Exercícios Enzimas de Restrição e Clonagem Molecular

Exercícios Enzimas de restrição e clonagem molecular Sequência 1 GCCTTCATGGCACACGGCTCGGAATCCTACTTCTTGGAATCGGCACGGTGTCATTACGGCGGGGGGGCCAG AACAACTCCCTGGACATCACACCTAGCCCGTGCGACGCGGGGAAACCTTCGCCGGCGCAGGCTTCGACGT GACCTCTACCGGGACCTCTCCCCACCCCAAGTGTTGGCGTGGCTGGTGGCTCACGGCGAATGGCACGTG GGCGTGCAGATCACCCGCTCGCACAATCGAATTCAGGACAACGGCTACAAGCTGTACCTGGACGGCGGCT CTCAGCTGGTCCTCCCCCGCACCGGCAGATCGAGGAGCACATTGCCGCCCAGCCAATCGACGCGCGGAA GATCCCCCGCTCCGAGGGCGAAGTCTGTAGACCTGTCGCTGAGTCTCCGGCTATGTCACCAGAGCTAAGTACC CTGGTGGCGCGGAGGCGCAATCCGAGCTGGCGGCCGGCGGAAGCTGAAGATCCTCTACACCCCCATGC ACGGCGTGGCGGCAATGCCCTGGAGTGGGCCTTACGTGAATTCGGCTTCGGCAACGTGCACGCGGTGGC CTGCGACGCGGCCCGGGAACCCCGGACCCTTCCCGACTGTGGACTTCCCCAACCCTGAGGAGCCGGGTGCCACC GACGCGCTGCTGGAAGAAGCCCCGCGCCATCGATGCGGACCTGCTGATCGCCCTGGATCCGGATGCGGACC Questão 1 Suponha que a sequência acima tenha sido obtida de um extrato bacteriano Uma vez conhecida a sequência deste gene queremos agora clonálo em um vetor de clonagem Para isso precisamos primeiro cortála com enzimas de restrição Sabese que a enzima de restrição EcoRI corta um DNA fita dupla do seguinte modo e no seguinte sítio veja figura Responda a Quantos sítios de restrição existem na nossa sequência Sublinheos b O gel abaixo apresenta na canaleta 1 um padrão de peso molecular onde as bandas representam sequências com 50bp 80bp 200bp e 1Kb Suponha que seu DNA acima tenha sido digerido pela enzima EcoRI e represente na canaleta 2 os fragmentos resultantes do corte Dica cada linha da sequência apresenta 70 bases Figura Corte com a enzima EcoRI c Utilizaremos aqui um plasmídeo chamado pLADA contendo 900bp que apresenta um sítio para a enzima EcoRI dentro de seu sítio múltiplo de clonagem O plasmídeo foi digerido com esta enzima de restrição e assim linearizado Suponha que você tenha purificado do gel seu maior fragmento obtido na canaleta 2 e incubado este fragmento com o plasmídeo digerido na presença de DNA ligase Na canaleta 3 apresente as bandas resultantes deste experimento de ligação Lembrese que o plasmídeo pode ligarse com ou sem o inserto Explique porque as bandas têm o tamanho observado no gel d Invente uma enzima de restrição que corte num sítio diferente da EcoRI Lembrese que as enzimas de restrição cortam em sítios palindrômicos idênticos nas duas fitas GAATTC é GAATTC também na fita complementarreversa Apresente o sítio de corte de sua enzima dê um nome para ela corte o DNA da sequência 1 com esta enzima em pelo menos um sítio e apresente na canaleta 4 os fragmentos gerados por este ensaio de digestão com seus respectivos tamanhos Enzima Sítio de corte Número e tamanho dos fragmentos de restrição gerados 50bp 80bp 200bp 1Kb