Métodos de Estudo Microbiológicos e Imunológicos da Flora Oral Normal e da Flora Associada a Patologia Oral

MÉTODOS DE ESTUDO MICROBIOLÓGICOS E IMUNOLÓGICOS DA FLORA ORAL NORMAL E DA FLORA ASSOCIADA A PATOLOGIA ORAL\n\n1. INTRODUÇÃO\nNa microbiologia clínica, o principal objectivo é identificar o microorganismo etiólogico e indicar a antibióticoterapia adequada. A etilogia microbiana das patologias orais, tais como cárie dentária, gengivite, periodontite, pulpite e abscessos periapicais, é complexa e está directamente relacionada com a microflora oral.\nEm determinadas situações, sabe-se que alguns microorganismos apresentam um papel bastante específico em alguns destes processos patológicos.\n\nPrincipais bactérias envolvidas em patologias infecciosas da cavidade oral\n\nQUADRO PATOLÓGICO\n\nOdontogénicos\n\nCárie dentária S. mutans, L. casei\nGengivite (GUNA) P. intermedia, espiroquetas\nPeriodontite\n- Adulto P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus\n- Juvenil A. actinomycetemcomitans\nPulpite P. endodontalis\nProcessos purulentos F. nucleatum spp., Phorphyromonas e Prevotella pigmentadas, Actinomyces spp.\n\nNão odontogénicos\n\nEstomatite ulcerativa e gangrenosa T. vicentii, F. nucleatum spp.\nParotidite aguda S. aureus 2. COLHEITAS\nNo estudo dos microorganismos orais e das patologias infecciosas da cavidade oral, podem-se utilizar diferentes tipos de amostras. O tipo de amostra vai estar condicionado pelo processo que se vai estudar e pelo tipo de análise que se pretende realizar.\n\nAs amostras para exame microbiológico são, muitas vezes, obtidas com técnica inadequada, de um local impróprio e em quantidade insuficiente. Muitas delas estão também comprometidas devido à demora e aos inadequados acondicionamentos e transporte para o laboratório. Tal, promove a distorção da quantidade relativa de microorganismos presentes, como a morte dos mais sensíveis, que são normalmente responsáveis pela infecção e proliferação exagerada dos mais resistentes, que muitas vezes, não são mais do que a flora autóctone.\n\nRegras gerais para colheita de amostras para exame microbiológico\n1- Obter o produto antes da administração da terapêutica antimicrobiana.\n2- Colher do local onde o agente etiólogico é mais frequentemente encontrado.\n3- Colher durante a fase aguda.\n4- Colher quantidade suficiente para permitir um exame completo.\n5- Fornecer ao laboratório as informações clínicas indispensáveis, fazendo o correcto preenchimento da requisição.\n6- Colher com técnica adequada, evitando a contaminação da amostra.\n7- Transporte para o laboratório em tempo adequado e em recipiente próprio.\n\nLocais de colheita\nDitado pela patogenicidade da doença.\nNa colheita de amostras orais deve-se evitar tanto quanto possível a contaminação da amostra pela flora indígena oral.\n\nTipos de amostras\n- Lesões da mucosa\n- Abscessos com supuração\n- Infecções das glândulas salivares Infecções endodônticas\n- Biópsias de tecidos\n- Sangue (Soro)\n- Bolsas periodontais (placa subgengival)\n- Placa supragengival\n\nA colheita microbiológica a partir da cavidade oral deve ter em conta que a maior parte dos microorganismos são anaeróbios e como tal deve ser processada para a pesquisa dos mesmos e com os cuidados requeridos para anaeróbios.\n\n3. TRANSPORTE\nComo a maior parte das bactérias orais são anaeróbias ou anaeróbias facultativas, deve-se ter em conta o transporte ao laboratório de microbiologia para que não se afecte a viabilidade das bactérias, nem se modifique a proporção dos microorganismos existentes.\n\nDeve-se partir do princípio que existem bactérias anaeróbias na amostra, que não toleram o oxigénio, nem por breves períodos de tempo. Para este motivo, o meio de transporte deve assegurar a sobrevivência de todas as bactérias anaeróbias que existam na amostra. Como os aeróbios e anaeróbios facultativos permanecem viáveis em condições de anaerobiose, o sistema de transporte universal será em todos os casos um meio anaeróbio.\n\nO meio de transporte deve:\n1- Evitar o contacto da amostra com o oxigénio\n2- Impedir a dissecação da amostra\n3- Evitar que os m.o. presentes na mesma se multipliquem\n\nExemplos de meios de transporte\n- Sistema da seringa montada\n- Port-A-Cul (BBL) meio Cary-Blair\n- Portagerm (bioMerieux) - PORTAGERM\n\nÉ um meio redutor sólido tamponado. O agar contido no meio impede a difusão do oxigênio que é levado a quando da colheita. Os agentes redutores combinam-se com o oxigênio livre para manter a anaerobiose. O indicador de óxido-redução presente no meio permite visualizar a presença ou ausência de oxigênio:\n\nColoração azul-lavanda -----> presença de oxigênio\nSem coloração -----> ausência de oxigênio\n\nA utilização deste meio é recomendada para o transporte de amostras ao laboratório de bacteriologia. Qualquer que seja a origem, a viabilidade da maior parte dos m.o. é mantida 48 horas a 20-25°C. 4. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE PLACA\nPara a identificação dos microrganismos presentes na placa, torna-se necessário que o transporte e o processamento apropriados das amostras sejam realizados. Os parâmetros importantes são:\n\n4.1. Anaerobiose\nUma vez que a placa, sobretudo a subgengival, contém diversas bactérias anaeróbias, é importante fornecer um meio de transporte para anaeróbios.\n\n4.2. Viabilidade durante o transporte\nO meio de transporte deve preservar a viabilidade microbiana, durante o transporte, assim como evitar o crescimento selectivo de algumas espécies, levando a resultados distorcidos.\n\n4.3. Dispersão\nDevido ao facto de as bactérias na placa formarem grumos, o material deve ser dispersado antes do exame cultural para que se obtenham resultados representativos.\n\n4.4. Diluição\nO número de microrganismos presentes na placa é muito elevado (entre 10⁹ e 10¹²). Por essa razão a amostra deve ser diluída antes do exame cultural, de forma a permitir contagens precisas do número de colônias.\n\n4.5. Incubação\nComo a maioria dos m.o. orais são anaeróbios, as amostras devem ser incubadas em atmosfera de anaerobiose. Se existir a suspeita da presença de bactérias aeróbias ou microaerofílicas, a amostra deve ser incubada nesse tipo de ambiente.\n\n5. MÉTODOS DE ESTUDO DE MICROBIOLOGIA ORAL\nUma vez que as lesões do periodonto, abscessos, cáries e outras infecções orais contêm uma grande variedade de possíveis microrganismos patogênicos, o diagnóstico microbiológico deve ter em conta uma grande diversidade de organismos. \n\nA maior parte dos laboratórios usam um método ou uma combinação de métodos de diagnóstico, dependendo das amostras e organismos que vão ser identificados. Em resumo um único método não é suficiente para abranger todas as situações. 5.2.1. Meios de cultura\n\nMeios não selectivos\nPermitem o crescimento dos microrganismos nas mesmas proporções em que se encontraram na amostra.\n\nMeios selectivos\nUm meio selectivo ideal é aquele que contém agentes antimicrobianos capazes de eliminar a flora contaminante, com exceção do organismo para o qual o meio é específico.\n\n5.2.2. Processos de inoculação\n- Sementeria por estrias\n- Sementeira por inundação\n\n5.2.3. Atmosfera de incubação\nA cultura de anaeróbios é baseada na exclusão de oxigênio da atmosfera e produção de um baixo potencial de oxidação-redução no meio de cultura. Sistemas de cultura para anaeróbios:\n- Câmara de anaerobiose\n- Jarro de anaerobiose\n\n5.2.4. Tempo de incubação\n\n5.3. Identificação\n\nIdentificação definitiva\nPara muitas espécies orais, a sua identificação requer um estudo bioquímico aprofundado, referindo-se para os anaeróbios, o estudo dos produtos finais do seu metabolismo ou o estudo do perfil proteico da membrana celular bacteriana (SDS-PAGE). Identificação presuntiva\nPara muitas espécies orais, a sua identificação pode ser acompanhada pelo uso de testes de identificação rápidos, implicando a combinação de meios selectivos e meios não selectivos e ainda uma série de testes bioquímicos.\n5.4. Testes de sensibilidade aos antibióticos Género Streptococcus\nO género Streptococcus consiste nos estreptococos piogénicos (β-hemolíticos), nos estreptococos orais e vários outros não agrupáveis.\nCARACTERÍSTICAS GERAIS\n- Streptococcus spp. apresentam células esféricas que podem ser ovais ou alongadas\n- Em meio sólido as células ocorrem em pares, aglomerados ou em cadeias curtas, mas em meio líquido ocorrem em cadeias características\n- Imóveis\n- Não formam endósporos\n- Algumas espécies formam cápsulas polissacarídicas\n- Várias espécies produzem grandes quantidades de polissacarídeos extracelulares (EPS), dextranos (poliglucanos) e levanos (polifrutanos), quando crescem na presença de frutose\n- Presença de fimbrias em diversas espécies, que mediam a adesão e agregação entre espécies\n- Origem colombiana brancas, mas que podem aparecer verdes como resultado de alfa hemólise\n- alfahemólise: hemólise parcial que produz cor verde no meio da colônia como resultado da produção de peróxido de hidrogênio quando as células são incubadas na presença de ar\n- betahemólise: hemólise completa, com uma zona clara bem definida à volta da colônia, produzida por hemolisinas específicas libertadas pelas células.\n- gamahemólise: ausência de hemólise\n- As colônias que contêm polímeros, podem ser aderentes ao ágar ou não, dependendo das espécies e em algumas, as colônias podem parecer húmidas como resultado da natureza higroscópica do polímero\n- Anaeróbios facultativos e capnofílicos. O crescimento aeróbio é estimulado pela presença de 5 a 10% de CO2\n- Algumas espécies são anaeróbias - Streptococcus spp. são fermentativos e como produtos finais apresentam grandes quantidades de ácido lático. Alguns ácidos orgânicos e aminoácidos também podem ser fermentados. Algumas espécies podem produzir peróxido de hidrogênio\n- Catalase negativa\n- Oxidase negativa (ausência de citocromos)\n- Necessidades nutricionais de aminoácidos, vitaminas, purinas e pirimidinas\n- O crescimento é estimulado pela adição ao meio de cultura de sangue ou soro\n- O meio de cultura pode ser gelose sangue - Meio de tripticasa-soja-5% sangue de cavalo ou carneiro.\nMDC selectivos para β-hemolíticos: adicionados de antibióticos como a gentamicina, ácido nalidíxico e cristal violeta.\nMDC selectivos para Estreptococos orais: adicionados de 5% de sucrose (TYC; MSB; GSTB; TYCSB). Estes meios também ajudam a diferenciar as diferentes espécies de estreptococos orais com base na sua morfologia.\n- Classificação de Lancefield: A, C, G e L. Esta classificação tem um uso limitado particularmente nos estreptococos orais que não têm antígenos específicos. Como tal, foram agrupados serologicamente em 5 sorotipos que se distinguem pela letra minúscula (a,b,c,d,e).\n- Sensibilidade à bacitracina - verifica-se um halo de inibição para os β-hemolíticos.\n- Habitat: os estreptococos fazem parte da flora comensal humana e de outros animais, encontram-se na pele, nas mucosas da nasofaringe, no canal alimentar e no tracto urogenital. A boca é o maior habitat das espécies orais que parecem estar bem adaptadas para colonizar a mucosa oral (S. salivarius) ou as superfícies duras - esmalte do dente (S. sanguis e S. mutans). As espécies patogênicas do gênero Estreptococos são β-hemolíticos (S. pyogenes) e causam várias infecções como a escarlatina, febre reumática, impetigo, tonsilite e outras infecções do trato respiratório.\nA maioria dos estreptococos não β-hemolíticos são patogênicos oportunistas numa grande variedade de infecções, nomeadamente, com grande afinidade para o tecido cardíaco, responsáveis por endocardites.\nNa cavidade oral, S. mutans tem sido considerado o principal responsável por cáries dentárias. A cariogenicidade deste m.o. é atribuída à produção de ácido láctico que vai dissolver o esmalte do dente; a produção de polissacarídeos extracelulares na presença de sacarose é o fator principal na colonização do dente por este organismo e contribui para iniciar cáries.\nEm relação à doença periodontal, algumas espécies como S. sanguis podem ter um papel protetor.\nOs estreptococos orais são os componentes majoritários da placa supragengival e também são encontrados na placa subgengival.\n\nDETERMINANTES VILURENTAS DE S. MUTANS\n\n1- Síntese de glucanos insolúveis em água\n2- Síntese de polissacarídeos intracelulares (IPS)\n3- Tolerância à acidez\n4- Acidogenicidade láctica\n5- Produção de endodextranase