Roteiro Pratica Biologia Molecular Extracao DNA e Eletroforese Agarose

PotI aplicado como aderec 50ML ou tampão auxiliar re a sacar em além grandes grupos Pisar a agarose a curva nós ve a 55 usando len AD simulador sacar marcada de peso molecular depois os amostras o gel coloca na corrida e aquele os é perametran parte crucial escolhe a porcentagem preparando a solução colocamos a b 15 do agarose no eller mayor fizemos a solução esperamos estriar uma 5 min depois colocamos o gel colocamos a parte esperamos polimerização o primeiro poço é do leadero IDENTIFICAÇÃO BIOMEDICINA Disciplina BIOLOGIA MOLECULAR Período NOTURNO Carga Horária 72 horas Professor Profa Me Mariana Andrade Semestre 20222 Teórica 36 horasPrática 36 horas ROTEIRO DE AULA PRÁTICA Data teórica 29092022 Data da prática 061022 Aula no 15 Extração de DNA 1 Materiais Escova ou swab estéril Materiais de coleta de sangue garrote algodão tubos EDTA seringa 3ml e agulha preta ou verde Tubo falcon de 15ml Vórtex Centrifuga de microtubos Microtubos de 15ml Ponteiras p 1000 Ponteiras p 200 Etanol absoluto Etanol 70 Etanol absoluto Banho seco 56 C Tampão de extração Tampão Lise Tampão de Ligação Tampão de Eluição Proteinase K Tampão de Lavagem I Tampão de Lavagem II Tubo de Reação 20 mL Tubo de Reação 15 mL Tubo Spin 2 Procedimento Extração Kit comercial Coletar o sangue total Em um microtubo de 15ml adicionar 200 microlitros e sangue total e 25 microlitros de proteinase K Adicionar 200 microlitros de Tampão de Lise Agitar no vórtex por 20 segundos e incubar a 56C por 15 minutos Adicionar 210 microlitros de etanol absoluto e agitar no vórtex Transferir a mistura para o Tubo Spin 5 e centrifugar 11000 x g1 minuto a amostra passará para o tubofiltro Colocar o tubofiltro em um novo tubo de coleta Adicionar 500 microlitros de Tampão de Lavagem azul e centrifugar 11000 xg1 minuto Descartar o tubo de coleta com o filtrado Colocar o tubofiltro em um novo tubo de coleta Adicionar 600 microlitros de Tampão de Lavagem branco e centrifugar 11000 xg2 minuto Descartar o tubo de coleta com o filtrado Colocar o tubofiltro em um Tubo de Eluição e adicionar 200 microlitros de Tampão de Eluição Aguardar 1 minuto e centrifugar 11000 x g 1 minuto 3 Partes do relatório Introdução Objetivo Metodologia Resultado Discussão Respostas Perguntas Qual o princípio dos seguintes ativos o Etanol absoluto o Proteinase K o Tampão de Eluição Quais os objetivos do vórtex Quais os possíveis resultados caso o uso do swab tubos e ponteiras não fossem estéreis Cabelo solto perdigotos e contato da pele poderiam influenciar de que forma Quais técnicas poderiam ser feitas com a obtenção do pellet IDENTIFICAÇÃO BIOMEDICINA Disciplina BIOLOGIA MOLECULAR Período NOTURNO Carga Horária 72 horas Professor Prof Me Mariana Andrade Semestre 20222 Teórica 36haula Prática 36 horas ROTEIRO DE AULA PRÁTICA Reação PCR Aula no 16 Data da prática 20102022 Data teórica 06102022 1 Mistura Master Reagentes NA 200 Agua livreup 50 DNA 50 Primer foward 20 Primer rev 20 Taq polimerase 050 2 conte micros Procedimento Simulação do preparo da PCR Volume final 20 microlitros quantidade de amostra exceto o DNA amostra 40 microlitros Mestura 110 microlitros Adisnionar 3 microlitros DNA cada microtubulo Adicionar 2 microlitros cada microlitubo Adicionar 050 microlitros Taq polimerase Podendo usar os nomes iniciador 3 Partes do relatório Introdução Objetivo Metodologia Resultado Discussão Respostas Perguntas Qual o princípio dos ativos o Tampão Reação o Taq polimerase o MgCl2 o Primer foward o Primer reversa Qual a reação contenúdo de bases dos primeiros a temperatura de desnaturação da reação O que caracteriza a reação da PCR nas primeiras a waufrina mesófila Porque primer auxiliar servem a detectar um gene Com amplificar material genético tipo RNA de amostra viral Reagentes Tampão Reação dNTP MgCl2 Taq polimerase Primer foward Primer reversa DNA amostra 44 amostra 56 42 44 48 20 70 10 10 20 20 60 50 60 50 90 90 4 amostras 16 amostras 12 amostras IDENTIFICAÇÃO BIOMEDICINA Disciplina BIOLOGIA MOLECULAR Semestre 20222 Periodo NOTURNO Teórica 36 horasPrática 36 horas Carga Horaria 72 horas Professor Profa Me Mariana Andrade Aluno Vinicius Pereira llichayne ROTEIRO DE AULA PRÁTICA Aula n 19 Data teórica 20102022 Data da prática 25112022 Eletroforese Gel de agarose 1 Materiais Pipetas Ponteiras Cuba Pentes Fonte Ladder Amostra Tampao de carregamento azul de bromofenol Marcador fluorescente grange G Agarose 2 Procedimento Simulación co preparo da PCR escolher a porcentage da gel Diluir a agarose em 1x TAE 1x conduzi eletricidade Aquece no microondas por 1 minutos Aplicar o ladder e amostras Posicionar corretamente os fios na fonte Configurar voltagem v corrente am e forçapotência w 3 Partes do relatório Introdução Objetivo Metodologia Resultado Discussão Resposta e Perguntas Azul de bromofenol para dar peso ao dna Qual o principio dos ativos Marcador de peso molecular Tampão de carregamento TAE Marcador fluorescente Qual o princípio da utilização da luz UV na eletroforese No que se baseia a leitura da porcentagem do gel Caso utilizássemos o brometo de etídio como marcador fluorescente em que etapa ele seria aplicado etapa do cromato de etídio Gel green como marcador fluorescente INTRODUÇÃO A Eletroforese em Gel de Agarose é uma técnica muito utilizada pelos cientistas para moléculas separadas O material que está sendo separado é colocado em uma substância semelhante a gel chamado de agarose Agarose é uma substância derivada de algas marinhas e quando usada em laboratório tem uma consistência semelhante à gelatina Os géis de agarose são formados da mesma maneira que a gelatina é feita A agarose é um tipo de pó que é misturado com água e uma solução tampão A mistura é aquecida até o ponto de ebulição Isso permite que a agarose se dissolva completamente e se disperse uniformemente A solução é derramada em um molde de fundição O líquido toma a forma do tabuleiro e depois que é assentado durante um período de vinte a trinta minutos ele solidifica OBJETIVOS Fazer um gel de agarose com a finalidade de analisar amostras de DNA obtidas durante o processo de extração de DNA MATERIAIS E MÉTODOS Preparo do gel de agarose 1 Após a pesagem da agarose a mesma foi diluída em tampão TAE 1x e em seguida foi aquecida no microondas durante 1 minuto após o liquido ter resfriado este foi despejado em uma cuba de eletroforese modelo horizontal com a adição do pente e então aguardouse a mistura polimerizar A voltagem foi configurada com a adição dos valores em Volts ou Amperagem e adição do tempo de corrida aguardouse o tempo de corrida das amostras RESULTADOS DISCUSSÃO A eletroforese em gel de agarose provou ser uma maneira eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos A alta resistência do gel de agarose permite o manuseio de géis de baixa porcentagem para a separação de grandes fragmentos de DNA A peneiração molecular é determinada pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose 7 na matriz do gel Em geral quanto maior a concentração de agarose menor o tamanho dos poros Os géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de DNA entre 100 pb e 25 kb Para separar fragmentos de DNA maiores que 25 kb será necessário usar eletroforese em gel de campo de pulso 6 que envolve a aplicação de corrente alternada de duas direções diferentes Desta forma fragmentos de DNA de tamanho maior são separados pela velocidade com que Figura 2 Segundo resultado esperado Gel de agarose com amostras corridas e visualizadas sob fluorescência em luz UV se reorientam com as mudanças na direção atual Fragmentos de DNA menores que 100 pb são separados de forma mais eficaz usando eletroforese em gel de poliacrilamida Ao contrário dos géis de agarose a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reação química conduzida por radicais livres Esses géis mais finos são de maior concentração são executados verticalmente e têm melhor resolução No sequenciamento de DNA moderno a eletroforese capilar é usada em que os tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel A utilização de tubos capilares permite a aplicação de altas voltagens possibilitando a separação de fragmentos de DNA e a determinação da sequência de DNA de forma rápida PERGUNTAS Qual o princípio dos seguintes ativos Marcador de peso molecular O marcador de peso molecular é uma mistura de varias porções de DNA com peso conhecido essa mistura é corrida isoladamente em um poço para que a mesma possa indicar a quantidade de pares de base para cada posição de banda encontrada no gel Tampão de carregamento O tampão de carregamento é misturado na amostra antes da corrida com intuito de deixar a amostra mais densa e ela ficar imóvel no poço de corrida a mesma também é um indicador de quando a corrida deve ser parada uma vez que vaza pelo gel TAE TAE inclui base Tris ácido acético glacial e EDTA TAE é uma boa escolha ao trabalhar com fragmentos de DNA maiores ou para clonagem Marcador fluorescente É o reagente utilizado na marcação das bandas que se formaram através da separação das moléculas Este é utilizado para que possamos visualizar a posição da banda e quantidade de pares de base dela Qual o princípio da utilização da luz UV na eletroforese Revelar as amostras que foram marcadas com reagente fluorescente este momento é o de visualização das amostras e do gel em geral No que se baseia a escolha da porcentagem do gel A porcentagem do gel influencia na viscosidade do mesmo e densidade também estes vão influenciar diretamente no tamanho dos poros os quais são responsáveis pela separação das amostras então se o gel for muito concentrado as amostras não são capazes de atravessalo porem isso varia de acordo com o tamanho de molécula trabalhada Caso utilizássemos o brometo de etidio como marcador fluorescente em que etapa ele seria aplicado O brometo de etidio não é mais utilizado é possível colocar antecipadamente no gel porem isso faz com que ele exerça uma contaminação em toda a cuba de eletroforese também é possível misturalo no tampão de carregamento ou em uma vasilha e deixar descansar um tempo INTRODUÇÃO A extração de DNA é um método para purificar o DNA usando métodos físicos eou químicos de uma amostra que separa o DNA das membranas celulares proteínas e outros componentes celulares Friedrich Miescher em 1869 fez o isolamento de DNA pela primeira vez A utilização da técnica de isolamento de DNA deve levar a uma extração eficiente com boa quantidade e qualidade de DNA que é puro e isento de contaminantes como RNA e proteínas Métodos manuais bem como kits comercialmente disponíveis são usados para extração de DNA Vários tecidos incluindo sangue fluidos corporais aspirado direto de citologia por aspiração por agulha fina FNAC tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina seção de tecido congelado etc podem ser usados para extração de DNA A extração de DNA envolve a lise das células e a solubilização do DNA que é seguida por métodos químicos ou enzimáticos para remover macromoléculas lipídios RNA ou proteínas As técnicas de extração de DNA incluem extração orgânica método fenol clorofórmio método não orgânico salting out e tratamento com proteinase K e método de adsorção membrana de sílicagel Gupta N 2019 OBJETIVOS Purificação do DNA utilizando o método de proteinase K de uma amostra de células sanguíneas MATERIAIS E MÉTODOS Coleta de sangue total O sangue do paciente doador foi coletado utilizado seringa com agulha estéril e tubo de coleta para armazenamento da amostra foram coletados 10mL de sangue total Extração do DNA Em um microtubo de 15mL adicionouse 200uL de sangue total e 25uL de proteinase K Em seguida foram adicionados 200uL de tampão de lise celular a amostra foi agitada em vórtex durante 20 segundos e incubada por 15 minutos a 56 graus C Após essa etapa adicionouse 210uL de etanol absoluto o qual foi agitado em vórtex A mistura foi transferida para tubo Spin S e centrifugada a 11000X G durante 1 minuto o tubo filtro foi inserido em um novo tubo de coleta seguido da adição de 600uL de tampão de lavagem branco o mesmo foi centrifugado 11000X G durante 2 minutos o tubo de coleta com o filtrado foi descartado Depois disso colocouse o tubofiltro em um tubo de eluição e adicionouse 200uL de tampão de eluição aguardouse 1 minuto e a amostra foi centrifugada 11000x G durante 1 minuto RESULTADOS Figura 1 Primeiro resultado esperado Concentrações em nanograma por microlitro das amostras em leitura por absorbância no comprimento de ondas de 260280 nm DISCUSSÃO O uso de protocolos de custobenefício rápido eficaz e gerenciável para extração de DNA genômico é importante na área de biologia molecular Outro importante fator é quanto à integridade e concentração do DNA o que pode influenciar muitas reações como a de PCR Os kits de extração geralmente são caros ou não estão prontamente disponíveis principalmente para pesquisadores de países em desenvolvimento e subdesenvolvidos A maioria das técnicas utilizadas em análises moleculares requer DNA de boa qualidade ou seja não fragmentado Assim a eficiência dessas análises depende essencialmente da qualidade e quantidade do DNA extraído exigindo uma atenção especial ao armazenamento das amostras destinadas ao uso Figura 2 Segundo resultado esperado Conforme observado na Figura 3A PKM as bandas estão bem definidas no gel apresentando portanto maior quantidade de DNA Um gel de agarose 2 e 40 mV foi usado para realizar a eletroforese PERGUNTAS Qual o princípio dos seguintes ativos Etanol absoluto O principal papel dos cátions monovalentes e do etanol é eliminar a camada de solvatação que envolve o DNA permitindo assim que o DNA precipite em forma de pellet Proteinase K Durante a extração de DNA ou ácidos nucléicos em geral há muitas proteínas contaminantes presentes Esses contaminantes devem ser removidos A proteinase K que é uma serina protease de amplo espectro é usada em muitos protocolos de extração de DNA para digerir essas proteínas contaminantes Tampão de Eluição Tampão é o melhor buffer para preservar a estabilidade de sua preparação por um longo tempo O tampão Tris controla o pH enquanto o EDTA quela quaisquer cátions divalentes como Mg2 impedindo a atividade da DNase Quais os objetivos do vórtex Homogeneizar uniformemente a amostra de trabalho ou facilitar a dissolução de solutos Quais os possíveis resultados caso o uso do swab tubos e ponteiras não fossem esteréis O uso de material não estéril aumenta em grandes proporções a possibilidade de contaminação de amostras Cabelo solto perdigotos e contato de pele poderiam influenciar de forma Claramente sim na análise de DNA e Rna e muito importante não deixar esses tipos de contaminantes colidirem com as amostras trabalhadas uma vez que estes possuem o mesmo material o qual o pesquisador está trabalhando DNA Quais técnicas poderiam ser feitas com a obtenção do pellet Gel de agarose para DNA Dosagem de quantidade de DNA extraído Avaliação do grau de pureza da amostra obtida INTRODUÇÃO A reação em cadeia da polimerase PCR é uma técnica comum de laboratório usada para fazer muitas cópias milhões ou bilhões de uma determinada região do DNA Essa região de DNA pode ser qualquer coisa em que o pesquisador esteja interessado Por exemplo pode ser um gene cuja função um pesquisador queira entender ou um marcador genético usado por cientistas forenses para comparar o DNA da cena do crime com suspeitos Normalmente o objetivo da PCR é produzir o suficiente da região alvo do DNA para que ela possa ser analisada ou usada de alguma outra maneira Por exemplo o DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento visualizado por eletroforese em gel ou clonado em um plasmídeo para outros experimentos A PCR é usada em muitas áreas da biologia e da medicina incluindo pesquisa em biologia molecular diagnóstico médico e até mesmo alguns ramos da ecologia OBJETIVOS O objetivo da PCR é produzir o suficiente da região alvo do DNA para que ela possa ser analisada ou usada de alguma outra maneira MATERIAIS E MÉTODOS Preparo do PCR Para um volume final de 20uL os reagentes foram multiplicados de acordo com a quantidade de amostra de DNA Essas amostras foram distribuídas em microtubos correspondentes no volume de 18uL adicionouse 2uL de DNA em cada microtubo e então estes foram posicionados no termociclador Para cada amostra a mistura de reagentes continha os seguintes componentes Tampão da reação dNTP MgCl2 Taq polimerase Primer forward Primer reverse Água ultrapura DNA amostra RESULTADOS Figura 1 Primeiro resultado esperado A amplificação das porções de DNA também podem ser observadas através do gel de agarose exemplo de descrição de legenda de um resultado PCR para testar a eficiência de polimerases na amplificação de produtos de PCR de sobrenadantes de diferentes concentrações de esporos da cepa de tipo selvagem de A fumigatus com iniciadores ITS1D2 tamanhos de banda de PCR esperados são 12 kb A Phusion DNA polimerase de alta fidelidade New England Biolabs B MyTaq RED Mix DNA polimerase Bioline P controle de PCR positivo amplificado a partir de DNA genômico 50 ng da cepa selvagem de A fumigatus N controle negativo sem DNA DISCUSSÃO As aplicações de pesquisa da tecnologia PCR são numerosas Uma lista parcial inclui clonagem genômica direta de DNA ou cDNA impressão digital genética de amostras forenses análise de variações de sequências alélicas e sequenciamento direto de nucleotídeos A PCR tem o potencial de substituir muitas técnicas convencionais de diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas na medicina clínica Atualmente a PCR está sendo usada para estudar doenças genéticas como hemofilia fibrose cística retinoblastoma doença de Huntington anemia falciforme e betatalassemia doença de von Willebrand neuropatia óptica de Leber distrofia muscular fenilcetonúria Tay Sachs e alfa 1 deficiência de antitripsina A PCR também pode ser usada para rastrear mutações pontuais no gene da insulina detectar uma única célula de linfoma na presença de 10 6células normais estudar translocações cromossômicas detectar deleções do gene do hormônio do crescimento e determinar o polimorfismo do gene de classe II do antígeno de linfócito humano HLA As aplicações de PCR para o diagnóstico de doenças infecciosas ocorreram primeiro com infecções virais para as quais a detecção precoce é particularmente importante Os resultados da PCR podem ser obtidos no prazo de um dia após o recebimento das amostras no laboratório Existem agora protocolos de PCR específicos e sensíveis publicados para a detecção e tipagem de papilomavírus humano vírus da imunodeficiência humana tipos 1 e 2 vírus linfotrópico de células T humanas tipo I vírus da hepatite A B e C vários sorotipos de enterovírus humanos vírus vírus do herpes e rotavírus parvovírus humano B19 rinovírus vírus da pseudoraiva vírus da rubéola paramixovírus que causam caxumba e sarampo citomegalovírus e vírus EpsteinBarr A PCR também tem sido utilizada para estabelecer a etiologia viral tanto na meningite enteroviral quanto na miocardite viral PERGUNTAS Qual o princípio dos seguintes ativos Tampão de reação O tampão usado para PCR consiste em TrisHCl cloreto de potássio e cloreto de magnésio A função do tampão é fornecer condições adequadas sob as quais a DNA polimerase possa funcionar adequadamente O pH do tampão cai entre 80 e 95 O pH é estabilizado pelo TrisHCl dNTP os dNTPs serão a matéria prima das novas cadeias formadas durante o PCR Vale lembrar que após o período de Extensão há uma volta aos processos de Desnaturation e Annealing se repetindo em ciclos Podem ser obtidos na forma liofilizada ou de soluções aquosas neutralizadas MgCl2 O cloreto de magnésio funciona como cofator da enzima DNA polimerase podendo afetar as temperaturas de denaturação das fitas de DNA e o anelamento dos primers Taq polimerase a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA Primer forward Um par de iniciadores ou primers que vai hibridar com a cadeia de DNA molde no início iniciador 5 ou forward e no fim iniciador 3 ou reverse do fragmento de DNA a amplificar Primer reverse Um par de iniciadores ou primers que vai hibridar com a cadeia de DNA molde no início iniciador 5 ou forward e no fim iniciador 3 ou reverse do fragmento de DNA a amplificar Qual a relação entre o conteúdo de bases dos primers e a temperatura de desnaturação da reação Durante a denaturação a dupla fita de DNA é separada então é neste momento que os primers que são complementares a uma sequencia de DNA podem se unir a fita e iniciar o processo de anelamento e as subsequentes etapas Por que não poderia ser usada DNA polimerase de uma bactéria mesófila Porque as bactérias mesófilas não são iguais as termofilas em relação a temperatura de crescimento sendo assim sua temperatura natural não é compatível com a reação de PCR Como amplificar material genético tipo RNA de amostra viral Para vírus ou RNA propriamente dito é necessário utilizar a transcriptase reversa primeiro para que uma cadeia de DNA seja sintetizada e as etapas subsequentes possam ser desenvolvidas