irão se ligar a um hexâmero de DnaB O complexo DnaBDnaC transfere um hexâmero de DnaB numa etapa dependente de ATP para cada uma das fitas do DNA formando duas forquilhas de replicação A proteína DnaB possui atividade de helicase Você deve estar lembrado que a helicase é uma enzima que rompe as pontes de hidrogênio do DNA duplahélice Após este evento a DnaB desloca as moléculas de proteína DnaA do DNA e inicia o processo de abertura das fitas ALONGAMENTO DA REPLICAÇÃO Observe agora a Figura 117 e acompanhe a explicação Após a abertura das fitas pela DnaB na origem de replicação muitas moléculas da proteína SSB se ligam mantendo as fitas separadas Na frente de cada uma das forquilhas a DNA girase topoisomerase II relaxa a tensão através da eliminação de superespiras negativas permitindo assim a abertura das fitas Se você estiver em dúvida pode rever a parte final da Aula 10 em que falamos sobre o papel da girase a b c d e Figura 117 a Após a abertura das fitas pela DnaB a SSB se liga à fita simples de DNA b A DnaG primase se liga à DnaB e sintetiza o iniciador de RNA c d O complexo γ subunidade χ desloca a primase e carrega a garra β no DNA e O núcleo catalítico inicia a síntese da fita líder C E D E R J 46 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 47 AULA 11 MÓDULO 2 O alongamento inclui duas operações diferentes conforme visto anteriormente a síntese da fita líder contínua e a síntese da fita tardia descontínua Vejamos como isso ocorre As duas forquilhas foram formadas e a helicase DnaB permanece ligada às duas fitas cada uma iniciando uma forquilha A DnaB promove a abertura na orientação 5 3 enquanto a proteína SSB recobre o DNA fita simples A DnaG que é uma proteína com atividade de primase será atraída para a forquilha através de uma interação proteínaproteína com a DnaB A helicase DnaB se desloca no sentido 5 3 A DnaG irá sintetizar uma molécula pequena de RNA 10 nucleotídeos que servirá de iniciador para a síntese do DNA A subunidade χ do complexo γ desloca a primase A primase faz contato com a SSB da mesma forma que o complexo χ Então de modo competitivo o complexo χ desloca a primase O complexo γ também conhecido como carregadordisparador de garra β da holoenzima DNA polimerase III coloca um dímero β em torno do iniciador de RNA formando a garra Esse processo é dependente de ATP O complexo γ também precisa reconhecer a extremidade 3 livre do iniciador Após o acoplamento da garra β o núcleo catalítico da DNA polimerase se liga e é posicionado na extremidade 3 do RNA de modo que a síntese pode ser iniciada Tudo estaria resolvido se não houvesse a necessidade de sintetizar a fita complementar de forma descontínua e ao mesmo tempo Então vejamos como isso acontece Nesse ponto a subunidade τ dimérica da holoenzima DNA polimerase III se liga ao centro catalítico que está ligado na fita que será replicada de forma contínua e permite a ligação de um outro centro catalítico Conforme o DNA é aberto pela helicase e replicado pelo centro catalítico da DNA polimerase III na fita contínua a primase interage com a helicase e sintetiza um iniciador de RNA na fita descontínua Observe a Figura 118 e acompanhe a explicação que se segue C E D E R J 46 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 47 AULA 11 MÓDULO 2 Figura 118 Síntese dos fragmentos de Okazaki na fita tardia A subunidade χ do complexo γ desloca a primase da mesma forma efetuada na fita líder e possibilita a ligação da garra β que por sua vez irá atrair o centro catalítico que está ligado ao dímero τ permitindo assim a síntese de um fragmento de Okazaki O complexo γ é o responsável por carregar a garra β nas duas fitas mas devido à necessidade de iniciações contínuas na fita tardia o complexo fica posicionado nessa fita Nesse ponto ocorre uma espécie de balé enzimático no qual metade do complexo da holoenzima DNA polimerase III sintetiza a fita contínua e a outra metade se desloca para sintetizar os fragmentos de Okazaki da fita descontínua A necessidade de abertura das fitas antes do início da síntese dos fragmentos provoca um atraso na replicação e devido à presença dos dois núcleos catalíticos ligados pelo dímero tau o DNA molde da fita descontínua deve formar uma alça o que permitirá a sua replicação Quando um fragmento de Okazaki encontra outro que já foi sintetizado anteriormente a garra β se desprende do centro catalítico da DNA polimerase juntamente com o DNA sintetizado que irá se ligar a uma outra garra β inserida pelo complexo γ junto a um novo iniciador a b d c C E D E R J 48 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 49 AULA 11 MÓDULO 2 A síntese prossegue dessa forma até que toda a fita tardia tenha sido sintetizada A presença da helicase na fita que será replicada de forma descontínua garante a ligação com a primase que poderá sintetizar inúmeros iniciadores um para cada fragmento de Okazaki Quando a síntese de um fragmento de Okazaki é concluída pela colisão com o fragmento adjacente o iniciador de RNA usado pelo fragmento anterior é removido pela atividade de exonuclease 5 3 da DNA polimerase I que simultaneamente preenche o segmento com dNTPs através da atividade de polimerase Finalmente os fragmentos são unidos pela enzima DNA ligase usando NAD como cofator energético TÉRMINO DA REPLICAÇÃO A região terminal TER da replicação do DNA está localizada do lado oposto à origem de replicação no cromossomo circular de Escherichia coli A região terminal TER ilustrada na Figura 119 formada por repetições de vinte nucleotídeos funciona como uma armadilha pois a forquilha de replicação entra mas não consegue sair dessa região que chega a apresentar 450 kb 1kb 1000 pb Existem seis TER nessa região Uma proteína chamada TUS Terminus Utilization Substance do inglês substância de utilização terminal se liga ao sítio TER e essa ligação impede a passagem da helicase DnaB ou seja a abertura das fitas é interrompida e conseqüentemente a replicação A síntese da fita líder termina um nucleotídeo antes do local onde a proteína TUS está ligada Os sítios TER funcionam somente em uma direção Para cada ciclo de replicação somente um sítio de terminação é geralmente usado A forquilha de replicação que encontrar um local de terminação na orientação ativa é reprimida e espera até que outra forquilha chegue ao mesmo sítio A forquilha parada em um complexo de terminação na sua orientação ativa correta aparentemente forma uma barreira para a forquilha oposta garantindo que cada segmento do cromossomo seja replicado uma única vez Mutantes de Escherichia coli que não possuem a região TER ou possuem a proteína TUS mutada são viáveis mas segregam um grande número de células inviáveis C E D E R J 48 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 49 AULA 11 MÓDULO 2 Figura 119 Organização dos sítios de iniciação e terminação da replicação no cromossomo de E coli A replicação bidirecional é iniciada na oriC as duas forquilhas de replicação estão representadas pelas helicase DnaB Os sítios de terminação estão marcados de TerA a TerF A localização dos sítios de terminação não está na escala correta pois de fato comparados aos ponteiros de um relógio os sítios TerA TerD e TerE estão localizados entre 23 e 29 minutos os sítios TerB e TerC entre 33 e 36 minutos e o sítio TerF está localizado a 48 minutos de modo que estão espalhados em uma longa distância 1 min corresponde a aproximadamente 50000 pb O formato em T do sítio de terminação indica sua polaridade as forquilhas de replicação que encontram o lado reto topo do T são retidas No sentido horário a forquilha atravessa os sítios TerE TerD e TerA mas irá parar em TerC TerB ou TerF Uma proteína chamada TUS se liga aos sítios Ter e esta ligação pára a atividade da helicase DnaB SEGREGAÇÃO DE MOLÉCULASFILHAS DE DNA CIRCULAR Quando a síntese do cromossomo termina as moléculas resultantes encontramse na forma de círculos interligados A separação das duas moléculasfilhas também conhecida como segregação requer a ação de topoisomerases Estudos com mutantes para Topoisomerase IV parC e parD demonstraram o aparecimento de erros na segregação os cromossomos duplicados mantêmse na forma de círculos interligados O defeito na separação dos cromossomos não está associado a defeitos na replicação consistente com as descobertas de que a replicação requer a Topoisomerase II girase para relaxar a estrutura do DNA C E D E R J 50 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 51 AULA 11 MÓDULO 2 REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS Devido à complexidade do genoma dos eucariotos o estudo da replicação se torna mais difícil A maior parte das informações sobre o maquinário de replicação em eucariotos foi obtida através de estudos com o vírus SV40 simian virus 40 Este vírus que infecta células de macaco apresenta um genoma pequeno e para se replicar utiliza quase que totalmente o maquinário da célula hospedeira Assim por extensão serve como um modelo para a replicação em eucariotos De um modo geral a replicação do DNA é bastante semelhante à de procariotos com algumas proteínas diferentes mas que desempenham a mesma função Uma diferença marcante é que a replicação do DNA em eucariotos é mais lenta do que a replicação em Escherichia coli 75 nucleotídeossegundo Uma proteína codificada pelo vírus chamada antígeno T é encontrada na forma de um hexâmero duplo e se liga à origem de replicação do DNA do SV40 utilizando ATP e causa uma distorção estrutural no DNA Essa distorção provoca a abertura das fitas e o antígeno T funciona como uma DNA helicase função semelhante a DnaB de procariotos Após a formação de um complexo estável antígeno TDNA uma outra proteína chamada RPA proteína de replicação A formada por três subunidades ligase ao DNA fita simples semelhante a SSB de procariotos Essa ligação promove uma abertura maior da molécula de DNA ou seja a RPA estimula a atividade da helicase A esse complexo antígeno TRPA irá se ligar uma polimerase αprimase Essa enzima tem atividade dupla pois ela sintetiza o iniciador de RNA mas em seguida também sintetiza um segmento de DNA Uma outra proteína RFC Replication Factor C do inglês fator C de replicação se liga ao extremo 3 da fita de DNA nascente sintetizada pela αprimase e irá carregar até o molde substituindo a subunidade α duas proteínas Uma delas a PCNA Proliferation Cellular Nuclear Antigen do inglês antígeno nuclear de proliferação celular e a outra DNA polimerase δ até o molde substituindo a subunidade α A PCNA desempenha uma função semelhante à subunidade β da holoenzima DNA polimerase III de procariotos A proteína RFC apresenta uma função semelhante ao complexo γ disparadorcarregador C E D E R J 50 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 51 AULA 11 MÓDULO 2 de garra presente em procariotos O complexo processivo RFCPCNA polδ alonga a fita de DNA nascente para formar o complexo de síntese contínua na fita líder A remoção dos iniciadores é feita por duas enzimas FEN1 exonuclease 5 3 e a RNaseH1 A DNA ligase I é necessária para unir os fragmentos de Okazaki em fitas de DNA contínuas A proteína que atua para relaxar a tensão torcional durante a replicação do DNA de eucariotos é a Topoisomerase I No caso do SV40 os produtos finais da replicação são moléculas circulares interligadas e fechadas covalentemente As moléculasfilhas são separadas pela Topoisomerase IIa ou IIb A Figura 1110 ilustra a síntese do DNA enfatizando a síntese da fita tardia C E D E R J 52 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 53 AULA 11 MÓDULO 2 Figura 1110 a a helicase abre as fitas do DNA e o complexo DNA polδRFCPCNA sintetiza o DNA na fita líder Na fita tardia a DNA pol α sintetiza o iniciador de RNADNA A DNA pol α é deslocada e trocada pelo complexo RFCPCNADNA pol δ que irá sintetizar o fragmento de Okazaki b a RNase H1 degrada o iniciador de RNA deixando um ribonucleotídeo que será retirado pelo complexo FEN1RTH1 A DNA polδ sintetiza o restante do fragmento que é unido pela DNA ligase a b C E D E R J 52 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação C E D E R J 53 AULA 11 MÓDULO 2 Conforme já vimos a DNA helicase promove a abertura na forquilha de replicação e o complexo DNA polδRFCPCNA sintetiza o DNA na fita líder Na fita tardia a DNA pol α sintetiza o iniciador de RNA e alguns nucleotídeos de DNA Da mesma forma que na fita líder o complexo RFCPCNA carrega a DNA polδ para continuar a síntese do fragmento de Okazaki Antes que a DNA pol delta atinja um fragmento de Okazaki previamente sintetizado a RNase H1 promove a clivagem e remoção do iniciador de RNA mas não é capaz de retirar o último ribonucleotídeo 5 Nesse ponto um outro complexo formado pela FEN1RTH1 remove este ribonucleotídeo e a DNA polδ completa a síntese do fragmento que é posteriormente ligado pela ação da DNA ligase I A proteína FEN1 é uma RNase mas ela não é capaz de remover o RNA quando um de seus nucleotídeos encontrase na forma trifosfato e é por isso que existe a necessidade de a RNase H1 atuar primeiro Em algumas situações o complexo DNA polδRFCPCNA desloca o iniciador de RNA e dessa forma a FEN1 é capaz de clivar o iniciador sem a ajuda da RNase H1 Existe ainda uma outra DNA polimerase chamada ε encontrada em eucariotos geralmente acoplada à DNA polδ que não é utilizada para a replicação do DNA do vírus SV40 Entretanto em leveduras a DNA polε é essencial para a replicação mas sua função ainda continua desconhecida Conforme visto anteriormente os cromossomos de eucariotos apresentam múltiplas origens de replicação cada uma delas formando forquilhas bidirecionais que sintetizam o cromossomo como um todo As extremidades dos cromossomos apresentam uma estrutura chamada telômero cuja síntese será estudada na próxima aula C E D E R J 54 Biologia Molecular O funcionamento do maquinário de replicação Na aula de hoje você teve a oportunidade de estudar o mecanismo de replicação como um todo Você pôde aprender que devido à impossibilidade de a DNA polimerase sintetizar DNA na orientação 3 5 o DNA é replicado de forma contínua em uma fita e de forma descontínua na outra Todo esse processo é mediado por um complexo enzimático formado pela holoenzima DNA polimerase III e muitas outras proteínas que participam do reconhecimento da origem de replicação abertura das fitas síntese de iniciadores relaxamento da estrutura do DNA entre outras atividades Na última parte da aula você estudou sobre a replicação em eucariotos e pôde observar que o mecanismo é bem menos conhecido devido à sua complexidade mas que no geral o mecanismo é bastante semelhante ao que ocorre em procariotos R E S U M O EXERCÍCIOS 1 Por que a síntese não pode ocorrer de forma contínua nas duas fitas do DNA molde 2 Quais eventos ocorrem na origem de replicação 3 O que são os fragmentos de Okazaki 4 De que forma a síntese da fita líder é coordenada com a síntese da fita tardia 5 Qual a importância da região terminadora no cromossomo de Escherichia coli 6 Quais as principais diferenças entre a replicação de procariotos e eucariotos AUTOAVALIAÇÃO Se você recorrer ao texto não terá dificuldades para responder às questões O nosso objetivo aqui é fazer com que você sintetize o conteúdo para assimilálo melhor Na próxima aula você estudará a última parte referente ao mecanismo de replicação do DNA Nela falaremos sobre a replicação de genomas lineares e também da replicação do DNA presente em organelas Até lá e bom estudo Replicação de genomas lineares e organelas Ao terminar esta aula você deverá ser capaz de Entender o mecanismo de manutenção das extremidades de genomas lineares durante o processo de replicação Conhecer alguns mecanismos de replicação que ocorrem em bacteriófagos e organelas celulares Compreender o conteúdo de replicação apresentado nas Aulas 9 10 e 11 objetivos 12 A U L A Prérequisitos C E D E R J 56 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 57 AULA 12 MÓDULO 2 Você já teve a oportunidade de estudar nas aulas anteriores que a replicação do DNA é um maquinário bastante complexo e dependente de muitas proteínas e atividades enzimáticas Já sabemos também que a DNA polimerase só sintetiza DNA na orientação 5 3 e que é necessária a presença de um iniciador que forneça um grupamento hidroxila livre para que um novo nucleotídeo possa ser incorporado Pois bem em organismos nos quais o genoma é composto por moléculas de DNA linear a finalização da replicação fica comprometida uma vez que a remoção do iniciador de RNA do extremo 5 das fitas recémsintetizadas irá resultar em uma fita filha de DNA mais curta A cada ciclo de replicação as moléculas serão progressivamente encurtadas A Figura 121 ilustra a situação descrita Figura 121 Após a replicação de um segmento linear de DNA a retirada dos iniciadores de RNA através da atividade de uma RNAse nas extremidades resulta na formação de uma fita de DNA mais curta INTRODUÇÃO C E D E R J 56 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 57 AULA 12 MÓDULO 2 Você pode concluir que esse fenômeno seria desastroso pois a perda de pedaços do DNA a cada replicação inviabilizaria a sobrevivência das células O problema é real mas na verdade não ocorre perda nas extremidades de genomas lineares o que nos leva a pensar que diferentes organismos utilizam estratégias alternativas para acomodar a síntese das extremidades De fato existem vários mecanismos dos quais podemos citar 1 Uma proteína pode intervir de modo a tornar possível a iniciação nas extremidades Vários vírus que possuem DNA linear apresentam proteínas que se ligam covalentemente à última base da extremidade 5 Os exemplos melhor caracterizados são o DNA do adenovírus o DNA do fago Φ29 e o RNA do poliovírus 2 Em vez de possuir extremidades definidas elas podem ser variáveis como no caso dos telômeros em cromossomos eucarióticos 3 A conversão de um replicon linear em uma molécula circular ou multimérica observada nos fagos T4 e λ 4 O DNA pode assumir uma estrutura pouco comum como a formação de um grampo nas extremidades de modo que não exista extremidade livre Isso ocorre no DNA mitocondrial de Paramecium Você terá a oportunidade de estudar como ocorrem os dois primeiros mecanismos citados anteriormente O primeiro exemplo de iniciação em um extremo linear foi observado nos DNAs do adenovírus e do fagoΦ29 que replicam a partir dos dois extremos usando um mecanismo conhecido como deslocamento da fita A síntese de uma nova fita se inicia em uma extremidade deslocando a fita homóloga previamente pareada Quando a forquilha de replicação atinge o outro extremo da molécula a fita deslocada é liberada como uma fita simples livre que é então replicada de modo independente C E D E R J 58 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 59 AULA 12 MÓDULO 2 Em muitos vírus que utilizam esse mecanismo existe uma proteína ligada covalentemente às extremidades 5 No caso do adenovírus uma proteína terminal está ligada ao DNA viral através de uma ligação fosfodiéster no aminoácido serina A proteína terminal é uma proteína de 55 kDa que desempenha duas funções Ela carrega um nucleotídeo citidina que funciona como iniciador e está associada à DNA polimerase Na verdade a ligação da proteína a um nucleotídeo é feita pela DNA polimerase na presença do DNA do adenovírus O complexo da polimerase e proteína terminal carregando o nucleotídeo C iniciador se liga às extremidades do DNA do adenovírus O grupamento hidroxila livre do nucleotídeo C é usado para iniciar a reação de alongamento pela DNA polimerase na fita complementar Isso gera uma nova fita cuja extremidade 5 está covalentemente ligada ao nucleotídeo iniciador C A reação geralmente envolve o deslocamento da proteína do DNA em vez de ocorrer uma ligação de novo Figura 122 A replicação do adenovírus pode ser iniciada em qualquer uma das extremidades A esfera negra indica a proteína terminal ligada à extremidade 5 do DNA A estrutura oval cinza indica a DNA polimerase ligada na fita 3 na qual a replicação será iniciada DNA Linear Síntese do DNA inicia no extremo 5 Avanço da forquilha A fita simples é deslocada quando a forquilha atinge o extremo C E D E R J 58 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 59 AULA 12 MÓDULO 2 A extremidade 5 do DNA do adenovírus fica ligada à proteína terminal que foi utilizada na replicação anterior A proteína terminal antiga é deslocada por uma nova proteína em cada novo ciclo de replicação A proteína terminal se liga a regiões localizadas entre 9 e 18 pares de bases da extremidade do DNA A região adjacente entre posição 17 e 48 é essencial para a ligação de uma proteína do hospedeiro fator nuclear I que é também necessária à reação de iniciação O complexo de iniciação pode então ser formado entre as posições 9 e 48 numa distância fixa a partir da extremidade do DNA SÍNTESE DOS TELÔMEROS Você deve estar lembrado da Aula 8 Módulo I sobre estrutura dos cromossomos de eucariotos quando falamos sobre os telômeros que são as estruturas encontradas nas extremidades dos cromossomos Os cromossomos eucarióticos são moléculas lineares de DNA O DNA dos telômeros consiste em repetições adjacentes de seqüências simples Estas seqüências são geralmente curtas e ricas em resíduos G em uma das fitas O ciliado Tetrahymena contém repetições 5TTGGGG3 adjacentes enquanto humanos e outros mamíferos contêm repetições 5TTAGGG3 Na maioria dos organismos o número de repetições de um extremo não é fixo dando aos telômeros uma aparência heterogênea e confusa O tamanho dessas seqüências repetitivas varia de 38 pares de bases em ciliados como Oxytricha até dezenas de milhares de bases em células de mamíferos Cada organismo apresenta um tamanho médio característico O tamanho de uma repetição telomérica simples é mantido pela enzima telomerase A telomerase é uma DNA polimerase especializada que adiciona seqüências teloméricas aos extremos dos cromossomos Esta adição de novas seqüências equilibra a perda de repetições durante cada ciclo de replicação de moléculas lineares de DNA pois a DNA polimerase não pode sintetizar DNA na seqüência molde muito perto do extremo 3 de cromossomos lineares como demonstrado anteriormente A telomerase é uma enzima ribonucleoprotéica pois apresenta dois componentes essenciais uma porção protéica e uma porção ribonucléica ou seja um RNA Você pode observar o mecanismo de ação da telomerase na Figura 123 C E D E R J 60 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 61 AULA 12 MÓDULO 2 Organismo Seqüência telomérica Seqüência RNA molde Tamanho do RNA Tetrahymena Oxytricha Humano Camundongo TTGGGG TTTTGGGG TTAGGG TTAGGG CAACCCCAA CAAAACCCCAAAACC CUAACCCUAAC CCUAACCCU 160 190 450 450 Componentes de RNA em Telomerases Tabela 121 Componentes do RNA em telomerases de diferentes organismos O componente de RNA provê o molde para a síntese das repetições teloméricas nos extremos dos cromossomos A telomerase de Tetrahymena por exemplo contém um RNA de 160 nucleotídeos e apresenta 9 moldes potenciais contendo os nucleotídeos CAAACCCCAA A redundância na região molde permite o pareamento de bases do telômero crescente com o RNA e ainda mantém uma região que pode ser usada como molde A Tabela 121 apresenta a seqüência telomérica de alguns organismos bem como o tamanho do componente de RNA da telomerase e suas seqüências C E D E R J 60 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 61 AULA 12 MÓDULO 2 Figura 123 Modelo de alongamento mediado pela telomerase a A telomerase reconhece o substrato telo mérico A repetição terminal 5TTGGGG3 é pareada com a seqüência 5CAACCCCAA3 presente no RNA da telomerase b O DNA é sintetizado utilizando o RNA como molde até atingir a extremidade a síntese é mediada pelo componente protéico da telomerase c A seqüência terminal TTGGGGTTG é liberada pela translocação da telomerase A porção de RNA se pareia novamente fornecendo um novo molde d Outro ciclo de cópia do molde produz repetições 5TTGGGG3 adicionais Isso ocorre muitas vezes no processo de síntese dos telômeros A fita complementar será posteriormente sintetizada pela DNA polimerase Com as informações obtidas você já pôde perceber que os organismos desenvolveram sistemas especiais para manter a integridade da molécula de DNA e garantir que ela seja transmitida de maneira correta Nos próximos tópicos você vai conhecer alguns mecanismos alternativos de replicação do DNA Começaremos analisando um mecanismo conhecido como círculo rolante C E D E R J 62 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 63 AULA 12 MÓDULO 2 MECANISMO DO CÍRCULO ROLANTE Nesse mecanismo somente a replicação de uma das fitas é usada para gerar cópias de algumas moléculas circulares Este tipo de estrutura é chamado círculo rolante pois o ponto de crescimento rola em torno da molécula molde circular Em princípio a síntese pode continuar infinitamente A Figura 124 ilustra o mecanismo Em função do movimento a forquilha de replicação alonga a fita externa e desloca a fita pareada inicialmente O novo DNA sintetizado está ligado covalentemente ao DNA original de modo que a fita deslocada possui sua unidade genômica no extremo 5 A unidade genômica original está acompanhada de uma série de unidades genômicas que foram sintetizadas durante as voltas em torno do molde Cada volta desloca o material sintetizado no ciclo anterior Observe na Figura 125 as várias utilizações do círculo rolante A cauda pode ser clivada como um monômero ou um multímero na forma linear A forma linear multimérica pode ser mantida como fita simples ou ser convertida em fita dupla através da síntese da fita complementar que posteriormente é clivada em monômeros dupla fita que se ligam formando moléculas fita dupla circular A forma linear monomérica pode formar uma fita simples circular que posteriormente será replicada formando uma fita dupla circular C E D E R J 62 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 63 AULA 12 MÓDULO 2 Figura 124 O círculo rolante gera uma cauda de DNA fita simples que pode conter múltiplas unidades genômicas C E D E R J 64 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 65 AULA 12 MÓDULO 2 Figura 125 Os círculos rolantes podem ser usados de diferentes formas A clivagem na unidade simples completa gera monômeros que podem ser convertidos em formas dúplex ou circular A clivagem do multímero gera uma série de cópias repetidas e adjacentes que podem se duplicar e após clivagem dar origem a várias moléculas de forma circular C E D E R J 64 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 65 AULA 12 MÓDULO 2 Esse mecanismo é utilizado em ovócitos de Xenopus para ampliar regiões do DNAr região do DNA que codifica o RNA ribossomal Os genes para RNAr estão organizados em um grande número de repetições adjacentes no genoma Uma dessas repetições é convertida em um círculo rolante A cauda deslocada contendo muitas cópias da repetição é convertida em DNA fita dupla que é posteriormente clivada do círculo de modo que as extremidades podem ser ligadas Como resultado é formada uma grande molécula circular contendo as repetições do DNAr várias vezes ampliada A replicação pelo mecanismo do círculo rolante é bastante comum em bacteriófagos As unidades genômicas podem ser clivadas da cauda deslocada gerando monômeros que por sua vez podem ser empacotados em partículas virais ou usados em ciclos posteriores O círculo rolante é um mecanismo de amplificação do replicon original ou unidade genômica A Figura 126 ilustra o mecanismo de replicação do círculo rolante utilizado pelo fagoΦX174 Esse fago possui seu genoma na forma de DNA fita simples circular conhecida como fita positiva Uma fita complementar chamada fita menos é sintetizada gerando um dúplex que é então replicado pelo mecanismo do círculo rolante O círculo duplo é convertido para uma forma covalentemente fechada que se torna superespiralada Uma proteína codificada pelo genoma do fago a proteína A corta a fita do dúplex em um sítio específico que define a origem de replicação Após o corte na origem a proteína A permanece ligada ao extremo 5 enquanto o extremo 3 é alongado pela DNA polimerase A estrutura do DNA tem um papel importante na reação uma vez que o DNA só pode ser cortado quando está superespiralado C E D E R J 66 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 67 AULA 12 MÓDULO 2 Figura 126 Replicação do DNA simples fita do fago φX174 O DNA do fago fita se duplica for mando uma fita comple mentar fita Esta fita será usada como molde para a replicação do genoma fita simples As etapas estão descritas na ilustração C E D E R J 66 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 67 AULA 12 MÓDULO 2 A cadeia é alongada em torno do molde circular até atingir o ponto inicial e desloca a origem A proteína A funciona novamente Ela permanece ligada ao círculo rolante bem como ao extremo 5 deslocado estando na proximidade enquanto o ponto de crescimento volta para a origem A proteína está então disponível para reconhecer a origem e cortála ligandose agora ao extremo gerado pelo novo corte O ciclo pode ser repetido indefinidamente Após o corte a fita simples deslocada é liberada como um círculo A proteína A está envolvida na circularização onde liga um extremo 5 ao 3 no final de um ciclo e início de outro REPLICAÇÃO DE DNA DE MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS A replicação dos DNAs circulares de mitocôndrias e cloroplastos acontece de uma forma bem inusitada A replicação se inicia em uma origem específica no DNA dupla fita circular formado pelas fitas L e H Inicialmente somente uma das fitas parentais é usada como molde fita H em DNA mitocondrial de mamíferos A RNA polimerase sintetiza um iniciador cuja extremidade 3 será gerada por uma endonuclease específica que reconhece a estrutura tripla do híbrido DNARNA mais o DNA fita simples deslocado A extremidade 3 é usada para alongar o DNA pela DNA polimerase I A síntese é processada numa distância curta deslocando a fita parental original L que permanece fita simples O deslocamento da fita L resulta na formação de uma alça D A Figura 127 apresenta o mecanismo de replicação do DNA mitocondrial Uma única alça D contendo 500600 nucleotídeos é encontrada em mitocôndrias de mamíferos Em cloroplastos ocorre formação de duas alças D C E D E R J 68 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 69 AULA 12 MÓDULO 2 Figura 127 Replicação do DNA mitocondrial A alça D mantém uma abertura no DNA que apresenta origens de replicação diferentes para cada fita C E D E R J 68 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas C E D E R J 69 AULA 12 MÓDULO 2 Na aula de hoje você teve a oportunidade de entender como os diferentes organismos que possuem genomas lineares superam o problema através de vários mecanismos Você teve a oportunidade de aprender que a síntese dos telômeros dos cromossomos de eucariotos ocorre através de uma enzima chamada telomerase Na segunda parte da aula você aprendeu como ocorre a replicação do DNA das organelas e também o mecanismo do círculo rolante utilizado por muitos vírus e também por regiões do genoma que codificam os RNAs ribossomais R E S U M O Conforme o DNA vai sendo replicado o tamanho da alça D aumenta O alongamento continua até cerca de 23 da molécula circular Neste ponto a origem de replicação da fita L deslocada é exposta tendo início então a síntese da fita H Uma primase sintetiza o iniciador de RNA que será alongado pela DNA polimerase usando a fita simples deslocada como molde na direção oposta da síntese que ocorre na fita H Existe uma defasagem no tempo de síntese pois quando a síntese da fita L é concluída a síntese da fita H só ocorreu em 13 da molécula Como resultado ocorre a liberação de um DNA dupla fita circular completo e outro incompleto que permanece parcialmente fita simples até que a síntese da fita H esteja completa Finalmente as novas fitas são seladas para se tornarem covalentemente intactas A existência de alças D e círculos rolantes apresenta um princípio geral Uma origem pode ser uma seqüência de DNA que serve para iniciar a síntese de DNA de uma fita molde A abertura do dúplex necessariamente leva à replicação na outra fita No caso do DNA mitocondrial as origens para replicar a fita complementar se encontram em locais diferentes C E D E R J 70 Biologia Molecular Replicação de genomas lineares e organelas EXERCÍCIOS 1 Por que a síntese das extremidades dos genomas lineares pode ser comprometida 2 Explique o mecanismo de síntese dos telômeros 3 Por que o número de repetições encontradas nos telômeros pode variar de um cromossomo para outro dentro do mesmo organismo 4 Qual a vantagem do mecanismo do círculo rolante AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu o conteúdo com certeza não teve dificuldades para responder aos exercícios Todas as respostas podem ser encontradas no texto Experimente responder às questões utilizando esquemas adaptados das figuras apresentadas na aula Isso irá ajudálo a compreender os mecanismos com maior facilidade Nesta aula encerramos o assunto de replicação de ácidos nucléicos Nas próximas aulas você conhecerá os mecanismos de mutação reparo e recombinação do DNA Até lá e bom estudo Ao final desta aula você deverá ser capaz de Entender o que é mutação Diferenciar as mutações espontâneas das induzidas assim como as mutações somáticas das germinativas Classificar os tipos de mutação de acordo com a mudança de aminoácido introduzida Listar os principais agentes mutagênicos que causam mutações no DNA Entender como as mutações podem se estabelecer no DNA Discutir a importância das mutações em diversas áreas da ciência Descrever os principais mecanismos de reparo de DNA Para acompanhar mais facilmente esta aula é importante que você reveja alguns conceitos das aulas sobre ácidos nucléicos 3 4 e 5 e replicação 9 10 11 e 12 de nossa disciplina Mutação e reparo do DNA objetivos 13 A U L A Prérequisitos C E D E R J 72 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 73 AULA 13 MÓDULO 2 Você viu na Aula 4 que o papel do DNA como molécula da hereditariedade depende em parte de sua estabilidade O armazenamento de informações por um longo período sem alteração é importante para a célula Concorda Contudo você deve saber que as reações que alteram a estrutura do DNA podem ser fisiologicamente significantes Processos como carcinogênese e envelhecimento por exemplo podem estar intimamente ligados ao acúmulo lento de alterações irreversíveis do DNA As mutações não devem ser vistas como algo totalmente ruim Se você pensar não como um indivíduo mas sim como uma espécie com certeza concordará com o lado bom das alterações no DNA As mutações que não levam à morte ou a restrições drásticas de vida de cada indivíduo de uma população podem representar uma vantagem em determinadas condições ambientais Essas variações sutis existentes entre os integrantes de uma população muitas vezes asseguram a perpetuação e o processo evolutivo de uma espécie Também é importante que você saiba que mutação e recombinação assunto da Aula 15 constituem as duas principais causas da variabilidade existente entre os indivíduos que integram uma população Outro mecanismo associado a esta variabilidade envolve os elementos genéticos de transposição que serão discutidos nas Aulas 18 e 19 Em uma célula que geralmente tem apenas uma ou duas cópias de DNA genômico as proteínas e os RNAs defeituosos podem ser rapidamente substituídos usando a informação codificada no DNA Entretanto as moléculas de DNA são insubstituíveis e apesar de se reconhecer a contribuição inestimável de algumas mutações manter a integridade da informação contida no DNA é uma obrigatoriedade celular o que é assegurado por um sofisticado conjunto de sistemas de reparo de DNA Os danos no DNA podem ser causados por uma variedade de processos alguns espontâneos outros catalisados por agentes ambientais Você verá que a própria replicação pode ocasionar danos no conteúdo de informação do DNA Nesta aula não discutiremos o aspecto evolutivo das mutações mas sim como elas ocorrem como podem ser classificadas e sua importância em diferentes áreas como a da saúde e a biotecnológica Você também terá a oportunidade de conhecer como as células reparam as possíveis lesões que surgem no DNA de forma a minimizar a transmissão desses erros para as futuras gerações de células INTRODUÇÃO CARCINOGÊNESE Processo de desenvolvimento de câncer doença que se origina de células mutantes que escapam dos controles normais de divisão celular podendo invadir e colonizar diferentes tecidos do corpo C E D E R J 72 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 73 AULA 13 MÓDULO 2 Ao final da aula serão discutidas as conseqüências para a célula de genes defeituosos que codificam proteínas que atuam nos sistemas de reparo Como são muitas informações sugerimos que você leia esta aula com mais calma e atenção do que o habitual Não é preciso se apressar Lembrese de que você está construindo seu conhecimento o que requer paciência e perseverança Vamos começar O QUE É MUTAÇÃO Denominamos mutação qualquer alteração resultante de um processo pelo qual os organismos sofrem mudança de um estado hereditário para outro sem que envolva recombinação O que você entende por sofrer mudança de um estado hereditário para outro Vamos pensar juntos Nós sabemos que ao se duplicar é interessante que uma célula origine célulasfilhas idênticas a ela Para que as características de uma célula sejam perpetuadas é necessário que seu material genético esteja íntegro sem alterações ou seja que seu estado hereditário se apresente inalterado Caso o material genético seja modificado o que pode ocorrer até mesmo durante a replicação estudaremos isso mais adiante podemos dizer que a célula sofreu uma mudança em seu estado hereditário e que as célulasfilhas herdarão tais modificações Está claro É importante ressaltar também que um dano causado no DNA não necessariamente caracteriza uma mutação uma vez que ele pode ser reparado antes que ocorra a divisão celular Um dano não reparado no DNA uma lesão tem como conseqüência mais séria uma mudança na seqüência de bases do DNA que se replicada e transmitida para as futuras gerações de células tornase permanente Esta mudança permanente é uma mutação Podemos dizer então que uma mutação se estabelece na molécula de DNA através de um processo em duas etapas Tenha certeza de que mais adiante tudo isso ficará mais claro para você C E D E R J 74 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 75 AULA 13 MÓDULO 2 Os ácidos nucléicos especialmente o DNA que constitui o material genético das células podem vir a apresentar uma seqüência de nucleotídeos diferente da seqüência original devido à substituição de um nucleotídeo por outro ou mesmo por adição ou remoção de um ou poucos nucleotídeos da molécula de DNA Tais alterações são chamadas mutações gênicas e serão estudadas nesta aula Entretanto alterações mais grosseiras ou seja que envolvem regiões mais extensas do DNA podem ocorrer ao nível de cromossomos constituindo as aberrações cromossômicas que podem ser estruturais translocações deleções duplicações inversões ou numéricas aneuploidias e poliploidias As aberrações cromossômicas serão discutidas nas aulas de Genética A alteração da seqüência de nucleotídeos em organismos de mais alto grau de complexidade pode ocorrer em tecidos distintos caracterizando a mutação somática e a mutação germinativa Observe as diferenças na Figura 131 acompanhando o texto Figura 131 Mutação somática vs mutação germinativa As mutações podem ocorrer tanto no tecido somático como no germinativo entretanto apenas as que ocorrem no tecido germinativo são transmitidas para a geração seguinte de células C E D E R J 74 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 75 AULA 13 MÓDULO 2 A mutação somática se caracteriza por ocorrer em tecido somático em desenvolvimento podendo originar uma população denominada clone de células mutantes idênticas todas descendentes da célula na qual ocorreu a mutação Este tipo de mutação em geral não é transmitido para a prole A mutação germinativa em contrapartida ocorre em tecido associado à formação de células sexuais A mutação é transmitida para a geração seguinte caso as células sexuais mutantes participem da fertilização Vale lembrar que um indivíduo exibindo fenótipo normal pode produzir células sexuais mutantes As mutações em bactérias podem causar resistência a antibióticos De fato o uso excessivo ou a interrupção do tratamento aumenta a probabilidade de surgimento de linhagens de bactéria resistentes a diversos antibióticos o que constitui um problema de saúde pública Os vírus sofrem mutação muito rapidamente o que representa uma preocupação dos profissionais da saúde Por exemplo as vacinas contra gripe devem ser modificadas a cada ano para se adequarem às mudanças virais Outro exemplo diz respeito à elevada taxa de mutação do HIV o que dificulta ainda mais o tratamento da AIDS MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS E INDUZIDAS Como grande parte das mutações que afetam as células ocorre espontaneamente vamos começar discutindo as diferenças entre as mutações espontâneas e as induzidas As mutações são ditas espontâneas quando resultam de uma operação celular normal ou de interações casuais com o ambiente Ao contrário do que se possa imaginar um número elevado de alterações no DNA poderia surgir por exemplo durante a replicação caso não existissem os sistemas de reparo do DNA Sabemos também que as mutações são em geral eventos raros uma vez que aquelas que ocorrem naturalmente e que causam danos severos ao gene são na maioria das vezes selecionadas durante o processo evolutivo o que dificulta a obtenção de mutantes espontâneos Além disso as conseqüências observáveis de uma mutação dependem de sua localização no gene portanto nem todas as mutações resultam em um fenótipo alterado C E D E R J 76 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 77 AULA 13 MÓDULO 2 Você já deve ter ouvido falar em alguns processos industriais como por exemplo a produção de antibióticos nos quais microorganismos são utilizados Saiba que estes processos podem ser melhorados sob diversos aspectos incluindo rendimento de produto formado através da utilização de organismos mutantes Se as mutações espontâneas são eventos raros como nós já vimos o que podemos fazer caso nosso objetivo seja produzir mutantes Pois saiba que a ocorrência das mutações pode ser aumentada com o uso de certos fatores ditos agentes mutagênicos ou mutágenos o que caracteriza as mutações induzidas A maioria dos agentes mutagênicos atua sobre uma base específica do DNA ou se incorpora ao ácido nucléico Discutiremos isso mais adiante A essa altura você deve estar desesperadoa com todos os termos que estão sendo utilizados Vamos então dar uma paradinha para rever cada um deles e introduzir alguns termos novos que serão importantes para o entendimento desta aula Mutante referese ao estado genético do organismo ou da célula Um organismo ou uma célula mutante é aquele que devido a uma mutação apresenta um conjunto de características observáveis fenótipo diferente do fenótipo selvagem que é o normalmente encontrado ou o que predomina entre os indivíduos de uma população Nós já definimos genótipo e fenótipo na Aula 1 Você já viu que a informação genética armazenada no DNA é transcrita sob a forma de RNA que então é utilizado durante a síntese de proteínas determinando a seqüência de aminoácidos na cadeia polipeptídica Aula 5 Também já foi estudado que na maioria das vezes apenas parte do genoma codifica alguma molécula ou seja está relacionada à síntese de uma molécula Se juntarmos essas informações é fácil entender que se a mutação ocorre em uma região do genoma que não representa um gene provavelmente não haverá alteração do fenótipo Além disso mesmo que a mutação ocorra dentro de um gene a constatação de um fenótipo alterado dependerá do local e do tipo da mutação Vamos entender por quê Nas aulas do Módulo 3 você verá que o gene apresenta regiões nãocodificadoras ou seja regiões que não são importantes para determinar por exemplo a seqüência de aminoácidos em uma proteína Você verá também nas aulas do Módulo 4 que vários tipos de códon a trinca de nucleotídeos no RNA que determina um aminoácido na proteína lembra determinam o mesmo aminoácido na proteína Assim se a mutação ocorre na região nãocodificadora ou modifica o códon sem que seja introduzida uma mudança de aminoácido na proteína o fenótipo associado à proteína não se apresentará alterado C E D E R J 76 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 77 AULA 13 MÓDULO 2 Mutação qualquer alteração estrutural do DNA herdada sem que envolva recombinação Nem toda mutação está associada a um fenótipo mutante já vimos isso mas todo mutante apresenta uma alteração estrutural no DNA que resulta em um fenótipo mutante Evento mutacional expressa a ocorrência de uma mutação Agente mutagênico ou mutágeno um agente físico ou um reagente químico que pode interagir com o DNA causando uma mutação Mutagênese é o processo de produção de mutantes ou seja de indução de mutação Agora que você já sabe diferenciar uma mutação espontânea de uma mutação induzida é importante você saber que as mutações se originam de um processo que envolve duas etapas primeiramente um erro é introduzido em uma das fitas do DNA duplahélice e então este erro é ratificado durante a síntese de DNA Para um melhor entendimento observe a Figura 132 Neste caso específico o DNA parental teve uma base A substituída por C Caso este erro não seja corrigido ao se replicar a fita normal servirá de molde para a síntese de um DNA selvagem idêntico ao parental Em contrapartida ao servir de molde na replicação a fita contendo a base alterada C determina a síntese de uma fita contendo G em lugar de T resultando na substituição do par TA pelo par GC Figura 132 Mutação ao nível molecular Após a introdução de uma base errada a a mutação é ratificada durante a replicação do DNA b C E D E R J 78 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 79 AULA 13 MÓDULO 2 COMO É FEITA A SELEÇÃO DE MUTANTES Antes de iniciarmos o estudo sobre seleção de mutantes é importante que você saiba que tipo de fenótipo mutante está sendo analisado Isto se faz necessário porque as conseqüências fenotípicas de uma mutação podem ser sutis necessitando de metodologias refinadas para se detectar o mutante ou podem ser graves produzindo defeitos morfológicos severos ou até mesmo a morte Os fenótipos mutantes podem ser separados de acordo com o tipo de mutação aos quais estão associados A seguir estão listados alguns tipos de mutação que originam fenótipos mutantes distintos Mutações morfológicas aquelas que levam a alterações morfológicas tais como as modificações na forma na cor ou no tamanho de uma célula ou de um organismo Mutações bioquímicas aquelas que resultam em perda ou alteração de alguma função bioquímica como por exemplo uma via metabólica defeituosa devido a uma ou mais enzimas mutadas e por isso não observáveis podendo ser identificadas apenas por análise bioquímica Mutações condicionais aquelas nas quais os fenótipos só se manifestam sob determinadas condições como por exemplo no caso dos mutantes sensíveis à temperatura Mutações resistentes aquelas que conferem resistência da célula ou do organismo a certos tipos de drogas incluindo os antibióticos Mutações regulatórias aquelas nas quais os fenótipos são detectados pela incapacidade de controle de expressão de um ou vários genes Mutações letais aquelas que resultam em morte da célula ou do organismo Agora que você já está familiarizado com alguns fenótipos mutantes vamos estudar como os mutantes espontâneos ou induzidos podem ser selecionados de acordo com suas características C E D E R J 78 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 79 AULA 13 MÓDULO 2 Vamos tomar como exemplo a seleção dos mutantes de bactéria resistentes a um antibiótico Nesse caso empregase meio de cultura adicionado de antibiótico permitindo assim o crescimento apenas das células mutantes Este método é bem simples não é Para a seleção de mutantes de bactéria incapazes de utilizar lactose podese utilizar um meio de cultura conhecido como EMB ágar contendo todos os aminoácidos lactose e dois CORANTES SENSÍVEIS AO PH eosina e azul de metileno Vamos entender o que ocorre As células LAC consomem lactose por um metabolismo oxidativo havendo liberação de íon H Portanto ocorre diminuição do pH do meio ao redor das células o que faz com que os corantes que permeiam as colônias apresentem coloração vermelha Ao contrário as células LAC consomem glicina e liberam NH3 amônia que causa um aumento de pH ao redor destas células Assim os corantes perdem a cor gerando colônias brancas BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES Existem duas classes principais de mutações gênicas substituição de bases em que ocorre substituição de um par de bases por outro inserção ou deleção de bases em que um ou mais pares de nucleotídeos é inserido ou deletado O grupo de substituições de bases por sua vez subdividese em a transição quando ocorre substituição de bases de mesmo tipo ou seja uma pirimidina por outra ou uma purina por outra par AT pelo par GC e viceversa ou o par TA pelo par CG e viceversa b transversão quando ocorre substituição de bases de tipos diferentes ou seja uma purina por uma pirimidina ou uma pirimidina por uma purina par AT pelos pares TA ou CG e viceversa ou par GC pelos pares TA ou CG e viceversa CORANTES SENSÍVEIS AO PH Estes compostos apresentam coloração distinta de acordo com seu estado de ionização São também conhecidos como indicadores de pH LAC Referese à bactéria selvagem capaz de utilizar a lactose como fonte de carbono LAC Referese à bactéria mutante que por não ser capaz de utilizar a lactose utiliza o aminoácido glicina como fonte de carbono C E D E R J 80 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 81 AULA 13 MÓDULO 2 COMO AS MUTAÇÕES GÊNICAS AFETAM AS PROTEÍNAS Em aulas anteriores já foi discutida superficialmente a relação entre uma seqüência de bases no DNA e a seqüência de aminoácidos em uma proteína Este tema será abordado mais detalhadamente nas aulas do Módulo 4 No entanto para o entendimento das conseqüências de uma mutação é fundamental que você saiba que as trincas adjacentes de nucleotídeos chamadas códons determinam a seqüência de aminoácidos em uma proteína e que qualquer alteração nestas trincas pode resultar em mudança dos aminoácidos que constituem uma cadeia polipeptídica Com base na mudança causada na proteína as mutações podem ser de diferentes tipos Leia a descrição deles acompanhando a figura Na Figura 133a você encontra três possíveis substituições de bases que podem ocorrer em um gene capazes de resultar em mutações silenciosa missense e nonsense Já na Figura 133b é possível observar a diferença resultante de inserção e deleção de bases Mutação silenciosa não causa mudança de aminoácido uma vez que mais de uma trinca pode codificar um mesmo aminoácido Exemplo substituição do códon UAC Tyr UAU Tyr Os dois códons especificam o aminoácido tirosina representado dentro dos parênteses pelo símbolo de três letras Mutação missense resulta em mudança de aminoácido Exemplo substituição do códon UAC Tyr UUC Phe Os dois aminoácidos têm mesma característica química são aminoácidos com grupamentos aromáticos apolares ou fracamente polares Muitas vezes é chamada mutação neutra Substituição do códon UAC Tyr GAC Asp Os dois aminoácidos têm características químicas diferentes Tyr é fracamente polar e Asp é polar carregado negativamente Por vezes é denominada mutação de sentido trocado Mutação nonsense mutação sem sentido determina uma terminação prematura da tradução resultando em uma proteína menor C E D E R J 80 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 81 AULA 13 MÓDULO 2 Exemplo substituição do códon UAC Tyr UAG Stop O códon que especifica Tyr é substituído por um códon que determina o término da tradução gerando assim uma proteína menor incompleta Mutação frameshift mutação por mudança de quadro de leitura a adição ou deleção de pares de bases não múltiplos de três dentro da região codificadora resulta em mudança de todos os códons a partir do ponto onde ocorreu a alteração Figura 133 Tipos de mutação a A partir de três bases constituintes de um gene é possível gerar algumas seqüências mutadas resultantes de substituições de cada uma das bases Neste exemplo tais alterações origi naram mutações silenciosa missense e nonsense associadas a proteínas normal defeituosa e incompleta respectivamente b Inserção ou deleção de bases envolvendo um número não múltiplo de três resulta em mudança de quadro de leitura frameshift As conseqüências de uma mutação frameshift podem ser as mais diversas incluindo proteínas defeituosas ou incompletas C E D E R J 82 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 83 AULA 13 MÓDULO 2 COMO OCORREM AS MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS As mutações espontâneas ocorrem por erros de replicação do DNA ou por lesões espontâneas Erros de replicação do DNA Os erros de replicação normalmente ocorrem devido ao tautomerismo de bases à incorporação de bases erradas e à replicação incorreta de seqüências repetitivas Vamos entender porque o tautomerismo das bases pode promover uma mutação Aliás antes vamos entender o que é tautomerismo Entendese por estado tautomérico a variação da posição de um próton H em uma molécula Em meio aquoso as purinas e pirimidinas possuem diferentes estados tautoméricos sendo que um deles predomina Observe na Figura 134 que as bases nitrogenadas adenina e citosina podem se encontrar sob as forma amino NH2 estado tautomérico mais comum e imino NH a forma transiente Com relação à guanina e à timina existem as formas ceto CO o estado normal e enol COH a forma transiente Repare também nas Figuras 135b e 135c os possíveis pares de bases formados pelos estados tautoméricos transientes A forma imino de A pareia com C e a forma imino de C pareia com A Já a forma enol de G pareia com T e a enol de T pareia com G Um exemplo importante da mutação causada por substituição de bases é a anemia falciforme doença caracterizada por hemólise quebra de hemácias acentuada devido à presença de hemoglobina mutante conhecida por hemoglobina S HbS no interior das células vermelhas do sangue Esta doença está associada à substituição de adenina por timina o que resulta em troca de ácido glutâmico por valina na hemoglobina C E D E R J 82 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 83 AULA 13 MÓDULO 2 a b c d Figura 134 Estados tautoméricos das bases Adenina a e citosina b apresentamse sob as formas amino estado mais comum e imino estado transiente Guanina c e timina d apresentamse sob as formas ceto estado mais comum e enol estado transiente C E D E R J 84 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 85 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 135 Possíveis pares de bases contendo uma das bases em seu estado tautomérico transiente Pares de bases WatsonCrick a e pares de bases formados pelas formas transientes de purinas b adenina e guanina e de pirimidinas c citosina e timina Agora chegou a hora de você entender porque algumas formas tautoméricas podem resultar em alteração do pareamento de nucleotídeos Vamos tomar como exemplo o par de bases GC em uma molécula de DNA durante a replicação Para facilitar leia o texto acompanhando a Figura 136 Durante a separação das fitas a forma normal de G poderia originar o tautômero transiente G o que resultaria na formação do par de bases GT em lugar de GC No próximo ciclo de replicação considerando a molécula de DNA contendo o par de bases GT muito Será que você se lembra das fórmulas estruturais das bases nitrogenadas Você sabe quais são os grupamentos envolvidos no pareamento das bases Não se esqueça de retornar às aulas anteriores sempre que sentir necessidade Se for necessário não hesite em retornar às Aulas 3 e 4 a b c C E D E R J 84 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 85 AULA 13 MÓDULO 2 provavelmente o tautômero G retornaria à forma amino e parearia normalmente com C Entretanto a outra fita de DNA contendo a base T serviria de molde para a síntese de uma molécula contendo então o par de bases AT Esta mudança do par original GC para o par AT caracterizaria uma mutação Portanto podemos concluir que tautômeros transientes permitem pareamentos nãopadrões de bases que se encaixam na duplahélice de DNA causando eventuais mutações nos ciclos seguintes de replicação Figura 136 Erro de replicação devido ao tautomerismo das bases a DNA parental a ser replicado b No primeiro ciclo de replicação o tautômero transiente G pareia com T em lugar de C originando o par GT c Durante o segundo ciclo de replicação a forma imino transiente é convertida para a forma amino regenerado o estado normal G d A fita de DNA contendo G gera uma molécula com o par de bases GC enquanto a outra fita contendo T gera o par de bases AT ratificando a mutação de GC para AT Durante a replicação algumas bases são erroneamente incorporadas Entretanto as próprias polimerases por apresentarem a função de edição encarregamse de retirar as bases erradas permitindo assim a incorporação da base correta Reveja as aulas sobre replicação Caso a função editora não seja desempenhada adequadamente a base errada passa a constituir a molécula de DNA e no segundo ciclo de replicação a mutação é então ratificada Para clarear o assunto veja a Figura 137 a b c d C E D E R J 86 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 87 AULA 13 MÓDULO 2 a b c d Outra possibilidade de erro se origina da replicação incorreta de SEQÜÊNCIAS REPETITIVAS OU SEQÜÊNCIAS DE REPETIÇÃO encontradas no genoma dos organismos Observe na Figura 138 que devido a um fenômeno conhecido como derrapagem da DNA polimerase é possível adicionar ou deletar uma ou mais bases Na Figura 138a a seqüência repetitiva AAAAA propicia o desemparelhamento da base T antes mesmo do término da síntese da nova fita Como resultado temos uma fita com seis em lugar de cinco bases do tipo T Caso este erro não seja corrigido em um segundo ciclo de replicação a mutação por adição de base será ratificada Ao contrário na Figura 138b é possível observar o que ocorre durante a replicação de uma seqüência repetitiva de CT Nesse exemplo a fita molde não é completamente utilizada o que resulta em Figura 137 Erro de replicação devido à incorporação de bases erradas No primeiro ciclo de replicação a uma base G é pareada erroneamente com uma base A e este erro não é corrigido o que resulta em uma molécula de DNA contendo o par de bases AG b Em um segundo ciclo de replicação c a fita contendo a base A irá parear cor retamente com a base T gerando o DNA selvagem No entanto a fita contendo a base G ao parear corretamente com a base C gera um DNA mutado d ratificando a mutação AT para CG SEQÜÊNCIA REPETITIVA OU SEQÜÊNCIA DE REPETIÇÃO As seqüências de repetição como o nome mesmo diz correspondem a unidades básicas de repetição que se encontram em múltiplas cópias em série no genoma dos organismos Estas seqüências são mais comumente do tipo mono di tri ou tetranucleotídeos ou seja de um dois três ou quatro nucleotídeos C E D E R J 86 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 87 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 138 Replicação incorreta de seqüências repetitivas Replicação incorreta de seqüências repetitivas resultando em adição a e deleção b de bases uma molécula com menos uma unidade de repetição CT Novamente se este erro não for reparado no ciclo seguinte de replicação será ratificada a mutação por deleção de duas bases Lesões espontâneas Além dos erros de replicação do DNA lesões espontâneas resultantes de depurinação desaminação e danos oxidativos também podem ocorrer Depurinação A depurinação consiste em perda de uma purina devido à quebra da ligação entre a base e a desoxirribose gerando sítios apurínicos conhecidos como sítios AP Esta ausência de base na fita molde durante a replicação resulta em incorporação de qualquer uma das quatro bases o que pode originar uma mutação que se ratificará no segundo ciclo de replicação caso o erro não seja reparado Observe na Figura 139a a perda da guanina e a conseqüente geração de um sítio AP Já na Figura 139b você encontra um esquema de como a mutação pode se estabelecer no DNA a partir de sítio apurínico A incorporação de T resulta em transição GA enquanto a incorporação de A ou G resulta em transversão G T ou GC após o segundo ciclo da replicação É importante você saber que uma única célula perde mais de 10000 purinas por dia sendo que a maioria dos sítios apurínicos é devidamente reparada C E D E R J 88 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 89 AULA 13 MÓDULO 2 a b Figura 139 Depurinação perda espontânea de purinas presentes no DNA A perda de purina gera um sítio apurínico sítio AP a Na ausência de uma base na fita molde qualquer base pode ser incorporada durante a replicação do DNA podendo gerar uma mutação b C E D E R J 88 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 89 AULA 13 MÓDULO 2 a b Figura 1310 Desaminação perda do grupamento amino das bases A perda do grupamento amino da cito sina a e da 5metilcitosina b resulta em uracila e timina respectivamente Essa mudança de base favorece a formação de um par de bases diferente do original o que caracteriza uma mutação Desaminação A desaminação caracterizase pela perda do grupamento amino NH2 de uma das bases nitrogenadas A desaminação da citosina por exemplo gera uracila conforme esquematizado na Figura 1310a o que resulta nos ciclos subseqüentes de replicação em conversão do par CG para o par TA Além disso algumas bases se encontram metiladas ou seja adicionadas de um grupamento metil CH3 sendo que o estado de metilação de um gene consiste em um importante mecanismo de controle de expressão gênica A desaminação de 5metilcitosina produz timina conforme a Figura 1310b resultando na transição CT e na substituição do par CG pelo par TA Como a presença de timina não é reconhecida pela maioria dos sistemas de reparo este mecanismo é uma causa comum de mutação C E D E R J 90 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 91 AULA 13 MÓDULO 2 Danos oxidativos Os danos oxidativos podem ocorrer espontaneamente devido à ação de RADICAIS LIVRES tais como superóxido O 2 peróxido de hidrogênio H2O2 e radical hidroxila OH que são gerados durante o metabolismo aeróbico normal Estas espécies reativas de oxigênio podem causar danos no DNA ou até mesmo nos precursores do DNA dGTP resultando em mutação Dois dos produtos formados estão representados na Figura 1311 O 8oxo7hidrodesoxiguanosina 8oxodG por exemplo pareia freqüentemente com A estando associado a altos níveis da transversão GT Já a timidina glicol bloqueia a replicação Os danos oxidativos ocorrem naturalmente mas sua freqüência é aumentada por radiação ionizante conforme você verá mais adiante nesta aula Figura 1311 Produtos de danos oxidativos do DNA decorrentes da ação de espé cies reativas de oxigênio a Timidina glicol que bloqueia a replicação do DNA b 8Oxo7hidrodesoxiguanosina 8oxodG que promove a transversão GT COMO OCORREM AS MUTAÇÕES INDUZIDAS As mutações induzidas ocorrem pela ação de agentes mutagênicos químicos e físicos Dentre os agentes mutagênicos químicos mais conhecidos destacamse os análogos de base os compostos que reagem com o DNA como o ácido nitroso e os agentes alquilantes e os agentes intercalantes Como exemplos de mutágenos físicos podemos citar os raios ultravioleta raios UV um tipo de radiação nãoionizante e dois tipos de radiação ionizante os raios γ e os raios X Como será que cada um desses agentes atua Vamos discutir um pouquinho sobre cada um deles separadamente RADICAIS LIVRES Átomos ou moléculas quimicamente reativas devido à existência de pelo menos um elétron desemparelhado que apresentam tempo de vida pequeno Na busca de uma con figuração mais estável os radicais livres podem causar danos às macromoléculas no interior das células Os radicais livres podem ser produzidos em processos normais ou patológicos e estão associados a danos teciduais em diver sas circunstâncias incluindo exposição à radiação danos por poluentes ambientais e envelhecimento As substâncias anti oxidantes como a vitamina C diminuem os níveis de radicais livres em nosso organismo evitando assim que eles causem algum dano Para maiores informações sobre radicais livres e sua importância visite a página da Virtual Free Radical School cujo endereço é http wwmedicineuiowaedu FRRBVirtualSchool Virtualhtml a b C E D E R J 90 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 91 AULA 13 MÓDULO 2 Agentes mutagênicos químicos Análogos de base Pelo nome você já deve entender como são os compostos desse grupo De fato a ação mutagênica de um análogo de base resulta de sua incorporação no DNA no lugar de uma base regular Se esse composto tautomeriza ou se permite dois modos de pareamento através de pontes de hidrogênio ele é mutagênico Como exemplo podemos citar o 5bromo uracila 5BU um análogo de timina Observe sua fórmula estrutural na Figura 1312a O caráter mutagênico do 5BU se deve à mudança do equilíbrio cetoenol causado pelo átomo de bromo conforme pode ser visto na Figura 1312b A forma enol existe por mais tempo em 5BU do que em T e pareia com G Portanto sua presença gera a transição AG e a mudança do par TA para o par CG Como nos casos já discutidos anteriormente são necessários dois ciclos de replicação para gerar um novo par de bases Figura 1312 Possíveis pareamentos entre 5bromo uracila 5BU e as bases nitrogenadas comuns A presença da forma comum do 5bromo uracila 5BU um análogo de timina pareia com adenina a enquanto a forma ceto de 5BU permite o pareamento com guanina b o que caracteriza uma mutação Um outro exemplo é a 2amino purina 2AP Figura 1313a um análogo de adenina Além de parear com T a forma protonada de 2AP pode formar uma ponte de hidrogênio com C Figura 1313b Esta possibilidade de pareamento causa uma mudança do par AT para o par GC C E D E R J 92 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 93 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1313 Possíveis pareamentos entre 2amino purina 2AP e as bases nitrogenadas comuns Enquanto 2amino purina 2AP pareia com timina a a forma protonada de 2AP permite o pareamento com citosina b o que em ciclos subseqüentes de replicação gera uma mutação caso o erro não seja reparado Exemplos de análogos de base são algumas drogas antivirais e antitumorais O AZT azidotimidina um análogo de timina é amplamente usado no tratamento de pacientes portadores de HIV Compostos que reagem com o DNA Vários compostos químicos que reagem com o DNA são conhecidos destacandose o ácido nitroso a hidroxilamina e o etil metano sulfonato um agente alquilante Ácido nitroso O ácido nitroso HNO2 causa desaminação oxidativa convertendo o grupamento amino NH2 das bases nitrogenadas ao grupamento carbonila CO Tal qual ocorre na desaminação espontânea que você já estudou anteriormente volte à Figura 1310 a desaminação por ácido nitroso promove a conversão de C em U que pareia com A em vez de parear com G A base A desaminada gera a base hipoxantina que pareia com C Já a desaminação de G resulta em xantina que pareia também com C não causando portanto mutação O ácido nitroso é formado a partir de precursores orgânicos tais como as nitrosaminas e de sais de nitrito e nitrato que são comumente empregados como conservantes de alimentos processados para prevenir o crescimento de bactérias tóxicas Na quantidade utilizada para este fim estes compostos não parecem aumentar o risco de câncer conferindo um risco muito menor para a saúde do que no caso dos alimentos estragados pelo não uso de conservantes C E D E R J 92 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 93 AULA 13 MÓDULO 2 Hidroxilamina A ação da hidroxilamina NH 2OH resulta em adição de uma hidroxila à citosina que dessa forma passa a parear com A mudando o par CG para o par TA Etil metano sulfonato O composto etil metano sulfonato EMS é um agente alquilante ou seja adiciona um grupamento alquila a uma base nitrogenada O EMS é capaz de adicionar o grupamento etila a muitas posições das quatro bases mas seu poder mutagênico está mais relacionado à adição da etila ao oxigênio na posição 6 da guanina A O6etilguanina formada pareia então com timina Figura 1314 podendo resultar na transição GC AT nos ciclos seguintes de replicação Já a ação de EMS sobre a timina resulta em formação de O4etiltimina que ao parear com guanina pode determinar a conversão de T para C A adição de um grupo alquila também pode ocorrer no N7 do anel purínico formando um nitrogênio quaternário nessa posição Este grupo quaternário estimula a ionização do anel e na forma ionizada a guanina alquilada pareia com T em lugar de C resultando na transição do par GC para o par AT Já a adenina alquilada apresenta uma ligação Nglicosídica facilmente hidrolizável produzindo um sítio apurínico tal qual foi visto na Figura 139a Tal sítio pode ser reparado mas se a replicação precede o reparo qualquer base pode ser inserida tal como ocorre na geração espontânea de sítios apurínicos que você já estudou Como na Figura 139b após a segunda replicação o par original AT pode ser regenerado ou convertido aos pares GC TA ou CG C E D E R J 94 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 95 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1314 Ação do etil metano sulfonato EMS A ação do EMS sobre a guanina gera O6etil guanina que ao parear com timina promove a conversão do par GC em AT a A timina sob ação do EMS é convertida em O4etil timina que pareia com guanina resultando na mudança do par TA em CG b Substâncias intercalantes As substâncias intercalantes tais como acridina laranja corante e proflavina antiséptico de uso veterinário Figura 1315 inseremse entre dois pares de bases num processo chamado intercalação Estes compostos são moléculas planares constituídas de três anéis cujas dimensões são muito similares às de um par purinapirimidina Quando um DNA contendo acridinas intercaladas por exemplo se replica bases adicionais aparecem na seqüência Normalmente ocorre adição de uma base embora ocasionalmente possa ocorrer também a adição de duas bases A deleção de bases também é possível a b C E D E R J 94 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 95 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1315 Substâncias intercalantes e seu modo de ação a Fórmula estrutural de duas substâncias inter calantes proflavina e acridina laranja b A presença de uma substância intercalante na molécula de DNA causa um estiramento da duplahélice o que faz com que durante a replicação a DNA polimerase promova a adição ou deleção de pares de bases O benzopireno encontrado na fumaça de cigarro e aflatoxinas produzidas pelo fungo Aspergillus flavus que cresce em amendoim e em diversos tipos de grãos são exemplos de agentes mutagênicos Agentes mutagênicos físicos Radiação nãoionizante raios ultravioleta Os raios ultravioleta constituem um exemplo de radiação não ionizante sendo considerado um mutagênico potente por sua capacidade de causar dímeros de timina e outros dímeros de pirimidina Na Figura 1316a você pode observar os dois tipos de dímero o dímero ciclobutanotimina formado pela ligação de dois resíduos adjacentes de timina ligados por anéis de ciclobutano envolvendo os carbonos 5 e 6 da timina e o fotoproduto 64 um outro tipo de lesão causada pelos a b C E D E R J 96 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 97 AULA 13 MÓDULO 2 raios UV As duas lesões de DNA promovem distorção da duplahélice interferindo no pareamento normal das bases A presença do dímero ciclobutanotimina bloqueia a transcrição e a replicação sendo a forma mais letal quando não é reparada O fotoproduto 64 é a forma mais mutagênica Um possível mecanismo de surgimento de mutação está esquematizado na Figura 1316b Durante a replicação de uma molécula de DNA apresentando dímero de timina ambas as fitas são usadas como moldes para síntese de novas fitas A presença do dímero na fita molde pode direcionar a incorporação de uma base errada na fita nova de tal forma que no segundo ciclo de replicação uma mutação será produzida Embora os dímeros de pirimidinas possam eventualmente ser corrigidos a mutação não é detectada pelo sistema de reparo de DNA O efeito mutagênico dos raios UV parece estar relacionado aos mecanismos de reparo desses danos como será visto mais adiante nesta aula C E D E R J 96 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 97 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1316 Ação de raios ultravioleta sobre o DNA a A incidência de raios UV sobre uma molécula de DNA que apresenta dois resíduos adjacentes de timina pode resultar em formação de dímero de timina ciclobutano ou em 64 fotoproduto b Um possível mecanismo para o surgimento de uma mutação induzida por raios UV a b C E D E R J 98 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 99 AULA 13 MÓDULO 2 Radiações ionizantes raios X e raios γ Dentre as radiações ionizantes destacamse os raios X e os raios γ que se caracterizam pelo alto poder de penetração sendo capazes de ionizar água e outras moléculas Os radicais livres formados por exemplo o radical hidroxila OH são muito reativos e reagem com o DNA promovendo quebra de fita simples quebras do suporte açúcarfosfato ou quebra do anel imidazol das purinas Estas lesões geram sítios apurínicos ou apirimidínicos o que pode resultar em deleção de nucleotídeos DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DAS MUTAÇÕES hot spots A distribuição espacial das mutações na molécula de DNA não é ao acaso e certos sítios são alterados com maior freqüência As regiões nas quais as mutações estão concentradas são conhecidas como hot spots Estes sítios não são idênticos para os diferentes agentes mutagênicos A presença dessas regiões em um DNA alterado muitas vezes contribui para identificar o tipo de agente mutagênico associado à alteração REPARO DO DNA Antes de iniciarmos este tópico é importante que você pense a respeito da fidelidade do processo de replicação do DNA Para a célula é interessante que seu DNA seja replicado de forma perfeita ou sejam introduzidos erros de seqüência de bases Pensou na forma perfeita Será que um errozinho é vantajoso Vamos discutir sobre isso Parece óbvio que se a cada ciclo de replicação fossem introduzidos erros de seqüências de bases na molécula de DNA a freqüência de doenças genéticas seria muito maior do que a observada Além disso como definiríamos uma espécie já que dificilmente ela seria preservada Em contrapartida uma replicação perfeita sem erros não permitiria a criação de novas espécies e muito menos a seleção de organismos mais bem adaptados a certas condições ambientais com um prejuízo inestimável ao processo evolutivo A recomendação de não se tomar banho de sol entre 10h e 14h é devida à maior quantidade de raios UV neste período do dia O bronzeamento solar excessivo pode causar a formação de dímeros de pirimidina nas células epiteliais podendo resultar em câncer de pele C E D E R J 98 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 99 AULA 13 MÓDULO 2 É importante que você saiba que a taxa de erro durante a replicação do DNA não é pequena Entretanto os sistemas de reparo de DNA reduzem esta taxa de erro sendo responsáveis por manter o equilíbrio entre preservar a saúde preservar as espécies e possibilitar a evolução Por exemplo a subunidade α da DNA polimerase III de Escherichia coli introduz aproximadamente uma base incorreta a cada 104 pares de bases formados durante a replicação in vitro Contudo a taxa estimada de mutação em células bacterianas é muito menor correspondendo a um erro a cada 109 nucleotídeos incorporados durante a síntese de DNA Esta redução da taxa de mutação se deve principalmente à função revisora das DNA polimerases de E coli Na DNA polimerase III esta função é exibida pela subunidade ε epsilon de forma que quando uma base errada é incorporada durante a síntese de DNA a polimerase faz uma pausa transfere a extremidade 3 da cadeia crescente para o sítio da exonuclease no qual a base malpareada é removida A extremidade 3 é então transferida de volta para o sítio da polimerase onde esta região é copiada corretamente A função revisora é uma propriedade de quase todas as DNA polimerases de bactéria e das polimerases δ delta e ε epsilon de células animais indicando que esta função é indispensável para reduzir o excesso de erro em todas as células Além dos sistemas de reparo que discutiremos nesta aula as células também desenvolveram sistemas enzimáticos capazes de neutralizar compostos com potencial de causar danos ao DNA Como exemplo podemos citar um sistema que previne contra danos oxidativos e que envolve a ação da enzima superóxido dismutase sobre radicais superóxidos convertendoos a peróxido de hidrogênio que é então convertido à água pela ação da enzima catalase Você já viu na primeira parte desta aula que os danos observados nas moléculas de DNA podem ser decorrentes não apenas de substituição de bases durante a replicação como também da troca de bases resultante da instabilidade química inerente às próprias bases ou às ligações Nglicosídicas e às alterações resultantes da ação de agentes químicos ou físicos Agora vamos discutir um pouco sobre os principais sistemas de reparo conhecidos lembrando que grande parte desse conhecimento foi adquirida a partir de estudos com bactéria Muitos desses sistemas de reparo também existem em eucarioto Entretanto o complexo enzimático envolvido e os detalhes do processo ainda não foram inteiramente esclarecidos C E D E R J 100 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 101 AULA 13 MÓDULO 2 Nos próximos parágrafos você estudará o reparo de mau pareamento de bases os reparos de excisão de base e de nucleotídeo e dois tipos de reparo direto nos quais participam DNA fotoliases e alquiltransferases Reparo de mau pareamento de bases mismatch repair O sistema de reparo de mau pareamento existente em células de bactéria e de eucariotos é responsável pela correção tanto de mau pareamento de uma única base exceto CC quanto de pequenas inserções e deleções Quando um mau pareamento ou seja um par de bases não usual é detectado a base incorreta é removida e substituída pela base correta O grande desafio deste mecanismo de reparo é discriminar entre as fitas de DNA normal e mutada de forma a reparar a fita mutada tendo a normal como referência Em bactéria como você verá mais adiante a fita nova é reconhecida por não ser metilada Apenas para reforçar sua importância vale lembrar que a correção de erros pelo sistema de reparo de mau pareamento na bactéria E coli aumenta de 102 a 103 a fidelidade da replicação Para você entender o que ocorre em organismos procarióticos leia os parágrafos seguintes acompanhando a Figura 1317 Este sistema de reparo atua logo após a replicação quando a fita recémsintetizada ainda não sofreu metilação O que será metilação No DNA de E coli resíduos de adenina nas seqüências GATC são metilados ou seja recebem um grupamento metila CH3 na posição 6 Você já sabe que as DNA polimerases incorporam adenina e não metil adenina no DNA de forma que os resíduos de adenina estarão apenas na fita recémsintetizada Como a metilação desta fita ocorre alguns minutos após a replicação pela ação da enzima Dam metil transferase ou Dam metilase o DNA replicado se apresenta por um período de tempo hemimetilado ou seja a fita original é metilada enquanto a fita recémsintetizada é nãometilada o que faz com que o sistema de reparo seja capaz de discriminar entre as duas fitas Esse reconhecimento é fundamental para que a base incorporada erroneamente na fita recém sintetizada nãometilada seja removida e que a base correta seja então incorporada de acordo com a seqüência da fita original metilada C E D E R J 100 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 101 AULA 13 MÓDULO 2 Em bactéria este processo engloba a participação de três proteínas A proteína MutH que se liga especificamente à seqüência GATC de moléculas hemimetiladas é capaz de distinguir a fita original metilada da fita recémsintetizada e portanto nãometilada A proteína MutS que reconhece o mau pareamento de bases forma um complexo com uma terceira proteína MutL O DNA atravessa esse complexo que se move nas duas direções ao longo da molécula de DNA Quando o complexo encontra uma proteína MutH ligada à seqüência hemimetilada GATC a atividade endonuclease latente da MutH é ativada ocorrendo a clivagem específica da fita não metilada Após esta incisão o segmento da fita recémsintetizada contendo a base incorporada erroneamente é retirado pela ação de uma exonuclease Este segmento é então devidamente substituído pela seqüência correta em uma etapa em que se observa a participação de várias enzimas incluindo a DNA polimerase III e a ligase Lembra do papel dessas enzimas na replicação C E D E R J 102 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 103 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1317 Metilação do DNA e reparo de mau pareamento de bases a Etapas envolvidas na metilação do DNA Note durante este processo a existência de DNAs hemimetilados importantes para o reconhecimento da fita a ser reparada b Etapas envolvidas no reparo de mau pareamento de bases A explicação da figura encontrase no texto a b C E D E R J 102 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 103 AULA 13 MÓDULO 2 Reparo por excisão de base BER baseexcision repair O reparo por excisão de base reconhece qualquer lesão que crie uma distorção significativa na duplahélice do DNA tais como as geradas pela desaminação de citosina e adenina Nesse caso a base alterada é removida por clivagem da ligação Nglicosídica pelas enzimas conhecidas como DNA glicosilases gerando um sítio AP já citado anteriormente A uracil glicosilase por exemplo é específica para a remoção de uracila que resulta da desaminação de citosina Esta glicosilase não remove resíduos de uracila do RNA nem resíduos de timina do DNA Outras glicosilases são capazes de remover hipoxantina resultante da desaminação de adenina e bases alquiladas Além disso lembre que os sítios AP também podem ser gerados pela hidrólise espontânea das ligações Nglicosídicas do DNA O fato é que independentemente dos eventos que antecedem sua formação o sítio AP é reparado por um processo enzimático que consiste em quatro etapas incisão ao reconhecer a distorção da duplahélice uma AP endonuclease corta a ligação fosfodiéster do suporte de açúcarfosfato próxima ao sítio AP excisão o segmento de DNA é removido pela atividade 53 exonuclease da DNA polimerase I síntese o grupamento 3OH é reconhecido pela DNA polimerase I que sintetiza um novo segmento de aproximadamente 20 nucleotídeos substituindo assim a seqüência incorreta pela correta ligação após a participação da DNA polimerase I a ligação fosfodiéster é refeita ou seja a fita corrigida é selada pela ação da DNA ligase Confira se você entendeu tudo direitinho observando a Figura 1318 C E D E R J 104 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 105 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1318 Reparo por excisão de base BER a A DNA glicosilase reconhece uma base danificada e cliva a ligação Nglicosídica formada entre esta base e a desoxirribose b Uma AP endonuclease cliva a ligação fos fodiéster próxima ao sítio AP c A DNA polimerase I inicia a síntese de um novo segmento de DNA concomi tantemente a sua atividade 53 exonuclease remove a porção da fita danificada d A fita é devidamente selada pela ação da DNA ligase a b c d C E D E R J 104 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 105 AULA 13 MÓDULO 2 Reparo por excisão de nucleotídeo NER nucleotideexcision repair O reparo por excisão de nucleotídeos reconhece grandes distorções da duplahélice do DNA Neste sistema de reparo uma enzima hidrolisa duas ligações fosfodiéster uma em cada lado da lesão Em E coli em particular o complexo enzimático que participa desse processo é denominado excinuclease ABC sendo constituído por três subunidades UvrA UvrB e UvrC Inicialmente o complexo formado por duas UvrA e uma UvrB A2B se ligam ao sítio da lesão O dímero UvrA A2 se dissocia e UvrB e UvrC efetuam as incisões que flanqueiam a lesão Em E coli e em outros procariotos o sistema enzimático hidrolisa a quinta ligação fosfodiéster no terminal 3 e a oitava no terminal 5 gerando um fragmento de 12 a 13 nucleotídeos dependendo se a lesão envolve uma ou duas bases Em seres humanos e outros eucariotos a enzima hidrolisa a sexta ligação fosfodiéster no terminal 3 e a vigésima segunda no terminal 5 produzindo um fragmento de 27 a 29 nucleotídeos Após a dupla incisão e liberação do oligonucleotídeo excisado o espaço gerado é preenchido pela DNA polimerase I em E coli e DNA polimerase ε em humanos A fita é então selada pela DNA ligase Releia este parágrafo acompanhando a Figura 1319 Figura 1319 Reparo por excisão de nucleotídeo NER a Um complexo enzimático denominado excinuclease cliva duas ligações fosfodiéster específicas que flanqueiam a lesão no DNA b O fragmento de DNA resultante com 13 ou 29 nucleotídeos respectivamente em E coli ou no ser humano é removido pela DNA helicase c O espaço vazio é preenchido pela DNA polimerase d A fita reparada é selada pela DNA ligase a b c d C E D E R J 106 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 107 AULA 13 MÓDULO 2 Reparo direto papel das fotoliases e das alquiltransferases Vários tipos de sistemas de reparo atuam sem remoção de base ou nucleotídeo Um deles é o da fotorreativação direta de dímeros de ciclobutanopirimidina uma reação promovida por enzimas fotorreativadoras as chamadas DNA fotoliases Você já viu que os dímeros de pirimidina resultam de uma reação induzida por luz ultravioleta As fotoliases também usam energia derivada de luz absorvida para reverter o dano causado Repare na Figura 1320 A diferença é que a clivagem dos dímeros de timina a monômeros de timina é catalisada pela enzima ativada pela luz visível 300600 nm As fotoliases geralmente contêm dois cofatores que atuam como compostos que absorvem luz os chamados cromóforos Um outro exemplo a ser citado é o reparo da O6metilguanina que se forma em presença de agentes alquilantes O reparo direto é feito pela O6metilguaninaDNA metiltransferase uma proteína que catalisa a transferência de um grupo metila de O6metilguanina para um dos seus resíduos de cisteína Esta enzima se comporta de maneira peculiar uma vez que a transferência de um único grupamento metila é suficiente para inativála O consumo de uma molécula protéica para reparar uma lesão corrobora a importância de se manter a integridade do DNA celular A proteína metilada no entanto não é degradada e atua como um ativador transcricional aumentando a expressão de seu próprio gene e dos genes de outras enzimas de reparo Figura 1320 Fotorreativação papel das DNA fotoliases O fotodímero de timina é primeiramente reconhecido pela fotoliase que se liga a ele Em presença de luz visível a fotoliase é capaz de promover a quebra do dímero con vertendoo aos monômeros originais C E D E R J 106 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 107 AULA 13 MÓDULO 2 Figura 1321 Reparo direto papel das alquiltransferases O grupamento metila é transferido para uma metil transferase que se torna inativa CONSIDERAÇÕES FINAIS Considerando tudo o que vimos nesta aula vamos pensar juntos sobre o destino de um dano no DNA Um erro na molécula de DNA pode ser tolerado ou simplesmente ignorado pode ser reparado pode causar a morte da célula ou determinar que a célula se programe para morrer através de um processo conhecido como apoptose ou pode ser fixado resultando em uma mutação As mutações se apresentam com grande utilidade não só na natureza representando uma das causas da variabilidade genética que permitem a seleção natural e portanto a evolução das espécies como também no campo da pesquisa Nesta área os genes mutantes são utilizados como sondas uma vez que ajudam a desvendar os mistérios pertinentes a uma função biológica Assim no estudo detalhado da função de um gene é importante que se obtenha o maior número possível de mutantes Muitos polimorfismos são responsáveis pela variabilidade observada entre os seres humanos Talvez você já tenha estudado sobre isso em Genética mas vale a pena repetir Em geral o termo mutação é usado para indicar uma mudança genética encontrada numa freqüência baixa Uma mutação passa a ser chamada polimorfismo quando sua freqüência se torna maior que 001 1 ou seja o termo polimorfismo é empregado quando se observam duas ou mais formas de um gene sem que nenhuma delas represente mais que 99 na população estudada Diferentemente da mutação o termo polimorfismo indica um variante normal de um gene Esta normalidade é controversa pois alguns alelos C E D E R J 108 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 109 AULA 13 MÓDULO 2 que inicialmente se mostram como variantes normais podem contribuir para o desenvolvimento de certas doenças incluindo o câncer de maneira bastante sutil Com o seqüenciamento do genoma humano foram identificados diversos polimorfismos de um único nucleotídeo conhecidos por SNPs Single Nucleotide Polymorphisms a cada 1000 a 2000 bases Com estes dados podese concluir que 93 dos genes contêm pelo menos um SNP Atualmente se acredita que o estudo de SNPs possa contribuir para o entendimento da diversidade fenotípica e da predisposição a doenças de maior complexidade Inúmeras doenças estão associadas a mutações em genes que desempenham papéis fundamentais nos processos celulares podendo ser herdadas Quando essas mutações se localizam em genes do sistema de reparo os portadores dessas alterações apresentam uma predisposição ao câncer o que de alguma forma contribui para a correlação mutagênese carcinogênese Como exemplos dessas doenças podemos citar câncer de colon nãopolipose hereditário por deficiência no reparo mismatch e anemia de Fanconi Xeroderma pigmentosum e Tricotiodistrofia por deficiência no reparo por excisão C E D E R J 108 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA C E D E R J 109 AULA 13 MÓDULO 2 Quanto às mutações você estudou nesta aula que elas podem ocorrer em tecidos somáticos e germinativos de forma espontânea ou induzida Existem regiões chamadas hotspots preferencialmente mutadas no genoma dos diferentes organismos Quanto ao aspecto molecular uma mutação pode ser definida como transição quando há substituição de uma purina por outra ou de uma pirimidina por outra ou transversão quando ocorre troca de uma purina por uma pirimidina ou vice versa Além disso mutações em um gene podem ou não causar alterações na proteína codificada por este gene As mutações espontâneas podem ser decorrentes de erros de replicação do DNA originados principalmente pelos pareamentos não usuais das formas tautoméricas raras das bases nitrogenadas ou de lesões espontâneas incluindo depurinação desaminação e danos oxidativos As mutações induzidas podem ser causadas por agentes químicos e físicos Dentre os mutagênicos químicos destacamse os análogos de bases compostos que reagem diretamente com o DNA e os agentes alquilantes As radiações ionizantes raios UV e nãoionizantes raios γ e os raios X são importantes por causarem danos no DNA A maioria das lesões é reparada pela célula Entretanto a maneira com que os sistemas de reparo atuam depende do tipo do dano ou erro Além disso diferentes organismos variam em sua capacidade de reparar DNA Quando ocorre falha no sistema de reparo um número muito menor de lesões é corrigido acarretando um aumento no número de mutações no genoma R E S U M O C E D E R J 110 Biologia Molecular Mutação e reparo do DNA EXERCÍCIOS 1 Uma mutação que ocorre em uma célula somática de um indivíduo pode ser herdada por sua prole Explique 2 Diferencie transição e transversão Não esqueça de citar exemplos 3 Quantos pares de bases teriam de ser deletados em um evento mutacional para eliminar um único aminoácido de uma proteína sem alteração do restante da cadeia polipeptídica 4 Descreva a ação do 5bromo uracila 5BU na produção de mutantes 5 Após a exposição de uma suspensão de células bacterianas à luz ultravioleta duas alíquotas foram plaqueadas em meio sólido sendo que uma delas foi incubada em ausência de luz e outra em presença de luz O número de mutantes na placa mantida no escuro foi infinitamente menor do que o obtido na placa incubada em presença de luz Como se explica esse fato AUTOAVALIAÇÃO Como comentado anteriormente esta aula envolve um número muito grande de informações Portanto optamos por exercícios que permitam você avaliar se o assunto foi devidamente assimilado Caso você não tenha conseguido resolver algum deles refaça a leitura da aula insista um pouco mais nas figuras pois temos certeza de que elas podem ajudar bastante Se as dúvidas persistirem vá até o pólo discutir com os tutores Certamente eles saberão como lhe ajudar FIQUE ATENTO Na próxima aula estudaremos recombinação e mais alguns sistemas de reparo Até lá Atividade presencial obrigatória Dinâmica DNA recombinante 14 A U L A BE AWARE OF POISON IVY OAK AND SUMAC Recombinação Nesta aula você terá a oportunidade de Entender o que é a recombinação genética e como ela ocorre Discutir algumas aplicações práticas da recombinação Conhecer o sistema de reparo recombinacional e a resposta SOS Esta aula será mais facilmente assimilada se você não tiver dúvidas em relação às aulas sobre estrutura replicação e reparo do DNA Aulas 4 9 10 11 14 e 13 Conhecimento básico de divisão celular também será necessário objetivos 15 A U L A Prérequisitos C E D E R J 114 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 115 AULA 15 MÓDULO 2 INTRODUÇÃO Você estudou na Aula 13 a base molecular das mutações e os principais agentes mutagênicos e sistemas de reparo Também já foi comentado que recombinação juntamente com mutação desempenha um papel importante na variabilidade genética entre indivíduos de uma população Estes temas também serão abordados nas aulas de Genética mas com um enfoque diferente Nesta aula você terá a oportunidade de estudar o que é e mais especificamente como ocorre a recombinação genética Você perceberá que nossa atenção estará voltada principalmente para a recombinação homóloga que está associada a um tipo específico de reparo Também incluímos nesta aula o sistema SOS que é ativado quando os danos são de proporções maiores e a célula se encontra na seguinte situação se correr o bicho pega se ficar o bicho come RECOMBINAÇÃO GENÉTICA O rearranjo da informação genética dentro de uma ou mesmo entre duas moléculas de DNA engloba inúmeros processos agrupados e reconhecidos como recombinação genética Veja na Figura 151 alguns exemplos de recombinação de acordo com o tipo de troca ocorrida Na recombinação recíproca após a troca de segmentos entre duas moléculas de DNA observase a geração de duas moléculas modificadas enquanto na recombinação nãorecíproca apenas uma das moléculas sofre modificação em sua seqüência A recombinação pode ocorrer em mais de um ponto das moléculas de DNA envolvidas conforme ilustrado no exemplo de crossover duplo Além disso o evento recombinacional pode ocorrer entre segmentos de uma única molécula de DNA Esse tipo de recombinação chamado recombinação intramolecular pode envolver repetições diretas na mesma direção e invertidas em direção contrária que estão associadas respectivamente às deleções e inversões Estes exemplos nos permitem dizer que em linhas gerais enquanto através de mutação ocorre a criação de novos alelos de um gene por recombinação se observa a geração de novas combinações dos alelos já existentes A recombinação representa portanto uma forma de recuperar e disseminar alelos favoráveis e ao mesmo tempo eliminar os alelos desfavoráveis sem que com isso haja um prejuízo de outros genes presentes no cromossomo C E D E R J 114 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 115 AULA 15 MÓDULO 2 Figura 151 Exemplos de recombinação a Recíproca b Nãorecíproca c Intra molecular repetições diretas e invertidas d Crossover duplo Explicação mais detalhada no texto Os eventos gerais de recombinação genética se dividem de acordo com a similaridade das seqüências das moléculas de DNA em pelo menos quatro classes principais recombinação homóloga recombinação nãohomóloga recombinação sítioespecífica e transposição de DNA Na Figura 152 você encontra os esquemas dos quatro tipos de recombinação C E D E R J 116 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 117 AULA 15 MÓDULO 2 A recombinação homóloga ou simplesmente recombinação envolve trocas genéticas entre quaisquer duas moléculas de DNA ou segmentos da mesma molécula que compartilham uma região de alta similaridade independentemente da seqüência de bases nesta região Figura 152a Em contrapartida a recombinação sítioespecífica envolve trocas genéticas que ocorrem somente em uma seqüência específica de DNA Na Figura 152c encontrase esquematizada a integração do DNA do bacteriófago λ no cromossomo bacteriano em um processo que conta com a participação da enzima integrase do fago λ Neste exemplo a recombinação ocorre em sítios específicos denominados sítios att presentes nos genomas da bactéria E coli e do fago A recombinação nãohomóloga envolve segmentos de DNA sem qualquer similaridade entre si Figura 152b Já a transposição de DNA assunto das Aulas 18 e 19 é distinta das outras classes uma vez que normalmente envolve um segmento curto de DNA com a capacidade notável de se mover de um local para outro no cromossomo com a participação da enzima transposase Figura 152d Figura 152 Tipos de recombinação a Recombinação homóloga envolve segmentos de DNA com alta homologia b Nãohomóloga envolve segmentos de DNA nãosimilares c Sítioespecífica ocorre em sítios específicos d Transposição envolve segmentos que se movem de um local para outro C E D E R J 116 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 117 AULA 15 MÓDULO 2 É importante que você saiba que os sistemas de recombinação genética desempenham inúmeras funções biológicas Estas incluem alguns sistemas especializados de reparo de DNA e atividades específicas na replicação do DNA a regulação da expressão de certos genes o favorecimento da segregação do próprio cromossomo durante a divisão celular em eucariotos a manutenção da diversidade genética e a implementação de rearranjos genéticos programados durante o desenvolvimento embrionário Na maioria dos casos a recombinação genética está intimamente integrada a outros processos no metabolismo do DNA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM EUCARIOTOS Em organismos eucarióticos a recombinação homóloga geralmente está associada à divisão celular apesar de também estar associada ao reparo de DNA A recombinação ocorre com maior freqüência durante a meiose processo pelo qual as células diplóides da linhagem germinativa com dois conjuntos de cromossomos dividemse para produzir os gametas haplóides espermatozóides em machos ou óvulos em fêmeas com apenas um conjunto de cromossomos Lembra das aulas de Genética Busque a Figura 153 para refrescar sua memória Em linhas gerais a meiose começa com a replicação do DNA na célula da linhagem germinativa de tal forma que cada molécula de DNA está presente em quatro cópias Durante a prófase da primeira divisão meiótica as cópias resultantes de DNA permanecem associadas aos seus centrômeros e são denominadas cromátidesirmãs Figura 153a Cada conjunto de quatro cromátides existe como dois pares de homólogos o que permite a formação da estrutura denominada tétrade Figura 153b Neste estágio a informação genética pode ser trocada entre as cromátides homólogas por recombinação um processo que envolve a quebra e a junção do DNA Figuras 153b e 153c A célula então prossegue em dois ciclos da divisão celular sem um ciclo intermediário de replicação de DNA o que reduz o conteúdo de DNA para o nível haplóide em cada gameta Na primeira divisão meiótica Figuras 153c e 153d os pares de homólogos se separam e migram para os pólos opostos da célula em divisão Já na segunda divisão as cromátides agora chamadas cromossomos são separadas constituindo o material genético de cada uma das células haplóides Figuras 153e e 153f C E D E R J 118 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 119 AULA 15 MÓDULO 2 Figura 153 Meiose em células da linhagem germinativa de organismos eucarióticos a Os seis cromossomos três pares de cromossomos homólogos de uma célula hipotética são replicados e mantidos unidos através do centrômero b Troca de informação genética entre as cromátidesirmãs por recombinação c Separação dos homólogos d Primeira divisão meiótica e Separação das cromátides que passam a ser chamadas cromossomos g Segunda divisão meiótica Explicação mais detalhada da figura encontrase no texto C E D E R J 118 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 119 AULA 15 MÓDULO 2 A troca de informação genética representada na Figura 153b também é chamada crossing over podendo ser observada com auxílio de microscópio eletrônico Figura 154b O crossing over junta os dois pares das cromátidesirmãs por pontos denominados quiasmas Figura 154a sendo esta ligação essencial para a segregação apropriada dos cromossomos nas divisões meióticas subseqüentes Figura 154 Crossing over a A tétrade é formada por um par de cromossomos homólogos Como cada homólogo é formado por duas cromátidesirmãs podese dizer que a tétrade é constituída por quatro cromátides O ponto de crossover que é o ponto de troca de informação genética é chamado quiasma b A observação dos cromossomos homólogos de um gafanhoto durante a prófase I da meiose por microscopia eletrônica permi tiu a elaboração de um esquema no qual estão em destaque alguns quiasmas que antecedem os eventos de recombinação homóloga Sabese que o crossing over não ocorre inteiramente ao acaso e alguns hot spots sítios preferenciais de troca de informação genética têm sido identificados em muitos cromossomos eucarióticos Contudo a hipótese de que o crossing over pode ocorrer em qualquer ponto dos cromossomos homólogos com igual probabilidade é razoável em muitos casos o que favorece o mapeamento genético Nesse caso ao considerarmos que a freqüência de recombinação homóloga em qualquer região separando dois pontos em um cromossomo é aproximadamente proporcional à distância entre estes podemos estimar as posições relativas e as distâncias entre diferentes genes C E D E R J 120 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 121 AULA 15 MÓDULO 2 A recombinação é usada no mapeamento genético uma vez que a freqüência de recombinação é proporcional à distância entre os genes Além disso ela é de grande utilidade na construção de organismos transgênicos É importante você saber que a montagem dos genes das imunoglobulinas é feita por recombinação Os seres humanos são capazes de produzir milhões de imunoglobulinas anticorpos diferentes com especificidades distintas mesmo que seu genoma contenha apenas aproximadamente 100000 genes Isto só é possível devido ao mecanismo de recombinação que permite a produção de uma diversidade extraordinária de anticorpos a partir de um DNA com capacidade codificadora limitada RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM PROCARIOTO Em bactéria a principal função da recombinação homóloga é no reparo do DNA através de um processo denominado reparo de DNA recombinacional Este geralmente é direcionado para a reconstrução da forquilha de replicação na qual a DNA polimerase pára devido à presença de uma lesão no DNA Esse sistema de reparo será discutido mais adiante ainda nesta aula A recombinação genética homóloga também pode estar envolvida na reorganização dos genes de organismos procarióticos dependendo apenas da entrada de um DNA contendo alelos originados de uma célula diferente O DNA exógeno pode entrar na célula por intermédio de três mecanismos conjugação transformação e transdução Na conjugação ocorre transferência do cromossomo de uma célula doadora para uma célula receptora sendo considerado portanto um processo sexual Na transformação o DNA exógeno seja de células mortas ou de outras procedências entra na célula através da membrana celular Este processo é amplamente usado na engenharia genética como parte da clonagem de genes Na transdução um vírus pode transferir a células receptoras pequenos fragmentos de DNA oriundos de uma célula anteriormente infectada e que foram incorporados ao seu genoma Esses três processos de forma similar ao que ocorre em organismos superiores envolvem troca de DNA homólogo C E D E R J 120 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 121 AULA 15 MÓDULO 2 MODELO DE RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA A recombinação homóloga é um processo bastante complexo com conseqüências moleculares sutis que contribuem para a diversidade genética uma vez que os dois cromossomos que participam da troca de segmentos de DNA não são necessariamente idênticos Lembre se de que a organização linear dos genes pode ser a mesma em dois cromossomos mas que alguns desses genes podem apresentar seqüências de bases distintas o que chamamos alelos diferentes A recombinação homóloga não altera a disposição dos genes mas pode determinar os tipos de alelos que se juntam em um único cromossomo Na Figura 155 você observa este rearranjo dos alelos mais detalhadamente Em um par de cromossomos foram representadas as formas alélicas de três genes Um cromossomo apresenta os alelos x y e z e o outro apresenta os alelos X Y e Z nesta disposição Após a replicação do DNA podese observar um par de homólogos sendo que cada um deles é representado por suas cromátidesirmãs Figura 155a O pareamento desses cromossomos permite a formação da tétrade Figura 155b onde se evidencia o quiasma formado por cromátides nãoirmãs ou seja cada cromátide pertence a um dos homólogos Ao término do crossing over ou recombinação a disposição dos alelos nessas cromátides é alterada Nesse caso uma cromátide apresenta os alelos na seguinte disposição x y e Z enquanto na outra cromátide os alelos estão dispostos como X Y e z Após a segunda divisão meiótica essas cromátides que passam a ser chamadas cromossomos constituirão o material genético de cada gameta C E D E R J 122 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 123 AULA 15 MÓDULO 2 Figura 155 Crossing over e recombinação durante a meiose a Replicação do DNA e formação dos pares de homólogos constituídos cada um por duas cromátidesirmãs b Com o pareamento dos homólogos ocorre a formação da tétrade c Após a recombinação que ocorre antes da primeira divisão meiótica originamse duas cromátides com disposição diferente dos alelos d Após a segunda divisão meiótica cada cromátide passa a ser chamada cromossomo constituindo o material genético dos gametas Os detalhes da recombinação homóloga podem variar de uma espécie para outra mas em geral em qualquer organismo a recombinação pode ocorrer de acordo com o modelo representado na Figura 156 Neste esquema você poderá olhar mais de perto o que ocorre desde a etapa em que os dois homólogos pareiam para formar a tétrade representada nas Figuras 153b e 154 até a troca genética entre eles Na verdade na Figura 156 só estão sendo mostrados os filamentos das cromátides nãoirmãs envolvidas diretamente na recombinação ou seja as cromátides externas não aparecem em nosso modelo C E D E R J 122 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 123 AULA 15 MÓDULO 2 Figura 156 Modelo geral de recombinação homóloga Este modelo consiste em quebra das fitas de cromossomos homólogos a troca b e união c das fitas cortadas migração da junção d dobramento e e rotação f da estrutura que pode ser visualizada por microscopia eletrônica e um segundo corte feito na mesma fita g ou não h o que leva à formação de produtos distintos Maiores detalhes encontramse no texto C E D E R J 124 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 125 AULA 15 MÓDULO 2 O processo conta com a participação de uma maquinaria celular responsável pela quebra na mesma posição relativa de cromátides não irmãs de homólogos Figura 156a seguida de crossing over Figura 156b e de junção dos filamentos cortados em uma disposição diferente de forma que não há perda ou ganho de material em nenhuma das moléculas envolvidas Figura 156c A estrutura formada é denominada INTERMEDIÁRIO DE HOLLIDAY e apresenta um ponto de ramificação chamado JUNÇÃO DE HOLLIDAY Após a migração da junção Figura 156d ocorre dobramento e rotação da estrutura Figuras 156e e 156f que pode ser visualizada por microscopia eletrônica Outros cortes que podem ocorrer nas mesmas fitas ou não separam as cromátides originando nova disposição dos alelos Figuras 156g e 156h A RECOMBINAÇÂO TEM INÍCIO COM A QUEBRA DE DUPLA FITA O modelo geral de recombinação homóloga representado na Figura 156 mostra a ocorrência de quebras sucessivas das fitas simples para que possa haver a troca genética Contudo a troca genética se inicia de fato a partir de uma quebra de dupla fita conforme o esquema da Figura 157 Este modelo também se aplica à recombinação que ocorre durante a meiose uma vez que a troca genética tem início a partir de uma quebra de dupla fita promovida pela ação de exonucleases A formação de DNA heterodúplex que consiste em uma molécula de DNA formada por um filamento de uma das cromátides e um filamento de outra cromátide nãoirmã confira na Figura 155 é uma etapa fundamental nesse processo JUNÇÕES E INTERMEDIÁRIOS DE HOLLIDAY A partir de seus estudos de microscopia eletrônica Robin Holliday em 1964 propôs a existência de estruturas intermediárias durante o processo de recombinação C E D E R J 124 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 125 AULA 15 MÓDULO 2 Figura 157 Modelo de recombinação homóloga com início a partir de quebra de dupla fita A explicação da figura se encontra no texto C E D E R J 126 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 127 AULA 15 MÓDULO 2 A presença de uma quebra de dupla fita em uma das cromátides Figura 157a tem por objetivo criar um ponto a partir do qual as fitas simples possam se desenrolar para participar da troca genética Sob a ação de exonucleases ocorre a conversão da quebra de dupla fita em uma fenda com extensões de fita simples com terminais 3 Figura 157b Isso se deve ao fato de as fitas com terminais 3 serem menos degradadas que aquelas com terminais 5 Um dos filamentos com terminal 3 livre invade uma cromátide nãoirmã pareando com uma região complementar e deslocando uma das fitas Figura 157c O terminal 3 da fita invasora funciona como um iniciador para a DNA polimerase que juntamente com a migração da junção pode gerar uma molécula de DNA com dois crossovers conhecidos por junções de Holliday Figura 156d Nesse estágio observase uma região heterodúplex Por ação da DNA polimerase é feita a substituição do DNA perdido em um dos lados da quebra de dupla fita original seguida de ligação das fitas por ação de DNA ligase Figura 156e Por fim a clivagem dos intermediários de Holliday por nucleases específicas pode gerar dois conjuntos de produtos sendo que apenas um deles conjuntos de produtos 2 contém produtos de recombinação Figura 156f SISTEMA DE REPARO RECOMBINACIONAL Na Aula 13 foram considerados os sistemas de reparo que geralmente atuam somente em lesões no DNA dupla fita com a fita original fornecendo a informação genética para a correção da fita danificada Entretanto em certos tipos de lesões incluindo quebras de dupla fita ligações cruzadas da dupla fita ou lesões em DNA fita simples a fita complementar também se encontra danificada ou mesmo ausente As quebras de DNA dupla fita e as lesões no DNA fita simples surgem na maioria das vezes quando a forquilha de replicação encontra uma lesão de DNA não reparada Tais lesões e ligações cruzadas de DNA podem também resultar da ação de radiação ionizante e reações oxidativas C E D E R J 126 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 127 AULA 15 MÓDULO 2 Em bactéria por exemplo quando a DNA polimerase pára em uma forquilha de replicação e não pode dar prosseguimento ao processo devido a uma lesão uma das opções é ativar o sistema de reparo recombinacional Na ausência de uma segunda fita que sirva de referência para especificar a seqüência de bases a informação necessária para um reparo preciso deve vir de um cromossomo homólogo envolvendo portanto recombinação homóloga Inúmeras enzimas envolvidas na recombinação homóloga têm sido isoladas de organismos procarióticos e eucarióticos Em E coli o complexo enzimático RecBCD apresenta atividades de helicase de nuclease e de ATPase DNAdependente o qual participa do desenrolamento do DNA para gerar regiões de DNA fita simples Já a proteína RecA promove todas as etapas fundamentais do processo incluindo o pareamento dos dois DNAs a formação dos intermediários de Holliday e a migração da junção Nucleases específicas denominadas resolvases atuam na clivagem dos intermediários de Holliday Não abordaremos os modelos propostos para o mecanismo de ação dessas enzimas O mais importante é que você saiba da sua existência e que informações mais detalhadas poderão ser encontradas nos livros sugeridos O reparo de quebra de dupla fita por recombinação homóloga é bastante preciso uma vez que o DNA apresentando a lesão é reparado tendo como referência o seu homólogo Entretanto a junção de terminais nãohomólogos também pode ocorrer por exemplo por causa da existência de lesões nos terminais envolvidos na religação dos segmentos cortados levando à perda de material genético Este tipo de reparo no qual se observa um aumento da taxa de erros é mais freqüente em plantas e animais do que o reparo por recombinação homóloga Você já estudou que com relação a danos causados por exposição à luz UV eucariotos inferiores plantas e bactérias têm sistemas adicionais de defesa tais como DNA fotoliases para monomerizar os dímeros ou DNA glicosilases ou nucleases que especificamente cortam o DNA nos dímeros de pirimidina Mamíferos não possuem enzimas fotorreativadoras para reverter diretamente os danos causados por radiação UV Neste grupo estes danos são corrigidos preferencialmente por reparo recombinacional C E D E R J 128 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 129 AULA 15 MÓDULO 2 RESPOSTA SOS Quando a extensão dos danos do DNA é maior como no caso de a célula ter sido exposta à luz UV de alta intensidade existe uma segunda opção de reparo através do sistema chamado reparo com tendência a erros errorprone repair Quando esta via está ativa o reparo do DNA é significativamente menos preciso resultando em alta taxa de mutação o que justifica o seu nome Esse sistema faz parte de uma resposta celular a danos extensos do DNA chamada apropriadamente resposta SOS Algumas proteínas SOS tais como UvrA e UvrB que normalmente estão presentes na célula são induzidas como parte da resposta SOS Proteínas SOS adicionais participam de uma nova via de error prone repair conhecida por síntese translesão Uma DNA polimerase especializada a DNA polimerase V desconhece a maioria das lesões que normalmente bloqueia a replicação normal Dessa forma parece lógico que o pareamento correto de bases seja praticamente impossível no local da lesão fazendo com que esse processo resulte em uma alta taxa de erros no DNA Por tudo que já foi comentado sobre a importância de se manter a integridade do DNA parece contraditória a existência de um sistema que aumenta a taxa de mutação Contudo devemos pensar que este sistema representa uma estratégia de desespero na qual as células lançam mão de todos os recursos na luta pela sobrevivência É certo que as mutações resultantes podem provocar a morte de inúmeras células mas este é o preço biológico que as células pagam para superar uma condição indesejada Acreditamos que elas apostam no fato de que pelo menos algumas poucas células mutantes possam sobreviver Muitas doenças hereditárias que determinam predisposição ao câncer têm em sua origem defeitos na capacidade de reparo do DNA C E D E R J 128 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 129 AULA 15 MÓDULO 2 Nesta aula você aprendeu que o rearranjo da informação genética em uma ou mesmo entre duas moléculas de DNA é chamado recombinação genética Esse processo diferentemente da mutação favorece a geração de novas combinações dos alelos já existentes Existem pelo menos quatro classes principais de recombinação genética a recombinação homóloga a recombinação nãohomóloga a recombinação sítio específica e a transposição de DNA Além disso os sistemas de recombinação desempenham diversas funções biológicas importantes Em eucariotos a recombinação homóloga está geralmente associada à divisão celular enquanto em procariotos sua principal função é atuar no reparo de DNA Em linhas gerais consiste em quebra das fitas de cromossomos homólogos troca e união das fitas cortadas migração da junção e dobramento rotação e um segundo corte da estrutura de Holliday podendo formar dois conjuntos distintos de produtos de acordo com o sítio de corte Os danos mais complexos e raros de DNA só podem ser corrigidos por processos celulares não tão específicos como os já mencionados na Aula 13 e por isso predispõem o DNA a erros Um grande desafio consiste em reparo de lesões que bloqueiam a maquinaria normal de replicação Nesses casos DNA polimerases especializadas conseguem passar pela lesão mas à custa de inserção na maioria das vezes de bases incorrretas R E S U M O C E D E R J 130 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 131 AULA 15 MÓDULO 2 EXERCÍCIOS 1 Nas últimas aulas discutimos bastante sobre a importância da variabilidade genética para uma espécie Responda a A variabilidade genética é benéfica ou prejudicial Explique b De acordo com a resposta do item a discuta por que uma célula se empenha em assegurar a fidelidade da replicação do DNA 2 Como você diferencia a a recombinação recíproca da recombinação nãorecíproca b a recombinação intramolecular que envolve repetições diretas daquela que envolve repetições invertidas 3 Vamos imaginar que uma linhagem de E coli se caracterize pela ausência do seu sítio att O que você teria a dizer sobre a infecção de uma célula dessa linhagem pelo bacteriófago λ 4 Desenhe a estrutura denominada tétrade indicando as cromátidesirmãs e nãoirmãs os homólogos pares de homólogos e centrômeros 5 Compare os esquemas representados a seguir indicando qual deles envolveu crossing over Complete então os esquemas com as etapas intermediárias detalhando cada uma delas 6 Como você explica a existência dos sistemas de reparo errorprone C E D E R J 130 Biologia Molecular Recombinação C E D E R J 131 AULA 15 MÓDULO 2 AUTOAVALIAÇÃO Você deve ter percebido que as Aulas 13 e 15 se complementam e que o conteúdo é demasiadamente grande para apenas duas aulas Os exercícios específicos desta aula têm por objetivo avaliar o quanto você aprendeu do tema em questão Assim não entre em pânico se encontrar dificuldades para resolvêlos Retorne à Aula 13 releia a Aula 15 e recorra aos tutores que estarão sempre nos pólos dispostos a ajudar você FIQUE ATENTO O tema das próximas duas aulas é transposição Até lá PROHIBIDAS LA RECOLECTA Y EL CONSUMO DE FRUTOS SILVESTRES Estudo dirigido Atividade presencial obrigatória Engenharia genética mitos e realidades 1617 A U L A S b Todas las anteriores Question 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Elementos de transposição em procariotos Ao final desta aula você deverá ser capaz de Aprender sobre os segmentos de DNA que apresentam a capacidade de se mover dentro do genoma de um organismo um mecanismo chamado transposição no qual os segmentos de DNA envolvidos recebem o nome de elementos de transposição ou simplesmente transposons Compreender como o mecanismo de transposição ocorre em procariotos Entender o mecanismo de recombinação visto na Aula 15 objetivos 18 A U L A Prérequisitos C E D E R J 136 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 137 AULA 18 MÓDULO 2 Nas aulas anteriores você teve a oportunidade de estudar que segmentos de uma molécula de DNA podem ser trocados num mecanismo chamado recombinação e que esse mecanismo leva a uma maior variabilidade dos organismos pois combinações diferentes de seqüências de DNA podem ser formadas resultando em produtos gênicos diferentes Pois muito bem as novidades não param por aí Hoje você terá a oportunidade de conhecer um outro mecanismo que também pode gerar variabilidade e tem muitas implicações evolutivas Vamos ver como essa história começou Durante as décadas de 1940 e 1950 uma pesquisadora norteamericana chamada BARBARA MCCLINTOCK utilizava a planta de milho como seu objeto de estudos de genética Ela fazia cruzamentos e observava o comportamento das características nas gerações seguintes A essa altura você já deve ter estudado em Genética Básica como são feitos os experimentos para estudar a herança dos caracteres Caso você ainda não tenha visto esse conteúdo você pode consultar um livro do Ensino Médio que traga algumas informações sobre esse assunto Barbara McClintock utilizava a microscopia para associar os seus resultados fenotípicos obtidos nos cruzamentos a possíveis alterações detectáveis na estrutura dos cromossomos McClintock sugeriu a existência de elementos no genoma do milho que se moviam de uma localidade para outra provocando modificações Dentre elas a quebra de cromossomos e conseqüente perda de pedaços dos mesmos gerando assim alterações fenotípicas detectáveis Naquela época não existiam as técnicas de biologia molecular que permitissem o seqüenciamento do DNA e a caracterização desses elementos O trabalho de McClintock ficou desacreditado durante anos pois os demais geneticistas não aceitaram que o genoma pudesse apresentar qualquer mobilidade muito menos do tipo sugerido por Barbara Somente nas décadas de 1960 e 1970 com o avanço das técnicas que permitiram analisar os genes ao nível molecular o trabalho de McClintock foi reconhecido Em 1983 ela recebeu o Prêmio Nobel pela sua contribuição à ciência através do estudo dos elementos de transposição INTRODUÇÃO BARBARA MCCLINTOCK 16071902 02091992 Geneticista norte americana que descreveu os elementos de transposição em milho C E D E R J 136 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 137 AULA 18 MÓDULO 2 Na próxima aula você poderá entender o modelo descrito por Barbara McClintock em milho mas primeiro nós vamos estudar como esses elementos foram descobertos em bactérias fato crucial que tornou aceitável a hipótese de segmentos do DNA que apresentam a capacidade de se mover dentro do genoma de um organismo Então para você ficar antenado precisa ter em mente que um elemento de transposição ou simplesmente transposon é o nome que se dá a uma seqüência de DNA que tem a capacidade de se mover no genoma de uma localidade para outra Nesta aula você terá a oportunidade de conhecer os diferentes tipos de transposons encontrados em bactérias e na próxima aula os transposons encontrados em eucariotos ELEMENTOS DE TRANSPOSIÇÃO EM BACTÉRIAS Os transposons em bactérias foram os primeiros a serem descritos molecularmente Eles são divididos em três tipos principais as Seqüências de Inserção IS os transposons compostos e os elementos TnA A seguir vamos analisar cada um deles ELEMENTOS IS Os elementos IS do inglês Insertion Sequence que significa Seqüência de Inserção são os tipos mais simples de transposons Eles receberam esse nome por serem capazes de se inserir em muitos locais diferentes no cromossomo e plasmídios da Escherichia coli Você deve estar se perguntando De que maneira podese saber que houve uma inserção de um segmento de DNA do tipo transposon Muito bem a melhor forma de se descobrir uma alteração genética é através da utilização de mutantes Nós já falamos sobre a importância do uso de mutantes para o estudo da função de muitas proteínas no processo de replicação você está lembrado Você também já aprendeu nas aulas anteriores de que maneira pode ocorrer uma mutação em um indivíduo Mas só para relembrar os mutantes são indivíduos que sofreram alguma alteração no seu material genético Como as bactérias são organismos que apresentam um genoma pequeno a maioria das alterações genéticas resulta em alterações fenotípicas pois existe uma grande possibilidade de a mutação atingir uma região ativa do genoma C E D E R J 138 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 139 AULA 18 MÓDULO 2 Assim quando ocorre uma alteração fenotípica por exemplo perda de uma atividade enzimática é possível descobrir o gene que sofreu a alteração e muitas vezes onde ocorreu e qual o tipo de mutação Dessa forma a existência de mutantes foi utilizada para o isolamento dos elementos de transposição em bactérias Os pesquisadores observaram que alguns mutantes lac mutação que impede a utilização de lactose como fonte de carbono pela bactéria apresentavam uma capacidade anormal de reverter para o tipo selvagem ou seja uma outra mutação fazia com que os mutantes lac recuperassem o genótipo lac capaz de utilizar lactose como fonte de carbono A análise molecular revelou que os mutantes lac apresentavam DNA extra dentro ou próximo ao gene lac quando comparado àqueles que haviam revertido a mutação Nesse último caso o DNA extra havia sido perdido Concluiuse que a mutação era causada por um elemento que apresentava a capacidade de sair do genoma ou seja móvel ESTRUTURA DOS ELEMENTOS IS Os elementos IS são formados por cerca de 2500 pares de nucleotídeos e contêm somente genes cujos produtos estão envolvidos no próprio mecanismo de transposição Cada elemento é representado por IS acompanhado de um número IS1 IS50 IS509 etc Observe a Figura 181 e acompanhe a explicação que se segue Figura 181 Estrutura de um elemento de inserção O transposon apresenta repetições terminais invertidas e gera repetições diretas no sítioalvo No exemplo o alvo é uma seqüência de 5 pares de nucleotídeos As extremidades estão representadas pelos números de 1 a 9 Cada número simboliza um nucleotídeo e ilustra o significado de repetições invertidas A região entre as repetições codifica a transposase enzima necessária para a ocorrência da transposição C E D E R J 138 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 139 AULA 18 MÓDULO 2 Os elementos IS apresentam uma pequena região idêntica ou quase idêntica nas suas extremidades Essas regiões estão sempre dispostas em orientação invertida e por isso são chamadas repetições terminais invertidas O tamanho dessas regiões varia de 9 a 40 nucleotídeos A importância dessas regiões terminais no mecanismo de transposição foi determinada através de estudos nos quais a modificação ou eliminação dessas regiões abolia a capacidade do elemento de se transpor Os elementos IS codificam para uma enzima chamada transposase que é necessária à transposição Essa proteína se liga às extremidades do transposon e corta as duas fitas O corte do DNA nesses locais retira o elemento do cromossomo ou plasmídio tornandoo livre para ser inserido em uma outra posição na mesma ou em outra molécula de DNA Quando um elemento IS é inserido em cromossomos ou em plasmídios uma duplicação de parte da seqüência do DNA é criada no local de inserção Uma cópia da duplicação está localizada em cada extremidade do elemento Observe a Figura 182 e você compreenderá melhor por que isso ocorre Figura 182 Produção da duplicação do sítioalvo pelo elemento de inserção IS a As duas fitas do DNA são cortadas em locais diferentes indicados pelas setas b O elemento IS é inserido na fenda criada pelo corte não linear do DNAalvo c A síntese do DNA preenche a fenda de cada um dos lados do elemento IS produzindo uma duplicação direta do sítioalvo C E D E R J 140 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 141 AULA 18 MÓDULO 2 Essas seqüências repetidas contendo de 2 a 13 nucleotídeos são chamadas duplicação do sítioalvo e são formadas em função do preenchimento da fenda gerada pela quebra não homogênea da molécula dupla fita de DNA O cromossomo bacteriano pode conter várias cópias de um tipo particular de elemento IS Por exemplo para o elemento IS1 são encontradas de 6 a 10 cópias TRANSPOSONS COMPOSTOS Os transposons compostos são representados pelo símbolo Tn seguido por um número Esses transposons são formados quando dois elementos IS se inserem próximos um do outro A região entre eles também é transposta pela ação conjunta das regiões localizadas nas extremidades de cada um dos elementos A orientação dos elementos IS pode variar nos diferentes transposons compostos Observe a Figura 183 e acompanhe a explicação que se segue C E D E R J 140 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 141 AULA 18 MÓDULO 2 Figura 183 Organização dos transposons compostos a O Tn9 é formado por dois elementos IS1 dispostos na mesma orientação Entre os dois elementos IS1 está o gene camR que confere resistência ao antibiótico cloranfenicol b O Tn5 é formado por dois elementos IS50 dispostos em orientação invertida Entre os dois elementos estão os genes kanR bleR e strR que conferem resistência aos antibióticos canamicina bleomicina e estreptomicina respectivamente c O Tn9 é formado por dois elementos IS10 dispostos em orientação oposta Entre os dois elementos está o gene tetR que confere resistência ao antibiótico tetraciclina No transposon Tn9 os elementos IS estão na mesma orientação Já no Tn5 e no Tn10 a orientação é invertida A região entre os elementos IS não está envolvida com a transposição Nesses três transposons a região central codifica genes que conferem resistência a antibióticos No Tn9 resistência ao cloranfenicol no Tn5 resistência à canamicina à bleomicina e à estreptomicina No Tn10 resistência à tetraciclina C E D E R J 142 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 143 AULA 18 MÓDULO 2 A essa altura você pode estar pensando Os transposons compostos são elementos capazes de se mover no genoma e esses transposons carregam genes de resistência a antibióticos Então esses genes de resistência podem passar de um cromossomo para um plasmídio e do plasmídio para um outro cromossomo e quem sabe até de uma bactéria para outra Se você pensou isso pensou de maneira correta e na verdade essa situação é um grande problema para o tratamento de infecções bacterianas com antibióticos As bactérias apresentam a capacidade de transferir DNA plasmidial de uma célula para outra através de um mecanismo conhecido como conjugação Você aprenderá sobre conjugação na disciplina Genética Básica Assim se um transposon composto carregando os genes de resistência a antibióticos ocorrer em um plasmídio que será transferido durante a conjugação a resistência ao antibiótico será transferida para a outra célula O mais curioso é que a conjugação pode ocorrer entre espécies diferentes de bactérias tornando assim o mecanismo de transmissão da resistência extremamente versátil Você já deve ter ouvido falar que não se deve fazer uso indiscriminado de antibióticos pois existe a possibilidade de seleção de bactérias resistentes Muito bem aí está a explicação Uma única célula que sobreviva na presença do antibiótico é capaz de transmitir para os seus descendentes essa resistência numa velocidade incrível uma vez que as bactérias se dividem com muita rapidez e o que é pior pode transferir para outras bactérias essa resistência também Algumas bactérias apresentam resistência a drogas múltiplas pois foram adquirindo os genes de resistência de outros organismos Um exemplo bem próximo é o caso da bactéria Staphylococcus que se apresenta como a grande vilã das famosas infecções hospitalares Essas bactérias apresentam resistência a muitas drogas e são muito difíceis de serem destruídas Dá para entender por que elas ocorrem em hospitais embora isso não devesse acontecer Nos hospitais existe um grande número de pacientes com diferentes tipos de infecções e uma ampla utilização de antibióticos Se o organismo do paciente estiver debilitado devido a uma intervenção cirúrgica por exemplo tornase um alvo fácil de infecção por essa bactéria dura de matar C E D E R J 142 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 143 AULA 18 MÓDULO 2 Mas vamos voltar ao assunto dos transposons compostos Algumas vezes os elementos IS em um transposon composto não são idênticos No Tn5 o elemento da direita chamado IS50R R de right no inglês direita é capaz de produzir uma transposase que estimula a transposição Já o elemento da esquerda IS50L L de left no inglês esquerda não é funcional A diferença se deve a um único par de nucleotídeos diferente que impede a produção de uma transposase funcional pelo IS50L Nesse ponto temos de refletir sobre um aspecto importante Será que os transposons ficam saltando de um lugar para outro do genoma de maneira indiscriminada ou existe um controle do mecanismo para limitar sua ação Para o transposon Tn5 foi demonstrado que existe regulação sim Vejamos como isso foi descoberto Quando uma bactéria é infectada com um fago que contém o transposon Tn5 a freqüência de transposição será reduzida se a célula infectada já possuir uma cópia do Tn5 Essa redução indica que o transposon já existente no cromossomo inibe a transposição de um outro transposon possivelmente através da síntese de um repressor Os pesquisadores demonstraram que o elemento IS50R produz duas proteínas Uma delas é a transposase normal que efetua a transposição e uma outra é a transposase truncada ou seja menor do que a original criada a partir da tradução iniciada em um segundo códon de iniciação presente dentro do gene da transposase que inibe a transposição A proteína menor é geralmente mais abundante que a proteína maior funcional dessa forma a transposição do Tn5 tende a ser reprimida Esse mecanismo é mesmo incrível você não acha Ele impede que um grande número de transposons se insiram no genoma e com isso coloque em risco a sobrevivência da célula através do acúmulo de mutações C E D E R J 144 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 145 AULA 18 MÓDULO 2 ELEMENTOS TNA Os transposons TnA não possuem elementos IS nas suas extremidades Em vez disso apresentam repetições invertidas simples de 38 a 40 pares de nucleotídeos Os elementos TnA também produzem duplicação no sítioalvo quando são inseridos no DNA O melhor exemplo de elemento TnA já caracterizado é o elemento Tn3 Observe a Figura 184 que apresenta os componentes do elemento Tn3 Figura 184 Organização do elemento Tn3 O tamanho das seqüências é dado em pares de nucleotídeos O tnpA é o gene que codifica a transposase o tnpR é o gene que codifica a resolvase e o bla é o gene que codifica a enzima βlactamase que confere resistência ao antibiótico ampicilina O transposon Tn3 apresenta três genes o tnpA tnpR e bla que codificam para as proteínas transposase resolvaserepressora e uma enzima chamada βlactamase respectivamente Essa última proteína confere resistência ao antibiótico ampicilina Observe a Figura 185 que descreve a transposição do elemento Tn3 e acompanhe a explicação que se segue C E D E R J 144 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 145 AULA 18 MÓDULO 2 Figura 185 Transposição do elemento Tn3 através da formação de um cointegrado a A transposase codificada pelo tnpA catalisa a formação de um cointegrado entre o plasmídio doador e o plasmídio receptor Durante esse processo o Tn3 é replicado de modo que uma cópia do elemento é formada em cada junção do cointegrado b A resolvase codificada pelo gene tnpR separa o cointegrado promovendo a recombinação entre os dois elementos Tn3 c Os plasmídios doador e receptor separados cada um contendo uma cópia do Tn3 C E D E R J 146 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 147 AULA 18 MÓDULO 2 A transposição do elemento Tn3 ocorre em duas etapas A transposase promove a fusão de duas moléculas formando uma estrutura conhecida como cointegrado Durante a formação dessa estrutura o transposon é duplicado e uma cópia é inserida em cada junção no cointegrado Os dois elementos Tn3 estão orientados na mesma direção Na segunda etapa da transposição a resolvase promove uma recombinação sítio específica entre os dois elementos Tn3 Você pode rever como ocorre esse tipo de recombinação na Aula 16 Esse evento ocorre em uma seqüência do Tn3 chamada res ou sítio de resolução gerando duas moléculas cada uma contendo uma cópia do transposon O produto do gene tnpR apresenta ainda uma outra função Ele reprime a síntese da transposase e da resolvase A repressão ocorre porque o sítio res está localizado entre os genes tnpA e tnpR Ao se ligar a esse sítio a proteína TnpR interfere na transcrição dos dois genes Assim o elemento Tn3 permanece imóvel De um modo geral os mecanismos através dos quais os transposons se movem podem ser divididos em dois tipos descritos a seguir 1 Transposição replicativa ocorre quando o elemento é duplicado durante a reação A região transposta é uma cópia do elemento original O transposon é copiado como parte do seu movimento Uma cópia permanece no sítio original enquanto a outra se insere no novo sítio A transposição replicativa envolve dois tipos de atividade enzimática uma transposase que atua na extremidade do transposon original e uma resolvase que atua nas cópias duplicadas Esse é o caso do elemento Tn3 que você acabou de estudar no tópico anterior Um outro exemplo de transposição replicativa é observado no fago Mu Você vai encontrar um esquema do mecanismo na Figura 186 seguida pela explicação do mesmo C E D E R J 146 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 147 AULA 18 MÓDULO 2 Figura 186 A transposição do fago Mu gera uma estrutura de cruz que é convertida em um cointegrado a partir da replicação C E D E R J 148 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 149 AULA 18 MÓDULO 2 O processo se inicia com a formação de um complexo de transferência da fita algumas vezes chamado complexo crossover que significa cruz As fitas doadora e alvo são ligadas de modo que cada extremidade da seqüência do transposon é unida a uma das fitas simples geradas pela quebra no sítioalvo O complexo de transferência forma uma estrutura em forma de cruz unida ao transposon duplo Essa estrutura de cruz possui uma região simples fita em cada extremidade Essas regiões funcionam como forquilhas de replicação as quais fornecem um molde para a replicação do DNA que usará o OH livre proveniente da quebra das fitas Se a replicação ocorrer em ambas as extremidades ela passará pelo transposon separando as duas fitas e terminará nas suas extremidades Após a replicação essa estrutura terá formado um cointegrado contendo as repetições diretas do transposon na junção entre os replicons 2 Transposição não replicativa ocorre quando o elemento de transposição se move como uma entidade física diretamente de um local para outro Isso ocorre através de dois mecanismos Um mecanismo utiliza a conexão das seqüências do doador e do DNAalvo e apresenta alguns passos que são semelhantes à transposição replicativa mostrada na Figura 186 formando a estrutura de cruz A quebra e a união das fitas permite que o alvo seja reconstruído enquanto as fitas do doador continuam quebradas Nesse caso não existe a formação de um cointegrado A Figura 187 ilustra o mecanismo de transposição não replicativa que também é utilizado pelo fago Mu Uma vez que as fitas doadoras tenham sido cortadas as fitasalvo podem ser ligadas ao transposon As fitas simples geradas pelo corte devem ser preenchidas pelo mecanismo de reparo você já estudou o mecanismo de reparo na Aula 12 caso não esteja lembrado dê uma olhada no conteúdo daquela aula O produto dessa reação é um repliconalvo no qual o transposon foi inserido entre as seqüências repetidas criadas pelos cortes na fita simples original O replicon doador possui uma quebra na duplafita no local onde o transposon estava originalmente localizado C E D E R J 148 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 149 AULA 18 MÓDULO 2 Figura 187 A transposição não replicativa ocorre quando a estrutura de cruz é rompida por um corte na molécula Isso insere o transposon no DNA cercado pelas repetições diretas do alvo e o doador é deixado com uma quebra na duplafita Os elementos IS e os elementos compostos Tn10 e Tn5 utilizam um segundo mecanismo que é mostrado na Figura 188 Esse mecanismo envolve a liberação do transposon do DNA doador durante a transferência Esse tipo de mecanismo requer somente uma transposase Ambos os mecanismos resultam na inserção de um elemento no sítioalvo e a perda do elemento no sítio doador O que acontece com a molécula doadora Sua sobrevivência requer que o sistema de reparo reconheça a quebra na duplafita e a conserte C E D E R J 150 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 151 AULA 18 MÓDULO 2 Figura 188 Ambas as fitas do Tn10 são clivadas seqüencial mente e então o transposon é ligado ao sítioalvo que foi clivado Alguns transposons utilizam somente um tipo de mecanismo de transposição enquanto outros podem utilizar mais de um Os elementos IS1 e IS903 bem como o fago Mu utilizam o mecanismo replicativo e o mecanismo não replicativo As mesmas reações são utilizadas em todas as classes de transposons As extremidades são desconectadas do DNA doador pela quebra que gera extremidades 3 OH livres As extremidades expostas são unidas ao DNAalvo por reações de transferência envolvendo transesterificação na qual o 3 OH ataca diretamente o DNAalvo Essas reações ocorrem dentro de um complexo nucleoprotéico que contém as enzimas necessárias e as duas extremidades do transposon A escolha do DNAalvo é feita pela transposase podendo ser aleatória ou apresentar especificidade para uma determinada seqüência conservada ou então apresentar especificidade por uma estrutura secundária presente no DNA por exemplo o superespiralamento ou a existência de dobras na molécula C E D E R J 150 Biologia Molecular Elementos de transposição em procariotos C E D E R J 151 AULA 18 MÓDULO 2 Nesta aula você teve a oportunidade de aprender que o genoma dos organismos não é estático ou seja existem algumas regiões que apresentam mobilidade Essas regiões do DNA chamadas elementos de transposição ou transposons foram primeiramente descritas em milho por Barbara McClintock Porém a sua funcionalidade só foi aceita após a comprovação da sua existência em bactérias As bactérias apresentam vários tipos de transposons que são divididos em três grupos elementos IS Seqüência de Inserção transposons compostos e TnA Os transposons se movem através da atividade de uma enzima chamada transposase que é codificada pelo próprio transposon A transposição pode ser replicativa quando uma cópia do transposon é mantida no sítio doador e uma outra cópia é gerada no sítioalvo ou não replicativa quando o transposon é retirado do sítio doador e inserido no sítioalvo R E S U M O EXERCÍCIOS 1 O que caracteriza um elemento de transposição IS 2 O que é um transposon composto 3 Por que o TnA pertence a uma classe diferente de transposons 4 Qual a diferença entre transposição replicativa e não replicativa AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu bem o conteúdo da aula não deve ter encontrado dificuldades para responder aos exercícios Todas as respostas estão contidas na aula Gostaríamos que você exercitasse a sua imaginação para compreender a importância e as implicações da existência desses mecanismos com os quais você acabou de ter contato Na próxima aula você vai saber um pouco mais sobre os transposons que ocorrem em eucariotos e vamos falar alguma coisa sobre a importância evolutiva desses DNAs saltadores Bom estudo e até lá Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos Ao final desta aula você deverá ser capaz de Continuar o estudo dos elementos de transposição dando ênfase aos transposons encontrados em eucariotos Estudo dos conceitos apresentados na Aula 18 objetivo 19 A U L A Prérequisitos C E D E R J 154 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 155 AULA 19 MÓDULO 2 Conforme vimos na aula anterior existem regiões do DNA que apresentam a capacidade de se mover no genoma e são chamadas transposons Na aula de hoje você terá a oportunidade de conhecer alguns dos elementos descritos em eucariotos inclusive em humanos Vamos iniciar falando sobre os elementos encontrados no milho que como já foi dito na aula anterior foram os primeiros transposons descritos Em seguida vamos falar sobre os transposons da mosca de fruta Drosophila melanogaster e vamos terminar estudando um tipo especial de transposon conhecido como retrotransposon e que é encontrado em leveduras moscas plantas e animais incluindo os humanos ELEMENTOS AC E DS DE MILHO Os elementos Ac e Ds de milho foram descritos no trabalho pioneiro de Barbara McClintock que você teve a oportunidade de conhecer no início da nossa aula anterior Através de análise genética ela demonstrou que esses elementos são responsáveis pelo aparecimento de listras e pontos roxoamarronzados em sementes de milho que normalmente são amarelas Muitos anos mais tarde Nina Dederoff Joachim Messing Peter Starlinger Heins Saedler Susan Wessler e seus colaboradores isolaram os elementos e determinaram a sua estrutura molecular McClintock descobriu os elementos Ac e Ds durante seus estudos nos quais a quebra de um cromossomo estava associada a um MARCADOR GENÉTICO que controlava a pigmentação da semente de milho Quando um marcador era perdido ou seja o fenótipo não era mais percebido ela pôde observar que o segmento do cromossomo no qual o marcador estava localizado também havia sido perdido devido à ocorrência de uma quebra no cromossomo Como conseqüência a alteração na coloração do aleurona a camada mais externa do endosperma triplóide do milho indicava a perda do gene responsável pela característica ou seja a perda do marcador genético Um dos marcadores utilizados por McClintock foi um alelo do locus C situado no braço curto do cromossomo 9 O alelo C é um inibidor dominante da coloração do aleurona Assim qualquer indivíduo que o possua não contém pigmentos INTRODUÇÃO MARCADOR GENÉTICO Pode ser um gene ou um segmento de DNA associado a uma determinada característica fenotípica Essa característica é utilizada para acompanhar o comportamento do marcador nas gerações seguintes após a realização de cruzamentos C E D E R J 154 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 155 AULA 19 MÓDULO 2 McClintock fertilizou plantas CC com pólen de plantas CC produzindo sementes com endosperma CCC Lembrese de que o endosperma triplóide recebe dois alelos da mãe e um alelo do pai A maioria das sementes obtidas era amarela o que indicava ausência de pigmentação No entanto algumas sementes apresentaram regiões contendo o pigmento roxoamarronzado formando um mosaico com setores não pigmentados e setores pigmentados McClintock sugeriu que nesses mosaicos o alelo C inibidor havia sido perdido durante a formação do endosperma formando um clone de tecido que era capaz de sintetizar o pigmento O genótipo desse clone é CC no qual o traço representa o alelo C perdido O mecanismo que McClintock propôs está explicado na Figura 191 Observe a figura e acompanhe a explicação que se segue C E D E R J 156 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 157 AULA 19 MÓDULO 2 Figura 191 Quebra no cromossomo causada pelo elemento de transposição Ds em milho O alelo C no braço curto do cromossomo 9 produz pigmentação normal no aleurona O alelo C inibe a pigmentação a Dois cromossomos maternos e um cromossomo paterno se unem para formar o endosperma triplóide b A quebra ocorre no local onde existe um elemento Ds c O fragmento do cromossomo que carrega o alelo inibidor da pigmentação é perdido formando um clone de células pigmentadas C E D E R J 156 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 157 AULA 19 MÓDULO 2 Uma quebra no local marcado por uma seta faz com que um segmento do cromossomo se desprenda do seu centrômero criando um fragmento acêntrico Esse fragmento tende a se perder durante a divisão celular de modo que todos os descendentes dessa célula não possuirão essa parte do cromossomo do pai formando um clone Uma vez que o fragmento perdido contém o alelo inibidor C todas as células desse clone serão pigmentadas Se qualquer uma delas produzir uma parte do aleurona um pedaço colorido aparecerá criando um mosaico semelhante ao mostrado na Figura 192 Figura 192 Semente de milho mostrando a perda do alelo C que inibe a pigmentação do aleurona Os setores pigmentados são CC enquanto os setores não pigmen tados são CCC McClintock descobriu que nessas sementes com mosaicos havia ocorrido uma quebra em um local específico no cromossomo 9 Ela chamou fator Ds esse local que produziu a quebra simbolizando dissociação No entanto sozinho esse fator é incapaz de produzir a quebra no cromossomo sendo necessária a estimulação por um outro fator chamado Ac que seria o ativador inglês Activator O fator Ac estava presente em algumas linhagens de milho mas ausente em outras Quando diferentes linhagens são cruzadas Ac pode ser combinado com Ds criando uma condição que leva à quebra do cromossomo O sistema AcDs era a explicação para os resultados obtidos por McClintock Além desse resultado ela também observou outras instabilidades no genoma do milho associadas ao sistema AcDs Assim ela propôs que os elementos Ds poderiam existir em muitos locais diferentes no genoma e que eles poderiam se mover de um local para outro desde que ativados pelo Ac Os elementos Ac e Ds pertencem a uma família de transposons Eles estão relacionados um ao outro e podem se inserir em muitos locais nos cromossomos Muitas cópias dos elementos Ac e Ds são encontradas no genoma do milho C E D E R J 158 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 159 AULA 19 MÓDULO 2 Quando um desses elementos se insere perto ou dentro de um gene a função do mesmo pode ser alterada ou inibida Você pode estar se perguntando Como esses elementos funcionam molecularmente Observe a Figura 193 e acompanhe a explicação que se segue Figura 193 Organização estrutural dos elementos de transposição pertencentes à família AcDs de milho As repetições terminais invertidas estão indicadas pelas setas Os tamanhos das seqüências de DNA estão indicados em pares de nucleotídeos pn C E D E R J 158 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 159 AULA 19 MÓDULO 2 O seqüenciamento do elemento Ac revelou que ele consiste em 4563 pares de nucleotídeos cercados por repetições invertidas de 11 nucleotídeos Cada elemento Ac também é cercado por repetições diretas de 8 pares de nucleotídeos As repetições diretas são criadas no momento em que o elemento é inserido no cromossomo sendo assim uma duplicação do sítioalvo e não uma parte integral do elemento semelhantes àquelas descritas para os elementos de bactéria e que você estudou na aula anterior Os elementos Ds são mais heterogêneos que os elementos Ac Eles também possuem repetições terminais invertidas como o elemento Ac mas a sua seqüência interna varia bastante É provável que os elementos Ds tenham derivado dos elementos Ac a partir da perda de seqüências internas Somente o elemento Ac codifica para uma transposase funcional Assim a mobilidade dos elementos AcDs é promovida pela transposase codificada pelo elemento Ac A transposase interage com as seqüências dos elementos Ac e Ds catalisando seu movimento Os elementos Ds uma vez que não produzem transposases são dependentes da transposase produzida pelo elemento Ac ELEMENTOS P E DISGÊNESE DO HÍBRIDO EM DROSOPHILA A maior parte da pesquisa feita com transposons de eucariotos enfocou os elementos P de Drosophila Na década de 1970 descobriu se que o cruzamento entre algumas linhagens de Drosophila produzia híbridos com uma série de características aberrantes incluindo alta taxa de mutação quebra nos cromossomos e esterilidade O termo disgênese do híbrido deriva do grego e significa deterioração da qualidade As linhagens de mosca foram classificadas em dois grupos de acordo com a sua capacidade de produzir disgênese do híbrido chamadas M e P Somente cruzamentos entre M e P produzem disgênese do híbrido e somente quando o macho pertence à linhagem P A Figura 194 ilustra o que foi observado Os pesquisadores sugeriram que os cromossomos da linhagem P carregam fatores que são ativados quando eles penetram em ovos produzidos por fêmeas M e uma vez ativados esses fatores induzem mutações e quebra nos cromossomos C E D E R J 160 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 161 AULA 19 MÓDULO 2 Figura 194 A disgênese do híbrido é induzida em cruzamentos entre machos P e fêmeas M mas não em cru zamentos entre machos M e fêmeas P C E D E R J 160 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 161 AULA 19 MÓDULO 2 Michael Simmons e Johng Lim descobriram uma mutação no gene white branco induzida por disgênese do híbrido Isso permitiu testar a hipótese de serem os transposons os responsáveis por essa mutação Em 1980 os dois pesquisadores enviaram o novo mutante do gene white para Paul Binghom e Gerald Rubins que haviam acabado de seqüenciar o DNA do gene white Usando esse DNA como SONDA eles foram capazes de comparar o DNA do mutante com o gene normal Em cada mutante eles descobriram um pequeno elemento que havia sido inserido na região codificadora do gene ou seja a região que produzirá o RNA mensageiro e que servirá de molde para a síntese da proteína Posteriormente foi demonstrado que esse elemento está presente muitas vezes no genoma da linhagem P No entanto está ausente na linhagem M A partir daí esses elementos foram chamados elementos P pois são específicos da linhagem P Os elementos P variam no tamanho A estrutura dos elementos P está ilustrada na Figura 195 Figura 195 Estrutura dos elementos P de Drosophila As orientações estão repre sentadas por setas Os tamanhos das seqüências de DNA estão indicados em pares de nucleotídeos pn SONDA É um segmento de DNA marcado radioativamente e que pode ser utilizado para localizar seqüências de DNA homólogas através da técnica de hibridação do DNA O DNA investigado é geralmente fixado a uma membrana de nylon ou nitrocelulose na forma de fita simples A sonda também fita simples é colocada em contato com a membrana e formará uma molécula híbrida quando encontrar uma molécula que possua uma seqüência complementar homóloga à sonda Posteriormente a região híbrida pode ser revelada através de autoradiografia que consiste na exposição do material em estudo no caso uma membrana a um filme plástico contendo uma película gelatinosa formada por cristais de prata brometo de prata A energia das partículas radioativas presentes na membrana convertem alguns íons dos cristais de prata em átomos de prata que na presença de uma solução reveladora convertem os cristais em prata metálica Esta precipita no filme produzindo uma imagem escura Assim é possível identificar o material radioativo nesse caso o DNA híbrido contendo uma das fitas radioativas C E D E R J 162 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 163 AULA 19 MÓDULO 2 Os maiores elementos contêm 2907 pares de nucleotídeos com inversões terminais repetidas de 31 pares de nucleotídeos Esses elementos P completos carregam um gene que codifica uma transposase Quando a transposase P se liga perto das extremidades de um elemento P completo ela pode mover aquele elemento para uma outra localização no genoma Elementos P incompletos não produzem a transposase porque algumas seqüências internas foram deletadas Entretanto eles possuem as seqüências terminais o que significa que uma transposase de um outro elemento pode agir sobre essas repetições e mover o elemento Um fato interessante é que os descendentes de moscas obtidos em laboratório que foram coletadas antes de 1950 não possuem elementos P sugerindo que os mesmos invadiram populações de Drosophila recentemente provavelmente através de um vírus natural As populações de Drosophila regulam o movimento dos elementos P Essa regulação depende do citotipo uma condição celular que é transmitida maternalmente através do citoplasma do ovo O citotipo P reprime os elementos P e o citotipo M permite o movimento O citotipo P é característico de linhagens que carregam o elemento P Já o citotipo M é característico de linhagens que não apresentam os elementos P Quando o citotipo M é combinado com os elementos P através de cruzamento a transposição ocorre A natureza celular do citotipo é desconhecida Os pesquisadores demonstraram que a transposição só ocorre em células germinativas Em tecidos somáticos nos quais os elementos P poderiam causar sérios danos ao indivíduo a transposase não é sintetizada RETROTRANSPOSON Além dos transposons tais como AcDs e P os genomas eucarióticos contêm elementos cujo movimento se dá através da transcrição reversa do RNA em DNA Esse mecanismo é semelhante àquele utilizado pelos vírus de RNA chamados retrovírus Essa reversão no fluxo da informação gênica levou os geneticistas a chamarem esses elementos retrotransposons Existem duas classes de retrotransposons os elementos semelhantes aos retrovírus e os retroposons C E D E R J 162 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 163 AULA 19 MÓDULO 2 ELEMENTOS SEMELHANTES AO RETROVÍRUS Esses elementos são encontrados em diferentes organismos como levedura plantas e animais Todos apresentam uma estrutura básica uma região codificadora central cercada por uma repetição terminal longa ou LTR do inglês Long Terminal Region que são orientadas na mesma direção As seqüências repetidas apresentam algumas centenas de nucleotídeos Cada LTR geralmente apresenta repetições da mesma forma que em outros tipos de transposons Conforme dito anteriormente esses transposons são encontrados em muitos organismos mas o assunto sobre retrotransposons é muito vasto de modo que nós vamos utilizar somente um exemplo para ilustrar o seu mecanismo Outros exemplos podem ser encontrados na literatura que está indicada no final deste módulo O elemento semelhante ao retrovírus melhor caracterizado é o transposon Ty1 de levedura Seu nome é derivado de Transposon Yeast 1 do inglês que significa Transposon de Levedura 1 A estrutura do elemento Ty1 está representada na Figura 196 Figura 196 Estrutura do elemento Ty1 de levedura As repetições terminais longas LTR estão representadas pela letra grega δ Os genes TyA e TyB também estão representados Os tamanhos das seqüências estão indica dos em pares de nucleotídeos pn O elemento Ty1 possui cerca de 5900 pares de nucleotídeos e seus LTRs possuem 340 pares de nucleotídeos Após a inserção do elemento Ty1 ocorre a criação de uma duplicação do sítioalvo de 5 pares de nucleotídeos Os elementos Ty1 possuem dois genes TyA e TyB que são homólogos aos genes gag e pol de retrovírus Estudos bioquímicos mostraram que o produto desses dois genes podem formar partículas semelhantes a um vírus dentro da célula de levedura No entanto essas partículas não são capazes de se transferir de uma célula para outra não sendo assim infecciosas C E D E R J 164 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 165 AULA 19 MÓDULO 2 A Figura 197 ilustra o mecanismo de transposição do elemento Ty1 Figura 197 Mecanismo de transposição do elemento Ty1 O DNA correspondente ao elemento Ty1 localiza do em algum lugar do genoma transcreve um RNA Esse RNA traduz uma transcriptase reversa que converte o RNA em uma molécula de DNA dupla fita Essa molécula de DNA dupla fita pode então ser inserida em um outro local do genoma criando um novo elemento Ty1 A transposição do elemento Ty1 envolve a transcrição reversa do DNA Depois que o RNA é sintetizado a partir do DNA Ty1 uma transcriptase reversa codificada pelo gene TyB utiliza o RNA como molde para fazer um DNA dupla fita O DNA é inserido em algum local do genoma criando um novo elemento Ty1 RETROPOSONS Os retroposons ou retrotransposons sem LTR são uma classe grande e amplamente distribuída de retrotransposons incluindo os elementos F G e I de Drosophila e o LINE Long Interspersed Nuclear Elements do inglês elementos nucleares longos distribuídos em mamíferos C E D E R J 164 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 165 AULA 19 MÓDULO 2 Esses elementos se movem através de uma molécula de RNA que é transcrita ao reverso para DNA provavelmente por uma proteína codificada pelos próprios elementos Apesar de criarem uma duplicação do sítioalvo eles não possuem repetições diretas ou invertidas nas suas extremidades Em vez disso eles possuem uma seqüência homogênea de bases A T em uma extremidade Essa seqüência é derivada de uma cauda poli A que é transcrita ao reverso e que é adicionada perto da extremidade 3 do RNA do retroposon durante a sua maturação RETROPOSON HUMANO O retroposon LINE1 conhecido como L1 é o único retroposon ativo no genoma humano O primeiro evento de transposição do L1 foi descrito em 1988 em um gene ligado ao cromossomo X para o fator protéico VIII um dos fatores de coagulação sangüínea A mutação resultou em hemofilia O elemento L1 inserido foi aparentemente produzido por transcrição reversa de um RNA produzido a partir de um elemento L1 presente no cromossomo 22 Os elementos L1 apresentam tamanhos heterogêneos e a maioria contém uma extremidade 5 truncada indicando a síntese incompleta do DNA por transcrição reversa a partir do RNA molde Existem cerca de 50000 a 100000 cópias no genoma humano que correspondem a cerca de 5 do DNA Elementos semelhantes são encontrados em genomas de outros mamíferos RETROPOSONS ASSOCIADOS AO TELÔMERO EM Drosophila Você já estudou na Aula 14 quando falamos sobre replicação de genomas lineares sobre o desafio de replicar as extremidades dos mesmos Se você achar melhor relembrar dê uma olhadinha na Aula 14 Nessa mesma aula nós vimos que a síntese dos telômeros nas extremidades dos cromossomos lineares é uma alternativa para evitar a possível perda de material genético durante a replicação Você viu também que muitos organismos utilizam uma enzima chamada telomerase para sintetizar os telômeros C E D E R J 166 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 167 AULA 19 MÓDULO 2 A Drosophila utiliza um mecanismo diferente para evitar a perda das extremidades dos cromossomos Na mosca os telômeros são formados por dois transposons Um deles é chamado HetA e o outro TART Telomere Associated Retrotransposon que significa retrotransposon associado ao telômero Estudos demonstraram que esses dois transposons se inserem preferencialmente nas extremidades dos cromossomos aumentando o seu tamanho em muitos kilobases 1 kilobase corresponde a 1000 pares de bases ou pares de nucleotídeos Mesmo que uma parte desses elementos seja perdida durante a replicação novos transposons são adicionados garantindo assim a manutenção do cromossomo intacto IMPORTÂNCIA EVOLUTIVA DOS TRANSPOSONS Os transposons pertencentes às diferentes classes apresentados na aula anterior e nesta aula estão espalhados em todos os genomas de vírus até eucariotos superiores Em alguns organismos como a mosca de fruta Drosophila a ocorrência de transposons chega a corresponder de 12 a 15 do DNA presente no genoma Aos transposons são atribuídas muitas das mutações que ocorrem nesses organismos Algumas regiões dos cromossomos apresentam um maior número de transposons Em milho por exemplo os transposons concentramse no DNA encontrado entre um gene e outro e correspondem a mais da metade do genoma Em Drosophila os transposons estão concentrados na heterocromatina mais especificamente próximo aos centrômeros Um fato interessante é que a maioria dos transposons estudados sofreu muitas modificações ao longo do processo evolutivo sendo atualmente praticamente imóveis Isso significa que essas modificações ocorreram em locais essenciais para a ocorrência da transposição que podem ser as extremidades ou as regiões envolvidas com a síntese das enzimas envolvidas no processo de transferência C E D E R J 166 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos C E D E R J 167 AULA 19 MÓDULO 2 A distribuição ampla dos transposons sugere que eles desempenharam um papel importante durante a evolução A capacidade de se copiar de se transpor e de rearranjar outras seqüências de DNA ou ainda de carregar genes de resistência a antibióticos como vimos na aula anterior sobre os transposons compostos de bactérias pode representar um benefício para os organismos que os carregam e uma vantagem adaptativa em situações adversas Os transposons podem ser considerados ferramentas naturais de ENGENHARIA GENÉTICA pois são capazes de introduzir novas características nos indivíduos bem como modificar características já existentes Nesta aula você teve a oportunidade de conhecer um pouco mais sobre o trabalho de Barbara McClintock relacionado aos elementos de transposição AcDs de milho Você aprendeu que os elementos Ds são inativos pois não são capazes de sintetizar a transposase No entanto se houver um elemento Ac no mesmo genoma que codifica para uma transposase ativa o elemento Ds pode ser transposto de um local para outro Nós vimos ainda que em Drosophila um tipo de transposon chamado elemento P é capaz de promover um grande número de modificações fenotípicas chamado disgênese do híbrido devido a sua inserção em diferentes locais no genoma Por último você teve a oportunidade de conhecer um tipo de transposon que se movimenta utilizando um mecanismo semelhante ao retrovírus de RNA e que requer a transcrição reversa de um RNA em uma molécula de DNA para que o mesmo seja inserido no genoma Esses transposons são encontrados em muitos organismos diferentes R E S U M O ENGENHARIA GENÉTICA É um conjunto de técnicas que permite a manipulação do genoma dos organismos Utilizandose ferramentas de Biologia Molecular é possível retirar um segmento de DNA de um organismo responsável por uma determinada característica de interesse e introduzir esse segmento em um outro organismo Como resultado temos a formação de organismos transgênicos Um organismo transgênico pode ser um vírus uma bactéria uma levedura uma planta e ainda um animal o qual teve seu genoma modificado pela introdução de um gene retirado de um outro organismo C E D E R J 168 Biologia Molecular Elementos de transposição em eucariotos AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu bem o conteúdo da aula de hoje não deve ter tido dificuldades para responder aos exercícios É importante que você tenha em mente que todos esses mecanismos embora sejam complexos e exijam muitas informações para a sua compreensão na essência visam a elucidar a maneira pela qual os organismos foram se tornando mais complexos ao longo do processo evolutivo Não se preocupe com os detalhes o importante é que fique clara para você a mensagem que queremos transmitir Nossa intenção não é que você decore todos os mecanismos mas que tenha uma idéia geral de que existem muitos processos que contribuíram e contribuem para a complexidade e a variabilidade dos organismos E muita coisa ainda está para ser descoberta Nas próximas aulas nós iniciaremos o estudo do fluxo da informação gênica ou seja como as informações contidas no DNA são decodificadas para dar origem à diversidade de características dos organismos Até lá e bom estudo EXERCÍCIOS 1 Como funciona o sistema de transposição AcDs de milho 2 Em que situação ocorre a ativação dos elementos P de Drosophila 3 O que é um retrotransposon Qual o mecanismo de transposição utilizado por esses transposons 4 Qual o papel dos transposons no processo evolutivo Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos Ao final desta aula você deverá ser capaz de Entender o mecanismo de expressão das informações contidas no DNA através da transcrição Estudar o mecanismo de transcrição em Procariotos Conceitos sobre a estrutura dos ácidos nucléicos Conceitos sobre o mecanismo de replicação do DNA objetivos 20 A U L A Prérequisitos C E D E R J 170 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 171 AULA 20 MÓDULO 3 INTRODUÇÃO Nas aulas dos Módulos 1 e 2 você aprendeu que as informações genéticas dos organismos vivos estão armazenadas nos ácidos nucléicos que podem ser RNA para alguns vírus e DNA para a maioria dos organismos Vimos também que o mecanismo de replicação permite a perpetuação e a transmissão das características para as célulasfilhas mantendo assim a integridade das características herdáveis Em contrapartida você teve a oportunidade de conhecer alguns mecanismos que modificam as informações contidas no DNA tais como mutação recombinação e transposição Vimos com isso que o genoma dos organismos não é estático ou seja ele pode sofrer modificações e essas modificações podem acarretar mudanças fenotípicas Nesta aula você iniciará os estudos sobre o mecanismo que garante o fluxo das informações contidas no DNA Em outras palavras como as informações se manifestam para produzir as características de um organismo Antigamente os cientistas acreditavam que em organismos multicelulares organizados em tecidos órgãos e sistemas cada célula especializada apresentava um conjunto de material genético diferente responsável pela produção das características fenotípicas específicas de cada tipo celular Posteriormente foi demonstrado que todas as células de um organismo possuem o mesmo genoma Um fato que contribuiu bastante para a compreensão de que todas ou quase todas as células de um organismo possuem o mesmo material genético foi a cultura de células de cenoura in vitro Curioso não é mesmo Vejamos como isso foi feito Antes de tudo temos de entender como ocorre o desenvolvimento e a diferenciação dos tecidos em plantas É importante lembrar que o desenvolvimento em plantas é bem mais simples do que em animais Basicamente o que determina a diferenciação das células em órgãos especializados como folhas e raízes é uma combinação de substâncias conhecidas como auxinas e citocininas também chamadas fitohormônios Existem várias substâncias que compõem o grupo das auxinas bem como das citocininas que podem variar de uma espécie para outra Para facilitar a compreensão vamos nos referir a essas substâncias somente como auxinas e citocininas Existe ainda um outro detalhe Alguns pesquisadores não gostam do termo hormônios pois seus mecanismos de síntese e ação são bem diferentes daqueles caracterizados para os hormônios animais Esses dois grupos de fitohormônios não são os únicos existentes em plantas existem muitos outros que desempenham funções diferentes Vocês estudarão essas substâncias em detalhe na disciplina Fisiologia Vegetal um pouco mais adiante C E D E R J 170 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 171 AULA 20 MÓDULO 3 Pois bem vamos ao que interessa para a compreensão do conteúdo desta aula Durante o desenvolvimento da planta as concentrações de auxinas e citocininas variam e como resultado ocorre a diferenciação dos tipos celulares que resultam na formação de órgãos especializados Se um tecido diferenciado de cenoura por exemplo um pedaço de uma raiz for colocado em um meio de cultura contendo nutrientes e uma auxina na concentração certa as células da raiz sofrerão um processo de indiferenciação pois ocorrerá um desbalanço no equilíbrio das concentrações de auxinas e citocininas que mantém a célula diferenciada ou seja elas perderão as características típicas das células da raiz Essas células quando mantidas em cultura por alguns dias formarão uma massa de células chamada calo Os calos são semelhantes a um pequeno tumor onde as células se dividem com muita rapidez A primeira conclusão a que podemos chegar está relacionada ao efeito da auxina De alguma forma a sua presença desprogramou a célula diferenciada transformandoa numa célula indiferenciada Pois bem se essa massa de células ou calo for transferida para um outro meio de cultura que não contenha a auxina e mantida por alguns dias as células indiferenciadas se diferenciam e formam tecidos e órgãos como folhas e raízes Agora então podemos concluir que as células da raiz inicialmente colocadas em contato com a auxina e que se transformaram em uma massa de células indiferenciadas possuíam todo o material genético necessário para produzir as características de uma planta inteira pois a partir do momento em que a auxina foi retirada as células foram capazes de se diferenciar em outros tipos celulares A formação de uma planta inteira a partir de células indiferenciadas mantidas em cultura chamase regeneração na linguagem dos pesquisadores que trabalham com cultura de tecidos vegetais A capacidade de uma célula indiferenciada formar uma nova planta intacta recebe o nome totipotência Em células animais o processo recebe o nome pluripotência Interessante você não achou Com esse tipo de observação podese afirmar que qualquer célula da cenoura que é um organismo multicelular possui um conjunto completo do seu genoma Mais tarde essa observação se estendeu para muitos outros organismos Podemos usar ainda um outro exemplo a polêmica clonagem da ovelha Dolly que foi clonada a partir de uma célula retirada da glândula mamária de uma outra ovelha As células foram mantidas em cultura na presença de substâncias capazes de desprogramar a expressão de características típicas das células da glândula mamária para um tipo celular indiferenciado C E D E R J 172 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 173 AULA 20 MÓDULO 3 MEIAVIDA Em algumas áreas da Biologia usamos o termo meiavida para definir o tempo que as biomoléculas permanecem intactas quer seja na célula in vivo ou em um tubo de ensaio in vitro A meiavida é definida como sendo o tempo necessário para a degradação ou inativação de 50 das moléculas presentes no momento inicial da contagem Após a inserção do núcleo dessa célula em um óvulo o material genético contido no núcleo foi capaz de coordenar a formação de um novo indivíduo E o que isso significa A clonagem da Dolly só foi possível porque as células da glândula mamária da ovelha doadora continham todo o material genético necessário para o desenvolvimento de um indivíduo Partindo do princípio de que todas as células de um organismo possuem o mesmo material genético o que as torna diferentes é a ativação ou inativação de algumas regiões do genoma o que resulta na produção de características específicas Em outras palavras em células nas quais é necessária a produção de determinadas proteínas responsáveis pela produção de características específicas que são codificadas por genes tais genes são ativados Já em outras células ou tecidos a sua ativação não é necessária Esse mecanismo recebe o nome de regulação da expressão gênica e você terá a oportunidade de entender como isso ocorre nas próximas aulas Veremos mais adiante de que maneira a informação contida no DNA é transferida para que em seguida ela possa ser interpretada ou traduzida na linguagem de proteínas A DESCOBERTA DE UM RNA INTERMEDIÁRIO Pois bem experimentos feitos com fagos vírus que infectam bactérias demonstraram a existência de uma molécula intermediária que carrega a informação contida no DNA e que será posteriormente decodificada em proteínas Vejamos como isso foi descoberto Os pesquisadores Elliot Volken e Lawrence Astrachan demonstraram em 1956 que a síntese de proteínas virais em uma bactéria hospedeira envolvia a participação de moléculas de RNA codificadas pelo DNA viral Eles observaram que após a infecção pelo fago T2 muitas moléculas de RNA eram sintetizadas A marcação dos RNAs com o isótopo radioativo P32 presente em um precursor do RNA mostrou que as moléculas de RNA eram instáveis com MEIAVIDA de alguns poucos minutos Além disso a composição do RNA marcado mostrouse semelhante ao DNA do fago e diferente do DNA da Escherichia coli Mais tarde em 1961 Sol Spiegelman e colaboradores demonstraram que os RNAs sintetizados em células de Escherichia coli infectadas com o fago T4 formavam dúplex DNARNA com o DNA desnaturado do fago T4 mas não eram capazes de formar dúplex com o DNA desnaturado da bactéria C E D E R J 172 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 173 AULA 20 MÓDULO 3 Observe a Figura 201 que descreve o experimento e acompanhe a explicação que se segue Figura 201 Experimento de Spiegelman utilizando Escherichia coli infectada com fago T4 1 Células de E coli infectadas com bacteriófago T4 2 Uridina H3 adicionada ao meio de cultura 3 Células bacterianas foram rompidas e o RNA isolado 4 Determinação do pareamento do RNA radioativo com DNA 5 Incubar a 65ºC durante 12 horas Lavar os filtros para remover o excesso de radioatividade Medir a radioatividade em cada membrana Escherichia coli RNA radioativo é sintetizado na bactéria Uridina H3 no meio de cultura e nas células RNA O DNA é desnaturado pelo calor sem DNA Solução de hibridação contendo RNA radioativo RNA radioativo pareia com o DNA do Fago Membranas de nitrocelulose contendo DNA Fago T4 DNA E coli RNA bacteriófago T4 C E D E R J 174 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 175 AULA 20 MÓDULO 3 As células de Escherichia coli foram infectadas com o fago T4 Um isótopo de uridina marcado com H3 foi adicionado ao meio de cultura em tempos de 2 4 6 8 e 10 minutos após a infecção e mantidos por 1 minuto A uridina marcada foi incorporada ao RNA assim os RNAs sintetizados pela bactéria estavam radioativos Após a incubação as células da bactéria foram lisadas e os RNAs foram isolados Três membranas de nitrocelulose foram preparadas conforme descreveremos a seguir Uma membrana continha DNA fita simples desnaturado de Escherichia coli outra membrana continha DNA fita simples desnaturado do fago T4 e uma terceira membrana que não continha DNA foi utilizada como controle negativo O RNA radioativo previamente isolado foi colocado em contato com as três membranas para permitir a formação de dúplex DNA fita simples RNA fita simples radioativo nos locais onde existisse complementaridade dos nucleotídeos Após retirar o excesso de RNA radioativo foi medida a radioatividade presente nas três membranas que foi detectada somente na membrana que continha DNA do fago T4 como resultado da formação de dúplex DNARNA O resultado comprovou que os RNAs radioativos sintetizados nas células de Escherichia coli foram produzidos a partir da utilização do DNA do fago como molde Dessa forma confirmouse a existência de uma molécula intermediária entre o DNA presente no genoma e a proteína a ser produzida e que essa molécula intermediária era um RNA Em procariotos a síntese do RNA intermediário e a síntese da proteína a partir dele pode ocorrer simultaneamente ou seja à medida que um RNA é sintetizado a síntese protéica pode ser iniciada nessa molécula Já em eucariotos a síntese do RNA intermediário ocorre no núcleo e a utilização desse RNA como molde para a síntese protéica ocorre no citoplasma O RNA intermediário recebe o nome de RNA mensageiro pois sua função é levar a informação contida no DNA para ser decodificada na forma de um polipeptídeo PRODUÇÃO DE UM RNA A PARTIR DE UM DNA MOLDE TRANSCRIÇÃO DO DNA O mecanismo de produção de um RNA a partir de um molde de DNA chamase transcrição A transcrição é um mecanismo semelhante à replicação do DNA com algumas diferenças Dentre elas podemos destacar os precursores são ribonucleosídeos trifosfato somente uma C E D E R J 174 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 175 AULA 20 MÓDULO 3 das fitas do DNA é utilizada como molde não existe a necessidade de um iniciador para a incorporação do primeiro nucleotídeo e o primeiro nucleotídeo é incorporado na forma de trifosfato Os demais nucleotídeos são incorporados na forma de monofosfato A transcrição da mesma forma que a replicação ocorre na orientação 5 3 Assim a molécula produzida será complementar à fita molde e será idêntica exceto para a presença de Uridina no lugar da Timina à fita complementar que não é utilizada como molde Note que para que a síntese ocorra na orientação 5 3 a fita molde deverá ser a fita 3 5 Observe o exemplo ilustrado na Figura 202 Se esse RNA for um RNA mensageiro ele será utilizado para decodificar uma seqüência de aminoácidos A maneira como isso ocorre você aprenderá nas próximas aulas nas quais estudaremos o mecanismo de tradução Existem ainda outros RNAs que são muito importantes mas não codificam proteínas Logo mais falaremos sobre eles Agora discutiremos o mecanismo de transcrição do DNA em procariotos Na próxima aula estudaremos o mecanismo de transcrição em eucariotos Figura 202 Transcrição de um segmento de DNA dupla fita A fita 3 5 é utilizada como molde O RNA pro duzido é idêntico exceto para U no lugar de T à fita 5 3 do DNA dupla fita C E D E R J 176 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 177 AULA 20 MÓDULO 3 TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS Um segmento do DNA que será transcrito para produzir uma molécula de RNA é chamado unidade transcricional Conforme comentamos anteriormente existem diferentes tipos de RNA Em procariotos foram descritos três tipos o RNA mensageiro cuja função é levar a informação armazenada no DNA para ser decodificada em proteína o RNA transportador responsável pelo transporte de aminoácidos ativados até os ribossomos o que possibilita a síntese protéica e por último o RNA ribossomal componente dos ribossomos estrutura na qual ocorre a síntese protéica Em procariotos uma única enzima sintetiza todos os RNAs citados Mais adiante falaremos sobre ela Você já deve ter notado que em Biologia Molecular existem muitos símbolos letras e números Mas é preciso que você se esforce para se familiarizar com eles Você está prestes a conhecer mais alguns Para facilitar a localização dos elementos que formam uma unidade transcricional utilizamos alguns termos e números O primeiro nucleotídeo transcrito recebe o sinal positivo seguido pelo número 1 1 Os nucleotídeos seguintes serão numerados 2 3 4 n onde n é o último nucleotídeo transcrito em uma determinada unidade transcricional O nucleotídeo localizado antes do nucleotídeo 1 recebe o sinal negativo seguido pelo número 1 1 os nucleotídeos seguintes serão 2 3 4 n Os nucleotídeos com a denotação estão posicionados 5 com relação ao nucleotídeo 1 Em inglês utilizase o termo upstream cuja tradução é rio acima Os nucleotídeos com a denotação estão posicionados 3 com relação ao nucleotídeo 1 Em inglês utilizase o termo downstream cuja tradução é rio abaixo Esses dois termos soam bastante esquisitos você não acha Então nas nossas aulas vamos utilizar os termos acima quando se tratar de nucleotídeos localizados na posição 5 com relação ao nucleotídeo 1 e abaixo quando se tratar de nucleotídeos localizados 3 com relação ao nucleotídeo 1 Observe a Figura 203 para que você possa se situar C E D E R J 176 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 177 AULA 20 MÓDULO 3 Cadeia crescente de RNA Fita de DNA molde Ribonucleosídeo trifosfato Direção do crescimento da cadeia 5 3 A RNA POLIMERASE DE ESCHERICHIA COLI Figura 203 Representação de um segmento de DNA ou unidade transcricional e o RNA transcrito a partir dele Os nucleotídeos 1 e 1 estão destacados A transcrição é iniciada no nucleotídeo 1 As linhas pontilhadas indicam que o DNA possui outros nucleotídeos além dos indicados As orientações 5 3 e 35 das moléculas também estão indicadas Figura 204 Reação de polimerização catalisada pela RNA polimerase Os precursores são ribonucleosídeos trifosfato e a reação ocorre através de um ataque nucleofílico do OH sobre o fosfato presente no ribonucleotídeo formando uma ligação fosfodiéster A enzima que catalisa a transcri ção do RNA é a RNA polimerase Você já teve a oportunidade de conhecer um tipo especial de RNA polimerase chamada primase responsável pela síntese dos iniciadores de RNA durante a replicação Da mesma forma que a DNA polimerase essa enzima incor pora ribonucleotídeos ao grupamento hidroxila 3 livre A reação envolve um ataque nucleofílico do grupamen to OH sobre o átomo de fósforo do ribonucleosídeo trifosfato resultando em uma ligação fosfodiéste r com a liberação de um pirofosfato A Figura 204 ilustra a reação catalisada pela RNA polime rase C E D E R J 178 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 179 AULA 20 MÓDULO 3 PROTEÍNA MULTIMÉRICA Proteína formada por várias subunidades cada subunidade corresponde a um monômero As subunidades de uma proteína multimérica podem ser iguais ou diferentes Elas podem ser diméricas quando possuem duas subunidades triméricas quando possuem três subunidades e assim respectivamente A holoenzima RNA pol é multimérica pois possui várias subunidades A RNA polimerase é uma proteína multimérica complexa que inicia a transcrição após a sua ligação a seqüências específicas de nucleotídeos presentes em locais do DNA chamados promotores ou regiões promotoras A RNA polimerase de Escherichia coli conhecida como holoenzima RNA pol possui uma massa molecular de 480 kDa e é formada por cinco polipeptídeos sendo que dois deles são idênticos A holoenzima é formada por 2 subunidades α 1 subunidade β uma subunidade β e uma subunidade σ As subunidades α estão envolvidas no acoplamento do complexo A subunidade β contém um sítio de ligação ao ribonucleosídeo trifosfato e a subunidade β contém uma região de ligação ao molde de DNA As subunidades β e β catalisam a reação de polimerização A Figura 205 apresenta a estrutura da holoenzima RNA pol A subunidade σ está envolvida com a iniciação da transcrição O fator σ é liberado logo após o início da transcrição sendo que o alongamento é catalisado pelo restante da enzima chamado núcleo catalítico O núcleo catalítico é formado por duas subunidades α uma subunidade β e uma subunidade β O fator σ reconhece o promotor e possibilita a ligação da holoenzima RNA pol Experimentos realizados in vitro demonstraram que na ausência do fator σ a transcrição pôde ser iniciada em qualquer ponto no entanto quando o fator σ estava presente a transcrição só ocorria a partir do promotor A transcrição envolve três etapas iniciação alongamento e terminação semelhante ao que vimos para o mecanismo de replicação Em seguida você verá o que ocorre em cada uma das etapas Figura 205 Representação esquemática da holoenzima RNA pol com suas diferentes subunidades Duas subunidades α uma subunidade β uma subunidade β e uma subunidade σ O esquema representa o modelo de acoplamento do complexo C E D E R J 178 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 179 AULA 20 MÓDULO 3 INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO O início da transcrição envolve três etapas ligação da RNA pol ao promotor abertura do DNA molde e formação das ligações fosfodiéster entre os primeiros nucleotídeos Antes de analisarmos o que ocorre no início da transcrição precisamos entender o que é um promotor O promotor é uma região do DNA localizada acima do início da transcrição 5 em relação ao nucleotídeo 1 Essa região apresenta seqüências específicas de nucleotídeos às quais se ligam proteínas envolvidas na transcrição Vamos fazer uma comparação para você nunca mais esquecer Um gene pode ser comparado ao motor de um carro Para que o motor funcione e movimente o carro a ignição é necessária para desencadear a queima do combustível que por sua vez fará o motor funcionar Pois bem o promotor de um gene pode ser comparado à ignição pois sem ele o gene não funciona Geralmente a menos que se faça uma ligação direta a ignição é acionada após o encaixe da chave e o giro da mesma quando é dada a partida no motor As proteínas que se ligam ao promotor de um gene podem ser comparadas à chave Normalmente a chave de um carro só irá se encaixar a uma única caixa de ignição De modo semelhante a proteína só se encaixará em um promotor específico que permitirá o funcionamento do gene através da ativação da transcrição As proteínas que se ligam a promotores são chamadas fatores de transcrição Alguns genes possuem vários fatores de transcrição que o regulam ou seja diferentes proteínas podem se ligar a seqüências específicas localizadas no promotor e afetar a transcrição Isso vale para procariotos e eucariotos Nas aulas sobre regulação da expressão gênica você verá que alguns fatores atuam positivamente na transcrição e com isso aumentam as quantidades de RNA produzidas Outros atuam negativamente na transcrição e com isso diminuem as quantidades de RNA produzidas Alguns genes apresentam somente as seqüências para a ligação da RNA pol que também pode ser considerada um fator de transcrição Mas isso é um assunto para mais tarde Antes porém veremos os elementos mínimos necessários para o funcionamento de uma unidade transcricional em procariotos ou seja somente aqueles envolvidos com o acoplamento da RNA pol C E D E R J 180 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 181 AULA 20 MÓDULO 3 Vamos a eles A comparação entre os promotores de vários genes revelou poucas semelhanças entre eles Essa comparação foi feita através do alinhamento das seqüências localizadas acima do nucleotídeo onde ocorre o início da transcrição nucleotídeo 1 em genes conhecidos Geralmente a seqüência de nucleotídeos do RNA é comparada à seqüência do DNA molde que originou aquele RNA com o intuito de distinguir as regiões transcritas e as regiões promotoras Desse modo duas seqüências curtas foram identificadas em promotores de genes diferentes Elas estão localizadas nas posições 10 e 35 acima do nucleotídeo 1 sendo por isso chamadas seqüências 10 e 35 Alguns nucleotídeos presentes nas seqüências variam de gene para gene enquanto outros são conservados Quando uma determinada seqüência ocorre em diferentes genes ou regiões do DNA e desempenha função semelhante ela é chamada seqüência consenso O consenso para a seqüência 10 é 5 TATAAT 3 e para a seqüência 35 é 5 TTGACA 3 A distância entre as duas seqüências chamada espaçador é importante para o acoplamento da RNA pol O espaçador nunca é menor do que 15 pares de bases ou maior do que 20 pares de bases O papel dessas seqüências no processo de transcrição foi determinado através de estudos com um velho conhecido nosso os mutantes Nesse caso a utilização de mutantes foi crucial para mapear os nucleotídeos necessários para o funcionamento do promotor Em mutantes que apresentaram alterações em alguns nucleotídeos dessas seqüências houve uma diminuição na eficiência da transcrição Em alguns casos a transcrição foi completamente inibida A Figura 206 apresenta um esquema do arranjo das seqüências 10 e 35 Figura 206 Representação esquemática das seqüências consenso 10 e 35 em uma região promotora Os nucleotídeos de cada seqüência bem como as suas posições estão indicados As barras pontilhadas indicam a existência de outros nucleotídeos que não estão representados Os nucleotídeos presentes no espaçador não influenciam a transcrição mas o tamanho do espaçador determinado pelo número de nucleotídeos é essencial para a transcrição O nucleotídeo 1 no qual ocorre o início da transcrição também está representado C E D E R J 180 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 181 AULA 20 MÓDULO 3 A Figura 207 ilustra os primeiros eventos que ocorrem durante o início da transcrição de um RNA mensageiro Observe a figura e acompanhe a explicação que se segue Figura 207 Início da transcrição a a RNA pol se liga inespecificamente ao DNA b a subunidade σ localiza o promotor ocorre a formação do complexo fechado c a RNA pol promove a abertura das fitas e estabelece a formação de um complexo aberto d Adição da purina contendo três fosfatos formação do complexo ternário e síntese dos primeiros nucleotídeos formação da bolha de transcrição f liberação do fator σ e alonga mento do transcrito pela RNA pol g representação da iniciação abortiva na qual uma seqüência curta de RNA é liberada a Ligação nãoespecífica da RNA pol e migração até o promotor b Formação de um complexo fechado com o promotor composto pelo DNA fechado e a RNA pol DNA molde RNA polimerase c Formação de um complexo aberto composto pelo DNA aberto e a RNA pol d Formação do complexo ternário composto por DNA RNA pol e o primeiro nucleotídeo trifosfato purina e Formação da bolha de transcrição Oito nucleotídeos são incorporados f O fator é liberado após a incorporação de oito nucleotídeos enquanto a RNA pol avança g Iniciação abortiva com a liberação de seqüências curtas com cerca de 2 a 9 nucleotídeos C E D E R J 182 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 183 AULA 20 MÓDULO 3 A RNA pol se liga inespecificamente ao DNA A subunidade σ é responsável pelo reconhecimento do promotor A holoenzima desliza no DNA até que a subunidade σ encontre a seqüência 35 do promotor Nesse ponto ocorre a formação de um complexo entre a RNA pol e o promotor chamado complexo fechado uma vez que o DNA do promotor permanece dupla fita A RNA pol promove a abertura das fitas na seqüência localizada na posição 10 formando o complexo aberto constituído pelas duas fitas de DNA e a holoenzima A presença de vários A T na seqüência facilita a abertura das fitas O primeiro nucleotídeo é incorporado e forma o complexo ternário composto pelo DNA molde aberto a holoenzima e o nucleotídeo de RNA recémsintetizado A holoenzima ligada ao promotor durante a síntese dos primeiros nucleotídeos forma uma estrutura chamada bolha de transcrição Muitas vezes o núcleo catalítico da RNA pol sintetiza cadeias curtas contendo dois a oito nucleotídeos Tais cadeias são liberadas em seguida desfazendo o complexo de iniciação Esse processo é chamado síntese abortiva Em seguida ocorre novamente o acoplamento do complexo Quando a RNA pol sintetiza uma cadeia com 10 ou mais nucleotídeos o complexo se estabiliza e a cadeia é alongada A função da síntese abortiva é desconhecida Todavia acreditase que funcione como um mecanismo de certificação que garante que a transcrição ocorrerá no local certo Após a síntese de oito a nove nucleotídeos o fator σ é liberado A partir daí ocorre o alongamento da transcrição ALONGAMENTO DA TRANSCRIÇÃO O desligamento do fator σ faz com que a RNA pol sintetize o RNA muito rapidamente Podese dizer que o fator σ funciona como um freio no início da transcrição que impede o rápido avanço da RNA pol Possivelmente isso funciona como um outro mecanismo de certificação garantindo a transcrição do segmento correto do DNA A RNA pol é capaz de desenrolar o DNA molde e romper as pontes de hidrogênio abrindo as fitas e também é capaz de restaurar o pareamento das bases do DNA logo em seguida C E D E R J 182 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 183 AULA 20 MÓDULO 3 A bolha de transcrição possui cerca de 18 nucleotídeos abertos e cerca de 40 nucleotídeos são incorporados por segundo Conforme a bolha caminha a cadeia de RNA nascente é deslocada do DNA molde e o pareamento das fitas do DNA pode ser restaurado A região de pareamento entre o DNA e o RNA é pequena cerca de 3 pares de bases Esse pareamento não é suficiente para estabilizar o complexo Assim a estabilidade do complexo é mantida através da ligação do DNA e da cadeia recémsintetizada de RNA a RNA pol Podemos concluir então que o alongamento consiste na incorporação dos nucleotídeos na cadeia nascente de RNA A síntese terminará quando o complexo atingir a região terminadora que veremos em seguida TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO O término da transcrição ocorre quando a RNA pol passa através do sinal de terminação O sinal de terminação é uma propriedade intrínseca do DNA molde que propicia a formação de uma estrutura que por sua vez favorece o rompimento do complexo RNA polDNA RNA Dois tipos de terminadores foram descritos em Escherichia coli Um deles precisa de uma proteína específica chamada rho ρ e por isso recebe o nome terminação dependente de ρ O outro é conhecido como terminação independente de ρ A terminação independente de ρ apresenta uma porção no DNA molde rica em G C seguida de uma região composta de seis ou mais pares de bases A T A transcrição da região rica em G C resulta em uma molécula de RNA fita simples que possui regiões complementares Essas regiões podem se parear formando uma estrutura do tipo grampo de cabelo A formação da estrutura está esquematizada na Figura 208 A estrutura de grampo de cabelo é formada logo após a transcrição dessa região A presença da estrutura de grampo interfere no movimento da RNA pol e causa uma pausa na síntese do RNA A transcrição da seqüência composta por pares A T produz um segmento de RNA formado por Us que estão parcialmente pareados aos As O pareamento A U pode ser rompido com facilidade Lembrese de que A forma duas pontes de hidrogênio com T ou U A presença da estrutura grampo de cabelo facilita o deslocamento da região rica em Us Como resultado o RNA é liberado e termina a transcrição C E D E R J 184 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 185 AULA 20 MÓDULO 3 Figura 208 Representação esquemática da terminação independente de ρ a a região rica em G C é transcrita b ocorre a formação da estrutura grampo de cabelo seguida pela região que apresenta os pareamentos A U observe a comple mentariedade dos nucleotídeos c as pontes de hidrogênio da região pareada A U são rompidas e o RNA é liberado do DNA molde desfazendo o complexo As terminações dependentes de ρ não possuem a seqüência rica em A T na fita molde mas às vezes possuem uma seqüência curta que é transcrita e forma um grampo A proteína ρ se liga ao RNA em sítios de ligação específicos e migra na direção 5 3 até alcançar o complexo de transcrição formado pela RNA pol que está sintetizando o RNA na região do sítio de terminação Devido às características da região terminadora ocorre uma pausa na transcrição Em função desta pausa a proteína ρ se aproxima da bolha de transcrição e promove a liberação do RNA recémsintetizado O mecanismo de ação da proteína ρ não é bem conhecido mas sabese que ela possui atividade de helicase DNA RNA dependente de ATP O ATP é hidrolisado pela proteína ρ durante o processo de terminação É provável que a atividade de helicase rompa as pontes de hidrogênio no híbrido DNARNA facilitando assim a liberação do transcrito a b c C E D E R J 184 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos C E D E R J 185 AULA 20 MÓDULO 3 Nesta aula vimos de que maneira a informação genética contida no DNA é utilizada para produzir as características de um indivíduo e que apesar de todas ou quase todas as células de um organismo possuírem o mesmo DNA somente regiões específicas são ativadas para produzir suas características Vimos também os experimentos que comprovaram a existência de uma molécula de RNA como intermediária entre o DNA molde que armazena a informação e as proteínas que manifestam as características Mais adiante pudemos constatar que a transcrição do DNA que é o mecanismo pelo qual o RNA é produzido é semelhante à replicação do DNA em alguns aspectos e diferente em outros As diferentes subunidades da holoenzima RNA polimerase de procariotos a enzima responsável pela transcrição dos diferentes tipos de RNA foram descritas bem como as suas respectivas funções Por último vimos que a transcrição em procariotos ocorre nas etapas de iniciação alongamento e terminação e que cada uma dessas etapas é determinada pelas características presentes no DNA utilizado com molde A região promotora ou promotor onde são encontradas seqüências específicas define o local em que a transcrição deve ser iniciada e é reconhecida pela subunidade σ da RNA pol Já a região terminadora possui seqüências que após a transcrição permitem a formação de estruturas no RNA que facilitam o deslocamento do complexo e o término da síntese EXERCÍCIOS 1 Trace um paralelo entre o mecanismo de replicação e transcrição destacando as semelhanças e diferenças entre os dois mecanismos 2 O que é um promotor De que maneira ele pode ser identificado 3 Quais são os componentes da RNA polimerase de procariotos e qual a função de cada um deles 4 Qual a importância da terminação da transcrição R E S U M O C E D E R J 186 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em procariotos AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu o conteúdo desta aula não deve ter encontrado dificuldades para responder aos exercícios propostos Procure responder aos exercícios sempre com suas palavras interpretando o conteúdo apresentado Recomendamos que as respostas sejam enriquecidas com esquemas com base na sua interpretação do que foi apresentado Isso certamente o ajudará na fixação dos conceitos Na próxima aula estudaremos o mecanismo de transcrição em eucariotos Por isso é importante que você estude esta aula com carinho e responda aos exercícios Bom estudo e até a próxima aula Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos Ao final desta aula você deverá ser capaz de Estudar o mecanismo de transcrição em eucariotos Entender a formação do RNA mensageiro em eucariotos Conteúdo da Aula 20 objetivos 21 A U L A Prérequisito C E D E R J 188 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 189 AULA 21 MÓDULO 3 INTRODUÇÃO Na aula anterior vimos o mecanismo de transcrição em procariotos e nesta aula veremos como ocorre a transcrição em eucariotos O processo de transcrição em eucariotos embora semelhante ao de procariotos apresenta uma complexidade maior Você já sabe que uma das principais diferenças entre uma célula eucariótica e uma célula procariótica é a presença da carioteca ou membrana nuclear nos eucariotos a qual separa os componentes do núcleo dos demais componentes do citosol Assim em eucariotos quando uma unidade transcricional é ativada para produzir um RNA mensageiro esse RNA deverá ser transportado para o citosol que é o local onde ocorrerá a tradução do mRNA síntese protéica O mesmo ocorre com os RNAs transportadores que também devem ser transportados para o citosol pois é lá que eles desempenharão suas funções na síntese protéica Somente um tipo de RNA chamado snRNA é mantido no núcleo Nós falaremos sobre a função dos snRNAs na Aula 22 Muitos genes possuem regiões intercalares que não são traduzidas em proteínas e portanto são retiradas do transcrito primário para formar um RNA mensageiro maduro Além disso o RNA sofre outras duas modificações a adição da cauda poliA na sua extremidade 3 e a adição de um capacete na sua extremidade 5 Existe ainda a edição do RNA que consiste na alteração da composição dos nucleotídeos após a transcrição Você terá a oportunidade de conhecer todos esses processos em detalhe Mas antes veremos como ocorre a síntese dos RNAs Vamos começar falando sobre as RNA polimerases AS RNA POLIMERASES DE EUCARIOTOS Três RNA polimerases foram descritas em eucariotos RNA pol I RNA pol II e RNA pol III formadas por dez ou mais subunidades As RNA pol não são capazes de se ligar sozinhas ao DNA e por isso necessitam da ajuda de outros fatores de transcrição para que ocorra o início da transcrição Você já sabe que esses fatores são aquelas proteínas que se ligam ao promotor do gene e auxiliam na transcrição não é mesmo Vimos isso na Aula 20 Se estiver em dúvida volte a ela e confira C E D E R J 188 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 189 AULA 21 MÓDULO 3 Vejamos qual a função de cada uma das RNA polimerases A RNA pol I é geralmente encontrada no nucléolo uma região especial do núcleo na qual o RNA ribossomal chamado rRNA é transcrito e combinado a proteínas ribossomais A RNA pol I sintetiza todos os rRNA exceto o rRNA 5S A RNA pol II transcreve genes nucleares que codificam proteínas produzindo RNAs mensageiros mRNA A RNA pol III sintetiza as moléculas de RNA transportador tRNA o rRNA 5S e os pequenos RNAs nucleares snRNA do inglês small nuclear RNA INÍCIO DA SÍNTESE DAS CADEIAS DE RNA Como já dissemos anteriormente as RNA polimerases de eucariotos precisam de fatores de transcrição Os fatores de transcrição reconhecem o promotor e se ligam a ele formando um complexo de iniciação que por sua vez possibilita a ligação da RNA pol As RNA pol I II e III reconhecem complexos de iniciação diferentes formados por fatores de transcrição e promotores específicos Em outras palavras a RNA pol I por exemplo não se ligará a um complexo de iniciação formado pelo acoplamento de fatores de transcrição específicos a um promotor para a RNA pol II Nesta aula daremos prioridade ao mecanismo de transcrição mediado pela RNA pol II ou seja a transcrição de RNAs mensageiros que serão traduzidos em proteínas A RNA pol II é formada por 12 subunidades Os fatores de transcrição que permitem o acoplamento da RNA pol II ao promotor são representados por TFIIx do inglês Transcription Factor for polimerase II que significa fator de transcrição para a polimerase II e o x indica cada um dos fatores por exemplo TFIIA TFIIH entre outros A Tabela 211 apresenta os diferentes fatores de transcrição e as suas funções A RNA pol também é um fator de transcrição pois também se liga ao DNA Tabela 211 Fatores de transcrição necessários para o funcionamento da RNA polimerase II e transcrição dos RNAm em eucariotos O número de subunidades a massa e a função de cada fator estão apresentados C E D E R J 190 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 191 AULA 21 MÓDULO 3 A transcrição em eucariotos pode ser dividida em várias etapas acoplamento do complexo de iniciação iniciação alongamento e terminação Vamos analisar cada uma das etapas mas antes de tudo vamos entender os elementos que compõem os promotores para a RNA pol II PROMOTORES DE EUCARIOTOS Semelhante ao que vimos para os promotores de procariotos os promotores reconhecidos pela RNA pol II são formados por pequenas regiões conservadas localizadas acima do nucleotídeo 1 Uma das regiões conhecida como caixa TATA apresenta a seqüência consenso 5TATAAAAA3 e está localizada na posição 30 A caixa TATA determina o local no qual ocorrerá a iniciação da transcrição fundamental para a mesma Uma outra região chamada caixa CAAT está localizada perto da posição 80 e apresenta a seqüência consenso 5GGCCAATCT3 a localização desta seqüência varia podendo estar localizada em alguns nucleotídeos acima ou abaixo da posição 80 Por isso dizemos que está perto da posição 80 Duas outras regiões a caixa GC formada pela seqüência consenso 5GGGCGG3 e o octâmero formado pela seqüência consenso 5ATTTGCAT3 são também encontradas nos promotores e influenciam a eficiência da iniciação A Figura 211 apresenta um esquema ilustrando a caixa CAAT e a caixa TATA Fator de transcrição Subunidades Massa kDa Funções RNA pol II 12 10 220 Catalisa a síntese do RNA TBP 1 38 Reconhece especificamente a seqüência TATA TFIIA 3 12 19 e 35 Estabiliza a ligação do TFIIB e TBP ao promotor TFIIB 1 35 Ligase ao TBP liga o TFIIF da RNA polimerase TFIID 12 15 250 Interage com proteínas reguladoras positivas e negativas TFIIE 2 34 e 57 Liga TFIIH apresenta atividade de ATPase e helicase TFIIF 2 30 e 74 Liga RNA pol II liga TFIIB impede que a RNA pol II se ligue ao DNA de modo TFIIH 12 35 89 inespecífico Desenrola o promotor do DNA fosforila a RNA pol II C E D E R J 190 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 191 AULA 21 MÓDULO 3 Figura 212 Representação esquemática do complexo de iniciação da RNA pol II no promotor de um gene de eucarioto e as demais etapas da transcrição 80 50 30 1 início DNA TBP ou TFII eou TFIIA TFIIB TFIIF RNA polimerase II TFIIE TFIIH TFIID TFIIA TFIIB TBP TFIIF RNA polimerase II TFIIE TFIIH Complexo fechado DNA desenrola para produzir o complexo aberto DNA desenrolado Fosforilação da RNA polimerase II iniciação e liberação do complexo de alongamento TFIID TFIIA TFIIB TBP RNA TFIIE TFIIH Fatores de alongamento Alongamento Terminação RNA Liberação e desfosforilação da RNA polimerase II Inr 30 TATA 1 Inr Figura 211 Representação esquemática de um promotor de eucarioto reconhecido pela RNA pol II As seqüências consenso contendo as caixas CAAT e TATA estão representadas A posição 1 na qual ocorre o início da transcrição também está indicada ACOPLAMENTO DO COMPLEXO DE INICIAÇÃO AO PROMOTOR A Figura 212 ilustra o complexo de iniciação e as demais etapas da transcrição Observe a figura e acompanhe as explicações que se seguem C E D E R J 192 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 193 AULA 21 MÓDULO 3 A formação do complexo de iniciação começa quando a proteína TBP do inglês TATA Binding Protein proteína ligante de TATA se liga à caixa TATA Em seguida o fator TFIIB se liga ao TBP e ao DNA nos dois lados da TBP O próximo passo é a ligação do fator TFIIA que aparentemente estabiliza o complexo TFIIB e TBP O complexo TFIIF RNA pol II se ligará ao restante dos componentes já ligados ao DNA O TFIIF ajuda a levar a RNA pol II até seus promotores pois interage com o TFIIB e reduz a inespecificidade da ligação da RNA pol ao DNA Por último os fatores TFIIE e TFIIH se ligam e completam o complexo fechado dê uma olhadinha na Tabela 211 para rever a função de cada um dos fatores O TFIIH possui atividade de DNA helicase dependente de ATP que promove a abertura do DNA localizado perto do nucleotídeo 1 formando assim o complexo aberto Após a formação do complexo aberto a transcrição é iniciada Além da atividade de DNA helicase o TFIIH também possui atividade cinase em uma das suas subunidades que fosforila a maior subunidade da RNA pol II em vários locais na região terminal carboxila Em resposta à fosforilação ocorre uma alteração conformacional do complexo o que permite o início da transcrição Durante a síntese dos 60 a 70 nucleotídeos iniciais do RNA ocorre a liberação do fator TFIIE e o fator TFIIH é liberado em seguida Isso permite que a RNA polimerase alongue a cadeia de RNA ALONGAMENTO E TERMINAÇÃO O TFIIF fica associado à RNA polimerase durante todo o alongamento A atividade da RNA pol aumenta após o acoplamento de proteínas chamadas fatores de alongamento Ao término da síntese a RNA pol é desfosforilada e reciclada podendo ser utilizada para iniciar a síntese de uma outra cadeia de RNA CAPEAMENTO DA EXTREMIDADE 5 DO RNA Enquanto a cadeia do RNA está sendo alongada a extremidade 5 do préRNAm é modificada pela adição de uma guanosina metilada O processo é chamado capeamento da extremidade 5 O capeamento ocorre geralmente quando a cadeia crescente do RNA possui cerca de trinta nucleotídeos O capeamento resulta de uma C E D E R J 192 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 193 AULA 21 MÓDULO 3 Figura 213 a estrutura do capacete 5 mostrando a ligação trifosfato 5 5 contendo a guanosina metilada bem como os dois primeiros nucleotídeos próximos ao capacete também metilados b reações envolvidas na adição do capacete na extremidade 5do RNA AdoHyc é a abreviação para a Sadenosilhomocisteína ligação trifosfato 55 pouco usual A estrutura formada é chamada capacete 5 Observe a Figura 213 b que ilustra as reações envolvidas no capeamento O capacete 5 é formado pela condensação de uma molécula de GTP com o trifosfato na extremidade 5do RNA A enzima fosfoidrolase retira o fósforo γ do nucleotídeo localizado na extremidade 5do RNA Em seguida a enzima ganililtransferase promove a ligação fosfodiéster entre a guanosina e o nucleotídeo 5 liberando um pirofosfato A enzima guanina 7metiltransferase metila a guanosina utilizando o grupamento metila da Sadenosilmetionina adoMet Dois grupamentos metila são adicionados às hidroxilas 2 do primeiro e do segundo nucleotídeo adjacente ao capacete pela enzima 2Ometiltransferase A Figura 213a ilustra a estrutura resultante dessas reações A presença dessa estrutura permite a ligação de fatores envolvidos na tradução os quais veremos nas aulas do Módulo 4 e também ajudam a proteger as cadeias de RNA que estão sendo sintetizadas da degradação pelas nucleases Base Algumas vezes metilada Base Algumas vezes metilada Ligação 5 5 trifosfato Extremidade 5 do RNA com capacete 7metilguanosina m7 GpppmNp adoHyc adoMet m7 GpppNp adoHyc adoMet GpppNp PPi Gppp GTP αβγ Pi pppNp γβα Extremidade 5 do RNA com grupo trifosfato ppNp a b C E D E R J 194 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 195 AULA 21 MÓDULO 3 TERMINAÇÃO ATRAVÉS DE CLIVAGEM DA CADEIA E ADIÇÃO DA CAUDA NA EXTREMIDADE 3 DO RNA As extremidades 3dos transcritos sintetizados pela RNA pol II ao contrário do que ocorre em procariotos quando a RNA pol encontra a região terminadora são produzidas por clivagem endonucleolítica dos transcritos primários A terminação pode ocorrer em sítios múltiplos os quais estão localizados cerca de 1000 a 2000 nucleotídeos de distância do local que corresponde à extremidade 3 do transcrito maduro Ou seja a RNA pol II transcreve um segmento de DNA bem maior do que o necessário para produzir um RNA mensageiro A região desnecessária é removida por clivagem endonucleolítica e ocorre em uma região localizada 11 a 30 nucleotídeos abaixo da seqüência 5AAUAAA 3 localizada perto do final da unidade transcricional Após a clivagem uma enzima chamada poliA polimerase ou ainda poliadenilato polimerase PAP adiciona uma cauda poliA formada por cerca de 200 resíduos de adenosina monofosfato à extremidade 3 do transcrito A adição da cauda poliA em RNAs eucarióticos é chamada poliadenilação A formação da cauda poliA necessita de um componente de especificidade que reconhece e se liga à seqüência AAUAAA dos RNAs dirigindo a clivagem e a reação de poliadenilação O componente de especificidade a endonuclease e a poliA polimerase estão presentes em um complexo multimérico que catalisa ambos a clivagem e a poliadenilação em reações fortemente acopladas A Figura 214 ilustra as etapas de clivagem e a adição da cauda poliA A cauda poliA dos RNAm de eucariotos aumenta a estabilidade do RNAm e desempenha um papel importante no seu transporte do núcleo para o citosol Ao contrário da RNA pol II a RNA pol I e pol III respondem a sinais discretos de terminação A RNA pol I termina a transcrição em resposta a uma seqüência de 18 nucleotídeos que é reconhecida por uma proteína terminadora associada A RNA pol III responde a um sinal de terminação que é semelhante ao terminador independente de Rho de Escherichia coli A maior parte do mecanismo é desconhecida poliA C E D E R J 194 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 195 AULA 21 MÓDULO 3 Figura 214 Adição da cauda poliA ao transcrito primário de RNA de eucariotos a a seqüência sinalizadora da clivagem é ligada por um complexo enzimático que inclui uma endonuclease uma poliadenilato polimerase e várias outras proteínas com múltiplas subunidades envolvidas no reconhecimento da seqüência no estímulo da clivagem e na síntese da cauda poliA b o RNA é clivado pela endonuclease em um local cerca de 10 a 30 nucleotídeos abaixo da seqüência AAUAAA c a poliadenilato polimerase sintetiza uma cauda poliA de extensão variável a partir do ponto de clivagem EDIÇÃO DO RNA No último tópico desta aula veremos o processo de edição do RNA A edição consiste na alteração da seqüência de um RNA através da inserção deleção ou modificação de nucleotídeos já existentes na molécula Molde de DNA RNA Complexo enzimático RNA polimerase AAUAAA AAUAAA OH3 ATP PPi a b c C E D E R J 196 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 197 AULA 21 MÓDULO 3 A descoberta desse fenômeno é recente 1986 e foi possível através do estudo de genes mitocondriais do protozoário Trypanosoma brucei Os RNAs sintetizados a partir desses genes apresentavam vários resíduos uracila que não estavam presentes no DNA que serviu de molde para a sua síntese Os pesquisadores concluíram que tais resíduos foram adicionados após a transcrição A Figura 215 ilustra um exemplo de edição de uma molécula de RNA O processo de edição do RNA é mediado por RNAs guia que são transcritos por diferentes genes mitocondriais ou seja o RNA guia não é produto da mesma unidade transcricional que originou o préRNAm Os RNAs guias contêm seqüências que são parcialmente complementares ao préRNAm que será editado O pareamento entre os RNAs guia e os préRNAm resulta em falhas contendo resíduos As não pareados nos RNAs guia Esses As servirão de molde para a inserção de Us A Figura 216 ilustra como exemplo a edição do préRNAm da proteína mitocondrial citocromo b de Leishmania tarentolae Figura 215 Exemplo de edição do RNA em Trypanosoma brucei a RNA produzido a partir do DNA molde b RNA mensageiro após a edição resultante da inserção de Us mostrados em cinza 5GGGGAAAGAUAUUGAUGAAAGGA3 5G GG GAA A G AUAUUGA UG A A AGG A3 U U UUU UU UUU U U UU U UU Inserção de Us C E D E R J 196 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 197 AULA 21 MÓDULO 3 Figura 216 Exemplo de edição em tripanossomos Os resíduos de uridina monofosfato Us que são inseridos nas falhas do préRNAm durante o processo de edição estão representados na cor cinza O pareamento entre o préRNAm e o RNA guia está representado por linhas verticais entre as duas moléculas Em alguns casos mais de um RNA guia participa do processo de edição do préRNAm Além de servir de molde para a síntese de Us o RNA guia também fornece os resíduos Us os quais serão adicionados durante a edição e que estão presentes em uma cauda poliU que possui 5 a 24 nucleotídeos Esses resíduos são transferidos através do mecanismo ilustrado na Figura 217 Observe a figura e acompanhe a explicação que se segue Transcrição Pareamento do pré RNAm com o RNA guia Inserção de resíduos de uridina monofosfato Liberação do RNA guia do RNAm RNA guia RNAm editado RNA guia préRNAm préRNAm préRNAm C E D E R J 198 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 199 AULA 21 MÓDULO 3 ataque RNA guia RNA guia RNA guia ataque RNA guia préRNAm parcialmente editado 1 Clivagem de uma ligação éster no préRNAm e formação de uma ligação éster entre o RNA guia e a porção 3 do préRNAm 2 Clivagem de uma ligação éster entre os dois Us terminais do RNA guia resgata o préRNAm apresentando um U inserido ao local da clivagem mostrado na etapa 1 Figura 217 Mecanismo de inserção de resíduos de uridina monofosfato nas moléculas de préRNAm durante o processo de edição C E D E R J 198 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 199 AULA 21 MÓDULO 3 Na primeira etapa a hidroxila 3 livre do RNA guia promove um ataque nucleofílico que quebra uma ligação éster interna no préRNAm formando uma ligação covalente Em seguida a hidroxila 3 livre na porção 5do préRNAm que foi cortado ataca uma ligação éster entre dois resíduos Us na extremidade da cauda poliU do RNA guia resgatando a estrutura do préRNAm que agora apresentará um resíduo U inserido no local no qual ocorreu o ataque inicial Um outro tipo de edição do RNA foi descrito para o gene da APOLIPOPROTEÍNAB em humanos e coelhos Observe a Figura 218 e acompanhe a explicação que se segue No fígado o RNAm para apolipoproteínaB codifica uma proteína que contém 4563 aminoácidos Em contrapartida no intestino a mesma proteína contém somente 2153 aminoácidos A princípio acreditava se que as duas proteínas eram produtos de unidades transcricionais diferentes mas estudos detalhados revelaram que eram produtos de um mesmo gene Nesse caso um resíduo C presente no préRNAm é Figura 218 Edição do préRNAm para a apolipoproteína B no intestino de mamíferos Fígado Pareamento do pré RNAm com o RNA guia Intestino RNA não editado Desaminase se liga ao RNA Edição do RNA através de desaminação oxidativa da citosina RNAm editado Tradução Apolipoproteína formada por 4563 aminoácidos Apolipoproteína formada por 2153 aminoácidos APOLIPOPROTEÍNAB Apolipoproteínas são proteínas presentes no sangue e que transportam determinados tipos de moléculas de gordura no sistema circulatório C E D E R J 200 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 201 AULA 21 MÓDULO 3 convertido em um resíduo U gerando um CÓDON DE TERMINAÇÃO UAA o qual irá determinar que a proteína sintetizada seja menor do que aquela originada a partir do RNA não editado A conversão de C U é catalisada por uma proteína que se liga a seqüências específicas de RNA e remove grupamentos amina de resíduos de citosina Depois de saber da existência do mecanismo de edição do RNA você pode estar se perguntando Por que ocorre a edição do RNA Para o caso da apolipoproteína a edição do RNA pode ser explicada como um mecanismo de produção de duas proteínas diferentes a partir de um mesmo gene uma vez que ambos os RNAs editado e não editado dão origem a proteínas funcionais Em contrapartida no caso dos tripanossomos os RNAs que não são editados não são capazes de sintetizar proteínas ativas Dessa forma a edição do préRNAm é um importante passo na regulação da produção dessas proteínas O mecanismo que garante a fidelidade da edição ainda não é conhecido Não seria mais lógico produzir RNAs que fossem uma cópia idêntica do DNA molde A pergunta permanece sem resposta mas sabese que os tripanossomos são eucariotos unicelulares primitivos que divergiram muito cedo dos demais eucariotos Assim alguns evolucionistas acreditam que a edição do RNA era comum em células ancestrais nas quais muitas reações eram catalisadas por moléculas de RNA em vez de moléculas protéicas conforme veremos na próxima aula CÓDON DE TERMINAÇÃO UAA UAA é um dos três códons que determinam o término da tradução Você estudará o mecanismo de tradução nas aulas do Módulo 4 mas é interessante saber que ao encontrar um código de terminação não mais haverá incorporação de aminoácidos na cadeia polipeptídica que está sendo sintetizada Daí concluise que a inclusão de um códon de terminação através da modificação de um dos nucleotídeos do RNAm fará com que a tradução pare antes do local apropriado C E D E R J 200 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos C E D E R J 201 AULA 21 MÓDULO 3 Na aula de hoje vimos que a transcrição em eucariotos é semelhante à transcrição em procariotos No entanto apresenta uma maior complexidade Você teve a oportunidade de aprender que três RNA polimerases sintetizam as diferentes classes de RNA e que elas não conseguem se ligar sozinhas aos seus promotores necessitando de fatores de transcrição adicionais Além disso a terminação da transcrição em eucariotos não é tão bem estabelecida quanto em procariotos Vimos ainda que após a transcrição de RNAs que servirão de molde para a síntese de proteínas RNAs mensageiros ocorre a adição de uma guanosina metilada na extremidade 5 que é chamada capacete bem como a adição de uma cauda poliA na extremidade 3 após a clivagem do RNA em uma região específica Por último vimos que alguns RNAs podem sofrer outro tipo de modificação chamada edição do RNA mecanismo que consiste na modificação da seqüência de nucleotídeos de um determinado RNA através da adição deleção ou modificação de alguns nucleotídeos e discutimos o papel evolutivo da existência de tais mecanismos R E S U M O EXERCÍCIOS 1 Identifique as semelhanças e diferenças entre o mecanismo de transcrição em eucariotos e procariotos 2 O que é o capacete 5 De que maneira ele é adicionado 3 Como ocorre a adição da cauda poliA em RNAs mensageiros 4 No que consiste o mecanismo de edição do RNA 5 Qual a principal conseqüência da edição do RNA 6 Na sua opinião que implicam todas as diferenças observadas entre os mecanismos de transcrição em procariotos e eucariotos C E D E R J 202 Biologia Molecular Fluxo da informação gênica transcrição em eucariotos AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu o conteúdo desta aula não deve ter encontrado dificuldades para responder aos exercícios propostos Sabemos que os mecanismos apresentados são complexos e exigirão paciência e dedicação para a sua compreensão Por isso recomendamos que você estude o conteúdo da aula com calma buscando refletir sobre as informações apresentadas na tentativa de avaliar a sua compreensão sobre o assunto Ao término de cada tópico você pode fazer esquemas e resumos e voltar ao conteúdo da aula para ver se compreendeu corretamente E mais uma vez não hesite em contatar os tutores presenciais e a distância para as eventuais dúvidas que surgirem Na próxima aula estudaremos o mecanismo de retirada dos íntrons e emenda dos éxons bem como a existência dos RNAs autocatalíticos Por isso é importante que você compreenda bem esta aula pois esta compreensão é fundamental para o entendimento dos conteúdos da próxima aula Bom estudo e até lá Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Ao final desta aula você deve ser capaz de Estudar o mecanismo de retirada dos íntrons e emenda dos éxons em préRNAs mensageiros Conhecer o mecanismo de ação dos íntrons autocatalíticos Conteúdo da Aula 21 objetivos 22 A U L A Prérequisito 204 C E D E R J C E D E R J 205 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons INTRODUÇÃO Na aula anterior você teve a oportunidade de estudar o mecanismo de trans crição em eucariotos e algumas das modificações que ocorrem nos transcritos que codificam proteínas Mas as novidades não param por aí existem ainda outras particularidades na produção dos RNAs mensageiros que você terá a oportunidade de estudar nesta aula Vamos lá Um fato interessante obser vado nos genes de eucariotos que codificam proteínas é que eles possuem freqüentemente seqüências que são transcritas mas não são encontradas nos RNAs mensageiros presentes no citosol os quais serão utilizados como molde para a síntese protéica Essas seqüências são conhecidas como seqüências intercalares ou íntrons Os transcritos encontrados no núcleo contendo íntrons são chamados RNAs primários ou RNAs nucleares heterogêneos Ao longo desta aula você entenderá porque eles são chamados heterogêneos Pois bem somente após a retirada dos íntrons temos a formação de um RNA mensageiro maduro O processo pelo qual os íntrons são removidos é chamado emenda Você vai encontrar alguns livros que utilizam o termo em inglês splicing cujo significado é emenda Nas nossas aulas vamos utilizar o termo emenda OK As seqüências mantidas após a emenda são chamadas éxons Na verdade o nome do mecanismo se refere somente à segunda etapa uma vez que primeiro ocorre a retirada dos íntrons e em seguida a emenda dos éxons Um fato interessante observado pelos pesquisadores é que os eucariotos superiores quando comparados aos eucariotos inferiores apresentam maior porcentagem de seus genes interrompidos por íntrons e estes geralmente apresentam um tamanho maior O padrão do tamanho dos íntrons segue grosseiramente a árvore evolutiva ou seja quanto mais complexo o organismo maior o tamanho dos íntrons encontrados em seus genes mas isso não é uma regra geral Alguns genes bacterianos também possuem íntrons mas são muito raros Falaremos sobre eles mais tarde COMO A EXISTÊNCIA DE ÍNTRONS E A EMENDA DOS ÉXONS FORAM DESCOBERTAS A emenda do RNA foi descoberta durante a análise da síntese de RNAm de adenovírus O RNAm que codifica a proteína do capsídeo chamada hexon foi isolado por eletroforese em gel a partir de RNAs citosólicos poliadenilados RNAs que apresentam a cauda poliA conforme visto na Aula 21 Para mapear a região do DNA viral que é transcrita para formar o RNAm do gene hexon os pesquisadores 204 C E D E R J C E D E R J 205 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons hibridaram o RNAm isolado com o DNA correspondente à unidade transcricional desnaturado Você já sabe que o RNA formará um híbrido com o DNA desnaturado naqueles locais onde houver homologia entre eles não é mesmo Pois afinal existe complementaridade das bases uma vez que uma das fitas do DNA serviu de molde para a síntese do RNA Pois bem após a hibridação o híbrido RNADNA foi visualizado através de microscopia eletrônica A Figura 221 ilustra o resultado obtido Observe a figura e acompanhe a explicação a seguir Figura 221 A formação de alças após a hibridação do RNAm e o DNA viral indicou a presença de regiões no DNA que não estavam presentes no RNAm a arranjo dos éxons e íntrons letras A B e C ao longo da porção do DNA do adenovírus b diagrama interpretativo da estrutura observada através de microscopia eletrônica mostrando o pareamento entre o DNA e o RNA as alças A B e C correspondem aos íntrons mostrados em a 5 A B C 3 a b RNA DNA C A B 206 C E D E R J C E D E R J 207 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Após a hibridação observouse a presença de três alças de DNA fita simples A B e C Essas alças correspondem aos três íntrons do gene hexon Os íntrons presentes no genoma viral não estão presentes no RNAm maduro do gene hexon e assim eles formam alças entre as seqüências do éxon que hibridam com suas seqüências complementares no RNAm Análise semelhante de híbridos de RNA isolados de núcleos de células infectadas e DNA viral resultou em RNAs colineares com o DNA viral transcrito primário e RNAs com um ou dois dos íntrons removidos intermediários Daí eles serem chamados RNAs nucleares heterogêneos pois no núcleo se encontram RNAs de diferentes tamanhos RNAs nos quais os íntrons ainda não foram retirados RNAs nos quais alguns íntrons foram retirados e RNAs nos quais todos os íntrons foram retirados formando assim um conjunto de RNAs diferentes mas que na verdade são produtos da mesma unidade transcricional Ficou claro para você Quando se trata de unidades transcricionais pequenas formadas por poucos éxons e íntrons a emenda ocorre logo após a clivagem e a poliadenilação da extremidade 3 do transcrito primário Você está lembrado que vimos isso na Aula 21 Se tiver dúvidas dê uma olhadinha nela Já em unidades transcricionais grandes formadas por vários éxons e íntrons a emenda ocorre no RNA nascente antes que a transcrição esteja completa CARACTERIZAÇÃO DOS ÍNTRONS E SÍTIOS DE EMENDA NO PRÉRNAm A presença de íntrons bem como a caracterização de sítios de emenda no préRNAm pôde ser determinada através da comparação entre a seqüência do DNA genômico correspondente à unidade transcricional e a seqüência de DNAc preparado a partir do RNAm correspondente As seqüências que estão presentes no DNA genômico mas ausentes no DNAC correspondem aos íntrons e permitem a análise das seqüências que circundam a junção entre o éxon e o íntron A análise de muitos RNAs mensageiros diferentes revelou a presença de seqüências moderadamente conservadas Observe a Figura 222 e acompanhe a explicação a seguir DNAC DNA complementar é um DNA sintetizado a partir de um RNAm Os RNAs mensageiros podem ser isolados seletivamente através da purificação de RNAs poliadenilados que contêm a cauda poliA Para isso utilizase uma resina na qual foram ligados oligonucleotídeos poliT Estes vão se parear com a cauda poliA dos RNAs mensageiros podendo posteriormente ser purificados A enzima transcriptase reversa é utilizada para a síntese da molécula de DNA a partir do RNA poliadenilado Através dessa técnica é possível isolar somente as regiões funcionais de um gene ou seja somente as regiões que serão utilizadas para sintetizar proteínas uma vez que as demais seqüências não estarão presentes no RNA mensageiro 206 C E D E R J C E D E R J 207 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons QUIMÉRICO Nome que se dá a um gene ou unidade transcricional gerada a partir da junção de diferentes segmentos de DNA de diferentes genes através das técnicas de DNA recombinante Figura 222 Representação da junção entre os éxons e os íntrons Na extremidade 5do íntron observase a pre sença do dinucleotídeo GU Na extremidade 3 do íntron observase a presença do dinucleotídeo AG A região rica em pirimidinas Pi também está representada A Adenosina em destaque indica o ponto de ramificação Os números no esquema indicam a freqüência de ocorrência desses nucleotídeos nos genes analisados Note que GU AG e o ponto de ramificação A ocorrem em 100 dos genes estudados Para os demais nucleotídeos ocorrem variações A junção entre o íntron e o éxon no préRNAm em eucariotos superiores apresenta uma região rica em pirimidina localizada acima do sítio de clivagem na extremidade 3 Os nucleotídeos conservados universalmente são GU na extremidade 5 e AG na extremidade 3 do íntron A destruição da porção central de diferentes íntrons mostrou que somente 3040 nucleotídeos são necessários em cada extremidade do íntron para que a sua retirada ocorra normalmente e conseqüentemente a emenda dos éxons Um fato bastante curioso foi observado quando pesquisadores utilizaram um DNA recombinante contendo a junção da extremidade 5 entre o éxon e o íntron a partir de uma unidade transcricional e a junção da extremidade 3 entre o éxon e o íntron a partir de uma outra unidade transcricional Você já sabe que um DNA recombinante pode ser obtido quando dois ou mais fragmentos de DNA oriundos de organismos diferentes são unidos através da ação da DNA ligase Esse DNA recombinante foi introduzido em células cultivadas Como resultado observouse a formação de moléculas de RNAm nas quais os dois éxons estavam emendados e o íntron QUIMÉRICO foi retirado de maneira correta A formação de RNAs mensageiros corretos mostrou que o maquinário de retirada dos íntrons e a emenda dos éxons foi capaz de reconhecer corretamente os sítios de clivagem presentes nas extremidades 5 e 3 mesmo sendo heterólogos ou seja proveniente de organismos diferentes Isso indica que o mecanismo é conservado para os diferentes RNAs primários AC A G G G AG U A U U C AG A CU A C G G N Região rica em Pi 70 60 80 100 95 70 80 45 100 80 90 80 100 80 80 60 100 100 2050b PréRNAm éxon 5 íntron éxon 3 Ponto de ramificação Sítio de emenda 5 Sítio de emenda 3 208 C E D E R J C E D E R J 209 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons RETIRADA DOS ÍNTRONS E EMENDA DOS ÉXONS Experimentos in vitro usando extratos celulares foram decisivos para a compreensão do mecanismo de retirada dos íntrons e emenda dos éxons do RNA A observação de moléculas intermediárias formadas durante a reação de emenda in vitro levou à conclusão de que os íntrons não são retirados como moléculas lineares O íntron é removido na forma de uma alça na qual a guanosina da extremidade 5 é unida de forma pouco usual a uma adenosina próxima à extremidade 3do íntron através da ligação fosfodiéster 5 2 ilustrada na Figura 223 A adenosina é chamada ponto de ramificação porque nela ocorre a formação de um braço na estrutura de alça a posição da adenosina já foi ilustrada na Figura 222 Figura 223 Formação da alça no ponto de ramificação O fosfato 5 da Guanosina na extremidade 5 do íntron é ligada ao grupamento hidroxila 2 da Adenosina no ponto de ramificação para formar uma ligação fosfodiéster 5 2 A cadeia rami ficada permanece na seqüência final do íntron que foi retirado e forma a alça A linha pontilhada representa a seqüência do íntron 3 da seqüência do íntron Ligação 2 5 208 C E D E R J C E D E R J 209 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Após a descoberta da formação da estrutura de alça foi possível demonstrar que a emenda ocorre através de duas reações seqüenciais de transesterificação mostradas na Figura 224 Figura 224 Reações seqüenciais de transesterificação durante a emenda Na primeira reação transesterificação 1 a ligação éster entre o fósforo 5 do íntron e o oxigênio 3 do éxon 1 é trocada por uma ligação éster com o oxigênio 2 do resíduo adenosina no ponto de ramificação Na segunda reação transesterificação 2 a ligação éster entre o fósforo 5 do éxon 2 e o oxigênio 3 do íntron é trocada por uma ligação éster com o oxigênio 3 do éxon 1 liberando o íntron na forma de alça e ligando os dois éxons As setas indicam os pontos nos quais os oxigênios dos grupamentos hidroxila ativados reagem com os átomos de fósforo Em cada reação uma ligação fosfato éster é trocada pela outra Não ocorre consumo de energia uma vez que o número de ligações fosfato éster não é alterado na reação O resultado dessas duas transesterificações é que os dois éxons são ligados e o íntron é liberado na forma de uma estrutura de alça 210 C E D E R J C E D E R J 211 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons MUTAÇÃO COMPENSATÓRIA Você deve estar lembrado do que vimos nas aulas anteriores sobre o uso de mutantes para entender a função de diferentes proteínas e assim poder identificar os genes responsáveis pela sua síntese Pois bem a mutação compensatória consiste em utilizar um indivíduo que apresente uma mutação em um determinado gene ou que não possua um determinado segmento de DNA responsável por uma função específica e que conseqüentemente será deficiente em uma determinada etapa de um processo biológico A introdução de um gene ou segmento de DNA que não contenha aquela alteração resgatará a função original e com isso será possível identificar os genes ou os segmentos de DNA que desempenham um papel específico naquele processo PEQUENAS PARTÍCULAS RIBONUCLEOPROTÉICAS NUCLEARES PARTICIPAM DA EMENDA Seis RNAs pequenos ricos em Us são abundantes no núcleo das células de mamíferos Esses pequenos RNAs são chamados snRNAs small nuclear RNAs que significa RNAs nucleares pequenos U1 a U6 e seus tamanhos variam entre 107 e 210 nucleotídeos Mesmo antes da demonstração da emenda in vitro várias observações indicaram a parti cipação dos snRNAs no mecanismo de emenda dos éxons A seqüência consenso encontrada na extremidade 5 dos íntrons CAGGUAAGU mostrou ser complementar a uma seqüência encontrada perto da extre midade 5 do snRNA U1 Além disso snRNAs associados com RNAs heterogêneos foram encontrados em extratos nucleares No núcleo os snRNAs associamse com seis a dez proteínas para formar partículas ribonucleoprotéicas nucleares pequenas chamadas snRNPs do inglês small nuclear RiboNucleoProtein Algumas dessas proteínas são comuns a todos os snRNPs enquanto outras são específicas para snRNPs individuais Evidências para a importância do pareamento da seqüência presente na extremidade 5 do snRNA U1 e a seqüência conservada no sítio da emenda na extremidade 5 foram obtidas a partir de experimentos com genes contendo mutações na seqüência consenso 5 de um íntron Quando os genes apresentando essas mutações foram transferidos para células a emenda dos RNAs correspondentes foi bloqueada Entretanto quando um gene mutante foi coinserido no mutante para snRNA U1 contendo uma seqüência compensatória que restaurava o pareamento com o sítio da emenda 5 a emenda ocorreu normalmente Este resultado sugeriu que o pareamento de bases entre o sítio 5 de um préRNAm e a região 5 do snRNA U1 é necessária para que ocorra a emenda Após a descoberta da estrutura de alça formada nos íntrons que foram retirados uma seqüência consenso foi reconhecida na região adjacente ao ponto de ramificação em préRNAs mensageiros Na levedura S cerevisiae todos os íntrons possuem a seqüência UACUAAC na região do ponto de ramificação A Exceto para o ponto de ramificação A a seqüência da levedura é complementar a uma seqüência interna do snRNA U2 Experimentos de MUTAÇÃO COMPENSATÓRIA semelhantes aos descritos para o snRNA U1 e o sítio de emenda na extremidade 5 demonstraram que o pareamento entre o snRNA da U2 e a seqüência 210 C E D E R J C E D E R J 211 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons do sítio de ramificação no préRNAm é crítico para a emenda O ponto de ramificação A que não é pareado ao snRNA U2 fica exposto permitindo que o seu grupamento hidroxila 2 participe da primeira reação de transesterificação durante a emenda do RNA Estes resultados observados para os snRNAs U1 e U2 indicaram que durante a emenda eles se pareiam com o préRNAm Experimentos adicionais com mutações compensatórias demonstraram que outras interações RNARNA também ocorrem durante a emenda A Figura 225 ilustra as interações descritas anteriormente Figura 225 Modelo de interação entre o préRNAm e os snRNPs a interações entre o préRNAm e o snRNP U1 e U2 b pareamento de bases entre U4 e U6 c U6 troca o pareamento com U4 pelo pareamento com U2 O pareamento de bases com U5 posiciona as regiões 5 e 3 do éxon favorecendo a formação da alça a b C 212 C E D E R J C E D E R J 213 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons UM MODELO PARA O MECANISMO DE EMENDA Com base nos resultados citados anteriormente na identificação de reações intermediárias e em outras análises bioquímicas foi possível propor um modelo para o mecanismo de emenda Observe a Figura 226 e acompanhe a explicação a seguir Emendossoma Rearranjo do pareamento RNARNA Figura 226 Represen tação esquemática do mecanismo de emenda do RNA As snRNPs estão ilustradas bem como as interações entre elas e o préRNAm para formar o emendossoma As duas transesterificações estão representadas resultando na emenda dos éxons e liberação do íntron na forma de alça associado ao emendossoma O íntron é degradado e as snRNPs são recicladas podendo participar novamente da emenda do RNA transesterificação 1 transesterificação 2 ATP 212 C E D E R J C E D E R J 213 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons DOMÍNIOS PROTÉICOS Regiões na seqüência de um polipeptídeo proteína responsáveis pelas suas funções No caso das enzimas os domínios protéicos apresentam as regiões responsáveis pelas atividades catalíticas Esses domínios são geralmente conservados em uma classe de proteínas O modelo propõe que U1 e U2 pareiam com o sítio de emenda 5 e com o ponto de ramificação do íntron respectivamente O snRNAs nos snRNPs U4 e U6 se pareiam em uma longa região complementar Você pode ver a extensão do pareamento na Figura 25b Este complexo se associa a U5 e em seguida ao complexo formado previamente pelo préRNAm pareado com U1 e U2 provavelmente através de interações proteínaproteína O complexo ribonucleoprotéico resultante de alto peso molecular 60S é chamado emendossoma Após a formação do emendossoma ocorrem rearranjos no pareamento dos snRNAs e os préRNAs mensageiros U4 e U6 se dissociam e então U6 se pareia a uma seqüência do U2 que está localizada 5 em relação à seqüência que interage com o ponto de ramificação no préRNAm U1 se desliga do sítio de emenda 5 no pré RNAm após o pareamento de U5 com seqüências próximas ao sítio de emenda Estes rearranjos resultam nas interações mostradas anteriormente na Figura 225 Após o rearranjo a porção protéica do emendossoma catalisa as duas reações de transesterificação que resultam na emenda do RNA Após a segunda reação de transesterificação os éxons ligados são liberados do emendossoma enquanto a alça do íntron permanece associada às snRNPs Este complexo final íntronsnRNP é instável e se dissocia As snRNPs individuais liberadas podem participar de um novo ciclo de emenda O íntron liberado é rapidamente degradado por uma enzima que hidrolisa a ligação fosfodiéster 2 5 no ponto de ramificação e outras RNases nucleares Estimase que pelo menos uma centena de proteínas estejam envolvidas na emenda do RNA o que faz com que esse mecanismo seja tão complexo quanto os mecanismos de síntese protéica e de iniciação da transcrição CONSEQÜÊNCIAS DA EMENDA O mecanismo de emenda dos RNAs apresenta implicações evolutivas Os éxons das unidades transcricionais geralmente coincidem com os DOMÍNIOS PROTÉICOS Os éxons de diferentes genes podem ser trocados através do mecanismo de recombinação Qual a possível conseqüência dessa troca A resposta é simples novos tipos de proteínas podem ser formados 214 C E D E R J C E D E R J 215 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons E não pára por aí A emenda também possibilita a criação de éxons durante a expressão gênica Vamos entender isso melhor utilizando um exemplo No início do desenvolvimento alguns préRNAs mensageiros podem ser emendados de uma maneira formando um RNAm que servirá de molde para a síntese de uma determinada proteína Mais tarde no desenvolvimento o mesmo préRNAm poderá ser emendado de maneira diferente formando um RNAm que servirá de molde para a síntese de uma outra proteína Por que ocorre a formação de proteínas diferentes Ora a seqüência de nucleotídeos no RNAm é quem determina os aminoácidos que serão incorporados no polipeptídeo Se a seqüência do RNAm for alterada em conseqüência da retirada dos íntrons e emenda dos éxons a seqüência do polipeptídeo também será alterada O mecanismo de emenda oferece ainda uma outra maneira de regulação da expressão gênica lembrese de que a regulação já pode ter ocorrido ao nível da iniciação da transcrição pois a eficiência do mecanismo e a forma como ele ocorre influenciam o tipo de proteína que será produzida Vamos utilizar o exemplo do gene que codifica a tropomiosina para ilustrar o que foi explicado anteriormente A tropomiosina é uma proteína envolvida na contração muscular e está presente em muitos tipos celulares diferentes A análise do RNAm da tropomiosina em diferentes tipos celulares revelou arranjos diferentes dos éxons Observe a Figura 227 e acompanhe a explicação a seguir 214 C E D E R J C E D E R J 215 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Figura 227 Organização do gene da αtropomiosina de rato e os sete padrões de emenda alternativa que ocorre nos diferentes tipos celulares apresentados Em cinza escuro éxons presentes em todos os RNAm em cinza mais claro próximo aos dois éxons representados em cinza escuro éxon específico para células do músculo liso em branco éxons específicos para células do músculo estriado e em preto éxon variável Os éxons da musculatura lisa e estriada codificam 39 a 80 aminoácidos que são exclusivos Éxons alternativos também ocorrem nas extremi dades 3 dos diferentes RNAs mensageiros 5NT região 5 não traduzida 3NT região 3 não traduzida A utilização de diferentes éxons de um préRNAm para formar diferentes RNAs mensageiros maduros é chamada emenda alternativa O nome se deve ao fato de existir um grande número de possibilidades alternativas de se combinar os diferentes éxons para produzir os trans critos maduros Estimase que cerca de 5 dos préRNAs mensageiros de eucariotos utilizem a emenda alternativa para formar proteínas dife rentes a partir de um mesmo RNA primário Quando ocorre a emenda alternativa alguns íntrons passam a funcionar como éxons pois eles não são retirados do RNA primário Para o gene que codifica a tropomiosina um único préRNAm é capaz de formar sete tipos de RNAs mensageiros Observe que quando comparamos o RNAm produzido nas células da musculatura lisa ao RNAm produzido nas células da musculatura estriada observamos duas regiões que atuam como éxons na musculatura estriada sendo retiradas como íntrons nas células da musculatura lisa Do mesmo modo uma região que atua como éxon na musculatura lisa é retirada como íntron nas células da musculatura estriada 216 C E D E R J C E D E R J 217 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons O mecanismo é bastante interessante você não acha Todavia a sua regulação não é bem conhecida pois é natural que nos pergun temos Como é que os íntrons e os éxons são escolhidos Uma das explicações é que proteínas ligantes de RNA podem inibir ou ativar o mecanismo de emenda através da exposição ou não dos sítios de ligação reconhecidos pelas snRNPs Uma outra possibilidade é a disponibilida de das snRNPs em alguns tipos celulares ou seja maior concentração implica em maior eficiência na retirada dos íntrons e emenda dos éxons enquanto menor concentração implica em menor eficiência que resulta na não retirada de alguns íntrons ÍNTRONS AUTOCATALÍTICOS Além do mecanismo de emenda descrito anteriormente no qual participam as snRNPs e ocorre a formação do emendossoma existem outros tipos de íntrons que não utilizam proteínas ou ribonucleoproteínas para a emenda dos éxons A grande novidade é o fato de eles serem autocatalíticos ou seja o próprio RNA catalisa a reação Isso foi demonstrado em 1982 por Thomas Cech e colaboradores durante o estudo do RNA ribossomal do protozoário ciliado Tetrahymena thermophila Os pesquisadores sintetizaram o RNA primário contendo íntrons in vitro e observaram que o RNA ribossomal maduro podia ser produzido sem a participação de nenhuma enzima protéica Posteriormente foi descoberto um RNA ribossomal capaz de promover a ligação peptídica entre dois aminoácidos Essas duas descobertas reforçaram a idéia de que alguns RNAs podem apresentar atividade catalítica sendo por isso chamados ribozimas termo resultante da junção de Ribonucléico e Enzimas Os íntrons autocatalíticos foram divididos nos grupos I e II a fim de discriminar o mecanismo de emenda Os íntrons do grupo I são encontrados em alguns genes nucleares mitocondriais e cloroplastiais que codificam RNAs ribossomais RNAs mensageiros e RNAs transportadores Já os íntrons do grupo II são encontrados em préRNAs mensageiros mitocondriais e cloroplastiais de fungos algas e plantas Os raros íntrons descritos em genes bacterianos pertencem aos grupos I e II Da mesma forma que ocorre com a emenda dependente de snRNPs a retirada dos íntrons e emenda dos éxons ocorre através de duas transesterificações 216 C E D E R J C E D E R J 217 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Um grupo hidroxila 2ou 3da ribose faz um ataque nucleofílico em um fósforo e em cada etapa uma nova ligação fosfodiéster é formada O íntron do grupo I utiliza uma guanosina como cofator cujo grupamento 3 OH é utilizado como um nucleófilo na primeira etapa do corte Esta guanosina pode ser mono di ou trifosfato Observe a Figura 228 e acompanhe a explicação a seguir Figura 228 Mecanismo de autoprocessamento de íntrons do grupo I 218 C E D E R J C E D E R J 219 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons O grupamento OH forma uma ligação fosfodiéster com a extremidade 5 do íntron A hidroxila 3 do éxon age como um nucleófilo em uma reação semelhante na extremidade 3 do íntron O resultado é a retirada do íntron e a emenda dos éxons O autoprocessamento do RNA de Tetrahymena pertence a esse grupo A guanosina se liga ao RNA e ataca a extremidade 5do íntron levando ao rompimento da fita de RNA neste local enquanto permanece ligada ao RNA Essa ligação resultará na exposição de uma extremidade 3 OH da guanosina Essa extremidade do éxon então ataca a extremidade 3OH do éxon anterior resultando na junção dos éxons e na liberação do íntron A extremidade 3do íntron ataca uma ligação fosfodiéster perto da extremidade 5do próprio íntron gerando um fragmento circular de RNA mais um fragmento de 15 nucleotídeos contendo a guanosina O RNA circular perde 4 nucleotídeos e se abre produzindo uma molécula linear Este autoprocessamento requer a integridade estrutural do RNA inicial pois o pareamento intracadeia que gera uma estrutura secundária e terciária é essencial para as etapas de corte Isso pode ser comprovado através da utilização de agentes desnaturantes que inibiram o processamento Algumas seqüências consenso foram caracterizadas nesta classe de íntrons Uma região rica em pirimidina CUCUCU ocorre no ponto de corte 5e seqüências ricas em purinas GGGAGG ocorrem dentro dos íntrons Nos íntrons do grupo II o padrão é semelhante exceto que o nucleófilo da primeira etapa nesse caso o grupamento hidroxila 2 é fornecido por um Adenilato presente na seqüência do íntron A Figura 229 ilustra as etapas envolvidas na retirada do íntron Assim ocorre a formação de uma alça como um intermediário da mesma forma que ocorre no ponto de ramificação visto anteriormente para a emenda dependente de snRNPs 218 C E D E R J C E D E R J 219 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons Figura 229 Mecanismo de autoprocessamento de íntrons do grupo II Ponto de ramificação Sítio 3 aceptor éxon 5 íntron éxon 3 ataque nucleofílico éxon 5 íntron éxon 3 éxon 5 íntron éxon 3 Ataque nucleofílico éxon 5 éxon 3 Íntron retirado na forma de alça Sítio 5 220 C E D E R J C E D E R J 221 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons É importante ressaltar que esses dois tipos de autoprocessamento apresentam características também presentes no processamento catalisado pelo emendossoma Em ambos a etapa inicial consiste de um ataque de um grupo OH de uma ribose no ponto de corte 5 A extremidade 3 OH recémformada no éxon anterior atacará o ponto de corte 3 do éxon seguinte formando uma ligação fosfodiéster éxon éxon Além disso em ambas as reações o grupo fosfato de cada ponto de corte é mantido nos produtos e são reações de transesterificação Os mecanismos sugerem que o processamento mediado pelo emendosso ma evoluiu a partir dos mecanismos autocatalíticos sendo que os íntrons do grupo II seriam um intermediário entre os dois mecanismos uma vez que apresentam a formação de uma alça durante a retirada do íntron O principal ponto de evolução nesse caso é o fato de que a atividade catalítica passou do RNA para moléculas protéicas permitindo assim uma melhor regulação do processo AFINAL QUAL A IMPORTÂNCIA DAS RIBOZIMAS Você já deve estar convencido de que para que ocorra a vida é necessário que muitas reações químicas aconteçam dando origem a macromoléculas essenciais ao metabolismo Você já estudou isso em Bioquímica e em outras disciplinas E agora em Biologia Molecular você está vendo mais uma vez que as enzimas desempenham um importante papel nessas reações químicas que vão desde antes da síntese do DNA até a produção das próprias proteínas Você sabe ainda que as enzimas são protéicas e por isso devem ser codificadas por um ácido nucléico Mas para que exista um ácido nucléico é necessária a participação de enzimas E agora Quem surgiu primeiro o ácido nucléico ou a proteína Esta pergunta intriga muitos dos pesquisadores que trabalham na área os quais propuseram algumas hipóteses Na década de 1960 Carl Woese Francis Crick e Leslie Orgel observaram a complexidade funcional e estrutural do RNA e propuseram que essa macromolécula poderia possuir uma função catalítica além da sua função básica informacional o que abriria um novo campo de inves tigação sobre os primórdios da vida A descoberta do RNA catalítico conforme descrito anteriormente e de RNAs que apresentam a capaci dade de catalisar a sua própria replicação permitiu formular a hipótese 220 C E D E R J C E D E R J 221 AULA 22 MÓDULO 3 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons de um mundo primordial formado apenas por moléculas de RNA Nesse mundo do RNA as moléculas se comportavam praticamente como organismos vivos competindo entre si por meio de seleção natural Aquelas que possuíam maior longevidade e estabilidade eram capazes de se replicar mais vezes e com maior fidelidade e como conseqüência aumentavam a sua população e contribuíam para a extinção de molé culas instáveis Com o surgimento do código genético e a conseqüente produção de proteínas criouse um mecanismo mais eficiente uma vez que estava separado do mecanismo informacional e não necessitava de uma estrutura especial para realizar as suas tarefas É possível que a partir daí cada um dos sistemas pôde evoluir com maior eficiência produzindo uma molécula melhor e mais estável capaz de armazenar a informação o DNA e outra molécula mais maleável capaz de assumir diferentes conformações que atuassem em reações diferentes gerando uma melhor especificidade enzimática Assim os RNAs autocatalíticos ou ribozimas seriam uma espécie de elo perdido para os processos conhecidos atualmente Na aula de hoje você teve a oportunidade de conhecer sobre um mecanismo adicional de modificação de RNAs que consiste na retirada de íntrons que são regiões não codificadoras e a emenda dos éxons que são as regiões codificadoras Vimos que em eucariotos existe um tipo de emenda que necessita da participação de um complexo formado por ribonucleoproteínas as quais reconhecem seqüências específicas do RNA e retiram o íntron na forma de uma alça Além disso você teve a oportunidade de conhecer o mecanismo de emenda alternativa que resulta na produção de diferentes RNAs mensageiros a partir de um mesmo RNA primário Ao final da aula você teve a oportunidade de aprender sobre outros mecanismos nos quais o próprio RNA desempenha a quebra da região do íntron e a junção dos éxons e que são por isso chamados íntrons autocatalíticos Por último discutimos a implicação evolutiva da existência de tais RNAs R E S U M O C E D E R J 222 Biologia Molecular Processamento do RNA retirada de íntrons e emenda de éxons EXERCÍCIOS 1 O que são íntrons De que forma a sua existência pode ser comprovada 2 Quais seqüências conservadas puderam ser caracterizadas ao se comparar íntrons de genes diferentes 3 De que forma ocorre a retirada dos íntrons e a emenda dos éxons 4 O que são snRNPs Qual a sua função no mecanismo de emenda 5 O que é emenda alternativa Qual a sua principal conseqüência 6 Como ocorre a emenda dos íntrons dos grupos I e II 7 Qual a importância evolutiva dos RNAs autocatalíticos AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu o conteúdo desta aula não deve ter encontrado dificuldades para responder aos exercícios propostos Sem fugir à regra dos assuntos tratados anteriormente nesta aula apresentamos uma série de processos moleculares mediados por muitas enzimas em inúmeras etapas Recomendamos mais uma vez que ao término de cada tópico você faça esquemas e resumos e volte ao conteúdo da aula para ver se compreendeu tudo corretamente A partir da próxima aula veremos os mecanismos de regulação da expressão gênica em procariotos e eucariotos Como você já deve ter notado os conteúdos não são independentes e a nãocompreensão de uma etapa compromete a compreensão da próxima Por isso é importante que você compreenda bem as aulas sobre transcrição em procariotos e eucariotos para que possa entender as aulas sobre regulação da expressão gênica Bom estudo e até lá Ao final desta aula você deverá ser capaz de Entender o mecanismo de regulação gênica ao nível transcricional em procariotos Estudar diferentes tipos de regulação utilizando os Operons lac ara e trp como modelos Conteúdo da Aula 5 Módulo 1 Conteúdo da Aula 20 Módulo 3 Regulação da expressão gênica em procariotos objetivos 23 A U L A Prérequisitos Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 224 C E D E R J 225 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 INTRODUÇÃO Você já teve a oportunidade de estudar na Aula 5 do Módulo I que existem muitos tipos de RNA na célula e que muitas vezes o próprio RNA apresenta função biológica como é o caso dos rRNAs RNAs ribossomais dos tRNAs RNAs transportadores e de outros RNAs Para relembrar você pode e deve retornar àquela aula e rever esse assunto Então quando pensamos em expressão gênica ou seja na ativação de um gene para produzir uma molécula biologicamente ativa não podemos nos esquecer desses RNAs principalmente porque eles também participam do mecanismo de síntese protéica e que a sua presença e funcionalidade influenciam diretamente na produção de uma proteína Assim quando falamos em regulação da expressão gênica estamos nos referindo aos genes que codificam proteínas e aos genes que codificam RNAs funcionais Nas Aulas 20 e 21 deste módulo você teve a oportunidade de estudar como ocorre a transcrição em procariotos Mais precisamente o mecanismo basal de transcrição ou seja o maquinário envolvido na produção de um RNA com ênfase para o mecanismo de produção de mRNAs RNAs mensageiros No entanto para a maioria dos genes ocorre um mecanismo de regulação para a sua expressão POR QUE REGULAR A EXPRESSÃO GÊNICA Alguns produtos gênicos como as moléculas de tRNA rRNA proteínas ribossomais RNA polimerase e enzimas que participam de processos metabólicos essenciais são chamados moléculas de manutenção pois são componentes essenciais de quase todas as células de qualquer organismo vivo Os genes responsáveis pela produção dessas moléculas de manutenção são expressos continuamente e são por isso chamados genes constitutivos Em contrapartida a quantidade de genes em uma determinada célula ou tipo celular é muito maior do que o número de proteínas necessário para o funcionamento daquela célula Partindo desse ponto a expressão desnecessária de genes e conseqüente produção de proteínas resultaria em um gasto energético muito grande Então podemos concluir que é vantajoso regular a transcrição modulando assim os níveis de RNAs que são produzidos em um determinado momento da vida daquela célula Se pensarmos em termos evolutivos a existência de um mecanismo de regulação provavelmente ofereceu aos organismos que o possuíam uma vantagem seletiva sobre os organismos que não o possuíam e por isso muitos dos organismos tais como bactérias ancestrais e vírus apresentam mecanismos fantásticos e altamente elaborados de regulação da expressão de seus genes Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 224 C E D E R J 225 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Nesta aula você terá a oportunidade de conhecer alguns mecanismos que permitem a regulação da expressão gênica em procariotos Então vamos a eles Os procariotos sofrem com pequenas variações do meio ambiente o que leva à necessidade de ajuste no seu metabolismo visando a uma melhor adaptação às variações do meio externo Então surge a primeira pergunta De que maneira algumas proteínas podem variar sua quantidade na célula em resposta ao meio no qual o organismo se encontra Na verdade a partir de um DNA molde até a produção de uma proteína funcional existem vários pontos que podem influenciar a expressão gênica A Figura 231 ilustra tais pontos Figura 231 Ilustração das diferentes etapas do fluxo da informação gênica e os dife rentes pontos em que a produção de uma proteína funcional pode ser regulada A regulação pode ocorrer durante a transcrição e a conseqüente pro dução do RNA bem como após a transcrição através do processamento A estabilidade do transcrito também influencia a síntese da proteína Outro ponto de regulação ocorre durante a tradução ou síntese protéica e tam bém por modificações na proteína que estarão intimamente relacionadas a sua funcionalidade assuntos que serão tratados nas aulas do Módulo 4 De um modo geral a regulação durante a transcrição é a mais comum de ocorrer principalmente em procariotos De certo modo é fácil com preender o porquê disso É mais barato para a célula energeticamente falando evitar que a transcrição ocorra quando a proteína não é necessária do que ativar os demais mecanismos uma vez que já houve o gasto com a produção do transcrito Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 226 C E D E R J 227 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 GENES ESTRUTURAIS Genes que codificam a seqüência de aminoácidos de proteínas estruturais Tais genes são diferentes dos genes reguladores GENE REGULADOR Gene responsável pela produção de um produto gênico que regula a expressão de outros genes Muitos genes reguladores precisam de outros genes reguladores que atuam na sua ativação e assim por diante Existem dois tipos possíveis de regulação da transcrição e em ambos existe a participação de um GENE REGULADOR Um deles é conhecido como controle positivo no qual o produto do gene regulador é necessário para ativar a expressão de um ou mais genes estruturais Nesse caso o produto do gene regulador é chamado ativador No outro conhecido como controle negativo o produto do gene regulador é necessário para desativar a expressão de GENES ESTRUTURAIS Nesse outro caso o produto do gene regulador é chamado repressor Vimos na Aula 20 e também na Aula 21 que a expressão de um gene transcrição é iniciada quando a RNA polimerase se liga ao promotor em uma seqüência específica O produto do gene regulador ativador ou repressor se liga a uma seqüência localizada próxima ao promotor Algumas vezes o produto do gene regulador não consegue se ligar sozinho ao gene e precisa de uma molécula chamada efetora As moléculas efetoras são pequenas moléculas tais como aminoácidos açúcares e outros metabólitos semelhantes Quando participam em conjunto com um ativador são chamadas moléculas indutoras ou simplesmente indutores e quando participam em conjunto com um repressor são chamadas moléculas corepressoras ou simplesmente corepressores O mecanismo de ação das moléculas efetoras indutoras ou corepressoras consiste na sua ligação ao produto do gene regulador promovendo uma mudança na sua conformação A mudança conformacional de proteínas geralmente resulta em alteração na sua atividade No caso do produto do gene regulador essa mudança altera a sua capacidade de se ligar na região do DNA próxima ao promotor do gene que ele controla A Figura 232 ilustra alguns padrões simples de regulação da transcrição Observe a Figura e acompanhe a explicação a seguir Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 226 C E D E R J 227 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Figura 232 Exemplos de regulação negativa e positiva a molécula efetora se liga ao repressor fazendo com que ele se desligue do operador b molécula efetora se desliga do repressor fazendo com que ele se desligue do operador c ativador promove a transcrição da ausência da molécula efetora d ativador promove a transcrição na presença da molécula efetora Podemos observar que durante a regulação negativa o repressor está ligado ao operador na ausência da molécula efetora corepressor A molécula efetora provoca a dissociação do repressor para permitir a transcrição No outro caso o repressor está ligado na presença da molécula efetora Quando esta é removida o repressor libera o operador e permite a transcrição Na regulação positiva o ativador se liga ao operador na ausência da molécula efetora indutor ativando a transcrição Na presença desta o ativador é desligado e pára a transcrição No outro exemplo o ativador está ligado na presença da molécula efetora Quando esta é removida o ativador é desligado e pára a transcrição Com esses exemplos você pode observar que existe mais de um tipo de regulação positiva e negativa Para facilitar a compreensão do funcionamento dessas diferentes moléculas vamos utilizar alguns exemplos de regulação em Escherichia coli que utilizam um ou mais de um dos sistemas citados Regulação negativa Regulação positiva repressor ligado inibe a transcrição ativador ligado facilita a transcrição Operador RNA polimerase Promotor DNA RNAm RNAm RNAm RNAm 5 3 5 3 5 3 5 3 b a d c Efetor Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 228 C E D E R J 229 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 PROMOTOR Você já viu a função dos promotores dos genes nas Aulas 20 e 21 Se não estiver se lembrando volte lá e confira Naquela ocasião falamos que um promotor ativará a expressão de uma unidade transcricional No caso do Operon a unidade transcricional produz um RNA que codifica mais de um produto funcional Figura 233 Esquema representativo de um Operon de procarioto Os genes AB e C são transcritos em um RNA policistrônico As seqüências reguladoras incluem os sítios de ligação para proteínas que ativam ou reprimem a transcrição a partir do promotor O OPERON LAC Em 1961 os pesquisadores François Jacob e Jacques Monod apresentaram pela primeira vez um modelo de regulação da transcrição em Escherichia coli ao estudarem o mecanismo de utilização da lactose como fonte de carbono por essa bactéria Esse trabalho de extrema importância para a compreensão das interações entre diferentes produtos gênicos lhes rendeu um Prêmio Nobel de Medicina em 1965 Por aí vocês podem dimensionar a importância de tais descobertas Jacob e Monod propuseram que a transcrição de dois ou mais genes contíguos é regulada por dois elementos Um desses elementos o gene repressor codifica uma proteína que em certas circunstâncias se liga a um segundo As bactérias possuem um mecanismo geral para a regulação coordenada de genes que codificam produtos relacionados ao funcionamento de um determinado processo bioquímico Exemplos disso são a rota de biossíntese de aminoácidos na qual participam várias enzimas e o metabolismo de açúcares Os genes que codificam os produtos envolvidos nos diferentes passos de uma rota estão agrupados em uma região particular do cromossomo e geralmente são transcritos como uma única molécula de RNA A maioria dos mRNAs de procariotos é policistrônica ou poligênica o que significa que um mesmo transcrito codifica para mais de uma proteína A produção do transcrito policistrônico é dirigida por um único PROMOTOR o qual possui seqüências que são responsáveis pela sua regulação O conjunto formado pelos genes pelo promotor e pelas seqüências regulatórias recebe o nome Operon A Figura 233 ilustra um Operon de procariotos A B C Promotor Sítio de ligação do ativador Seqüências reguladoras Sítio de ligação do repressor Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 228 C E D E R J 229 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 elemento o operador O operador está sempre próximo ao gene ou aos genes cuja expressão é regulada por ele É importante citar que na época em que os dois pesquisadores fizeram seus experimentos a função dos promotores que vimos anteriormente ainda era desconhecida Quando o repressor está ligado ao operador ele inibe a atividade da RNA polimerase Os operadores estão geralmente localizados entre o promotor e a região codificadora do gene Surgiu então pela primeira vez o conceito de Operon sendo formado pelo promotor operador e unidade transcricional O Operon lac contém um promotor P um operador principal O1 dois operadores secundários O2 e O3 e três genes estruturais lacZ lacY e lacA que codificam as enzimas βgalactosidase permease e transacetilase Além disso apresentam o gene que codifica o repressor gene I que possui seu próprio promotor A Figura 234 ilustra o arranjo dos diferentes componentes do Operon lac A enzima βgalactosidase é capaz de clivar a lactose em glicose e galactose que assim servirão como fonte de carbono para a célula A βgalactosidase é uma enzima indutível uma vez que sua produção varia de acordo com as necessidades celulares Sua expressão será alta caso a bactéria esteja crescendo em meio rico em lactose e será baixa caso exista um outro carboidrato como fonte de carbono A galactosídeo permease como seu próprio nome sugere é a proteína responsável pelo transporte de lactose do meio extracelular para o meio intracelular através da membrana bacteriana A lactose como a maioria dos carboidratos não é capaz de atravessar a bicamada lipídica sem uma proteína carreadora O papel da transacetilase in vivo ainda é incerto mas in vitro ela é capaz de transferir uma acetila do acetilCoA para a hidroxila do carbono 6 de um tiogalactosídeo A Figura 235 ilustra o metabolismo de lactose em Escherichia coli desde a sua entrada até a sua quebra promovida pela βgalactosidase Figura 234 Esquema repre sentativo dos componentes do Operon lac de Escherichia coli As regiões correspondentes aos promotores operadores genes estruturais e genes reguladores estão representadas Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 230 C E D E R J 231 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Figura 235 O metabolismo de lactose em Escherichia coli A captação da lactose é feita pela galactosídeo permease Em seguida a βgalactosidase cliva a lactose em galactose e glicose Além disso também é capaz de produzir uma outra molécula chamada alolactose Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 230 C E D E R J 231 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Observe que além de clivar a lactose em galactose e glicose a βgalactosidase também promove a formação de uma molécula chamada alolactose Mais adiante voltaremos a falar sobre o papel dessa molécula na regulação do Operon lac O estudo de mutantes do Operon lac revelou alguns detalhes do funcionamento do sistema regulatório dos Operons Você já notou que os mutantes estão em todos os lugares não é mesmo Na ausência de lactose os genes do Operon lac estão reprimidos Mutações no operador ou no gene I levam à síntese constitutiva dos produtos gênicos Quando o gene I estiver defeituoso a repressão pode ser restaurada introduzindo um gene funcional I na célula ou numa outra molécula de DNA demonstrando que o gene I codifica uma molécula difusível que causa a repressão Essa molécula é uma proteína chamada repressor Lac O repressor Lac é um tetrâmero composto por monômeros idênticos ou seja quatro moléculas da mesma proteína se unem para formar a estrutura funcional A Figura 236 ilustra o repressor Lac Figura 236 Esquema representando a molécula do repressor Lac a Lac monomérica b Lac tetramérica Os sítios de ligação ao indutor e ao DNA estão indicados Ligação ao DNA Repressor Lac monomérico Repressor Lac tetramérico Ligação ao indutor a b Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 232 C E D E R J 233 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 O operador ao qual ele se liga mais fortemente chamado O1 encontrase ao lado do sítio de início da transcrição O gene I é transcrito a partir do seu próprio promotor P1 e é independente dos genes do Operon lac O Operon lac possui ainda outros dois operadores secundários aos quais se liga o repressor Lac O operador O2 está localizado próximo à posição 410 dentro do gene que codifica para a βgalactosidase Já o operador O3 está localizado próximo à posição 90 dentro do gene I que codifica o repressor O repressor Lac se liga ao operador principal O1 e a um dos operadores secundários O2 ou O3 Como conseqüência ocorre a formação de uma alça formada pelo DNA presente nos dois sítios de ligação A formação da alça bloqueia o início da transcrição Veja na Figura 237 a estrutura da alça descrita anteriormente Figura 237 O repressor Lac se liga ao operador principal O1 e a um dos operadores secundários O2 ou O3 formando uma alça no DNA que envolve o repressor como mostrado Essa estrutura esconde o promotor dos genes Z Y e A impedindo a sua transcrição A ligação do repressor Lac reduz em cerca de 1000 vezes a velocidade de iniciação da transcrição Se os sítios O2 e O3 forem eliminados por deleção ou mutação a ligação do repressor no sítio O1 reduz a transcrição em cerca de 100 vezes Apesar desse elaborado complexo de ligação a repressão não é absoluta Mesmo no estado reprimido cada célula possui algumas moléculas de βgalactosidase e da galactosídeo permease presumivelmente sintetizadas nas raras ocasiões em que o repressor dissociase temporariamente dos operadores Esse nível de transcrição basal é essencial para a regulação do Operon DNA Repressor Lac Operadores Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 232 C E D E R J 233 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Quando a lactose está disponível o Operon lac é induzido Uma molécula indutora sinal se liga a um sítio específico do repressor Lac causando uma mudança conformacional que leva à dissociação do repressor do operador O indutor do sistema do Operon lac não é a própria lactose mas sim um isômero da lactose chamado alolactose Conforme vimos anteriormente depois de entrar na célula a lactose é convertida em alolactose por uma das poucas moléculas de βgalactosidase existentes A liberação do repressor Lac causada pela alolactose permite que os genes do Operon lac sejam expressos e leva a um aumento de 1000 vezes na concentração da βgalactosidase A presença da glicose inibe a indução do Operon lac bem como outros Operons que controlam a síntese de enzimas envolvidas com o catabolismo de carboidratos Esse fenômeno chamado repressão catabólica assegura que a glicose será preferencialmente utilizada quando presente em vez de uma outra fonte de carbono A repressão catabólica é mediada por uma proteína regulatória chamada CRP do inglês cAMP receptor protein que significa proteína receptora de cAMP também conhecida como CAP do inglês Catabolite Activator Protein que significa proteína ativadora por catabólito e por uma molécula efetora pequena chamada cAMP AMP cíclico adenosina 3 5 monofosfato A proteína CRP é um homodímero cada subunidade possui massa de 22 kDa que possui sítios de ligação para o DNA e o cAMP Sabese que o promotor lac contém dois sítios de ligação separados um deles para a ligação da RNA polimerase e outro para a ligação do complexo CRPcAMP A Figura 238 ilustra a ligação do complexo CRPcAMP no DNA Figura 238 Complexo proteína CRPcAMP ligado ao DNA Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 234 C E D E R J 235 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 O complexo precisa estar presente no seu sítio de ligação para que o promotor do Operon lac seja ativado O complexo exerce um controle positivo na transcrição do Operon lac oposto ao efeito observado para a proteína repressora Somente o complexo se liga ao promotor Na ausên cia de cAMP a proteína CRP não se liga A concentração intracelular de cAMP é sensível à presença de glicose A glicose inibe a atividade da enzima adenilatociclase responsável pela síntese de cAMP de modo que na presença de glicose os níveis de AMPc serão baixos e com isso não haverá a formação do complexo com a proteína CRP e a conseqüente ligação ao promotor mantendo o Operon lac inativo Neste ponto faremos uma pausa para reflexão sobre os diferentes tópicos que foram abordados até agora Vamos tentar resumir os principais aspectos da regulação do Operon lac para facilitar a compreensão e darmos continuidade com os demais exemplos A Figura 239 resume a regulação do Operon lac Figura 239 Resumo da regulação do Operon lac Na ausência de glicose e presença de lactose o complexo CRP cAMP se liga ao promotor estimulando a transcrição ao mesmo tempo que o repressor Lac será desligado do operador pela ação da alolactose Na presença de glicose o complexo CRPcAMP não se forma e conseqüente mente não ocorre a transcrição Mas para que a transcrição ocorra também é necessária a presença da lactose que através do seu derivado alolactose irá deslocar o repressor Lac do operador Glicose baixa cAMP alta cAMP CRP Repressor Lac ligado Lactose Repressor Lac Repressor Lac Lactose RNA RNA polimerase Promotor Sítio CRP Glicose alta cAMP baixa Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 234 C E D E R J 235 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 A lactose não é a principal fonte de carbono utilizada pela bactéria Escherichia coli No entanto na falta de glicose ela pode ser metabolizada Para evitar um desperdício de energia durante a produção das proteínas envolvidas no metabolismo da lactose elas somente serão produzidas quando a lactose estiver presente no ambiente Então na ausência de lactose existe uma proteína repressora chamada Lac que se liga ao operador do Operon e faz com que ele fique inativo Na presença de lactose a enzima βgalactosidase produz alolactose que funciona como um agente indutor uma vez que se liga ao repressor Lac e faz com que ele se desligue do operador Pois bem essa é uma das formas de regulação A segunda é modulada pela presença da glicose Existe uma proteína CRP que ativa a transcrição dos genes do Operon lac através da sua ligação com uma região localizada no promotor do Operon No entanto a proteína CRP só é capaz de se ligar ao promotor caso ela esteja ligada ao cAMP que por sua vez só estará disponível quando a glicose estiver baixa uma vez que a glicose inibe a enzima que produz o cAMP Deste modo podemos concluir que quando existir lactose e glicose a glicose será utilizada primeiro e a lactose só será utilizada quando os níveis de glicose baixarem e houver produção de cAMP Em adição a presença da lactose é necessária para produzir a alolactose que é a molécula que permitirá o desligamento do repressor Lac do operador Agora podemos analisar o segundo exemplo de Operon chamado Operon ara responsável pelo metabolismo do açúcar arabinose O OPERON ARA Um esquema regulador mais complexo é encontrado no Operon arabinose ara de Escherichia coli A Figura 2310 ilustra o Operon ara Observe a figura e acompanhe a explicação a seguir Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 236 C E D E R J 237 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 A Escherichia coli pode usar a arabinose como uma fonte de carbono convertendoa em xilulose5fosfato um intermediário na via da pentose fosfato Essa conversão requer as enzimas ribulose cinase arabinose isomerase e ribulose5fosfato epimerase codificadas pelos genes araB araA e araD respectivamente Os três genes estão presentes no Operon ara Além disso o Operon possui dois operadores araO1 e araO2 mais o sítio araI I de indutor ao qual se liga a proteína reguladora AraC e um promotor adjacente ao araI responsável pela transcrição dos genes araB araA e araD PBAD O promotor araO2 possui um único sítio de ligação para a proteína AraC enquanto araI e araO1 possuem dois sítios de ligação na mesma orientação O gene araC está localizado próximo a essa região e é transcrito a partir do seu próprio promotor PC mas a sua orientação é oposta aos genes araB A e D O sítio de ligação da CRP está localizado próximo ao promotor PBAD que modula a sua ativação de forma diferente da que vimos para o Operon lac Figura 2310 Representação esquemática do Operon ara Os diferentes componentes do Operon estão representados bem como a rota de metabolismo da arabinose Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 236 C E D E R J 237 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 No Operon ara a proteína reguladora AraC exerce um controle positivo e também um controle negativo De que maneira isso é possível Pois bem a proteína reguladora se liga a uma molécula sinal arabinose que promove uma mudança conformacional na sua estrutura Essa mudança faz com que a proteína mude de uma forma repressora para uma forma ativadora da transcrição Essa mudança tem conseqüências drásticas no seu efeito final Além disso a proteína repressora AraC regula sua própria síntese através da inibição da transcrição do próprio gene Esse mecanismo é chamado autoregulação Por último os efeitos de algumas seqüências reguladoras podem ser exercidos a distância ou seja essas seqüências nem sempre estão localizadas próximas dos promotores As seqüências de DNA distantes podem ser aproximadas pela formação de uma alça de DNA Essa aproximação ocorre através de interações específicas proteínaproteína e proteínaDNA O papel da proteína AraC na regulação do Operon ara é complexo Vamos tentar entender como isso funciona Quando a concentração de AraC excede 40 cópias por célula ela regula sua própria síntese ligandose ao araO1 e reprimindo a transcrição do gene araC Ela age tanto como um regulador positivo como negativo dos genes do araBAD e nessa qualidade ligase tanto ao araO2 quanto ao araI Quando ligada ao araO2 ela se liga simultaneamente ao araI e inibe a transcrição a partir do PBAD Quando a arabinose está ausente não é necessário expressar os genes estruturais que participam do seu metabolismo A AraC se liga simultaneamente ao araO2 e ao araI e como resultado promove a formação de uma alça que compreende o DNA localizado entre os dois sítios A formação da alça impede o acesso da RNA polimerase ao promotor A Figura 2311 ilustra a estrutura da alça Figura 2311 Esquema representativo da formação da alça de DNA em função da liga ção da proteína AraC no araO2 e no araI Observe que a estrutura esconde o PBAD e impede a transcrição dos genes estruturais Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 238 C E D E R J 239 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Quando a arabinose está presente ela se liga à proteína AraC e provoca uma alteração conformacional que faz com que a AraC assuma a sua função como ativadora da transcrição AraC se liga ao araI que funciona também como um sítio ativador Se a glicose estiver ausente ocorre a formação do complexo CRPcAMP o qual se ligará ao seu sítio de ligação localizado entre o araO2 e o araI Essa ligação faz com que a alça de DNA formada pela proteína ligada ao araO2 e araI se rompa e auxilia na ligação da AraC ao araI Nesse caso o complexo CRPcAMP não exerce a função de auxiliar a ligação da RNA polimerase ao promotor A Figura 2312 ilustra o que foi descrito e a Figura 2313 apresenta um resumo dos diferentes eventos Figura 2312 A ligação do complexo CRPcAMP auxilia a ligação da AraC ativadora após a ligação com arabi nose no araI e promove a abertura da alça de DNA Figura 2313 Regulação do Operon ara Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 238 C E D E R J 239 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Quando tanto a arabinose quanto a glicose estão abundantes ou ambas estão ausentes o Operon ara permanece reprimido Todavia não se sabe ao certo a situação em que se encontram as proteínas reguladoras e os seus sítios de ligação nestas condições A regulação do Operon ara é rápida e reversível um exemplo de mudança de resposta no nível de regulação gênica à troca de condições ambientais Agora que você já teve contato com dois tipos de Operons que modulam o metabolismo de açúcares veremos o terceiro exemplo de Operon desta aula que está relacionado com a biossíntese do aminoácido triptofano O OPERON TRIPTOFANO Os vinte aminoácidospadrão são requeridos em grandes quantidades para a síntese de proteínas e a Escherichia coli é capaz de sintetizar todos eles Os genes das enzimas necessárias para sintetizar um certo aminoácido estão geralmente agrupados num Operon e são expressos todas as vezes em que os suprimentos do aminoácido sejam inadequados para atender às necessidades celulares Quando o aminoácido estiver abundante as enzimas biossintetizantes não são mais necessárias e o Operon é reprimido O Operon triptofano trp da Escherichia coli inclui cinco genes estruturais que codificam as três enzimas utilizadas na conversão de corismato em triptofano A Figura 2314 ilustra o Operon triptofano Observe a figura e acompanhe as explicações a seguir Figura 2314 Esquema ilus trando o Operon trp bem como as etapas envolvidas na conversão de corismato a triptofano Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 240 C E D E R J 241 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 O gene trpE codifica o componente I da antranilato sintase enquanto o componente II é produzido pelo gene trpD O gene trpC codifica a N 5fosforribosil antranilato isomerase indol 3 glicerol fostato sintase O gene trpB codifica a subunidade β da triptofano sintase enquanto o gene trpA codifica a subunidade α A expressão do Operon é regulada pela proteína repressora TrpR que é produzida a partir do gene trpR O gene trpR está localizado a uma longa distância do Operon O repressor Trp é um homodímero com cada subunidade contendo 107 resíduos de aminoácidos Quando o triptofano for abundante ele se liga ao repressor Trp provocando uma alteração conformacional que permite ao repressor se ligar ao operador trp e inibir a expressão do Operon trp O sítio do operador trp se sobrepõe ao promotor de forma que a ligação ao repressor pode bloquear a ligação da RNA polimerase Novamente esse circuito simples ligardesligar mediado pelo repressor não nos conta toda a história regulatória Um mecanismo muito mais intrigante foi descoberto no Operon trp Quando foi descoberta a regulação negativa do operon trp modulada pelos níveis de triptofano e a sua ligação à TrpR acreditavase que um mutante para o gene trpR deveria ser insensível ao triptofano Imagine a surpresa quando descobriram que tal mutante continuava não expressando os genes estruturais após a adição de triptofano A partir dessa observação estabeleceuse um segundo nível de controle pelo triptofano que envolvia dois componentes o tRNA para o triptofano tRNAtrp e o gene trpL O gene trpL codifica um peptídeo que possui 14 aminoácidos Na sua seqüência ele contém dois códons para o triptofano e dessa forma serve como um termômetro que sinaliza o suprimento de trp na célula Se o triptofano estiver abundante o tRNAtrp carregado com triptofano também estará disponível e com isso o peptídeo será traduzido Se o triptofano estiver ausente a tradução pára no ponto em que os ribossomos encontram os códons trp Você deve estar se perguntando E daí O que isso tem a ver com a transcrição do Operon A resposta para essa pergunta foi dada a partir da observação de que o mRNA do trpL pode assumir diferentes conformações devido à presença de várias regiões complementares que podem formar estruturas do tipo grampo de cabelo Uma das conformações é muito Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 240 C E D E R J 241 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 semelhante ao terminador da transcrição típico de bactérias Você já teve a oportunidade de conhecer essa estrutura na Aula 20 Ela é resultante do pareamento entre as regiões 3 e 4 e está ilustrada na Figura 2315 Na outra conformação o terminador não é formado porque a região 3 está agora pareada com a região 2 ilustrada na Figura 2316 Essas estruturas são chamadas terminador e antiterminador respectivamente Figura 2315 Estrutura do terminador formado através do pareamento das regiões 3 e 4 do gene trpL Figura 2316 Estrutura do antitermina dor formado através do pareamento das regiões 2 e 3 do gene trpL O que leva à formação de uma ou de outra estrutura Você já sabe que em procariotos a transcrição e a tradução podem ocorrer simultaneamente não é mesmo Então os ribossomos estão ligados ao RNAm e podem influenciar a formação dessas estruturas no RNA Se houver triptofano o ribossomo segue logo atrás da RNA polimerase até o ponto em que é interrompido por um códon de parada localizado na região 2 do transcrito Nessa situação ocorre a formação da alça através do pareamento entre as regiões 3 e 4 Se não houver triptofano o tRNAtrp não estará carregado com triptofano e o ribossomo ficará detido na região 1 esperando a chegada de um tRNA apropriado Com isso a região 2 está livre e pode se parear com a região 3 Essa estrutura não impede o avanço da RNA polimerase e o transcrito dos genes estruturais é produzido normalmente A Figura 2317 resume os eventos que foram descritos 34 Terminador 23 Antiterminador Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 242 C E D E R J 243 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 Figura 2317 Mecanismo de regulação da transcrição por atenuação no Operon trp A seqüência regulatória 1 é crucial para o mecanismo sensível ao triptofano que determina se a seqüência 3 pareia com a seqüência 2 permitindo que a transcrição continue ou com a seqüência 4 transcrição atenuada Com esses três exemplos estudados você pode ter uma idéia dos diferentes mecanismos de regulação da transcrição em procariotos Você pôde observar que nos três casos a presença da molécula envolvida na rota bioquímica é quem determina a expressão dos genes estruturais Quando os níveis de triptofano forem altos o ribossomo rapidamente traduz a seqüência 1 janela de leitura do peptídeo líder e bloqueia a seqüência 2 antes que a seqüência 3 seja transcrita A transcrição continuada leva à atenuação na estrutura do atenuador semelhantemente ao terminador formado pelas seqüências 3 e 4 Quando os níveis de triptofano forem baixos o ribossomo pausa nos códons do Trp na seqüência 1 A formação da estrutura pareada entre as seqüências 2 e 3 previne a atenuação porque a seqüência 3 não estará mais disponível para formar a estrutura do atenuador com a seqüência 4 A estrutura 23 ao contrário do atenuador 34 não impede a transcrição Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 242 C E D E R J 243 C E D E R J AULA 23 MÓDULO 3 R E S U M O Nesta aula você teve a oportunidade de aprender que existem muitos mecanismos possíveis de regular a expressão de um gene mas que o mais comum é a regulação da transcrição Nós falamos sobre um tipo especial de regulação que é muito comum em procariotos conhecida como Operon Vimos que em um Operon existem vários genes que codificam proteínas relacionadas a um determinado processo bioquímico e que esses genes são expressos em conjunto No Operon existem alguns componentes que codificam proteínas reguladoras as quais podem ativar ou desativar a expressão dos genes No caso do Operon lac você viu que ele é regulado por uma proteína repressora que se liga ao sítio operador e só será desligada na presença do indutor alolactose Viu ainda que o complexo CRPcAMP ativa a transcrição do Operon quando não existe glicose disponível Mais adiante vimos um segundo Operon envolvido na utilização do açúcar arabinose Neste caso a regulação é mais complexa pois a proteína AraC que regula o Operon atua tanto como repressor como ativador da transcrição dos genes estruturais O complexo CRPcAMP também participa do processo mas não ativa a transcrição do Operon E por último vimos que o Operon trp é regulado pela presença do aminoácido triptofano na célula Este Operon responde a dois sistemas de regulação um deles através da proteína repressora TrpR que se liga ao operador na presença de triptofano e também um segundo mecanismo chamado atenuação que regula a transcrição dos genes estruturais através da formação de estruturas tipo grampo de cabelo na molécula do RNAm Esse tipo de regulação é possível graças à sincronia entre o processo de transcrição e tradução que ocorre em procariotos Em síntese podemos dizer que regulação da transcrição dos genes está intimamente relacionada às necessidades fisiológicas da célula Todos esses mecanismos têm como objetivo otimizar a utilização dos recursos pela célula e minimizar o gasto desnecessário com a produção de produtos que só são utilizados em determinadas circunstâncias É claro que existem outros mecanismos para outros genes mas nós vamos parar por aqui pois se você compreender o funcionamento destes que foram apresentados já terá uma idéia da complexidade de outros mecanismos similares Biologia Molecular Regulação da expressão gênica em procariotos 244 C E D E R J EXERCÍCIOS 1 Quais são os possíveis pontos de controle na expressão de um gene que codifica para uma proteína 2 O que é um Operon 3 Qual o papel da proteína CRP no mecanismo de regulação do Operon lac 4 Como ocorre a regulação do Operon ara 5 O mecanismo de regulação por atenuação pode ocorrer em eucariotos Justifique sua resposta AUTOAVALIAÇÃO Se você compreendeu bem o conteúdo desta aula não deve ter encontrado dificuldades para fazer os exercícios Tenha em mente que os diversos exemplos utilizados servem como modelos para compreender a complexidade envolvida em mecanismos celulares relativamente simples Nas próximas aulas você conhecerá alguns mecanismos envolvidos na regulação da expressão gênica em eucariotos que são bem mais complexos do que em procariotos Por isso é importante que você estude com carinho os conteúdos desta aula para que possa compreender as próximas Bom estudo e até a próxima Gabarrito CEDERJ 246 CEDERJ 247 Aula 9 Aula 10 1 Sim A partir da replicação que significa produzir uma réplica do DNA idêntico ao original é possível perpetuar as informações genéticas que serão transmitidas para as célulasfilhas Tais informações serão utilizadas para a produção de suas características Comentário esse exercício fará com que você reflita sobre o papel da replicação na perpetuação das informações genéticas de um indivíduo 2 A partir da descrição do modelo da dupla hélice composta por duas fitas complementares e antiparalelas que são ligadas através de pontes de hidrogênio formadas entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos As pontes de hidrogênio podem ser facilmente rompidas gerando duas fitas simples Outros nucleotídeos contendo suas respectivas bases nitrogenadas podem ligarse através da formação de pontes de hidrogênio permitindo assim a formação de duas fitas duplas a partir de duas fitas simples Comentário ao responder a este exercício você poderá visualizar o modelo a partir das propriedades químicas da molécula de DNA 3 Replicação semiconservativa significa que uma das duas fitas que serviu de molde para a replicação foi conservada da moléculamãe semi que significa metade A outra fita é aquela recémsintetizada a partir do molde fitafilha Comentário esse exercício é para enfatizar o conceito sobre o modo de replicação do DNA 1 Durante a replicação algumas estruturas foram observadas através de microscopia eletrônica Uma delas apresenta um formato semelhante a um olho formado pelo DNA já replicado e pelo DNA ainda não replicado Esse tipo de estrutura é encontrado na replicação de DNAs lineares Em DNAs circulares observouse a formação de uma estrutura que se assemelha à letra grega θ Essas estruturas são formadas em função do estabelecimento das forquilhas de replicação que representam o movimento do aparato de replicação ao longo do DNA Comentário esse exercício fará com que você analise as estruturas e possa posteriormente associálas ao maquinário enzimático É interessante que você esquematize as estruturas para compreender melhor o que acontece CEDERJ 246 CEDERJ 247 2 A DNA polimerase I de Escherichia coli apresenta três atividades distintas atividade de polimerase 5 3 atividade de exonuclease 5 3 e atividade de exonuclease 3 5 Comentário esse exercício chama a atenção para as outras funções da DNA polimerase I enfatizando que sua principal função não está associada à replicação 3 A polimerase III é formada por muitas subunidades Apresenta dois núcleos catalíticos formados pelas subunidades α θ e ε Cada núcleo catalítico é o responsável pela síntese de uma das fitas do DNA Apresenta duas garras β formadas por um dímero da subunidade β Cada garra β está situada em uma das fitas do DNA A garra β se liga ao DNA e ao núcleo catalítico proporcionando uma maior estabilidade deste último garantindo assim a síntese do DNA Um dímero τ liga os dois centros catalíticos permitindo o acoplamento simultâneo nas duas fitas do DNA Um complexo γ é formado pelas subunidades γ χ e δ Esse complexo é conhecido como disparadorcarregador de garra β pois utiliza energia da quebra de ATP para prender o dímero β ao DNA Comentário esse exercício fará com que você revise os diferentes componentes da DNA polimerase III É recomendável que você tente responder com suas próprias palavras de preferência através de esquemas que auxiliarão a compreensão 4 A helicase é uma enzima que utiliza a hidrólise de ATP para romper as pontes de hidrogênio presentes na molécula de DNA dupla fita A abertura das fitas é fundamental para que ocorra a replicação pois é necessário que haja a exposição dos moldes que serão replicados A SSB é uma proteína que liga DNA fita simples seu papel é importante para manter essas fitas separadas Comentário esse exercício fará com que você reflita sobre a importância dessas duas proteínas no início da replicação 5 A topoisomerase desempenha um papel fundamental durante o mecanismo de replicação do DNA porque a abertura das fitas pela DNA helicase gera uma tensão contorcional no DNA localizado mais adiante de modo que o DNA vai ficando mais apertado e tende a se superespiralar A topoisomerase relaxa a tensão contorcional através de cortes provocados na molécula de DNA que permitem que a molécula gire e assuma uma conformação mais estável Assim a topoisomerase atua sempre na frente da helicase à medida que a forquilha de replicação caminha ao longo do DNA Comentário esse exercício fará com que você pense no mecanismo de replicação de uma forma dinâmica no qual a participação coordenada de cada enzima é fundamental para o sucesso do mecanismo como um todo CEDERJ 248 CEDERJ 249 Aula 11 1 Porque a DNA polimerase só consegue sintetizar DNA na orientação 5 3 A DNA polimerase utiliza um grupamento hidroxila livre do nucleotídeo anterior e promove a formação de uma ligação fosfodiéster entre os dois nucleotídeos À medida que uma das fitas é sintetizada a fita complementar é exposta e deve ser replicada de forma descontínua para que ambas as fitas sejam sintetizadas simultaneamente Caso contrário seria necessário abrir a molécula completamente e começar a síntese contínua a partir da outra extremidade do DNA Comentário esse exercício fará com que você associe a atividade da DNA polimerase com a necessidade de replicar as duas fitas do DNA 2 Várias moléculas da proteína DnaA se ligam às repetições de 9 pares de bases presentes na origem de replicação o DNA se enrola e esse enrolamento provoca uma tensão que resulta no rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos presentes nas repetições de 13 pares de bases O fato de essas repetições serem ricas em A T facilita a abertura das fitas Após a abertura das fitas a proteína SSB se liga ao DNA simples fita mantendoas separadas e permitindo a ligação da DNA helicase Comentário este exercício fará com que você revise o assunto relacionado ao início da replicação 3 Os fragmentos de Okazaki são os segmentos de DNA que estão sendo sintetizados de forma descontínua permitindo a replicação da fita 5 3 Comentário esse exercício visa à fixação do conceito de que uma das fitas é sintetizada de forma descontínua 4 A DNA primase sintetiza um iniciador de RNA na fita líder que fornecerá o grupamento hidroxila livre para a síntese do DNA O complexo γ carrega uma garra β até o iniciador e permite a ligação do núcleo catalítico o dímero τ se liga a um outro núcleo catalítico À medida que a síntese da fita líder prossegue a DNA primase sintetiza um iniciador na fita tardia ao qual será ligado uma garra β através da atividade do complexo γ Nesse ponto o segundo núcleo catalítico ligado ao dímero τ irá se ligar a garra β e iniciar a síntese de um fragmento de Okazaki A síntese de um fragmento termina quando ele encontra um outro fragmento que foi sintetizado anteriormente A garra β é liberada mais adiante a DNA primase sintetiza um outro iniciador ao qual será ligada uma garra β por intermédio do complexo γ O núcleo catalítico que se desprendeu do DNA após o deslocamento da garra β no fragmento anterior irá se ligar novamente a essa outra garra β e iniciar a síntese de um novo CEDERJ 248 CEDERJ 249 fragmento de Okazaki E assim sucessivamente até que toda a fita tardia tenha sido sintetizada Os iniciadores de RNA são retirados pela atividade exonucleásica da DNA polimerase I que também preenche a falha adicionando nucleotídeos Posteriormente os fragmentos são unidos através da atividade da enzima DNA ligase Comentário esse exercício fará com que você revise o assunto sobre replicação tentando explicar com suas próprias palavras de preferência com o auxílio de esquemas e facilitará a compreensão do processo como um todo 5 O fato de a região terminadora ser formada por diferentes repetições dispostas em orientações opostas garante que a replicação do DNA irá parar em um dos pontos impedindo que mais de uma molécula seja replicada durante um único ciclo Comentário esse exercício fará com que você reflita sobre o que poderia acontecer com um genoma circular caso não houvesse uma região terminadora 6 Os mecanismos são semelhantes contendo enzimas diferentes que desempenham a mesma função Em eucariotos duas DNA polimerases participam da replicação A primeira delas é a polimerase α que sintetiza o iniciador de RNA e também um segmento pequeno de DNA posteriormente essa polimerase é trocada por uma polimerase δ que sintetizará o restante do DNA Para a retirada dos iniciadores duas proteínas participam do processo primeiro uma RNase especial reconhece regiões híbridas de DNARNA e degrada o RNA e posteriormente a proteína FEN1 retira o último ribonucleotídeo A DNA polimerase δ adiciona os nucleotídeos que estão faltando Os fragmentos de Okazaki são ligados através da DNA ligase Comentário esse exercício fará com que você compare os mecanismos de procariotos e eucariotos de modo crítico para poder situar as semelhanças e as diferentes entre eles 1 A síntese das extremidades dos genomas lineares pode ser comprometida devido à remoção dos iniciadores de RNA localizados nas extremidades 5 das fitas recém sintetizadas A remoção dos iniciadores resulta na formação de uma fita mais curta do que a fita original O tamanho da molécula pode ser seqüencialmente reduzido após cada ciclo de replicação Comentário ao responder a esse exercício você estará reforçando os conceitos sobre replicação do DNA Além disso facilitará a associação com os mecanismos utilizados para superar o problema dos genomas lineares Aula 12 CEDERJ 250 CEDERJ 251 2 Os telômeros são sintetizados através de uma enzima chamada telomerase A telomerase é uma enzima ribonucleoprotéica que apresenta um componente ribonucléico e um componente protéico O componente ribonucléico apresenta uma região complementar à extremidade do cromossomo que se pareia enquanto a porção adjacente serve de molde para a síntese de uma fita de DNA Quando a síntese está completa a telomerase se desloca e se pareia mais adiante com uma outra região complementar servindo novamente de molde para a síntese do DNA Esse processo se repete centenas de vezes produzindo um grande número de repetições que são complementares ao componente ribonucléico da telomerase Posteriormente a DNA polimerase sintetiza a fita complementar formando uma fita dupla na região do telômero Comentário ao responder esse exercício você estará revendo o conteúdo apresentado lembrando que os telômeros desempenham um papel fundamental na estrutura dos cromossomos eucarióticos 3 Porque em cada cromossomo a telomerase pode servir de molde para a síntese de um número diferente de repetições teloméricas não existindo um número crítico de repetições que devem ser adicionadas Comentário esse exercício fará com que você reflita que a manutenção do telômero é mais importante do que o seu tamanho 4 O círculo rolante é um mecanismo que permite a amplificação de um replicon ou de uma unidade genômica Isso é possível devido à replicação contínua de um único replicon produzindo assim muitas moléculas Comentário esse exercício fará com que você pense na utilização do círculo rolante como um mecanismo que evita a perda das extremidades de genomas lineares mas também permite a multiplicação de alguns segmentos genômicos Aula 13 1 Não Apenas as mutações que ocorrem em células germinativas de um indivíduo podem ser transmitidas para sua prole Muitas doenças são herdadas e estão associadas a mutações em genes importantes para diferentes processos celulares 2 Transição se caracteriza pela substituição de uma purina por outra ou de uma pirimidina por outra Exemplos par AT pelo par GC e viceversa ou o par TA pelo par CG e viceversa Transversão consiste em troca de uma purina por uma pirimidina ou de uma pirimidina por uma purina Exemplos par AT pelos pares TA ou CG e viceversa ou par GC pelos pares TA ou CG e viceversa CEDERJ 250 CEDERJ 251 3 Além da substituição de bases a mutação gênica pode ocorrer por inserção ou deleção de bases Para eliminar um aminoácido de uma proteína é necessário deletar a trinca de bases códon correspondente a este aminoácido do gene que codifica esta proteína Se o objetivo fosse eliminar dois aminoácidos seis bases correspondentes aos códons destes aminoácidos deveriam ser deletadas Da mesma forma se quiséssemos inserir um aminoácido em uma proteína o seu códon três bases deveria ser inserido no gene Caso a inserção ou deleção envolva um número de bases não múltiplo de três ocorre mudança do quadro de leitura o que caracteriza a mutação frameshift 4 O 5BU é um análogo de timina Figura 1312a e seu caráter mutagênico se deve à mudança do equilíbrio cetoenol causado pelo átomo de bromo Figura 1312b A forma enol existe por mais tempo em 5BU do que em T e pareia com G e não com A Portanto sua presença gera a mudança do par AT para o par GC Lembre que a troca do par de bases só é observada após dois ciclos de replicação 5 Primeiramente a exposição de uma cultura de bactérias à luz ultraviolteta promove a formação de dímeros de timina Um dos sistemas de reparo dessa lesão conta com a participação de DNA fotoliases enzimas que são ativadas em presença de luz visível Portanto as células bacterianas incubadas em presença de luz tiveram as lesões reparadas e sobreviveram enquanto aquelas mantidas no escuro não tiveram seu DNA reparado Como muito provavelmente a extensão do dano foi muito grande a maioria das células incubadas no escuro não sobreviveu o que explica o número reduzido de colônias Aula 15 1 a Benéfica A variabilidade genética aumenta a capacidade de adaptação de uma espécie a diferentes condições ambientais contribuindo para seu processo evolutivo b Apesar de a variabilidade genética ser benéfica para uma espécie a existência de um balanço entre estabilidade e mudança é fundamental para a sobrevivência Um número elevado de mutação poderia provocar a morte de todos os indivíduos de uma população devido ao acúmulo de mutações em genes essenciais Em contrapartida a ausência de variabilidade genética poderia determinar a morte de todos os indivíduos de uma população em condições diferentes das habituais Uma espécie bemsucedida é constituída de indivíduos que dispõem de um processo de replicação com alto grau CEDERJ 252 CEDERJ 253 de fidelidade mas que permite a introdução eventual de algumas variações As variações que resultam em melhoramento persistirão por seleção natural Entretanto as variações prejudiciais poderão acarretar a morte do indivíduo que a possui mas não a extinção da espécie 2 a Na recombinação recíproca observase a formação de duas moléculas modificadas pela troca genética Já na recombinação não recíproca apenas uma das moléculas sofre modificação em sua seqüência b A recombinação intramolecular ocorre quando o evento recombinacional acontece entre segmentos de uma única molécula de DNA Quando a recombinação envolve repetições diretas observase a deleção de uma parte do segmento Já na recombinação que envolve repetições invertidas não se observa perda de nenhum segmento mas sim inversão de parte da região envolvida Volte à Figura 151 para observar os esquemas associados a cada um dos tipos de recombinação mencionados nesta questão 3 Não haveria infecção pois a integração do genoma do fago λ ao genoma da célula hospedeira depende inteiramente da presença do sítio att Este é um exemplo clássico de recombinação sítioespecífica que se diferencia dos outros tipos de recombinação por ocorrer apenas em uma seqüência específica do DNA que você pode conferir na Figura 152c 4 Confira sua resposta voltando à Figura 154 5 O esquema representado em b envolveu crossing over uma vez que dois dos seus gametas são recombinantes As etapas intermediárias podem ser conferidas com os esquemas das Figuras 153 e 155 6 Esses sistemas em geral são ativados quando a extensão das lesões é muito grande ultrapassando a capacidade dos sistemas de reparo mais específicos Nestas situações os mecanismos empregados pelas células na tentativa emergencial de reparar os danos no DNA favorecem uma alta taxa de erros Entretanto na maioria das vezes estas células morreriam pelos danos já existentes Portanto o reparo mesmo introduzindo erros pode significar a única solução mais ou menos como apostar no fato de que se pelo menos uma célula sobreviver a espécie não é extinta CEDERJ 252 CEDERJ 253 Aula 18 1 Um elemento IS é caracterizado pela presença de repetições terminais invertidas que cercam uma região do DNA que codifica a proteína transposase A transposase corta o elemento IS bem como o local onde ele será inserido Após a inserção ocorre uma duplicação do sítioalvo local onde o transposon foi inserido em função do preenchimento da fenda causada pelo corte provocado pela transposase 2 Um transposon composto é formado por dois elementos IS que se inseriram no genoma próximo um do outro Na maioria das vezes a região entre os elementos IS carregam genes que conferem resistência a antibióticos Esses genes não participam do mecanismo de transposição Em alguns transposons compostos um dos elementos IS pode ser ativo enquanto o outro é ativo ou seja só um deles produz uma transposase funcional capaz de mover o transposon Em outros ambos os elementos IS são ativos Da mesma forma que os elementos IS os transposons compostos produzem a duplicação do sítioalvo após a inserção 3 Os transposons TnA não possuem elementos IS nas suas extremidades por isso são considerados diferentes dos transposons compostos embora na maioria das vezes também apresentem genes que não participam do mecanismo de transposição e carregam resistência a antibióticos As extremidades do TnA são formadas por repetições invertidas contendo de 38 a 40 pares de nucleotídeos Após a inserção também ocorre a duplicação do sítioalvo 4 Na transposição replicativa o transposon é replicado antes de ser transposto para uma outra região do genoma Dessa forma um transposon é mantido no sítio doador e um novo transposon é inserido no sítioalvo Isso ocorre geralmente através da formação de uma estrutura chamada cointegrado e exige duas atividades enzimáticas uma transposase e uma resolvase Na transposição replicativa o transposon é cortado do sítio doador e inserido no sítioalvo Dessa forma mantémse o mesmo número de elementos no genoma Para esse processo só a transposase é necessária Comentário ao responder aos quatro exercícios propostos você estará revisando e organizando os conceitos apresentados nesta aula CEDERJ 254 CEDERJ 255 Aula 19 1 O elemento de transposição Ds possui as repetições na sua extremidade No entanto a sua região central não produz uma transposase ativa Assim é necessária a ação de uma transposase codificada por um outro elemento de transposição nesse caso o elemento Ac para que a transposição ocorra Uma determinada linhagem de milho pode conter muitas cópias do elemento Ds inativo Porém se for cruzada com uma outra linhagem que contenha o elemento Ac poderá ocorrer um grande número de eventos de transposição nos descendentes desse cruzamento Comentário ao responder a esse exercício você fixará o conteúdo sobre o mecanismo de transposição bem como a idéia de que um elemento inativo pode ser ativado por um outro elemento presente no genoma 2 A ativação do elemento P só vai ocorrer quando houver a combinação de um citotipo M presente em linhagens M de Drosophila com um indivíduo da linhagem P Além disso só ocorrerá se o macho pertencer à linhagem P e a fêmea pertencer à linhagem M Comentário esse exercício fará com que você reflita sobre as condições necessárias para a ocorrência da transposição 3 Um retrotransposon é um transposon que se movimenta de maneira semelhante a um retrovírus No caso do retrovírus a partícula infecciosa injeta um RNA na célula hospedeira que produzirá uma transcriptase reversa A transcriptase reversa é uma DNA polimerase dependente de RNA como molde Então ela fará a síntese de um DNA dupla fita a partir do RNA do vírus que será inserido no genoma Toda vez que aquela região do genoma for transcrita produzirá um RNA viral que poderá formar uma partícula infecciosa e passar para outra célula No caso dos retrotransposons o mecanismo é bastante semelhante O DNA correspondente ao transposon inserido no genoma transcreve um RNA que produz a transcriptase reversa que por sua vez utilizará o RNA como molde para produzir uma molécula dupla fita de DNA que será então inserido em um outro local do genoma gerando um outro retrotransposon A diferença principal entre o retrotransposon e o retrovírus é que o primeiro não é convertido em uma partícula capaz de invadir outras células Ele permanece no genoma transpondose de um local para outro Comentário esse exercício fará com que você trace um paralelo entre o mecanismo de infecção utilizado pelo retrovírus e o mecanismo de transposição utilizado pelo retrotransposon 4 Todos os transposons descritos apresentam a capacidade de se mover no genoma Alguns deles como os transposons compostos de procariotos podem ser transferidos de um organismo para outro levando consigo características novas que CEDERJ 254 CEDERJ 255 Aula 20 1 Ao responder a esse exercício você revisará os conceitos estudados nas aulas sobre replicação do DNA A comparação dos dois mecanismos facilitará a associação dos conceitos e a aprendizagem As informações necessárias para responder ao exercício estão contidas nesta aula bem como nas Aulas de 9 a 12 do Módulo 2 Replicação Transcrição 1 As duas fitas são copiadas 1 Somente uma das fitas é copiada 2 A função da replicação é copiar o DNA para garantir a transferência das informações genéticas para as célulasfilhas 2 A função da transcrição é produzir moléculas de RNA que desempenharão diferentes funções O RNA mensageiro será utilizado como molde para sintetizar proteínas que darão as características do indivíduo 3 A enzima DNA polimerase requer um iniciador que forneça um grupamento OH livre O primeiro desoxirribonucleotídeo é adicionado na forma mono fosfato 3 A enzima RNA polimerase não requer um iniciador que forneça um grupamento OH livre O primeiro ribonucleotídeo é adicionado na forma trifosfato 4 A DNA polimerase é uma ho loenzima formada por várias subunidades 4 A RNA polimerase é uma holoenzima formada por várias subunidades 5 A síntese do DNA ocorre na orientação 5 3 5 A síntese do RNA ocorre na orientação 5 3 6 O início da replicação ocorre na origem de replicação 6 O início da transcrição ocorre no promotor 7 A replicação ocorre em três etapas iniciação alongamento e terminação 7 A transcrição ocorre em três etapas iniciação alongamento e terminação podem apresentar um alto valor adaptativo Além disso a inserção ou retirada de um transposon de um determinado local do genoma pode alterar as suas características ou seja pode haver a ativação de regiões inativas e a desativação de regiões ativas Como conseqüência existe um aumento na variabilidade genética e uma possível variabilidade nos fenótipos que podem ter sido e ainda são importantes para o processo evolutivo Comentário esse exercício fará com que você reflita sobre a importância dos transposons na complexidade e diversidade dos organismos CEDERJ 256 CEDERJ 257 2 O promotor é uma região do DNA localizada acima do início da transcrição 5 em relação ao nucleotídeo 1 Possui seqüências de nucleotídeos específicas às quais se ligam proteínas envolvidas na transcrição do DNA Um promotor pode ser caracterizado comparandose a seqüência do RNA com a seqüência do DNA utilizado como molde para a transcrição Comentário esse exercício tem como objetivo fixar o conceito das características e das funções do promotor A resposta pode ser encontrada nesta aula A compreensão do assunto é muito importante pois falaremos sobre promotores em todas as aulas de transcrição Fique atento 3 A RNA polimerase de procariotos é formada por cinco polipeptídeos de quatro subunidades diferentes Duas subunidades α uma subunidade β uma subunidade β e uma subunidade σ A subunidade σ reconhece o promotor as subunidades α estão envolvidas no acoplamento do complexo a subunidade β contém um sítio de ligação ao ribonucleosídeo trifosfato e finalmente a subunidade β contém uma região de ligação ao molde de DNA As subunidades β e β catalisam a incorporação dos nucleotídeos A subunidade σ é desligada do complexo após o início da transcrição O alongamento é catalisado pelo núcleo catalítico composto pelas duas subunidades α subunidade β e subunidade β Comentário esse exercício visa a fixar o conceito de que a RNA polimerase é formada por várias subunidades sendo que cada uma delas tem uma função importante para o funcionamento do mecanismo 4 Da mesma forma que ocorre na replicação a terminação garante que somente a região de interesse seja transcrita Na sua ausência em teoria a RNA polimerase transcreverá indiscriminadamente todo o genoma Comentário ao responder a esse exercício você refletirá sobre a importância do controle da transcrição promovido pelas seqüências de terminação CEDERJ 256 CEDERJ 257 1 Ao responder a essa pergunta você estará comparando o mecanismo de transcrição em procariotos com o de eucariotos e com isso fixando os conteúdos aprendidos nas Aulas 20 e 21 Procariotos Eucariotos 1 Uma única RNA polimerase sintetiza todos os tipos de RNA 1 Três RNA polimerases sintetizam os diferentes tipos de RNA 2 A transcrição ocorre em três etapas iniciação alongamento e terminação 2 A transcrição ocorre em três etapas iniciação alongamento e terminação 3 A enzima RNA polimerase se liga diretamente ao promotor do gene que será transcrito 3 As RNA polimerases necessitam de fatores de transcrição adicionais para reconhecer o promotor do gene que será transcrito 4 A transcrição e a tradução podem ocorrer simultaneamente 4 A transcrição e a tradução não ocorrem simultaneamente A transcrição ocorre no núcleo e o RNA mensageiro deve ser transportado para o citoplasma para que ocorra a tradução 5 Não ocorre modificação do RNA mensageiro 5 Ocorre modificação nos RNAs mensageiros com a adição do capacete 5 e da cauda poli A na extremidade 3 do transcrito 6 A terminação é bem definida com o reconhecimento de regiões específicas 6 A terminação não é bem definida A extremidade do transcrito é gerada por clivagem endonucleolítica 2 O capacete 5 consiste em uma guanosina metilada adicionada à extremidade 5 do transcrito primário O capeamento resulta de uma ligação trifosfato 5 5 pouco usual e ocorre em diferentes etapas Primeiro a enzima fosfoidrolase retira o fósforo γ do nucleotídeo localizado na extremidade 5 do RNA Em seguida a enzima ganililtransferase promove a ligação fosfodiéster entre a guanosina e o nucleotídeo 5 liberando um pirofosfato A enzima guanina 7metiltransferase metila a guanosina utilizando o grupamento metila da Sadenosilmetionina Dois grupamentos metila são adicionados nas hidroxilas 2 do primeiro e do segundo nucleotídeo adjacente ao capacete pela enzima 2 Ometiltransferase Comentário ao responder a essa questão você estará fixando o mecanismo de adição do capacete 5 mas o mais importante é você refletir sobre a complexidade do mecanismo e sobre a quantidade de etapas e enzimas envolvidas no processo CEDERJ 258 CEDERJ 259 3 A cauda poliA é adicionada pela ação de uma enzima chamada poliA polimerase A região terminal do transcrito é retirada através de clivagem endonucleolítica e ocorre em uma região localizada 11 a 30 nucleotídeos abaixo da seqüência 5 AAUAAA 3 localizada perto do final da unidade transcricional Após a clivagem a enzima chamada poliA polimerase ou ainda poliadenilato polimerase PAP adiciona uma cauda poliA formada por cerca de 200 resíduos de adenosina monofosfato à extremidade 3 do transcrito Comentário ao responder a essa questão você estará fixando o mecanismo de adição da cauda poliA à extremidade 3 dos transcritos codificados pela RNA pol II Da mesma maneira que foi comentado para o exercício 2 o mais importante é você refletir sobre a complexidade do mecanismo e a quantidade de etapas e enzimas envolvidas no processo A intenção é fazer com que você reflita sobre toda a complexidade de regulação e a necessidade de fidelidade nos processos 4 A edição do RNA consiste em modificar a seqüência de nucleotídeos de uma determinada molécula através da adição deleção ou modificação dos nucleotídeos originalmente presentes formando assim uma molécula diferente da molécula sintetizada a partir de um determinado DNA molde 5 A principal conseqüência da edição do RNA é que a produção de uma molécula de RNA diferente servirá de molde para a síntese de uma proteína diferente uma vez que é a seqüência de nucleotídeos que irá determinar a ordem dos aminoácidos que estarão presentes em um determinado polipeptídeo Comentário ao fazer os exercícios 4 e 5 da mesma maneira que para os exercícios anteriores você deverá refletir sobre o significado dessas modificações 6 Algumas das conclusões que podem ser tiradas com base nas diferenças entre o processo de transcrição em procariotos e eucariotos é que em eucariotos o processo é bem mais complexo exigindo a participação de inúmeras proteínas e enzimas Desde a iniciação da transcrição as RNA polimerases necessitam de fatores adicionais que auxiliam no seu acoplamento e permitem a sua funcionalidade e precisão Na seqüência a terminação também apresenta uma complexidade muito maior Esses fatores somados às demais modificações implicam uma necessidade muito maior de regulação de cada uma das etapas pois a ausência de qualquer um dos componentes compromete o processo como um todo Comentário ao responder a esta pergunta você terá construído a idéia de que quanto mais complexo o mecanismo maiores serão as possibilidades de erro e conseqüentemente maior a necessidade de haver sincronia entre as diferentes etapas pois do sucesso de cada uma delas dependerá o sucesso do mecanismo como um todo CEDERJ 258 CEDERJ 259 Aula 22 1 Os íntrons ou seqüências intercalares são seqüências presentes no transcrito primário produzido a partir de um DNA molde e que no caso dos RNAs mensageiro não são utilizadas para a síntese de proteínas As regiões ativas do RNA são chamadas éxons A sua existência pode ser comprovada através de experimentos de hibridação do RNAm encontrado no citoplasma com o DNA que serviu de molde para a sua síntese A molécula híbrida resultou na formação de alças na molécula de DNA indicando que algumas regiões presentes no DNA não estavam presentes no transcrito maduro Comentário ao responder ao exercício você fixará os conceitos que definem funcionalmente um íntron e um éxon A resposta se encontra no conteúdo da aula 2 As seqüências conservadas são nas extremidades 5 e 3 do íntron existem os dinucleotídeos GU e AG respectivamente Uma região rica em pirimidina localizada acima da extremidade 3 Uma Adenosina localizada próxima à extremidade 3 do íntron chamada ponto de ramificação Comentário Esse exercício reforça os conceitos de que apenas algumas poucas seqüências são importantes para o funcionamento do mecanismo e que elas são conservadas entre genes diferentes A resposta pode ser encontrada na primeira parte da aula 3 Os íntrons são retirados e os éxons são emendados através de duas reações seqüenciais de transesterificação Na primeira transesterificação a ligação éster entre o fósforo 5 do íntron e o oxigênio 3 do éxon 1 é trocada por uma ligação éster com o oxigênio 2 da Adenosina no ponto de ramificação Na segunda transesterificação a ligação éster entre o fósforo 5 do éxon 2 e o oxigênio 3 do íntron é trocada por uma ligação éster com o oxigênio 3 do éxon 1 liberando o íntron na forma de alça e ligando os dois éxons Comentário ao responder ao exercício você fixará o mecanismo de emenda através das trocas de ligação na qual não ocorre gasto energético A resposta para o exercício se encontra na Figura 224 4 As snRNPs são ribonucleoproteínas moléculas formadas pela junção de uma parte protéica e uma parte ribonucléica oriunda de um snRNA As snRNPs desempenham um importante papel no processo de retirada dos íntrons e emenda dos éxons através da interação entre o RNA primário e o snRNA através do pareamento e da atividade catalítica desempenhada pela porção protéica que é responsável pelas reações de transesterificação formando um complexo chamado emendossoma Comentário a resposta para o exercício se encontra no texto da aula e a sua resposta visa a concluir a importância da associação das proteínas com os RNAs para o funcionamento do processo CEDERJ 260 CEDERJ 261 5 A emenda alternativa consiste na escolha dos íntrons e éxons que serão retirados e emendados diferencialmente a partir de um mesmo RNA primário A principal conseqüência é que diferentes RNAs mensageiros podem ser produzidos a partir de um mesmo RNA primário dependendo de quais seqüências forem mantidas como éxons e quais seqüências forem retiradas como íntrons A partir daí diferentes proteínas poderão ser produzidas a partir de um mesmo RNA primário uma vez que a seqüência final do RNAm é que determina os aminoácidos de um polipeptídeo Esse mecanismo pode implicar uma forma de regulação uma vez que a retirada correta dos íntrons estará diretamente relacionada à produção de uma determinada proteína Comentário esse exercício visa a fixar o conceito de que os íntrons e éxons podem ser diferencialmente escolhidos resultando na produção de RNAs mensageiros diferentes É importante estar atento para o fato que o mecanismo exige sincronia dos processos e implica a regulação da produção de proteínas 6 Os íntrons do grupo I e II são autocatalíticos ou seja o próprio RNA efetua a retirada dos íntrons e a emenda dos éxons sem a participação de enzimas protéicas Os íntrons do grupo I utilizam uma guanosina externa como cofator cujo grupamento 3 OH é utilizado como um nucleófilo na primeira etapa do corte A guanosina se liga ao RNA e ataca a extremidade 5 do íntron levando ao rompimento da fita de RNA e expondo uma extremidade 3OH Essa extremidade ataca a extremidade 3OH do éxon anterior unindo os éxons e liberando o íntron No íntron do grupo II o grupamento OH 2 é fornecido por um Adenilato presente na seqüência do íntron Ocorre a formação de uma alça como um intermediário da mesma forma que ocorre no ponto de ramificação visto anteriormente para a emenda dependente de snRNPs Ambos os tipos utilizamse de duas reações de transesterificação da mesma forma descrita para os íntrons que utilizam as snRNPs Comentário ao responder a esse exercício você fixará o mecanismo de retirada dos íntrons e emenda dos éxons uma vez que eles apresentam um ponto principal em comum que consiste nas duas reações de transesterificação 7 Os RNAs autocatalíticos podem ter desempenhado um importante papel no mundo prébiótico Essas moléculas com capacidade de autocatálise e conseqüente modificação intramolecular podiam gerar novas moléculas a partir de uma molécula original as próprias moléculas Essa habilidade pode ter sido importante para o estabelecimento da informação na forma como hoje é conhecida na qual os mecanismos de armazenamento da informação e catálise das reações são separados em moléculas especializadas Comentário esse exercício tem como objetivo discutir a parte final da aula na qual comentamos a teoria do mundo do RNA CEDERJ 260 CEDERJ 261 Aula 23 1 A expressão de um gene que codifica uma proteína pode ser controlada em diferentes pontos a durante a transcrição produção do RNA b após a transcrição processamento do RNA estabilidade do transcrito c durante a tradução produção da proteína d após a tradução modificações na proteína que garantem a sua funcionalidade Comentário ao responder a esse exercício você estará fixando a idéia de que a produção de uma proteína ativa depende de um mecanismo sincronizado de regulação Uma vez que existem vários pontos de controle todos devem estar funcionando bem para que a proteína funcional seja produzida 2 O Operon é um arranjo de componentes comumente encontrado em procariotos e que permite a regulação simultânea da expressão de genes responsáveis pela síntese de diferentes produtos envolvidos em um mesmo processo bioquímico como por exemplo o metabolismo de açúcares e a biossíntese de aminoácidos O Operon possui diversos componentes tais como um gene regulador uma região operadora na qual o produto do gene regulador é ligado um promotor e a seqüência codificadora para os genes estruturais O RNA produzido em um Operon é geralmente policistrônico ou seja um único RNA será produzido e contém as seqüências necessárias para a expressão de mais de um produto gênico Comentário esse exercício tem como objetivo fixar o conceito do funcionamento de um Operon Você encontrará a resposta no corpo do texto desta aula 3 A proteína CRP funciona como um ativador da transcrição do Operon lac A sua funcionalidade depende da presença do cAMP sua síntese é modulada pela presença de glicose com o qual forma um complexo capaz de se ligar a uma região do promotor do Operon Na presença de glicose o complexo não pode ser formado e conseqüentemente os genes envolvidos com o metabolismo de lactose não são produzidos Quando o nível de glicose cai ocorre a síntese de cAMP e este se ligará à proteína CRP formando o complexo que ativa a transcrição dos genes estruturais Comentário ao responder ao exercício você estará fixando o conceito sobre o efeito da glicose na ativação do Operon lac uma vez que a proteína CRP só se ligará ao promotor quando o nível de glicose estiver baixo e permitir a produção de cAMP CEDERJ 262 4 O Operon ara é regulado pela proteína AraC que atua como repressor e ativador do Operon Na ausência de arabinose a proteína AraC atua como repressor ligandose a dois sítios araI e araO2 e promovendo a formação de uma alça de DNA que impede que a transcrição seja iniciada no promotor do operador Na presença de arabinose a proteína AraC se liga a ela e sofre uma alteração conformacional que a transforma na proteína ativadora Quando a glicose estiver baixa ocorre a formação do complexo CRPcAMP que se liga a uma região próxima ao promotor e facilita a ligação da proteína AraC ao sítio araI bem como o rompimento da alça de DNA Com isso o promotor é exposto e a transcrição pode ser iniciada A proteína AraC também regula sua própria síntese 5 Não Porque a formação do atenuador depende da sincronia do mecanismo de transcrição e tradução Em procariotos o mecanismo é possível pois enquanto o transcrito está sendo produzido os ribossomos se ligam e começam a sintetizar a proteína Em eucariotos a síntese protéica ocorrerá no citosol enquanto a transcrição ocorre no núcleo Desta forma a sincronia entre os dois mecanismos não é possível Comentário ao responder a esse exercício você estará mais uma vez discriminando as diferenças entre procariotos e eucariotos e também fixando o conceito que o mecanismo de regulação por atenuação só é possível quando a transcrição e a tradução ocorrem simultaneamente A resposta para o exercício pode ser encontrada no corpo do texto desta aula No text present in image ISBN 8576480603 UENF Universidade Estadual do Norte Fluminense UERJ Fundação do Estado do Rio de Janeiro Universidade Federal Fluminense UFF Universidade do Estado do Rio de Janeiro Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro UNIRIO FAPERJ Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro GOVERNO DO Rio de Janeiro SECRETARIA DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE ABERTA DO BRASIL UAB Ministério da Educação BRASIL UM PAÍS DE TODOS GOVERNO FEDERAL