Resenha Critica

Modelos animais no estudo de doenças genéticas humanas Felipe Tadeu Galante Rocha de Vasconcelos1 Laura Machado Lara Carvalho1 Lucas Santos e Souza1 Igor Neves Barbosa2 Carolini Kaid Dávila3 Mayana Zatz3 Mariz Vainzof3 1Doutorandoa do Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas BiologiaGenética Departamento de Genética e Biologia Evolutiva Instituto de Biociências Universidade de São Paulo SP 2Mestrando do Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas BiologiaGenética Departamento de Genética e Biologia Evolutiva Instituto de Biociências Universidade de São Paulo SP 3Pesquisadora do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva Centro de Estudos do Genoma Humano e CélulasTronco Instituto de Biociências Universidade de São Paulo SP Felipe Laura Lucas e Igor contribuíram igualmente para o artigo Autor para correspondência mvainzofuspbr Palavraschave modelos animais genética humana doenças genéticas zebrafish camundongo cão 3Rs Modelos animais são espécies não humanas que têm sido utilizadas em inúmeras pesquisas científicas permitindo a compreensão do funcionamento de organismos vivos complexos além do desenvolvimento de tecnologias aplicadas à saúde humana como medicamentos soros e vacinas Esses modelos são utilizados na mimetização de doenças na expectativa de se poder posteriormente utilizar o conhecimento gerado em humanos Nesta leitura você poderá conhecer alguns dos principais modelos utilizados em experimentação implicações éticas e legais do seu uso além de exemplos de aplicações que contribuíram significativamente para a sociedade principalmente no campo da genética humana Por que utilizar animais para estudar doenças humanas Ao longo da história os estudos com animais permitiram melhor compreensão de aspectos de fisiologia patologia farmaco logia e genética Os modelos animais dão aos pesquisadores a possibilidade de experimentar em situações controladas e mimetizar condições biológicas complexas de um ser vivo contribuindo para encontrar soluções para questões de saúde humana A Figura 1 apresenta uma linha do tempo com alguns exemplos de avanços importantes a partir de estudos com animais no campo das ciências biomédicas Os experimentos com modelos animais contribuem para o conhecimento científico e melhorias na qualidade de vida através do desenvolvimento de novos medicamentos e vacinas bem como novas técnicas cirúrgicas e protocolos de administração de fármacos Praticamente 90 das pesquisas laureadas com o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina utilizaram experimentos com animais Em genética costumase usar modelos animais para identificar a função de genes e entender como estão relacionados às doenças e a outras características fenotípicas A partir da década de 1980 com o aperfeiçoamento das tecnologias de biologia molecular e edição gênica houve uma explosão nas possibilidades de manipulação genética de animais modelo Assim podese por exemplo silenciar um gene específico e verificar o efeito resultante em escala molecular e fisiológica como também observar as características visíveis a olho nu Dessa forma é possível avaliar se um gene candidato realmente é causador de uma doença No extremo oposto podemos aumentar a expressão ou mesmo adicionar cópias de um ou mais genes inclusive genes não pertencentes à espécie e observar as consequências Outras possibilidades são os estudos funcionais que investigam os mecanismos fisiopatológicos das doenças além dos testes de novos tratamentos Com o advento recente de uma nova técnica muito eficaz e específica de edição gênica CRISPR aumentou consideravelmente o potencial de se obter resultados promissores para a sociedade a partir de estudos de doenças genéticas humanas utilizando modelos animais Sobre a técnica de CRISPR esta revista publicou dois artigos esclarecedores em 2017 Carli e colaboradores Souza e Pereira de maneira que você pode consultálos para entender melhor os mecanismos moleculares envolvidos e as implicações sociais Farmacologia ciência que estuda como diferentes substâncias os fármacos interagem com o organismo e que resposta desencadeiam Biologia molecular ciência que busca compreender a estrutura e o funcionamento de moléculas biológicas em especial as que constituem o material genético Edição gênica alteração artificial de sequência de DNA em organismo vivo Gene candidato considerase como candidato um gene para o qual há evidências preliminares de que possa estar relacionado mecanicamente à manifestação de determinada doença ou característica A relação do gene candidato com uma doença é uma hipótese que precisa ser confirmada ou refutada a partir de evidências experimentais complementares Estudos funcionais no âmbito da genética são estudos que buscam entender mecanicamente a relação entre genes e seus fenótipos CRISPR técnica de edição gênica que mimetiza mecanismos bacterianos de clivagem de DNA A clivagem é seguida de reparo do DNA pela célula utilizada no experimento o que frequentemente resulta em mutações A sigla significa Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats em referência ao lócus bacteriano que desencadeia tal mecanismo de combate a DNAs exógenos 1889 Oskar Minkowski e Joseph Von Mering descobriram a partir da remoção do pâncreas de um cachorro que a ausência desse órgão causa diabetes 1906 Santiago Ramón y Cajal recebeu um prêmio Nobel por um conjunto de descobertas sobre morfologia degeneração e regeneração do sistema nervoso central Para isso Cajal utilizou diversos modelos como coelhos gatos e aves 1928 Em um famoso experimento que utilizou camundongos Frederick Griffith descobriu o princípio genético da transformação Princípio genético da transformação também chamado de transformação bacteriana Por esse processo ocorre a captura de pedaços de DNA do ambiente e incorporação ao genoma da bactéria 2007 Ganharam o prêmio Nobel três pesquisadores Oliver Smithies Martin Evans e Mario Capechi que anos antes haviam iniciado trabalhos pioneiros com alteração de genes em camundongos que ficam conhecidos como animais knockout Animais knockout animais em que ocorreu a inativação ou deleção de um gene 2016 O grupo brasileiro de Patrícia Beltrão Braga USP utilizou camundongos para compreender a patogenicidade do vírus zika e comprovou sua relação com a microcefalia Desde então centenas de diferentes camundongos knockout foram desenvolvidos com o objetivo de se estudar a participação de genes específicos nos mecanismos de origem de várias doenças Figura 1 Exemplos de experimentos com modelos animais que foram importantes para a humanidade Figura 2 Monumento ao camundongo de laboratório em um parque em frente ao Instituto de Citologia e Genética da Academia de Ciências da Rússia na cidade de Novosibirsk Observase um camundongo tricotando uma molécula de DNA que representa a gratidão da humanidade pelo animal que é utilizado em pesquisas genéticas para entender mecanismos biológicos e desenvolver novas drogas e tratamentos para doenças Autora Irina Gelbukh 2013 Licença Creative Commons atribuída Figura 3 Alguns benefícios da utilização do zebrafish como modelo animal Figura 5 Benefícios de se utilizar o camundongo Mus musculus como modelo animal Doenças neurodegenerativas doenças nas quais ocorre perda progressiva da estrutura e do funcionamento dos neurônios Alzheimer transtorno que causa a deterioração cognitiva e da memória além de alterações comportamentais que comprometem a vida diária Neurodesenvolvimento desenvolvimento físico e psíquico do sistema nervoso Imunodeprimido indivíduo que tem baixa resposta imunológica devido a uma condição patológica Existem mais de mil linhagens diferentes de camundongos E muitas delas são modelos para doenças humanas como câncer doenças neurodegenerativas como doença de Huntington e o Alzheimer neuromusculares como as distrofias musculares do neurodesenvolvimento como autismo imunodeficiências doenças autoimunes obesidade entres outras Uma outra razão pela qual camundongos são amplamente utilizados como modelos em pesquisa experimental é a alta similaridade com o genoma do ser humano havendo semelhança de aproximadamente 85 nas regiões codificadoras de proteínas Alguns genes apresentam quase 100 de equivalência Além disso cerca de 80 dos genes desses dois genomas são ortólogos Uma linhagem relevante nas pesquisas biomédicas é a nude Figura 6 Ela apresenta uma mutação espontânea em homozigose no gene Foxn1 o que acarreta defeitos na produção das células do timo glândula localizada no tórax que é responsável pela maturação de células do sistema imune Em decorrência da ausência do timo tratase de um animal imunodeprimido e isso faz com que esse modelo seja amplamente utilizado para estudar diversos mecanismos sem interferência do sistema imune Além disso apresenta deficiência na produção dos pelos por isso a ausência de pelagem Figura 6 Camundongo nude Os pesquisadores aproveitam que os camundongos nude não apresentam uma boa resposta imunológica para fazer experimentos sobre câncer É possível inserir um pedaço de tumor humano no animal pois o organismo do modelo nude não reage adequadamente para combatêlo Assim podese observar tanto o desenvolvimento de tumores derivados de pacientes humanos quanto testar a resposta a diferentes tratamentos Doença de Huntington doença genética que acomete progressivamente o sistema nervoso central causando movimentos involuntários alterações comportamentais e declínio cognitivo Neuromusculares doenças neuromusculares são aquelas que afetam direta ou indiretamente a função muscular isto é incluem patologias intrínsecas do músculo e também aquelas do sistema nervoso que afetam o comando das contrações musculares Doenças autoimunes são caracterizadas por respostas imunológicas contra estruturas do próprio organismo Alopecia também chamada de calvície é a perda ou ausência de cabelo Mutação sem sentido variante genética na qual um códon que levaria à inclusão de um aminoácido à cadeia polipeptídica é alterado passando a sinalizar o término da tradução isto é tornase um códon de parada no RNA UAG UAA ou UGA Distrofina proteína muscular que liga o citoesqueleto da célula do músculo a um complexo de proteínas da membrana que por sua vez interage com o colágeno extracelular Multifatorial diz respeito a características cujas manifestações resultam de interações entre múltiplos fatores genéticos e ambientais Mutações homozigóticas no gene FOXN1 em humanos também são muito prejudiciais causando desde problemas na pele e alopecia congênita até deficiência do sistema imunológico o que torna essas pessoas muito suscetíveis a infecções Existem algumas linhagens de camundongos que são utilizadas para estudar diferentes doenças neuromusculares Uma delas é a linhagem Dmdmdx para Distrofia Muscular de Duchenne que tem uma mutação espontânea do tipo mutação sem sentido no gene Dmd murino o que faz com que não haja a produção da proteína distrofina no músculo esquelético desses animais Entretanto diferentemente dos humanos nos camundongos Dmdmdx o quadro clínico é muito leve e a sobrevida é bastante próxima da normal Nos humanos a Distrofia Muscular de Duchenne se manifesta em meninos desde os primeiros anos de vida e se caracteriza pela degeneração muscular progressiva com perda da força muscular com uma série de consequências que comprometem a expectativa e a qualidade de vida Além dos modelos espontâneos de camundongo também os modelos induzidos são muito úteis em pesquisas biomédicas Uma das abordagens com esse tipo de modelo é o de validação de genes candidatos a diversas doenças Um exemplo é o autismo que é uma condição que pode ter origem monogênica ou multifatorial Quando se tem um gene candidato para determinada forma de autismo podese editar esse gene em camundongos e verificar se os animais apresentam características semelhantes às dos pacientes humanos Um dos testes que pode ser feito para avaliar o comportamento social dos camundongos é o chamado teste de sociabilidade três câmaras Figura 7 Nele o camundongo central é observado pelos pesquisadores e suas ações são quantificadas Entre os parâmetros avaliados estão o tempo de exploração da gaiola número de vezes e tempo gasto na interação com os outros camundongos etc Congênita condição que independentemente da sua causa já se apresenta ao nascimento Distrofia Muscular de Duchenne doença genética causada por variantes deletérias no gene da distrofina Tratase do tipo mais comum de distrofia muscular Murino referente ao grupo Murinae do qual fazem parte os camundongos Degeneração deterioração de um tecido ou órgão Teste de sociabilidade três câmaras Normalmente os roedores preferem passar mais tempo com outro roedor e investigam um novo indivíduo mais do que um familiar novidade social Com base nessa tendência este teste é útil para avaliar o comportamento social dos animais Nele a gaiola é dividida em três câmaras com aberturas entre elas Após a habituação à câmara vazia a do meio o animal em análise encontra outros indivíduos nas outras câmaras O tempo gasto cheirando cada animal o tempo gasto em cada câmara e o número de entradas são registrados e analisados É aplicável por exemplo a estudos envolvendo autismo efeito de medicamentos na sociabilidade comportamento parental e interesse em novidades sociais Figura 7 Teste de sociabilidade Cão Canis lupus familiaris Por que utilizar o melhor amigo do homem em pesquisas Existem pelo menos 450 doenças que surgem espontaneamente em cães e 80 delas também afetam humanos Além disso em muitos casos a manifestação dessas doenças nos cães é comparável ao que ocorre em humanos considerando sua complexidade social comportamental e do ambiente em que estão inseridos e assim sendo o potencial translacional do modelo canino para o estudo de doenças humanas é maior que de outros modelos que são mais utilizados como por exemplo camundongos e zebrafish A resposta imune dos cães tem maior similaridade com a do humano do que outros modelos Além disso o tamanho maior dos cães tornaos fisiologicamente mais próximos dos humanos Isso contribui por exemplo para mimetizar melhor a biodistribuição de fármacos em um tratamento experimental Afinal a biodistribuição tende a ser facilitada no corpo de animais menores Muitos medicamentos testados em pequenos animais podem não alcançar seus alvos moleculares em humanos com a mesma eficácia já que somos muito maiores o que é uma barreira translacional Potencial translacional potencial de gerar informações ou ferramentas aplicáveis à saúde humana Biodistribuição passagem de um fármaco da corrente sanguínea para os tecidos É afetada por fatores fisiológicos e propriedades físicoquímicas do próprio fármaco Figura 8 Alguns benefícios de se utilizar o cão como modelo animal Figura 9 Análise comparativa entre modelos de Distrofia Muscular de Duchenne Figura 10 Comparações entre zebrafish camundongo e cão Em casos de divergência funcional entre animais e humanos podese procurar aperfeiçoar o uso do modelo a fim de responder às questões centrais da pesquisa Um exemplo é o caso do camundongo duplo mutante DmdmdxLargemyd desenvolvido em 2013 pelo grupo de pesquisa coordenado por Mariz Vainzof da Universidade de São Paulo Enquanto o camundongo Dmdmdx apresenta as mesmas características genéticas e bioquímicas que pacientes humanos com Distrofia Muscular de Duchenne a fraqueza muscular é um componente que não está presente de forma muito evidenciada ou seja tal modelo não manifesta todos os aspectos funcionais da doença Então os animais Dmdmdx foram cruzados com animais com mutação também espontânea no gene Large1 relacionado a uma outra forma de distrofia muscular A linhagem obtida DmdmdxLargemyd apresenta grave e progressiva fraqueza muscular semelhante ao que acontece em humanos associada a deficiência de distrofina no músculo de forma que é um modelo para estudo das distrofias musculares em geral Há um debate a respeito da usabilidade e confiabilidade dos animais para modelagem de algumas características humanas Parte dos críticos argumenta que mesmo em casos em que há grande similaridade genética algumas características podem não ser tão similares Sobre isso cabe dizer que a reprodutibilidade de estudos nos quais são usados modelos animais que são organismos complexos depende de um rigoroso controle de variáveis que podem influenciar nos resultados Essas variáveis podem ser o background genético de uma linhagem tipo de alimentação oferecida controle do ciclo de dianoite exposição a fatores estressantes como barulho etc Os animais de experimentação sempre que possível devem ainda ser mantidos em biotérios cuja estrutura e responsáveis pelo seu cuidado sejam adequadamente preparados para seu uso em pesquisa Dessa forma reduzse a chance de observações experimentais contraditórias Vale a pena lembrar que toda pesquisa clínica realizada em humanos para validação de qualquer medicamento é precedida pela experimentação em modelos animais A quantidade de trabalhos científicos em todo o mundo em que foram usados modelos animais em seu desenvolvimento para uma infinidade de aplicações e todos os avanços que propiciaram à sociedade como medicamentos vacinas técnicas etc não deixam dúvidas de que são importantes ferramentas quando usados corretamente Aspectos legais da experimentação animal no Brasil No Brasil todos os projetos de ensino ou pesquisa que envolvam animais vertebrados devem passar por uma apreciação ética prévia da CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais da instituição na qual os animais serão utilizados Tratase de um procedimento obrigatório As CEUAs são credenciadas e reguladas por um órgão hierarquicamente superior o CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal que está vinculado ao Ministério de Ciência Tecnologia e Inovações do governo federal Somente após a aprovação do projeto pela CEUA podem ser iniciados experimentos envolvendo animais A apreciação ética da CEUA envolve a verificação de que o plano de trabalho proposto pelos pesquisadores está de acordo com legislação vigente sobretudo a Lei nº 117942008 conhecida como Lei Arouca De maneira geral a apreciação ética envolve as seguintes verificações 1 A real necessidade da realização do experimento tendo em vista os benefícios que poderia trazer à sociedade Vale a pena investigarsolucionar o problema de pesquisa em questão Foi verificado se alguém já solucionou ou estudou esse problema anteriormente Quais benefícios a pesquisa trará Que parcela da população e que segmentos da economia serão beneficiados Reprodutibilidade característica de um experimento científico passível de ser reproduzido novamente apresentando resultados equiparáveis aos de execuções anteriores Tratase de uma condição importante para que os experimentos científicos tenham credibilidade pois é preciso evitar conclusões errôneas a partir de efeitos aleatórios erros de análise ou mesmo manipulações inadequadas Lei Arouca é assim conhecida por ser de autoria do Deputado Sergio Arouca Link de acesso a essa legislação httpwwwplanaltogovbrccivil03ato200720102008lei111794htm Background genético fundo genético composição genética de uma linhagem ou espécie todos os alelos do genoma excluindose os genes de interesse do estudo Problema de pesquisa questão para a qual se buscam respostas em uma pesquisa científica Pesquisa clínica testes realizados em humanos após etapas prévias em modelos animais para averiguar a segurança e a eficácia de uma intervenção vacinas e medicamentos 2 Se o projeto de pesquisa segue o princípio dos 3Rs que será apresentado mais adiante 3 Se há pessoas na equipe capacitadas tecnicamente para os procedimentos propostos Além disso a Lei Arouca proíbe a utilização de animais em atividades educacionais de primeiro e segundo graus ficando restrita somente a estabelecimentos de ensino superior ou de educação profissional técnica da área biomédica A Lei Arouca também prevê sanções legais às pessoas físicas pesquisadores e jurídicas instituições que transgredirem essa legislação As sanções variam entre advertência multa interdição impedimento temporário ou definitivo do exercício da atividade com animais e suspensão de financiamentos provenientes de fontes oficiais de crédito e fomento científico Os princípios dos 3Rs Os Princípios dos 3Rs compõem uma norma técnica proposta em 1959 por William Russell e Rex Burch e amplamente difundida entre os países para uso de animais em pesquisas Baseiase em três pilares reduzir substituir e aprimorarrefinar do inglês reduction replacement and refinement Figura 11 É imperativa de acordo com esses princípios a reflexão de sempre tentar reduzir o número de animais por procedimento experimental substituir sempre que possível o uso de animais e aprimorar métodos para minimizar o desconforto animal Para minimizar o desconforto animal utilizamse por exemplo instalações limpas e adequadas em espaço temperatura com disponibilidade de água alimento etc além de sedativos analgésicos ou anestésicos durante eventuais procedimentos que poderiam causar dor Também é preciso que os pesquisadores que os manipulam tenham passado por treinamento prévio de capacitação e recomendável que não utilizem cosméticos que possam ter odores durante os procedimentos com animais porque isso causa desconforto Uma opção bastante factível de substituição de animais especificamente para fins de ensino são vídeos e técnicas modernas de apresentação 3D em computador pois permitem a demonstração de fenômenos fisiológicos Além disso o uso de bonecos realísticos para treinamento de estudantes da área de saúde por exemplo na realização de suturas são aliados muito interessantes na redução do uso desnecessário de animais nas aulas práticas Do ponto de vista da pesquisa científica além das melhorias que têm ocorrido no desenvolvimento de melhores modelos animais um grande esforço está sendo dedicado à busca de abordagens alternativas ou mesmo prévias ao uso de animais culturas celulares abordagens in vitro e o uso de célulastronco para diferenciação no tecido de interesse Quando nos referimos a abordagens prévias quer dizer que resultados pouco promissores nesses ensaios preliminares podem levar à desistência de se seguir avaliando tal hipótese excluindo a necessidade de se testar em animais No entanto cabe dizer que nenhum processo vivo ocorre isoladamente Portanto em algumas situações os estudos envolvendo animais tendem a mimetizar melhor a complexidade dos processos biológicos de organismos vivos Para saber mais ANDERSEN M L WINTER L M F Animal models in biological and biomedical research experimental and ethical concerns AnAcadBras Cienc v 91 2019 doi10159000013765201720170238 CARLI G J SOUZA T A J PEREIRA T C A revolucionária técnica de edição genética CRISPR Genética na Escola v 12 n 2 p 114123 2017 SOUZA T A J Pereira T C O impacto na sociedade da tecnologia de edição gênica com base no sistema CRISPRCas9 Genética na escola v 12 n 2 p 124131 2017 Modelos animais na pesquisa em DMD Fala Mariz Com Mariz Vainzof httpsyoutubey5uk33rYlrs Culturas celulares são conjuntos de células desenvolvidas sob condições controladas em ambientes artificiais In vitro expressão latina que designa experimentos da área biológica que têm lugar fora de sistemas vivos como por exemplo em tubos de ensaio Célulastronco células que conseguem se diferenciar e se transformar em diversos tipos celulares 3R R1 REPLACEMENT SUBSTITUIÇÃO sempre que possível substituir experimento com animais por outra metodologia R2 REDUCTION REDUÇÃO utilizar estritamente o número necessário de animais para o experimento R3 REFINEMENT APRIMORAMENTO aprimorar protocolos experimentais para minimizar a dor ou o estresse sempre que possível Figura 11 A norma técnica dos 3Rs Ilustrações As figuras 1 e 3 a 11 foram produzidas pelos autores utilizando recursos Mind the Graph httpswwwmindthegraphcom respeitando as condições de seus termos de uso Financiamento Os autores são gratos pelo apoio das agências de fomento FAPESP CAPES e CNPq que financiam seus projetos CEPID e INCT e bolsas de pósgraduação