Coloracao de Gram: Erros, Interpretacao e Melhores Praticas

A coloração de Gram é um dos métodos mais utilizados em microbiologia para identificação bacteriana permitindo sua distinção em dois grandes grupos de acordo com a coloração apresentada como resultado das diferenças morfológicas entre as bactérias grampositivas e gramnegativas principalmente com relação de suas paredes celulares Apesar de ser uma técnica relativamente simples é possível observar resultados inconclusivos ou incorretos decorrentes de erros ou falhas ocorridas tanto durante o processo pré analítico quanto analítico do procedimento Conhecendo as etapas da coloração de Gram reviseas se necessário reflita sobre a função de cada uma delas e relate quais possíveis erros podem ocorrer durante a realização da coloração explicando também sua consequência na interpretação dos resultados Além disso comente o que pode ser feito para identificar e minimizar a ocorrência desses erros A coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial de fundamental importância para a identificação e classificação de bactérias É amplamente utilizado nas áreas de microbiologia médica e industrial Apesar de ser um método há muito estabelecido erros ocasionais ainda podem ocorrer na execução da técnica Embora sejam raros é preciso quantificar a taxa de erro e avaliar os tipos de erro relacionados com questões de técnica e interpretação A interpretação de uma lâmina de coloração de Gram é subjetiva embora sua interpretação possa ser superada por meio de um bom treinamento permanecem vários fatores que indicam se uma amostra é corada corretamente incluindo fixação de espécimes protocolo de coloração e análise de lâminas para avaliar o nível de erros cometidos em um laboratório típico A coloração de Gram é uma ferramenta importante no processo de identificação bacteriana por meio da classificação em dois grupos os chamados Grampositivos e Gram negativos A técnica também permite uma clara visão de suas classificações O desenvolvedor da coloração diferencial foi o bacteriologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram durante seu estudo de glóbulos vermelhos em 1884 O método de coloração policromática passou por várias aiterações desde sua descrição e hoje a técnica de coloração envolve a coleta de uma colônia microbiana isolada e emulsionandoa em uma lâmina seguido de sua fixação através da aplicação de calorE m seguida devese realizar a coloração das células bacterianas com cristal violeta e fixalas utilizando corante à base de iodo Em seguida utilizase um solvente para remover os corantes de alguns tipos de bactérias como acetona ou etanol Por fim aplicase a contracoloração cuja ideia foi desenvolvida alguns anos depois por um patologista alemão chamado Carl Weigert que usou safranina como contracoloração que corou as células de vermelho O próprio Gram nunca utilizou contracoloração O primeiro passo envolve a retirada de colônias únicas puras de uma placa de ágar de bactérias ainda em crescimento emplacadas por 18 24 horas e fixação térmica das células que as mata em uma lâmina de microscópio Em seguida as células são coradas com um corante básico cristal violeta que cora todas as células bacterianas azuis Em soluções aquosas o cristal violeta se dissocia e penetra através da parede e membrana de bactérias Grampositivas e Gramnegativas Os cristais violeta interagem com componentes carregados negativamente de células bacterianas corando as células de roxo A segunda etapa envolve a adição de uma solução de iodoiodeto de potássio A solução de iodo entra nas células e forma um complexo insolúvel em água com o corante cristal violeta Quando adicionado o iodo interage com os cristais violeta formando grandes complexos cristal violetaiodo CVI no citoplasma e nas camadas externas da célula Na terceira etapa as células são tratadas com álcool ou solvente de acetona no qual o complexo violeta de cristal de iodo é solúvel Nesse tratamento com solvente apenas as células gram positivas permanecem coradas pois a membrana externa das bactérias gram negativas lipopolissacarídeo ou LPS é perdida da célula expondo a camada de peptidoglicano As células gramnegativas têm camadas finas com uma a três camadas de peptidoglicano com uma estrutura ligeiramente diferente do peptidoglicano das células grampositivas Após tratamento com etanol as paredes celulares gramnegativas são dissolvidas e isso permite que os grandes complexos crsital violetaiodo sejam lavado da célula enquanto o peptidoglicano altamente reticulado e espesso da célula grampositiva é desidratada pela adição do solvente A natureza multifacetada do peptidoglicano junto com a desidratação do tratamento com etanol aprisiona o os complexos cristal violeta iodo no citoplasma das células Após a descoloração a célula Grampositiva permanece na cor roxa enquanto a Grampositiva a bactéria gramnegativa perde a cor púrpura e só é revelada quando a contracoloração é adicionada Depois de descoloradas as células são tratadas com uma contracoloração ou seja uma coloração positiva composta por um corante ácido vermelho positivamente carregado como safranina para tornar as células gramnegativas descoloridas visíveis às vezes a fucsina básica é consubstanciada pela safranina fucsina geralmente cora as bactérias mais intensamente do que safranina Além disso algumas bactérias são mal coradas por safranina como Haemophilus spp Legionella spp e algumas bactérias anaeróbicas As células Gramnegativas contrastadas aparecem em vermelho e as células Grampositivas permanecem roxas A lâmina é então examinada microscopicamente usando uma ampliação de x 1000 através de uma ocular de x 10 e um x100 sob imersão em óleo para melhorar o índice de refração É possível que gramnegativas apareçam como grampositivos Isso pode ocorrer quando o esfregaço é muito espesso resultando em bactérias gram negativas não serem totalmente descoloridas durante as etapas de descoloração e aparecendo como bactérias Grampositivas Outros erros incluem distender inadequadamente não fixar pelo calor a solução de iodo é fraca falha ao enxaguar entre os reagentes Outros erros na detecção também podem ocorrer pela falha no uso do controle positivo e negativo ou manchas na lâmina o que significa que as imprecisões do procedimento podem passar despercebidas Um estudo realizado por Sandle 2019 apresentou das taxas de erro de coloração de Gram ao longo de um período de dois anos envolvendo vários analistas de laboratório Os analistas trabalhavam em uma grande instalação farmacêutica localizada no sudeste da Inglaterra Mais de 6000 resultados separados de coloração de Gram foram avaliados quanto a erros que foram categorizados na tentativa de estabelecer suas causas mais comuns Os erros avaliados foram comparação do resultado da coloração de gram com a morfologia da placa comparação do resultado da coloração de gram com a identificação posterior de espécies avaliação da coloração de Gram por verificação de supervisão e teste de repetição posterior Tais erros foram classificados em manchas mal interpretadas manchas positivas interpretadas incorretamente como negativas e viceversa culturas mistas uso de subculturas que foram envelhecidas plaqueadas 24 horas descoloração excessiva fixação inadequada por exemplo solução de iodo é muito fraca desorganização resultando em amostras rotulados incorretamente