Genética Molecular - Interpretações Experimentais da Expressão Gênica em Plantas

Universidade Estadual de Santa Cruz UESC Programa de Pós Graduação GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Mestrado Doutorado Trabalho Analítico em GRUPO Genética Molecular CIB 028 Apresentação em 19 jul 20 2 3 prof Leandro L Loguercio INTERPRETAÇÕES EXPERIMENTAIS IE1 Um determinado gene A está sendo estudado quanto a sua expressão induzida ou não em 2 espécies de plantas em resposta à exposição a um dado poluente metálico M contaminante de solo Estudos prévios em outras espécies sugerem que esse gene codifica uma proteína importante para a planta que auxilia na remoção de metais potencialmente tóxicos p os vacúolos Como você já sabe a técnica de northernblot permite identificar fragmentos específicos de mRNA correspondentes a genes expressos utilizando fragmentos de DNA do gene marcado radioatividade ou quimioluminescência como sondas Análise de northernblot a partir de RNA total extraído de raízes das 2 plantas e utilizando 600 pb de região conservada do gene A como sonda apresentou os seguintes resultados Tempo de exposição 05 1 2 3 dias 1 3 6 9 12 ao composto M jacarandá jenipapo a Qual seria uma característica estrutural elementar dos ácidos nucléicos que permite esta técnica analítica funcionar e por qu ê b O fato de ter sido utilizado o RNA total extraído e não somente o mRNA pode interferir na análise e interpretação deste resultado Se sim ou se não explique como eou porquê c Assumindo que esta atividade transcricional detectada seria determinante para a regulação d a expressão final desse gene qual dessas espécies supostamente teria um maior potencial para ser usada como fitorremediadora de locais poluídos com elevados níveis d e um outro metal tóxico W Por qu ê d Buscando então verificar os níveis de absorção desse outro metal tóxico W pelas plantas de jacarandá e jenipapo realizouse experimentos de exposição de plântulas dessas espécies a este metal em doses crescentes do mesmo Analisouse nos mesmos tempos da figura a i expressão transcricional como acima i i os níveis de acúmulo da proteína correspondente e i ii atividade de ligação ao metal e transferência para os vacúolos O bservouse que os níveis do RNA foram semelhantes aos northernblots da figura e que a proteína correspondente a ument ou na mesma proporção Entretanto não se encontrou diferenças nos níveis d o composto W nos vacúolos entre os tratamentos de tempo O qu ê esses resultados podem suger ir e por quê IE 2 O gene A é responsável pela produção do polipeptídeo J O alelo a não produz um polipeptídeo J funcional enquanto o alelo A produz este polipeptídeo funcional Portanto est a funcionalidade está ausente nos indivíduos aa Os dois gráficos abaixo I e II referemse à V elocidade de F ormação de um determinado P roduto VFP em mghora em dois indivíduos da mesma espécie em tratamentos com temperaturas crescentes a A partir de uma observação atenta dos gráficos e das informações dadas sobre a funcionalidade dos alelos qual seria a função mais provável do polipeptídeo J no processo de formação d esse determinado produto Por quê b Q ual dos grá ficos refere se a um indivíduo A e qual refere se a um indivíduo aa Explique sua resposta c De acordo com sua resposta em b como você explicaria o comportamento da síntese ie o padrão de alteração na VFP de produto no gráfico correspondente ao indivíduo A em relação ao efeito da temperatura d Pode estar havendo algum efeito de modificação na conformação do polipeptídeo J Se sim ou se não explique e Com base nas informações do problema o que vc sugere a relação entre os alelos é de dominância completa ou não Explique seu ponto de vista IE 3 Análises do elongamento das cadeias polipeptídicas pode ser feita a partir de experimentos de tradução in vitro utilizando lisados de reticulócitos de coelhos Quantidades de mRNAs específicos e purificados são adicionados a tubos de ensaio juntamente com esses lisado s que contém a maquinaria de tradução tampão e metionina marcada com S 35 isótopo radioativo do enxofre O crescimento da cadeia peptídica é estimado pela incorporação d este aminoácido marcado sendo o polipeptídeo visualizado por eletroforese e exposição a filmes de raio X autorradiografia semelhante ao northernblot Moléculas de mRNA de tamanho s aproximad amente iguais 15 kb mas correspondendo a 2 genes diferentes A e B foram traduzida s in vitro neste sistema em tubos separados sendo que alíquotas de cada reação foram retiradas a cada 2 min e submetidas à eletroforese autoradiografia Os resultados foram estes 0 4 8 12 1 6 20 2 4 2 8 min 0 4 8 12 1 6 20 2 4 2 8 0 4 8 12 1 6 20 2 4 2 8 min 0 4 8 12 1 6 20 2 4 2 8 Kd 150 100 50 15 Kd 150 100 50 15 gene A gene B a Após quanto tempo aproximadamente um polipeptídeo completo é produzido p os genes A e B Por que concluiu assim b Existe diferença na taxa de síntese nº de polipeptídeos produzidos unidade de tempo entre este s polipeptídeos Explique seu raciocínio c Considerando se tratar de um experimento in vitro e comparando os resultados de tradução para os 2 mRNAs sug i r a algumuns possível is mecanismos de regulação que possam estar atuando nesse caso d Os polipeptídeos codificados por estes dois mRNAs são de mesmo tamanho Explique e É possível que os 2 mRNAs sejam de mesmo tamanho mas seus respectivos polipeptídeos sejam de tamanhos diferentes Se sim ou se não explique sua resposta IE 4 O gel a seguir representa o resultado de um a PCR com dois primers A forward e B reverse desenhados para um a sequência gênica previamente conhecida do DNA controle e que foram testados para possível amplificação em DNAs de outros organismos canaletas 2 a 10 sendo cada uma de um organismo diferente O esquema abaixo indica a posição dos primers em relação à sequência do gene 05 Kb A B pb CTRL 2 3 4 5 6 7 8 9 10 500 250 A quantidade de DNA template inicial e todas as demais condições de reação foram idênticas entre todos os tratamentos As bandas de tamanho menor que o esperado posição indicada pela seta no gel 250pb das canaletas 5 8 9 e 10 são produtos supostamente inespecíficos da PCR mas foram isoladas e sequenciadas diretamente sem clonagem pelos 2 primers forward e reverse para tentar identificar o que eram esses fragmentos As bandas de 500 pb foram isoladas e sequenciadas e confirmaram tratarse do gene do controle apesar das sequencias serem ligeiramente diferentes entre as amostras o que era de certa forma esperado visto que cada canaleta contém DNA de outros organismos diferentes do controle Contudo para os resultados referentes às bandas supostamente inespecíficas de 250 pb surpreendentemente também indicaram uma sequência idêntica à do fragmento AB amplificado e correspondendo à extremidade onde se liga o primer A ou sejam correspondendo à barra horizontal abaixo do esquema do DNA Analisando o gel atentamente e aliado a essas informações acima ofereça uma explicação plausível para as seguintes questões a Por que ocorreu essa amplificação repetida para somente uma metade do gene nos organismos 5 8 9 e 10 simultânea à amplificação do fragmento AB conforme esperado b Por que para algumas canaletas essa banda menor não apareceu 7 ou foi muito fraca ctrl 2 3 4 e 6 c Por que houve também diferença de intensidade nas bandas para as amplificações de tamanho esperad o ie 500 pb nos organismos 2 3 4 e 6 e ausência de amplificação no 7 OBS desconsi dere qualquer erro experimental Os primers são específicos não degenerados para as sequências para as quais foram desenhados e os resultados são reais e corretos IE 5 A Figura abaixo representa no DNA genômico a organização geral das principais regiões segmentos em cis funcionais de um gene eucarioto que participam de sua expressão 5 3 A TG 1 TG A região promotora fim transcrição início transcrição introns exons 5 3 A TG 1 TG A região promotora fim transcrição início transcrição introns exons a Esta figura porém está incompleta Analisea atentamente e explique brevemente que segmento estaria faltando para es t a organização tornarse completa padrão e por qu ê DICA é algo que deveria ser visualizado dentro desta figura ou seja não está fora dos limites 5 e 3 apresentados b Assuma que o gene da figura corresponde a uma enzima que participa de uma reação bioquímica qualquer Todas essas reações e seus destinos e resultados dependem do fluxo de energia na célula conforme as Leis da Termodinâmica Com isto em mente responda e explique seu raciocínio para a seguinte questão Uma determinada reação de síntese intracelular d e um composto C a partir de A e B na s célula s da espécie sob cultura tem um nível de Energia Livre final MAIOR que o inicial da ordem de 3 Kcal Qual da reações abaixo poderia ser vir para a célula acoplar a esta reação a K Y Z G 3 Kcalmol d H M N G 11 Kcalmol b W V X G 13 Kcalmol e O P Q G 1 Kcalmol c F G H G 1 Kcalmol f X S T G 3 Kcalmol Questão bônus A figura mostra uma porção de um gel 2D com proteínas de um determinado tecido de plantas que são separadas nesta técnica por carga elétrica numa dimensão pH e tamanho na outra Kd Neste caso específico da figura nem todos os spots são peptídeos originários de genes mRNA diferentes alguns representam variações formas modificadas de um mesmo peptídeo que migram em posições ligeiramente diferentes Circule 1 ou 2 grupos de spots que podem estar representando moléculas de uma mesma proteína que difere m pelo número de fosfatos que carrega e explique porquê OBS adição de 1 fosfato altera a carga da proteína e quase nada na sua massa molecular