Resolução de Exercícios

1 Você tem cinco genes e gostaria de realizar até 3 reações multiplex Como você faria o arranjo dos genes e de reagentes considerando que todas usam a mesma quantidade de reação em suas reações individuais Reação de 25uL Buffer 5uL 10X MgCl2 1uL 50mM Taq 015uL 5U dNTP 05uL 10mM Primers 1uL 10pmol DNA 2uL Água O que faltar para 25uL O gene 1 tem 182pb com temperatura de anelamento de 53 graus celsius O gene 2 tem 325pb com temperatura de anelamento de 56 graus celsius O gene 3 tem 412 pb com temperatura de anelamento de 54graus celsius O gene 4 tem 440pb com temperatura de anelamento de 52 graus celsius O gene 5 tem 502pb com temperatura de anelamento de 57 graus celsius 2 Considerando as seguintes soluções para quais dos problemas que ocorrem em uma PCR cada uma é usada a Ajustar a temperatura de anelamento b Purificar o DNA ou utilizar diluições adequadas 3 Considerando o sequenciamento de Sanger classifique os eletroferoramas em satisfatórios ou não e quando não o que pode ter ocorrido a c d 4 Identifique as espécies do contig dos arquivos em anexo Seq1F e Seq2R 5 Qual a diferença entre as tipagens por MLST PFGE e MLVA 1 Para decisão de quais genes escolher em uma mesma reação multiplex é preciso levar em consideração a temperatura de anelamento dos primers Dessa maneira temperaturas de anelamento próximas serão úteis para otimizar a temperatura de anelamento única escolhida no termociclador Assim seria interessante escolher reações multiplex com os genes 134 desvio padrão Tm 0816 123 desvio padrão Tm 1247 e 235 desvio padrão Tm 1247 De acordo com o artigo Multiplex PCR Critical Parameters and StepbyStep Protocol de 1997 os pares de primers com produtos de amplificação mais longos funcionam melhor em menores concentrações de sal presentes no tampão de PCR na concentração X buffer enquanto pares de primers com produtos de amplificação curtos funcionam melhor com maior concentração de sal concentração 2X buffer Quanto à concentração de primers de cada um dos genes é preciso utilizar primeiramente concentrações equimolares e ajustar essa quantidade empiricamente com testes de PCR Ainda de acordo com esse artigo científico a quantidade de MgCl2 de 10 mM é capaz de reduzir produtos inespecíficos de PCR Os melhores resultados de PCR Multiplex foram obtidos na concentração entre 200 e 400 uM de cada dNTP A tabela a seguir indica as escolhas de volume dos reagentes para cada uma das três reações multiplex A reação 123 apresenta concentração de buffer igual a 2X por possuir amplicons menores A concentração de MgCl2 foi ajustada para 10 mM A quantidade de Taq Pol não precisa ser ajustada uma vez que 015 uL são capazes de sintetizar 5 micromoles de DNA em 1 hora A quantidade de DNA template é indiferente entre as concentrações 30 e 500 ng25 uL PCR 134 PCR 123 PCR 235 Buffer 10x 25 uL 5 uL 25 uL MgCl2 025 uL 025 uL 025 uL Taq Pol 015 uL 015 uL 015 uL dNTPs 05 uL 05 uL 05 uL primers 1 uL de cada par 1 uL de cada par 1 uL de cada par DNA template 2 uL 2 uL 2 uL H2O Até completar 25 uL Até completar 25 uL Até completar 25 uL 2 a Geração de produtos de PCR inespecíficos formação de dímeros de primers b Inibição da amplificação por contaminantes como fenol e inibição da reação por quantidades excessivas de DNA na amostra 3 a O eletroferograma apresentado possui sequenciamento de boa qualidade com picos bem definidos Assim o preparo da amostra foi adequado permitindo a incorporação de apenas um tipo de ddNTP marcado com corante fluorescente por vez na fita complementar de DNA b O eletroferograma apresenta a presença de muitos nucleotídeos indeterminados N representando uma baixa qualidade de sequenciamento É possível visualizar na base do eletroferograma ruídos que atrapalham a leitura dos picos bem definidos Isso pode ter ocorrido por contaminação do DNA submetido ao sequenciamento muito provavelmente no processo de extração do DNA c O eletroferograma não apresenta boa qualidade uma vez que possui uma mancha fluorescente ocasionada por problemas na remoção total de etanol 4 Os contigs Seq1F e Seq2R representam uma sequência da RNA polimerase II de Fusarium sp 5 A tipagem MLST Multilocus sequence typing se baseia na análise por meio de sequenciamento de múltiplos loci de genes housekeeping Essa abordagem permite a identificação de espécies isoladas possuindo muita aplicabilidade em metagenômica Essa técnica necessita de bancos de dados com as sequências de DNA dos genes housekeeping já consolidados uma vez que é necessário comparar as sequências obtidas no sequenciamento e aquelas já depositadas para identificação da espécie em estudo Por outro lado a técnica PFGE Pulsedfield gel electrophoresis utilizase de enzimas de restrição para fragmentação específica do DNA genômico Devido às diferenças no DNA entre indivíduos até mesmo da mesma espécie conhecidos como polimorfismos nesse caso cada amostra analisada obterá um perfil de restrição distinto Ao se analisar esses fragmentos de DNA em gel de eletroforese de campopulsado será possível analisar fragmentos de até 10 Mb A comparação dos perfis de restrição obtidos com aqueles já conhecidos podem permitir a determinação de uma espécie biológica ou a diferenciação entre dois indivíduos da mesma espécie Por fim a técnica MLVA Multi Locus VNTR Analysis consiste na análise de polimorfismos do tipo VNTR Variable Number Tandem Repeat em genes com grande variabilidade para discriminação entre indivíduos A abordagem se baseia na amplificação por PCR das regiões de interesse utilizando primers específicos que flanqueiam a região Ao se realizar uma eletroforese é possível calcular o número de repetições em tandem que um determinado indivíduo possui a partir do tamanho do fragmento obtido A partir da comparação entre essas regiões por meio de softwares ou manualmente será possível realizar uma tipagem precisa