Métodos de Análise em Microbiologia de Alimentos e Planos de Amostragem

Métodos de Análise em Microbiologia de Alimentos 1 Planos de Amostragem para Análise Microbiológica de Alimentos ICMSF Amostragem de Duas Classes Amostragem de Três Classes Padrões Microbiológicos A análise microbiológica deve ser realizada para verificar quantos e quais microrganismos estão presentes em um alimento Isso é fundamental para se conhecer as condições higiênicas do processamento e os riscos que o alimento pode oferecer a quem o consome Muitos métodos podem ser utilizados na detecção qualitativa e quantitativa de microrganismos em alimentos entretanto é aconselhável a utilização de métodos que tenham sido aprovados pelos órgãos reguladores como Vigilância Sanitária Federal Estadual ou Municipal Ministério da Agricultura e Pecuária Ministério da Saúde Considerando a necessidade de constante aperfeiçoamento das ações de controle sanitário na área de alimentos visando a proteção à saúde da população e a regulamentação dos padrões microbiológicos para alimentos a Anvisa aprovou o Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos a RDC nº 12 em 12012001 Nessa RDC são estabelecidos os critérios e padrões microbiológicos para alimentos Esses critérios são fundamentais para a implantação das Boas Práticas de Produção de Alimentos e para aplicação do Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle APPCC auxiliando assim na gestão da qualidade microbiológica dos produtos alimentícios e com isso priorizando a produção de alimentos seguros que não estejam envolvidos em Doenças Transmitida por Alimentos DTA Outra importante função da RDC 12 12012001 foi compatibilizar a legislação relacionada aos critérios e padrões microbiológicos para alimentos vigente no nosso país com regulamentos harmonizados no Mercosul Nas análises microbiológicas são utilizados os Planos de Amostragem para a determinação do número e tamanho de unidades de amostras a serem analisadas Os conceitos fornecidos abaixo estão disponíveis na RDC 12 12012001 e são fundamentais para fins de aplicação de plano de amostragem a m é o limite que em um plano de três classes separa o lote aceitável do produto ou lote com qualidade intermediária aceitável b M é o limite que em plano de duas classes separa o produto aceitável do inaceitável Em um plano de três classes M separa o lote com qualidade intermediária aceitável do lote inaceitável Valores acima de M são inaceitáveis c n é o número de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente Nos casos nos quais o padrão estabelecido é ausência em 25g como para Salmonella sp e Listeria monocytogenes e outros patógenos é possível a mistura das alíquotas retiradas de cada unidade amostral respeitandose a proporção pv uma parte em peso da amostra para 10 partes em volume do meio de cultura em caldo d e é o número máximo aceitável de unidades de amostras com contagens entre os limites de m e M plano de três classes Nos casos em que o padrão microbiológico seja expresso por ausência c é igual a zero aplicase o plano de duas classes São utilizados planos de Duas classes quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como aceitável ou inaceitável em função do limite designado por M apliquese para limites qualitativos Quando da existência do plano de duas classes onde o c é igual a zero o resultado positivo de uma amostra indicativa é interpretado para todo o lote ou partida O mesmo se aplica quando for detectada a presença de toxinas em quantidades suficientes para causar doença no consumidor Nos planos de Três classes quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como aceitável qualidade intermediária aceitável ou inaceitável em função dos limites m e M Além de um número máximo aceitável de unidades de amostra com contagem entre os limites m e M designado por c As demais unidades n menos c devem apresentar valores menores ou iguais a m Nenhuma das unidades pode apresentar valores superiores ao M Se houver avaliação de lotes e ou de produtos relacionados no Anexo I da RDC 12 de 02012001 devem ser adotados os planos de três classes Na Tabela apresentada abaixo você poderá observar uma parte da página 1 desse anexo in natura inteiras selecionadas ou não Grupo de alimentos Microorganismo Tolerância para amostra indicativa n c m Tolerância para amostra indicativa n c m M Análises microbiológicas No artigo apresentado abaixo foi avaliado o desempenho de planos de amostragem para a qualidade microbiológica de alimentos Acesse Microbiológicas para o Preparo de Diluições Preparo de Meios de Cultura e Dilue Nos laboratórios de microbiologia devemos trabalhar com o máximo de cuidado pois neles estarão presentes uma grande variedade de microrganismos Logo é preciso evitar contaminação do manipulador do ambiente e do material em estudo Algumas normas práticas de microbiologia devem ser aplicadas com o objetivo de ensinar ao estudante os princípios e os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia Além disso essa série de normas visam eliminar ou minimizar os riscos de contaminação não só dos alimentos a serem analisados como também dos manipuladores visto que sempre existe a possibilidade de se estar trabalhando com material contaminado por patógenos Com isso podese fica evidente a necessidade de aprendizado de técnicas microbiológicas que constituem uma série de operações especializadas executadas segundo normas padronizadas visando o conhecimento e manipulação segura de microrganismos Esterilização de material de microbiologia No link abaixo você terá acesso a normas gerais instruções de trabalho e Procedimentos Operacionais Padrões adotados em laboratórios de microbiologia Acesse 1 As bancadas deverão ser utilizadas somente para as análises Portanto nunca deixe os materiais escolares sobre a bancada eles deverão ser colocados em local especificados pelo professor 2 Para realização das análises o laboratorista deverá estar vestido adequadamente e sempre usar guardapó avental ou jaleco limpo Este de preferência deve ter mangas longas e deve permanecer abotado além de não ser utilizado fora do laboratório Devese utilizar sapatos fechados 3 É preciso utilizar a touca de forma a tampar as orelhas e retirar os brincos mesmo que pequenos 4 Limpe e desinfete a bancada de trabalho antes e após o término dos trabalhos práticos Ao fazer isso estará destruindo ou minimizando a quantidade de microrganismos que poderiam contaminar suas culturas além das pessoas que estiverem trabalhando no local Geralmente a desinfecção é efetuada com o uso de agentes químicos desinfetantes como álcool 70 Hipoclorito 1 formol ou outro agente 5 Não se deve fumar comer ou ingerir quaisquer espécies de líquidos no laboratório Se a bancada equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer microrganismo comer e fumar são meios eficientes para uma autocontaminação 6 Não se deve conversar tossir ou espirrar em cima do material de trabalho 7 Nunca umedeça rótulos ou etiquetas com a língua 8 Não participe do trabalho quando tiver ferida nas mãos 9 Devese tratar imediatamente quaisquer ferimentos provocados durante o trabalho cortes arranhões etc 10 Avise o professor sobre algum possível caso de contaminação acidental ex quebra de alguma vidraria com cultura microbiana neste caso cubra toda a área com papel toalha e derrame sobre ela o líquido desinfetante disponível no laboratório após 15 minutos remova as toalhas e descarteas de forma indicada pelo professor 11 Higienize as mãos antes e depois do trabalho ou sempre que suspeitar de contaminação 12 Não se deve tocar os olhos boca ou nariz 13 Não coloque materiais contaminados pipetas lâminas etc sobre a bancada Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados para posterior limpeza 14 Identifique todo o material com o número do grupo e data Marque as placas e tubos de forma legível com caneta ou lápis vidro gráfico 15 Devese seguir as normas de uso dos aparelhos O microscópio é um instrumento de trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente Logo o conhecimento sobre tal instrumento é um prérequisito para usálo No fim de cada aula limpe a lente ocular e as objetivas com papel macio 16 Cuidado ao acender o bico de gás bico de Bunsen verifique se não existem substâncias infláveis por perto 17 Trabalhe sempre próximo ao bico de Bunsen pois em um raio de 30 cm o ar é considerado esterilizado A chama deve estar mais azul possível pois esta tem maior intensidade de calor 8 Tubos de ensaio para armazenamento de amostras microbiologia A seguir trazemos alguns cuidados e orientações para a coleta armazenamento e transporte de amostras para análises microbiológicas Deverá ser colhida quantidade suficiente de material para permitir uma completa análise microbiológica As barreiras de proteção como cabines de segurança recipientes adequados e luvas deverão ser utilizadas a cada procedimento As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados acondicionadas em frascos firmemente vedados e meios de transporte apropriados sempre se atentando com a possibilidade de a amostra ser patogênica As amostras devem ser manuseadas no laboratório de microbiologia com os cuidados necessários devese evitar o manuseio de amostras em trânsito A contaminação da superfície externa do frasco de coleta deverá ser evitada caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa do frasco devese fazer descontaminação com álcool 70 ou outra solução descontaminante disponível As amostras devem ser devidamente identificadas todas as informações necessárias no frasco de coleta e nunca na tampa Devese trabalhar atrás da chama sempre O bico de Bunsen fica entre o manipulador e o material de trabalho frascos e tubos esterilizados com ou sem microrganismos 19 Devese flambar alças agulhas e pinças antes e após o uso Estas devem ser flambeadas ao rubro evite a formação de aerossóis quando flambar a alça de inoculação 20 Flambe antes e depois do uso a boca de tubos e frascos 21 Anote cuidadosamente os resultados de seu trabalho Essas anotações servem de base para o seu aprendizado O vídeo apresentado acima possui informações detalhadas e é bem explicativo sobre os procedimentos de preparo de materiais para análises microbiológicas Entretanto vale a pena ressaltar que a professora que realizou a filmagem do vídeo está de aliança e cabelo solto Ela deveria estar sem anéis e com o cabelo preso para atender aos quesitos de segurança laboral Segundo Jay 2010 os diferentes tipos de microrganismos não possuem as mesmas exigências para o seu crescimento Para que seja possível realizar cultura e análise em laboratório é necessário conhecer quais as necessidades nutritivas e condições físicas para cada um O material nutritente preparado para o crescimento de microrganismos é chamado de meio de cultura Pelo fato de a cultura em laboratório ser requerida para o estudo detalhado de qualquer microrganismo é necessária atenção criteriosa na seleção e no preparo dos meios para que o cultivo seja bemsucedido Devese verificar também a quantidade de água suficiente pH adequado e a presença ou não de oxigênio e outros compostos Entre os principais componentes de um meio de cultura estão fontes de carbono e energia fontes de nitrogênio fósforo e sais minerais Diversos outros componentes podem ser encontrados alguns destes componentes como os fatores de crescimento específicos as vitaminas e os aminoácidos visam nutrir e incentivar os microrganismos específicos Outros como o ágar permitem a gelatinação do meio de cultura à temperatura ambiente Existem também agentes ou constituintes que inibem o crescimento de certos microrganismos sendo estes considerados meios seletivos Além de meios seletivos existem também meios que permitem diferenciar microrganismos são os meios diferenciadores ou diferenciais Existem duas técnicas de contagem a Contagem em Superfície também conhecida como Spreader Plate e a Contagem em Profundidade ou mistura chamada de Pour Plate A escolha da técnica depende da análise de qual grupo ou microrganismos que precisaremos identificar A técnica Pour Plate é mais trabalhosa entretanto é mais precisa O meio de cultura deverá ser adicionado depois da adição da diluição seriada do material a ser analisado A técnica Spreader Plate é um método comumente empregado na análise de alimentos em que as amostras de alimentos são maceradas e diluídas de produto são pipetadas em placas de Petri esterilizadas contendo o meio de cultura requerida para análises Após incubação as colônias bacterianas são contadas em um contador de colônias que pode ser manual ou digital Portanto para a realização das análises de alimentos as amostras devem ser homogenizadas diluídas em séries com diluentes apropriados plaquetadas utilizando a técnica mais recomendada e meios de cultura apropriados Na sequência as placas deverão ser incubadas invertidas em estufa com temperatura controlada para possibilitar o crescimento Após a incubação é efetuada a contagem de células viáveis Geralmente é utilizada a temperatura entre 36 e 37ºC para contagem de bactérias mesófilas para fungos e leveduras devese usar a temperatura entre 24 e 25ºC As determinações que utilizam o NMP não fornecem uma medida direta da contagem bacteriana O resultado é estimado de respostas positivas ou negativas em uma ou mais diluições decimais das amostras Por exemplo na utilização de cinco tubos de meio para cada uma de três diluições inoculadas e incubadas observase a formação de gás em cada tubo e com o auxílio de tabelas como a da ABNT os resultados são interpretados O método utiliza a estatística e fornece resultados maiores que os encontrados na contagem padrão em placas A necessidade de rapidez na obtenção dos resultados levou ao desenvolvimento de métodos rápidos de determinação de microrganismos São eles precisão custo tempo de análise aceitação pelos órgãos oficiais simplicidade de operação assistência técnica oferecida pelos fabricantes e disponibilidade de espaço no laboratório Os métodos rápidos mais encontrados no mercado são os de leitura em espectrofotômetros proteína Creativa PCR métodos fluorogênicos tubos múltiplos placas de Petrifilm da 3M meio de cultura LMX e o ágar Chromocult ambos da Merck Simplate da IDEXX Laboratories aqueles para contagem de coliformes totais e Escherichia coli contagem de bolores e leveduras detecção de Salmonella spp e Listeria monocytogenes Esses métodos apresentam como principal vantagem reduzir o tempo de análise o que diminui o tempo de retenção dos produtos na indústria diminuindo os custos e simplificando os análises Entretanto esses métodos apresentam algumas desvantagens como a impossibilidade de se obter colônias isoladas e a imprecisão da determinação do número de microrganismos presentes pois algumas dessas técnicas se baseiam em número mais provável Outra desvantagem citada está relacionada aos cuidados necessários na semeadura e no espalhamento da amostra para não ocorrer perda de amostra As placas 3M Petrifilm foram desenvolvidas utilizando tecnologia da empresa 3M eliminando a necessidade de preparar e armazenar placas do método tradicional fornecendo resultados de forma mais rápida e simples para testes microbiológicos A placa 3M Petrifilm é específica para grupos de microrganismos como coliformes por exemplo ou seletiva para um único microrganismo como Salmonella Escherichia coli Staphylococcus aureus etc Além de oferecer detecção qualitativa ela também fornece a confirmação bioquímica dos microrganismos específicos São utilizadas para alimentos processados amostras de monitoramento ambiental eliminando etapas demoradas do método tradicional e oferecendo confirmação bioquímica em menos de 44 horas 2x mais rápido que o método tradicional e sem a necessidade de uso de equipamentos para leitura No artigo abaixo foi feita uma correlação entre métodos cromogênicos e o método convencional na enumeração de coliformes e Escherichia coli em carne bovina moída Acesse 6 Conclusão O sucesso de uma análise microbiológica irá depender dos cuidados adotados no laboratório com a técnica a ser utilizada e no preparo do material A escolha do método a ser utilizado irá depender do microrganismo a ser identificado da disponibilidade de realização da análise no seu laboratório do custo da análise e do tempo para obtenção dos resultados Estudos entre as contagens de coliformes totais e coliformes termotolerantes nos sistemas Compact dry e Petrifilm EC e a metodologia tradicional têm indicado que os resultados obtidos através desses métodos rápidos são equivalentes aos obtidos pelo método de referência Os métodos rápidos são sistemas mais simples e práticos e podem ser usados como alternativas viáveis nas análises microbiológicas sem comprometer a confiabilidade e a sensibilidade 7 Referências ANVISA 2004 Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos Módulo IV Disponível em httpwwwanvisagovbrservicosaudemicrobiologiamod42004pdf BRASIL 2001 ResoluçãoRDC N 12 de 02 de janeiro de 2001 Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos Diário Oficial da República Federativa do brasil n 7E p 4653 seção I CASAROTTI Sabrina N PAULA Aline T ROSSI Daise A Correlação entre métodos cromogênicos e o método convencional na enumeração de coliformes e Escherichia coli em carne bovina moída Rev Inst Adolfo Lutz Impr São Paulo v 66 n 3 2007 Disponível em httpperiodicossesspbvsbrscielophpscriptsciarttextpidS007398552007000300011lngennrmiso CHAVES J B P ROBERTO C D PAIVA G ARAÚJO LD Desempenho de planos de amostragem de 2classes e 3classes para avaliação da qualidade microbiólogica de alimentos Revista do Instituto Adolfo Lutz São Paulo 2010 6933117 FRANCO B D G e LANDGRAF M Microbiologia dos Alimentos São Paulo Atheneu 2008 e edições anteriores GERMANO Pedro Manuel Leal GERMANO Maria Izabel Simões Org Higiene e vigilância sanitária de alimentos 5 ed rev e atual Barueri SP Manole 2015 xxxii 1077 p 22 p de l e edição anterior JAY JM Microbiologia de Alimentos Porto Alegre Artmed 6 ed 2010 e edições anteriores Youtube 16 outubro 2017 Métodos Analíticos de Microbiologia de Alimentos Preparo de Amostras e Diluições Cris Zaicovski 19min22 Disponível em httpsyoutubekodUGP2keY Youtube 07 março 2017 Métodos Analíticos de Microbiologia de Alimentos Preparo de Materiais Cris Zaicovski 24min55 Disponível em httpsyoutubezeA1SNZ2Kjo Youtube 23 março 2015 Diluição seriada aula prática Paulo Tomazino 14min04 Disponível em httpsyoutubeWc4lTZx12AM Youtube 07 março 2017 Principais meios de cultura Pipetando 2min19 Disponível em httpsyoutubeyKq161PbY8