Methylobacterium Symbioticum

Instituto Federal Farroupilha Campus Santo Augusto Curso Superior de Bacharelado em Agronomia Professor Ricardo Tadeu Paraginski Atividade Referente aos 10 artigos base para elaboração do TCC I Art Título Instituição Citação autorano Conclusão 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Vol0123456789 1 3 Folia Microbiologica 2024 69121131 httpsdoiorg101007s12223023010784 ORIGINAL ARTICLE Application and effectiveness of Methylobacterium symbioticum as a biological inoculant in maize and strawberry crops Rocío Torres Vera1 Antonio José Bernabé García1 Francisco José Carmona Álvarez1 Jesús Martínez Ruiz1 Félix Fernández Martín1 Accepted 14 July 2023 Published online 1 August 2023 The Authors 2023 Abstract The effectiveness of Methylobacterium symbioticum in maize and strawberry plants was measured under different doses of nitrogen fertilisation The biostimulant effect of the bacteria was observed in maize and strawberry plants treated with the biological inoculant under different doses of nitrogen fertiliser compared to untreated plants control It was found that bacteria allowed a 50 and 25 decrease in the amount of nitrogen applied in maize and strawberry crops respectively and the photosynthetic capacity increased compared with the control plant under all nutritional conditions A decrease in nitrate reductase activity in inoculated maize plants indicated that the bacteria affects the metabolism of the plant In addition inoculated strawberry plants grown with a 25 reduction in nitrogen had a higher concentration of nitrogen in leaves than control plants under optimal nutritional conditions Again this indicates that Methylobacterium symbioticum provide an additional supply of nitrogen Keywords Biofertiliser Biostimulant Maize Methylobacterium symbioticum Nitrogenfixing bacteria Strawberry Introduction Bacteria of the genus Methylobacterium Patt et al 1976 are classified as belonging to the class Alphaproteobacteria the Gramnegative bacteria being characterised by a pinkish pigmentation due to the synthesis of carotenoids Van Dien et al 2003 mainly xanthophiles They are rod shaped strictly aerobic and can grow using compounds containing only one carbon C1 such as methanol or methylamine Toyama et al 1998 Konovalova et al 2007 Methylobacterium spp can occupy different habitats including soil water leaf surfaces nodules grains and air Tani et al 2012 Wellner et al 2012 and have been detected in more than 70 species of plants Omer et al 2004 There are symbiotic species such as Methylobacterium nodulans which are known to induce the formation of radical nodules in legumes of several Crotalaria spe cies Jourand et al 2004 while the vast majority estab lish epiphytic or endophytic relationships Elbeltagy et al 2000 Wanderley Costa et al 2012 The epiphytic species often advance along the leaf surface and invade the stomatic pores where they can then establish endophytic bacterial communities Kutschera 2007 which do not cause damage or form visible external structures in the host Ardanov et al 2012 Dourado et al 2015 In the phyllosphere only about 30 of Methylobacterium spp can fix atmospheric nitrogen Madhaiyan et al 2015 However this atmospheric nitrogen is a great advantage for the establishment of these species in the phyllosphere as nitrogen is often the most limiting nutrient for plant growth Conley et al 2009 Atmospheric nitrogen is not available for plants metabolism Dourado et al 2015 and nitro genfixing bacteria reduces atmospheric N2 to ammonium NH4 through the enzyme nitrogenase nifH gene Phosphorus is the second most important element in min eral nutrition but is not directly available for plants as it is bound to calcium iron or aluminium or is immobilised as a phytate Lim et al 2007 Agafonova et al 2013 There are some species belonging to Methylobacterium spp that can dissolve inorganic phosphates which then become available to the plant Agafonova et al 2013 This is due to enzymes such as phosphatase or phytase as well as to the secretion of organic acids which reduce the pH of the medium Agafonova Rocío Torres Vera rociotorressymborgcom 1 RD Department Symborg SLU Murcia Spain 122 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 et al 2013 Dourado et al 2015 Some Methylobacterium spp can also protect host plants by synthesising a wide spectrum of antimicrobial molecules Ryan et al 2008 such as bacterioc ins and organic acids including 4hydroxybenzoic acid Kwak et al 2014 Dourado et al 2015 or by activating Induced Systemic Resistance ISR Nigris et al 2013 through the production of hydrolytic enzymes such as pectinase and cel lulase Ardanov et al 2012 In addition it has been observed that Methylobacterium spp produce hydroxamatetype sidero phores capable of inhibiting the growth of pathogens in the plant Sharma and Johri 2003 Andreote et al 2008 Due to their ability to offer plants a source of nitrogen and phosphorus as well as to protect plants from patho gens these microorganisms play a crucial role as Plant Growth Promoting Bacteria PGPBs Dourado et al 2015 which can lead to an improvement in the development of agricultural crops Recently a new species Methylobacterium symbioticum has been isolated from spores of the symbiont fungus species Glomus iranicum var tenuihypharum Pascual et al 2020 These authors demonstrated how Methylobacterium symbioticum reduced the need for nitrogen chemical fertilisers without reducing growth or the yield of rice maize and wine grape crops acting as a biofertiliser Pascual et al 2020 The yield of most of the crops treated with Methylobacterium symbioticum were higher than those of untreated crops because of the ability of the bacteria to fix atmospheric nitrogen This enzymatic activity is possible due to the presence of nitrogenase com plex composed of chlorophyllide reductases and ferredoxin protochlorophyllide reductases ATPdependent NCBI txid2584084 that compensate for the reduction in chemical nitrogen fertilisation Molybdenumcontaining nitrogenase encoded by nif genes is the more conventional enzyme that regulates nitrogen fixation although its central metal ion can be replaced by vanadium encoded by vnf genes this being the specific case of Methylobacterium symbioticum Methylobacterium symbioticum 533 aa protein VUD728331 GI168990407 Sippel and Einsle 2017 Mus et al 2018 This new species of the genus Methylobacterium is postu lated as an efficient biological inoculant for agriculture so it deserves further study Therefore an exhaustive study of the application of Methylobacterium symbioticum on maize and strawberry plants was carried out in order to determine its biostimulantbiofertiliser effect on the crops under different doses of nitrogen fertilisation Materials and methods Plant material and microorganisms used Maize plants Zea mays of the variety EP4636 Monsanto San Luis Missouri USA and strawberry plants Fragaria vesca of the variety Fortuna were used and the recently iso lated and described bacterium Methylobacterium symbioti cum strain SB23 was used as inoculum Pascual et al 2020 Plant growth and treatments applied Maize crop assay The assay was carried out in a greenhouse at Symborg Experimental Farm Los Martínez del Puerto Murcia Spain The 150L containers contained a mixture of sterile silica sand substrate farm soil and coconut fibre in a 111 ratio 3 plants per container Maize seeds were sown on 17112017 and the plants were harvested on 30042018 The irrigation water used came from a desalination plant Table S1 and during the assay 130 L of water per plant were applied at a concentration of 01 gL of nitrate 13 g per plant A 35 kv electric pump was used to feed the water to a 32 mm secondary pipe connected to 16 mm tubes pro vided with 3 Lh selfcompensating external drippers The commonly used quantity of fertiliser units for this crop was provided except in the case nitrogen when the 0 206 412 and 825 fertiliser units NFU used corresponding to 0 50 100 and 200 respectively of the standard nitrogen input for maize Table S2 The nutritional needs of the plants were supplied in the irrigation system When the plants were in stage 14 of the BBCH scale Methylobacterium symbioti cum was sprayed on the leaves with water at a rate of 1 105 colony forming units CFU per plant using a sprayer Plants treated with sterile bacterial inoculum were used as control Strawberry crop assay The experiment was carried out in a field located on the experimental plot belonging to Sym borg Corporate in Los Martínez del Puerto Murcia The plot is 8 m wide and 24 m long 192 m2 and the planting frame was 2 m between rows and 01 m between plants The strawberry plants were provided by nurseries and sown following a quincunx pattern They were transplanted into 1 m 018 m 015 m coconut fibre bags giving a sowing density of 50000 plants per ha Transplantation was car ried out on 02112017 and the plants were harvested on 01062018 The irrigation water used during the assay came from a desalination plant Table S1 and a total of 130 L of water per plant were applied with a concentration of 01 gL of nitrate 13 g per plant The water was supplied in exactly the same way as in the above assay and the fertilisation units were those corresponding to strawberry plants However in the case of nitrogen 13 180 348 515 and 683 NFU repre senting 0 25 50 75 and 100 respectively of the standard nitrogen input for strawberry crops were used Table S2 The nutritional contribution was made through the irrigation system The bacteria Methylobacterium symbioticum was applied via the leaves at 1 1010 CFUha Foliar application was carried out with a spray backpack at the rate of 200 L ha when the plant was in stages 1314 of the BBCH scale 123 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 It was applied at an ambient temperature of 20 C and 50 relative humidity with no dew on the leaves Plants treated with sterile bacterial inoculum were used as control Evaluation parameters and methodology Quantification of Methylobacterium symbioticum on leaf CFUg The CFU of Methylobacterium symbioticum was assessed in a leaf sample serially diluted in water For the first dilution 1 g of the leaf was chopped with a sterile scal pel and incubated up to 10 mL with sterile distilled water for 1 h at 160 rpm thus favouring the extraction of bacteria from both the internal and external tissue Serial dilutions were plated on methanol selective medium with minimal salt without a nitrogen source Pascual et al 2020 After 7 days of incubation at 28 C the colonies of Methylobacterium symbioticum grown in the selective medium were quanti fied The CFU present in maize leaves were quantified after 2 months of growth using 3 biological replicates per treat ment For the strawberries the bacteria was quantified after 1 2 3 and 4 months of growth Three biological replicates were used each composed of a 50 plant leaf mixture per treatment Quantification of nitrate reductase activity Leaf nitrate reductase NR activity was measured using the method described by Daniel and Curran 1981 For this purpose after 2 months of maize plant growth 3 biological repli cates consisting of 2 technical replicates were used for each treatment studied The strawberry crop was analysed after 2 and 3 months of growth using 3 biological replicates each formed by the mixture of leaves from 25 plants per treatment Nitrogen content g100 g plant This parameter is an indi cator of the amount of nitrogen that has accumulated in plant tissue at the time of analysis Using the Kjeldahl method Kjeldahl 1883 six biological replicates of each treatment were used analysing the total nitrogen in each plant at the end of cultivation in the case of maize Similarly total plant nitrogen was analysed in the strawberry crops but taking in this case 4 biological replicates each composed of 25 plants per treatment Photosynthetic capacity of the plant Plant photosynthetic capacity was measured using a SPADChlorophyll Meter SPAD 502Plus Konica Minolta Aurora United States The SPAD SoilPlant Analysis Development value is con sidered a parameter of the physiological state of the plant because it is proportional to the photosynthetic capacity of the plant and an indirect indicator of the chlorophyll content Eke et al 2000 Ling et al 2011 In maize crops after 2 3 and 4 months of growth the SPAD value was measured on the fourth true leaf of 6 biological replicates for each treatment Similarly the SPAD values were measured in strawberry plants but using 20 biological replicates for each treatment Each biological replicate of both tests consisted of the average value of 2 technical replicates Crop yield After harvesting all the maize cobs the average yield based on the kg harvested per plant and the yield per ha for each treatment studied were calculated To assess the yield of the strawberry crop 30 plants were randomly selected from each treatment and harvested throughout the growing cycle Statistical analysis All the study parameters were analysed using ANOVA using Statgraphics Plus software for Windows 51 Mau gistics Inc USA Results Effect of Methylobacterium symbioticum on the growth and development of maize crops grown under different nitrogen conditions Presence of Methylobacterium symbioticum in the phyllo sphere Following foliar application of Methylobacterium symbioticum the number of colonies in leaves of maize plants grown with different doses of nitrogen was quantified No colonies were observed in the control plants indicating that the assay had been properly carried out The amount of Methylobacterium symbioticum quantified in treated plants 4 weeks after bacterial inoculation was between 127 102 and 333 103 CFUg of leaf but there was no linear rela tionship between the number of CFU counted and the amount of nitrogen provided to plants Table 1 Plant nitrate reductase activity There was a linear correla tion between nitrogen supply and nitrate reductase activity in the control plants In plants treated with Methylobacte rium symbioticum the nitrate reductase activity tended to increase as the nitrogen provided increased However under the same nitrogen input conditions all the plants inoculated with Methylobacterium symbioticum showed significantly lower nitrate reductase activity than the control plants More specifically as the nitrogen dose increased the reduction reached 56 27 57 and 36 respectively for doses repre senting 0 50 100 and 200 of nitrogen Fig 1A Plant photosynthetic activity In control plants there is a lin ear relationship between the SPAD values and the nitrogen 124 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 dose Photosynthetic activity was significantly higher in con trol plants grown with a nitrogen doses of 100 and 200 compared with the SPAD values in the absence of this nutri ent Fig 1B On the other hand the SPAD index for plants inoculated with Methylobacterium symbioticum was equal to or greater than that of control plants for all the nitrogen fertiliser values Fig 1B When the nitrogen supply was 0 the photosynthetic activity of treated plants was significantly higher 21 than in the control plants in the same condi tions Fig 1B Similarly with a 50 nitrogen deficiency the SPAD value of treated plants was significantly 31 higher than in control plants Fig 1B Crop yield When the plant growth cycle had finished the cobs were harvested and the g of maize grain generated per plant were calculated A comparison with the yields obtained from the control plants grown in the different nutri tional conditions pointed to a linear relationship between the g of maize produced and the nitrogen dose provided Fig 1C On the other hand when the yields obtained in plants inoculated with Methylobacterium symbioticum were compared with yields obtained from the control plants there were only significant differences in the case of the treat ment representing half the usual nitrogen supply Indeed the plants treated with Methylobacterium symbioticum generated 385 more grain per plant than the control plants grown under the same nutritional conditions In addition this treat ment produced the highest yield recorded in the experiment although the 21 increase was not significantly different from the yield of control plants grown without nitrogen defi ciency Fig 1C Effect of Methylobacterium symbioticum on the growth and development of strawberry crops grown under different nitrogenous conditions Permanence of Methylobacterium symbioticum in the phyl losphere After foliar application of Methylobacterium symbioticum the number of colonies present in the leaves intently and superficially was quantified over a period of 90 days In control plants the presence of Methylobacterium symbioticum was not observed at any of the times analysed indicating that no manipulation errors occurred in the exper iment Table 2 The amount of Methylobacterium symbi oticum quantified in treated plants was between 1 103 and 18 104 CFUg leaf with no linear relationship between the number of CFU and the amount of nitrogen provided to plants Table 2 Plant nitrate reductase activity No dosedependent pattern in nitrate reductase activity was detected in control plants according to the dose of nitrogen used Fig 2A In contrast nitrate reductase activity of plants treated with Methylobac terium symbioticum had lower levels of nitrate reductase activity than control plants for all the nitrogen doses stud ied The lowest value in treated plants was observed with 50 nitrogen when the nitrate reductase activity detected was 13 lower than in control plants in the same conditions and 144 lower than in the control plants under normal nitrogen conditions Both results were statistically signifi cant Fig 2A Plant photosynthetic activity There was a gradual increase in photosynthetic activity as the nitrogen dose increased all values being significantly higher than the SPAD values of control plants in the absence of the nutrient However the SPAD index for plants treated with Methylobacterium sym bioticum was higher than in control plants for all nitrogen doses used Fig 2B Plants treated with Methylobacterium symbioticum in conditions that represented 25 50 75 and 100 of the usual nitrogen supply showed values that were equal to or greater than those of control plants with 100 nitrogen In addition at 100 nitrogen the treated plants had 88 more photosynthetic activity than control plants at the usual nitrogen dose the differences being significant Crop yield During the strawberry growing cycle strawber ries from 100 plants from each treatment and nitrogen dose were harvested weekly A comparison of the yield of the control plants amongst themselves in the different nutri tional conditions pointed to a linear relationship between the kg of strawberries harvested and the nitrogen dose pro vided Fig 2C An analysis of the results obtained in plants inoculated with Methylobacterium symbioticum identified a significant increase in yield of 299 and 326 under conditions of 25 and 75 nitrogen compared to control plants under the same conditions Fig 2C In addition plants treated with the 75 dose of nitrogen produced the highest amount of kg observed in the experiment the 213 increase being statistically significant compared with the yield of nonnitrogen deficient control plants Fig 2C When the nitrogen supply was 0 50 and 100 the treated Table 1 Quantification of Methylobacterium symbioticum on leaf CFUg of maize plants treated and nontreated with Methylobacte rium symbioticum and grown with different doses of nitrogen 0 50 100 and 200 4 weeks after application Three biological replicates were used for each treatment and dose of nitrogen M symbioticum CFUg Nitrogen doses Control M symbioticum treated 0 0 0 13 102 608 101 50 0 0 147 103 924 102 100 0 0 127 102 643 101 200 0 0 333 103 115 103 125 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 plants showed no significant differences from their controls with the same nitrogen dose Fig 2C Assimilation of nitrogen in plant and its relationship with the yield and nitrogen dose provided In the final stage of growth of the strawberry plants it was observed that the plants assimilated less nitrogen than provided in all the treatments except in the treatment involving no added nitrogen Table 3 In control plants the assimilation levels of nitrogen by the plant was directly related with the grad ual increase in nitrogen supply In addition under optimal nitrogen conditions 100 control plants showed the maxi mum values for yield and nitrogen assimilation On the other hand it was found that with a dose of 25 and 50 nitrogen the yield of plants treated with Methylobacterium symbi oticum did not show significant differences compared to Fig 1 A Nitrate reductase activity µmol NO2g of fresh leaf after 1 h of incubation B SPAD rates and C grains g in maize plants treated and non treated with Methylobacterium symbioticum Met and grown with different doses of nitrogen 0 50 100 and 200 of nitro gen Simple ANOVA analysis Different letters indicate signifi cant differences with p 005 Fisher LSD test 126 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 control plants under optimal nutritional conditions In addi tion plants treated with Methylobacterium symbioticum and receiving 75 nitrogen gave the highest yields and showed the greatest level of nitrogen assimilation of all the plants and treatments of the assay with a 217 higher yield and 11 kgha more assimilated nitrogen than control plants under optimal conditions Surprisingly with a contribution of 100 nitrogen plants inoculated with Methylobacterium symbioti cum the yield and nitrogen uptakeassimilation values fell by 271 and 99 respectively compared to the inoculated plants with a contribution of 75 nitrogen However this result does not present significant differences with respect to the control plants under optimal nutritional conditions Table 3 Discussion The continuous addition of nitrogen fertilisers obtained by chemical synthesis severely affects ecosystems Mahanty et al 2016 making biofertilisers based on beneficial microorganisms an attractive alternative Pascual and co workers demonstrated how the application of the nitrogen fixing bacterium Methylobacterium symbioticum in vari ous crops permitted conventional nitrogen fertilisation to be reduced while providing equal or better yields than those obtained with conventional agricultural treatments Pascual et al 2020 Some authors hypothesise that there is a degree of bac teriumplant specificity in which both groups coevolve Romanovskaya et al 1999 Dourado et al 2012 Due to this possible specificity we studied the interaction of Methylobacterium symbioticum in two very differ ent crops maize and strawberries Parameters related to growth and development and nitrogen metabolism of plants grown under different nitrogen input conditions were analysed After foliar application we observed that in both maize and strawberry plants inoculated with Methylobacterium symbioticum nitrogen supply did not affect the survival of Methylobacterium symbioticum in the phyllosphere Differ ences were detected between the amount of Methylobacte rium symbioticum in maize and strawberry plants but it is known that the population density of endophytic bacteria varies greatly with the type of plant and bacterial strain as well as the environmental growing conditions Pillay and Nowak 1997 In addition a constant population of Methy lobacterium symbioticum was observed in strawberry crops throughout the crop development cycle With this result we observe that the application time of Methylobacterium sym bioticum application can be adapted to the needs of the crop allowing the possible benefits to be prolonged Numerous studies suggest that the success of Methylobacterium strains in the colonisation of the phyllosphere is due to its ability to metabolise methanol emitted through plant stomata and use it as a source of carbon and energy Sy et al 2005 How ever these strains are capable of offering carbon to the plant thanks to their ability to carry out anoxygenic photosynthe sis due to bacteriophytochromes present in their metabolism Giraud and Vermeglio 2008 Specific bacteriochlorophylls chlorophyllide reductases NCBItxid2584084 have been described in Methylobacterium symbioticum that regulates this process mainly using C1 compounds such as metha nol and formaldehydes as carbon source Sy et al 2005 Kutschera 2007 Due to the diazotrophic nature of Methylobacterium sym bioticum we studied whether there was a metabolic relation ship between bacterial inoculation and the plant nitrogen Table 2 Quantification of Methylobacterium symbioticum on leaf CFUg of strawberry plants treated and nontreated with Methylo bacterium symbioticum and grown with different doses of nitrogen 0 25 50 and 100 after 1 30 60 and 90 days post inoculation dpi Three biological replicates were used for each replicates for each treatment and applied nitrogen M symbioticum CFUg Treatment Nitrogen doses 1 dpi 30 dpi 60 dpi 90 dpi Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 M symbioticum 0 933 103 115 103 2 103 866 102 2 103 0 25 103 5 102 25 233 103 153 103 11 103 316 102 8 103 265 103 8 103 265 103 50 2 103 173 103 107 103 115 102 647 103 15 103 5 103 209 103 75 180 104 721 103 3 103 5 102 103 103 577 101 303 103 723 102 100 260 103 115 103 1 103 0 11 103 1 102 103 103 577 101 127 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 requirements Nitrate NO3 is considered as one of the main sources of nitrogen available to plants Schrader and Hageman 1967 In order to assimilate it nitrate must be converted to ammonium NH4 by the plant through the activity of the enzymes nitrate reductase and nitrite reduc tase Kaiser and Huber 1994 Borsani et al 1999 Wang et al 2014 This biochemical process is highly regulated so nitrate reductase activity can be used as an indicator of alterations in the nitrogen metabolism of the plant For all the nitrogen percentages used nitrate reductase activity was lower in plants inoculated with Methylobacterium symbi oticum than in both maize and strawberry control plants It Fig 2 A Nitrate reductase activity µmol NO2g of fresh leaf after 1 h of incubation B SPAD rates and C fruit kg in strawberry plants treated and nontreated with Methylobac terium symbioticum Met and grown with different doses of nitrogen 0 25 50 and 100 of nitrogen Simple ANOVA analysis Different letters indi cate significant differences with p 005 Fishers LSD test 128 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 has previously been described how high concentrations of ammonium in the plant have an inhibitory effect on nitrate reductase activity since its activity is not essential Ohyama 2010 Our results seem to point to high bacterial activity during the fixation of atmospheric nitrogen which is regu lated by a reduction in reductase activity in the plant This coincides with the observations of Pascual and coworkers 2020 in maize plants treated with Methylobacterium sym bioticum in which plant enzymatic activity was seen to decrease Despite the decrease in nitrate reductase activity in treated plants an inversely proportional decrease was not shown for all applied nitrogen doses This may be due to the fact that the nitrate reductase activity is regulated not only by the amount of ammonium in the plant which is partly supplied by Methylobacterium symbioticum but also depends on the CN ratio present in the plant the oxygen con ditions the presence or absence of vanadium and lighting con ditions Giraud and Vermeglio 2008 Sippel and Einsle 2017 Mus et al 2018 The values of SPAD are proportional to the amount of chlorophyll present in the leaves and therefore to their photosynthetic activity Eke et al 2000 Ling et al 2011 The results obtained for both maize and strawberry control plants pointed to an increase in the photosynthetic activity of all treatments compared with the results obtained without additional nitrogen This result confirms that the different nitrogenous treatments are detected by plants which assimi late the nitrogen since its presence is related with greater photosynthetic activity Plants inoculated with Methylobac terium symbioticum had similar or higher values of SPAD in maize than those found in control plants under the same growing conditions while the values were always higher in strawberry confirming the positive effect that Methylobac terium symbioticum have on the photosynthetic capacity of the plant In addition inoculation allowed the amount of nitrogen added to be reduced by 100 in maize and 75 in strawberry with no quantitative loss of SPAD compared with control plants in optimal conditions This shows that in conditions of nitrogen stress the plant can promote its sym biosis with Methylobacterium symbioticum This is consist ent with studies by Cervantes et al 2004 and Madhaiyan et al 2015 who recorded higher photosynthetic activity in plants inoculated with several species of Methylobacterium compared with noninoculated plant In molecular studies multiple strains of Methylobacterium spp were seen to con tain the genes involved in photosynthesis such as those that encode lightharvesting complexes and the biosynthesis of bacteriochlorophylls and carotenoids Marx et al 2012 Our results suggest that treatment with Methylobacte rium symbioticum could supply 50 of the conventional nitrogen supplied to the maize crop accompanied by a 21 increase in yield Strawberry plants inoculated with Methylobacterium symbioticum behaved in the same way the bacteria compensating for a 50 and 75 nitrogen deficiency and even improving yield by 21 when the deficiency was 25 of the conventional nitrogen supply Improved performance in plants treated with Methylobac terium symbioticum may result from ammonium uptake provided by the microorganism through nitrogen fixation which would result in a saving of energy for the plant These results in strawberry are in agreement with the values of photosynthetic activity detected for the plants treated in the 3 doses of nitrogen mentioned since they were similar to the values of the control plants under optimal conditions However only the plants treated and grown with a 25 nitrogen deficiency showed a signifi cant increase in yield and in the amount of nitrogen in the leaf compared to control plants This result may be related to a high leaching of nitrogen in the soil caused by the continuous irrigation applied to the strawberry crop since a higher yield would be expected for the treated plants grown with a deficiency of 50 compared to those grown with deficiency of 75 The biofertilising effect of Methylobacterium symbioticum has also been described in other species of the genus such as Methylobacterium radiotolerans in peanuts Arachis hypogaea and Meth ylobacterium extorquens in strawberry crops amongst others AbandaNkpwatt et al 2006 Priya et al 2019 Some studies have shown that nitrogen supplementation caused by the application of the species Methylobacterium suomiense and Methylobacterium oryzae has a biofertilis ing effect on red pepper crops Capsicum annuum This effect may be derived from increased activity of the bacte rial enzyme nitrogenase through a Fe3Mo2dependent Table 3 Dose of nitrogen provided NFUha assimilated nitrogen kgha and yield kg per plant of strawberry plants treated and non treated with Methylobacterium symbioticum and grown with different doses of nitrogen 0 25 50 and 100 of nitrogen Simple ANOVA analysis Different letters indicate significant differences with p 005 Fishers LSD test One hundred biological replicates were used for each treatment and applied nitrogen Nitrogen doses Assimilated nitrogen Yield Treatment NFUha kgha kg per plant Control 0 13 14 024 a 25 180 104 08 b 50 348 295 107 c 75 515 312 105 c 100 683 313 115 c M symbioticum 0 13 14 017 a 25 180 115 104 c 50 348 292 112 c 75 515 324 14 d 100 683 292 102 c 129 Folia Microbiologica 2024 69121131 1 3 nitrogenase system Shah et al 1984 Madhaiyan and co workers 2015 observed an increase in this activity in jatropha Jatropha curcas plants inoculated with Methy lobacterium radiotolerans and which had high yields and improved plant growth and development In contrast in strawberry there was no greater assimilation of nitrogen or increase in yield in plants inoculated at the 100 nitrogen dose Similarly the yield of maize plants inoculated with Methylobacterium symbioticum was unaltered under opti mal conditions which shows that the biofertilising effect may depend on the existence of abiotic stress in the plant In addition to providing ammonium to the plant it has been described how Methylobacterium spp can regulate plant growth by producing hormones such as auxins or cytokinins These hormones are key in vegetative growth Seok et al 2006 Yim et al 2010 and the induction of its synthesis demonstrates the biostimulant effect of Methy lobacterium spp when interacting with the plant Also it has been suggested that some strains of Methylobacterium synthesise vitamin B12 inducing the plant development Seok et al 2006 Conclusion To summarise the data shows the ability of Methylobacte rium symbioticum to fix atmospheric nitrogen and support the hypothesis that for a Methylobacteriumplant asso ciation nitrogen is transferred from the bacteria to the plant which thus receives the nitrogenous input it needs However the results also point to the need for specific studies to be conducted for each crop in order to ascer tain the nutritional conditions in which Methylobacterium symbioticum fulfils its maximum potential as a biofer tiliser just as we have done in this work for maize and strawberry crops Supplementary Information The online version contains supplemen tary material available at https doi org 10 1007 s12223 023 010784 Acknowledgements The authors would like to thank Celia Parejo Aranda for her contribution to this work with her Thesis carried out at Symborg SL to obtain a masters degree in Plant and Applied Biology from the Universidad Complutense de Madrid Author contribution Conceived and designed the experiments RTV AJBG FJCA and FFM In vitro and field trials RTV AJBG and FJCA RTV wrote the draft of the manuscript and FFM revised and implemented the manuscript All authors read and approved the final manuscript Declarations Conflict of interest The authors declare no competing interests Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attri bution 40 International License which permits use sharing adapta tion distribution and reproduction in any medium or format as long as you give appropriate credit to the original authors and the source provide a link to the Creative Commons licence and indicate if changes were made The images or other third party material in this article are included in the articles Creative Commons licence unless indicated otherwise in a credit line to the material If material is not included in the articles Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use you will need to obtain permission directly from the copyright holder To view a copy of this licence visit http creat iveco mmons org licen ses by4 0 References AbandaNkpwatt D Musch M Tschiersch J Boettner M Schwab W 2006 Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings growth promotion methanol con sumption and localization of the methanol emission site J Exp Bot 571540254032 https doi org 10 1093 jxb erl173 Agafonova NV Kaparullina EN Doronina NV Trotsenko YA 2013 Phosphatesolubilizing activity of aerobic Methylo bacteria Microbiology 826864867 https doi org 10 1134 S0026 26171 40100 20 Andreote FD Lacava PT Gai CS Araújo WL Maccheroni W van Overbeek LS van Elsas JD Azevedo JL 2008 Detection of siderophores in endophytic bacteria Methylobacterium Spp associated with Xylella Fastidiosa subsp Pauca Pesq Agropec Bres Brasilia 435521528 https doi 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Ângelo Rosa Rodrigues IPB Coorientação Profª Margarida Maria Pereira Arrobas Rodrigues IPB Prof Luis Cesar Cassol UTFPR Bragança 2022 PREVIEW JULIANA APARECIDA MARCHETTI EFEITO DE MICRORGANISMOS FIXADORES DE NITROGÊNIO QUE HABITAM A FILOSFERA NA NUTRIÇÃO DA ALFACE Dissertação apresentada ao Instituto Politécnico de Bragança para obtenção do Grau de Mestre em Agroecologia no âmbito da dupla diplomação com a Universidade Tecnológica Federal do Paraná Orientador Prof Dr Manuel Ângelo Rosa Rodrigues Coorientadores Profª Dra Margarida Maria Pereira Arrobas Rodrigues Prof Dr Luis Cesar Cassol BRAGANÇA 2022 PREVIEW À minha família em especial Marli e Genésio Marchetti meus pais PREVIEW AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelo dom da vida pela saúde discernimento e força para trilhar meus caminhos Agradeço por guiar minhas escolhas iluminar meus passos e me amparar durante todos os meus dias Aos meus pais Marli e Genésio pelo amor carinho cuidado e atenção ao longo de toda a minha vida pelo esforço e apoio para que eu chegasse até aqui Obrigada por terem me ensinado a sonhar por terem sonhado comigo e por estarem sempre ao meu lado durante a realização de cada sonho A minha irmã Thainá pelo incentivo pela força pelo companheirismo e principalmente por ser minha fonte de inspiração desde à infância Obrigada por serem o alicerce que sustenta meu ser Agradeço ao meu namorado Leonardo que além de acreditar em meus sonhos aceita vivelos junto comigo aventurandose no desconhecido Obrigada pelo companheirismo auxílio e suporte durante este ano e na realização desta dissertação Obrigada pela paciência zelo e todo amor Agradeço aos meus avós maternos Delézia e Natal in memoriam e aos meus avós paternos Rozimbo e Alide por terem me ensinado muito sobre caráter e resiliência e por terem ajudado por diversas vezes durante todos os meus anos como estudante Agradeço aos amigos e familiares brasileiros por cada prece por cada vela por toda intercessão e por cada mensagem de carinho Agradeço aos meus amigos de longa data e aos que conquistei durante este ano em Portugal vocês foram essenciais para o sucesso desta caminhada Eu os levo em meu coração independentemente de onde eu for Ao meu orientador Prof Dr Manuel Ângelo Rodrigues e aos coorientadores Prof Dra Margarida Maria Pereira Arrobas Rodrigues e Prof Dr Luís Cesar Cassol pelos conselhos orientação disponibilidade e conhecimento partilhado durante a realização deste programa e desta dissertação Aos demais professores que fizeram parte da minha trajetória acadêmica por transmitirem conhecimento e atuarem além da formação profissional mas também na PREVIEW manifestação do caráter e responsabilidade interpessoal Por terem disponibilizado o tempo de suas vidas para a realização de cada projeto que conclui até hoje desde o início da graduação Ao Instituto Politécnico de Bragança e a Universidade Tecnológica Federal do Paraná pela oportunidade de realizar o programa de dupla diplomação e poder realizar esta dissertação A técnica do laboratório de solos da Escola Superior Agrária Rita Diz e a engenheira Ana Pinto e David Carvalho por todo apoio auxilio e companheirismo na realização das análises Agradeço também a colega Soraia de Lurdes Raimundo por todos o suporte no decorrer deste trabalho Por fim agradeço a todos que de certa forma contribuíram e continuam a contribuir para minha formação académica e preparação para a vida Muito obrigada PREVIEW RESUMO Na agricultura além da disponibilidade da água a disponibilidade de nitrogênio é geralmente considerada o fator mais limitante para o crescimento de plantas no seu ambiente natural Apesar de sua importância e de ser requerido em quantidades significativas pelos seres vivos este elemento é encontrado na natureza em abundância em uma forma quimicamente muito estável predominantemente na forma de gás nitrogênio N2 fazendose necessária a transformação para uma forma combinada com o hidrogênio H2 que facilite sua assimilação As plantas podem adquirir o nitrogênio combinado a partir de diferentes fontes sintéticas processo Haber Bosch e naturais como os raios e a fixação biológica de nitrogênio FBN A FBN constitui a principal via de incorporação do nitrogênio à biosfera tornandose um processo biológico determinante para a vida na terra de igual importância a fotossíntese e a respiração Com o intuito de reduzir os efeitos adversos dos fertilizantes sintéticos manter e aumentar a fertilidade dos solos contribuir com a nutrição das culturas e melhor aproveitar a FBN têmse avaliado o potencial dos fertilizantes biológicos Neste contexto o potencial de organismos fixadores de nitrogênio que habitam a filosfera de culturas hortícolas é ainda pouco conhecido Neste trabalho testouse a aplicação de um bioestimulante comercial com microrganismos que colonizam a filosfera na cultura da alface Lactuca sativa L e avaliouse a capacidade de fixação de nitrogênio do microrganismo e sua contribuição para a cultura O experimento decorreu no município de Bragança região de TrásosMontes nordeste de Portugal Para a condução do experimento utilizouse um delineamento fatorial com dois fatores fertilização nitrogenada com quatro níveis de fator D1 D2 D3 e D4 a que correspondem 0 033 066 e 132 g N vaso1 e um produto comercial com Methylobacterium symbioticum com dois níveis de fator Com e Sem De cada tratamento foram incluídas quatro repetições Realizaramse dois ciclos de cultivo Ao longo do experimento determinouse a intensidade da cor verde das folhas As plantas foram coletadas e levadas a estufa até atingirem peso constante pesadas moídas e levadas ao laboratório para determinação da biomassa produzida e avaliação da composição elementar dos tecidos De modo geral os resultados permitiram atribuir ao tratamento Com Microrganismo um incremento na produção de matéria seca 114 contra 98 g vaso1 no primeiro ciclo e 146 contra 107 g vaso1 no segundo ciclo área foliar 994 dm² contra 693 dm² no primeiro ciclo e índice de clorofila medido por leituras SPAD nos valores de 278 contra 250 no primeiro ciclo em comparação com as plantas de alface não inoculadas Para os demais parâmetros avaliados teor de nitratos e macro e micronutrientes nos tecidos apesar dos valores não diferirem estatisticamente os resultados obtidos nas plantas com microrganismo mantiveram uma tendência favorável quando comparados ao tratamento sem microrganismo Ainda assim recomendase a realização de novos estudos para avaliar a eficácia do produto comercial à base de Methylobacterium symbioticum para esta e outras culturas Palavraschave Lactuca sativa L Methylobacterium symbioticum agricultura sustentável biofertilizantes bioestimulantes fixação biológica de nitrogênio PREVIEW ABSTRACT In agriculture in addition to water nitrogen availability is generally considered the most limiting factor for plant growth in their natural environment Despite its importance and being required in significant quantities by living beings this element is found in nature in abundance in a chemically very stable form predominantly in the form of nitrogen gas N2 making it necessary to transform into a form combined with hydrogen H2 that facilitates its assimilation Plants can acquire combined nitrogen from different synthetic Haber Bosch process and natural sources such as lightning and biological nitrogen fixation BNF The BNF constitutes the main way of incorporation of nitrogen into the biosphere becoming a biological process determinant for life on earth of equal importance to photosynthesis and respiration To reduce the adverse effects of synthetic fertilizers maintain and increase soil fertility contribute to crop nutrition and make better use of BNF the potential of biological fertilizers has been evaluated In this context the potential of nitrogenfixing organisms that inhabit the phyllosphere of horticultural crops is still poorly understood In this work the application of a commercial biofertilizer with microorganisms that colonize the phyllosphere in the lettuce crop Lactuca sativa L was tested and the nitrogen fixation capacity of the microorganism and the increase in production of this crop evaluated The experiment took place in the municipality of Bragança region of TrásosMontes northeast of Portugal In the experiment a factorial design with twofactors was used nitrogen fertilization with fourfactor levels D1 D2 D3 and D4 corresponding to 0 033 066 and 132 g N pot1 and commercial product with Methylobacterium symbioticum with twofactor levels With and Without From each treatment four replicates were included Two cultivation cycles were carried out Throughout the experiment the intensity of the green color of the leaves was determined The plants were collected and taken to the greenhouse until they reached constant weight weighed ground and taken to the laboratory to determine the biomass produced and evaluate the elemental composition of the tissues In general the results allowed to attribute to the treatment with microorganism an increase in the production of dry matter 114 against 98 g vase1 in the first cycle and 146 against 107 g vase1 in the second cycle leaf area 994 dm² versus 693 dm² in the first cycle and chlorophyll index measured by SPAD readings in the values of 278 versus 250 in the first cycle compared to uninoculated lettuce plants For the other parameters evaluated nitrate content and macro and micronutrients in the tissues although the values did not differ statistically the results obtained in plants with microorganism maintained a favorable trend when compared to the treatment without microorganism Even so further studies are recommended to evaluate the effectiveness of the commercial product based on Methylobacterium symbioticum for this and other cultures Key words Lactuca sativa L Methylobacterium symbioticum sustainable agriculture biofertilizers plant biostimulants biological nitrogen fixation PREVIEW LISTA DE FIGURAS Figura 1 Imagem do local de implantação do experimento Google Earth 2022 29 Figura 2 Matéria seca produzida no primeiro ciclo da alface nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 36 Figura 3 Matéria seca produzida no segundo ciclo da alface nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 36 Figura 4 Área foliar por planta no primeiro ciclo da alface nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 37 Figura 5 Área foliar por planta no segundo ciclo da alface nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 37 Figura 6 Concentração de nitrogênio N nos tecidos da alface produzida no primeiro ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 submetidas Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 39 Figura 7 Concentração de nitrogênio N nos tecidos da alface produzida no segundo ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 39 Figura 8 Concentração de NO3 nos tecidos da alface produzida no primeiro ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 40 PREVIEW Figura 9 Concentração de NO3 nos tecidos da alface produzida no segundo ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 41 Figura 10 Leituras SPAD realizadas na alface produzida no primeiro ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 42 Figura 11 Leituras SPAD realizadas na alface produzida no segundo ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 42 PREVIEW LISTA DE TABELAS Tabela 1 Concentração média de fósforo potássio cálcio e magnésio na matéria seca da alface do primeiro ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 43 Tabela 2 Concentração média de fósforo potássio cálcio e magnésio na matéria seca da alface do segundo ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Para cada fator letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 44 Tabela 3 Concentração média de boro ferro manganês zinco e cobre nos tecidos da cultura de alface do primeiro ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Na coluna e para cada ciclo letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 45 Tabela 4 Concentração média de boro ferro manganês zinco e cobre nos tecidos da cultura de alface do segundo ciclo nos fatores Microrganismo Micro e Dose de N D1 D2 D3 e D4 respetivamente 0 033 066 e 132 g N vaso1 Na coluna e para cada ciclo letras iguais indicam a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey HSD α 005 46 PREVIEW ÍNDICE 1 INTRODUÇÃO 12 2 OBJETIVOS 13 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14 31 AGRICULTURA ORGÂNICA 14 32 FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 16 321 Sistemas fixadores 18 322 Bioquímica da fixação 22 33 Methylobacterium symbioticum 23 34 A CULTURA DA ALFACE 25 341 Descrição da cultura 25 342 O cultivo da alface no Brasil e em Portugal 26 343 Características culturais 27 4 MATERIAIS E MÉTODOS 29 41 LOCAL DO EXPERIMENTO 29 42 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 30 43 INSTALAÇÃO E MANUTENÇÃO DO EXPERIMENTO 30 431 Instalação do experimento 30 432 Manutenção do ensaio 31 44 DETERMINAÇÕES EM CAMPO 31 441 Determinação da intensidade da cor verde das folhas 31 442 Estimativa da área foliar 32 45 COLHEITA E PREPARO DAS AMOSTRAS 32 46 ANÁLISES LABORATORIAIS 32 461 Determinação do nitrogênio 33 462 Determinação de fósforo potássio cálcio magnésio cobre ferro zinco e manganês33 463 Determinação de boro 34 464 Determinação de nitratos 34 47 ANÁLISE DE DADOS 34 5 RESULTADOS 35 51 MATÉRIA SECA E ÁREA FOLIAR DAS PLANTAS 35 52 CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO NOS TECIDOS E INDICADORES DE ESTADO NUTRITIVO NITROGENADO 38 53 CONCENTRAÇÃO DOS MACRONUTRIENTES FÓSFORO POTÁSSIO CÁLCIO E MAGNÉSIO NAS FOLHAS 43 PREVIEW 54 CONCENTRAÇÃO DE MICRONUTRIENTES NOS TECIDOS VEGETAIS 45 6 DISCUSSÃO 47 61 FATOR MICRORGANISMO 47 62 FATOR DOSE DE NITROGÊNIO 49 7 CONCLUSÕES 53 PREVIEW 12 1 INTRODUÇÃO Na agricultura além da disponibilidade da água a disponibilidade de nitrogênio é geralmente considerada o fator mais limitante para o crescimento de plantas no seu ambiente natural Esta importância é decorrente ao fato de o nitrogênio ser um importante componente das clorofilas pigmentos indispensáveis à fotossíntese assim como dos aminoácidos os principais constituintes das proteínas incluindo enzimas e muitos outros componentes essenciais ao crescimento de plantas Barros 2020 Desta forma as plantas respondem rapidamente ao nitrogênio aplicado como fertilizante o que o torna cada vez mais importante para a agricultura Por este motivo a utilização da adubação nitrogenada mineral na agricultura é cada vez mais comum e muitas vezes inevitável entretanto representa um custo significativo na produção e quando em excesso este pode tornarse um fator poluente alterando o equilíbrio ecológico causando impactos negativos no ambiente e na sociedade Cui et al 2014 Com o intuito de reduzir os efeitos adversos dos fertilizantes sintéticos manter e aumentar a fertilidade dos solos e contribuir com a nutrição das culturas têmse avaliado o potencial dos fertilizantes biológicos Além disso a procura por alimentos mais saudáveis livres de possíveis contaminantes químicos que venham da utilização excessiva de agroquímicos tem se elevado Paralelamente também se tem voltado a uma produção menos dependente dos recursos não renováveis e menos poluentes Neste contexto os questionamentos referentes às formas de fertilização das culturas especialmente das hortícolas revestemse de elevada importância para fazer frente à crescente demanda de alimentos por parte da população que vem crescendo de forma exponencial Incrementase na agricultura o uso de práticas agrícolas que visam o fomento da fixação biológica do nitrogênio elemento essencial para o desenvolvimento de uma agricultura sustentável A fixação biológica contribui para sustentabilidade da produção de alimentos de forma direta onde o nitrogênio fixado é consumido através do produto cultivado ou indiretamente fornecendo nitrogênio ao solo e ao ecossistema agrícola não dependendo de recursos exógenos nomeadamente fertilizantes nitrogenados sintéticos No que diz respeito à produção de hortícolas a fixação biológica de nitrogênio demonstra ainda mais potencial Estes produtos apresentam grande resposta à adubação nitrogenada entretanto em condições de elevada Reproduced with permission of copyright owner Further reproduction prohibited without permission PREVIEW MEIO DE CULTURA ALTERNATIVO PARA METHYLOBACTERIUM SYMBIOTICUM Andriele Pavani Ribeiro1 Emanuelle Barbosa de Quadros2 Terimar Facin Ruoso3 Resumo As Unidades de Produção Própria UPP têm se destacado no agronegócio pela multiplicação de microrganismos de interesse para produção agricola On Farm oferecendo vantagens econômicas ao produtor Este estudo experimental e qualitativo objetivou analisar o crescimento da bactéria Methylobacterium symbioticum em meio mínimo suplementado com glicose e caseína Utilizaramse reagentes estéreis e inoculados com contagem de UFCml realizada a cada 12 horas Ambos os meios atingiram a concentração ideal de 1x108 UFCml em 36 horas mas a glicose mostrouse mais viável economicamente devido ao seu custo significativamente menor em comparação à caseína Concluiuse que a glicose é uma alternativa eficaz e econômica para a produção On Farm de M symbioticum Palavraschave On Farm Fixação Biológica de Nitrogênio Inóculo Bioinsumos Metanol 1 INTRODUÇÃO As Unidades de Produção Própria UPP estão em alta no agronegócio para multiplicação de microrganismos On Farm com supervisão técnica ou não dentro da propriedade rurais SANTOS DINNAS FEITOZA 2020 O On Farm traz consigo ótimas vantagens de baixo custo ao produtor porém quando não supervisionada por profissionais ou sem a orientação correta podem não obter o resultado desejado da multiplicação do microrganismo de interesse Isto se dá por dois motivos i contaminação por outros microrganismos e ii especificidades de cultivo de cada microrganismo não seguidas como protocolo BOCATII et al 2022 A Methylobacterium symbioticum é uma bactéria inoculante recentemente comercializada ainda sem protocolos de cultivo em UPP e com especificidades de cultivo muito singulares Descrita em 2020 na Espanha a espécie tem características morfotintoriais 1 Andriele Pavani Ribeiro Graduanda em Ciências Biológicas UFSM andrielepavaniacadufsmbr 2 Emanuelle Barbosa de Quadros Mestranda no PPG de Agronegócio emanubqgmailcom 3 Terimar Facin Ruoso Professora do Departamento de Ciências da Saúde UFSM terminarmhotmailcom de bacilo Gram negativo e apresenta complexo enzimático nitrogenase que por sua vez funciona como catalisador de fixação biológica de nitrogênio no solo Além disso é uma bactéria metilotrófica ou seja usa metano ou metanol como única fonte de carbono na natureza PASCUAL et al 2020 O ágar de cultivo para essa bactéria é o meio mínimo metanol que por sua vez é conveniente para análises laboratoriais porém pela volatilidade do metanol não é viável para cultivo em meios de cultura líquidos em curta ou larga escala Por isso o objetivo deste trabalho é analisar o comportamento de crescimento da cepa bactéria metilotrófica em meio mínimo suplementado com glicose e meio mínimo suplementado com caseína 2 MATERIAL E MÉTODOS Estudo de caráter experimental e qualitativo a cepa da bactéria utilizada provém do acervo próprio do Laboratório de Microbiologia da UFSMPM o qual também foi o local para o decorrer do experimento A Glicose Anidra Pa Dextrose e Peptona de Caseína foram os reagentes escolhidos por serem fontes de açúcar e proteína respectivamente Foram autoclavados à 121ºC por 15 minutos um Erlenmeyer contendo meio mínimo com 2 glicose e outro com 2 caseína Foram adicionados 1ml de inóculo bacteriano contendo aproximadamente 1x108 UFCml em cada um dos meios e colocados por 36 horas no agitador orbital A contagem de unidades formadoras de colônias UFCml foi realizada a cada 12 horas por meio de diluição seriada e cultivo spread plate de 01 ml das amostras em meio mínimo metanol sólido 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos indicam que Methylobacterium symbioticum tem a capacidade de utilizar tanto glicose quanto caseína como fonte de carbono para seu crescimento sendo que ambos mostram resultados positivos levando em consideração que um inóculo para ser efetivo na lavoura precisa ter a concentração de 1x108 UFCml GARCÍA DE SALAMONE 2019 Ambos atingiram a concentração ideal em 36h de multiplicação mostrando eficiência já que a bactéria tem crescimento lento em ágar 57 dias Tabela 1 Resultados de crescimento UFCml em 36 horas de experimento Hora Meio Mínimo Glicose Meio Mínimo Caseína 12 430E06 331E07 24 980E07 750E07 36 133E08 174E08 Fonte Elaboração própria Em referência ao custo de produção para uma multiplicação de 500 litros seria necessário 10 Kg de glicose ou caseína sendo que a glicose se destaca pela sua precificação baixa entre 20 e 40 reais por kilo sem considerável elevação aos custos em relação às caldas de cultivo utilizadas On Farm que por sua vez são compostos por água sem cloro e açúcar cristal ou mascavo entre outros ingredientes alimentícios UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA 2022 Já a caseína possui um valor muito elevado sendo vendido normalmente apenas como reagente para laboratórios está na faixa de 300400 reais o kilo se tornando inviável para a produção On Farm pois eleva os custos e têm resultados muito similares à glicose 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS A utilização de glicose como fonte de carbono para o cultivo de Methylobacterium symbioticum oferece uma alternativa viável para a produção On Farm dada a eficiência da glicose em atingir a concentração ideal de células e seu custo substancialmente menor em comparação com a caseína é recomendável adotar a glicose juntamente com o meio mínimo para cultivo desta bactéria em UPP REFERÊNCIAS BOCATTI C R et al Microbiological quality analysis of inoculants based on Bradyrhizobium spp and Azospirillum brasilense produced on farm reveals high contamination with nontarget microorganisms Brazilian Journal of Microbiology v 53 p 267280 2022 Disponível em httpslinkspringercomarticle101007s42770021 006492 GARCÍA DE SALAMONE IE et al Manufacturing and Quality Control of Inoculants from the Paradigm of Circular Agriculture 2019 In Singh D Gupta V Prabha R eds Microbial Interventions in Agriculture and Environment Springer Singapore Disponível em httpsdoiorg10100797898113838302 PASCUAL JA et al Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum var tenuihypharum Curr Microbiol 77 20312041 2020 Disponível em httpsdoiorg101007s00284020021014 SANTOS A DINNAS S FEITOZA A QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE BIOPRODUTOS COMERCIAIS MULTIPLICADOS ON FARM NO VALE DO SÃO FRANCISCO DADOS PRELIMINARES Enciclopédia Biosfera v 17 n 34 2020 Disponível em httpswwwconhecerorgbrenciclop2020Dqualidadepdf UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA Multiplicação de microrganismos on farm regulamentação potenciais e riscos Disponível em httpswwwufsmbrpetagronomia20220510multiplicacaodemicrorganismosonfarm regulamentacaopotenciaiseriscos Vol0123456789 1 3 Current Microbiology 2020 7720312041 httpsdoiorg101007s00284020021014 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum var tenuihypharum Jose Antonio Pascual1 Margarita Ros1 Jesus Martínez2 Francisco Carmona2 Antonio Bernabé2 Rocío Torres2 Teresa Lucena3 Rosa Aznar3 David R Arahal3 Felix Fernández2 Received 12 March 2020 Accepted 18 June 2020 Published online 27 June 2020 Springer ScienceBusiness Media LLC part of Springer Nature 2020 Abstract Strain SB00233 T isolated from spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus iranicum var tenuihypharum was analysed to determine whether it represents a new species It was studied for its applicability in the field of agriculture to reduce the input of nitrogen fertilizers Comparative analysis of the 16S rRNA gene sequence shows the strain to be affiliated to the genus Methylobacterium the closest similarities 987 being shared with Methylobacterium dankookense Further phylogenomic analysis through Uptodate Bacterial Core Gene UBCG confirmed Methylobacterium dankookense as its closest relative Average Nucleotide Identity ANI and in silico DNADNA hybridization DDH were lower than 92 and 44 respectively of the values shown by its phylogenetic relatives Its genome had an approximate length of 605 Mb and the G C content of the genome was 701 mol The main cellular fatty acid was Summed Feature 8 C181 ω7c andor C181 ω6c It is a Gramstainingnegative pinkpigmented strictly aerobic and facultative methylotroph it grows at 28 ºC and can grow at up to 3 salinity in the presence of sodium chloride All the data collected support the naming of a novel species to accommodate the strain SB00233 T for which the name Methylobacterium symbioticum sp nov is proposed The type strain is SB00233 T CECT 9862 T PYCC 8351 T Abbreviations AMF Arbuscular mycorrhizal fungi ANI Average Nucleotide Identity BLAST Basic Local Alignment Search Tool UBCG Uptodate Bacterial Core Gene CECT Colección Española de Cultivos Tipo DDH DNADNA hybridization SCSIE Servicio Central de Soporte a la Investigación Experimental GGDC GenometoGenome Distance Calculator GSI Gene Support Index NCBI National Center for Biotechnology Information PYCC Portuguese Yeast Culture Collection RAST Rapid Annotation using Subsystem Technology SPAD SoilPlant Analyses Development Introduction Arbuscular mycorrhizal fungi AMF are obligate plant symbionts that are able to colonize the roots of approxi mately twothirds of all terrestrial plant species 1 Glomus iranicum var tenuihypharum is an AMF isolated from alka line soil with high concentrations of Ca2 Na and Mg2 a low CN ratio and low organic matter level 2 This isolate induces a high plant biomass leading to higher yields not only in leafy crops but also in fruit crops 1 This benefi cial effect be attributed to its ability to permit higher plant nutrient and water uptake probably through the increase in hydraulic conductivity 3 However although an extensive literature exists on rhizosphere colonization little is known regarding the bacterial colonization of AMF hyphae the hyphosphere Bacteria and AMF have different interac tion ways 4 It has also reported interactive effects between pathogens rhizobia and AMF 5 6 Moreover bacteria The GenBankEMBLDDBJ accession numbers for the 16S rRNA gene and whole genome sequences of the type strain of Methylobacterium symbioticum are MN154398 and GCA902141845 respectively Jose Antonio Pascual jpascualcebascsices 1 Departamento de Conservación de Suelos Agua y Manejo de Residuos Orgánicos CEBASCSIC Murcia Spain 2 Symborg SL Murcia Spain 3 Departamento de Microbiología y Ecología y Colección Española de Cultivos Tipo CECT Universitat de València València Spain 2032 J A Pascual et al 1 3 isolated from AMF spores and mycorrhizal have showed positive or also negative effect affecting AMF spore germi nation mycorrhization and plant growth 7 Such data sug gest that this bacteria plays an important role in successful AMF plant colonization and symbiosis 8 further insights into bacteriaAMF interactions are highly relevant Methylobacterium strains have been studied for their various plant growth promoting activities and has been reported to positively influence the growth of several plant species 9 Microscopic observations showed this bacterium attached to AMF spores in a way that would probably benefit both partners through the facilitation of certain metabolic interactions such as nutrient and carbon exchange which relies on close cell contact between the bacterial and fungal components It belongs to a heterogeneous group of faculta tive methylotrophs 10 forming two major clades represent ing the genera Methylobacterium and Methylorubrum and two minor classes 11 it is classified within the Alphapro teobacteria as a Gramnegative bacterium with a generally pink pigmentation due to carotenoid synthesis 12 It is rodshaped strictly aerobic and able to grow using com pounds containing only one carbon C1 such as methanol or methylamine 13 The above species occupy different habitats including soil water leaf surfaces nodules grains and air 14 and they have been reported in more than 70 plant species 15 where they actively colonize the root as putative endophytes 9 Methylobacterium spp are well documented for coloniz ing different environments including plants 16 Some spe cies of this genus can fix atmospheric nitrogen or mobilize other nutrient such as phosphorus that there are important nutrients involved in both microorganism and plant metabo lism 17 There are other species that produce antimicrobial molecules 18 protecting host plants by competition with pathogens for nutrients 19 or by inducing systemic resist ance ISR In agriculture Methylobacterium spp play a part in sev eral biotechnological applications It has been reported that treated plants show significant improvements in yield 9 possibly due to multiple mechanisms including atmospheric nitrogen fixation through a Fe3Mo2dependent nitroge nase system the modulation of photosynthesis prolonga tion of leaf senescence and precocity in flower sex differen tiation 20 In this paper a new bacterium SB00233 T isolated from Glomus iranicum var tenuihypharum spores was assayed in vitro and field trials to demonstrate the effect on plant growth and yield increasing It also was phenotypically and genotypically characterised For the first task its substrate and enzyme activity were determined using API 20NE and API ID 32GN respectively while for the latter the 16S rRNA gene sequence was analysed for phylogenetic clas sification Once it was established that it belonged to the genus Methylobacterium the closest species were compared by sequencing the whole DNA of the isolated strain using ANI and in silico DDH calculations Materials and Methods The Isolated Strain its Morphological Characteristics and Biochemical Activity Origin and Isolation of the New Isolated Strain Strain SB00233 T was isolated from the inner part of spores of Glomus iranicum var tenuihypharum BCCM 54871 T through a process involving disinfection of the external spore walls by washing with 05 sodium hypochlorite plus Tween 80 for 5 min in a total of five disinfection cycles Glomus iranicum var tenuihypharum was isolated from nonagricul tural soil characterized as Solonetz Gley saline sodic pH 85 CaCO3 12 g kg1 and a CN ratio of 65 in Fortuna Murcia Spain Then sterile Petri dishes containing non nitrogen source Minimum Salt Methanol Medium MMM nN Methanol 200 ml NaNO3 05 g MgSO47H2O 05 g K2HPO4 10 g FeSO47H2O 001 g CaCl22H2O 001 g KCl 05 g vitamins solution 10 ml micronutrients solu tion 20 ml Agar 12 g in 1000 ml of distilled water pH 720 were sowed with different dilutions of the spore solu tions and incubated at 28 ºC for 5 days Five different colo nies with a pink colour were selected and reisolated at least three times to ensure that they represented axenic cultures These strains were assayed to test if they were identified as the same specie Morphological Characteristics and Biochemical Activity of the New Isolated Strain The five colony isolates were assayed to their colony mor phology motility pH and temperature range of growth in the MMMnN Petri showing no difference between them deciding to maintain only one of the 5 initial isolate colonies data not shown Salt tolerance of the selected colony was assayed using MMMnN with different NaCl concentrations 0 05 10 15 20 25 and 30 wv and diazotrophic capacity was assayed using NitrogenFree Medium supplemented with methanol NFM Malic acid 50 g methanol 200 ml MgSO4 7H2O 02 g K2HPO4 01 g KH2PO4 04 g FeCl3 001 g NaCl 01 g KOH 48 g micronutrient solution 20 mL vitamin solution 10 ml bromothymol blue solution of 05 on KOH 2 N 20 ml in 1000 ml of distilled water pH 69 Both were incubated at 28 ºC under aerobic conditions for 5 and 7 days respectively 2033 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum 1 3 Substrate and enzyme activity was determined using API 20NE and API ID32GN BioMérieux France Fatty acid methyl esters were extracted from biomass grown for 48 h on tryptic soy agar TSA at 25 C and prepared according to standard protocols as described for the Sherlock Microbial Identification System MIDI Microbial identification Sys tem Cell fatty acid content was analysed by gas chromatog raphy with an Agilent 6850 chromatographic unit using the MIDI Microbial Identification System Phylogenomics Assay of the Isolated Strain DNA Preparation for Sequencing DNA from one bacterial colony grown on MMMnM Petri dishes was extracted by suspending the colony content in a nucleic lysis solution and protein lysis solution Promega and 10 Polyvinylpyrrolidone PVP The microbial DNA was isolated by centrifuging the suspension at 10000 g and the wizard genomic DNA was purified following the manufacturers recommendations Promega 16S rRNA amplification from a pure colony was managed by PCR Genius thermocycler Techne Burlington NJ USA using the primer pairs 616 V 5AGA GTT TGATYMTGG CTC AGP699R 5GGGTYKCGC TCG TTR and 609D 5GGMTTA GAT ACCCBDGTAP1492R 5TAC CTT GTT ACG ACTT For amplification a mixture of 50 μl was made containing 05 μl 50 pmolμl of each universal primer 025 μl 5Uμl of Taq polymerase Takara Clon tech Laboratories Inc 5 μl 10 reaction buffer 4 μl dNTP 10 mM mixture 3475 μl filtered distilled water MilliQ purification system Millipore Billerica MA USA and 5 μl colonial suspension Amplification was performed with ini tial denaturation SET at 94 C for 5 min followed by 35 denaturation cycles at 94 C for 30 s annealing at 56 C for 30 s and extension at 72 C for 45 s followed by a final extension at 72 C for 10 min Sequencing and Sequence Analysis Genome sequencing was carried out at the Central Experi mental Research Support Service SCSIE of the University of Valencia Valencia Spain using Illumina Miseq technol ogy with 2 250 pairedend reads The primers used were the same as those used in the amplification reaction but diluted fivefold 10 pmolμl The Illumina reads were ana lysed by FASTQC a common quality control tool developed by Babraham Bioinformatics to check raw sequencing data The bioinformatics tool SPAdes 300 software was used for DNA read assembling 21 and CheckM for assessing the genome quality 22 prior to annotation using Prokka v140 23 and RAST v20 Rapid Annotation using Subsystem Technology 24 Genomic Comparisons Sequence analysis was performed using EzBioCloud 25 and BLAST 26 Phylogenetic trees of 16S rRNA gene sequences were constructed by distance and clustering with the maximum likelihood and evolutionary distances using the JukesCantor method 27 all performed using Mega package software Molecular Evolutionary Genetic Analy sis version 1005 28 Following this the phylogenetic relationships of the genomes were explored with UBCG 29 using default settings This software tool which is available for downloading at EzBioCloud 25 uses a set of 92 single copy core genes commonly present in all bacterial genomes The robustness of the nodes was estimated from the gene support index GSI defined as the number of individual gene trees out of the total genes used that present the same node 30 Available genomes from Methylobacterium spp retrieved from NCBI were included in the analysis The final assembly was evaluated by comparing a reference genome using QUAST v43 software 31 Similarity between whole genome pairs was assessed using the following indices for species delineation 32 DNADNA hybridization DDH estimated in silico with the GenometoGenome Distance Calculator GGDC 20 using the BLAST method 33 Average Nucleotide Identities according to MUMmer ANIm BLAST ANIb and OrthoANI were determined in JSpeciesWS 34 35 Plant Growth and Yield Assays In vitro Assays Commercial maize seeds Zea mays var SY Kairo Syn genta were washed and disinfected with distilled water and then immersed in a 06 active chlorine bleach solution with Tween 80 surfactant for 20 min The seeds were then soaked in 70 ethanol for 30 s before planting under sterile condi tions Four different amounts of nitrogen were applied by irrigation 0 50 100 and 200 of the usual amount of nitrogen applied corresponding to 0 206 412 and 825 units of nitrogen After 10 days once the plants showed two or three true leaves the bacterial inoculum was sprayed on leaves at 1 106 CFU per plant To prevent the inoculum from contaminating the substrate it was covered with plastic before spraying the inoculum Several measurements directly related with crop qual ity and yield were made including the fresh and dry aerial weight Nitrate reductase NR activity in leaves was also measured 36 The SPAD SoilPlant Analyses Develop ment value is considered a plant fitness parameter because it is proportional to the plants photosynthetic capacity and an indirect measurement of the chlorophyll content 37 with the advantage of being a nondestructive method 2034 J A Pascual et al 1 3 Field Assays Ten sites dedicated to the commercial production of rice maize and wine grapes were studied by the bacterial inocu lum In seven locations the production of rice Rice 12 and maize and maize Maize 15 was assayed comparing the bacterial inoculum by reducing the nitrogen fertilizer at different percentage to the usual nitrogen fertilization Table 5 In the other three locations the production of organic maize Maize 6 and wine grape Wine grape 12 with low nitrogen inputs was assayed the treatments consist ing of applying or not the bacterial inoculation In all cases the bacterium inoculum was sprayed on leaves to reach the desired concentration of 1 1010 CFU per hectare The aver age yield was determined by selecting six representative plots of 50 50 m from each location three applying the inoculum and the other three applying the usual nitrogen as it is described in the Table 5 annotating the collected kilo grams and afterwards calculating the production per hectare Results Morphological Characteristics and Biochemical Activity of the New Isolated Strain Strain SB00233T CECT 9862T was Gramnega tive strictly aerobic rodshaped 081 µm in width and 1216 µm in length with a lateral flagellum and in sus pension appeared individually or in pairs with no spore formation Table 1 Colonies of strain SB00233T grown on MMM Agar or NFbM Agar for 5 to 7 days were circular pink coloured with a clearly defined border The optimal temperature for growth was 28 ºC Within an NaCl range of 015 growth was reduced at 2025 and it failed to grow at 30 In general no significant differences were found compared with the other studied strains Table 1 The fatty acid composition of strain SB00233 T CECT 9862 T grown in TSA is shown in Table 1 As can be seen C181 ω7c accounted for more than 80 of the total followed by a few minor components C180 C160 C180 3OH C140 3OH and C16 ω7cω6c Table 1 The phenotypic characteristics of the isolated strain and that most similar to it M dankookense SW087 T DSM 22415 T as observed in the phylogenetic cluster Fig 1 pointed to differences in the use of some substrates Table 2 Table 1 Comparison of the growth characteristics and fatty acid composition of strain SB00233T CECT 9862T and some other Methylobac terium species The growth characteristics of strain SB00233 T and M dankookense were obtained in the laboratory and those for M hispanicum and M phyl losphaerae were obtained from Lee et al 38 Only the fatty acid composition of strain SB00233 T was obtained in the laboratory while the composition of the other three strains were obtained from Lee et al 38 Not analysed in the reference Lee et al 38 Summed features represent groups two or three fatty acids that could not be separated by GLC with the MIDI system Summed feature 2 con tains isoC161 I andor C140 3OH Summed feature 3 contains isoC161 ω7c andor C150 2OH Strain SB00233T M dankookense SW0807T M hispanicum GP34T M phyl losphaerae CBMB27T Growth characteristics Colony pigmentation Pink defined clear border Pink to red Pink Pink to red Colony diameter TSA 7 days mm 1520 0420 1020 0208 Temperature range ºC optimum 1030 28 1030 25 1530 28 2030 28 NaCl range 0030 0030 0020 pH range 5580 5080 5090 Fatty acid composition C160 22 02 31 05 17 01 30 02 C180 34 01 58 17 29 01 34 01 C180 3OH 19 02 34 10 C181 ω7c 894 05 798 21 829 07 874 02 Sum feature 2 18 01 33 16 23 02 13 04 Sum feature 3 13 02 30 05 85 04 39 02 2035 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum 1 3 For example SB00233 T CECT 9862 T could use and assimilate capric acid inositol ribose tri sodium citrate while M dankookense SW087 T DSM 22415 T did not By contrast Lalanine Larabinose glycogen 4hydroxy benzoic acid Lhistidine Dmelibiose 2 and 5 potas sium ketogluconate and sodium acetate could not be used by strain SB00233 T CECT 9862 T but could be used by M dankookense SW087 T As regards the biochemical analysis strain SB00233 T CECT 9862 T was positive for capric assimilation βgalactosidase phenylacetic acid and trisodium citrate while M dankookense SW087 T was not Table 2 Strain SB00233 T CECT 9862 T was oxidase negative while M dankookense SW087 T was positive Phylogenomic Analysis of the Isolated Strain The similarity analysis BLAST of the 16S rRNA sequence 1325 nt of strain SB00233 T with the annotated 16S Fig 1 Phylogenetic position of the strain SB00233 T CECT 9862 T within the relevant genus Methylobacterium strains based on 16S rRNA gene sequences Distance and clustering with the Maximum likelihood and the evolutionary distances using the JukesCan tor method were obtained using Mega package software Molec ular Evolutionary Genetic Analysis version 1005 28 Genome accession numbers are indicated in parentheses Bar 005 substitutions per position 2036 J A Pascual et al 1 3 rRNA sequence in NCBI showed that the highest similar ity was found with the types of M dankookense 987 M trifolii 968 M radiotolerans 968 M hispani cum 977 M cerastii 955 and M jeotgali 965 Phylogenetic analysis showed that strain SB00233 T was very closely related with M dankookense SW087 T DSM 22415 T Fig 1 The draft genome of strain SB00233 T CECT 9862 T accession number GCF9021418451 had an estimated size of 609 Mb and a 701 mol G C content Table 3 It is composed of 247 contigs with a N50 value of 51249 nucleo tides and a final assembly coverage of 57 The CheckM results of contamination and completeness were 016 and 9983 respectively Fig 2 The position of strain SB00233 T CECT 9862 T was explored using a multi gene genomebased phylogenetic approach using the UBCG tool Fig 2 against 15 genomes in the genus Genome annotation through RAST predicted the potential ability for ubiquinone 10 Q10 synthesis Regarding polar lipids a potential ability for phosphatidyl glycerol PG synthe sis was predicted from the detection of genes cdsA coding for phosphatidate cytidylyltransferase EC 27741 pgsA and coding for CDPdiacylglycerolglycerol3phosphate 3phosphatidyltransferase EC 2785 Diphosphatidylg lycerol DPG synthesis was predicted from the presence of cardiolipin synthetase EC 278 gene cls The potential ability to synthesize phosphatidylcholine PC was predicted from the detection of phosphatidylcholine synthase EC 27824 gene pcs while the potential for phosphatidyle thanolamine PE synthesis was predicted from the detection of phosphatidylserine decarboxylase EC 41165 gene psd Finally the gene coding for CDPdiacylglycerolserine Ophosphatidyltransferase EC 2788 the enzyme respon sible for phosphatidylserine PS biosynthesis in bacteria was not annotated by RAST or Prokka which suggests that this phospholipid was not formed by the strain The obtained UBCG phylogenetic approach showed a specific relationship with M dankookense SW087 T DSM 22415 T Gen bank accession number GCF9021418551 with a high GSI 89 as nearest neighbour Fig 2 Further more the comparison of the whole genome of SB00233 T CECT 9862 T with all the genome sequences of the same 15 genomes in the genus made using ANIb ANIm and OrthoANI showed that the closest was again M dankookense SW087 T DSM 22415 T with values of 9108 9015 and 9211 respectively Table 4 Plant Growth and Yield Assays In vitro Assay The isolated strain demonstrated its endophytic capacity when it was found inside the plant root and leaves after inoc ulation by not being affected the way in which the strain was inoculated through the root or aerial part No significant differences were found in plant weight or height between inoculated and noninoculated plants during the 10 days of the in vitro assay data not shown The SPAD value was significantly higher in plants inocu lated with the strain SB00233 T CECT 9862 T than in those that had not been inoculated the greatest differences were being a 50 reduction in the nitrogen fertilization Fig 3 The nitrate reductase NR was reduced in plants treated with the strain SB00233 T Table 2 Differential biochemical characteristics of strain SB00233 T CECT 9862 T compared with Methylobacter dankookense SW08 07 T DSM 22415 T assessed using API ID32GN and API 20NE tests BioMérieux Both strains were catalase positive For API ID32GN Positive for both assayed strains glu cose hydroxybenzoic hydroxybutyric acid lactic acid Lproline Nacetylglucosamine rhamnose serine sodium malonate suberic acid itaconic acid valeric acid Negative for both fucose maltose mannitol propionic acid salicin sorbitol sucrose For API 20NE Positive for both assayed strains adipic acid and assimilation of malate potassium gluconate assimilation tryptophan formation urease Negative for both arginine hydrolase assimila tion of arabinose cytochrome oxidase glucose assimilation maltose assimilation mannitol assimilation mannose assimilation Nacetyl glucosamine protease gelatine hydrolysis βglucosidase ESCU LIN hydrolysis SB00233 T M dankookense SW0807 T API ID32GN LAlanine LArabinose Capric acid Glycogen 4Hydroxybenzoic acid LHistidine Inositol DMelibiose Potassium 2ketogluconate Potassium 5ketogluconate DRibose Sodium Acetate Trisodium citrate API 20NE Capric assimilation βGalactosidase Nitrite reduction Phenyl acetic acid Trisodium citrate Oxidase 2037 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum 1 3 Field Assays The in vitro assays conducted to test the effect of the strain in field conditions in rice maize and wine grape showed that in general SB00233 T strain inoculation showed an increase yield permitting a reduction of the average level of nitrogen In the treatments of maize and rice the level of nitrogen was reduced between 3042 leading to maintain or increase yield of 28 Table 5 In the cases of organic maize where only organic matter was added no added nitrogen fertilizer the increase yield reached 56 Table 5 Discussion Classical phenotypical characterization of the strain SB00233 T strain pointed to no significant morphologi cal differences from other similar strains of the genus Table 3 Genomes used in the study and their principal characteristics Size Mb G C mol Number Contigs Genes Protein Genes RNA Accessions numbers M symbioticum SB00233 T 609 701 247 5665 94 GCF9021418451 M dankookense DSM 22415 T 615 704 132 5839 93 GCF9021418551 M tarhaniae DSM 25844 T 674 704 483 5896 81 NZLABZ000000001 M platani JCM 14648 T 685 711 554 6120 84 NZJXOD000000001 M aquaticum DSM 16371 T 743 699 512 6247 69 GCA0010439151 M frigidaeris IER2516 T 640 705 1670 5624 61 NZPELK000000001 M currus PR1016AT 776 705 5 6738 133 GCA0030583251 M variabile DSM 16961 T 743 707 562 6610 65 NZLABY000000001 M nodulans ORS 2060 T 777 689 1 7880 97 NC011894 M gossipiicola Gh105 T 452 687 80 4046 60 NZFOPM000000001 M pseudosasicola BL36T 685 684 131 6430 61 NZFOTK000000001 M phyllostachyos BL47T 602 687 51 5551 64 NZFNHS000000001 M phyllosphaerae CBMB27T 608 698 4 5499 73 NZCP015367 M oryzae CBMB20T 629 698 1 5571 75 NZCP003811 M organophilum DSM 760 T 675 714 88 6122 59 NZQEKZ000000001 M radiotolerans JCM 2831 T 714 709 9 6294 82 NC010505 Fig 2 Phylogenetic tree gener ated with UBCG 29 using the amino acids sequences The numbers at the nodes indicate the gene support index maximum value 92 Genome accession numbers are indicated in parentheses Bar 005 substi tutions per position 2038 J A Pascual et al 1 3 Methylobacterium 38 The most similar strain M dankookense SW087 T DSM 22415 T pointed out some differences in the use of some substrates and some biochemi cal analysis as it is shown in Table 2 38 suggesting that it could be considered a new strain of M dankookense or even as a new species Recent advances in DNA sequencing technology has led to genome sequence data being used more in prokaryotic taxonomy and enabled measurements between two whole genome sequences called overall genome relatedness indi ces OGRI and a cutoff that defines boundaries between species has been developed 32 Average nucleotide iden tity ANI has been the most widely used 39 40 with a proposed species boundary cutoff of 9596 41 val ues higher than those obtained from a comparison of the 15 closest genera analysed by 16S rRNA phylogeny and UBCG clusters 29 which would mean that these genomes are from different species ANIm and ANIb values for the genome pair of the isolate SB00233 T and M dankookense SW087 T DSM 22415 T were the highest value but yet under the cutoff value for species An improved algorithm named OrthoANI has been proposed to orthologically overcome the problem of reciprocal values in conventional ANI calculations 34 Again the OrthoANi obtained when comparing the closest species were below 83 and M dankookense SW087 T DSM 22415 T being the closest with a value of 9108 which is far from the proposed spe cies boundary cutoff of 9596 41 that means that the studied strain is to be considered a new species Once strain SB00233 T would be considered as new spe cies it was also interesting to evaluate its effect on plant by the in vitro and in vivo assays From the beginning it was demonstrated that the strain SB00233 T showed the capacity to penetrate plant tissue and further it would move through the xylem not being affected by which part is inoculated root or shoot Strain SB00233 T inoculation also permitted to reduce nitrogen by at least a half without any quantita tive loss of SPAD that it would monitor chlorophyll content and nutritional status 42 The SPAD values were higher at 50 N than at 100 N a fact that it might be explained by the nutritional deficiency 50 N provoked need of nitrogen that promoted symbiosis while with a complete nutritional contribution 100 N the plant does not need the potential nitrogen that the inoculum would provide 15 43 The nitrate reductase a key enzyme for the assimilation of available nitrogen content 44 decreased in the inocu lated plants but it did not have a negative effect on plant fitness as measured by SPAD This fact could be supported the view that the fixed atmospheric nitrogen through strain SB00233 T inhibited the nitrate reductase activity through ammonium nitrogen production an intermediate compound of nitrogen fixation that it is demonstrated to the inhibition Table 4 OrthoAni ANIb and ANIm values between M symbioticum SB00233 T and the genomes of Methylobacterium species arranged as in Fig 2 OrthoANI ANIb ANIm M dankookense DSM 22415 T 9108 9015 9211 M tarhaniae DSM 25844 T 7828 7620 8482 M platani JCM 14648 T 7854 7633 8484 M aquaticum DSM 16371 T 7829 7624 8512 M frigidaeris IER2516 T 7824 7628 8498 M currus PR1016AT 7864 7663 8499 M variabile DSM 16961 T 7875 7078 8536 M nodulans ORS 2060 T 7804 7603 8462 M gossipiicola Gh105 T 7846 7796 8481 M pseudosasicola BL36T 8022 7821 8549 M phyllostachyos BL47T 7994 7817 8560 M phyllosphaerae CBMB27T 8300 8095 8742 M oryzae CBMB20T 8028 7886 8570 M organophilum DSM 760 T 8027 7886 8577 M radiotolerans JCM 2831 T 8073 7978 8588 Fig 3 Nitrate reductase a and SPAD content b of maize leaves grown with and without inoculation of the strain SB00233 T CECT 9862 T at different nitrogen rates A B 0 10 20 30 40 50 0 50 100 Noninoculated Inoculated SPAD percentage of nitrogen content 0 001 002 003 004 005 006 0 50 100 Noninoculated Inoculated micromol nitrate g MF1 h percentage of nitrogen content 2039 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum 1 3 of this enzyme activity 45 The production of phytohor mones that stimulate plant growth could be also a process related to inoculation by the isolated strain 9 although the strain SB00233 T has not yet been studied as a plant growth promoting bacterium PGPR Deeping on studying several Methylobacterium strains it was reported that they could be divided into three groups with distinguishable features 46 The first group would have nitrogen fixation capacity M nodulans and Methylobacterium sp 13 47 the second group would have the capacity to plant growth promotion through aminocyclopropane1carboxylate ACC deami nase and phytase activity and no nitrogen fixation capacity M oryzae and M radiotolerans and the third group M extorquens that would lack these above activities From the field assay the inoculation of the SB00233 T strain dem onstrated the capacity to reduce nitrogen application while maintaining yields and even increasing them as a result of better plant fitness probably related to the biostimulant or biofertilization effects of the strain 9 13 47 Therefore the new isolated strain could be of agrobiotechnological interest for use in modern agriculture Description of Methylobacterium symbioticum sp nov Methylobacterium symbioticum symbioticum NL neut adj symbioticum symbiotic Methylobacterium symbioticum is a Gramstain negative motile bacillus 081 µm width and 1216 µm length and does not form endospores it can occur singly or in pairs It is positive for catalase activity but negative for oxidase activity It is sensitive to NaCl growing well at 015 reducing growth at 2025 and showing no growth at 30 Colonies on MMM were circular pink in colour with a clearly defined border It grows between 10 and 30 C optimal temperature 28 C pH 5580 optimum pH 7 it is strictly aerobic and facultative methylotrophic It can reduce nitrate but not nitrite It can use the following substrates as sole carbon sources ino sitol ribose tri sodium citrate glucose hydroxy benzoic hydroxybutyric acid lactic acid Lproline Nacetylglu cosamine rhamnose serine sodium malonate suberic acid itaconic acid valeric acid and it is negative for Lalanine Larabinose glycogen 4hydroxybenzoic acid Lhistidine Dmelibiose potassium 2 and 5ketogluco nate and sodium acetate fucose maltose mannitol propi onic acid salicin sorbitol sucrose It can also assimilate capric acid phenylacetic acid trisodium citrate adipic acid assimilation of malate and potassium gluconate The cellular fatty acids it contains include summed fea ture 8 C18 1 ω7cω6c as a major component and the following minor components C180 C160 C180 3OH C140 3OH and C16 ω7cω6c The G C molar content of its DNA obtained from genome sequence data is 701 mol The type strain is SB00233 T CECT 9862 T PYCC 8351 T that it was isolated from the inner spores of Glo mus iranicum var tenuihypharum obtained from a non agricultural soil in Fortuna Murcia Spain Acknowledgments The authors from CEBASCSIC would like to thank the Fundación Seneca of the Region of Murcia for its financial support within the Research Groups of 468 Excellence Programme of the Region of Murcia Grant No 19896GERM15 This research was partially funded by the Spanish funded body CDTI Grant No IDI 20170147 We are grateful to Dr Aharon Oren The Hebrew University of Jerusalem Israel for his help with the specific nomenclature and etymology We also thank Philip and Alvaro Thomas for checking the English Table 5 Field assays applying strain sb00233t CECT 9862t Rice 1 Albufera Valencia Rice 2 Delta del Ebro Maize 1 Altorricon Huesca Maize 2 Montesusin Huesca Maize 3 Belver de cinca Huesca Maize 4 Albacete Maize 5 Gamarzal Galicia Maize 6 Albacete Wine grape 1 Toli Jumilla Wine grape 2 Tomelloso La Mancha Nitrogen Fertilizer units Average yield kg per hectare Noninoculation Strain inoculation of Saving Noninoculation Strain Inoculation of higher production Rice 1 267 156 42 7031 8001 14 Rice 2 210 126 40 8124 8134 0 Maize 1 237 142 40 14312 17539 23 Maize 2 293 175 40 16881 17511 4 Maize 3 480 295 39 14346 18335 28 Maize 4 230 161 30 10515 11828 12 Maize 5 276 188 32 12525 12863 3 Maize 6 Organic Organic 27810 43429 56 Wine grape 1 25 25 0 13937 16464 18 Wine grape 2 18 18 0 14029 19776 41 2040 J A Pascual et al 1 3 Author Contributions Conceived and designed the experiments JM FF and JAP Isolation and morphological and phenotypical characteri zation FC AB RT and FF Molecular characterization and genomic comparisons JAP MR JM TL RA and DRA In Vitro and field trials AB FF and RL JAP wrote the draft of the manuscript and JM TL DRA and FF revised and implemented the manuscript All authors read and approved the final manuscript Compliance with Ethical Standards Conflict of interest The authors declare that they do not have conflict of interest References 1 Smith SE Read DJ 2008 Mycorrhizal symbiosis Academic Press Cambdrige 2 Fernández F Juarez J Nicolás E et al 2017 Application of Arbus cular Mycorrhizae Glomus iranicum var tenuihypharum var nova in Intensive Agriculture a study case J Agric Sci Technol B 7221247 https 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reductase activity in corn Zea mays L seedlings by endogenous metabo lites PLANT Physiol 4217501756 https doiorg101104 pp42121750 45 Hoffman BM Lukoyanov D Yang ZY et al 2014 Mechanism of nitrogen fixation by nitrogenase the next stage Chem Rev 11440414062 https doiorg101021cr400 641x 46 Kwak MJ Jeong H Madhaiyan M et al 2014 Genome infor mation of Methylobacterium oryzae a plantprobiotic methy lotroph in the phyllosphere PLoS ONE 9e106704 https doi org101371journ alpone01067 04 47 Camilli A Bassler BL 2006 Bacterial smallmolecule signaling pathways Science 31111131116 Publishers Note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations 25º Encontro Acadêmico de Produção Científica do Curso de Medicina Veterinária ISSN 19820151 São João da Boa Vista 09 de outubro de 2024 MAXIMIZANDO A PRODUÇÃO DE MILHO COM UTRISHA N UM AVANÇO SUSTENTÁVEL NA ALIMENTAÇÃO ANIMAL REVISÃO BIBLIOGRÁFICA BRUNA PAN DOS SANTOS1 LEONARDO COSTA2 LENITA CAMARGO VERDURICO3 1 Discente do Curso de Medicina Veterinária UNIFEOB São João da Boa VistaSP 2 Discente do Curso de Engenharia Agronômica UNIFEOB São João da Boa VistaSP 3 Docente do Curso de Medicina Veterinária UNIFEOB São João da Boa VistaSP RESUMO Atualmente o cereal com maior produção mundial é o milho sendo que no Brasil 46 de sua produção total é destinada à alimentação animal Na nutrição animal o milho é utilizado tanto para nutrir ruminantes quanto não ruminantes e apesar de não possuir muita proteína é uma excelente fonte de energia Sendo assim para garantir que a cultura do milho alcance uma boa produtividade é importante fornecer macronutrientes como nitrogênio potássio fósforo cálcio e magnésio em quantidades adequadas pois são requeridos em maior quantidade pelas plantas Desse modo visando um avanço sustentável na nutrição animal juntamente com a maximização da produção de milho verificase na presente revisão o uso do inoculante biológico comercial Utrisha N da Corteva Agriscience desenvolvido com a estirpe exclusiva de Methylobacterium symbioticum uma bactéria gramnegativa estritamente aeróbia e em forma de bastonete que visa reduzir a aplicação de fertilizantes nitrogenados promovendo uma agricultura sustentável pois além de fixar nitrogênio atmosférico o produto estimula o crescimento das plantas reduzindo a necessidade de fertilizantes em até 50 em certas culturas Medidas como essa não só promovem a eficiência agrícola mas também minimizam o impacto ambiental destacando a importância de práticas agrícolas sustentáveis na produção de alimentos para os animais PALAVRASCHAVE fertilização nitrogenada Methylobacterium symbioticum milho nutrição animal Utrisha N INTRODUÇÃO Nos dias atuais o milho é o cereal que possui maior produtividade por hectare sendo considerado o maior em nível de produção mundial ABPA 2020 No Brasil grande parte dessa produção é destinada à alimentação animal nutrindo tanto ruminantes quanto não ruminantes O milho em grãos inteiros ou moídos é a base da mistura da ração para os animais de produção PESSOA 2024 Para que o milho alcance uma produtividade eficiente é importante fornecer macronutrientes como nitrogênio potássio fósforo cálcio e magnésio em quantidades adequadas pois são necessários em maior quantidade pela planta PINHO et al 2010 O nitrogênio por sua vez desempenha um papel crucial na influência da produtividade das plantas em ecossistemas naturais e agrícolas RITCHIE 2017 Porém o manejo inadequado desse elemento é o principal fator que afeta a produtividade e aumenta os custos de produção da cultura FERNANDES LIBARDI 2007 Sendo assim recentemente a Corteva Agriscience lançou ao mercado o inoculante biológico comercial Utrisha N desenvolvido com a estirpe exclusiva de Methylobacterium symbioticum a qual visa reduzir a aplicação de fertilizantes nitrogenados e promover a agricultura sustentável HUBEL VERDE 2022 A revisão de literatura correlaciona o uso do inoculante biológico Utrisha N com a maximização da produção de milho a fim de avançar de maneira sustentável na agricultura e consequente alimentação animal REVISÃO DE LITERATURA Atualmente o cereal com maior produção mundial é o milho ainda que o trigo possua a maior área cultivada o milho por sua vez apresenta maior produtividade por hectare Foram semeados 194 milhões de hectares com produção superior a 1 bilhão de toneladas em 2018 FAO 2020 No Brasil aproximadamente 50 milhões de toneladas de milho são direcionadas para a alimentação animal o equivalente a cerca de 46 da produção total do cereal ABPA 2020 Na nutrição animal este cereal é utilizado tanto para nutrir ruminantes quanto não ruminantes 25º Encontro Acadêmico de Produção Científica do Curso de Medicina Veterinária ISSN 19820151 São João da Boa Vista 09 de outubro de 2024 Apesar de não possuir muita proteína é uma excelente fonte de energia Os grãos de milho inteiros ou moídos são a base das misturas de ração para animais de produção como ruminantes suínos e aves muitas vezes formando a maior parte de suas dietas Além de ser consumido em sua forma de grão o milho também é encontrado na forma de silagem e desintegrado com palha e sabugo servido igualmente de alimento aos animais PESSOA 2024 Para garantir que a cultura do milho alcance uma boa produtividade é importante fornecer macronutrientes como nitrogênio potássio fósforo cálcio e magnésio em quantidades adequadas pois são necessários em maior quantidade pela planta Sendo assim é crucial entender as necessidades e quantidades desses nutrientes em cada etapa do ciclo da cultura para favorecer o aumento da produtividade PINHO et al 2010 O nitrogênio por sua vez é o nutriente absorvido em maior quantidade pelo milho No entanto o manejo inadequado desse importante elemento é o principal fator que afeta a produtividade e aumenta os custos de produção da cultura FERNANDES LIBARDI 2007 É essencial que a administração dos fertilizantes nitrogenados atenda às necessidades da planta durante os momentos críticos enquanto simultaneamente buscase reduzir as perdas para minimizar o impacto ambiental uma vez que a aplicação contínua de fertilizantes nitrogenados obtidos por a síntese química afeta severamente os ecossistemas MAHANTY et al 2016 As fontes nitrogenadas mais comumente utilizadas na agricultura são a ureia e o sulfato de amônio Essas fontes no entanto estão propensas a perdas de nitrogênio no solo devido à lixiviação escoamento superficial volatilização da amônia principalmente a ureia e imobilização na biomassa microbiana podendo comprometer a produtividade agrícola ALVA et al 2006 A maior parte das pesquisas indica que há uma grande variação no aproveitamento de nitrogênio do fertilizante pelo milho com uma taxa que geralmente não excede 50 do nitrogênio aplicado Diante disso tornouse necessária a exploração de técnicas que reduzissem essas perdas aumentando assim a eficácia da fertilização nitrogenada e por consequência a produtividade da cultura KAPPES et al 2009 Nesse contexto estudos foram feitos utilizando a bactéria do gênero Methylobacterium a qual se faz amplamente presente na superfície das plantas e pode estimular o seu crescimento e desenvolvimento através da produção de uma variedade de fitohormônios MIZUNO et al 2013 Na pesquisa isolouse a cepa SB00233T da parte interna de esporos do fungo micorrízico Glomus iranicum var tenuihypharum posteriormente designada como Methylobacterium symbioticum Esta bactéria gramnegativa estritamente aeróbia e em forma de bastonete possui ótima temperatura de crescimento de 28 C Ensaios foram conduzidos a fim de avaliar sua eficiência em plantas demonstrando sua capacidade endofítica ao colonizar raízes e folhas e movimentarse pelo xilema independentemente da parte inoculada Testes de campo em arroz milho e videira para vinho evidenciaram que Methylobacterium symbioticum em sua maioria aumentou o rendimento das culturas permitindo a redução do nitrogênio aplicado destacando seu potencial como bioestimulante ou biofertilizante na agricultura moderna PASCUAL et al 2020 A aplicação foliar de Methylobacterium juntamente com outros promotores do crescimento vegetal desempenhou um papel crucial ao impedir a degradação da clorofila durante condições adversas de seca Esse processo específico resultou na retenção prolongada da clorofila nas folhas contribuindo significativamente para o atraso do processo de senescência ou seja o envelhecimento e deterioração das células vegetais assim beneficiando as culturas como o milho SIVAKUMAR et al 2017 Desta maneira recentemente foi lançado no mercado o inoculante biológico comercial Utrisha N da Corteva Agriscience desenvolvido com a estirpe exclusiva de Methylobacterium symbioticum a qual visa reduzir a aplicação de fertilizantes nitrogenados e promover a agricultura sustentável Recomendado para a cultura do milho o Utrisha N é aplicado via foliar nas fases iniciais do desenvolvimento da planta otimizando a cobertura do solo Além de fixar nitrogênio atmosférico o produto estimula o crescimento das plantas reduzindo a necessidade de fertilizantes em até 50 em certas culturas Beneficiando a fisiologia vegetal o Utrisha N retarda o envelhecimento celular prolonga a vida fotossintética efetiva e melhora a qualidade póscolheita dos frutos aumentando a rentabilidade das culturas de forma ambientalmente responsável essencial para o desenvolvimento sustentável da produção de alimentos para animais em escala global HUBEL VERDE 2022 CONSIDERAÇÕES FINAIS A presente revisão de literatura demonstrou a significativa importância do milho como cultura de alto rendimento mundial destinada principalmente à alimentação animal Conforme relatado por Pinho et al 2010 para otimizar sua produtividade a gestão adequada de macronutrientes como 25º Encontro Acadêmico de Produção Científica do Curso de Medicina Veterinária ISSN 19820151 São João da Boa Vista 09 de outubro de 2024 nitrogênio potássio fósforo cálcio e magnésio é fundamental especialmente em diferentes estágios do ciclo de crescimento Nesse contexto a eficiência no uso do nitrogênio é de extrema importância dado seu impacto significativo nos custos de produção e no meio ambiente demandando estratégias para minimizar perdas Para Hubel Verde 2022 a introdução de Methylobacterium symbioticum como inoculante biológico exemplificado pelo Utrisha N é um grande avanço para a agricultura sustentável reduzindo até 50 da necessidade de fertilizantes nitrogenados e melhorando a qualidade das culturas Por fim ao otimizar a produção de milho e adotar práticas agrícolas mais responsáveis não só se promove uma maior sustentabilidade na agricultura mas também se contribui para a saúde e a produtividade dos animais de criação refletindo na qualidade e na eficiência da produção alimentar global REFERÊNCIAS ABPA Relatório anual 2020 In OLIVEIRA M LANG G H FERREIRA C D Milho química tecnologia e usos São Paulo Editora Blucher 2022 p 6 ALVA A K PARAMASIVAM S FARES A DELGADO J A MATTOS JR D SAJWAN K Nitrogen and irrigation management practices to improve nitrogen uptake efficiency and minimize leaching losses Journal of Crop Improvement Binghamton v 15 p 369420 2006 FAO Food outlook biannual report on global food on global food markets June 2020 In OLIVEIRA M LANG G H FERREIRA C D Milho química tecnologia e usos São Paulo Editora Blucher 2022 p 4 FERNANDES F C S LIBARDI P L Percentagem de recuperação de nitrogênio pelo milho para diferentes doses e parcelamentos do fertilizante nitrogenado Revista Brasileira de Milho e Sorgo Sete Lagoas v 6 n 3 p 285296 2007 HUBEL VERDE 2022 Ficha Técnica de Produto UTRISHA N Referência FT00400 Hubel Verde Engenharia Agronômica S A KAPPES C CARVALHO M A C YAMASHITA O M SILVA J A N Influência do nitrogênio no desempenho produtivo do milho cultivado na segunda safra em sucessão à soja Pesquisa Agropecuária Tropical Goiânia v 39 p 251259 2009 MAHANTY T BHATTACHARJEE S GOSWAMI M BHATTACHARYYA P DAS B GHOSH A TRIBEDI P 2016 Biofertilizers a potential approach for sustainable agriculture development Environ Sci Pollut Res 24433153335 MIZUNO M YURIMOTO H IGUCHI H TANI A SAKAI Y 2013 Colonização dominante e herança de Methylobacterium sp estirpe OR01 em plantas de perila Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 77 n 7 p 15331538 PASCUAL J A ROS M MARTINEZ J CARMONA F BERNABÉ A TORRES R LUCENA T AZNAR R ARAHAL D R FERNÁNDEZ F Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum var tenuihypharum Current Microbiology v 77 n 9 p 20312041 2020 PESSOA R A S Nutrição Animal Conceitos Elementares São Paulo SRV Editora LTDA 2014 p 58 PINHO R G V BORGES I D PEREIRA J L D A R REIS M C D Marcha de Absorção de Macronutrientes e Acúmulo de Matéria Seca em Milho Revista Brasileira de Milho e Sorgo v8 n2 p 157173 2010 RITCHIE H Yields vs land use how the Green Revolution enabled us to feed a growing population Published online at OurWorldInDataorg 2017 SIVAKUMAR R NANDHITHA G K CHANDRASEKARAN P BOOMITHAN P SENTHILKUMAR M 2017 Impact of pink pigmented facultative methylotroph and PGRs on water status 25º Encontro Acadêmico de Produção Científica do Curso de Medicina Veterinária ISSN 19820151 São João da Boa Vista 09 de outubro de 2024 photosynthesis proline and NR activity in tomato under drought International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences v 6 n 6 p 16401651 Citation Rodrigues MÂ Correia CM Arrobas M The Application of a Foliar Spray Containing Methylobacterium symbioticum Had a Limited Effect on Crop Yield and Nitrogen Recovery in Field and PotGrown Maize Plants 2024 13 2909 httpsdoiorg103390 plants13202909 Academic Editor Jesus Munoz Rojas Received 20 September 2024 Revised 10 October 2024 Accepted 14 October 2024 Published 17 October 2024 Copyright 2024 by the authors Licensee MDPI Basel Switzerland This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution CC BY license https creativecommonsorglicensesby 40 plants Article The Application of a Foliar Spray Containing Methylobacterium symbioticum Had a Limited Effect on Crop Yield and Nitrogen Recovery in Field and PotGrown Maize Manuel Ângelo Rodrigues 12 Carlos Manuel Correia 3 and Margarida Arrobas 12 1 Centro de Investigação de Montanha CIMO Instituto Politécnico de Bragança Campus de Santa Apolónia 5300253 Bragança Portugal marrobasipbpt 2 Laboratório para a Sustentabilidade e Tecnologia em Regiões de Montanha Instituto Politécnico de Bragança Campus de Santa Apolónia 5300253 Bragança Portugal 3 Centre for the Research and Technology of AgroEnvironmental and Biological Sciences CITAB University of TrásosMontes and Alto Douro 5001801 Vila Real Portugal ccorreiautadpt Correspondence angeloripbpt Abstract In this study the effectiveness of an inoculant containing a nitrogen Nfixing microorgan ism Methylobacterium symbioticum was evaluated on maize Zea mays L grown both in the field silage maize and in pots over two years 2021 and 2022 The field trial included the following two treatments with Yes and without No the inoculant The pot experiment was designed as a factorial arrangement with two factors the application of the inoculant Yes and No and N applied to the soil 0 04 08 and 16 g pot1 In the field total dry matter yield DMY did not differ significantly between treatments although the average DMY was higher in the inoculant treatment In pots the total DMY varied significantly across all N rates but was only significantly affected by the inoculant application in 2022 N fixation estimates in the field were 588 and 145 kg ha1 for 2021 and 2022 respectively representing 237 and 91 of the N recovered in the aboveground plant parts In pots the estimated fixed N values were 492 and 1992 mg pot1 in 2021 and 2022 respectively which corresponded to 52 and 185 of the N found in the aboveground plant parts Considering the average values obtained across the four cultivation conditions there was a positive outcome for the treated plants However these values cannot be considered significant when compared to nitrogen removal in maize crops A commercial product should provide an unequivocal and quantitatively relevant contribution to plant nutrition which did not appear to be the case Thus for this inoculant to provide reliable guarantees of positive outcomes for farmers and become a useful tool in promoting more sustainable agriculture further studies appear necessary These studies should aim to determine in which crops and under what cultivation conditions the application of the inoculant is truly effective in enhancing N fixation and improving crop productivity Keywords Zea mays biological nitrogen fixation plant biostimulant microbial inoculant beneficial microorganisms 1 Introduction Maize is one of the most important crops in the world rivaling wheat and rice In 2022 the area under maize cultivation was 203 M ha and grain production was 116 billion metric tons 1 Although it has less importance as a food crop compared to wheat and rice maize is a more versatile multipurpose crop making it the second most widely grown crop in the world after wheat the latter grown on 219 M ha 1 In the developed economies maize grain is primarily used as a livestock feed crop with a varied role as an industrial and energy crop with emphasis on the production of bioethanol 2 In addition the maize plant is also used as green forage and for silage Maize cultivated for forage accounts for an additional 168 M ha annually 34 Plants 2024 13 2909 httpsdoiorg103390plants13202909 httpswwwmdpicomjournalplants Plants 2024 13 2909 2 of 15 Agricultural systems in which maize is grown in the world can be very diverse and with very different levels of farming intensification Maize grown in particularly high input systems is prevalent in the Global North where it can generate environmental externalities including land degradation water eutrophication and greenhouse gas emissions into the atmosphere 2 In highinput agricultural systems maize is one of the crops that receives the highest rates of N fertilizers 57 Excessive use of N in agricultural fields leads to the loss of large amounts of nitrates to waterbodies resulting in harmful algal blooms 89 Irrigated crops are also responsible for the emission of N oxides into the atmosphere because the wetting and drying cycles create favorable conditions for nitrification which is followed by denitrification 1011 When maize is integrated into livestock farming it receives high amounts of farmyard manure which tend to increase environmental problems In addition to the loss of nitrates to watercourses and the emission of greenhouse gases into the atmosphere the use of organic amendments increases the potential loss of dissolved organic carbon C 1213 with an impact potentially harmful to aquatic ecosystems and drinking water quality 1415 Furthermore animal manure is rich in phosphorus P especially that of nonruminants which lack phytases 1617 The application of large amounts of animal manure can reduce the P retention capacity of soils increasing the labile P fractions and exhausting P retention sites with nutrient loss to watercourses 1819 where it exacerbates the effect of N increasing the risks of eutrophication hypoxia and loss of species diversity 20 Some crops can access high amounts of N from the atmosphere thus needing to receive smaller amounts of N fertilizers which makes agricultural practices more sustainable with less energy consumption and less environmental impact Nodulated legumes for instance establish symbiotic relationships with Nfixing microorganisms commonly known as diazotrophs accessing N that may be sufficient to meet their nutritional needs 2123 In rice Oryza sativa L fields the development of the aquatic fern Azolla has been promoted since it establishes a symbiotic relationship with the Nfixing cyanobacterium Anabaena azollae the fern being cultivated as green manure before rice transplantation or as an intercrop with rice 2425 which can provide more than half of the N required for the rice crop 212324 It has also been shown that the tissues of some plants are invaded by endophytic microorganisms capable of fixing N In the case of sugarcane Saccharum officinarum L these microorganisms can provide the crop with more than half of its N needs 2627 Maize is often grown in intercropping or in rotation with legumes to reduce N fertilizer needs 2830 However it has been demonstrated that maize can directly access atmospheric N by its own means Some Nfixing microorganisms such as Herbaspirillum seropedicae are considered true endophytic diazotrophs predominantly associated with tropical grasses 3132 H seropedicae can invade the roots stems and leaves of the host plant mainly the apoplastic compartments 3233 Alves et al 34 applied the endophytic diazotroph H seropedicae strain ZAE94 to maize under field conditions The authors found that application of the H seropedicae inoculant increased the amount of N in plants owing to biological N fixation However the agronomic significance of bioinoculants with H seropedicae for N nutrition under field conditions remains a matter of debate and improvement and is currently not comparable to the effects of rhizobia inoculation in legumes 3234 Methylobacterium symbioticum is a diazotroph recently isolated from spores of Glomus iranicum var tenuihypharum 35 The genus Methylobacterium is ubiquitous in nature with numerous species thriving in diverse habitats 3637 Recently an inoculant containing M symbioticum strain SB00233 T appeared on the market for application in foliar spraying with the promise of being effective in nonlegume species The microorganism lodges in the phyllosphere where it has access to organic compounds providing N to the plants in return 3538 It is well known that certain species of the genus Methylobacterium can live on the phyllosphere utilizing methanol as a source of C and energy 3941 Plants release substantial amounts of methanol through their stomata as a byproduct of pectin metabolism during cell wall synthesis 42 In this way plants can support bacterial Plants 2024 13 2909 3 of 15 activity and enhance N fixation capacity A previous study demonstrated that the presence of the strain SB00233 T reduces the activity of nitrate reductase which is evidence of an increased presence of ammonium N an intermediate compound in N fixation 38 Additionally the microorganism promotes the production of phytohormones that stimulate plant growth thereby increasing plant productivity 35 Thus given the high N rates usually used in maize some contribution of N via biological fixation would have enormous ecological significance To better understand the ability of this microorganism to fix N two experiments were conducted one in the field and the other in pots In the field only two treatments were used with and without application of the inoculant to maize fertilized with 70 of the N recommended by the laboratory as suggested by the manufacturer In pots a factorial experiment was established with and without the application of inoculant and four rates of mineral N equivalent to 0 40 80 and 160 kg ha1 of N The hypothesis raised for the field and pot experiments was whether the inoculant improves crop productivity and increases the amount of N recovered by maize Based on the pot experiment a second hypothesis was raised as to whether the nutritional status of the plants created by different rates of N fertilizer affects the performance of M symbioticum in its ability to fix N 2 Materials and Methods 21 Experimental Conditions This study involved a field trial and a pot experiment both carried out in Bragança Northeastern Portugal during two consecutive growing seasons in 2021 and 2022 The region benefits from a Mediterranean warm summer climate Csb according to the KöppenGeiger classification The average annual temperature is 126 C and the to tal annual precipitation is 7727 mm 43 The records of average air temperatures and monthly precipitation for the experimental period are shown in Figure 1 Plants 2024 13 x FOR PEER REVIEW 3 of 16 release substantial amounts of methanol through their stomata as a byproduct of pectin metabolism during cell wall synthesis 42 In this way plants can support bacterial activ ity and enhance N fixation capacity A previous study demonstrated that the presence of the strain SB00233 T reduces the activity of nitrate reductase which is evidence of an increased presence of ammonium N an intermediate compound in N fixation 38 Addi tionally the microorganism promotes the production of phytohormones that stimulate plant growth thereby increasing plant productivity 35 Thus given the high N rates usually used in maize some contribution of N via biological fixation would have enor mous ecological significance To better understand the ability of this microorganism to fix N two experiments were conducted one in the field and the other in pots In the field only two treatments were used with and without application of the inoculant to maize fertilized with 70 of the N recommended by the laboratory as suggested by the manufacturer In pots a factorial experiment was established with and without the application of inoculant and four rates of mineral N equivalent to 0 40 80 and 160 kg ha1 of N The hypothesis raised for the field and pot experiments was whether the inoculant improves crop productivity and in creases the amount of N recovered by maize Based on the pot experiment a second hy pothesis was raised as to whether the nutritional status of the plants created by different rates of N fertilizer affects the performance of M symbioticum in its ability to fix N 2 Materials and Methods 21 Experimental Conditions This study involved a field trial and a pot experiment both carried out in Bragança Northeastern Portugal during two consecutive growing seasons in 2021 and 2022 The region benefits from a Mediterranean warm summer climate Csb according to the Kö ppenGeiger classification The average annual temperature is 126 C and the total annual precipitation is 7727 mm 43 The records of average air temperatures and monthly pre cipitation for the experimental period are shown in Figure 1 Figure 1 Monthly average temperature and accumulated precipitation of the climatological normal and recorded during the experimental period at the meteorological station of Quinta de Santa Apo lónia Bragança The field trial was carried out on a plot subjected to an eightyear crop rotation where four years of foragemaize are followed by four years of temporary pasture The experi ment took place in the third and fourth years of the maize phase The soil is a eutric Flu visol 44 developed in a fluvial deposit with a sandy loam texture In the year of instal lation of the experiment the soil of the plot presented the properties shown in Table 1 determined from composite samples taken at a depth of 0020 m In the pot experiment Figure 1 Monthly average temperature and accumulated precipitation of the climatological normal and recorded during the experimental period at the meteorological station of Quinta de Santa Apolónia Bragança The field trial was carried out on a plot subjected to an eightyear crop rotation where four years of foragemaize are followed by four years of temporary pasture The experiment took place in the third and fourth years of the maize phase The soil is a eutric Fluvisol 44 developed in a fluvial deposit with a sandy loam texture In the year of installation of the experiment the soil of the plot presented the properties shown in Table 1 determined from composite samples taken at a depth of 0020 m In the pot experiment soil from the 0020 m layer was used taken from a plot that had remained uncultivated the previous Plants 2024 13 2909 4 of 15 year The soil is a Regosol of colluvial origin 44 with a sandy clay loam texture Other properties of the soils used in this study are shown in Table 1 Table 1 Selected soil properties average standard deviation n 3 determined from composite soil samples taken at 0020 m depth at the beginning of the experiments Soil Properties Field Trial Pot Experiment 1 Organic carbon g kg1 141 061 91 126 2 pH H2O 59 031 65 020 3 Extract phosphorus mg kg1 P2O5 440 896 672 1378 3 Extract potassium mg kg1 K2O 1037 1148 812 771 4 Exchang calcium cmolc kg1 137 092 98 121 4 Exchang magnesium cmolc kg1 49 044 35 016 4 Exchang potassium cmolc kg1 11 016 03 003 4 Exchang sodium cmolc kg1 15 012 04 004 5 Exchang acidity cmolc kg1 01 000 01 002 6 CEC cmolc kg1 213 108 141 134 7 Sand 5621 2855 5441 2425 7 Silt 2453 2289 2069 2088 7 Clay 1927 5077 2490 4331 8 Texture Sandy loam Sandy clay loam 1 Wet digestion WalkleyBlack 2 potentiometry 3 ammonium lactate 4 ammonium acetate 5 potassium chloride 6 cation exchange capacity 7 Robinson pipette method 8 USDA The United States Department of Agriculture 22 Experimental Designs The field trial was carried out with only two treatments with and without application of the inoculant containing M symbioticum The experimental plot received 70 of the amount of N estimated as necessary for the maize crop as recommended by the manufac turer of the commercial inoculant Three replicates of each treatment were included in the experiment and the treated plots were kept more than 50 m away from the untreated plots to avoid contamination with the microorganism The pot experiment was a factorial design of two treatments with inoculant with and without and four N rates corresponding to the application of 0 04 08 and 16 g pot1 and four replicates per treatment N rates aimed to provide each plant with the equivalent of 0 40 80 and 160 kg ha1 of N considering a planting density of 100000 plants ha1 23 Preparation and Management of Field and Pot Experiments In the field experiment maize hybrid DKC 6181 staygreen line midseason FAO 500 was sown on May 13 and 16 2021 and 2022 respectively Before sowing the seedbed was prepared by plowing the soil to a depth of 025 m followed by chiseling to level the ground Subsequently the plots were marked to receive presowing fertilization A compound NPK fertilizer 101010 NP2O5K2O was applied at a rate of 700 kg ha1 of fertilizer 70 70 and 70 kg ha1 of N P2O5 and K2O respectively which represents 70 of half the full rate of N recommended by the laboratory 200 kg ha1 of N following the manufacturers instructions for the best use of the commercial product Blue N The fertilizer was then incorporated with a last pass of cultivator which also finalized the preparation of the seedbed Sowing was carried out with a precision seeder which spaced the seeds at 070 m between rows and 014 m between rows 100000 plants ha1 Plots with and without inoculant were placed more than 50 m apart to eliminate the risk of bacterial contamination from the treated plots At the phenological stage 14 four unfolded leaves 45 a herbicide treatment was carried out The herbicide that was used contained isoxadifenethyl 22 g L1 and tembotrione 44 g L1 as active ingredients and was applied at a concentration of 05 L hL1 2 L ha1 The other half N rate 70 kg ha1 of N as ammonium nitrate 205 N was applied as a sidedressing when the plants were at phenological stage 1617 six to seven unfolded leaves 45 This application coincided with the application of the inoculant in the cor Plants 2024 13 2909 5 of 15 responding plots The inoculant was applied at the concentration recommended by the manufacturer 333 g ha1 diluted in 100 L of water and applied with a knapsack sprayer wetting the adaxial and abaxial sides of the leaves Maize was sprinkled irrigated with a center pivot whenever the summer rains were not enough to keep the plant hydrated According to estimates by the farmers association that supplies the water approximately 3000 m3 ha1 of water was used each year No other farming operations were carried out during the growing season The pots 036 m in height and 017 m in average diameter were filled with 10 kg of dried and sieved soil In the initial phase the fertilizers used in preplanting were homoge neously mixed with the soil and then placed in the pots As a preplanting N fertilizer half of the N rates mentioned in the experimental design were applied as ammonium nitrate 205 N P was also applied at a rate of 08 g P2O5 pot1 as superphosphate 18 P2O5 and potassium K at a rate of 08 g K2O pot1 as potassium chloride 60 K2O Many other macro and micronutrients were applied using a fertilizer containing 10 MgO 03 boron B 185 SO3 03 copper Cu 2 iron Fe 1 manganese Mn 002 molybdenum Mo and 16 zinc Zn at the rate of 016 g pot1 year1 Sowings were carried out on May 24 and 27 2021 and 2022 respectively The hybrid DKC 6181 was also used in the pot experiment Three seeds were placed in each pot After germination excess seedlings were removed leaving only one plant per pot In the following weeks all the weeds that were germinating in the pots were promptly pulled out In the phenological stage 1617 45 the pots corresponding to the inoculant treatment received the commercial product as a foliar spray at the dosage and concentration referred to the field with each plant receiving the fraction corresponding to each of the 100000 plants of a hectare The application was carried out with a sprayer suitable for treating indoor plants adequately wetting the adaxial and abaxial sides of the leaves On that date N was also applied as sidedressing at an equivalent rate to that applied in preplanting Pots were watered throughout the growing season as needed Considering the vari ation in environmental variables during the growing season the phenological state of the plants and the differences in plant size induced by the fertilizer treatments the pots received different amounts of water but care was taken not to overwater or that the plants went through periods of drought stress After sowing the pots that received the inoculant were placed 50 m away from the pots that did not receive the inoculant All pots were surrounded by a wooden plank structure to prevent solar radiation from falling directly on the sides of the pots and excessively increasing the temperature in the rooting zone No further cropping practices were needed throughout the growing season until harvest 24 Measurements During the Growing Season Leaf greenness an index of plant N nutritional status was determined in the field and pot experiments using the portable Soil and Plant Analysis Development SPAD502 Plus chlorophyll meter Spectrum Technologies Inc Osaka Japan In the field thirty readings for each measurement were taken from the middle of the blade of the youngest fully expanded leaves In the pot experiment five readings for each plant were taken also from the youngest fully expanded leaves 25 Sample Collection and Preparation for Laboratory Analysis At the beginning of the field trial three composite soil samples 10 cores per sample were taken from the 0020 m layer to characterize the experimental plot For the pot experiment the soil was initially also taken in the 0020 m layer in sufficient quantity for all pots Then three samples were taken for laboratory analysis by a random process All soil samples were dried in an oven at 40 C and sieved 2 mm mesh before being submitted for laboratory analysis In the field experiment the final harvests were carried out on September 12 and 19 2021 and 2022 respectively at phenological stage 73 early milk 45 For each plot 10 plants were taken from two central rows of the plots After cutting the plants close to the Plants 2024 13 2909 6 of 15 ground the samples were immediately weighed fresh and chopped into thin sections Then random subsamples of approx 1 kg of fresh matter were taken and placed in hermetically sealed plastic bags In the laboratory the subsamples were weighed fresh ovendried at 70 C until constant weight and weighed to determine the percentage of dry matter data that allowed estimating the DMY in the plot and in the hectare Thereafter the samples were ground 1 mm mesh and sent for elemental chemical analysis The plants in the potted experiment were harvested on 7 and 12 September 2021 and 2022 respectively at the phenological stage 87 physiological maturity 45 Individual plants were ovendried at 70 C to constant mass and ground 1 mm mesh before being sent for elemental analysis 26 Soil and Plant Analysis Soil samples were analyzed for their content on clay silt and sand by the Robinson pipette method After that they were also analyzed for pH H2O and KCl soil solution 125 cationexchange capacity ammonium acetate pH of 70 organic C wet digestion WalkleyBlack method and extractable P and K EgnerRiehm method ammonium lactate extract These analytical procedures are fully described in Van Reeuwijk 46 The N concentration in plant tissues was quantified using the Kjeldahl method This procedure involves mineralizing the tissue sample with sulfuric acid H2SO4 and a seleniumbased catalyst Following mineralization the sample undergoes distillation with sodium hydroxide NaOH which converts the N into ammonia NH3 The amount of ammonia is then determined by titration which measures the NH3 carried in the steam stream 47 27 Data Analysis Data were tested for normality and variances homogeneity using the ShapiroWilk and Bartletts tests respectively The results of the field experiment were compared using a Students ttest to compare two means A twoway ANOVA examined the results of the pot experiment When the means of the N treatments displayed significant differences p 005 they were separated by Tukey HSD test α 005 Apparent N fixation ANF was used as an index of the effectiveness of N fixation by the microorganism in both the field and pot experiments ANF was determined by the difference between N recovered by plants that were and were not treated with the Nfixing microorganism separately for each rate of N applied to the soil ANF N recovered in inoculated plantsN recovered in untreated plants 3 Results 31 Maize Growth Performance In the field experiment no significant differences were observed between treatments in DMY either in 2021 or 2022 Figure 2 However in 2021 the average yield of the plots that received the inoculant 242 t ha1 was higher compared to those that did not receive it 202 t ha1 In 2022 the average yields were closer with 156 t ha1 and 141 t ha1 for the plots that received and did not receive the inoculant respectively The results from the pot experiment did not reveal significant differences in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 3 The average values for straw and grain were 1204 and 576 g pot1 and 1168 and 556 g pot1 for the treatments without and with inoculant respectively The application of mineral N in turn resulted in highly significant differences between treatments in straw grain and total DMY The total DMY varied significantly across the different levels of applied N with average values of 954 1637 1961 and 2506 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treatments respectively Plants 2024 13 2909 7 of 15 Plants 2024 13 x FOR PEER REVIEW 7 of 16 Figure 2 Maize dry matter yield DMY in the field experiments of 2021 and 2022 for the treatments without No and with Yes 333 g ha1 inoculant Within each year means followed by the same letter are not significantly different according to Students ttest The error bars represent the stand ard errors The results from the pot experiment did not reveal significant differences in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 3 The average values for straw and grain were 1204 and 576 g pot1 and 1168 and 556 g pot1 for the treatments without and with inoculant respectively The application of mineral N in turn resulted in highly significant differences between treatments in straw grain and total DMY The total DMY varied significantly across the different levels of applied N with average values of 954 1637 1961 and 2506 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treat ments respectively Figure 3 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2021 from the factorial experi ment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inocu lant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly dif ferent by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors In the 2022 pot experiment significant differences were observed in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 4 The total DMY averaged 1702 and 1890 g pot1 for the treatments without and with inoculant respec tively The results for mineral N application followed a pattern very similar to that of 2021 a a a a 0 5 10 15 20 25 30 No Yes No Yes 2021 2022 DMY t ha1 P2021 04877 P2022 05712 a a c b b a a a d c b a 0 50 100 150 200 250 300 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate DMY g plant1 Straw Grain Straw Pino 04853 Pnr 00001 Pint 01958 Grain Pino 04795 Pnr 00001 Pint 02018 Total Pino 02635 Pnr 00001 Pint 00561 D B A C A A Figure 2 Maize dry matter yield DMY in the field experiments of 2021 and 2022 for the treatments without No and with Yes 333 g ha1 inoculant Within each year means followed by the same letter are not significantly different according to Students ttest The error bars represent the standard errors Plants 2024 13 x FOR PEER REVIEW 7 of 16 Figure 2 Maize dry matter yield DMY in the field experiments of 2021 and 2022 for the treatments without No and with Yes 333 g ha1 inoculant Within each year means followed by the same letter are not significantly different according to Students ttest The error bars represent the stand ard errors The results from the pot experiment did not reveal significant differences in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 3 The average values for straw and grain were 1204 and 576 g pot1 and 1168 and 556 g pot1 for the treatments without and with inoculant respectively The application of mineral N in turn resulted in highly significant differences between treatments in straw grain and total DMY The total DMY varied significantly across the different levels of applied N with average values of 954 1637 1961 and 2506 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treat ments respectively Figure 3 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2021 from the factorial experi ment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inocu lant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly dif ferent by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors In the 2022 pot experiment significant differences were observed in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 4 The total DMY averaged 1702 and 1890 g pot1 for the treatments without and with inoculant respec tively The results for mineral N application followed a pattern very similar to that of 2021 a a a a 0 5 10 15 20 25 30 No Yes No Yes 2021 2022 DMY t ha1 P2021 04877 P2022 05712 a a c b b a a a d c b a 0 50 100 150 200 250 300 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate DMY g plant1 Straw Grain Straw Pino 04853 Pnr 00001 Pint 01958 Grain Pino 04795 Pnr 00001 Pint 02018 Total Pino 02635 Pnr 00001 Pint 00561 D B A C A A Figure 3 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2021 from the factorial experiment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly different by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors In the 2022 pot experiment significant differences were observed in maize straw grain and total DMY due to the application of the inoculant Figure 4 The total DMY averaged 1702 and 1890 g pot1 for the treatments without and with inoculant respectively The results for mineral N application followed a pattern very similar to that of 2021 with significant differences observed across each N dose The average total DMY values were 918 1545 2103 and 2617 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treatments respectively Plants 2024 13 2909 8 of 15 Plants 2024 13 x FOR PEER REVIEW 8 of 16 with significant differences observed across each N dose The average total DMY values were 918 1545 2103 and 2617 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treatments re spectively Figure 4 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2022 from the factorial experi ment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inocu lant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly dif ferent by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors 32 Plant N Nutritional Status N Recovery and Apparent N Fixation SPAD readings did not exhibit significant differences between treatments for the in oculant factor Figure 5 even in 2022 when differences in DMY were observed Figure 4 The average values ranged between 342 and 355 Conversely the application of mineral N to the soil had a pronounced effect on the greenness of the leaves with significant dif ferences in SPAD values across treatments in both years of this study In 2021 the average SPAD values ranged from 230 in the N0 treatment to 455 in the N160 treatment Similarly in 2022 these values varied from 228 to 466 in the same respective treatments Figure 5 SPAD readings in maize leaves from the factorial experiment involving inoculant applica tion No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their in teraction respectively For each experimental factor and year means followed by the same letter are b a d c b a b a d c b a 0 50 100 150 200 250 300 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate DMY g plant1 Straw Grain Straw Pino 00090 Pnr 00001 Pint 02404 Grain Pino 00027 Pnr 00001 Pint 02332 Total Pino 00001 Pnr 00001 Pint 05680 B A D C B A a a d c b a a a d c b a 0 10 20 30 40 50 60 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate SPAD readings 2021 2022 2021 Pino 01007 Pnr 00001 Pint 00967 2022 Pino 01199 Pnr 00001 Pint 03728 Figure 4 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2022 from the factorial experiment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly different by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors 32 Plant N Nutritional Status N Recovery and Apparent N Fixation SPAD readings did not exhibit significant differences between treatments for the inoculant factor Figure 5 even in 2022 when differences in DMY were observed Figure 4 The average values ranged between 342 and 355 Conversely the application of mineral N to the soil had a pronounced effect on the greenness of the leaves with significant differences in SPAD values across treatments in both years of this study In 2021 the average SPAD values ranged from 230 in the N0 treatment to 455 in the N160 treatment Similarly in 2022 these values varied from 228 to 466 in the same respective treatments Plants 2024 13 x FOR PEER REVIEW 8 of 16 with significant differences observed across each N dose The average total DMY values were 918 1545 2103 and 2617 g pot1 for the N0 N40 N80 and N160 treatments re spectively Figure 4 Dry matter yield DMY of maize straw grain and total in 2022 from the factorial experi ment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inocu lant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor means followed by the same letter within lowercase and above uppercase the columns are not significantly dif ferent by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors 32 Plant N Nutritional Status N Recovery and Apparent N Fixation SPAD readings did not exhibit significant differences between treatments for the in oculant factor Figure 5 even in 2022 when differences in DMY were observed Figure 4 The average values ranged between 342 and 355 Conversely the application of mineral N to the soil had a pronounced effect on the greenness of the leaves with significant dif ferences in SPAD values across treatments in both years of this study In 2021 the average SPAD values ranged from 230 in the N0 treatment to 455 in the N160 treatment Similarly in 2022 these values varied from 228 to 466 in the same respective treatments Figure 5 SPAD readings in maize leaves from the factorial experiment involving inoculant applica tion No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their in teraction respectively For each experimental factor and year means followed by the same letter are b a d c b a b a d c b a 0 50 100 150 200 250 300 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate DMY g plant1 Straw Grain Straw Pino 00090 Pnr 00001 Pint 02404 Grain Pino 00027 Pnr 00001 Pint 02332 Total Pino 00001 Pnr 00001 Pint 05680 B A D C B A a a d c b a a a d c b a 0 10 20 30 40 50 60 No Yes N0 N40 N80 N160 Inoculant Nitrogen rate SPAD readings 2021 2022 2021 Pino 01007 Pnr 00001 Pint 00967 2022 Pino 01199 Pnr 00001 Pint 03728 Figure 5 SPAD readings in maize leaves from the factorial experiment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their interaction respectively For each experimental factor and year means followed by the same letter are not significantly different by the Tukey HSD test α 005 The error bars represent the standard errors Plants 2024 13 2909 9 of 15 The N concentration in the whole plant at harvest in the field trial did not vary significantly with the application of the inoculant in either 2021 or 2022 Table 2 The average values ranged between 94 and 103 g kg1 The N recovered in the aboveground biomass which is the product of N concentration and DMY also did not differ significantly between treatments although the average values were higher in the inoculanttreated plots Consequently the average ANF values were positive at 587 and 145 kg ha1 for the inoculant treatment in 2021 and 2022 respectively and this represents 237 and 91 of the N recovered by maize Table 2 Plant nitrogen concentration PNC N recovery and apparent N fixation ANF in the field experiments of 2021 and 2022 for the treatments without No and with Yes 333 g ha1 inoculant PNC g kg1 N Recovery kg ha1 ANF kg ha1 2021 2022 2021 2022 2021 2022 No 94 a 103 a 1888 a 1446 a Yes 102 a 101 a 2475 a 1591 a 587 145 Prob 00503 07226 03008 06385 In columns means followed by the same letter are not significantly different by the Students ttest ANF N recovery in inoculated plants N recovery in untreated plants The N concentration in the straw did not vary significantly with inoculant application in 2021 but was significantly lower in the inoculanttreated plots compared to the non treated plots in 2022 Table 3 The effect of soil N application on straw N concentration was generally higher in the N0 treatment and subsequently in the N160 treatment It is worth noting that some plants in the N0 treatment did not produce grain which hindered the remobilization of N from the straw The N concentration in the grain decreased significantly with inoculant application in 2021 and increased in 2022 with a significant interaction observed with soil N application The N application to the soil tended to be higher in the N0 treatment where grain was produced in some plants and subsequently increased with the application of the highest N rate Table 3 Straw nitrogen concentration SNC grain N concentration GNC N recovery in the whole plant grain straw and apparent N fixation ANF in 2021 and 2022 from a factorial experiment involving inoculant application No and Yes 333 g ha1 nitrogen rate 0 N0 40 N40 80 N80 and 160 N160 kg ha1 Pino Pnr and Pint represent the probability associated with inoculant nitrogen rate and their interaction respectively SNC g kg1 GNC g kg1 N Recovery mg pot1 ANF mg pot1 2021 2022 2021 2022 2021 2022 2021 2022 Inoculant No 42 a 32 a 97 a 100 b 10024 a 8804 b Yes 41 a 30 b 84 b 120 a 9531 a 10796 a 492 1992 Nitrogen rate N0 44 a 41 a 136 a 4756 d 3699 d 08 248 N40 39 b 28 bc 83 bc 107 b 8597 c 6853 c 882 143 N80 36 c 25 c 77 c 97 c 10212 b 10741 b 136 1850 N120 46 a 29 b 89 b 124 a 15653 a 17908 a 942 6013 Pino 00811 00031 00001 00001 01968 00003 Pnr 00001 00001 00001 00001 00001 00001 Pint 00001 00221 00001 00001 06446 00004 In columns means followed by the same letter are not significantly different by the Tukey HSD test α 005 ANF N recovery in inoculated plants N recovery in untreated plants N recovery in the whole plant grain straw did not vary significantly with inoculant application in 2021 but increased in 2022 compared to the nontreated control Table 3 Plants 2024 13 2909 10 of 15 Soil N application had a marked effect on the amount of N recovered in the whole plant with significant differences observed between N levels in both years These N recovery results allowed for the estimation of average apparent N fixation values of 492 mg pot1 in 2021 and 1992 mg pot1 in 2022 which represents 52 and 185 of the N recovered by maize respectively These quantities distributed across the different soil N treatments resulted in negative apparent N fixation values of 08 882 136 and 942 mg pot1 in 2021 and overall positive values of 248 143 1850 and 6013 mg pot1 in 2022 for the N0 N40 N80 and N160 treatments respectively In this study concentrations of other nutrients in plant tissues were also determined including P K calcium Ca magnesium Mg boron B iron Fe manganese Mn copper Cu and zinc Zn Various soil properties were also assessed such as organic C pH extractable P and K base saturation cation exchange capacity and the micronutrients mentioned for plant tissue analysis Overall the variables analyzed showed limited sensi tivity to the treatments and contributed minimally to the interpretation of the results and therefore are not presented 4 Discussion 41 Dry Matter Yield Increased Significantly with SoilApplied N and to a Much Lesser Extent with the Inoculant Application In the field trial no significant differences in DMY were observed between plots with and without the inoculant However the plots with the inoculant generally yielded higher average values particularly in the 2021 trial In the pot experiment no significant differences existed between inoculated and noninoculated plants in 2021 However in 2022 the inoculated plants exhibited significantly higher DMY In the pot experiment the response to soilapplied N was striking in both years with highly significant differences observed among the various N levels applied N is a major ecological factor limiting plant productivity and as it generally does not accumulate in soils in forms usable by plants it is typically necessary to apply it annually to crops 4849 Thus providing mineral N to the plants resulted in a strong productivity response Figures 2 and 3 which was also facilitated by pot cultivation where root expansion and access to soil N are more constrained 5051 However in a study where plants showed a strong response to N fertilization the effect of applying an inoculant containing a Nfixing microorganism was modest in comparative terms The use of Nfixing inoculants in agriculture is a wellestablished practice with commercial development primarily focused on the use of specific rhizobial strains for legume inoculation 2123 Some attempts to use other Nfixing microorganisms Azoto bacter sp Azospirillum sp Herbaspirillum sp Bacillus sp etc have been made though with much more limited success compared to the application of inoculants in nodulated legumes 323952 In maize cultivation Alves et al 34 applied the endophytic diazotroph H seropedicae strain ZAE94 The authors observed that the amount of N found in the plants increased indicating that biological N fixation had occurred However the practical signifi cance of using these inoculants under field conditions remains uncertain and continues to be a topic of ongoing debate 3234 42 Indicators of N Nutritional Status Increased with SoilApplied N but Did Not Change Significantly with the Inoculant Application The plant greenness did not vary significantly with the inoculant application but it increased significantly with each level of soilapplied N SPAD values measure the light absorbed by leaf chlorophyll with higher values indicating greater chlorophyll content 53 Chlorophyll content in turn reflects the N content in the plant 4849 and SPAD readings are commonly used as an indicator of the plants N nutritional status 5455 This result highlights the high effectiveness of supplying N to the plant through soilapplied N and the lower effectiveness of the inoculant used for the same purpose The total N concentration in the plant as measured in the field trial did not vary significantly with the inoculant application In the pot experiment the effects of inoculant Plants 2024 13 2909 11 of 15 application and N rate on N concentration in plant tissues were difficult to interpret due to the separate analysis of straw and grain For instance some plants in the N0 treatment did not produce grain resulting in higher total N concentrations in straw compared to some treatments that received N Substantial remobilization of photosynthates occurs in mature plants from the leaves to the developing reproductive organs as these organs are prioritized sinks for these resources 5657 Regarding N there is a noticeable reduction in leaf N concentration throughout the growing season as the nutrient is remobilized to the seeds where it tends to accumulate in the form of protein 4958 In the N0treated plants N deficiency was so severe that the plants did not produce ears leading to generally higher N concentrations in the straw compared to the fertilized treatments 43 The Inoculant Application Was Inconsistent in N Fixation When evaluating the N recovery in plants during the field trial no significant dif ferences were observed between treatments although the mean values were higher in inoculated plants In the 2022 pot experiment plants treated with the inoculant showed significantly higher total N recovery grain straw than untreated plants However the re sults from the mineral N treatments demonstrated a pronounced effect on the amount of N recovered in the whole plant indicating that the additional N accessible to inoculated plants was relatively modest by comparison On average the field trial estimated N fixed through inoculant application at 577 and 145 kg ha1 in 2021 and 2022 respectively while in the pot experiment the values were 492 and 1992 mg pot1 in 2021 and 2022 respectively These N fixation values resulting from inoculant application can be considered modest especially compared to the increase in N recovery with soilapplied N These findings align with the results of other recently published studies using the same inoculant 5159 The capacity for biological N fixation by Nfixing microorganisms is highly dependent on the systems in which they are integrated High N fixation capacities can be achieved in symbiotic systems associated with nodulated legumes Microorganisms invade the host tissues after the plant secretes secondary metabolites called flavonoids which are recognized by the bacteria prompting the release of lipochitooligosaccharides known as nodulation factors which are then recognized by the host plant 60 Once inside the plant tissues the microorganisms transform into bacteroids through the synthesis of leghemoglobin which regulates oxygen flow within the nodules This process combined with the supply of photosynthates via the phloem ensures a high N fixation capacity which under certain conditions can exceed 400 kg ha1 year1 2123 In other Nfixing systems such as the relationship between the aquatic fern Azolla filiculoides and the cyanobacterium Anabaena azollae N fixation can exceed 100 kg ha1 year1 21232461 This fern is often used as an intercrop with rice to reduce the need for N fertilization 2425 Numerous cavities on the ferns leaf surfaces house the cyanobacterium protecting it from predation and facilitating access to exudates which allows for high levels of N fixation to be achieved 246162 It is also well documented that some tropical grasses such as sugarcane can establish endophytic associations with Nfixing microorganisms like Gluconoacetobacter diazotrophicus and Azospirillum brasilense which can satisfy more than half of the plants N needs 262762 H seropedicae is also considered a true endophytic diazotroph predominantly associated with tropical grasses capable of invading the roots stems and leaves of the host plant par ticularly the apoplastic compartments although the quantities of N fixed by this bacterium are less well documented 3134 In all highcapacity Nfixing systems highly specific symbiotic relationships are established between symbionts resulting from millions of years of coevolution 2361 However this does not preclude numerous freeliving N fixers which do not depend on a host from accessing atmospheric N These microorganisms can inhabit water as autotrophs live on leaf surfaces or exist in the soil as heterotrophs However excluding the photoautotrophs N fixation capacities are generally reduced due to the lack of protection for nitrogenase from excess oxygen and substrate limitations 212363 Plants 2024 13 2909 12 of 15 The Blue N inoculant was isolated from Glomus iranicum var tenuihypharum spores 35 It is known that other bacteria of the genus Methylobacterium eg M nodulans and M radiotolerans are capable of fixing N in interaction with plants by forming nodules on legume roots 40 However the Blue N inoculant which contains M symbioticum was developed for foliar application allowing it to thrive on the phyllosphere of cultivated plants Some Nfixing microorganisms can live on the phyllosphere of higher plants where they have access to various plantreleased products such as methanol which they use as a C source as well as soluble carbohydrates amino acids organic acids and many other compounds This access may enhance their N fixation capacity compared to freeliving microorganisms 3941 According to studies conducted by the team that developed the commercial product applying the inoculant to maize and strawberries resulted in a 50 and 25 reduction in the required N respectively accompanied by an increase in productivity compared to treatments that received the same amount of soilapplied N but without the inoculant application 38 However the Blue N inoculant is generally recommended for all cultivated species and as is well known each species harbors a diverse microbiome with different species competing for photosynthates and space 396465 Furthermore the phyllosphere is subject to variable environmental conditions which can be either hostile or favorable to specific microorganisms 396465 Although studies quantifying these effects are still lacking 3942 this environmental variability may account for the considerably different outcomes observed in the four trials reported in this study This variability makes it highly unlikely that the product could be universally effective as high N fixation capacities typically result from highly specific relationships between Nfixing microorganisms and their host plants 2123 Consequently the variation in results across the four trials underscores the urgent need for additional research to better establish the conditions under which a commercial inoculant can provide more consistent and predictable outcomes for farmers depending on plant species and cultivation conditions In the pot experiment a significant interaction was observed between the inoculant application and the soil N application This means that the N recovered in the inoculant treated plants depended on the level of mineral N applied and vice versa Consequently the 2021 results showed that inoculant application tended to be more negative at higher levels of soilapplied N meanwhile in 2022 the results tended to be more positive The commercial product information suggests that this inoculant is more effective when plants have a moderate N nutritional status than when N levels are very low 3866 It is be lieved that plants with a moderately favorable nutritional status release more substrates that microorganisms can utilize The results from the second year seem to support this hypothesis although the firstyear results tend to complicate the overall interpretation On the other hand although the environmental variables reported for this study namely average air temperature and precipitation Figure 1 do not clearly establish the cause of the differences observed in the various trials and considering that the soil was the same in both years of this study it is evident that the efficacy of the inoculant is sensitive to the conditions of application Therefore these conditions must be better understood to ensure greater reliability in the efficacy of the results when the inoculant is used by farmers 5 Conclusions The commercial inoculant Blue N demonstrated limited consistency in fixing N when applied to maize crops in field and pot experiments The limitations of the inoculant were more evident in the pot experiment where plants showed a strong response to various N rates applied to the soil To date high N fixation capacity has been observed in biological systems with a high specificity between the Nfixing microorganism and the host plant resulting from a coevolutionary process spanning millions of years To ensure that the use of this commercial inoculant is more effective and yields more reliable results for farmers further studies are necessary to optimize application conditions We should not overlook that in a global context where access to industrial N remains linked to very high Plants 2024 13 2909 13 of 15 energy costs and the use of synthetic fertilizers can have significant negative environmental impacts alternative or supplementary fertilization methods are particularly important on the path toward more sustainable agriculture Author Contributions MA funding acquisition investigation methodology and writingoriginal draft preparation CMC methodology writingreview and editing MÂR conceptualization funding acquisition project administration investigation methodology data curation writing review and editing All authors have read and agreed to the published version of the manuscript Funding The authors are grateful to the Foundation for Science and Technology FCT Portugal for financial support from national funds FCTMCTES to CIMO UIDBAGR006902020 SusTEC LAP00072020 and CITAB UIDB040332020 Data Availability Statement The data presented in this study are available on request from the corresponding author Conflicts of Interest The authors declare no conflicts of interest References 1 FAOSTAT Production Crops and Livestock Products 2024 Available online httpswwwfaoorgfaostatendataQCL accessed on 4 August 2024 2 Erenstein O Jaleta M Sonder K Mottaleb K Prasanna BM Global maize production consumption and trade Trends and RD implications Food Sec 2022 14 12951319 CrossRef 3 Heuzé V Tran G Edouard N Lebas F Maize Green Forage INRAE CIRAD AFZ and FAO 2017a Available online httpswwwfeedipediaorgnode358 accessed on 15 August 2024 4 Heuzé V Tran G Edouard N Lebas F Maize Silage INRAE CIRAD AFZ and FAO 2017b Available online https wwwfeedipediaorgnode13883 accessed on 15 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y rendimiento de la quinua Chenopodium quinoa Willd usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno en el sector la Argelia del cantón Loja AUTOR Carlos David Valarezo Ramos DIRECTORA Dra Mirian Irene Capa Morocho PhD Loja Ecuador 2023 Trabajo de Integración Curricular previo a la obtención del título de Ingeniero Agrónomo ii Certificación Loja 24 de febrero de 2023 Dra Mirian Irene Capa Morocho PhD DIRECTORA DEL TRABAJO DE INTEGRACIÓN CURRICULAR CERTIFICO Que he revisado y orientado todo el proceso de elaboración del Trabajo de Integración Curricular denominado Evaluación del crecimiento y rendimiento de la quinua Chenopodium quinoa Willd usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno en el sector la Argelia del cantón Loja previo a la obtención de título de Ingeniero Agrónomo de la autoría del estudiante Carlos David Valarezo Ramos con cédula de identidad Nro1105136491 Una vez que el trabajo cumple con todos los requisitos exigidos por la Universidad Nacional de Loja para el efecto autorizo su presentación del mismo para su respectiva sustentación y defensa Dra Mirian Irene Capa Morocho PhD DIRECTORA DEL TRABAJO DE INTEGRACIÓN CURRICULAR Firmado electrónicamente por MIRIAN IRENE CAPA MOROCHO iii Autoría Yo Carlos David Valarezo Ramos declaro ser autor del presente Trabajo de Integración Curricular y eximo expresamente a la Universidad Nacional de Loja y a sus representantes jurídicos de posibles reclamos y acciones legales por el contenido del mismo Adicionalmente acepto y autorizo a la Universidad Nacional de Loja la publicación de mi Trabajo de Integración Curricular en el Repositorio Digital Institucional Biblioteca Virtual Firma Cédula 1105136491 Fecha 9 de septiembre de 2023 Correo electrónico carlosdvalarezounleduec Teléfono 0994381678 iv Carta de Autorización por parte del autor para la consulta reproducción parcial o total yo publicación electrónica de texto completo del Trabajo de Integración Curricular Yo Carlos David Valarezo Ramos declaro ser el autor del Trabajo de Integración Curricular denominado Evaluación del crecimiento y rendimiento de la quinua Chenopodium quinoa Willd usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno en el sector la Argelia del cantón Loja como requisito para optar el título de Ingeniero Agrónomo por lo que autorizo al sistema bibliotecario de la Universidad Nacional de Loja para que con fines académicos muestre a mundo la publicación intelectual de la Universidad a través de la visibilidad de su contenido en el Repositorio Digital Institucional Los usuarios pueden hacer uso de este trabajo investigativo en las redes de información del país RID y del exterior con las que mantenga convenio la Universidad La Universidad Nacional de Loja no se responsabiliza por el plagio del Trabajo de Integración Curricular que realice un tercero Para constancia de esta autorización en la ciudad de Loja a los ocho días del mes de septiembre del dos mil veintitrés Firma Autor Carlos David Valarezo Ramos Cédula 1105136491 Dirección Av Cuxibamba y Tulcán 0476 Correo electrónico carlosdvalarezounleduec Teléfono 0994381678 DATOS COMPLEMENTARIOS Director del Trabajo de Integración Curricular Dra Mirian Irene Capa Morocho PhD v Dedicatoria Dedico este trabajo a mis padres Mirian Ramos y Davi Valarezo a mis hermanos Edin y Madelyn a alguien muy especial en mi vida Alexandra Jiménez por todo el amor sacrificio y por el apoyo que me han brindado de manera incondicional para ver cristalizado este sueño no solo mío porque también es de ellos pues sin su ayuda no habría podido sobresalir y afrontar todos los obstáculos que se me han atravesado en el camino y que junto con ellos he logrado superarlos A mis abuelitos Julia Carlos Genoveva Segundo que por sus raíces de agricultores me han hecho amar el campo y todas las actividades que se realizan en la agricultura que me han sabido enseñar y darme su cariño Finalmente dedico el presente trabajo a toda mi familia en general a mis tíosas y a primosas Carlos David Valarezo Ramos vi Agradecimiento Agradezco a Dios por habernos dado vida y salud y poder estudiar a mi familia que con su apoyo en todos los sentidos de la palabra me hayan ayudado a cumplir esta gran propuesta en mi vida al igual que agradezco a todosas mis amigosas que siempre pendientes y me han estado dando ánimos para seguir con mis estudios en especial a mi mejor amiga Jessica Rosales También doy gracias a cada uno de los docentes de todas las materias cursadas durante la carrera que con sus conocimientos y experiencias compartidas me dieron el aprendizaje necesario para formarme en el campo profesional y desempeñar mis funciones en mi futuro empleo A mi directora del Trabajo de Integración Curricular la Dra Mirian Irene Capa Morocho PhD por su asesoramiento y orientación académica durante el desarrollo de este trabajo de investigación Carlos David Valarezo Ramos vii Índice de contenidos Portada i Certificación ii Autoría iii Carta de Autorización iv Dedicatoria v Agradecimiento vi Índice de tablas xi Índice de figuras xii Índice de anexos xiv 1 Título 1 2 Resumen 2 21 Abstract 3 3 Introducción 4 4 Marco teórico 6 41 Cultivo de quinua 6 411 Importancia cultural y producción 6 412 Taxonomía 7 413 Fenología 7 414 Condiciones edafoclimáticas 8 a Altitud y suelo 8 b Humedad 9 c Temperatura 9 d Precipitación 9 415 Requerimientos nutricionales 9 416 Importancia del nitrógeno en el crecimiento y rendimiento 9 42 Fertilización 10 421 Fertilización química 10 a Fuente nitrogenada 10 b Fuente de fósforo 10 c Fuente de potasio 10 422 Biofertilización 11 423 Bacterias como biofertilizantes 11 424 Bacterias fijadoras de nitrógeno 11 425 Methylobacterium simbyoticum como fijadora de nitrógeno 12 viii 43 Antecedentes 13 5 Metodología 14 51 Localización del estudio 14 Fig 1Ubicación de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua Villavicencio 2021 14 52 Metodología general 14 521 Tipo de investigación y alcance 14 522 Diseño experimental 15 Fig 2Esquema del DCA de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua 16 524 Manejo del cultivo 16 53 Metodología para el primer objetivo específico Describir el crecimiento de la quinua usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno 17 Altura de la planta 17 Diámetro del tallo 18 Número de hojas 18 Número de ramas 18 Cobertura del área foliar 18 Índice SPAD 18 54 Metodología para el segundo objetivo específico Determinar el efecto de Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno sobre el rendimiento de la quinua 19 Número de granos por planta 19 Número de granos por m2 19 Peso de 1000 granos 19 Rendimiento R 19 Índice de cosecha 19 6 Resultados 21 61 Variables de Crecimiento 21 Altura de la planta 21 Fig 3 Altura de plantascm las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante diferentes días después de la siembra DDS Líneas cobre las barras indican el error ix estándar medio Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 21 Diámetro del tallo 21 Fig 4Diámetro del tallomm de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante los 114 y 129 días después de la siembra DDS Líneas cobre las barras indican el error estándar medio Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 22 Número de hojas 22 Fig 5Número de hojas de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 22 Número de ramas 23 Fig 6Número de ramas de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteriunm simbioticum en dos momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS 23 Cobertura del área foliar 23 Fig 7 Cobertura de Área Foliar de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms 2 a los 69 84 99 114 y 129 días después de la siembra DDS 24 Índice SPAD 24 Fig 8 Índice SPAD de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms durante la etapa 6 fase de antesis del cultivo de quinua según la escala BBCH de Sosa et al 2017 Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 24 Índice de Área Foliar IAF 25 62 Variables de Rendimiento 25 Número de granos por planta 25 Número de granos por m2 25 Peso de 1000 granos 26 x Fig 9 Peso de 1000 granos de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha 26 Rendimiento R 26 Índice de cosecha 27 7 Discusión 28 8 Conclusiones 32 9 Recomendaciones 33 10 Bibliografía 34 11 Anexos 39 Anexo 1 Delimitación de las parcelas 39 xi Índice de tablas Tabla 1 Clasificación taxonómica de la Quinua según Apaza 2014 7 Tabla 2 Etapas fenológicas de la escala BBCH en quinua según Sosa et al 2017 8 Tabla 3 Tratamientos con el factor fertilización y momento de aplicación de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua 15 Tabla 4Índice de Área Foliar IAF de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la etapa 8 del cultivo de quinua según la escala BBCH de Sosa et al 2017 Medias con una letra común no son significativativamente diferentes p005 25 Tabla 5 Número de granos por planta bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la cosecha Medias con una letra común no son significativativamente diferentes p005 25 Tabla 6 Número de granos por m2 de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la cosecha Medias con una letra común no son significativativamente diferentes p005 26 Tabla 7 Rendimiento de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha 27 Tabla 8 Índice de cosecha de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha 27 xii Índice de figuras Fig 1Ubicación de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua Villavicencio 2021 14 Fig 2Esquema del DCA de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua 16 Fig 3 Altura de plantascm las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante diferentes días después de la siembra DDS 21 Fig 4Diámetro del tallomm de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante los 114 y 129 días después de la siembra DDS 22 Fig 5Número de hojas de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS 22 Fig 6Número de ramas de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteriunm simbioticum en dos momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS 23 Fig 7 Cobertura de Área Foliar de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms 2 a los 69 84 99 114 y 129 días después de la siembra DDS Medias con una letra común no son significativativamente diferentes p005 24 Fig 8 Índice SPAD de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms durante la etapa 6 del cultivo de quinua según la escala BBCH xiii de Sosa et al 2017 24 Fig 9 Peso de 1000 granos de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha 26 xiv Índice de anexos Anexo 1 Delimitación de las parcelas 39 Anexo 2 Instalación de sistema de riego por aspersión 39 Anexo 3 Cultivo en etapa vegetativo 40 Anexo 4 Aplicación foliar de Methylobacterium 40 Anexo 5 Toma de muestras para llevar a laboratorio 40 Anexo 6 Medición de Área Foliar con el medidor Cl202 41 Anexo 7 Peso de biomasa 41 Anexo 8Producto químico HELCORE con ingrediente activo Difenoconazole para combatir la enfermedad fungosa provocada por el mildiú Peronospora variabilis 42 Anexo 9 Producto comercial BlueN que contiene la bacteria Methyñobscterium symbioticum 42 Anexo 10 Certificado de traducción del resumen 43 1 1 Título Evaluación del crecimiento y rendimiento de la quinua Chenopodium quinoa Willd usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno en el sector la Argelia del cantón Loja 2 2 Resumen Por muchos años el cultivo de quinua ha sido de gran importancia en la agricultura familiar y campesina principalmente en países como Perú Bolivia Ecuador y Colombia debido a la gran fuente de ingresos y de trabajo a los productores además de aportar a la soberanía El nitrógeno es un elemento limitante su baja disponibilidad disminuye el crecimiento vegetativo y el potencial de rendimiento El fertilizante nitrogenado más utilizado es la urea químico y de alto costo Una opción para la sustitución de este producto es el uso de microorganismos como las bacterias Por esto el objetivo del presente estudio permitió evaluar el crecimiento y rendimiento de la quinua Chenopodium quinoa Willd usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno El ensayo se estableció en la Quinta Experimental Docente La Argelia QEDA de la Universidad Nacional de Loja ubicada cantón Loja bajo un diseño completamente al azar DCA con arreglo unifactorial con 5 tratamientos y 3 repeticiones con un total de 15 parcelas Los tratamientos incluyeron T1 testigo la aplicación de Methylobacterium 3 107 UFCg T3 etapa 4 y T4 etapa 4 y 6 T2 aplicación urea N en etapas 4 y 6 y T5 aplicación combinada de nitrógeno Methylobacterium en etapas 4 y 6 Las variables altura de la planta diámetro de tallo número de hojas y número de ramas la toma de datos se realizó a partir de la etapa 4 de la escala BBCH del cultivo de quinua Por otro lado para las variables índice SPAD y biomasa aérea se tomaron las mismas plantas que fueron 2 de los surcos centrales durante las etapas 4 5 6 y 8 de la fenología del cultivo Los análisis estadísticos ANAVA y prueba de test de Tukey se realizaron con el programa INFOSTAT Los mayores valores se obtuvieron en altura con el T2 15682 cm y T5 15611 cm en el diámetro de tallo el T2 993 mm En cuanto al número de hojas índice SPAD y peso de 1000 granos el tratamiento T5 presentó los mayores valores con 894 hojas 5054 unidades SPAD y 323 g de peso en 1000 semillas Este trabajo proporciona nuevas herramientas de manejo cultivo de quinua realizándolo de una manera más ecológica y a la vez reduciendo los gastos económicos para los productores Palabras clave quinua bacterias nitrificantes urea rendimiento crecimiento 3 21 Abstract For many years the cultivation of quinoa has been of great importance in family and peasant agriculture mainly in countries such as Peru Bolivia Ecuador and Colombia due to the great source of income and work for producers in addition to contributing to sovereignty Nitrogen is a limiting element its low availability reduces vegetative growth and yield potential The most commonly used nitrogen fertilizer is urea chemical and expensive One option for the substitution of this product is the use of microorganisms such as the bacteria Therefore the objective of this study was to evaluate the growth and yield of quinoa Chenopodium quinoa Willd using Methylobacterium symbioticum as a nitrogenfixing source The trial was established in Quinta Experimental Docente La Argelia QEDA at National University of Loja located in Loja canton under a completely randomized design CRD with a unifactorial arrangement with 5 treatments and 3 replications with a total of 15 plots Treatments included T1 control application of Methylobacterium 3 107 CFUg T3 stage 4 and T4 stage 4 and 6 T2 urea N application in stages 4 and 6 and T5 combined application of nitrogen Methylobacterium in stages 4 and 6 The variables plant height stem diameter number of leaves and number of branches were collected from stage 4 of the BBCH scale of the quinoa crop On the other hand for the variables SPAD index and aerial biomass the same plants were taken from the central furrows during stages 4 5 6 and 8 of the crop phenology ANAVA statistical analysis and Tukeys test were carried out with the INFOSTAT program The highest values were obtained in height with T2 15682 cm and T5 15611 cm in stem diameter T2 993 mm Regarding the number of leaves SPAD index and weight of 1000 grains the T5 treatment presented the highest values with 824 leaves 5054 SPAD units and 323 g of weight in 1000 seeds This work provides new management tools for quinoa cultivation doing it in a more ecological way and at the same time reducing economic expenses for producers Key words quinoa nitrifying bacteria urea yield growth 4 3 Introducción Por muchos años el cultivo de quinua ha sido de gran importancia en la agricultura familiar y campesina principalmente en países como Perú Bolivia Ecuador y Colombia debido a que ha generado una gran fuente de ingresos y de trabajo a los productores además de aportar a la soberanía alimentaria García Plazas 2018 Esto debido a la gran cantidad de aminoácidos esenciales oligoelementos y vitaminas que posee el grano de quinua al no contener gluten Gómez Aguilar 2016 Las zonas de producción de quinua en Ecuador se encuentran en las provincias de la Región Sierra Calvache Valle 2021 con un rendimiento a nivel nacional de 093 tha en el 2021 demasiado bajo comparado con la producción obtenida por Perú de 148 tha en el mismo año MAG 2021 En su mayoría la quinua es sembrada en suelos con bajos contenidos de nutrientes y sin fertilización lo que repercute en bajos rendimientos observados frente a la fertilización nitrogenada fosforada y potásica en suelos con deficiencias de estos nutrientesAlvarado Cartagena 2017 El nitrógeno es un elemento limitante para el crecimiento de especies vegetales ya que su nivel de disponibilidad es bajo debido al alto grado de solubilidad que presenta este y se pierde fácilmente por lixiviación y volatilización principalmente Ante el insuficiente nitrógeno disponible habrá cantidades mínimas de clorofila en las plantas Ariza et al 2020 disminuyendo el crecimiento vegetativo y la capacidad fotosintética de la planta por lo tanto el potencial de rendimiento también podría reducirse Gómez Aguilar 2016 El principal fertilizante nitrogenado utilizado en la producción de cultivos es la urea que es de origen químico y de alto costo Una opción para la sustitución de este producto como nutrición nitrogenada es la incorporación de biofertilizantes elaborados a base de microorganismos como lo son las bacterias fijadoras de nitrógeno Castañeda et al 2021 Una alternativa muy útil podría ser la bacteria Methylobacterium symbioticum quien produce enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera y con los azúcares que obtiene de la planta fija el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana produciendo nitrógeno en niveles efectivos y controlados de manera que sean asimilables para las plantas Santana et al 2017 En la actualidad es poca la información e investigación generada sobre el uso de los microorganismos captadores de nitrógeno atmosférico Santana et al 2017 específicamente de la bacteria Methylobacterium symbioticum y más aún en el cultivo de 5 quinua por lo que se desconocen los resultados que se podrían obtener en el crecimiento y en el rendimiento al ser aplicada en dicho cultivo El presente proyecto se ubica en el Segundo Objetivo de Desarrollo Sostenible declarado por la Organización de las Naciones Unidas ODS 2 denominado Hambre cero debido a que contribuye al incremento del rendimiento de la quinua procurando la soberanía alimentaria En lo que respecta al Plan Nacional de Desarrollo del Ecuador Creando Oportunidades pertenece al Objetivo 3 del Eje Económico denominado Fomentar la productividad y competitividad en los sectores agrícola industrial acuícola y pesquero bajo el enfoque de la economía circular Secretaria Nacional de Planificación 2021 El proyecto de investigación tiene relación con la línea de investigación de Sistemas Agropecuarios Sostenibles Para la Soberanía Alimentaria de la Universidad Nacional de Loja y se encuentra vinculado a la Sublínea 3 de Investigación de la Carrera de Agronomía denominada Las tecnologías para la producción y posproducción agrícola sostenible Además este trabajo es parte del proyecto de investigación institucional de la Universidad Nacional de Loja denominado Bases fisiológicas del uso de la radiación solar y el nitrógeno en genotipos de quinua ecuatoriana código 05DIFARNR2021 El objetivo general del proyecto de investigación es Evaluar el crecimiento y rendimiento de la quinua usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno Por su parte se consideraron los siguientes objetivos específicos Describir el crecimiento de la quinua usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno Determinar el efecto de Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno sobre el rendimiento de la quinua 6 4 Marco teórico 41 Cultivo de quinua 411 Importancia cultural y producción La quinua es originaria de la región de Suramérica García Plazas 2018 cultivada desde los años 2000 aC de manera principal en Perú Bolivia Ecuador y Colombia caracterizada por las comunidades ancestrales como símbolo de cultura religiosidad y abundancia Andrews 2017 Por muchos años ha sido un eslabón en el fortalecimiento de la agricultura familiar y campesina ya que aporta a la seguridad soberanía y autonomía alimentaria de los territorios García Plazas 2018 Se tienen datos de que Ecuador tiene una producción de 1296 toneladas mientras que otros datos señalan que Perú y Bolivia presentan conjuntamente al mercado unas 80 mil toneladas Vargas et al 2019 Las zonas de producción de quinua en Ecuador se encuentran en las provincias de Carchi Imbabura Pichincha Cotopaxi Tungurahua y Chimborazo con un rendimiento promedio de 30 quintales por hectárea Calvache Valle 2021 En su mayoría la quinua es sembrada por el agricultor pequeño 1 ha y mediano 1 a 5 ha en suelos con bajos contenidos de nutrientes y comúnmente sin recibir fertilización Esta falta de manejo adecuado de la fertilidad de los suelos y la nutrición del cultivo se constituye en uno de los factores críticos para los bajos rendimientos observados considerando que se reportan respuestas significativas en el rendimiento del cultivo frente a la fertilización nitrogenada fosforada y potásica en suelos con deficiencias de estos nutrientes Alvarado Cartagena 2017 7 412 Taxonomía La clasificación taxonómica de la quinua se indica en la Tabla 1 Tabla 1 Clasificación taxonómica de la Quinua según Apaza 2014 Taxonomía Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Caryophyllales Familia Amaranthaceae Subfamilia Chenopodioideae Tribu Chenopodieae Género Chenopodium Especie Chenopodium quinoa Willd 413 Fenología Se describen las etapas fenológicas Tabla 2 con una escala estandarizada para la quinua basada en el sistema de codificación de la BBCH descrita por Sosa et al 2017 8 Tabla 2 Etapas fenológicas de la escala BBCH en quinua según Sosa et al 2017 Etapas Fenológicas Características Inicio Días después de la Siembra DDS 0 Germinación Hinchado de semilla y germinado 3 5 V1 Fase cotiledonar Emergencia de la planta sobre el suelo 3 10 V2 2 hojas verdaderas Inicio del periodo vegetativo se presenta un rápido desarrollo radicular 10 20 V3 5 hojas alternas Estado vegetativo temprano sensible a la competencia con malezas 35 45 V413 hojas alternas Se presenta importante ramificación 45 50 V5 Pre floración desarrollo el botón floral Pueden distinguirse inflorescencias laxas o glomeruladas 55 70 V6 Floración Inicia la floración en la parte superior de la inflorescencia y continúa hasta la base Etapa sensible al granizo sequía helada y enfermedades 90 130 50 de flores V7 Inicio de llenado de granopastoso Los granos están todavía suaves y húmedos 50 humedad etapa sensible al granizo sequía heladas y enfermedades 100 130 V8 Llenado de grano pastoso El color específico de la variedad se desarrolla y los granos están más secos 25 humedad 130 160 V9 Madurez fisiológica Se observan granos duros y secos 15 humedad 130 180 414 Condiciones edafoclimáticas a Altitud y suelo La quinua puede cultivarse desde los 500 msnm hasta los 3500 msnm Gómez Aguilar 2016 La quinua puede crecer en un rango amplio de diferentes tipos de suelos siendo los más óptimos los de buen drenaje o francos semi profundo y con un alto contenido de materia orgánica Se debe evitar suelos con problemas de anegamiento o inundación porque dificultan el establecimiento inicial del cultivo y luego a lo largo del ciclo 9 propician la podredumbre radicular Otro factor que influye muy fuertemente es el pH la quinua prospera muy bien en un rango de pH de 55 a 78 Gómez Aguilar 2016 b Humedad La humedad relativa apta para la quinua varía dependiendo la variedad a cultivar donde de manera general se puede desarrollarse desde 40 a 100 Mujica 2001 c Temperatura Las temperaturas óptimas de crecimiento y desarrollo dependiendo de las variedades están en el rango de 15 C a 25ºC Puede tolerar las heladas y temperaturas altas durante las fases de desarrollo vegetativo al igual que puede controlar la formación o no formación de la inflorescencia esto lo puede realizar desde la floración hasta el estado de grano Gómez Aguilar 2016 d Precipitación La quinua se cultiva dentro de un rango de precipitación de 300 mm a 1000 mm Se considera que el rango de precipitación óptima es de 500 mm a 800 mm Gómez Aguilar 2016 415 Requerimientos nutricionales La quinua es una planta exigente en nutrientes necesita sobre todo macroelementos como el oxígeno carbono hidrógeno nitrógeno fósforo potasio calcio magnesio y azufre También necesita pequeñas cantidades de microelementos como hierro boro zinc cobre sodio molibdeno cloro cobalto y sílice Gómez Aguilar 2016 por ello requiere un buen abono y fertilización Las dosis a utilizar dependerán de la riqueza y contenido de nutrientes de los suelos donde se instalará la quinua de la rotación utilizada y también del nivel de producción que se desea obtener Aracena Bitancor 2018 La falta de incentivos conocimiento y formulación de programas agroecológicos entre otros factores han llevado a la comunidad a un mal manejo de la fertilización química estos aspectos están causando daño ambiental e importantes pérdidas económicas Gutierrez et al 2018 416 Importancia del nitrógeno en el crecimiento y rendimiento 10 El nitrógeno es un elemento importante para la quinua debido a que incrementa el crecimiento vegetativo y la capacidad fotosintética de la planta es decir determina el número de hojas el número de semillas por inflorescencia y por lo tanto determina el potencial de rendimiento Una importante cantidad del nitrógeno absorbido por la planta llega a los granos a la madurez y contribuye a la cantidad de proteína Gómez Aguilar 2016 La quinua requiere un importante aporte de nitrógeno para incrementar el rendimiento y calidad del grano Kakabouki et al 2018 Es así que el nitrógeno es un elemento limitante para los cultivos ya que su nivel de disponibilidad es bajo y ante el insuficiente nitrógeno disponible habrá cantidades mínimas de clorofila disminuyendo crecimiento rendimiento y producción de cultivos Ariza et al 2020 42 Fertilización 421 Fertilización química Los fertilizantes químicos son productos de origen inorgánico que contienen por los menos un elemento químico que la planta necesita para su ciclo de vida La urea es el fertilizante nitrogenado sólido de origen químico con mayor concentración de nitrógeno 46 Aracena Bitancor 2018 En sí se tienen las siguientes fuentes de fertilizantes químicos que generalmente se aplican a los cultivos convencionales de quinua a Fuente nitrogenada Urea con 46 de nitrógeno Fosfato diamónico que tiene aproximadamente 18 de nitrógeno Nitrato de calcio que provee 155 de nitrógeno y 265 de calcio b Fuente de fósforo Fosfato diamónico que proporcionará 46 de fósforo Fosfato simple de calcio que tiene 24 de fósforo y 85 de calcio Fosfato triple de calcio con 46 de fósforo y 10 de calcio c Fuente de potasio Sulfato de potasio con 50 de potasio y 18 de azufre Nitrato de potasio con 13 de nitrógeno y 44 de potasio Gómez Aguilar 2016 11 422 Biofertilización Una opción agroecológica para la nutrición de los cultivos es la incorporación de biofertilizantes elaborados a base de microorganismos como hongos y bacterias útiles para el crecimiento protección fitosanitaria rendimiento y mejoramiento de la fertilidad del suelo propuestos como alternativa la reducción de fertilizantes químicos sintéticos en los cultivos mediante una combinación con biofertilizantes para optimizar la eficiencia de uso de nutrientes contenidos en los fertilizantes químicos sintéticos y el suelo Castañeda et al 2021 Para mejorar la disponibilidad del nitrógeno se emplean microorganismos fijadores de nitrógeno dentro de los que se distinguen dos grupos los microorganismos simbióticos y los de tipo asimbiótico Los simbióticos fijan nitrógeno en asociación con plantas estos microrganismos llamados rizobios colonizan y forman nódulos en las raíces de las plantas donde el nitrógeno gaseoso se reduce a amonio Por otra parte los microorganismos de tipo asimbióticos o de vida libre proporcionan al medio compuestos nitrogenados como amonio aprovechados por los vegetales Ariza et al 2020 423 Bacterias como biofertilizantes Los mecanismos directos ocurren cuando las bacterias sintetizan metabolitos que facilitan a las plantas o bien cuando estas incrementan la disponibilidad de diferentes elementos nutritivos requeridos para su metabolismo y para mejorar su proceso de nutrición Moreno et al 2018 Entre los mecanismos directos destacan la fijación de nitrógeno la síntesis de fitohormonas vitaminas y enzimas la solubilización de fósforo inorgánico y la mineralización de fosfato orgánico la oxidación de sulfuros el incremento en la permeabilidad de la raíz la producción de nitritos la acumulación de nitratos la reducción de la toxicidad por metales pesados y de la actividad de la enzima ACC desaminasa la secreción de sideróforos la reducción de los niveles de etileno en los suelos y el incremento de la permeabilidad de las raíces Moreno et al 2018 424 Bacterias fijadoras de nitrógeno Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo para desarrollar su fertilidad y aumentar el contenido del nitrógeno en las condiciones medioambientales adecuados Las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera y con los azúcares que obtienen 12 de la planta fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana si las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno pasan a la planta y tienen la capacidad de absorber niveles elevados de proteína en las plantas Santana et al 2017 Algunas bacterias que contribuyen a la fijación de nitrógeno al incremento de la toma de nutrientes a la síntesis y fijación de fitohormonas pueden estar vinculadas con el desarrollo vegetal y se les considera en el grupo de bacterias promotoras de crecimiento Medina et al 2019 425 Methylobacterium simbyoticum como fijadora de nitrógeno Methylobacterium symbioticum es una especie de bacteria fijadora de nitrógeno única A diferencia de otras especies ya conocidas es endófita es decir vive dentro de la planta Su hábitat preferido es la hoja en concreto en el interior de las células fotosintéticas en las zonas más próximas al cloroplasto donde se alimenta principalmente de metanol un producto de desecho de la fotosíntesis Esta característica le confiere una ventaja competitiva respecto a sus colegas que habitan en el suelo puesto que Methylobacterium symbioticum desarrolla su actividad en un ambiente de baja competencia sin apenas gasto energético para la planta BlueN 2021 Aplicada de manera foliar Methylobacterium symbioticum se introduce en la planta a través de las estomas de las hojas y penetra hasta el interior de las células fotosintéticas situándose en las zonas más próximas al cloroplasto Esta característica única permite a Methylobacterium symbioticum Colonizar eficazmente la planta Coloniza la planta estableciéndose en un ambiente de baja competencia y resguardado frente a amenazas externas Intensificar la fotosíntesis Capaz de intensificar la fotosíntesis gracias a unas vesículas llamadas cromóforos que tienen la propiedad de reflejar la luz hacia el cloroplasto Activar la fijación biológica de nitrógeno Utiliza elementos de desecho de la planta y los excedentes derivados de la fotosíntesis potenciada para activar la fijación biológica de nitrógeno BlueN 2021 Methylobacterium symbioticum captura el nitrógeno N2 del aire y lo convierte en amonio NH4 mediante el complejo nitrogenasa por el cual se consigue separar los dos átomos de N2 y reducirlo de manera constante en NH4 El amonio reducido se metaboliza ya directamente en la planta en forma del aminoácido glutamina gracias a la acción de las 13 enzimas glutamina sintetasa y glutamato sintasa GSGOGAT La planta puede activar y detener la nitrogenasa en función de su posibilidad para metabolizar el amonio proporcionando a la planta la capacidad de obtener nitrógeno durante todo el ciclo del cultivo y minimizar los daños por exceso o carencia de nitrógeno BlueN 2021 43 Antecedentes No se encontraron investigaciones ni información de la aplicación de Methylobacterium symbioticum en quinua pero sí sobre la utilización de otros microorganismos Cabe recalcar que sí hay trabajos de investigación en la que se aplica la bacteria pero es empleada en otros cultivos Según Choque 2017 el abonamiento con estiércol descompuesto más la inoculación de las cepas fijadoras de nitrógeno el cultivo de quinua en La Paz Bolivia dieron lugar a mejores resultados en variables agronómicas como altura de planta altura de panoja diámetro de panoja y aumentaron significativamente el rendimiento En la investigación realizada en Perú por León et al 2021 se obtuvo un mayor rendimiento de quinua con el empleo del producto comercial Microorganismos Eficaces seguido por el tratamiento con la aplicación de Trichoderma sp mientras que el menor rendimiento se registró con el tratamiento testigo León et al 2019 en su trabajo realizado en Cochabamba Bolivia obtuvo un crecimiento y rendimiento significativamente superior en las plantas de quinua con las bacterias nativas del género Bacillus en comparación al producto comercial TRICOBAL Equiza 2021 en su trabajo de investigación realizada en España aplicando Methylobacterium simbioticum no observo ningún efecto positivo en plantas de borraja y acelga frente al tratamiento testigo Marchetti 2022 en su investigación realizada en Bragança Portugal aplicando Methylobacterium simbioticum al cultivo de lechuga obtuvo mayores resultados en cuanto a materia seca área foliar y lecturas spad frente a la fertilización nitrogenada Nitrato 27 y el tratamiento testigo 14 5 Metodología 51 Localización del estudio El presente proyecto se realizó en la Quinta Experimental Docente La Argelia QEDA de la Universidad Nacional de Loja ubicada en el barrio la Argelia parroquia Punzara cantón Loja de la provincia de Loja con coordenadas geográficas 402192S 7912006W y a una altitud de 2 150 msnm Figura 1 la temperatura promedio es de 18 C la precipitación anual es de 1 058 mm y posee un suelo franco limoso con pH de 45 a 6 Villavicencio 2021 Fig 1Ubicación de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua Villavicencio 2021 52 Metodología general 521 Tipo de investigación y alcance El tipo de investigación fue experimental debido a que se implementó un diseño experimental con tratamientos y variables a medir Además fue de tipo cuantitativa debido a que las mediciones realizadas arrojaron datos numéricos que fueron analizados mediante métodos estadísticos Tuvo un alcance explicativocausal puesto que se describió la respuesta de cada una de las variables de los tratamientos de manera univariada 15 522 Diseño experimental Se usó un diseño completamente al azar DCA con arreglo unifactorial con 5 tratamientos y 3 repeticiones con un total de 15 parcelas Los tratamientos incluyeron un testigo la aplicación de Methylobacterium 3 107 UFCg en 1 y 2 momentos la aplicación de nitrógeno ureico N en 2 momentos y la aplicación combinada de nitrógeno Methylobacterium en 2 momentos Tabla 3 La aplicación de la urea se la realizó al voleo mientras que para el caso de Methylobacterium se usó el fertilizante comercial Blue N fabricado por la empresa Symborg Anexo 9 que contiene 3 107 UFCg de Methylobacterium en una dosis de 70 g ha1 la aplicación se realizó de manera foliar Anexo 4 y en las primeras horas de la mañana cuando los estomas estaban completamente abiertos de manera que penetrara en las hojas de la planta a través de ellos hacia las hojas y se instalaran principalmente en las células fotosintéticas Tabla 3 Tratamientos con el factor fertilización y momento de aplicación de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua Tratamientos Momento de aplicación Repeticiones 1 Testigo 3 2 N corregido V4 V6 3 3 Methylobacterium en 1 momentos V4 3 4 Methylobacterium en 2 momentos V4 V6 3 5 Mitad de N corregido Methylobacterium en 2 momentos V4 V6 3 Las parcelas experimentales tuvieron un área de 4 m2 2 m 2 m con una distancia de separación entre parcelas de 1 m Anexo 1 En total el área experimental fue de 112 m2 como se lo muestra en la Figura 2 16 Fig 2Esquema del DCA de la investigación del uso de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua 523 Modelo matemático Se utilizó el siguiente modelo matemático Yij µ Ʈi Ɛij En donde i es el número de tratamientos j es el número de repeticiones Yij es la jésima observación del iésimo tratamiento µ es la media general común a todos los tratamientos Ʈi es el efecto fijo del tratamiento i Ɛij es una variable aleatoria normal error independientemente distribuida con esperanza 0 y varianza ơ2 que representa la variabilidad 524 Manejo del cultivo En el terrero se realizó un análisis de suelo para realizar la respectiva corrección de macro y micronutrientes se tomaron 4 submuestras en zigzag a una profundidad aproximada de 02 a 03 m se mezclaron todas para posteriormente utilizar 1 kg para su análisis químico en el laboratorio La corrección de nutrientes del suelo se realizó con base en la necesidad del cultivo según Sosa et al 2017 debido a que la quinua necesita gran cantidad de N el cual es uno de los elementos de mayor importancia para poder realizar su producción Además 17 según el análisis de suelo el mismo se encontró en muy bajas cantidades de N Dado que el N se volatiliza por lo cual para el T2 se realizaron dos aplicaciones de 30 gparcela y para el T5 dos aplicaciones de 15 gparcela esto a los 60 dds días después de la siembra durante el desarrollo de partes vegetativas cosechables etapa 4 y en la fase de antesis etapa 6 esto según las etapas fenológicas de la escala BBCH descritos por Sosa et al 2017 para que no carezca del mismo La fórmula utilizada para determinar la dosis de N fue Dosis de N Demanda del cultivo Aporte del suelo Para preparar el terreno se usó el arado y la rastra posteriormente se procedió a delimitar las unidades experimentales La siembra se la realizó a chorro en hileras con la variedad INIAP Tunkahuan Se realizó la aplicación del producto químico HELCORE Anexo 8 cuyo ingrediente activo es el Difenoconazole para combatir la enfermedad fungosa provocada por el mildiú Peronospora variabilis En cuanto al riego se lo realizó cuando existió escasez de lluvias Anexo 2 mediante aspersión El control de malezas se lo hizo de manera manual cuando se lo requería 53Metodología para el primer objetivo específico Describir el crecimiento de la quinua usando Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno Para las variables altura de la planta diámetro de tallo número de hojas y número de ramas la toma de datos se realizó a partir de la etapa 4 de la escala BBCH del cultivo de quinua establecida por Sosa et al 2017 para su medición se tomaron las mismas plantas que fueron 5 de las hileras centrales de cada unidad experimental con una frecuencia de 15 días llegando con estas mismas plantas hasta la etapa de cosecha para determinar los indicadores de rendimiento Por otro lado para las variables índice SPAD y biomasa aérea se tomaron las mismas plantas que fueron 2 de los surcos centrales se evaluaron en cuatro momentos durante la fenología del cultivo 60 dds durante el desarrollo de partes vegetativas cosechables etapa 4 que fue cuando se aplicaron los tratamientos el segundo durante la aparición de inflorescencias etapa 5 el tercero en las fases de antesis etapa 6 y finalmente durante la madurez filológica etapa 8 esto según las etapas fenológicas de la escala BBCH descritos por Sosa et al 2017 Altura de la planta 18 Se tomó la longitud del tallo en cm tomando como referencia desde el cuello de la planta hasta el ápice terminal Diámetro del tallo Se midió el diámetro del tallo en mm utilizando un calibrador Vernier Se midió a una altura de 5 cm del nivel del suelo Número de hojas Mediante observación directa se contó el número de hojas por planta Número de ramas Mediante la manipulación directa se contaron las ramas de las plantas Cobertura del área foliar Se estimó la cobertura del área foliar del cultivo tomando fotografías con un teléfono inteligente con la aplicación llamada CANOPEO la misma que dio el dato en forma de porcentaje esto se realizó a cada unidad experimental con una frecuencia de 15 días Índice SPAD Se seleccionaron 5 hojas totalmente expandidas en el tercio medio superior de la planta a las cuales se les realizaron 3 mediciones evitando el contacto con su nervadura y se sacó un promedio con el clorofilómetro SPAD Minolta502 Índice de área foliar IAF Se seleccionaron 5 hojas totalmente expandidas en el tercio medio superior de la planta y en el laboratorio en donde se registró el área foliar de todas plantas muestreadas con el medidor de Área Foliar Cl202 Anexo 6 a partir de las áreas determinadas se realizó un promedio y se consideró la distancia entre hileras y plantas como superficie Esto se realizó en la etapa 8 del cultivo según las etapas fenológicas de la escala BBCH descritos por Sosa et al 2017 Con los datos obtenidos del área foliar además de considerar la distancia entre hileras y plantas como superficie se calculó el índice de área foliar IAF 19 IAF Á𝑟𝑒𝑎 𝑓𝑜𝑙𝑖𝑎𝑟 𝑆𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑎 54 Metodología para el segundo objetivo específico Determinar el efecto de Methylobacterium symbioticum como fuente fijadora de nitrógeno sobre el rendimiento de la quinua Se utilizaron las mismas plantas empleadas para las variables altura de la planta diámetro de tallo número de hojas y número de ramas En la época de cosecha se determinaron los siguientes indicadores Número de granos por planta Se contó el número de granos obtenidos por planta Número de granos por m2 Ya determinado el número de granos por planta se multiplicó el número de granos por planta por el número de plantas por m2 Peso de 1000 granos Se determinó eligiendo al azar una muestra representativa de 100 granos del total de granos cosechados en las plantas se llevaron las muestras a horno a 65 C por tres días luego se los pesó llevándolos a la balanza digital Posteriormente se aplicó una regla de 3 para calcular el peso de 1 000 granos en relación con los 100 granos ya pesados Rendimiento R Ya obtenidos los componentes del rendimiento de la quinua se determinó el rendimiento aplicando la siguiente fórmula 𝑹 𝑁𝐺 𝑚2 𝑃𝐺 Donde 𝑅 rendimiento 𝑁𝐺 𝑚2 número de granos por metro cuadrado 𝑃𝐺 peso de grano Índice de cosecha El índice de cosecha se determinó mediante la relación rendimiento del grano y peso total de la planta biomasa aérea total por ende se aplicó la siguiente fórmula 20 IC 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜 𝑔𝑚2 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎é𝑟𝑒𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑔𝑚2 55 Análisis estadístico Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa INFOSTAT versión libre los cuales fueron sometidos a un análisis de varianza ANAVA unifactorial en función de los tratamientos y comparaciones múltiples Primeramente se comprobaron los supuestos después se utilizó el test de Tukey con un nivel de significancia del 5 en donde se determinó el grado estadístico de significancia de las variables 21 6 Resultados 61 Variables de Crecimiento Altura de la planta En la variable altura de la planta cm se encontró diferencias estadísticamente significativas a los 84 DDS pvalor de 00267 en donde la mayor media la presenta Methylobacterium simbioticum aplicados en 2 momentos Ms 2 De igual manera a los 99 y 129 DDS se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos p valor de 00028 y 00164 respectivamente donde los tratamientos Urea y UreaMs presentan las mayores medias Figura 3 Fig 3 Altura de plantascm las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante diferentes días después de la siembra DDS Líneas cobre las barras indican el error estándar medio Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 Diámetro del tallo En el diámetro del tallo mm se encontraron diferencias estadísticamente significativas a partir de los 114 DDS pvalor de 00111 siendo los tratamientos Urea y UreaMs quienes tienen una mayor media A los 129 DDS también se tienen diferencias estadísticamente significativas pvalor de 00224 el tratamiento con urea B B B AB AB AB B B B A AB AB AB A A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 84 99 129 Altura de plantas cm DDS Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms 22 tiene mayor media de diámetro de tallo Figura 4 Fig 4Diámetro del tallomm de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum en 2 momentos Urea Ms durante los 114 y 129 días después de la siembra DDS Líneas cobre las barras indican el error estándar medio Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 Número de hojas Existieron diferencias estadísticamente significativas a los 129 DDS pvalor de 00439 entre los tratamientos en donde la mayor media la presentó el tratamiento UreaMs con 849 hojas por plantas Figura 5 Fig 5Número de hojas de las plantas de quinua bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum B B A A AB AB AB AB A A 0 2 4 6 8 10 12 114 129 Diametro de tallo mm DDS Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms B AB AB AB A 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 129 Número de hojas Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms 23 en 2 momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 Número de ramas En el número de ramas no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos durante todo ciclo del cultivo Figura 6 Al final del ensayo el número de ramas por planta varió entre 342 y 408 Fig 6Número de ramas de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteriunm simbioticum en dos momentos Urea Ms durante los 129 días después de la siembra DDS Cobertura del área foliar En la cobertura foliar realizada con CANOPEO no se encontraron diferencias estadísticamente significativas Figura 7 entre los tratamientos Al final del ensayo la cobertura del área foliar fue de promedio 724 4 9 14 19 24 29 34 39 69 84 99 114 129 Número de ramas DDS Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms 24 Fig 7 Cobertura de Área Foliar de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms 2 a los 69 84 99 114 y 129 días después de la siembra DDS Índice SPAD En cuanto al índice SPAD Figura 8 se observaron diferencias significativas solamente en la etapa 6 del cultivo pvalor de 00049 siendo el tratamiento UreaMs 2 el que presentó una mayor media con 50 unidades SPAD Fig 8 Índice SPAD de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms durante la etapa 6 fase de antesis del cultivo de quinua según 20 30 40 50 60 70 69 84 99 114 129 Cobertura de área foliar DDS Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms B B AB AB A 0 10 20 30 40 50 60 6 Indice SPAD ETAPA Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms 25 la escala BBCH de Sosa et al 2017 Letras diferentes en cada tiempo indican diferencias estadísticas con p 005 Índice de Área Foliar IAF En el IAF realizado en la etapa 8 del cultivo no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos Tabla 4 Tabla 4Índice de Área Foliar IAF de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la etapa 8 del cultivo de quinua según la escala BBCH de Sosa et al 2017 Tratamiento Media Error estándar medio Ms 1 004 001 Ms 2 004 001 Urea Ms 004 001 Urea 003 001 Testigo 003 001 62 Variables de Rendimiento Número de granos por planta En la variable de número de granos por planta no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos Tabla 5 Tabla 5 Número de granos por planta bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la cosecha Tratamiento Media Error estándar medio Urea 1413368 123382 Ms 1 1147156 123382 Ms 2 1042874 123382 Urea Ms 1040252 123382 Testigo 843803 123382 Número de granos por m2 No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la variable de número 26 de granos por m2 entre los tratamientos Tabla 6 Tabla 6 Número de granos por m2 de las plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms en la cosecha Tratamiento Media Error estándar medio Urea 28267358 2467636 Ms 1 22943123 2467636 Ms 2 20857471 2467636 Urea Ms 20805038 2467636 Testigo 16876049 2467636 Peso de 1000 granos En cuanto al peso de 1000 granos Figura 9 se tiene diferencias estadísticamente significativas pvalor de 00498 siendo el tratamiento UreaMs 323g el que presentó la mayor media 27g Fig 9 Peso de 1000 granos de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha Rendimiento R No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la variable rendimiento de las plantas Tabla 7 B AB AB AB A 0 05 1 15 2 25 3 35 4 Peso de 1000 granos g Testigo Urea Ms 1 Ms 2 Urea Ms 27 Tabla 7 Rendimiento de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha Medias con una letra común no son significativativamente diferentes p005 Tratamiento Media gm2 Error estándar medio Urea 7888 6942 Urea Ms 675 6942 Ms 1 65357 6942 Ms 2 62535 6942 Testigo 45565 6942 Índice de cosecha En el índice de cosecha no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos Tabla 8 Tabla 8 Índice de cosecha de plantas bajo los tratamientos Testigo Urea en 2 momentos Methylobacterium simbioticum en 1 momento Ms 1 Methylobacterium simbioticum en 2 momentos Ms 2 y Mitad de Urea Methylobacteirum Simbioticum en dos momentos Urea Ms en la cosecha Tratamiento Media g Error estándar medio Ms 1 032 388 Ms 2 031 388 Urea 031 388 Urea Ms 028 388 Testigo 026 388 28 7 Discusión En este estudio se evaluó la influencia de la bacteria nitrificadora Methylobacterium symbioticum en el crecimiento y rendimiento de la quinua Se observó un efecto significativo de la aplicación de Methylobacterium symbioticum en el cultivo de quinua en las variables altura de la planta diámetro de tallo número de hojas índice SPAD y peso de 1000 granos Sin embargo el número de ramas por planta cobertura del área foliar índice de área foliar número de granos por planta número de granos por m2 rendimiento e índice de cosecha no fueron afectados por la aplicación de esta bacteria Según Van Dommelent 2003 las bacterias como Azospirillum influyen positivamente en el crecimiento de las plantas el rendimiento de los cultivos y el contenido de N de la planta este efecto estimulante de las plantas se ha atribuido a la fijación biológica de N2 Al igual que otras especies de bacterias como P polymyxa P macerans P durus sinónimos Paenibacillus azotofixans Bacillus azotofixans Clostridium durum P peoriae P borealis P brasilensis P graminis y P odorifer se consideran importantes para la agricultura ya que influyen directamente en el crecimiento Coelho et al 2003 En la variable de altura de las plantas se tuvo una mayor media 15611 cm con la aplicación combinada de Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms resultado que es superior a los demás tratamientos Estos resultados difieren de los resultados obtenidos por Alcón 2018 pues en su investigación realizada en Bolivia en el cultivo de quinua en un suelo franco arenoso obtuvo una mayor altura de planta 10096 cm con el tratamiento de Urea frente al tratamiento orgánico estiércol de Ovis aries Además manifiesta que el tener mejores resultados en el cultivo de quinua con la urea es debido a que la misma es rica en nitrógeno y es de fácil solubilidad para la planta aun en condiciones de baja humedad mientras que la materia orgánica y la actividad microbiana necesita una humedad adecuada en el suelo para que la planta realice la asimilación de nutrientes lo que se ve afectada tanto por sequía como por las elevadas temperaturas La aplicación de microorganismos parece influir de manera positiva sobre el crecimiento de la quinua Estos resultados concuerdan con la investigación realizada por León 2019 en la que al cultivo de quinua en Bolivia se le aplicaron bacterias endófitas como lo son Bacillus pumilus y Paenibacillus polymyxa las cuales influyeron positivamente en la altura de la planta obteniéndose la mayor altura de 104138 cm 29 En el diámetro de tallo las mayores medias fueron de los tratamientos Urea 993 mm y por el tratamiento Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum 94 mm Estos resultados son similares a los presentados por Torres et al 2020 en Perú en el cultivo de quinua en la cual observó que el mayor diámetro de tallo fue el tratamiento en el cual se combinó Materia Orgánica Microorganismo Trichoderma harzianum Azospirillum brasilense Azotobacter chrococcum Lactobacillus acidophilus y Saccharomyces cerevisae 105 mm Valores que contrastan con los obtenidos por Quispe 2014 quien reportó en Bolivia en un suelo heterogéneo suelo arcilloso limoso y franco arenoso un valor mínimo 28 mm en el tratamiento Testigo y un máximo valor de 52 mm en el tratamiento que aplicó conjuntamente abonamiento orgánico y la cepa BBAP001 Pseudomona En cuanto al número de hojas no se obtuvo diferencias estadísticamente significativas hasta los 129 DDS en la cual sobresalió el tratamiento Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms con un promedio de 880 hojas por planta respectivamente Estos resultados contrastan con el estudio de García et al 2017 quien obtuvo diferencias significativas P005 en el número de hojas de cultivo de quinua en donde tratamientos T2 fertilizante químico y T3 fertilizante orgánico mostraron un incremento del follaje en el día 72 alcanzando un promedio de hojas de 855 y 1125 respectivamente de manera contraria el tratamiento con menor número de hojas el T0 testigo Castellanos et al 2021 manifiestaron en su trabajo que el alto índice de área foliar generada por elevadas cantidades de fertilizantes aplicadas a una planta no necesariamente indica el obtener una mayor productividad puesto que las plantas altas podrían tener mayor número de hojas pero un bajo índice de cosecha Además enfatiza la importancia de la aplicación de fuentes nitrogenadas pues influyen directamente en la división celular aumentando el área foliar ya que las hojas son órganos productores de carbono que exportan asimilados hacia los tejidos vertederos como semillas En el índice SPAD se obtuvo diferencias estadísticamente significativas en la antesis etapa 6 del cultivo en donde el mayor promedio fue el del tratamiento Mitad de Urea Methylobacterium Simbioticum Urea Ms García et al 2017 en su estudio en el cultivo de quinua presentó diferencias estadísticamente significativas en las cuatro etapas fenológicas hojas verdaderas ramificación antesis y llenado de grano de la 30 planta donde fue mayor estadísticamente el T2 fertilizante químico debido a que el contenido de clorofila está estrechamente relacionada con la condición nutricional de la misma principalmente cuando los contenidos de nitrógeno disponible aumentan sin embargo se evidencia una reducción de clorofila en la etapa de antesis para todos los tratamientos esto por el proceso de llenado de grano En el rendimiento no se encontraron diferencias estadísticamente significativas obteniendo un valor máximo con el tratamiento de Urea 789 kgha y el valor mínimo con el tratamiento Testigo 456 kgha Estos rendimientos fueron bajos y contrastan con lo obtenido por Quispe 2014 quien aplicando la cepa bacteriana BBAP001 Pseudomona tuvo un rendimiento de 2120 kgha mientras que al aplicar la cepa BBAR001 Rhizobia obtuvo un rendimiento de 1897 kgha De igual manera los resultados de este estudio contrastan con lo obtenido por Choque 2017 que en Bolivia sí obtuvo diferencias estadísticamente significativas aplicando solamente cepas de bacterias fijadoras de nitrógeno reportó 40175 kgha Además con la aplicación combinada de abonamiento estiércol de ovino y cepas de bacterias fijadoras de nitrógeno presento el mayor rendimiento llegando a 50018 kgha mientras que el menor valor fue el del tratamiento testigo con 28949 kgha Las bacterias al igual que otros microorganismos fijadores de N2 son capaces de expresar la enzima nitrogenasa siendo una oxidorreductasa que catalizan reacciones de tipo óxidoreducción específicamente la reducción de nitrógeno molecular y que son de especial importancia para las plantas ya que efectúan en ellas el proceso de fijación de nitrógeno convirtiéndolo en amoniaco fácilmente asimilable Castellanos Abril 2007 El nitrógeno es un elemento importante debido a que incrementa el crecimiento vegetativo y la capacidad fotosintética de la planta y por lo tanto determina el potencial de rendimiento Gómez Aguilar 2016 En el estudio de deficiencia de N en las plantas de quinua realizado por Alfonso et al2017 obtuvo que la deficiencia del mismo inicia con una clorosis en las hojas viejas para luego avanzar a las hojas jóvenes hasta que la planta presenta una clorosis general el crecimiento de la planta se redujo además de presentar un tallo más delgado de lo normal y el rendimiento disminuye En este trabajo se ha observado que la aplicación de nitrógeno urea en interacción con bacterias fijadoras de nitrógeno como lo es Methylobacterium symbioticum pueden contribuir a una mejor 31 eficiencia del nitrógeno mejorando el crecimiento y las variables productivas de la quinua en Loja Este manejo podría ser un manejo alternativo al cultivo de quinua 32 8 Conclusiones Methylobacterium symbioticum tuvo efectos positivos en el crecimiento altura diámetro de tallo número de hojas índice SPAD del cultivo de quinua dado que la aplicación de la bacteria tiene resultados similares e incluso superiores a el tratamiento químico urea y al testigo Por lo tanto el fertilizante químico urea podría ser reemplazado por Methylobacterium symbioticum y una alternativa de uso en la producción agroecológica Methylobacterium symbioticum no afectó significativamente el rendimiento obteniéndose 6513 kgha en promedio bajo las condiciones de Loja sin embargo el uso de esta bacteria afectó positivamente al peso de mil granos de quinua que fue superior al testigo 33 9 Recomendaciones Realizar trabajos de investigación con diferentes momentos y dosis de aplicación de Methylobacrium symbioticum para determinar el momento exacto a aplicar y dosis adecuada y se aproveche de mejor manera Hacer estudios de diferentes especies de microorganismos fijadores de N2 aplicados en el cultivo de quinua de manera que elimine el uso de fertilizantes químicos y realizarlo de una manera más saludable como lo es la agroecología 34 10 Bibliografía Alcón G Flores A 2018 EVALUACIÓN DE LAS VARIABLES AGRONÓMICAS DE LA QUINUA Chenopodium quinoa Willd Y CALIDAD DE GRANO CON APLICACIÓN DE NIVELES DE ESTIÉRCOL OVINO Y UREA Revista de Investigación e Innovación Agropecuaria y de Recursos Naturales 5 3746 Alfonso G Alvarado Ochoa S Cartagena Y 2017 Evaluación de deficiencias nutricionales en el cultivo de quinua Chenopodium quinoa Willd bajo invernadero Siembra 41 93109 httpsdoiorg1029166siembrav4i1504 Alvarado S Cartagena Y 2017 Evaluación de deficiencias nutricionales en el cultivo de quinua Chenopodium quinoa Willd bajo invernadero Revista Siembra 41 93109 httpsdoiorg1029166siembrav4i1504 Andrews D 2017 Race Status and Biodiversity The Social Climbing of Quinoa Culture Agriculture Food and Environment 391 1524 httpsdoiorg101111cuag12084 Apaza J 2014 Caracterización y variabilidad de progenies s3 autofecundadas procedentes de cruzas simples genéticamente distantes y cercanas en seis cultivares de quinua Chenopodium Quinoa Willd Tesis Ingeniero Agrónomo Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa Repositorio institucional Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa Aracena G Bitancor M 2018 Evaluación de cuatro fertilizantes en la producción de quinua Revista INTA 5 Ariza S González O López J 2020 Evaluación de fijadores biológicos de nitrógeno libres sobre el crecimiento de gramíneas en suelo degradado Revista Colombiana de Biotecnología 221 8797 35 httpsdoiorg1015446revcolombbiotev22n178019 BlueN 2021 La nueva forma de aportar nitrógeno a los cultivos Methylobacterium symbioticum BlueN Technology 6 Calvache M Valle L 2021 Índice de cosecha con macronutrientes en grano de quinua Chenopodium quinoa Willd Revista Alfa 513 1528 httpsdoiorg1033996revistaalfav5i1395 Castañeda E Vásquez M Martínez G Robles C Lozano S Villegas Y 2021 Valoración sustitutiva de biofertilizantes en el cultivo de maíz en cinco regiones del Estado de Oxaca Revista Mexicana de Agroecosistemas 8 11 Choque R 2017 Influencia de tres bacterias fijadoras de nitrógeno con y sin abonamiento en suelos degradados en el cultivo de quinua Chenopodium quinoa Willd en la Estación Experimental de Patacamaya Tesis Ingeniero Agrónomo Universidad Mayor de San Andrés Repositorio institucional Universidad Mayor de San Andrés Coelho M R R von der Weid I Zahner V Seldin L 2003 Characterization of nitrogenfixing Paenibacillus species by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism analysis of part of genes encoding 16S rRNA and 23S rRNA and by multilocus enzyme electrophoresis FEMS Microbiology Letters 2222 243250 httpsdoiorg101016S0378109703003008 Equiza I 2021 Optimización de nutrición nitrogenada en hortícolas de hoja crecidas en sistema de hidroponía pura NGS Uso de inoculantes microbianos Tesis Ingeniero Agrolimentario y del Medio Rural Universidad Pública de Navarra Repositorio institucional Universidad Pública de Navarra httpsacademica eunavarraesbitstreamhandle245440369120733TFGequizapdfsequence1 isAllowedy 36 García M García J Melo D Deaquiz Y 2017 RESPUESTA AGRONÓMICA DE LA QUINUA Chenopodium quinoa Willd VARIEDAD DULCE DE SORACÁ A LA FERTILIZACIÓN EN VENTAQUEMADABOYACA Granja Victoria 6677 García M Plazas N 2018 La quinua Chenopodium quinoa Willd en los sistemas de producción agraria Revista Producción Limpia 131 112119 httpsdoiorg1022507pmlv13n1a6 Gómez L Aguilar E 2016 Guía de cultivo de la quinua 2 Edición Universidad Nacional Agraria La Molina Gutierrez J Felipez J Navia M Ortuño N 2018 Selección de bacterias fijadoras de nitrógeno en plantas de Chenopodium quinoa Willd Quinua Revista de Agricultura 8 Kakabouki I Hela D Roussis I Papastylianou P Sestras A Bilalis D 2018 Influence of fertilization and soil tillage on nitrogen uptake and utilization efficiency of quinoa crop Chenopodium quinoa Willd Journal of Soil Science and Plant Nutrition ahead 2 httpsdoiorg104067S0718 95162018005000901 Leon B Mendoza P Soto J Borja Y 2021 Trichoderma sp Endófito y microorganismos eficaces en el control de kcona kcona Eurysacca sp y mejora del rendimiento de Chenopodium quinoa Revista Alfa 514 346355 httpsdoiorg1033996revistaalfav5i14122 León M Mancilla J Ortuño F 2019 Evaluación de bacterias endófitas promotoras de crecimiento en el cultivo de quinua Evaluation of endophytic growth promoting bacteria in quinoa cultivation Journal of the Selva Andina Biosph 72 12 37 MAG 2021 Boletín situacionalCultivo de quinua Gobierno del Ecuador 7 Marchetti J 2022 EFEITO DE MICRORGANISMOS FIXADORES DE NITROGÊNIO QUE HABITAM A FILOSFERA NA NUTRIÇÃO DA ALFACE Tesis Maestría en Agroecología Instituto Politécnico de Bragança Repositorio institucional Instituto Politécnico de Bragança Medina M Ceja L López S Venegas J Sánchez C 2019 Efecto de Methylobacterium extorquens en el desarrollo del tomate en presencia o ausencia de Fusarium oxysporum Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 107 1469 1479 httpsdoiorg1029312remexcav10i7644 Moreno A García Mendoza V Reyes J Vásquez J Cano P 2018 Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal Una alternativa de biofertilización para la agricultura sustentable Revista Colombiana de Biotecnología 201 6883 httpsdoiorg1015446revcolombbiotev20n173707 Mujica A 2001 mayo 25 Orígenes e historia International Year of Quinoa 2013 httpswwwfaoorgquinoa2013whatisquinoaoriginand historyesnomobile1 Quispe A 2014 USO DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO CON DIFERENTES NIVELES DE ABONAMIENTO ORGÁNICO EN EL CULTIVO DE QUINUA Chenopodium quinoa Willd COMUNIDAD VILLA PATARANI ALTIPLANO CENTRAL Tesis Ingeniero Agrónomo Universidad Mayor de San Andrés Repositorio institucional Universidad Mayor de San Andrés httpsrepositorioumsaboxmluibitstreamhandle1234567895574T 1999pdfsequence1isAllowedy Santana D Colina E Castro C Cadena D Sotomayor A Galarza E López M 2017 Microorganismos fijadores de nitrógeno y su acción complementaria a la 38 fertilización química en el cultivos de Coffea arabica L European Scientific Journal 133 12 httpsdoiorg1019044esj2016v13n3p211 Secretaria Nacional de Planificación 2021 Plan de Creación de Oportunidades 2021 2025 de Ecuador Observatorio Regional de Planificación para el Desarrollo Sosa V Brito V Fuentes F Steinfort U 2017 Phenological growth stages of quinoa Chenopodium quinoa based on the BBCH scale Annals of Applied Biology 8 httpsdoiorgdoi101111aab12358 Torres Y Vásquez W Ramírez J 2020 Efecto de tres dosis de materia orgánica con la inoculación de microorganismos mejoradores del suelo en el rendimiento del cultivo de quinua Chenopodium quinoaWill variedad Pasankalla en centro poblado de Huanchac IndependenciaAncash Aporte Santiaguino 1181129 httpsdoiorg1032911as2020v13n2738 Van Dommelen A Keijers V Wollebrants A Vanderleyden J 2003 Phenotypic Changes Resulting from Distinct Point Mutations in the Azospirillum brasilense glnA Gene Encoding Glutamine Synthetase Applied and Environmental Microbiology 699 56995701 httpsdoiorg101128AEM6995699 57012003 Vargas P Arteaga R Cruz L 2019 Análisis bibliográfico sobre el potencial nutricional de la quinua Chenopodium quinoa como alimento funcional Revista Centro Azúcar 464 12 39 11 Anexos Anexo 1 Delimitación de las parcelas Anexo 2 Instalación de sistema de riego por aspersión 40 Anexo 3 Cultivo en etapa vegetativo Anexo 4 Aplicación foliar de Methylobacterium Anexo 5 Toma de muestras para llevar a laboratorio 41 Anexo 6 Medición de Área Foliar con el medidor Cl202 Anexo 7 Peso de biomasa 42 Anexo 8Producto químico HELCORE con ingrediente activo Difenoconazole para combatir la enfermedad fungosa provocada por el mildiú Peronospora variabilis Anexo 9 Producto comercial BlueN que contiene la bacteria Methyñobscterium symbioticum 43 Anexo 10 Certificado de traducción CarlosDavidValarezoRamos Methylobacterium and Its Role in Health CareAssociated Infection Julia Kovaleva John E Degener Henny C van der Mei Department of Medical Microbiology and Infection Control University of Groningen University Medical Center Groningen Groningen The Netherlandsa Department of Biomedical Engineering University of Groningen University Medical Center Groningen Groningen The Netherlandsb Methylobacterium species are a cause of health careassociated infection including infections in immunocompromised hosts The ability of Methylobacterium species to form biofilms and to develop resistance to high temperatures drying and disinfecting agents may explain the colonization of Methylobacterium in the hospital environment in eg endoscopes Due to its slow growth it can be easily missed during microbiological surveillance of endoscope reprocessing The purpose of this minireview is to present an overview of documented infections and crosscontaminations with Methylobacterium related to endoscopic procedures and to illustrate the health careassociated relevance of this slowgrowing bacterium Methylobacterium species are fastidious Gramnegative bacilli which have been reported to be opportunistic pathogens in immunocompromised patients These species form pinkpigmented colonies on agar plates and have been frequently isolated from tap water in hospitals The ability to form biofilms and to develop tolerance to disinfecting agents high temperatures and drying may explain the frequent occurrence and colonization of Methylobacterium in the hospital environment Here we review the microbiology and health careassociated relevance of this slowgrowing bacterium with particular attention to biofilm formation in medical devices and transmission of Methylobacterium during endoscopic procedures MICROBIOLOGY LABORATORY IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY The genus Methylobacterium of the family Methylobacteriaceae class Alphaproteobacteria was described as a new genus of facultative methylotrophic bacteria by Patt et al in 1976 1 This genus including the first Methylobacterium organophilum and 3 species from the Pseudomonas genus eg Pseudomonas mesophilica Pseudomonas radiora and Pseudomonas rhodos currently consists of 49 different species httpwwwbacterionetmethylobacteriumhtml last accessed 20 December 2013 Methylobacterium spp are commonly isolated from various natural environments ie leaf surfaces soil dust and fresh water 2 3 Methylobacterium spp are strictly aerobic facultatively methylotrophic fastidious slowgrowing bacteria They form small 1 to 2 mm in diameter pinkpigmented colonies on ordinary solid media such as tripticase soy agar sheep blood agar nutrient agar and MuellerHinton agar and on plate count agar and R2A agar two media used for plate count analysis in drinking water 4 Optimum growth occurs between 25 and 30C after 5 to 7 days of incubation with moderate growth at 35C and no growth at 42C 46 The best growth was observed on Sabouraud dextrose agar and buffered charcoal yeast extract agar The species grow as Gramnegative or gramvariable pleomorphic nonsporeforming vacuolated rodshaped cells and have one polar flagellum 2 Methylobacterium spp are nonfermenting βgalactosidase and nitrate reductasenegative and trypsin and ureasepositive bacteria and are resistant to desferrioxamine 7 These biochemical tests are helpful to differentiate methylobacteria from other aerobically growing Gramnegative bacteria which form pinkpigmented colonies on blood agar ie Serratia Azospirillum Roseomonas and Asaia Methylobacterium spp were reported to be catalase and oxidase positive 1 but were oxidase negative in tests with the dimethylparaphenylenediamine reagent 2 Identification of Methylobacterium is performed using commercially available manualidentification test strips 8 9 However determination to the species level by these systems can be difficult 16S rRNA gene sequence analysis can differentiate Methylobacterium isolates to the species level with pairwise similarity of 16S rRNA gene sequences of between 97 and 996 10 11 Recent developments in mass spectrometry MS have shed light on rapid and precise identification of Methylobacterium spp Tani et al 10 applied the wholecell matrixassisted laser desorption ionizationtime of flight MALDI mass spectrometry WCMS technique to identify Methylobacterium spp collected from plant samples A total of 213 Methylobacterium isolates were analyzed with WCMS using MALDI Biotyper software Bruker Daltonics and this identification was confirmed by 16S rRNA gene sequencing The WCMS technique demonstrated high effectiveness in the identification of known and novel species of Methylobacterium Methylobacterium spp are susceptible to amikacin gentamicin ciprofloxacin and trimethoprimsulfamethoxazole and have various levels of susceptibility to the βlactam antibiotics due to βlactamase production with high sensitivity to ceftriaxone ceftizoxime and imipenem 6 8 12 Discordant carbapenem susceptibilities with high sensitivity to imipenem MIC 025 to 1 mgliter and resistance to meropenem MIC 32 mgliter seem to be a distinctive feature of Methylobacterium spp 13 HEALTH CAREASSOCIATED TRANSMISSION OF METHYLOBACTERIUM Members of the genus Methylobacterium are major inhabitants of aqueous environments including potable water supplies and hospital tap water 4 Transmission of Methylobacterium spp in the hospital environment has been related to contaminated tap water Published ahead of print 15 January 2014 Editor G V Doern Address correspondence to Julia Kovaleva jkovalevaumcgnl Copyright 2014 American Society for Microbiology All Rights Reserved doi101128JCM0356113 May 2014 Volume 52 Number 5 Journal of Clinical Microbiology p 13171321 jcmasmorg 1317 These species have also been isolated from water in dental and blood bank purification units 14 15 and from endoscopes and automated endoscope reprocessors AERs which are probably contaminated by the use of nonsterile water for rinsing 1618 High resistance to dehydration chlorination and elevated tem peratures and slow growth and the ability to form biofilms can explain the frequent occurrence and colonization of Methylobac terium in the hospital environment 12 18 19 Since methylo bacteria have been isolated from tap water in hospital units Hor nei et al 5 suggested monitoring water for the occurrence of methylobacteria in hospital units in which immunocompromised patients are admitted Despite low virulence Methylobacterium is able to cause colo nization and infections in immunocompromised patients 3 8 Methylobacterium mesophilicum Methylobacterium zatmanii and Methylobacterium extorquens are the three most commonly re ported species isolated from normally sterile body sites ie blood liquor cerebrospinalis bone marrow synovia and ascitic and peritoneal fluids 3 5 An underlying state of immunosuppres sion including that corresponding to solid or hematologic malig nancy organ transplant renal failure HIV infection tuberculosis or alcoholism may predispose subjects to a systemic infection caused by methylobacteria 3 8 In general Methylobacterium spp cause mild clinical symptoms such as fever but severe infec tions including bloodstream infections peritonitis and pneumo nia have also been reported 3 8 Central catheter infections are the most common portal of infection in these situations Most reported Methylobacterium infections have been nosoco mial Two cases of bloodstream infections due to M mesophilica were attributed to tap water used for oral irrigation for patients with mucositis as a complication after bone marrow transplanta tion 20 Contaminated preservative fluid used for bone marrow harvesting was a possible source of Methylobacterium bacteremia in a patient receiving hematopoietic stem cell transplantation 21 A patient receiving continuous ambulatory peritoneal dial ysis developed recurrent peritonitis due to M mesophilicum which was also isolated from contaminated stagnant water in the bathroom 22 Several Methylobacterium infections in immuno compromised patients have been associated with environmental exposure ingestion of raw vegetables gardening swimming in a river and exposure to soil leaves and flowers 3 just before development of infection ENDOSCOPE REPROCESSING AND METHYLOBACTERIUM TRANSMISSION RELATED TO ENDOSCOPIC PROCEDURES Contaminated endoscopes are medical devices frequently associ ated with outbreaks of health careassociated infections 19 23 These instruments are difficult to disinfect and easy to damage because of their complex design with multiple internal channels and narrow lumina Most flexible endoscopes belong to semicriti cal devices which come into contact with mucous membranes during use and may be either sterilized or disinfected Flexible endoscopes for therapeutic procedures ie bronchoscopy and gastrointestinal endoscopic procedures used in sterile body cav ities are classified as critical devices and require sterilization after each procedure Due to their material composition most flexible endoscopes cannot be steam sterilized but tolerate ethylene oxide and hydrogen peroxide plasma sterilization Accurate reprocessing of flexible endoscopes involves cleaning and highlevel disinfection followed by rinsing with bacterium free water and drying before storage 19 Glutaraldehyde and peracetic acid are disinfecting agents frequently used for decon tamination of flexible endoscopes They are active against viruses fungi mycobacteria and all vegetative bacteria including Methy lobacterium However resistance of M mesophilicum to 2 glu taraldehyde has been reported 24 A recent study demonstrated high efficacy of 1 peracetic acid against M extorquens in the planktonic state but the disinfectant was less efficient in biofilms 18 According to Furuhata and Koike 25 70 70100 of exam ined samples from chlorinated drinking water were positive for Methylobacterium spp and 25 to 93 of methylobacterial strains isolated from tap water were highly resistant to chlorine and survived contact at 01 mgliter concentration of free residual chlorine for 5 min 11 25 Accurate endoscope drying is crucial whereas a humid envi ronment facilitates microbial growth during storage 19 The final drying steps greatly reduce the risk posed by remaining pathogens as well as the possibility of recontamination of the endoscope by waterborne microorganisms such as Pseudomonas spp Acinetobacter spp and Methylobacterium spp 19 23 Members of the genus Methylobacterium have been reported to be highly resistant to dehydration and high temperatures 18 Hence they can survive in endoscope channels during inadequate or insufficient drying resulting in recontamination of endo scopes Methylobacterium outbreaks after endoscopic procedures have been related to contaminated tap water 6 24 AERs containing biofilm 16 and contaminated endoscope channels 17 18 Crosscontaminations with Methylobacterium in 7 patients during bronchoscopy have despite the usual disinfection proce dure been related to contamination by tap water of endoscope channels 6 Growth of pinkpigmented bacteria later identified as M mesophilicum was observed in mycological surveillance cul tures of samples obtained from a bronchoscope which was used for a diagnostic procedure in a patient with an atypical pneumo nia Growth of Methylobacterium was discovered as a consequence of the extended incubation time for fungal culture In the next 3 months M mesophilicum was isolated from 6 other patients after bronchoscopy Cultures obtained from bronchoscopes biopsy forceps AERs tubing glutaraldehyde disinfectant and environ mental samples from the bronchoscopy unit were negative for this bacterium M mesophilicum was isolated from tap water collected from the sink faucet in the bronchoscopy room It was considered a colonizer because none of the patients developed a postbroncho scopy infection from this organism Crosscontaminations with bronchoscopyassociated Methy lobacterium in 18 patients have been documented by Kressel and Kidd 16 M mesophilicum and Mycobacterium chelonae were isolated from deep respiratory specimens obtained from venti lated patients during bronchoscopy None of the patients mani fested postendoscopic infection with this bacterium M mesophi licum grew in the cultures obtained from AERs and from 2 glutaraldehyde used during the automated disinfection procedure and did not grow from bronchoscopes tap water or unopened glutaraldehyde containers or from the containers used for collect ing the clinical samples The presence of M mesophilicum biofilm on the tubing from one of the AERs was confirmed Contaminated endoscope disinfectors were replaced by new AERs that use per acetic acid instead of glutaraldehyde for disinfection procedures Minireview 1318 jcmasmorg Journal of Clinical Microbiology Nosocomial M mesophilicum transmission was related to con taminated 2 glutaraldehyde solution used to manually disinfect the bronchoscopes 24 Environmental cultures from the AER bronchoscopes gastroscopes and brushes were positive for this pinkpigmentforming bacterium The procedure of reprocessing endoscopes was investigated and showed no shortcomings in technique Endoscopes were sent for ethylene oxide sterilization but M mesophilicum from endoscope channels was identified again 2 months later The water supply was assumed to be the source of contamination and a submicron filter was installed to get filtered tap water for rinsing of endoscopes after cleaning and disinfection procedures After disinfection and sterilization of the reprocessing equipment subsequent cultures were negative for 4 months M mesophilicum caused no infections in patients after endoscopic procedures with contaminated bronchoscopes Repeated contaminations of flexible bronchoscopes with Methylobacterium spp have been detected at the University Med ical Center Groningen UMCG Groningen The Netherlands 18 Growth of the bacterium later identified as M extorquens was accidentally observed on Sabouraud dextrose agar used for culturing of surveillance samples from endoscopes Because of the slow growth and unclear significance of this bacterium it was necessary to prolong the incubation time for 7 days to recover these bacteria from the surveillance samples Cultures were posi tive for Methylobacterium from 2009 to 2011 from endoscope channels particularly from bronchoscopes Methylobacterium was also isolated from bronchoalveolar lavage fluid samples from the patients after bronchoscopy We considered Methylobacte rium to be a contaminating nonpathogen causing the coloniza tion because no patient manifested true infection with this bac terium The procedures of endoscope reprocessing revealed no recurrence Environmental cultures from the endoscopy unit in cluding AERs and rinsing water were negative for Methylobacte rium Biofilm formation inside bronchoscope channels was sus pected Strains of M extorquens isolated from the contaminated flexible bronchoscope were investigated for the ability to form biofilms and the effects of peracetic acid disinfection and drying on M extorquens biofilm formation were studied see the section discussing the impact of biofilm formation by Methylobacterium below To date only one case of Methylobacterium bacteremia in a patient following endoscopy has been published 17 A 77year old patient with biliary lithiasis underwent a biliary sphincterot omy and implantation of a prosthesis in the biliary tract via endo scopic retrograde cholangiopancreatography The prosthesis was removed by means of an endoscopic procedure 10 days later The next day the patient developed fever and after 5 days bacterial growth was detected in one aerobic blood culture bottle M meso philicum was isolated from a positive blood culture and the de termination was confirmed by 16S rRNA gene sequencing The procedures of peraceticacidbased decontamination and endo scope washer maintenance appeared to be effective because no recurrence of Methylobacterium was seen Water samples obtained for culture from the tap water points in the endoscopy room and from the AER before and after rinsing were negative The inner endoscope channels were found to be the source of contamination with M mesophilicum The endoscope was sent to the manufac turer for replacement of the inner channel sheath IMPACT OF BIOFILM FORMATION BY METHYLOBACTERIUM A biofilm is an assemblage of microbial cells that is attached to a surface and enclosed in a matrix of exopolymeric substances 26 Biofilms may form on different surfaces including medical de vices water supply systems or endoscope channels 16 18 26 They are extremely difficult to remove and allow microorganisms to survive under conditions of drying and chemical and antibiotic exposure Settlement of biofilmproducing species inside endo scope channels can result in failure of the endoscope reprocessing and is an important factor in the pathogenesis of endoscopyre lated infections 19 23 The reduced sensitivity of bacteria to disinfectants within a biofilm can be explained by poor penetra tion of a disinfectant into the underlying cells chemical interac tion between the biofilm itself and the disinfectant and the low growth rate and nutrient limitation of microorganisms in biofilms 27 The presence of biofilm on the tubing from one of the AERs with growth of M mesophilicum was the source of an outbreak described in patients following bronchoscopy 16 Also biofilm formation inside endoscope channels was suspected to be the cause of repeated crosscontaminations of flexible bronchoscopes with M extorquens at the UMCG 18 Mimicking biofilm forma tion in an in vitro study M extorquens isolated from a contami nated bronchoscope was tested in 96well microtiter plates 18 In this model the effects of the 1 peracetic acid disinfectant 10 min incubation at 25C without and with the additional drying 2 h at 50C followed by 7 days drying at room temperature on M extorquens biofilm formation were studied to imitate the proce dures used for reprocessing of flexible endoscopes M extorquens had a strong biofilmproducing ability with the highest biofilm amount and the maximum metabolic activity after 7 days incubation in R2A broth 18 The use of 1 peracetic acid disinfectant caused a marked inhibition of M extorquens growth in 2 5 and 7day biofilms directly after treatment Regrowth of M extorquens biofilms occurred following 7 days of incubation with R2A broth directly after the disinfection procedure Re growth of M extorquens biofilms was observed in wells after dis infection when the drying procedure was skipped No biofilm regrowth was observed after a drying procedure This study dem onstrated insufficient efficacy of the peracetic acid against M ex torquens biofilms and high efficacy of the drying procedure after the disinfection step against Methylobacterium in biofilms According to the literature Methylobacterium has a strong bio filmproducing ability 2830 Simões et al 29 tested the effects of sodium hypochlorite liquid bleach on the activity and cultur ability of Methylobacterium biofilms Methylobacterium biofilms recovered their mass activity and culturability after 1 h of treat ment with 001 sodium hypochlorite a concentration of only 01 completely inactivated this bacterium in biofilms after 1 h of incubation Methylobacterium in biofilms survived after contact with other cleaning agents including 1 benzalkonium chloride for 24 h 28 The strains demonstrated a high tolerance to drying Ten days after drying the reduction in the survival of Methylobac terium was less than 1 log Some strains of Methylobacterium in biofilms survived and exhibited a potential to grow after 4 weeks of desiccation without any nutrients CONCLUSION Methylobacterium spp are fastidious microorganisms that have been described as a cause of crosscontaminations related to en Minireview May 2014 Volume 52 Number 5 jcmasmorg 1319 doscopes and reprocessing equipment and have been reported as a cause of infections in immunocompromised patients Due to its slow growth the bacterium can be easily missed during surveil lance of endoscope reprocessing The ability to form biofilms and to exhibit tolerance to cleaning and disinfecting agents and to high temperatures and drying is probably the cause of their predomi nance in the hospital environment particularly in tap water and endoscope channels REFERENCES 1 Patt TE Cole GC Hanson RS 1976 Methylobacterium a new genus of facultatively methylotrophic bacteria Int J Syst Bacteriol 26226229 httpdxdoiorg10109900207713262226 2 Vaneechoutte M Dijkshoorn L Nemec A Kämpfer P Wauters G 2011 Acinetobacter Chryseobacterium Moraxella and other nonfermen tative Gramnegative rods p 729731 In Versalovic J Carroll KC Jor gensen JH Funke G Landry ML Warnock DW ed Manual of clinical microbiology10th ed vol 1 ASM Press Washington DC 3 Sanders JW Martin JW Hooke M Hooke J 2000 Methylobacterium mesophilicum infection case report and literature review of an unusual opportunistic pathogen Clin Infect Dis 30936938 httpdxdoiorg 101086313815 4 Rice EW Reasoner DJ Johnson CH DeMaria LA 2000 Monitoring for methylobacteria in water systems J Clin Microbiol 3842964297 5 Hornei B Lüneberg E SchmidtRotte H Maass M Weber K Heits F Frosch M Solbach W 1999 Systemic infection of an immunocompro mised patient with Methylobacterium zatmanii J Clin Microbiol 37 248250 6 Flournoy DJ Petrone RL Voth DW 1992 A pseudooutbreak of Methy lobacterium mesophilica isolated from patients undergoing bronchoscopy Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11240243 httpdxdoiorg101007 BF02098087 7 Vaneechoutte M Wauters G 2011 Approaches to the identification of aerobic Gramnegative bacteria p 544549 In Versalovic J Carroll KC Jorgensen JH Funke G Landry ML Warnock DW ed Manual of Clin ical Microbiology10th ed vol 1 ASM Press Washington DC 8 Lai CC Cheng A Liu WL Tan CK Huang YT Chung KP Lee MR Hsueh 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httpdxdoiorg101111j134804212006tb03765x 13 Zaharatos GJ Dascal A Miller MA 2001 Discordant carbapenem sus ceptibility in Methylobacterium species and its application as a method for phenotypic identification J Clin Microbiol 3920372038 httpdxdoi org101128JCM395203720382001 14 Barbeau J Tanguay R Faucher E Avezard C Trudel L Cote L Prevost P 1996 Multiparametric analysis of waterline contamination in dental units Appl Environ Microbiol 6239543959 15 OBrien JR Murphy JM 1993 Identification and growth characteristics of pink pigmented oxidative bacteria Methylobacterium mesophilicum and biovars isolated from chlorinated and raw water supplies Microbios 73215227 16 Kressel AB Kidd F 2001 Pseudooutbreak of Mycobacterium chelonae and Methylobacterium mesophilicum caused by contamination of an auto mated endoscopy washer Infect Control Hosp Epidemiol 22414418 httpdxdoiorg101086501926 17 Imbert G Seccia Y La Scola B 2005 Methylobacterium sp bacteraemia due to a contaminated endoscope J Hosp Infect 61268270 httpdx doiorg101016jjhin200501030 18 Kovaleva J 2013 Microbiological safety in endoscope reprocessing PhD thesis University of Groningen Groningen the Netherlands 19 Kovaleva J Peters FT Van der Mei HC Degener JE 2013 Trans mission of infection by flexible gastrointestinal endoscopy and bron choscopy Clin Microbiol Rev 26231254 httpdxdoiorg101128 CMR0008512 20 Gilchrist MJ Kraft JA Hammond JG Connelly BL Myers MG 1986 Detection of Pseudomonas mesophilica as a source of nosocomial infec tions in a bone marrow transplant unit J Clin Microbiol 2310521055 21 Brown MA Greene JN Sandin RL Hiemenz JW Sinnott JT 1996 Methylobacterium bacteremia after infusion of contaminated autologous bone marrow Clin Infect Dis 2311911192 httpdxdoiorg101093 clinids2351191 22 Rutherford PC Narkowicz JE Wood CJ Peel MM 1988 Peritonitis caused by Pseudomonas mesophilica in a patient undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis J Clin Microbiol 2624412443 23 Kovaleva J Meessen NE Peters 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httpdxdoiorg101264jsme2ME12146 29 Simões LC Simões M Vieira MJ 2009 Susceptibility of drinking water biofilm bacteria to sodium hypochlorite p 124125 In Eurobiofilms 2009 book of abstracts httprepositoriumsdumuminhoptbitstream 182296071EUROBIOFILMS2009AbstractSimoes5B15Dpdf 30 Simões LC Simões M Vieira MJ 2010 Adhesion and biofilm formation on polystyrene by drinking waterisolated bacteria Antonie Van Leeu wenhoek 98317319 httpdxdoiorg101007s1048201094442 Minireview 1320 jcmasmorg Journal of Clinical Microbiology Julia Kovaleva is a clinical microbiologist finishing her training at the Department of Medical Microbiology and Infection Control at the University Medical Center Groningen UMCG Groningen The Netherlands She obtained her MSc degree in Medical Science at the Volgograd State Medical University Russia in 2000 followed by a PhD degree in Clinical Pharmacology in 2004 In 2008 she received her second masters degree in Medical Science from the Ghent University Belgium and started her specialization in Clinical Microbiology at the UMCG Following 4 years of residency she received a second PhD in Medical Science at the University of Groningen in 2013 Her PhD thesis was called Microbiological safety in endoscope reprocessing Her research is focused on microbiological surveillance of endoscope reprocessing development of postendoscopic in fection and the impact of biofilm on endoscopes Her research has been presented at the 19th 20th and 22th European Congress of Clinical Micro biology and Infectious Diseases and the 3M European Infection Prevention Expert Conference where she was an invited speaker She had authored a book chapter and a number of publications in peerreviewed journals Minireview May 2014 Volume 52 Number 5 jcmasmorg 1321 Methylobacterium symbioticum Applied as a Foliar Inoculant Was Little Effective in Enhancing Nitrogen Fixation and Lettuce Dry Matter Yield Autora principal Arrobas Margarida Data de Publicação 2024 Outros Autores Correia Carlos M Rodrigues MA Tipo de documento Artigo Idioma eng Título da fonte Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal Repositórios Cientìficos Texto Completo httphdlhandlenet1019830048 Resumo Nitrogen N is a limiting ecological factor for plant growth in most agroecosystems Biological N fixation especially from nodulated legumes has been promoted in recent decades as an alternative or complement to industrially synthesized N fertilizers The possibility of utilizing Nfixing organisms from the phyllosphere that demonstrate effectiveness across a wide range of crops is particularly exciting In this study we examined the Nfixing capacity and the impact on lettuce growth of an inoculant recently introduced to the market which contains the microorganism Methylobacterium symbioticum and is recommended for various cultivated species A pot experiment was conducted using a factorial design which included the inoculant No and Yes and four N rates 0 N0 25 N25 50 N50 and 100 N100 kg ha1 of N with four replicates over four lettuce growing cycles The inoculant had a significant effect on dry matter yield DMY only during the second of the four growing cycles The mean values of the four growing cycles ranged from 99 to 137 g pot1 and 99 to 126 g kg1 in pots that received and did not receive the inoculant respectively On the other hand plants exhibited a robust response to N applied to the soil showing significant increases in both DMY and tissue N concentration across all growing cycles Mean values of DMY in the treatments N0 and N100 ranged from 56 to 89 g pot1 and 125 to 161 g pot1 respectively N concentration in tissues varied inversely with DMY indicating a concentrationdilution effect The difference in N concentration between treated and untreated plants used as an estimate of fixed N was very low for each of the soils applied N rates assuming average values for the four growing cycles of 15 09 24 and 63 kg ha1 for N0 N25 N50 and N100 respectively This study emphasized the low amount of N supplied to lettuce by the inoculant and its limited effect on DMY Generally in biological systems with Nfixing microorganisms achieving high fixation rates requires a high level of specificity between the microorganism and host plant a condition that seems not to have been met with lettuce Considering the importance of the subject is imperative that further studies be conducted to determine more precisely in which crops and under what growing conditions the inoculant proves to be a valuable input for farmers and an effective method for reducing N mineral fertilization Metadados do item PORTADA UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DR JACOBO BUCARAM ORTIZ CARRERA DE INGENIERÍA EN AGRONOMÍA EVALUACIÓN DEL EFECTO DE Methylobacterium symbioticum Y Bradyrhizobium spp EN LA PRODUCTIVIDAD DEL CULTIVO DE ARROZ Oryza sativa TRABAJO EXPERIMENTAL Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención de título INGENIERA AGRÓNOMA AUTORA VELASCO CAPITO MELANIE MICHELLE TUTOR ING BARRETO MACÍAS ARNALDO GUAYAQUIL ECUADOR 2023 2 UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DR JACOBO BUCARAM ORTIZ CARRERA DE INGENIERÍA EN AGRONOMÍA APROBACIÓN DEL TUTOR Yo ARNALDO BARRETO MACÍAS docente de la Universidad Agraria del Ecuador en mi calidad de Tutor certifico que el presente trabajo de titulación EVALUACIÓN DEL EFECTO DE Methylobacterium symbioticum Y Bradyrhizobium spp EN LA PRODUCTIVIDAD DEL CULTIVO DE ARROZ Oryza sativa realizado por la estudiante VELASCO CAPITO MELANIE MICHELLE con cédula de identidad N 0932204217 de la carrera Ingeniería en Agronomía Campus Dr Jacobo Bucaram Ortiz Guayaquil ha sido orientado y revisado durante su ejecución y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador por lo tanto se aprueba la presentación del mismo Atentamente Ing Arnaldo Barreto Macías Guayaquil 22 de marzo del 2023 3 UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DR JACOBO BUCARAM ORTIZ CARRERA DE INGENIERÍA EN AGRONOMÍA APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN Los abajo firmantes docentes designados por el H Consejo Directivo como miembros del Tribunal de Sustentación aprobamos la defensa del trabajo de titulación EVALUACIÓN DEL EFECTO DE Methylobacterium symbioticum Y Bradyrhizobium spp EN LA PRODUCTIVIDAD DEL CULTIVO DE ARROZ Oryza sativa realizado por la estudiante VELASCO CAPITO MELANIE MICHELLE el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador Atentamente Ing Juan Martillo García PRESIDENTE PhD Daniel Mancero Castillo Ing Wilmer Baque Bustamante EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL Ing Arnaldo Barreto Macías EXAMINADOR SUPLENTE Guayaquil 10 de abril del 2023 4 Dedicatoria Este trabajo de investigación es dedicado a Dios ya que me dio fuerzas sabiduría y mucha perseverancia para poder haber culminado exitosamente el trabajo de tesis A mis padres Elsa Capito Tubay y Guillermo Velasco López ya que fueron un gran apoyo incondicional y a la vez por ayudarme en toda mi carrera universitaria ya que con el gran esfuerzo que han hecho cada día los dos he logrado terminar la carrera a la vez agradezco por inculcarme que en los momentos difíciles no hay que rendirse A mi hermana Mildred Velasco Capito que también fue uno de mis pilares fundamentales por siempre brindarme su gran apoyo en los momentos difíciles y por su perseverancia para guiarme cada día Mi hermano Christian Capito Tubay por su apoyo incondicional 5 Agradecimiento Agradezco a mi tutor Ing Marlon Obando Quintanilla por haberme guiado durante el desarrollo de tesis Al Ing Darlyn Amaya por brindarme su ayuda en cuanto a laboratorio Al Ing Freddy Veliz por ser guía fundamental en titulación a la vez por sus recomendaciones de mejoramiento A la vez al Ing Samuel Mora por su ardua ayuda para que el trabajo de investigación se haya implementado en campo y al Ing Billy Sánchez por compartirme sus conocimientos acerca del producto probado en tesis y por su ayuda Agradezco a Daniel Contreras Ronquillo por haberme permitido desarrollar mi trabajo de investigación en su predio sobre todo por haber compartido muy a gusto sus conocimientos en cuanto al cultivo de arroz consejos y gran ayuda junto a sus trabajadores A Anggi Jazmín Anthony agradezco por su amistad apoyo y ayuda ante cualquier situación a lo largo de la carrera en especial a Bryan Cuji por haber estado siempre dispuesto en brindarme su ayuda conocimientos y apoyo en mis últimos años de estudios 6 Autorización de Autoría Intelectual Yo VELASCO CAPITO MELANIE MICHELLE en calidad de autora del proyecto realizado sobre EVALUACIÓN DEL EFECTO DE Methylobacterium symbioticum Y Bradyrhizobium spp EN LA PRODUCTIVIDAD DEL CULTIVO DE ARROZ Oryza sativa para optar el título de INGENIERA AGRÓNOMA por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra con fines estrictamente académicos o de investigación Los derechos que como autora me correspondan con excepción de la presente autorización seguirán vigentes a mi favor de conformidad con lo establecido en los artículos 5 6 8 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento Guayaquil 10 de abril del 2023 Velasco Capito Melanie Michelle CI 0932204217 7 Índice general PORTADA 1 APROBACIÓN DEL TUTOR 2 APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN 3 Dedicatoria 4 Agradecimiento 5 Autorización de Autoría Intelectual 6 Índice general 7 Índice de tablas 13 Índice de figuras 14 Resumen 16 Abstract 17 1 Introducción 18 11 Antecedentes 18 12 Planteamiento y formulación del problema 19 121 Planteamiento del problema 19 122 Formulación del problema 20 13 Justificación del problema 20 14 Delimitación de la investigación 20 15 Objetivo general 21 16 Objetivos específicos 21 17 Hipótesis 21 2 Marco teórico 22 8 21 Estado de arte 22 22 Bases teóricas 23 221 Origen del arroz 23 222 Clasificación taxonómica 23 223 Características botánicas 24 224 Morfología del arroz 24 2241 Raíz 24 2242 Tallo 25 2243 Hojas 25 2244 Panícula 25 2245 Espiguilla 26 2246 Flor 26 2245 Grano 26 225 Requerimientos edafoclimáticos 26 2251 Clima 26 2252 Temperatura 27 226 Variedades del arroz 27 227 Principales labores del cultivo de arroz 27 2271 Preparación del terreno 27 2272 Siembra 28 2273 Fertilización 28 2274 Riego 29 9 2275 Cosecha 29 228 Plagas principales en el cultivo de arroz 29 2281 Mosca minadora del arroz Hydrellia wirthi korytkovski 29 2282 Chinche negro Tibraca limbativentris Stal 30 2283 Novia del arroz Rupela albinella 30 2284 Sogata Tagosodes orizicolus Muir 30 2285 Chicharrita pintada Hortensia similis 30 229 Enfermedades principales en el cultivo de arroz 31 2291 Virus de la hoja blanca 31 2292 Pyriculariosis 31 2293 Mancha marrón de la hoja Bipolaris sp 31 2294 Añublo de la hoja Rhizoctonia solani 32 2295 Carbón de la hoja Eballistra oryzae 32 2210 Bacterias fijadoras de nitrógeno 32 22101 Nitrógeno atmosférico 32 22102 Grupos de organismos 32 2211 Insumos a utilizarse 33 22111 Methylobacterium symbioticum 33 22112 Aplicación de Methylobacterium symbioticum SB23 33 2212 Fijación de nitrógeno atmosférico 34 22121 Fijación biológica 34 2213 Bradyrhizobium japonicum 34 10 23 Marco legal 35 3 Materiales y métodos 37 31 Enfoque de la investigación 37 311 Tipo de investigación 37 3111 Investigación aplicada 37 3112 Investigación de campo 37 3113 Investigación experimental 38 3114 Investigación explicativa 38 32 Metodología 38 321 Variables 38 3211 Variable independiente 38 3212 Variables dependientes 38 32121 Altura de planta cm 38 32122 Longitud de la espiga cm 39 32123 Espigas por plantas 39 32124 Peso de 1000 granos g 39 32125 Número de granos llenos 39 32126 Productividad KgHa 39 32127 Análisis económico 40 322 Tratamientos 40 323 Diseño experimental 40 324 Recolección de datos 42 3241 Recursos 42 11 32411 Material experimental 42 32412 Materiales y herramientas 42 32413 Equipos de oficina 42 32414 Recursos bibliográficos 42 32415 Recursos humanos 43 32416 Recursos económicos 43 3242 Métodos y técnicas 44 32421 Métodos 45 32422 Técnicas 45 325 Análisis estadístico 46 3251 Análisis funcional 46 3252 Hipótesis estadística 46 4 Resultados 47 41 Determinación de la compatibilidad invitro de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum 47 411 Confrontación entre bacterias Methylobacterium symbioticum y Bradyrhizobium japonicum 47 42 Análisis del comportamiento agronómico de cultivo de arroz Oryza sativa con el uso de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum 48 421 Altura de planta a los 15 días cm 48 422 Altura de plantas a los 30 días cm 49 423 Altura de planta a los 45 días 50 424 Longitud de la espiga cm 51 12 425 Espigas por planta 52 426 Números de granos llenos 53 427 Peso de 1000 granos g 54 428 Productividad Kg Ha 55 429 Análisis económico 56 5 Discusión 58 6 Conclusiones 60 7 Recomendaciones 61 8 Bibliografía 62 9 Anexos 67 13 Índice de tablas Tabla 1 Descripción de los tratamientos 40 Tabla 2 Esquema de análisis de varianza ANDEVA 41 Tabla 3 Delimitación experimental 41 Tabla 4 Valoración económica 44 Tabla 5 Altura de planta a los 15 días cm 49 Tabla 6 Altura de planta a los 30 días cm 50 Tabla 7 Altura de planta a los 45 días cm 51 Tabla 8 Longitud de la espiga cm 52 Tabla 9 Espigas por plantas 53 Tabla 10 Número de granos llenos 54 Tabla 11 Peso de 1000 granos 55 Tabla 12 Productividad Kg Ha 56 Tabla 13 Análisis económico 57 14 Índice de figuras Figura 1 Bacteria fijadora de nitrógeno Bradyrhizobium japonicum 48 Figura 2 Área de realización del ensayo 67 Figura 3 Croquis de trabajo experimental 67 Figura 4 Ficha técnica de Bradyrhizobium japonicum 68 Figura 5 Ficha técnica Methylobacterium symbioticum 68 Figura 6 Tabla costos de producción 69 Figura 7 Análisis estadístico de altura de planta a los 15 días 69 Figura 8 Altura de planta a los 15 días 70 Figura 9 Análisis estadístico de altura de planta a los 30 días 70 Figura 10 Altura de planta a los 30 días 71 Figura 11 Análisis estadístico de altura de planta a los 45 días 71 Figura 12 Altura de planta a los 45 días 72 Figura 13 Análisis estadístico de longitud de la espiga cm 72 Figura 14 Longitud de la espiga 73 Figura 15 Análisis estadístico de espigas por plantas 73 Figura 16 Espigas por plantas 74 Figura 17 Análisis estadístico de número de granos llenos 74 Figura 18 Números de granos llenos 75 Figura 19 Análisis de 1000 granos g 75 Figura 20 Peso de 1000 granos g 76 Figura 21 Análisis estadístico de Productividad KgHa 76 Figura 22 Productividad KgHa 77 Figura 23 Delimitación del área experimental 77 Figura 24 Área experimental 78 15 Figura 25 Elaboración de muros 78 Figura 26 Delimitación de bloques para cada tratamiento 79 Figura 27 Trasplante de plántulas de arroz 79 Figura 28 Trasplante de plántulas de arroz 80 Figura 29 Cultivo de arroz trasplantado 80 Figura 30 Arroz 20 días de ser trasplantado 81 Figura 31 Realización de estacas con carteles de cada tratamiento 81 Figura 32 Control manual de malezas 82 Figura 33 Aplicación de bacterias fijadoras de nitrógeno 82 Figura 34 Toma de primeras variables de altura 83 Figura 35 Toma de variables de producción 83 Figura 36 Visita de tutor de tesis 84 Figura 37 Cosecha manual de arroz 84 Figura 38 Elaboración de medio de cultivo agar nutritivo 85 Figura 39 Propagación de bacterias 85 Figura 40 Bacteria Bradyrhizobium sp 86 Figura 41 Methylobacterium symbioticum 86 Figura 42 Realización de confrontación 87 Figura 43 Confrontación mayor crecimiento Bradyrhizobium 87 16 Resumen La agricultura ha ido decreciendo por las malas prácticas agronómicas que se realiza en las diferentes clases de cultivos especialmente el manejo de la fertilización a la vez afecta a los cultivos ya que desapareciendo los nutrientes naturales que posee los suelos el objetivo del trabajo de investigación fue evaluar el efecto de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium spp en la producción del cultivo de arroz Oryza sativa el trabajo experimental se realizó en el sector La Germania Vía Daule provincia del Guayas Se implementó un diseño de bloques completo al azar DBCA dividido entre cuatro tratamientos y cinco repeticiones evaluando el comportamiento agronómico en el cultivo de arroz como Altura de la planta entre 15 30 y 45 días longitud de la espiga número de espigas por planta número de granos llenos peso de 1000 semillas para obtener el rendimiento KgHa y determinar el beneficio costo en cada tratamiento En laboratorio se realizó una confrontación entre las bacterias fijadoras de nitrógeno la bacteria más agresiva fue Bradyrhizobium en cuanto su crecimiento ya que creció de manera eficaz El Tratamiento compuesto por Methylobacterium Bradyrhizobium fue uno de los mejores tratamientos al elevar los promedios de las variables agronómicas del cultivo de arroz en conclusión Methylobacterium SB23 y Bradyrhizobium obtuvieron resultados eficientes tanto en campo y de manera estadística como complemento de la nutrición Palabras claves Bacteria agresiva Bradyrhizobium Confrontación Laboratorio Methylobacterium symbioticum SB23 17 Abstract Agriculture has been decreasing due to poor agronomic practices in the different types of crops especially the management of fertilization at the same time affecting the crops because of the disappearance of natural nutrients in the soil the objective of the research work was to evaluate the effect of Methylobacterium symbioticum SB23 and Bradyrhizobium spp in the production of rice Oryza sativa the experimental work was carried out in the sector La Germania Daule way province of Guayas A randomized complete block design RCBD was implemented divided into four treatments and five replications evaluating the agronomic behavior in the rice crop such as plant height between 15 30 and 45 days spike length number of spikes per plant number of full grains weight of 1000 seeds to obtain the yield KgHa and determine the cost benefit in each treatment In the laboratory a confrontation between nitrogenfixing bacteria was carried out the most aggressive bacterium was Bradyrhizobium in terms of growth since it grew efficiently The treatment composed of Methylobacterium Bradyrhizobium was one of the best treatments by raising the averages of the agronomic variables of the rice crop in conclusion Methylobacterium SB23 and Bradyrhizobium obtained efficient results both in the field and statistically as a complement to nutrition Key words Aggressive bacteria Bradyrhizobium Confrontation Laboratory Methylobacterium symbioticum SB23 18 1 Introducción 11 Antecedentes De acuerdo Ronquillo 2017 en Ecuador el cultivo de arroz Oryza sativa es una de las principales gramíneas mayor cultivadas ya que tiene un rol importante en la economía del país especialmente en la zonas costeras como son las provincias de Guayas y Los Ríos dónde existen grandes extensiones agrícolas del cultivo de arroz se lo siembra en dos ciclos de producción como son en invierno y verano por lo general en las dos estaciones existe un mayor incremento de productividad sin embargo los productores no aplican las buenas prácticas agrícolas con el manejo del cultivo principalmente en la fertilización ya que realizan aplicaciones químicas por lo tanto en ocasiones no colocan las dosificaciones correctas a la vez no dejan descansar al suelo luego de las aplicaciones causando daño al cultivo y al suelo como consecuencia afectando su micro y macro fauna además dejándolo con el pasar de los tiempos infértil El efecto de una nutrición adecuada en el cultivo del arroz es muy práctico ya que además de asegurar una buena cosecha también potencia otros aspectos como por ejemplo una mejor resistencia a plagas y enfermedades por lo tanto las plantas crecerán vigorosas Una fertilización correcta y eficiente promueve el crecimiento de las raíces y las plantas son más resistentes a los efectos nocivos de la sequía Mientras tanto cuanto mayor es la absorción de nutrientes tendrá más desarrollo el sistema radicular de la planta aspecto que beneficia tanto a la oxigenación del suelo y la circulación del correcta del agua en la superficie del suelo 19 12 Planteamiento y formulación del problema 121 Planteamiento del problema Actualmente la producción del cultivo de arroz ha ido decreciendo atributo que se le da al desbalance nutricional por causa de la mala práctica agronómica especialmente en la fertilización debido al mal uso de fertilizantes tanto de síntesis química como sintética que sin duda alguna perjudican las características físicas químicas y biológicas del suelo desapareciendo con su mal uso la macro y micro fauna que son los responsables de la descomposición de la materia orgánica y los que dan la fertilidad a los suelos para poder ser cultivados como consecuencia incrementan los costos de producción en las cosechas Perjudicando a pequeños medianos y grandes productores quienes se dedican a esta actividad Cabe destacar que los agricultores de la zona realizan solamente fertilizaciones químicas que es la manera más tradicional y eficiente al obtener mayor productividad en su efecto contaminan el medio ambiente y deterioran la capa arable del suelo por otro lado también el problema principal es la contaminación del agua por los nitratos ya que posee relevantes consecuencias en el ser humano y el medio ambiente Al limitar el suministro de agua a las poblaciones afectadas en consecuencia son obligadas a disponer de costosos sistemas de depuración generando la eutrofización de las aguas lo que significa contaminación por exceso de nutrientes es decir pérdida de biodiversidad en los ecosistemas Se propuso aplicar dos microorganismos Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum fijadores de nitrógeno atmosférico en las hojas y raíces de las plantas de manera natural lo cual logró incrementar la rentabilidad de la producción sin causar impacto al medio ambiente y manteniendo un equilibrio de los ecosistemas naturales y antrópicos 20 122 Formulación del problema Cómo la aplicación de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum incrementará la producción en el cultivo de arroz 13 Justificación del problema La bacteria fijadora de nitrógeno Methylobacterium symbioticum SB23 es caracterizada por su fuerte capacidad de fijar nitrógeno atmosférico en la planta de manera foliar por lo tanto el nitrógeno es un macronutriente vital para el desarrollo vegetativo de los cultivos a la vez con Bradyrhizobium japonicum que también es encargada de fijar nitrógeno pero directamente a las raíces por consiguiente se incrementará la producción en el cultivo de arroz aplicándolo de forma foliar y edáfica en el sector La Germania Las aplicaciones de fertilizantes orgánicos mejorarán la calidad y el bienestar del agroecosistema del cultivo de arroz las bacterias Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum ayudaron a incrementar la productividad a la vez desarrollaron una agricultura rentable y sostenible manteniendo los tres principios de la agricultura sostenible con una producción económicamente rentable motivando a la sociedad y cuidando del medio ambiente el uso de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum aportarán nitrógeno atmosférico al cultivo de arroz de manera efectiva y controlada a la planta de forma biológica ya que busca reducir el aporte de nitrógeno sintético además de mantener el cuidado y conservación de los suelos para generaciones futuras 14 Delimitación de la investigación Esta investigación se desarrolló en el sector La Germania vía Daule dentro de la provincia del Guayas La extensión del predio donde se desarrolló el trabajo experimental es de media hectárea 21 Espacio Se lo llevó a cabo en la Región Costa provincia Guayas sector La Germania Vía Daule cuyas coordenadas UTM son 2254S 795711O Tiempo La investigación fue de cinco meses aproximadamente octubre febrero Población el presente trabajo de investigación benefició a la Universidad Agraria del Ecuador a la vez a los productores del sector que conocieron acerca de las bacterias fijadoras de nitrógeno Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum 15 Objetivo general Evaluar el efecto de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum en la producción del cultivo de arroz Oryza sativa en el sector La Germania Vía Daule provincia del Guayas 16 Objetivos específicos Analizar el comportamiento agronómico del cultivo de arroz Oryza sativa con el uso de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum Determinar la compatibilidad invitro de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum Establecer la relación beneficiocosto de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum en función a las diferentes dosis aplicadas 17 Hipótesis Una de las dosis aplicadas de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum incrementará la producción del cultivo de arroz Oryza sativa 22 2 Marco teórico 21 Estado de arte Se llevó a cabo un estudio en Perú Lambayeque dónde se aplicó Methylobacterium symbioticum pero en su presentación comercial como BlueN 333 gha en el cultivo de arroz en la variedad Tinajones luego de haber trascurrido 22 días del trasplante se aplicó de manera foliar el producto no tuvo la necesidad de mezclar con otro producto el volumen de aplicación fue de 200 Lha el campo dónde se llevó a cabo el trabajo de investigación se encontraba con una humedad a capacidad de campo con vientos menos de 12 kmh Los rendimientos obtenidos en la zona en estudio estuvieron dentro de los rendimientos promedios de la zona obteniéndose 200 kgha más en la parcela tratada con Methylobacterium symbioticum SB23 a comparación del testigo con una reducción del 48 del nitrógeno de cobertera la parcela tratada con Methylobacterium symbioticum SB23 obtuvo un 87 de grano entero a diferencia de la parcela testigo con un 82 MedinaCeja López Venega y Sánchez 2019 Según Scott 2020 manifestó en su estudio que los cultivares de arroz tratados con Bradyrhizobium japonicum tienen un desarrollo longitudinal considerable de en los primeros 30 días de establecido el cultivo llegando a medir 2568 cm mientras que en los tratamientos testigos donde no se inoculo el microrganismo benéfico obtuvieron un crecimiento de 2450 cm mientras que a los 45 días las medidas de crecimiento del tratamiento de Bradyrhizobium japonicum fue de 3428 cm en los testigos absolutos del estudio obtuvo un crecimiento longitudinal de 3226 cm determinando que la aplicación de Bradyrhizobium japonicum sí ayuda en el desarrollo fenotípico de los cultivares de arroz 23 El estudio realizado sobre la longitud de las guías del cultivo de arroz arrojó resultados significativos Se pudo comprobar que el tratamiento T2 que utilizó Bradyrhizobium japonicum tuvo una longitud de 2670 cm Por otro lado el tratamiento T4 utilizado como control presentó una longitud de 2552 cm Latsague Sáez y Mora 2014 De acuerdo Bacilio y Bernilla 2015 mencionan que el número de granos por espigas obtenidos en los tratamientos inoculados con Bradyrhizobium japonicum tuvo un promedio mayor con 134 granos por espigas mientras que los tratamientos de control tuvieron un numero de granos por espigas promedio de 12340 granos 22 Bases teóricas 221 Origen del arroz Fondo Nacional de Investigaciones Agropecuarias 2006 menciona que el cultivo de arroz Oryza sativa es originario del continente asiático principalmente en sus regiones húmedas este cultivo ha existido aproximadamente 10000 años Pertenece a la familia de las gramíneas además desarrolla un papel importante como alimento básico para la población mundial Paredes Becerra Gepts y Donoso 2021 explica que en la actualidad el arroz es uno de los principales cultivos sembrados a nivel mundial donde también se caracteriza por sus sin números tipos de arroz En Ecuador el cultivo de arroz se lo desarrolla más en las provincias de Guayas y Los Ríos 222 Clasificación taxonómica De acuerdo Degiovanni Berrío y Charry 2017 explican la siguiente taxonomía acerca del arroz Reino Plantae 24 División Magnoliophhyta Clase Liliopsida Subclase Commelinidae Orden Poales Familia Poaceae Subfamilia Ehrhartoideae Tribu Oryzeae Género Oryza Especie Oryza sativa L 223 Características botánicas Arregocés Rosero y Gonzáles 2005 El arroz pertenece a la familia poaceae también conocida normalmente como gramínea es un cultivo anual de tallos redondos huecos están compuestos por nudos y entrenudos por consiguiente sus hojas tienen forma de lámina aplanada unida al tallo por la vaina es decir es una planta monocotiledónea su inflorescencia forma la panícula Los órganos de la planta de arroz se clasifican en dos grupos Órganos vegetativos los conforman las raíces tallos y hojas mientras que los órganos reproductores están conformados por las flores y semillas 224 Morfología del arroz 2241 Raíz Becerra 2007 Las raíces del arroz son delgadas fibrosas y fasciculadas estas se dividen en dos partes la primera son seminales ya que se originan desde la radícula son temporales a diferencia de las raíces adventicias secundarias que 25 tienen libre ramificación desde los nudos inferiores del tallo joven por lo tanto sustituyen a las raíces seminales que son de naturaleza temporal 2242 Tallo Su tallo está conformado por nudos y entrenudos por ende su nudo principal se forma una hoja y yema formando una macolla La yema se ubica entre el nudo y la base de la vaina de la hoja principal En la parte interna del nudo se encuentra el septo que se encarga de separar los dos entrenudos adyacentes en el exterior del tallo carece de vellos absorbentes brillo y color este depende según la variedad La altura de la planta de arroz va dependiendo en cuanto la longitud y números de entrenudos estos son caracteres varietales que son definidos por el medio ambiente por lo tanto podría variar por las condiciones climáticas Olmos 2007 2243 Hojas De acuerdo Ruíz 2011 las hojas del arroz son largas aplanadas y puntiagudas estas se desarrollan en cada nudo del tallo la hoja superior se encuentra debajo de la panícula también conocida como hoja bandera ya que es más corta y ancha que las demás Sus hojas son alternas y se las encuentra a lo largo del tallo a la vez están conformadas por vaina zona de unión y lámina Arregocés Rosero y Gonzáles 2005 2244 Panícula Olivo 2022 la panícula se encuentra ubicada sobre el nudo apical del tallo es una inflorescencia que está con conformada por un eje llamado raquis también está compuesta por cuello base ramas primarias y secundarias pedicelos gluma rudimentarias y espiguillas 26 2245 Espiguilla Morán 2015 explica que la espiguilla es formada por un pequeño conjunto llamado raquis en este se encuentra una flor simple conformada por dos brácteas denominadas glumas estériles Dos brácteas superiores conocidas como glumas florales estás constituyes la caja floral 2246 Flor Jara 2015 explica que las flores del arroz son de color blanquecino en forma de espiguilla por ende está constituida por seis estambres y un pistilo sus estambres constan de filamentos delgados por ende este posee anteras cilíndricas que contiene cada una entre 500 y 100 granos de polen Por otro lado el pistilo contiene el ovario estigma y estilo 2245 Grano La semilla de arroz se encuentra rodeada externamente por una estructura llamada pericarpio en consecuencia conforma una estructura llamada cariópside lo que es fruto este se encuentra adherido en la pared del fruto maduro está formado por la cáscara y a la vez está compuesta por glumelas raquis y arista Olivo 2022 225 Requerimientos edafoclimáticos 2251 Clima Hablich 2021 el cultivo de arroz se desarrolla en las zonas tropicales y subtropicales pero obtiene una mejor producción a nivel mundial en las zonas húmedas tropicales los terrenos que conservan mucha humedad son los más apropiados para que el cultivo de arroz tenga un mejor desarrollo 27 2252 Temperatura Jetter Rosatto y Jaureguiberry 2008 señala que la temperatura para este cultivo no debe ser baja entre 10 a 20 C pero la temperatura óptima para este cultivo es de 30 y 35 C en consecuencia la planta se desarrolla más rápido sin embargo la temperatura llega estar por encima de 40 C esta va a causar daños a la planta como a no realizar su germinación y sus tejidos se harán blandos 2253 Suelo Guzmán 2006 el tipo de suelo en el que se puede desarrollar el cultivo de arroz es variado este varía entre textura arenosa o arcillosa es importante destacar que la textura del suelo cumple un rol importante en el manejo del riego y de los fertilizantes 226 Variedades del arroz Montero Domingo Palma Tomás y Catalá 2017 los productores tienen diferentes opciones de sembrar distintas variedades de arroz estas se diferencian en cuanto entre cada una de ellas por el tipo altura de planta color aspecto del follaje forma de la espiga desgrane días a la madurez la calidad del grano así mismo se caracteriza algunas variedades que son más tolerantes a las condiciones edafoclimáticas 227 Principales labores del cultivo de arroz 2271 Preparación del terreno Paredes y Alfaro 2015 el cultivo de arroz necesita terrenos con condiciones secas e inundables también labores combinadas de arado romplow y ratas para la segunda etapa de preparación se realiza la labor de fangueo es decir mezcla el 28 suelo que se ha inundado anteriormente para que quede uniforme esta labor se la realiza con tractor canguro y gavias 2272 Siembra Existen diferentes tipos de siembra para el cultivo de arroz como al voleo directa y trasplante la siembra directa es el tipo de simbra que más es utilizado por los grandes productores ya que esta la realizan con ayuda de máquinas sembradoras su distancia está dada entre 025 m entre hileras por 025 m entre plantas cabe destacar que la siembra al voleo es realizada con semillas pre germinadas y sin germinar por lo tanto es utilizada entre 75 y 85 kg de semilla por hectárea Tinoco 2009 2273 Fertilización La fertilización es un requerimiento de mucha importancia para toda clase de cultivos ya que esta tiene de objetivo modificar el estado de carencia del suelo respecto a sus nutrientes además establecer o restablecer al terreno con los elementos que le caracterizan su fertilidad Tomás y Catalá 2014 Lozada 2014 indica que al implementar buenas labores de fertilización cumple un papel importante en la productividad del arroz El nitrógeno es absorbido rápidamente por la planta en sus etapas de desarrollo y al final del periodo vegetativo alude que la deficiencia del nitrógeno causa clorosis limitando de manera radical su crecimiento Explica que para poder producir una tonelada de arroz en cuanto su desarrollo absorbe aproximadamente 22 kg de Nitrógeno 5 kg de Fósforo 25 kg de Potasio 6 kg de Calcio 4 kg de Magnesio y 2 kg de Azufre Entre el 75 de Nitrógeno Fósforo y el 10 de Potasio se acumula en el grano el resto sigue adherido en el 29 cultivo retornando al suelo como resultado se obtiene altos niveles en cuanto su rendimiento en el cultivo de arroz Espinoza 2020 2274 Riego Infoagro 2020 explica que la implementación del sistema de riego en los cultivos de arroz son distintos ya que se suele aplicar sistemas estáticos de recirculación y de acumulación de agua por consiguiente se debe de tener en cuenta las ventajas y desventajas que presenta cada sistema de riego además analizar su impacto potencial en la calidad del agua 2275 Cosecha Al cosechar el cultivo de arroz se debe de tener en cuenta tres aspectos esenciales el método se cosecha perdida en rendimiento y la calidad del grano Al cosechar con una humedad mayor a 27 habrá menor rendimiento y granos duros asimismo si se lo cosecha por debajo del 18 habrá gran pérdida de granos de calidad y mayor riesgo en el cultivo Montero et al 2017 afirma que la cosecha se puede hacer de manera mecánica conjunto de la combinada y manual se corta las plantas con herramientas ideales para este cultivo como la hoz 228 Plagas principales en el cultivo de arroz 2281 Mosca minadora del arroz Hydrellia wirthi korytkovski Se considera por ser una de las plagas principales que más ataca al cultivo de arroz en sus primeras etapas de desarrollo Comúnmente es conocida como mosca minadora a los 30 días de crecimiento del cultivo causa daños como decoloración en las puntas de las hojas provocándoles torceduras en las hojas del arroz Gutiérrez García Antigua Gómez Correa y Meneses 2015 30 2282 Chinche negro Tibraca limbativentris Stal De acuerdo kruger y Burdyn 2015 El chinche negro ataca principalmente con mayor frecuencia a los sectores arroceros causándole al cultivo heridas tanto en el tallo como en varias zonas de la planta en consecuencia de las heridas a causa de esta plaga puede provocar también ataques de nematodos por lo tanto el cultivo tendrá plantas enfermas Frecuentemente ataca más en su estado de ninfa y adulto 2283 Novia del arroz Rupela albinella Comúnmente es denominada como novia del arroz tras su color blanco brillante Es una plaga principal que ataca al cultivo de arroz su daño es de poca importancia económica Afecta al cultivo en su estadio de larva ya que realiza un orificio en el tallo perforando los entrenudos en consecuencia las hojas tornan un color amarillento también conocido como panícula blanca Meneses 2008 2284 Sogata Tagosodes orizicolus Muir Indican Paredes y Alfaro 2015 Sogata es una plaga que mayormente afecta la producción del cultivo de arroz particularmente es portadora del virus de la hoja blanca Esta transmite el virus al momento que se alimenta de la plaga de manera directa también ataca de manera indirecta mediante su oviposición lo cual introduce sus huevos a la planta 2285 Chicharrita pintada Hortensia similis Explican Corrales Villalobos Vargas Rodríguez y González 2017 Esta plaga es reconocida a simple vista en campo por las marcas de color negro que tiene en su cabeza y por su cuerpo color verde brillante pero pálido carece daños de importancia económica A comparación del Sogata esta no es portadora del virus de la hoja blanca coloca sus huevos en las venas principales de las hojas por lo 31 tanto al eclosionar durante su desarrollo se va consumiendo toda la savia de la planta 229 Enfermedades principales en el cultivo de arroz 2291 Virus de la hoja blanca De acuerdo Plata Navia y Garandillas 2018 Este virus se encuentra dentro del insecto Sogata Tagosodes oryzicolus en algunas épocas del año existe una mayor incidencia del mismo provocando bajo de rendimiento y calidad de cosecha Un síntoma principal de este virus es que en la hoja presenta líneas en forma de banda color blanco estás se ubican alineadas en la nervadura central de la hoja otro síntoma principal es que en las plantas causa enanismo provocando que las panículas sean de menor tamaño 2292 Pyriculariosis Esta enfermedad es causada por el hongo Pyricularia oryzae este hongo infecta al cultivo durante todas sus etapas de crecimiento afectando a toda la planta La enfermedad inicia principalmente en la parte baja de la planta Se puede dispersar mediante semillas malezas y rastrojos de anteriores cosechas Catalá y Tomás 2014 2293 Mancha marrón de la hoja Bipolaris sp De acuerdo Vivas y Intriago 2012 La presencia de esta enfermedad causa necrosis en el follaje o manchado del grano esta es transmitida por las semillas por lo que existen semillas de mala calidad Los síntomas en las semillas son manchas necróticas de diversas tonalidades a comparación de la hoja que son manchas circulares u ovaladas solamente de color marrón 32 2294 Añublo de la hoja Rhizoctonia solani Una de su característica del Añublo de la hoja es el volcamiento del arroz y su maduración precoz este visibiliza manchas de color oscuro que suelen cambiar a color verde Cuando la panícula está naciendo esta enfermedad ataca rápidamente hacia la parte superior de la panícula por lo tanto una de las consecuencias para atraer esta enfermedad es la alta humedad relativa o altas temperaturas Cuevas y Higuera 2018 2295 Carbón de la hoja Eballistra oryzae Manifiestan Plata Navia y Gandarillas 2018 Que un síntoma peculiar del carbón de la hoja es la reducción de la capacidad al absorber luz solar para el proceso de fotosíntesis provoca disminución de peso al grano causando pérdidas las cuales pueden ser mayores cuando la infección de la enfermedad está cerca a la floración del cultivo 2210 Bacterias fijadoras de nitrógeno 22101 Nitrógeno atmosférico Estas bacterias toman nitrógeno directamente del aire produciendo compuestos que pueden incorporarse al suelo o a los organismos vivos Por medio de esta forma el nitrógeno atmosférico inicia su ciclo al ingresar a las plantas García 2011 22102 Grupos de organismos Dentro del grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno se clasifican en dos grupos de organismos Por ende el primer grupo está conformado por bacterias del suelo que son móviles estas son atraídas hacía la raíz gracias a los compuestos que esta libera dentro de este grupo están los quimioorganotrofos que son denominados rizobios Medina Ceja López Gonzáles y Sánches 2019 por consiguiente en el 33 segundo grupo está conformado por Actinomicetos son bacterias filamentosas que viven en simbiosis con plantas actinotiacicas que tienen más capacidad de formar nódulos 2211 Insumos a utilizarse 22111 Methylobacterium symbioticum Methylobacterium symbioticum coloniza rápidamente la filosfera de la planta desde las primeras etapas de desarrollo se caracteriza por su alta capacidad de fijar nitrógeno atmosférico en la planta además posee efecto estimulante de desarrollo de la planta en consecuencia permite reducir la aplicación de fertilizantes nitrogenados Hubel 2021 Hortus 2022 explica que la bacteria fijadora de nitrógeno ayuda a los productores aumentar la rentabilidad de sus cultivos sin impacto ambiental además de contener efecto nutricional Methylobacterium symbioticum SB23 también tiene un efecto positivo en la fisiología de la planta ya que retrasa el envejecimiento de las células vegetales y prolonga su vida fotosintética efectiva Al mismo tiempo promueve el crecimiento de las raíces y permite que la planta tenga un mejor acceso a los nutrientes y al agua a la vez mejorando la calidad y la vida postcosecha de las frutas y aumenta el rendimiento de los cultivos 22112 Aplicación de Methylobacterium symbioticum SB23 Universidad Pública de Navarra 2021 menciona que la aplicación de Methylobactrium symbioticum SB23 es de manera foliar se aplica en las primeras fases del cultivo para obtener mayor eficiencia en él La bacteria fijadora de nitrógeno penetra en la planta a través de los estomas de las hojas instalándose principalmente en las células fotosintéticas así haciendo uso del sistema enzimático 34 de la nitrogenasa para la fijación del nitrógeno por lo tanto esta se encarga de fijar el nitrógeno atmosférico transformándolo en amonio cederlo posteriormente a la planta como consecuencia la planta es capaz de asimilar el amonio proveniente del nitrógeno atmosférico posiblemente reduce la aplicación de nitrógeno mineral de esta manera disminuyendo la lixiviación de nitrato y la degradación de los suelos 2212 Fijación de nitrógeno atmosférico 22121 Fijación biológica La aplicación biológica del nitrógeno atmosférico mediante Methylobacterium symbioticum SB23 consigue que la planta no tenga necesidad de tomar el nitrógeno vía radicular ya que disminuye así el gasto energético de la panta ya aplicado Methylobacterium symbioticum SB23 utilizará el desecho de la panta metanol como carbono y energía Calvo 2010 Según Catuto 2013 las bacterias fijadoras de nitrógeno pueden dividirse en dos grupos a las de vida libre como por ejemplo las pertenecientes a los géneros Azospirillum Beijerinchia Azotobacter Bacillus Mycobacterium Pseudomonas y b las que fijan nitrógeno a partir del establecimiento de una simbiosis con las plantas leguminosas las cuales pertenecen a los géneros Rhizobium Bradyrhizobium Azorhizobium Allorhizobium Mesorhizobium y Sinorhizobium que comúnmente se denominan Rhizobium 2213 Bradyrhizobium japonicum Existen diversas maneras que los rizobios un tipo de bacteria pueden vivir y desarrollarse Pueden actuar como saprófitos en el suelo formar una relación simbiótica con las raíces y tallos de las plantas leguminosas donde transforman el nitrógeno atmosférico en amonio y lo suministran a la planta en forma de 35 biomoléculas vitales también pueden existir como endófitos en las raíces de diferentes especies vegetales y tienen un efecto positivo en el crecimiento de la planta Lodeiro y Covelli 2013 23 Marco legal 231 Constitución de la República del Ecuador Que el Artículo 284 inciso 2 de la Constitución de la República establece como objetivo de las Políticas Económicas incentivar la producción nacional la productividad y competitividad sistémicas la acumulación del conocimiento científico y tecnológico la inserción estratégica en la economía mundial y las actividades productivas complementarias en la integración regional Que las leyes de sanidad vegetal y sanidad animal forman parte del régimen de soberanía alimentaria por lo que deben garantizar el respeto a los derechos de la naturaleza y el manejo de los recursos naturales en concordancia con los principios de sostenibilidad ambiental y las buenas prácticas de producción según lo establece el último inciso del artículo 2 de la Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria Asamblea Nacional Constituyente 2008p 2 232 Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria Protección de la agrobiodiversidad Artículo 7 Protección de la agrobiodiversidad El Estado así como las personas y las colectividades protegerán conservarán los ecosistemas y promoverán la recuperación uso conservación y desarrollo de la agrobiodiversidad y de los saberes ancestrales vinculados a ella Las leyes que regulen el desarrollo agropecuario y la agrobiodiversidad crearán las medidas legales e institucionales necesarias para asegurar la agrobiodiversidad mediante la asociatividad de cultivos la investigación y sostenimiento de especies la creación de bancos de semillas y plantas y otras medidas similares así como el apoyo mediante incentivos financieros a quienes promuevan y protejan la agrobiodiversidad Artículo 8 Semillas El Estado así como las personas y las colectividades promoverán y protegerán el uso conservación calificación e intercambio libre de toda semilla nativa Las actividades de producción certificación procesamiento y comercialización de semillas para el fomento de la agrobiodiversidad se regularán en la ley correspondiente El germoplasma las semillas plantas nativas y los conocimientos ancestrales asociados a éstas constituyen patrimonio del pueblo ecuatoriano consecuentemente no serán objeto de apropiación bajo la forma de patentes u otras modalidades de propiedad intelectual de conformidad con el Art 402 de la Constitución de la República Asamblea Nacional 2018 p 3 233 Reglamento General de la Ley Orgánica de Sanidad Agropecuaria De las medidas sanitarias Art 18 Objeto Las medidas sanitarias tienen por objeto prevenir confinar excluir combatir o erradicar las plagas enfermedades y contaminantes que 36 pongan en riesgo la sanidad agropecuaria e inocuidad de los alimentos en la producción primaria Art 19 Cumplimiento obligatorio Las disposiciones emitidas por la Agencia para la aplicación de medidas sanitarias las cuales tengan como finalidad el control prevención erradicación de una plaga enfermedad o evento de inocuidad serán de obligatorio cumplimiento por parte de los propietarios arrendatarios o posesionarios de plantas productos vegetales animales mercancías pecuarias otros artículos reglamentados e insumos agropecuarios incluyendo su aplicación ejecución y costos Art 20 Medida preventiva sanitaria Es la ejecutada por los Inspectores de la Agencia cuando se tenga elementos conducentes a algún riesgo sanitario o exista certidumbre de daño conforme al principio de prevención esta debe ser ratificada o levantada dentro del proceso administrativo o a través de la evidencia científica o de valoración Art 21 Horario hábil y movilización Con el fin de cumplir con los procesos de control fito y zoosanitario la Agencia podrá establecer jornadas especiales de trabajo así como normativa específica para el uso de bienes públicos de conformidad con la Ley y demás normativa de la materiaAsamblea Nacional 2019 p 7 y 8 37 3 Materiales y métodos 31 Enfoque de la investigación El trabajo de investigación fue de carácter narrativo descriptivo y experimental en cuanto a la aplicación de las bacterias Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum que se encargaron de fijar nitrógeno atmosférico en la misma planta 311 Tipo de investigación Los tipos de investigación que se utilizaron en el trabajo de investigación fue bibliográfica experimental y en campo puesto que abarcó la parte fundamental del proyecto en este tipo de experimento se determinó cuál de los tratamientos planteados entre Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum presentó mayor rendimiento en la productividad en el cultivo de arroz mediante la implementación de un diseño de bloques completamente al azar DBCA dónde se evaluó cuatro tratamientos con cinco repeticiones 3111 Investigación aplicada La presente investigación es de tipo aplicada ya que se empleó una alternativa como complemento de la nutrición en el cultivo de arroz Oryza sativa para incrementar su rendimiento de producción 3112 Investigación de campo La investigación realizada fue en campo y laboratorio ya que se obtendrán datos reales por lo tanto permitió estudiarlos dentro de los dos campos de estudios antes ya mencionado de tal manera los datos obtenidos fueron comparados con investigaciones posteriores 38 3113 Investigación experimental Esta investigación fue de tipo experimental ya que se probó la efectividad de Methylobcaterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum para mejorar la nutrición de la planta y su rendimiento de producción en el cultivo de arroz Oryza sativa se realizó primero trasplante de plántulas de arroz 3114 Investigación explicativa La investigación fue de tipo explicativa ya que una vez recopilada la información y los datos obtenidos en campo y en laboratorio se desarrolló de manera detallada que métodos y herramientas se utilizaron para llevar a cabo el presente trabajo de investigación 32 Metodología 321 Variables Según el tipo de investigación se incluyó las siguientes variables 3211 Variable independiente Aplicación de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum para aumentar la productividad del cultivo de arroz 3212 Variables dependientes 32121 Altura de planta cm Esta variable después de ser trasplantadas las plántulas de arroz variedad 011 se midió de acuerdo a los días de frecuencia de las aplicaciones entre 15 30 y 45 días A la vez se evaluó 10 plantas al azar que se encontraban en el medio dentro del área útil en cada bloque de los tratamientos se las señaló para poder llevar un correcto seguimiento para la toma de datos de las variables con la ayuda de un flexómetro se midió la altura desde la superficie del suelo hasta el ápice de la hoja 39 32122 Longitud de la espiga cm Se eligieron en total solo diez espigas al azar que se encontraban en el medio del área útil de la parcela con un flexómetro se midió desde el nudo de la espiga hasta la punta del último grano de la espiga 32123 Espigas por plantas Para esta variable se contó las espigas que contiene cada una de las 10 plantas ubicadas en el medio dentro del área útil de la parcela de cada tratamiento después fueron promediadas por cada tratamiento 32124 Peso de 1000 granos g Se seleccionó todas las espigas de las 10 plantas que se encontraban en medio del área útil esto se realizó por cada tratamiento por ende se procedió a contar 1000 granos para luego ser pesados mediante la ayuda de una gramera en consecuencia se procedió a sacar solo un promedio total de cada tratamiento 32125 Número de granos llenos Se contabilizó los granos llenos de 10 espigas seleccionadas al azar del medio del área útil de cada tratamiento para obtener datos numéricos de la cantidad de granos llenos 32126 Productividad KgHa Para la evaluación de esta variable se consideró el rendimiento obtenido en cada tratamiento se cosechó por metro cuadrado Se determinó su peso en GHa después se los expresó en kilogramos por hectáreas Productividad Kg ha Rendimiento parcela útil 10000 m² Área de parcela útil m² 40 32127 Análisis económico Se utilizó el método de análisis de relación beneficio costo usando la siguiente fórmula Relación Beneficio Costo RBC 322 Tratamientos Los tratamientos de las bacterias fijadoras de nitrógeno de dividen por Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum que fueron aplicadas en el cultivo de arroz Oryza sativa Tabla 1 Descripción de los tratamientos Tratamientos DosisHa DosisParcela Dosis de parcela por las 5 repeticiones Disolución H2O por parcelas Días de aplicación T1 Methylobacterium T2 Bradyrhizobium T3 Methylobacterium Bradyrhizobium T4 Testigo absoluto 333 gha 4 L 333 g 4 L 083 g 10 ml 083 g 10 ml 415 g 50 ml 415 g 50 ml 500 ml parcela 500 ml parcela 500 ml parcela 15 30 45 días 15 30 45 días 15 30 45 días Descripción de los tratamientos Velasco 2023 323 Diseño experimental Para la ejecución del experimento se implementó un diseño de bloques completo al azar DBCA en el cual se conformó por cuatro tratamientos diferentes con cinco repeticiones dónde se evaluaron diferentes dosificaciones de Methylobacterium symbioticum SB23 Bradyrhizobium japonicum y la mezcla de Methylobacterium symbioticum SB23 más Bradyrhizobium japonicum el cuarto tratamiento fue un Ingreso Egreso 41 testigo absoluto con un total de 20 unidades experimentales cuyas dimensiones por bloques fueron de 5 m x 5 m con un área total 245 m x 31 m 75950 m2 Tabla 2 Esquema de análisis de varianza ANDEVA Fuente de variación Fórmula Desarrollo Grados de libertad Tratamientos t1 41 3 Repeticiones r1 51 4 Error experimental t1 r1 41 51 12 Total N1 201 19 Descripción del esquema de análisis de varianza Velasco 2023 Tabla 3 Delimitación experimental Descripción Dimensiones Unidad Número de tratamientos Número de repeticiones Número de parcelas Largo de la parcela Ancho de parcela Área de cada parcela Distancia entre parcela Efecto del borde de la UE Selección del área útil Distancia entre bloque Distancia entre planta Distancia entre hilera Número de plantas por parcela Total de plantas útiles en el ensayo Número de plantas en total Hileras por parcelas Plantas por hileras Plantas a muestrear Total plantas por parcelas Área total del proyecto 4 5 20 5 5 5 m x 5 m 25 1 050 4 m x 4 m 16 1 020 030 417 17 8340 17 25 12 425 245 m x 31 m 7595 m m m2 m m m2 m m m m2 Delimitación experimental Velasco 2023 42 324 Recolección de datos 3241 Recursos 32411 Material experimental Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum que fueron aplicadas de manera foliar y edáfica en diferentes dosis con frecuencia de 15 30 y 45 días 32412 Materiales y herramientas Cámara fotográfica Machetes rastrillos Piola cintas estacas Letreros Flexómetro cinta métrica Balanza Tablas Bomba de mochila Pala azadón 32413 Equipos de oficina Computadora e impresora Libreta esferográfico Carpeta Resma de hojas A4 32414 Recursos bibliográficos Páginas web Informes fichas técnicas 43 Tesis de grado Revistas Artículos científicos Uso de la biblioteca virtual de la Universidad Agraria del Ecuador 32415 Recursos humanos Tutor Tesista Redactor técnico Redactor estadístico Docente de taller de titulación I y II 32416 Recursos económicos El presente trabajo de investigación fue financiado por recursos económicos propios de la tesista 44 Tabla 4 Valoración económica Implementos Cantidad Precio Total Terreno Machete Flexómetro Balanza gramera Resma de hojas Piolas Estacas y letreros Bomba de fumigar Jornales fumigación Methylobacterium Symbioticum Bradyrhizobium japonicum Riego Eliminación de malezas jornales Semillas de arroz Transporte Gigantografía Siembra de arroz Trasplante jornales Laboratorio Agar nutritivo Cajas Petri Antifúngico Agua destilada Bisturí Alcohol industrial Total Media hectárea 1 1 1 5 2 20 1 8 1 1 2 8 1 4 1 2 2 1 4 2 1 2 1 150 10 3 15 5 250 2 30 10 70 20 200 10 50 5 10 10 10 60 5 050 2 030 3 150 10 3 15 25 625 40 30 80 70 20 200 80 50 50 10 20 20 60 20 1 2 060 3 96585 Descripción de la valoración económica Velasco 2023 3242 Métodos y técnicas El presente trabajo se lo llevó a cabo en el sector La Germania en la provincia del Guayas el tiempo estipulado del trabajo experimental fueron de cinco meses a partir de octubre 2022 las bacterias que se usaron para llevar a cabo el trabajo experimental fueron Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum aplicando su uso en cuatro tratamientos de diferentes dosis con cinco repeticiones de las bacteria fijadoras de nitrógeno que ayudaron a incrementar el rendimiento del cultivo de arroz en cuanto su producción Su delimitación fueron 20 bloques parcelas de 5 m x 5 m 25 m2 45 32421 Métodos Deductivo Mediante este método se indicaron los casos iguales de la investigación a través de teorías leyes y principios dando un criterio técnico y único Inductivo Los resultados obtenidos mediante el trabajo de investigación estarán disponibles a toda persona que esté interesada en obtener mejores resultados Análisis Este método ayudó a conocer más sobre las bacterias fijadoras de nitrógeno que se estudiaron para obtener una información adecuada clara y precisa para futuros trabajos de investigación Síntesis Con la ayuda de este método se consiguió demostrar que todo trabajo de investigación necesita un estudio para poder asegurar y confirmar sus resultados 32422 Técnicas Preparación del terreno Se realizó dos pases romplow y luego dos pases de fangueadora Siembra Se realizó semillero la variedad de arroz que se utilizó fue 011 para luego ser trasplantado Trasplante Se realizó trasplante de plántulas de arroz variedad 011 Control de malezas Este control se lo manejó de manera manual de acuerdo a la presencia de las malezas más se lo realizó para controlar el arroz malo que se pudo presenciar y a la vez controlar durante su desarrollo Control plagas y enfermedades De acuerdo a la presencia de plagas como la novia de arroz Rupela albinella Cramer y enfermedades se controló con diferentes insumos Safex y Debut 46 Fertilización La fertilización fue de manera foliar aplicando Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum se aplicó de forma edáfica para abastecer los requerimientos de nutricionales del suelo Cosecha La cosecha se realizó en cada parcela experimental de manera manual una vez que el cultivo de arroz obtuvo su madurez fisiológica 325 Análisis estadístico 3251 Análisis funcional En el análisis estadístico los datos que se recolectaron se sometieron a un análisis de varianza para comprobar las diferencias significativas que existe entre los tratamientos en el caso de haber diferencias se aplicó la prueba de Tukey al 5 de significancia 3252 Hipótesis estadística H0 Ninguna de las aplicaciones de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum Tendrá efecto en el rendimiento en el cultivo de arroz Oryza sativa L H1 Al menos uno de los tratamientos con aplicación de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum obtendrá mayor rendimiento en el cultivo de arroz Oryza sativa L 47 4 Resultados 41 Determinación de la compatibilidad invitro de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrizobium japonicum 411 Confrontación entre bacterias Methylobacterium symbioticum y Bradyrhizobium japonicum La confrontación entre bacterias se refiere a la forma en que diferentes tipos de bacterias interactúan en un ambiente determinado Esta interacción puede ser una competencia por los recursos limitados o una respuesta a la presencia de un patógeno La confrontación entre bacterias puede llevar a la dominación de una especie sobre otra o a una relación simbiótica en la que ambas se benefician En el marco de un experimento de laboratorio se llevó a cabo una prueba de confrontación entre dos bacterias fijadoras de nitrógeno Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobiumn japonicum Para ello se utilizó un medio de cultivo adecuado específicamente Agar nutritivo con antifúngico gentamicina en cajas Petri con el fin de evaluar su viabilidad ya que eran bacterias comerciales La confrontación se realizó mediante la colocación de una muestra de las bacterias en los extremos de las cajas Petri Durante el desarrollo de las bacterias se observó que Bradyrhizobium japonicum y Methylobacterium SB23 eran compatibles ya que no se evidenció ninguna barrera de incompatibilidad entre ellas que pudiera impedir su colonización Además no se detectaron rastros de ataque mutuo entre las bacterias durante el proceso Es importante destacar que Bradyrhizobium japonicum mostró un mejor desarrollo en el ambiente controlado del experimento en comparación con 48 Methylobacterium S23 lo cual podría indicar diferencias en su capacidad de adaptación y crecimiento en el medio de cultivo utilizado Figura 1 Bacteria fijadora de nitrógeno Bradyrhizobium japonicum Velasco 2023 42 Análisis del comportamiento agronómico de cultivo de arroz Oryza sativa con el uso de Methylobacterium symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum 421 Altura de planta a los 15 días cm En la tabla 5 acerca de la variable altura de la planta a los 15 días cm indica que el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium presentó mayor altura de 3264 cm a los 15 días figura 8 a comparación de los demás tratamientos por consiguiente el tratamiento con menor altura fue el tratamiento cuatro Testigo con 49 una medida de 2644 cm de altura El coeficiente de variación fue de 564 y un pvalor 00063 005 existiendo significancia figura 7 Tabla 5 Altura de planta a los 15 días cm T Tratamientos N Altura de planta a los 15 días cm T 4 Testigo absoluto 5 2644 a T2 Bradyrhizobium 5 3016 b T1 Methylobacterium 5 3064 b T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 3264 b CV 564 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 422 Altura de plantas a los 30 días cm En la tabla 6 se muestra los datos de la variable altura de la planta a los 30 días cm dónde los tratamientos con mayor representación estadística con mayor promedio fueron el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium con 6518 cm de altura a los 30 días seguido de tratamiento uno Methylobacterium con 6438 cm de altura figura 10 tratamiento dos Bradyrhizobium con 6156 cm de altura y el tratamiento con menor promedio de altura fue tratamiento cuatro testigo con 5756 cm Su coeficiente de variación fue 379 y un p valor de 00073 005 existiendo significancia figura 9 50 Tabla 6Altura de planta a los 30 días cm T Tratamientos N Altura de planta a los 30 días cm T4 Testigo absoluto 5 5756 a T2 Bradyrhizobium 5 6156 a b T1 Methylobacterium 5 6438 b T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 6518 b CV 379 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 423 Altura de planta a los 45 días En la tabla 7 se muestra los datos de la variable altura de la planta a los 45 días cm dónde los tratamientos con mayor significancia estadística que presentaron mayor promedio fueron el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium con un promedio de altura de 10642 cm seguido por tratamiento dos Bradyrhizobium con 10182 cm de altura tratamiento uno Methylobacterium con un promedio de 10136 cm de altura figura 12 por lo tanto el tratamiento con menor promedio estadístico en cuanto a la altura de la planta a los 45 días fue el tratamiento cuatro Testigo con 10004 cm Su coeficiente de variación fue 132 y con un p valor 00004 005 figura 11 51 Tabla 7 Altura de planta a los 45 días cm T Tratamientos N Altura de planta a los 45 días cm T 4 Testigo absoluto 5 10004 a T1 Methylobacterium 5 10136 a T2 Bradyrhizobium 5 10182 a T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 10642 b CV 132 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 424 Longitud de la espiga cm En la tabla 8 se visualiza los datos de la variable longitud de la espiga cm se observa que el mejor tratamiento con mayor resultado fue el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium con un promedio de longitud de espigas de 2658 cm tratamiento uno Methylobacterium con 2598 cm de longitud de espiga tratamiento dos Bradyrhizobium con una longitud de 2572 cm En comparación de la longitud más baja que fue del tratamiento cuatro Testigo 2502 cm El coeficiente de variación asignado fue de 243 y un p valor de 00360 005 figura 13 por lo tanto se demostró que si tuvo efecto el tratamiento con las bacterias fijadoras de nitrógeno figura 14 52 Tabla 8Longitud de la espiga cm T Tratamientos N Longitud de las espigas cm T4 Testigo absoluto 5 2502 a T2 Bradyrhizobium 5 2572 a b T1 Methylobacterium 5 2598 a b T3 Methylobacterium symbioticum Bradyrhizobium 5 2658 b CV 243 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 425 Espigas por planta En la tabla 9 se presenta los promedios de la variable espigas por plantas los tratamientos con mayor representación estadística fueron los tratamientos tratamiento uno Methylobacterium que obtuvo un mayor promedio de números de espigas por planta de 2654 al igual que el tratamiento dos Bradyrhizobium con 2646 números de espigas por planta el tratamiento más bajo en cuanto representación estadística fue el tratamiento cuatro testigo con un promedio de 2280 espigas por planta Demostró un coeficiente de variación de 441 y un p valor de 00050 005 existe significancia figura 15 En síntesis los tratamientos a base de Methylobacterium symbioticum y Bradyrhizobium aportan un mejor resultado que los fertilizantes sintéticos en cuanto a las características a agronómicas del cultivo figura 16 53 Tabla 9 Espigas por plantas T Tratamientos N Espigas por planta T4 Testigo absoluto 5 2280 a T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 2572 b T2 Bradyrhizobium 5 2646 b T1 Methylobacterium 5 2654 b CV 441 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 426 Números de granos llenos En la tabla 10 se observan los datos de la variable número de granos llenos por lo tanto se demostró que el tratamiento que obtuvo mayor número de granos llenos fue el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium con un promedio de granos llenos de 14218 figura 18 seguido del tratamiento uno Methylobacterium con un promedio 13972 tratamiento dos Bradyrhizobium 13920 al contrario del tratamiento cuatro Testigo tuvo menor promedio de números de granos llenos con un resultado de 13208 Nuevamente se reflejó que las bacterias fijadoras de nitrógeno tienen un mayor resultado en cuanto al comportamiento agronómico del cultivo de arroz Oryza sativa L al ser aplicadas juntas a comparación del testigo absoluto que contó con una fertilización sintética Su coeficiente de variación fue de 284 y un p valor de 00401 005 figura 17 54 Tabla 10 Número de granos llenos T Tratamientos N Número de granos llenos T4 Testigo absoluto 5 13208 a T2 Bradyrhizobium 5 13920 a b T1 Methylobacterium 5 13972 b T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 14218 b CV 284 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 427 Peso de 1000 granos g Mediante la tabla 11 se observan los promedios del peso de 1000 granos g El análisis de varianza demostró un coeficiente de variación de 463 con un p valor de 00035 005 figura 19 Dos tratamientos fueron los que tuvieron mayor peso pero el más significante entre los dos fue el tratamiento tres Methylobacterium Bradyrhizobium con un peso promedio de 3257 gramos seguido por el tratamiento dos Bradyrhizobium con 2828 gramos Sin embargo el tratamiento con menor representación estadística en cuanto al peso de los 1000 granos g fue el tratamiento cuatro testigo con un peso de 2811 gramos Se observó que al mezclar las bacterias Methylobacterium symbioticum Bradyrhizobium juntas tienen mayor eficacia a comparación del tratamiento testigo absoluto figura 20 55 Tabla 11 Peso de 1000 granos T Tratamientos N Peso de 1000 granos g T4 Testigo absoluto 5 2811 a T1 Methylobacterium 5 2823 a T2 Bradyrhizobium 5 2828 a T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 3257 b CV 463 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 428 Productividad Kg Ha La tabla 12 presenta la productividad en kilogramos por hectárea El análisis de varianza reveló un coeficiente de variación de 433 y un p valor de 00001 005 figura 21 El tratamiento con mayor significancia estadística en cuanto a la mayor cantidad de rendimiento kilogramo por hectárea fue el tratamiento tres Methylobacterium symbioticum Bradyrhizobium japonicum con un promedio de 545782 kilogramos por hectáreas seguido por el tratamiento uno Methylobacterium con un rendimiento 521260 kilogramos por hectárea además el tratamiento dos Bradyrhizobium con 515230 de rendimiento en cuanto a kilogramo por hectárea Mientras que el tratamiento cuatro testigo tuvo un menor rendimiento de 320662 kilogramos por hectárea figura 22 Se comprobó que las bacterias fijadoras de nitrógeno al mezclarlas es decir Methylobacterium symbioticum Bradyrhizobium japonicum tienen mayor eficiencia en el cultivo de arroz 56 Tabla 12 Productividad Kg Ha T Tratamientos N Rendimiento KgHa T4 Testigo absoluto 5 320662 a T2 Bradyrhizobium 5 515230 b T1 Methylobacterium 5 521260 b T3 Methylobacterium Bradyrhizobium 5 545782 b CV 433 Medias con una letra común no son significativamente diferentes p 005 Velasco 2023 429 Análisis económico En la tabla 13 del análisis económico de los tratamientos está relacionado con la producción de cultivo de arroz variedad 011 rendimiento kgha precio de venta ingresos egresos y beneficio Se muestra todos los promedios alcanzados al realizar el análisis económico del cultivo se estableció que el mejor tratamiento en relación costobeneficio lo alcanzó el tratamiento uno Methylobacterium con 161 dónde se obtiene 061 ctvs por cada dólar invertido seguido por el tratamiento dos Bradyrhizobium con 126 dónde se obtiene 026 ctvs por cada dólar invertido el tratamiento cuatro Testigo con 117 dónde se obtiene 017 ctvs por cada dólar invertido y por último se encuentra el tratamiento uno Methylobacterium con 116 dónde se obtiene 016 ctvs por cada dólar invertido En la figura seis se visualiza los costos de producción de cada tratamiento también sus ingresos el tratamiento 1 es más rentable a comparación de los demás tratamientos en estudio es decir que por cada dólar que se invierte se tiene un beneficio costo de 061 ctvs 57 El Ministerio de Agricultura y Ganadería establece los precios de referencia para los compradores en el interior del país que en este caso alcanzan los 045 ctvs Tabla 13 Análisis económico Tratamientos Rendimiento KgHa Precio de venta Ingresos Egresos Beneficio neto Relación Beneficio Costo Methylobacterium 521260 045 234567 145359 89208 161 ctvs Bradyrhizobium 515230 045 231854 184463 47390 126 ctvs Methylobacterium Bradyrhizobium 545782 045 245602 211192 34410 116 ctvs Testigo absoluto 320662 045 144298 123239 21059 117 ctvs Velasco 2023 58 5 Discusión Mediante el trabajo de investigación se evaluó el efecto de las bacterias fijadoras de nitrógeno Methylobacterium Symbioticum SB23 y Bradyrhizobium japonicum como complemento de la nutrición de las plantas se visualizó que al aplicar las dosis de las bacterias ayudaron a incrementar las variables agronómicas del cultivo los productos se aplicaron de manera foliar y edáfica Aplicando de acuerdo a los días de aplicación estipulados en la investigación después del trasplante como resultado se obtuvo las siguientes respuestas De acuerdo a los resultados del estudio realizado se estableció que la variable altura de la planta a los 30 días con un promedio de 6518 cm y a los 45 días con 106 42 cm logró mayor incremento con la aplicación de Methylobacterium Bradyrhizobium japonicum estadísticamente presentó mayor promedio discrepando con Scott 2020 que en su investigación presenta que con la aplicación de Bradyrhizobium japonicum obtuvo menor promedio de altura entre los 30 y 45 días Menciona Scott 2020 en su trabajo de investigación por medio de la variable longitud de la espiga tuvo mayor promedio estadístico de 2702 cm al solo aplicar Bradyrhizobium japonicum a comparación de este trabajo de investigación que hubo menor promedio estadístico En la variable espigas por planta los tratamientos con mayor resultado de promedio fueron el tratamiento uno con un promedio de 26 54 cm seguido por el tratamiento dos con 26 46 cm por lo tanto Latsague Sáez y Mora 2014 indican que el tratamiento alto con Bradyrhizobium japonicum tuvo un promedio de 14 60 59 Las variables número de granos llenos en los datos estadístico del trabajo de investigación tuvo un promedio de 14218 al aplicar Methylobacterium symbioticum SB23 Bradyrhizobium japonicum a comparación de Bacilio y Bernilla 2015 dónde explican que hubo menor promedio estadístico de 134 En la variable de peso de 1000 granos el tratamiento con mayor respuesta estadística fue el tratamiento tres con 3237 g al discrepar con LatsagueSáez y Mora 2014 que indican un promedio de 2544 g por lo tanto cabe recalcar que existe mayor incremento en las variables agronómicas del cultivo al aplicar Methylobacterium Bradyrhizobium japonicum Por último en la variable rendimiento kgha se indica que el tratamiento con mayor rendimiento fue el tratamiento tres con un rendimiento de 545782 kgha al aplicar Methylobacterium Bradyrhizobium japonicum refutando con Medina Ceja y López 2019 mencionan como resultado de 200 kgha al solo aplicar Methylobacterium 60 6 Conclusiones Las aplicaciones de las bacterias fijadoras de nitrógeno tanto Methylobacterium como Bradyrhizobium japonicum ayudaron a incrementar la productividad en el cultivo de arroz Oryza sativa L especialmente el tratamiento tres que consistió en la mezcla de estas dos bacterias Methylobacterium Bradyrhizobium ya que ayudaron a tener un mejor desarrollo en su toda su etapa productiva Bradyrhizobium japonicum tuvo un mejor resultado en cuanto a la confrontación con Methylobacterium symbioticum ya que esta se desarrolla más rápido en consecuencia esta bacteria dominó sobre Methylobacterium symbioticum SB23 De acuerdo a la hipótesis si hubo mayor incremento al aplicar Methylobacterium symbioticum y Bradyrhizobium japonicum ya que se obtuvo un rendimiento de 545782 kgha a comparación del testigo absoluto con un rendimiento de 320662 kgha 61 7 Recomendaciones Se recomienda utilizar el tratamiento con Methylobacterium symbioticum Bradyrhizobium japonicum en cuanto su comportamiento agronómico ya que permitió mejorar la producción y rendimiento en las unidades experimentales del cultivo de arroz Oryza sativa L En cuanto a laboratorio si se realiza un estudio en laboratorio en cuanto a la bacteria se recomienda utilizar un protocolo adecuado además utilizarlas antes de llevarlas a campo porque luego puede existir contaminación por ende no se obtendrá un buen resultado en laboratorio Se recomienda continuar investigando el efecto de estos simbiontes en la productividad del cultivo de arroz y en otros aspectos importantes para la agricultura como la resistencia a enfermedades y la tolerancia a factores ambientales adversos Se recomienda trabajar con agricultores y empresas agrícolas para aplicar los conocimientos adquiridos en la tesis en la práctica agrícola mejorando así la productividad y la sostenibilidad del cultivo de arroz 62 8 Bibliografía Acevedo M y Castrillo W 2006 Origen evolución y diversidad del arroz En Agronomía Tropical Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas INIA Arregocés O Rosero M y González J 2005 Morfología de la planta de arroz Centro Internacional de Agricultura Tropical 116 Asamblea Nacional 2019 Sanidad Agropecuaria Reglamento General De La Ley Orgánica De Sanidad Agropecuaria 12 Asamblea Nacional 2018 Ley Orgánica del Régimen de la Soberania Alimentaria Ley Orgánica Del Regimen de La Soberanía Alimentaria 25 255 Asamblea Nacional Constituyente 2008 Ley Orgánica De Sanidad Agropecuaria Bacilio D y Bernilla B 2015 Efecto de la inoculación mixta de Rhizobium etli y Bradyrhizobium yuanmingense sobre el crecimiento aéreo y radicular de Oryza sativa Becerra V 2007 Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz Sistemas de Producción de Arroz En Colombia 2260 Calvo S 2010 Bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno 177 Camacho M 2015 Estudios sobre las actividades reductoras de nitratos en Bradyrhizobium spp relaciones con la fijación simbiótica de Nitrogeno Catalá E y Tomás N 2014 Sesiones Formativas Irta de las Mejores Prácticas del cultivo de arroz 74 Catuto A 2013 Efecto de inoculación de Rhizobium en el creciemiento y nutrición de las plántulas de soya en la zona de Manglaralto Cantón Santa Elena Tesis de pregrado Universidad Estatal Península de Santa Elena Santa Elena Ecuador Corbera J 2011 Evaluación de la inoculación conjunta Bradyrhizobium japonicum 63 hongos ma y la aplicación de un bioestimulador del crecimiento vegetal en soya cultivada en época de primavera Corrales J Villalobos K Vargas A Rodríguez J y González A 2017 Principales plagas de artropodos en cultivo de arroz Cuadrado B Rubio G y Santos W 2010 Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium con habilidad de nodulación seleccionados de los cultivos de fríjol caupi Vigna unguiculata como potenciales bioinóculos Cuevas A y Higuera H 2018 Guía para el monitoreo y manejo de enfermedades Degiovanni V Berrío L y Charry R 2017 Origen taxonomía anatomía y morfología de la planta de arroz Oryza sativa L Ferreira A 2018 Caracterización morfológica de aislados nativos de Bradyrhizobium sp y tolerancia a condiciones de estrés García S 2011 Bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno Gutiérrez A García A Antigua G Gómez J Correa F y Meneses R 2015 Guía para el Trabajo de Campo en el Manejo Integrado de Plagas del Arroz Guzmán D 2006 Manejo agronómico del cultivo de arroz Oryza sativa L sembrado bajo riego en finca ranchos Horizonte Cañas Costa Rica Tesis de pregrado Instituto tecnológico de Costa Rica sede regional San Carlos Guanacaste Costa Rica Hablich R 2021 Ánalisis multicreativo para determinar la fertilización del cultivo de arroz aplicando SIG Tesis de pregrado Universidad Agraria del Ecuador Guayaquil Ecuador Herrera F 2010 Comparación entre coinoculación con Bradyrhizobium japonicum y Azospirillum brasilense e inoculación simple con Bradyrhizobium japonicum en la nodulación crecimiento y acumulación de N en el cultivo de soja 64 Hortus 2022 Ficha técnica BlueN Methylobacterium symbioticum 12 Hubel 2021 Ficha Técnica de Producto Methylobacterium symbioticum 79 Jara I 2015 Análisis agroecológico de la producción de arroz Oryza sativa L en la parroquia Pimocha del cantón Babahoyo provincia de Los Ríos Tesis Maestría Universidad Agraria del Ecuador Jetter C Rosatto D y Jaureguiberry E 2008 Guía de Buenas Prácticas Agrícolas para el cultivo de arroz en Corrientes kruger R y Burdyn L 2015 Guía identificación de plagas del cultivo del arroz Oryza sativa L para la Provincia de Corrientes Latsague M Sáez Patricia y Mora M 2014 Efecto de la fertilización con nitrógeno fósforo y potasio sobre el contenido foliar de carbohidratos proteínas y pigmentos fotosintéticos en plantas de Berberidopsis corallina Lodeiro A y Covelli J 2013 Biofertilización con Bradyrhizobium japonicum para la agricultura sustentable Tesis doctoral Universidad Nacional de la Plata Buenos Aires Argentina Lozada M 2014 Evaluación de nitrógeno en sus diferentes formas y su relación con las bacterias nitrificantes en el lago de Xochimilco Tesis de pregrado Universidad nacional autonoma de México Xochimilco México Medina M Ceja L López S Venegas J y Sánchez C 2019 Efecto de Methylobacterium extorquens en el desarrollo del tomate en presencia o ausencia de Fusarium oxysporum Medina M Ceja L y López S 2019 Efecto de Methylobacterium extorquens en presencia o ausencia de Fusarium oxysporum Meneses R 2008 Manejo integrado de los principales insectos y ácaros plagas del arroz en Cuba 65 Montero P Domingo C Palma E Tomás N y Catalá M 2017 Manual de Buenas Prácticas en el cultivo de arroz Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias 631 Morán L 2015 Caracterización morfológica molinera y culinaria de 25 cultivares criollos de arroz Oryza sativa L con fines de mejoramiento genético en la zona de Yaguachi provincia del Guayas Tesis de pregrado Universidad Agraria del Ecuador Yaguachi Ecuador Olivo C 2022 Antagonismo de biocontroladores sobre el manchado del grano de arroz Oryza sativa L en condiciones in vitro Tesis de pregrado Universidad Agraria del Ecuador Guayaquil Ecuador Olmos S 2007 Apunte de morfología fenología ecofisiología y mejoramiento genético del arroz Cátedra de Cultivos II Facultad de Ciencias Agrarias UNNE Corrientes 2006 Argentina 13 Ortega R 2016 Aspectos básicos de la fijación de nitrógeno atmosférico Paredes M Alfaro M 2015 Producción de arroz Buenas Prácticas Agrícolas BPA Paredes M Becerra V Gepts P y Donoso G 2021 Capítulo 1 Origen del Arroz Oryza sativa L Plata G Navia O y Garandillas A 2019 Manejo de enfermedades en el cultivo de arroz mediante bacterias biocontroladoras Puentes A 2016 Efecto de la inoculación con Bradyrhizobium sp y Trichoderma harzianum en triticale X Triticosecale Wittmack en condiciones de estrés por sequía Romero F 2015 Respuesta de Bradyrhizobium japonicum a la adición de alginato en presencia de fungicidas peletizados en semillas de soya 66 Ronquillo A 2017 Efectos de diferentes dosis de un biofertilizante orgánico mineral en el cultivo de arroz Oryza sativa L Daule Provincia del Guayas Tesis de pregrado Universidad Agraria del Ecuador Daule Ecuador Santos E 2009 Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium con habilidad de nodulación Scott G 2020 Efecto de biofertilizantes como complemento para incrementar la productividad en el cultivo de arroz en cantón Yaguachi Tesis de pregrado Universidad Agraria del Ecuador Yaguachi Ecuador Tinoco A 2009 Manual de recomendaciones técnicas para cultivo de arroz Tomás N y Catalá M 2014 Ficha técinca del Instituto de investigación y tecnología Agroalimentaria de las mejores práticas del cultivo de arroz Trujillo L Ramírez Ry Gonzáles D 2015 Producción de un inoculante líquido de Bradyrhizobium japonicum con alto impacto en la siembra mecanizada de la soya en Cuba Universidad Pública de Navarra 2021 Optimización de nutrición nitrogenada en hortícolas de hoja crecidas en sistema de hidroponía pura Uso de inoculantes microbianos 8 Valencia R y Gómez L 2012 Caracterización molecular de las cepas de Bradyrhizobium japonicum J01 J96 y J98 mediante protocolos repPCR Vivas L y Intriago D 2012 Guía para el reconocimiento y manejo de las principales enfermedades en el cutlivo de arroz 67 9 Anexos Figura 2 Área de realización del ensayo Google Earth 2023 Figura 3 Croquis de trabajo experimental Velasco 2023 68 Figura 4 Ficha técnica de Bradyrhizobium japonicum Fertigran 2023 Figura 5 Ficha técnica Methylobacterium symbioticum Symborg 2023 69 Figura 6 Tabla costos de producción Velasco 2023 Figura 7 Análisis estadístico de altura de planta a los 15 días Velasco 2023 70 Figura 8 Altura de planta a los 15 días Velasco 2023 Figura 9 Análisis estadístico de altura de planta a los 30 días Velasco 2023 71 Figura 10 Altura de planta a los 30 días Velasco 2023 Figura 11 Análisis estadístico de altura de planta a los 45 días Velasco 2022 72 Figura 12 Altura de planta a los 45 días Velasco 2023 Figura 13 Análisis estadístico de longitud de la espiga cm Velasco 2023 73 Figura 14 Longitud de la espiga Velasco 2023 Figura 15 Análisis estadístico de espigas por plantas Velasco 2023 74 Figura 16 Espigas por plantas Velasco 2023 Figura 17 Análisis estadístico de número de granos llenos Velasco 2023 75 Figura 18 Números de granos llenos Velasco 2023 Figura 19 Análisis de 1000 granos g Velasco 2023 76 Figura 20 Peso de 1000 granos g Velasco 2023 Figura 21 Análisis estadístico de Productividad KgHa Velasco 2023 77 Figura 22 Productividad KgHa Velasco 2023 Figura 23 Delimitación del área experimental Velasco 2023 78 Figura 24 Área experimental Velasco 2023 Figura 25 Elaboración de muros Velasco 2023 79 Figura 26 Delimitación de bloques para cada tratamiento Velasco 2023 Figura 27 Trasplante de plántulas de arroz Velasco 2023 80 Figura 28 Trasplante de plántulas de arroz Velasco 2023 Figura 29 Cultivo de arroz trasplantado Velasco 2023 81 Figura 30 Arroz 20 días de ser trasplantado Velasco 2023 Figura 31 Realización de estacas con carteles de cada tratamiento Velasco 2023 82 Figura 32 Control manual de malezas Velasco 2023 Figura 33 Aplicación de bacterias fijadoras de nitrógeno Velasco 2023 83 Figura 34 Toma de primeras variables de altura Velasco 2023 Figura 35 Toma de variables de producción Velasco 2023 84 Figura 36 Visita de tutor de tesis Velasco 2023 Figura 37 Cosecha manual de arroz Velasco 2023 85 Figura 38 Elaboración de medio de cultivo agar nutritivo Velasco 2023 Figura 39 Propagación de bacterias Velasco 2023 86 Figura 40 Bacteria Bradyrhizobium sp Velasco 2023 Figura 41 Methylobacterium symbioticum SB23 Velasco 2023 87 Figura 42 Realización de confrontación Velasco 2023 Figura 43 Confrontación mayor crecimiento Bradyrhizobium japonicum Velasco 2023 INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM Escola Superior Agraria de Santarém Efeito da bactéria Methylobacterium symbioticum na adubação azotada em laranjeiras Dissertação Mestrado em Engenharia Agronómica Nuno José Alves Quaresma Rodrigues Primo Orientação Doutora Ana Mafalda Dúlio Ribeiro Pacheco Ferreira orientadora Berto Filipe Lopes Correia coorientador Dezembro 2023 POLITÉCNICO DE SANTARÉM II III Agradecimentos Quero expressar a minha profunda gratidão a todas as pessoas que contribuíram para a realização deste trabalho pois sem o seu apoio e orientação este feito não seria possível À Doutora Mafalda Ferreira da Escola Superior Agrária de Santarém e ao Engenheiro Berto Correia da empresa Hubel Verde agradeço pela orientação perspicaz paciência e encorajamento ao longo deste percurso académico Estas contribuições foram fundamentais para o desenvolvimento desta tese e para o meu crescimento como profissional À equipa da empresa Zona Imperial onde tive a oportunidade de realizar o estágio expresso o meu agradecimento por me terem aceite na empresa e terem enriquecido o meu conhecimento a nível profissional Gostaria também de agradecer à minha família por todo o apoio dado especialmente nestes últimos anos e por todo os esforços que fazem diariamente por mim A execução desta dissertação foi também facilitada com o apoio diário dos meus amigos mais chegados e a todos eles agradeço o apoio recebido Quero agradecer sobretudo aos meus colegas da ESAS que me permitiram concluir com sucesso este projeto apesar de todas as adversidades IV V AbreviaturasSímbolos ATP Adenosina Trifosfato FMA Fungos Micorrízicos Arbusculares GS Glutamina Sintese GOGAT Glutamato Sintese IAF Índice de Área Foliar MDH Metanol por meio da Desidrogenase do Metanol N Azoto N2 Azoto Molecular Diatómico Na Sódio NADH Nicotinamidaadenina Dinucleótido NADPH Nicotinamidaadenina Dinucleótido Fosfato NH4 Ião de Amónio NH3 Amoníaco NO3 Nitrato NO2 Nitrito NPK Azoto Fosforo Potássio UFC Unidades Formadoras de Colónias SPAD SoilPlant Analyses Development VI VII Resumo A necessidade de estratégias sustentáveis na agricultura tem despertado o interesse em explorar o potencial das bactérias fixadoras de azoto como uma alternativa promissora na redução da dependência de fertilizantes químicos e no aumento da produtividade das culturas A Methylobacterium simbioticum sp nov é uma bactéria isolada dos esporos de um fungo micorrízico arbuscular Glomus iranicum var tenuihypharum que induz uma biomassa vegetal elevada levando a rendimentos mais elevados não apenas em culturas anuais mas também em culturas perenes O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dessa bactéria na capacidade de fixação do azoto e o efeito no crescimento de árvores de laranjeira O ensaio foi realizado em estufa de viveiros de árvores de fruto localizada na Lousã O delineamento experimental utilizado foi totalmente casualizado com cinco repetições Foram ensaiados dois fatores fertilização azotada com 5 níveis de fator 100 90 80 60 e 50 da dose de azoto recomendada para a cultura e uma aplicação com Methylobacterium symbioticum com 1 nível de fator 100 O ensaio teve início em julho e terminou em setembro de 2023 Durante esse período foram realizadas observaçoes semanais da altura das plantas diâmetro basal e área foliar No final do ensaio realizouse uma análise à seiva Embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre tratamentos no que respeita aos parâmetros analisados os resultados sugerem uma influência positiva no crescimento das plantas com a aplicação da Methylobacterium sp especialmente no tratamento com redução de 40 de azoto Contudo esses resultados não se mostraram com expressão suficiente para concluir um efeito positivo da utilização da bactéria quanto aos parâmetros avaliados Assim recomendase a realização de novos estudos para avaliar a eficácia da bactéria Methylobacterium sp para esta e outras culturas Palavraschave Laranjeira azoto fixação biológica Methylobacterium simbioticum spnov VIII IX Abstract The need for sustainable strategies in agriculture has sparked interest in exploring the potential of nitrogenfixing bacteria as a promising alternative for reducing dependence on chemical fertilizers and increasing crop productivity Methylobacterium symbioticum sp nov is a bacterium isolated from the spores of an arbuscular mycorrhizal fungus Glomus iranicum var tenuihypharum which induces high plant biomass leading to higher yields not only in annual crops but also in perennial crops The objective of this work was to study the effect of this bacteria on the nitrogen fixation capacity and the effect on the growth of orange trees The test was carried out in a fruit tree nursery greenhouse located in Lousã The experimental design used was completely randomized with five replications Two factors were tested nitrogen fertilization with 5 factor levels 100 90 80 60 and 50 of the recommended nitrogen dose for the crop and an application with Methylobacterium symbioticum with 1 factor level 100 The trial began in July and ended in September 2023 During this period weekly observations of plant height basal diameter and leaf area were carried out At the end of the test a sap analysis was carried out Although no significant differences were observed between treatments with regard to the analyzed parameters the results suggest a positive influence on plant growth with the application of Methylobacterium sp especially in the treatment with a 40 nitrogen reduction However these results were not sufficiently expressive to conclude a positive effect of using the bacteria in terms of the parameters evaluated Therefore it is recommended that new studies be carried out to evaluate the effectiveness of the bacteria Methylobacterium sp for this and other cultures Keywords Orange tree nitrogen biological fixation Methylobacterium simbioticum spnov X XI Índice Agradecimentos III AbreviaturasSímbolos V Resumo VII Abstract IX Índice de quadros XIII Índice de figuras XV 1 Introdução 1 2 Pesquisa Bibliográfica 3 21 Cultura da laranjeira 3 22 Caracterização botânica da planta 4 221 Variedade Lane Late 4 222 Nutrição da laranjeira 6 23 O Azoto 7 24 Ciclo do azoto 8 25 Fixação biológica do azoto 10 26 Methylobacterium Simbioticum 12 3 Materiais e Métodos 15 31 Caracterização do Local de Ensaio 15 311 Estufa de Propagação de Citrinos 15 312 Sistema de Rega e Fertilização 16 32 Protocolo Experimental 17 4 Resultados e discussão 23 41 Altura das plantas 23 42 Diâmetro basal 27 43 Área foliar 29 XII 44 Analise à seiva 30 5 Considerações finais 32 6 Referências bibliográficas 34 Anexos 38 XIII Índice de Quadros Quadro 1 Organismos que intervêm na fixação biológica do azoto 10 Quadro 2 Tratamentos realizados 17 Quadro 3 Quantidade de adubo NPK utilizado em cada um dos tratamentos 21 Quadro 4 Altura Média Semanalcm e Respetivo Desvio Padrão nos tratamentos T1 100 adubação T2 100 adubaçãobactéria T390 adubaçãobactéria T480 adubaçãobactéria T560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100 bacteria 24 Quadro 5 Diâmetro Basal médio mm e respetivo desvio padrão nos tratamentos T1 100 adubação T2 100 adubação bactéria T390 adubaçãobactéria T480 adubaçãobactéria T560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100 bacteria 27 Quadro 6 Valores médios da área foliar total cm² nos tratamentos T1 100 adubaçãoT2100 adubaçãobactériaT390 adubaçãobactériaT480 adubaçãobactériaT560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100bacteria 29 Quadro 7 Analise à seiva para visualização da quantidade de NO³ presente na planta em ppm nos tratamentos T1 100 adubação T2 100 adubaçãobactéria T390 adubaçãobactéria T480 adubaçãobactéria T560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100 bacteria 30 Quadro 8 Ensaios de campo onde foi aplicado Methylobacterium symbioticum sp 31 XIV XV Índice de Figuras Figura 1 Laranjeira da variedade Lane Late 5 Figura 2 Morfologia da laranja da variedade Lane Late 5 Figura 3 Planta com sintomas visíveis de carência em Azoto 8 Figura 4 Processo de fixação de azoto atmosférico 12 Figura 5 Methylobacterium isolada da filosfera de folhas de mostarda 13 Figura 6 Ensaios in vitro onde foi aplicado Methylobacterium symbioticum spnov 14 Figura 7 Localização da empresa e da estufa onde foi realizado o ensaio 15 Figura 8 Plantas selecionadas para o ensaio 18 Figura 9 Local onde foram colocadas as plantas do ensaio 18 Figura 10 Analise da área foliar através do programa imagemJ 19 Figura 11 Análise à seiva e ao grau Brix nos tratamentos do ensaio 19 Figura 12 Primeiro segundo e terceiro teste de adubação respetivamente 21 Figura 13 Aplicação do adubo misturado no substrato 22 Figura 14 Altura média cm a 16 de março das plantas selecionadas para o ensaio nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria 23 Figura 15 Altura média semanal cm nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria As setas indicam as semanas nas quais se aplicou o adubo e a bactéria 25 Figura 16 Diâmetro basal médio nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria 28 1 1 Introdução O aumento exponencial da população mundial tem levado a uma enorme pressão sobre os recursos da Terra De acordo com dados estatísticos das Nações Unidas a população mundial estará perto de 11 bilhões de pessoas e haverá mais 2 a 3 bilhões de pessoas para alimentar Nações Unidas 2022 Este crescimento tem levado à expansão da produção agrícola à exigência de maiores rendimentos das colheitas e ao cultivo de terras agrícolas adicionais Um efeito direto dessa tendência é o aumento do uso de fertilizantes azotados Fernandes et al 2021 Liang et al 2019 e o aumento constante da prevalência da agricultura em terras marginais áridas e semiáridas especialmente no mundo em desenvolvimento Lantican et al 2003 Köberl et al 2011 Na agricultura a disponibilidade de azoto é geralmente considerada um dos fatores mais importantes para a nutrição vegetal uma vez que exceção feita às leguminosas o azoto é o elemento que mais limita as produções Por um lado as plantas absorvem grandes quantidades deste nutriente Por outro como não é possível constituir reservatórios de azoto inorgânico nos solos devido à sua elevada mobilidade é aquele que mais frequentemente aparece em deficiência sendo sistematicamente necessário suplementar as disponibilidades naturais do solo recorrendo à aplicação de fertilizantes Por estas razões o azoto é o nutriente que usualmente é fornecido em maior quantidade às culturas sendo a sua aplicação inadequada a principal responsável por situações de sobrefertilização e frequente poluição das águas superficiais e subterrâneas Despacho nº 12302018 Decreto Lei nº 25 de 5 de fevereiro de 2018 do Ministério do Ambiente e Agricultura Florestas e Desenvolvimento Rural No âmbito da Estratégia do Prado ao Prato uma das principais ações do Pacto Ecológico Europeu a Comissão Europeia visa reduzir as perdas de nutrientes em pelo menos 50 até 2030 sem deterioração da fertilidade do solo Tal deverá resultar numa redução da utilização de fertilizantes de pelo menos 20 Comissão Europeia 2023 Neste contexto é cada vez mais importante adotar estratégias mais sustentáveis para aumentar a eficiência do uso do azoto e reduzir o impacto negativo da sobredosagem deste nutriente sobre o ambiente A utilização de biofertilizantes poderá constituir uma estratégia viável para esse efeito 2 Os biofertilizantes são produtos cujo princípio ativo são microrganismos vivos não patogénicos que favorecem a nutrição e ou o desenvolvimento das plantas sem afetar a diversidade biológica do solo e o ambiente com exclusão dos denominados agentes de controlo biológico biofungicidas bionematicidas e bioinsecticidas portaria 1852022 de 21 de julho de 2022 Estes produtos atuam na fertilidade e nutrição das plantas trazem melhorias nos processos físicoquímicos e biológicos do solo aumentam sua capacidade produtiva e ainda regeneram os sistemas de produção JenHshuan Chen 2006 Nesse cenário emerge uma abordagem agrícola mais sensível que visa não apenas a produção de alimentos mas também a proteção do meio ambiente A pesquisa de alternativas para fornecer azoto às plantas de forma sustentável tem vindo a aumentar e a bactéria Methylobacterium Simbioticum spp apresentase como uma forma promissora para a obtenção de azoto graças à sua capacidade de fixação de azoto atmosférico O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito desta bactéria na nutrição azotada da laranjeira através da altura diâmetro basal índice de área foliar e analise à seiva das plantas como indicadores de crescimento 3 2 Pesquisa Bibliográfica 21 Cultura da Laranjeira A laranjeiras Citrus sinensis L são usadas predominantemente para a produção de frutos mas também encerram grande interesse como plantas ornamentais Enquanto grupo de culturas frutícolas é um dos mais importantes a nível mundial Oriundos do continente asiático China e Índia os citrinos adaptaramse bem em muitas zonas do mundo com especial destaque para a bacia do Mediterrâneo Em Portugal podemos encontrar a cultura da laranjeira em todo o país sendo predominante no Algarve no litoral alentejano e noutras zonas microclimáticas espalhadas pelo país Duarte 2014 Os citrinos ocupam um lugar de destaque na fruticultura nacional tendo o recenseamento geral agrícola de 2009 apurado uma área de citrinos no território nacional de 16389 ha com predomínio das laranjeiras com 13631 ha de área plantada Tomás 2016 No Algarve a área de laranjeiras corresponde a 68 do total nacional a de laranjeiras a 80 do total nacional e a área de limoeiros a 31 do total nacional Tomás 2016 A produção mundial de laranja em 2022 foi de cerca de 110 milhões de toneladas O Brasil foi o maior produtor mundial com uma produção de cerca de 45 milhões de toneladas seguido da China com uma produção de cerca de 25 milhões de toneladas A produtividade média mundial de laranja é de cerca de 40 toneladas por hectare O Brasil e a China apresentam as maiores produtividades mundiais com valores de cerca de 60 e 50 toneladas por hectare respetivamente Santos e Silva 2023 Em Portugal a produção de laranja em 2022 foi de cerca de 355 mil de toneladas A região do Algarve é a principal produtora de laranja em Portugal sendo responsável por cerca de 80 da produção nacional A área plantada com laranjeiras é cerca de 17 221 mil ha A região do Algarve é também a região com a maior área plantada com laranjeiras em Portugal com cerca de 80 mil hectares Instituto Nacional de Estatística INE 2022 4 22 Caracterização botânica da planta A laranjeira Citrus sinensis é uma árvore de fruto da família Rutaceae nativa da Ásia É uma espécie híbrida resultante do cruzamento de duas espécies de citrinos a tangerina Citrus reticulata e a citrina Citrus medica Pertence ao Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Sapindales Família Rutaceae Subfamília Aurantioideae Tribo Citreae Gênero Citrus Espécie Citrus sinensis Silva 2022 Em relação à sua morfologia podese caracterizar por uma árvore de porte médio com uma altura média entre 5 a 10 metros A copa é arredondada com folhas verdeescuras e brilhantes As flores são brancas com cinco pétalas Os frutos da laranjeira são hesperídios com casca lisa e brilhante O interior do fruto é dividido em gomos que contém a polpa e as sementes Silva 2022 221 Variedade Lane Late Descoberta na propriedade de Lindsay Lane em Curlwaa New South Wales Austrália em 1954 Presumese que será uma mutação da Washington Navel Adquiriu grande importância no Algarve a partir de meados da década de noventa por ser mais tardia que as variedades do grupo Navel até então cultivadas na região É bastante produtiva O fruto pode manterse na árvore até abril ou maio sem perda de qualidade Tomás 2016 A estrutura da árvore é composta por uma copa de forma esférica por vezes elipsoide Vigor médio com ramos principais medianamente densos e de crescimento vertical mas com tendência para apresentar ramos pendentes na zona inferior da copa Apresenta alguns espinhos retos Na maturação o fruto mantém uma boa aderência ao pedúnculo Figura 1 Tomás 2016 O fruto é caracterizado por ter tamanho médio a grande embora ligeiramente inferior ao da Newhall com forma tendencialmente redonda Tem umbigo pequeno Pode apresentar caneladuras mais ou menos longas desde o cálice até à zona estilar Não tem sementes Figura 2 Tomás 2016 5 Figura 1 Laranjeira da variedade Lane Late Fonte Tomás 2016 Figura 2 Morfologia da laranja da variedade Lane Late Fonte Tomás 2016 6 222 Nutrição da Laranjeira Para obter uma boa produtividade e uma elevada qualidade da produção é necessário não descurar a fertilização do pomar O diagnóstico do estado nutritivo do pomar deve ser feito anualmente através de uma análise de folhas colhidas no período compreendido entre setembro e novembro quando as folhas da rebentação de primavera têm 79 meses de idade Não é conveniente realizar a amostragem antes de 1520 dias depois da última adubação O período mais crítico em termos da nutrição do pomar é a primavera quando ocorre a floração e o vingamento do fruto e numa época em que a temperatura não favorece a absorção de nutrientes Assim é conveniente dar muita atenção à adubação de outono para que as árvores entrem no Inverno em bom estado e estejam preparadas para dar uma boa floração sem atingir um estado crítico em termos de teores de nutrientes Todos ou quase todos os fertilizantes são aplicados por fertirrega sendo por vezes conveniente complementar com uma aplicação de micronutrientes por via foliar Duarte 2014 Os requisitos nutricionais das plantas inclusive da laranjeira são fundamentais para o seu desenvolvimento estrutural e para a captação da energia luminosa para a fotossíntese Estudos como o de Paredes PrimoMillo 1988 identificaram os principais nutrientes necessários destacando a importância do azoto fósforo potássio e micronutrientes como ferro zinco e manganês As deficiências nutricionais são identificadas por sintomas visuais nas plantas e Alva et al 2018 analisaram esses sintomas auxiliando na deteção precoce de problemas nutricionais Por outro lado o excesso de nutrientes como azoto e potássio pode ter impactes negativos na cultura incluindo a poluição do solo e da água conforme discutido por Smith e Jones 2016 Para contrariar os impactes negativos do uso de fertilizantes químicos Xavier et al 2020 investigaram estratégias como o uso de biofertilizantes e coberturas mortas na nutrição da laranjeira Os resultados desse estudo sugerem que as estratégias de nutrição sustentável podem ser uma alternativa viável aos fertilizantes químicos tradicionais Essas estratégias podem ajudar a melhorar a produtividade a qualidade dos frutos e a saúde das plantas além de reduzir o impacte ambiental da agricultura Os microrganismos do solo também desempenham um papel importante na nutrição da laranjeira conforme identificado por Santos et al 2017 que ao investigar o papel dos 7 microrganismos do solo na nutrição da laranjeiraclementina concluíram que estes podem melhorar a absorção de nutrientes pelas plantas levando a um aumento da produtividade e da qualidade dos frutos 23 O Azoto O azoto é o nutriente mais importante exigido por plantas cultivadas e a sua escassez no solo afeta significativamente o rendimento das culturas Por sua vez as quantidades excessivas no solo podem resultar em efeitos ambientais indesejáveis O esgotamento do azoto em solos agrícolas ocorre principalmente por meio da remoção de plantas Muitas vezes é restabelecido através de adição de fertilizantes azotados ou em parte através de processos naturais nomeadamente a fixação biológica Estimase que à escala global a fixação biológica de azoto possa contribuir com cerca de 90 milhões de toneladas de N ha1 ano1 em sistemas agrícolas dos quais a simbiose Rhizobiumleguminosa é estimada em cerca de 40 milhões de toneladas Ahmad 1996 citado por Ladeira 2017 O azoto é o macronutriente mais abundante nas plantas sendo também o mais exigido em relação aos demais A sua função mais importante está relacionada com sua participação na constituição das proteínas Além disso participa também na formação de compostos indispensáveis às plantas como purinas pirimidinas e coenzimas Varennes 2003 De todos os nutrientes minerais o azoto é o mais importante para o crescimento das plantas influenciando o crescimento das folhas e consequentemente a disponibilidade de hidratos de carbono disponíveis para o crescimento a taxa fotossintética por unidade de área da folha bem como o número e tamanho de órgãos de armazenamento Varennes 2003 No entanto a carência de azoto é uma das principais deficiências nutricionais que afeta as laranjeiras Os efeitos da deficiência de azoto nas laranjeiras incluem crescimento reduzido redução da produção e redução na qualidade do fruto Silva et al 2022 Sendo o azoto um componente essencial de todas as proteínas promove a formação da clorofila e por esse motivo um dos principais sintomas visuais da sua deficiência é a coloração amarelada das folhas jovens Figura 3 Barros 2020 8 Figura 3 Planta com sintomas visíveis de carência em Azoto Fonte Gasparotto Bueno1999 24 Ciclo do Azoto As principais formas de azoto absorvidas pelas plantas são os iões amónio NH4 e nitrato NO3 O ião nitrito NO2 e certos compostos orgânicos simples aminoácidos ureia ácido úrico etc podem também ser absorvidos pelas raízes mas em quantidades reduzidas Campbell 1978 citado por Coutinho 2000 Estas duas formas de azoto que as plantas absorvem com mais ou menos facilidade resultam essencialmente da degradação de compostos azotados mais complexos que existem quer na matéria orgânica quer na população microbiana do solo A maior parte de amónio absorvido é incorporado em formas orgânicas nas raízes enquanto o nitrato possui grande mobilidade na planta sendo translocado no xilema ou podendo ser armazenado nos vacúolos das células da raiz parte aérea e órgãos de reserva sem ser incorporado em compostos orgânicos Marschner 1995 A assimilação do nitrato implica a sua redução a amoníaco NH3 Esta reação dáse em dois passos em primeiro lugar o nitrato é reduzido a nitrito NH2 no citoplasma pela enzima nitrato redutase atuando a nicotinamidaadenina dinucleótido NADH ou a nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NADPH como dadores de eletrões o nitrito é de seguida reduzido a amónio NH4 nos cloroplastos das folhas ou proplastídeos das raízes pela redutase normalmente com a ferredoxina reduzida como dador de eletrões A energia para 9 a redução dos nitratos é retirada da respiração ou de produtos das reações luminosas da fotossíntese Carvalho 1997 A localização da redução de nitrato nas plantas é muito importante porque envolve custos energéticos ligados ao transporte e metabolismos dos ácidos carboxílicos envolvidos na síntese de aminoácidos Quando a redução ocorre nas raízes implica que uma quantidade apreciável de esqueletos de carbono seja transportada das folhas para as raízes uma vez que o amoníaco praticamente não é translocado quer no xilema quer no floema Carvalho 1997 Enquanto o nitrato pode ser armazenado nos vacúolos sem provocar efeitos tóxicos o amónio e sobretudo o amoníaco são tóxicos O amoníaco produzido na redução do nitrato ou na fotorrespiração nas plantas C3 e o amónio absorvido diretamente pelas raízes combinamse com ácidos orgânicos para formar aminoácidos amidas e compostos afins evitando a toxicidade que poderia ocorrer por acumulação das formas reduzidas de azoto Marschner 1995 A incorporação de amoníaco em aminoácidos envolve uma via metabólica cíclica envolvendo duas enzimas a glutamina sintetase GS e a glutamato sintetase GOGAT Nas plantas estas enzimas foram identificadas em raízes e cloroplastos A primeira envolve a combinação de amónio ácido glutâmico e consumo de ATP produzindo glutamina A GS tem uma forte afinidade com o amoníaco sendo capas de incorporálo se este se encontrar em baixas concentrações Carvalho 1997 Para que a assimilação de amoníaco prossiga verificase a reposição de ácido glutâmico a partir da glutamina e do ácido oxaloglutárico numa reação que envolve a GOGAT que produz duas moléculas de ácido glutâmico por cada molécula de glutamina Uma destas moléculas é utilizada na assimilação de amoníaco sendo a outra utilizada na síntese de compostos azotados Carvalho 1997 10 25 Fixação Biológica do Azoto A fixação biológica de azoto é comum a um conjunto de microrganismos procariotas que possuem o complexo enzimático nitrogenase a partir do qual conseguem transformar o azoto atmosférico em azoto utilizável pelas plantas Estes organismos são conjuntamente designados diazotrofos Santos 2015 A fixação biológica do azoto atmosférico consiste na redução de azoto molecular N2 a amoníaco NH3 o qual é convertido numa forma orgânica Este processo é realizado tanto por bactérias que vivem livremente nos seus habitats como por bactérias que estabelecem relações de simbiose com diversas plantas Militão 2004 Quadro 1 Organismos que intervêm na fixação biológica do azoto Fonte Intagri 2018 Formas de vida Tipos de Organismos Exemplos Livre Bactérias Azotobacter spp Clostridium pasteurianum Beijerinckia sp Cianobactérias Nostoc spp Anabaena sp Actinobactérias Frankia alni Em Simbiose Rhizobium Parasponia sppRizhobium sppEnsifer sppBradyrhizobium sppAzorhizobium sppMesorhizobium sp Cianobactérias Nostoc spp parmotremma stuppeum caloplaca saxícola Notothylas spp Anthoceros sppAbabaena azollae Nostoc punctiforme calothrix spOscillatoria spRivularia sp Associação não simbiótica Bactérias Filosfera Methylobacterium mesophilicumMethylobacterium simbioticumAzobacter spBeijerinckia spPseudomonas syringae Bactérias Rizosfera Azospirillum spEnterobacter sppKlebsiella spp Pseudomonas SppBurkholderia spp A nitrogenase é uma enzima produzida por determinadas bactérias essencial para o processo de fixação biológica de azoto Requer grande quantidade de energia adenosina trifosfato o ATP para romper a ligação tripla que existe entre os átomos de N conforme a seguinte equação 11 As plantas geram energia necessária para este processo mediante a fotossíntese Por sua vez os microrganismos utilizam essa energia para a fixação de azoto Unkovich et al 2008 A enzima nitrogenase proteínachave na fixação do azoto consiste em duas proteínas componentes O componente I proteína que contém molibdénio e ferro é constituído por quatro subunidades cada uma delas com uma hélice simples de aminoácidos contendo vinte e quatro átomos de ferro dois átomos de molibdénio e cerca de 28 átomos de enxofre ácido lábil O componente II proteína que contém ferro é constituído por duas subunidades e inclui quatro átomos de ferro e quatro átomos de enxofre ácido lábil Na composição em aminoácidos da proteína de ferromolibdénio predominam ácidos acíclicos possuindo todos os aminoácidos comuns A proteína do componente II não contém triptofano Hoffmann et al 2014 Militão 2004 A fixação do azoto implica a transferência de átomos de hidrogénio dos glícidos para o azoto que se opera através da nitrogenase existente apenas em procariontes Os eletrões provenientes dos glícidos são transferidos para o componente II e depois para o componente I onde ocorre a redução de azoto a amónia sendo os protões removidos do meio aquoso da célula O funcionamento dos dois componentes necessita de ATP Hoffmann et al 2014 Militão 2004 Os eletrões provêm da ferredoxina que pode ser reduzida de diversas formas de acordo com o organismo de proveniência através da fotossíntese nas bactérias processos respiratórios em fixadores de azoto aeróbios ou fermentações em organismos anaeróbios como é exibido na Figura 4 12 Figura 4 Processo de fixação de azoto atmosférico Fonte Hubel Verde 2021 26 A Methylobacterium Simbioticum O género Methylobacterium pertence à ordem Rhizobiales subclasse αProteobacteria e à família Methylobacteriaceae É composto por bactérias de coloração rosa metilotróficas facultativas PPFM pinkpigmented facultative methylotrophic que podem fixar azoto nodular a planta hospedeira produzir citocinina e as enzimas pectinase e celulase podendo dessa forma promover o crescimento vegetal devido à disponibilidade de azoto e à indução de resistência sistémica As bactérias Methylobacterium spp têm sido descritas como endófitas ou epífitas em diferentes plantas hospedeiras onde a sua colonização e distribuição no hospedeiro podem ser influenciadas pelo genótipo da planta ou por interações com outros microrganismos associados ao hospedeiro Dourado 2010 A principal característica desse grupo está na habilidade de oxidar metanol por meio da desidrogenase do metanol MDH codificada pelo gene mxaF Estas bactérias apresentam como características taxonómicas a forma de bastonete reto e metabolismo estritamente aeróbio Figura 5 Crescem ativamente em tecidos meristemáticos formando populações entre 104 e 106 unidades formadoras de colónias UFC por grama de tecido da planta onde podem formar biofilmes e utilizar o metabolismo metilotrófico como vantagem durante a 13 colonização da planta hospedeira Ocupam os mais diferentes habitats incluindo solo água superfícies de folha nódulos grãos ar entre outros Dourado 2010 Figura 5 Methylobacterium isolada da filosfera de folhas de mostarda Fonte Subhaswaraj 2017 Espécies do género Methylobacterium podem ser encontradas em associação com mais de 70 espécies de plantas colonizando ativamente a superfície de folhas de diferentes hospedeiros como por exemplo soja amendoim citrinos eucalipto milho arroz Dourado 2010 A Methylobacterium simbioticum é uma bactéria isolada de esporos do fungo micorrízico arbuscular Glomus iranicum var tenuihypharum Foi estudada quanto à sua utilidade no campo da agricultura para reduzir o aporte de fertilizantes nitrogenados Os fungos micorrízicos arbusculares FMA são simbiontes vegetais obrigatórios que são capazes de colonizar as raízes de aproximadamente dois terços de todas as espécies de plantas terrestres A Methylobacterium Simbioticum apresenta capacidade de penetrar no tecido vegetal e ainda se deslocar pelo xilema não sendo afetada pela parte inoculada raiz ou parte aérea Esta induz a uma elevada biomassa vegetal levando a maiores rendimentos não apenas em culturas folhosas mas também em culturas frutíferas Pascual et al2020 A bactéria é Gramnegativa estritamente aeróbia em forma de bastonete 081 μm de largura e 1216 μm de comprimento com flagelo lateral pode aparecer em suspensão de forma individual ou aos pares sem formação de esporos Cresce entre 10 e 30 C temperatura ótima 28 C pH 5580 pH ótimo 7 É sensível ao cloreto de sódio NaCl crescendo bem entre 015 reduzindo o crescimento a 2025 e não mostram crescimento a 30 Pascual et al 2020 14 Segundo Pascual et al 2020 a Methylobacterium spp desempenha um papel em várias aplicações biotecnológicas As plantas tratadas mostram melhorias significativas no rendimento possivelmente devido a múltiplos mecanismos incluindo fixação de azoto atmosférico através de um sistema 𝐹𝑒3 𝑀𝑜2 dependente da nitrogenase a modulação da fotossíntese o prolongamento da senescência das folhas e a precocidade na diferenciação sexual das flores Os mesmos autores testaram esta estirpe em ensaios in vitro milho e em ensaios de campo milho arroz e uva de mesa e demonstraram que em todos os casos foi possível diminuir a fertilização azotada Nos ensaios in vitro em plantas de milho com 2 a 3 folhas inoculadas com Methylobacterium spp e com redução da fertilização azotada em 50 o valor de SPAD SoilPlant Analyses Development foi significativamente maior do que em plantas com 100 de adubação azotada mas não inoculadas com a bactéria em questão Figura 6 Nos ensaios de campo demonstraram que de modo geral houve um aumento rendimento permitindo uma redução do nível médio de azoto mineral Nos tratamentos do milho e do arroz o nível de azoto mineral foi reduzido entre 3042 levando à manutenção ou aumento rendimento de 28 Os resultados mostramse assim promissores e realçam o potencial destas bactérias para reduzir a dependência de fertilizantes azotados Figura 6 Ensaios in vitro onde foi aplicado Methylobacterium symbioticum spnov Fonte Pascual et al 2020 15 3 Materiais e métodos 31 Caracterização do local de ensaio O ensaio experimental foi realizado na empresa Zona Ímpar Lda dedicada à produção de materiais de propagação vegetativa localizada na Lousã A empresa é detentora de oito estufas de polietileno fixado em estruturas de ferro orientadas Este Oeste A estufa onde se realizou o ensaio destinase à propagação de citrinos e tem uma área de 400 m2 40 m x 10 m Figura 7 Figura 7 Localização da empresa e da estufa onde foi realizado o ensaio 311 Estufa de propagação de citrinos A estufa escolhida para o ensaio foi a estufa nº5 localizada no centro das oito estufas A escolha foi feita para evitar variações de temperatura proporcionando um ambiente mais controlado A estufa tem uma área de 400 m2 com 40 m de comprimento e 10 m de largura A cobertura é de polietileno e as laterais são revestidas rede o que ajuda a proteger da Xylella fastidiosa e da Trioza erytreae A área é completamente vedada sem aberturas e com uma antecâmara na entrada com uma cortina de vento para evitar a entrada de pragas e doenças 16 Nesta estufa são plantados os porta enxertos em vasos de 35 L e 6 L Após um ano de crescimento são enxertados pelo método de borbulha com as variedades desejadas permanecendo na estufa até atingirem o porte necessário para a transplantação para outros vasos e posteriormente para outra estufa 312 Sistema de rega e de fertilização O sistema de irrigação adotado compreende o uso de fertirrigação com um sistema de gota a gota com débito de 1Lhora movido por uma bomba de água de 635 cm e um computador para a automatização do tempo de rega e para aplicação de vários componentes de fertilização A empresa contém 7 tanques de fertilizantes diferentes 1º Tanque Macronutrientes NPK 2º Tanque Enraizante 3º Tanque Especial Citros Fe Mn Zn 5º Tanque Cálcio 6º Tanque Tratamentos pontuais 7º Tanque Matéria Orgânica MO Durante a Primavera e o Verão a fertirrega ocorre diariamente com duas aplicações por dia A primeira é realizada às 7 horas da manhã e inclui a adição de nutrientes enquanto que a segunda à tarde é exclusivamente para irrigação sem a incorporação de qualquer tipo de nutrientes A matéria orgânica é adicionada uma vez por mês 17 32 Protocolo experimental O ensaio foi realizado em laranjeiras variedade Lane Late dentro de estufas de viveiro em vasos de 35 L com substrato de origem vegetal carrasca de pinho perlita isento de metais pesados O substrato foi misturado com fertilizante de libertação controlada Para satisfazer as necessidades hídricas da planta foi instalada uma fita de rega gota a gota também utilizada para a fertilização O delineamento experimental utilizado foi totalmente casualizado com cinco repetições Foram ensaiados dois fatores fertilização azotada com 5 níveis de fator 100 90 80 60 e 50 da dose de azoto recomendada para a cultura e uma aplicação com Methylobacterium symbioticum com 1 nível de fator 100 totalizando 7 tratamentos e 35 unidades experimentais Quadro 2 Quadro 2 Tratamentos realizados Tratamentos T1 Total de Azoto T2 Total de Azoto e Methylobacterium sp T3 Redução em 10 de Azoto Methylobacterium sp T4 Redução em 20 de Azoto Methylobacterium sp T5 Redução em 40 de Azoto Methylobacterium sp T6 Redução em 50 de Azoto Methylobacterium sp T7 Total de Methylobacterium sp As 35 plantas foram escolhidas do mesmo lote de forma a que o porte fosse o mais homogéneo possível Figura 8 com uma idade de aproximadamente 2 anos As plantas selecionadas foram colocadas no centro da estufa para não haver interferência ao nível da temperatura e da humidade Assim o ambiente em redor era mais estável e homogéneo Figura 9 18 Figura 8 Plantas selecionadas para o ensaio Figura 9 Local onde foram colocadas as plantas do ensaio O ensaio foi montado no dia 16 de março de 2023 Para quantificar o crescimento das plantas fizeramse duas medições semanais segundafeira e quintafeira da altura e do diâmetro basal As medições tiveram início no mês de julho e terminaram no mês de setembro que coincide com o término do ensaio O diâmetro basal foi medido através de um packlist e a altura foi medida com o auxílio de uma fita métrica O índice de área foliar IAF foi estimado a partir de imagens digitais processadas pelo software ImageJ disponível gratuitamente via internet no site httpsimagejnihgovijdownloadhtml Foram retiradas fotos com um telemóvel munido com uma câmara de 48MP As fotos foram realizadas para todas as folhas de cada planta de forma individual colocando uma folha de papel branca por baixo da folha desejada da planta 19 Posteriormente fotografouse a copa da planta de forma vertical Com o auxílio do programa referido anteriormente conseguiuse apurar o IAF sem destruir ou retirar as folhas da planta Figura 10 Esta manobra foi fundamental já que a planta tinha um tamanho reduzido e poderia comprometer o seguimento do ensaio caso se optasse pelo método destrutivo Esta análise foi feita mensalmente e iniciouse no mês de julho e depois todos os meses Figura 10 Analise da área foliar através do programa imagemJ Para analisar a síntese metabólica das plantas em estudo realizouse uma análise à seiva no final do ensaio Esta análise foi realizada com a ajuda da Hubel Verde foram retiradas entre 35 a 40 folhas por tratamento retirouse o pecíolo e cortouse em fragmentos mais pequenos que posteriormente foram colocados numa prensa para extrair a seiva com a finalidade de a colocar nos medidores de pH NO3 Na e açucares presentes na seiva Grau Brix Figura 11 Análise à seiva e ao grau Brix nos tratamentos do ensaio Os primeiros testes de fertilização foram realizados no início de maio pois aquando da instalação do ensaio as plantas encontravamse a sair do estado de dormência do inverno O 20 adubo utilizado foi um adubo NPK sólido granulado de libertação controlada e com inibidor de urease com 24 unidades de azoto 5 unidades de fósforo e 10 unidades de potássio 24 510 A quantidade de adubo foi definida com base nas recomendações de fertilização para a cultura em análise INIAV 2022 Tendo em conta que a quantidade recomendada pelo manual de fertilização de cultura é de 20 g de azoto por planta a quantidade de adubo aplicada foi de 83 g por planta uma vez que o adubo utilizado continha 24 unidades de azoto a cada 100kg Antes de fazer a fertilização nas plantas do ensaio foram realizados testes de fertilização noutras plantas da mesma variedade e do mesmo lote para não comprometer as plantas do ensaio e a viabilidade do mesmo No primeiro teste de fertilização realizado no dia 3 de maio de 2023 aplicouse 83 g de adubo As plantas foram retiradas dos vasos e o substrato foi sacudido para outro recipiente Nesse recipiente misturouse o adubo com o substrato e replantouse a planta no mesmo vaso Após o transplante fezse uma rega imediata Durante uma semana observouse atentamente o comportamento da planta Verificouse que a quantidade de 83 g de adubo aplicada de uma só vez causou a morte da planta Assim optouse por realizar duas fertilizações no lugar de uma só usandose 415 g de adubo por fertilização No dia 10 de maio de 2023 foram realizados mais dois testes de adubação Para evitar constrangimentos nas plantas de ensaio colocouse neste segundo teste 415 g de adubo sobre a superfície do vaso No terceiro teste misturouse 415 g de adubo no substrato sem sacudir a raiz Em suma em ambos os testes a resposta das plantas foi positiva Figura 12 21 Figura 12 Primeiro segundo e terceiro teste de adubação respetivamente A fertilização dos diferentes tratamentos do ensaio foi realizada no dia 17 de julho de 2023 utilizandose o método do terceiro ensaio de fertilização para a primeira adubação ou seja misturando 415 g de adubo no substrato sem sacudir a raiz As quantidades de adubo aplicadas apresentamse no Quadro 3 Quadro 3 Quantidade de adubo NPK utilizado em cada um dos tratamentos TRATAMENTOS T1100 ADUBO 41 g de adubo T2100 ADUBO 41 g de adubo T390 ADUBO 3735 g de adubo T480 ADUBO 332 g de adubo T560 ADUBO 249 g de adubo T650 ADUBO 2075 g de adubo T70 ADUBO 0 g de adubo 22 Figura 13 Aplicação do adubo misturado no substrato Após a fertilização sólida aguardouse até ao dia 22 de julho de 2023 Neste dia foi aplicada a bactéria Methylobacterium simbioticum 300g diluídos numa calda de 250l cálculo realizado através da ficha técnica do produto Aplicouse manualmente o preparado com uma mangueira ligada a um pulverizador acoplado a um trator em todas as plantas de todas as estufas Para evitar contaminação das plantas do ensaio estas foram retiradas para a antecâmara da estufa e foi feita uma aplicação individual No dia 17 de agosto de 2023 foi realizada a segunda fertilização Devido ao tamanho e para evitar stress nas plantas para que estas não cessassem temporariamente o crescimento foi aplicado o adubo adequado sobre a superfície de cada vaso As quantidades aplicadas foram as registadas no Quadro 3 23 4 Resultados e discussão Ao longo deste estudo foram realizadas várias medições com o intuito de analisar algumas características das plantas no decorrer de três meses tais como a medição da altura e do diâmetro basal das plantas como também o índice de área foliar e analise à seiva Neste ponto apresentamse e discutemse os resultados obtidos no que respeita às medições da altura das plantas diâmetro basal área foliar e análise à seiva 41 Altura das plantas No início do ensaio as plantas foram selecionadas de forma a possuírem alturas semelhantes Essa seleção possibilitou um grupo inicial uniforme permitindo avaliar com maior rigor o efeito dos tratamentos no crescimento das plantas Na Figura 14 podese observar a semelhança das plantas em relação à altura média em todos os tratamentos considerados Figura 14 Altura média cm a 16 de março das plantas selecionadas para o ensaio nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria Podemos assim considerar que a organização dos tratamentos realizada no dia 16 de março de 2023 foi bemsucedida visto que se obteve uma homogeneidade aceitável de alturas de árvores entre tratamentos variando aproximadamente entre 54 a 56 cm No Quadro 4 e Figura 15 apresentase a evolução semanal da altura média das plantas ao longo do ensaio Recordese que em cada semana foram realizadas duas medições uma à 57 56 55 54 53 52 51 50 T1 T2 T3 Tratamentos T4 T5 T6 T7 Altura Média cm 24 segundafeira e outra à quintafeira Os resultados apresentados em cada semana dizem respeito ao valor médio obtido dessas duas observações Quadro 4 Altura média semanal cm e respetivo desvio padrão nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria Altura Média Semanal cm e Desvio Padrão Semana T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 1 3Jul a 6Jul 62227 61857 60822 65428 63857 63944 5938 2 10Jul a 13Jul 6432 62969 62726 67626 65954 6655 59728 3 17Jul a 20Jul 6482 64472 63331 68324 66752 67353 60429 4 24Jul a 27Jul 65625 6762 63432 69126 6752 67553 61438 5 31Jul a 3Ago 66228 71333 65649 70945 69373 69542 6436 6 7Ago a 10Ago 71254 73734 69466 75992 756111 73149 69548 7 14Ago a 18Ago 77194 77241 77435 80873 80284 74859 71759 8 21Ago a 24Ago 78891 79158 80332 83848 83563 7660 72755 9 28Ago a 31Ago 7939 79358 81225 8546 85253 76259 73154 10 4Set a 7Set 79489 8056 81227 85147 87448 77866 74547 11 11Set a 14Set 80194 81155 81628 85844 89576 79584 7645 12 18Set a 21Set 80910 81554 82329 86941 90377 80382 7751 25 Figura 15 Altura média semanal cm nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria As setas indicam as semanas nas quais se aplicou o adubo e a bactéria A altura média das plantas aumentou ao longo do ensaio mas a análise estatística realizada ANOVA mostrou não ter havido diferenças significativas entre tratamentos Em todos os tratamentos verificouse um aumento da altura média das plantas entre a semana 1 e a semana 12 Esse aumento pareceu mais evidente a partir da semana 4 altura em que se aplicou o adubo e a bactéria Methylobacterium sp Recordese que a primeira fertilização com o adubo e com a bactéria foi realizada na semana 3 e a que segunda fertilização foi realizada na semana 7 Os tratamentos onde se verificou maior crescimento da altura das plantas desde o início até ao fim do ensaio foram os tratamentos T3 T4 e T5 com aumentos de 21 20 e 22 cm respetivamente Sentese necessidade de evidenciar o tratamento T5 com aplicação da bactéria Methylobacterium sp e 60 de adubo que foi aquele onde o aumento de altura das plantas foi mais expressivo Este resultado sugere que a aplicação da Methylobacterium sp teve uma influência positiva no crescimento das plantas permitindo reduzir a fertilização em 40 91 88 85 82 79 76 73 70 67 64 61 58 55 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T 1 T 2 T 3 Semanas T 4 T 5 T 6 T 7 Altura cm 26 O tratamento em que se registou o menor crescimento das plantas 18 cm foi o tratamento T7 que correspondeu ao tratamento onde apenas se aplicou a Methylobacterium sp Este resultado mostra que a substituição da fertilização total pela bactéria não permitiu o melhor crescimento das plantas Embora existam estudos que evidenciem o efeito positivo da aplicação de determinadas bactérias no crescimento das plantas como demonstrado por Bogas 2010 que analisou o efeito da aplicação da bactéria Methylobacterium spp em porta enxertos de plantas de limão e tangerina identificando aumentos de crescimento entre 1 a 3 cm nas plantas de tangerina em comparação com os grupos de controle em diferentes ensaios realizados outros estudos contradizem esse resultado Por exemplo trabalhos realizados em plantas de eucalipto como o de Araújo 2021 que ao analisar os efeitos da mesma bactéria não observou os resultados esperados Nas plantas tratadas com a bactéria não se observou diferenças significativas em relação à altura e à biomassa vegetal em comparação com as plantas não tratadas No presente trabalho à semelhança dos resultados de Araújo 2021 não foram encontradas diferenças significativas que comprovassem o efeito positivo da bactéria no crescimento em altura das plantas de laranjeira o que não permite a formulação de conclusões mais definitivas 27 42 Diâmetro Basal O Quadro 5 e a Figura 16 apresentam os resultados semanais referentes ao diâmetro basal médio em cada tratamento do início até ao final do ensaio Quadro 5 Diâmetro Basal médio cm e respetivo desvio padrão nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria Semana T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 1 3Jul a 6Jul 08005 08008 08009 08004 08004 07008 07004 2 10Jul a 13Jul 08005 08008 08009 08004 08004 07008 07004 3 17Jul a 20Jul 08005 08008 08009 08004 08004 07008 07004 4 24Jul a 27Jul 08004 08006 0801 08004 08005 08006 08006 5 31Jul a 3Ago 08004 08002 08009 08004 08008 0801 08004 6 7Ago a 10Ago 08004 08004 07008 08004 08005 0801 08004 7 14Ago a 18Ago 08004 08006 08008 08006 08006 0801 08006 8 21Ago a 24Ago 08009 08008 08008 09008 08008 0801 08008 9 28Ago a 31Ago 08008 09008 08008 09006 09000 0801 08008 10 4Set a 7Set 08009 09008 08009 09006 09006 0801 09008 11 11Set a 14Set 09008 0901 0801 09008 0901 0901 09008 12 18Set a 21Set 09008 0901 0801 09008 0901 0901 09008 28 Figura 16 Diâmetro basal médio nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria Os tratamentos estudados não exerceram efeitos significativos p 005 no diâmetro basal das plantas No entanto pela observação do Quadro 5 e da Figura 16 podemos observar que apesar das diferenças terem sido muito pouco expressivas e não terem sido significativas os tratamentos T7 e T5 foram aqueles onde parece terse registado maior desenvolvimento do diâmetro basal Tal como observado no crescimento em altura Estes resultados estão de acordo com os de Bogas 2010 que analisou o efeito da aplicação da bactéria Methylobacterium spp em porta enxertos de plantas de limão e tangerina e também não encontrou diferenças significativas no diâmetro basal entre as plantas inoculadas nenhum com Methylobacterium spp e as plantas não inoculadas 1 09 08 07 06 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Semanas T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 Diametrocm 29 43 Área Foliar A área foliar total foi um dos parâmetros analisados pois o aumento da área foliar é de grade importância quanto maior a área de captação de energia solar maior será a síntese metabólica da planta O desenvolvimento da área foliar total por planta nos meses de julho agosto e setembro nos sete tratamentos realizados pode ser observado no Quadro 6 Quadro 6 Valores médios da área foliar total cm² nos tratamentos T1 100 adubo T2 100 adubo bactéria T3 90 adubo bactéria T4 80 adubo bactéria T5 60 adubo bactéria T6 50 adubo bactéria e T7 100 bactéria Área Foliar de Julho Área Foliar de Agosto Área Foliar de Setembro Tratamentos Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão T1 1265 109 1577 205 2021 490 T2 1088 312 1312 370 1613 445 T3 1304 118 1414 122 1538 125 T4 1255 101 1460 141 1718 209 T5 1265 235 1482 244 1761 253 T6 1201 439 1348 503 1524 581 T7 1324 359 1460 289 1619 238 Os tratamentos estudados não exerceram efeitos significativos p 005 na área foliar das plantas No entanto pela observação do Quadro 6 podemos observar que em todos os tratamentos a área foliar aumentou de julho a setembro Este aumento foi mais marcado no tratamento T1 aumento de 756 cm2 e menos expressivo nos tratamentos T3 aumento de 234 cm2 e T7 aumento de 295 cm2 De uma maneira geral verificouse que a redução de 50 na quantidade de adubo aplicada influenciou de forma negativa o desenvolvimento da área foliar das plantas de laranjeira 30 44 Analise à seiva No Quadro 7 apresentamse os resultados das concentrações médias de azoto nítrico NO3 sódio Na pH e grau Brix obtidos na seiva das plantas nas diferentes modalidades experimentais T1 100 adubação T2 100 adubaçãobactéria T3 90 adubaçãobactéria T480 adubaçãobactéria T560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100 bactéria Quadro 7 Analise à seiva para visualização da quantidade de NO³ presente na planta em ppm nos tratamentos T1 100 adubação T2 100 adubação bactéria T390 adubaçãobactéria T480 adubaçãobactéria T560 adubaçãobactéria T650 adubaçãobactéria T7100 bacteria Através do Quadro 7 tendo como referência os tratamentos 1 e 7 que correspondem respetivamente ao tratamento em que não foi aplicada bactéria e ao tratamento em que foi apenas aplicada a bactéria verificase que o tratamento 4 atingiu os níveis de NO3 iguais aos do tratamento 1 o tratamento 5 apesar de não atingir esses valores mantevese próximo uma vez que foi aplicada a bactéria em ambos os tratamentos e houve uma redução na adubação o tratamento 3 e 7 apresentaram valores abaixo do ideal comparativamente ao tratamento 1 onde foi feita a adubação segundo o manual de fertilização Após uma pesquisa aprofundada constatouse que ainda não há referências bibliográficas com valores de referência concretos para esta cultura visto que de país para país os valores são muito díspares Acresce o facto de as plantas serem muito jovens o que torna mais difícil a busca por valores concretos Tratamentos NO³ ppm pH Na ppm Brix T1 2000 61 160 9 T2 1500 63 100 4 T3 1300 64 91 3 T4 2000 66 140 3 T5 1800 65 120 3 T6 1600 65 160 3 T7 1100 67 140 2 Análise à Seiva 31 Estudos com outras culturas como o de Pascual et al 2020 que analisaram o efeito da aplicação da bactéria Methylobacterium sp em plantas de arroz milho e uva de mesa Quadro 8 têm demonstrado que a aplicação desta bactéria permite reduzir a fertilização azotada e manter bons resultados no crescimento e produtividade das plantas Nesse estudo a produtividade das culturas foi maior quando se reduziu a fertilização em 50 do que quando se aplicou 100 da fertilização Os mesmos autores explicam essa situação como resultado de uma deficiência nutricional em azoto 50 N Essa deficiência terá estimulado a simbiose entre a planta e a bactéria No presente estudo os resultados obtidos com os tratamentos T4 e T5 que corresponderam a uma redução de fertilização de 20 e 40 respetivamente foram aqueles que nos pareceram os mais promissores tendose observado teores de NO3 superiores aos dos outros tratamentos com redução da fertilização A redução de 100 de fertilização mostrou um desenvolvimento reduzido e os teores de açúcar na planta foram menores do que os outros tratamentos Quadro 8 Ensaios de campo onde foi aplicado Methylobacterium symbioticum spnov Adaptado de Pascual et al 2020 32 5 Considerações finais O ensaio realizado teve como objetivo avaliar o efeito da bactéria Methylobacterium simbioticum no crescimento de plantas de laranjeira em viveiros Foram realizados sete tratamentos onde se aplicou a bactéria e diferentes níveis de adubação azotada Apesar de não se terem verificado diferenças significativas entre tratamentos os resultados obtidos permitiram tecer algumas considerações As plantas do tratamento T2 com 100 de adubo e bactéria mostraram baixos resultados dos componentes de crescimento bem como nas concentrações de NO3 relativamente ao tratamento 1 que apresentou valores mais elevados sendo este o tratamento controle em que não houve interferência da bactéria As plantas dos tratamentos T4 com aplicação de bactéria e redução em 20 da fertilização e T5 com aplicação de bactéria e redução em 40 da fertilização apresentaram em média uma altura total maior do que as plantas dos restantes tratamentos Em contrapartida o menor crescimento em altura ocorreu nas plantas do tratamento T7 onde apenas se aplicou a bactéria Pese embora a variação do diâmetro basal ter sido similar em todos os tratamentos foi também no tratamento T5 onde se observou o maior aumento no diâmetro basal De uma maneira geral o crescimento das plantas parece ter sido mais evidente nos tratamentos com redução de fertilização de 20 e 40 quando comparados com os resultados obtidos nos tratamentos com reduções mais elevadas e nos tratamentos em que não ouve redução de fertilização Este facto pode ser explicado pela deficiência nutricional provocada pela necessidade de azoto que promoveu simbiose enquanto com a adição nutricional completo de 100 N isso não terá acontecido Com base nos resultados obtidos parece ser viável reduzir a adubação azotada sem comprometer o desenvolvimento das plantas o que permitirá diminuir a quantidade de nitratos que lixiviados nos solos O ensaio realizado teve várias limitações que poderão ter afetado o desenvolvimento das plantas tais como a falta de controlo de temperatura e humidade dentro da estufa Em dias muito quentes as plantas podem cessar o crescimento podendo perder área foliar devido a 33 esse stress Temperaturas elevadas também podem comprometer o bom funcionamento da bactéria A falta de evidências para confirmar a colonização da bactéria foi um dos fatores que contribuiu para essa incerteza Este tipo de ensaios são muitas vezes difíceis de confirmar devido a existirem muitas variáveis que provocam alterações que nem sempre são percetíveis Em suma os resultados do presente trabalho apontam para a possibilidade de um potencial benefício na aplicação da bactéria e uma redução de 20 a 40 da fertilização azotada mesmo que não tenha sido estatisticamente robusto ao nível de significância utilizado Há indícios que sugerem resultados promissores com os tratamentos T4 e T5 o que pode indicar que sob condições específicas a presença deste biofertilizante pode influenciar positivamente o crescimento das plantas de laranjeira embora essa conclusão precise de ser analisada com maior detalhe A ausência de diferenças estatisticamente significativas não deve ser interpretada como ausência total de efeitos mas sim como uma indicação de que as variações observadas podem ser devidas a fatores não completamente considerados neste estudo Dessa forma sugerese que investigações mais detalhadas sejam realizadas para elucidar as nuances e os possíveis benefícios do tratamento T4 em relação ao crescimento das plantas considerando variações experimentais adicionais e análises mais aprofundadas dos mecanismos envolvidos Além dos aspetos avaliados poderia ser interessante avaliar a taxa de respiração para verificar o efeito das diferentes dosagens de azoto nas plantas Seria também interessante confirmar a vitalidade da bactéria nas plantas e realizar este estudo noutras localizações e em diferentes culturas além de tratamentos com diferentes percentagens da dosagem de nutrição mineral Com o desenvolvimento de novos produtos deste tipo gerase a necessidade cada vez maior de aferir a sua viabilidade agronómica e económica Se os resultados positivos forem confirmados poderá haver uma diminuição do uso de fertilizantes sintéticos o que contribuirá para restaurar ou melhorar a qualidade dos solos e águas 34 Referencias bibliográficas Alva M De la Rosa A LópezReyes J A 2018 Visual symptoms of plant nutritional disorders A review Frontiers in Plant Science 9 1651 httpsdoiorg103389fpls201801651 Ahmad1996 Nitrogen Economy in Tropical Soils Proceedings of the International Symposium on Nitrogen Economy in Tropical Soils held in Trinidad WI January 9 14 1994 Developments in Plant and Soil Sciences Vol 69 Kluwer Academic Publishers as cited in LadeiraL 2017Valor agronómico de fertilizantes enriquecidos com microrganismos fixadores de azoto Araújo M 2021 Estudos para o Melhoramento de um Consórcio Microbiano com Potencial Bioestimulante em Mudas de Eucalyptus Barros J 2020 Universidade de Évora Fertilidade do solo e Nutrição das plantas Bogas A 2010 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Avaliação da interação entre Methylobacterium spp e citros Brian M Hoffman Dmitriy Lukoyanov ZhiYong Yang Dennis R Dean Lance C Seefeldt2014 Mechanism of Nitrogen Fixation by Nitrogenase The Next Stage CoutinhoM 2000Instituto Politécnico de Bragança Eficiência de utilização do azoto pelas plantas Carvalho P 1997 Ciclo interno do azoto em árvores Lisboa ISA 69 p Comissão Europeia Utilização sustentável dos nutrientes httpsagricultureeceuropaeusustainabilityenvironmentalsustainabilitylowinput farmingnutrientspt 1 de janeiro de 2023 DouradoMN 2010 Ecologia de Methylobacterium spp na planta hospedeira Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Duarte A2014 Breves Notas Sobre a Citricultura Portuguesa Faculdade de Ciências e Tecnologia Universidade do Algarve 35 Gasparotto L BuenoN1999 Embrapa Amazónia Ocidental Sintomas de Deficiência Nutricionais em Citrinos Hubel Verde 2021 Apresentação BlueN INTAGRI2018Fijacion Biológico de Nitrógeno Atmosférico Serie Nutrición Vegetal Núm 126 Artigo Técnicos de INTAGRIMexico4p Instituto Nacional de Estatística INE 2022 Estatísticas Agrícolas 2022 Lisboa Portugal INE JenHshuan Chen 2006 Workshop Internacional sobre Manejo Sustentado do Sistema SoloRizosfera para Produção Agrícola Eficiente e Uso de Fertilizantes Köberl M Müller H Ramadan EM e Berg G 2011 A agricultura no deserto se beneficia do potencial microbiano em solos áridos e promove a diversidade e a saúde das plantas Lantican MA Pingali PL e Rajaram S 2003 A pesquisa sobre terras marginais está se atualizando O caso de ambientes desfavoráveis para o cultivo de trigo Agrícola Econ Marscher H 1995 Mineral nutrition of higher plants 3ª Edição MilitãoC 2004 Estudo do Ciclo do Azoto Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Nações Unidas 2022 População mundial deve ultrapassar marca de 8 bilhões Pascual JA Ros M Martínez J et al Methylobacterium symbioticum sp nov uma nova espécie isolada de esporos de Glomus iranicum var tenuihypharum Curr Microbiol 77 20312041 2020 httpsdoiorg101007s00284020021014 PascualJRosMMartinezJCarmonaFBernabéATorresRLucenaTAznarRA rahalD FernándezF2020 Methylobacterium symbioticum sp nov a new species isolated from spores of Glomus iranicum var tenuihypharum Paredes PrimoMillo 1988 Capitolo 1 Introdução à Nutrição de Plantas 36 Santos M J Carvalho A M Teixeira J P 2017 Efeito de microrganismos do solo na nutrição da laranjeiraclementina Revista Brasileira de Fruticultura 394 1053 1060 Santos JQ 2015 Fertilização fundamentos agroambientais da utilização dos adubos e corretivos Santos M A Silva A V 2023 Citrus production and consumption in the world a review Food Reviews International 392 100037 Silva MPMG Avaliação da influência da adubação azotada nítrica e amoniacal no crescimento e na actividade de algumas enzimas em oliveiras jovens Olea europaea L cv Cobrançosa Lisboa ISA 2010 62 p Silva A M Santos M A Ferreira P 2022 Taxonomia e morfologia da laranjeira Silva R Santos J Souza P 2022 Efeitos da deficiência de nitrogênio em laranjeiras Smith M Jones R B 2016 Soil and water pollution from agricultural fertilizers A review Environmental Pollution 213 253265 httpsdoiorg101016jenvpol201602042 SubhaswarajP JobinaR ParasuramanP SiddhardhaB 2017 Plant Growth Promoting Activity of Pink Pigmented Facultative Methylotroph Methylobacterium extorquens MM2 on Lycopersicon esculentum L Tomas J2016 Variedades e portaenxertos de citrinos Direção Regional de Agricultura e Pesca do Algarve UnkovichM David Herridge Mark Peoples Georg Cadisch Bob Boddey Ken Giller Bruno Alves and Phillip Chalk 2008 Measuring plantassociated nitrogen fixation in agricultural systems Varennes J F 2003 Nutrição mineral das plantas Lisboa Portugal Instituto Superior de Agronomia 37 Xavier J T N Carvalho A M Santos M J 2020 Estratégias de nutrição sustentável para laranjeirasclementinas Revista Brasileira de Fruticultura 424 789 797 38 Anexos Tabela Anova do Desenvolvimento da Altura durante o Ensaio ANOVA Fonte de variação SQ gl MQ F valor P F crítico Entre grupos 3266714286 6 5444524 108503 0395249 2445259 Dentro de grupos 1405 28 5017857 Total 1731671429 34 Tabela Anova do Desenvolvimento do Diâmetro Basal durante o Ensaio ANOVA Fonte de variação SQ gl MQ F valor P F crítico Entre grupos 0142857 6 00238095 241545894 00523373 2445259395 Dentro de grupos 0276 28 00098571 Total 0418857 34 Tabela Anova do Desenvolvimento da Área Foliar ANOVA Fonte de variação SQ gl MQ F valor P F crítico Entre grupos 9391234 6 1565206 15067492 02123 2445259395 Dentro de grupos 2908630 28 1038796 Total 3847753 34 1 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Avaliação da interação entre Methylobacterium spp e citros Andréa Cristina Bogas Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2010 Andréa Cristina Bogas Bióloga Avaliação da interação entre Methylobacterium spp e citros Orientador Prof Dr WELINGTON LUIZ DE ARAÚJO Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2010 3 3 RESUMO Avaliação da interação entre Methylobacterium spp e citros A interação bactériaplanta é um processo complexo que envolve diversos fatores bióticos e abióticos podendo resultar em interações neutras benéficas ou patogênicas O gênero Methylobacterium tem sido descrito como endófito em diferentes plantas hospedeiras podendo beneficiálas por meio da promoção de crescimento vegetal e do controle de fitopatógenos Em citros este endófito coloniza o mesmo nicho que patógenos e assim muitas espécies desse gênero são interessantes candidatas ao controle simbiótico contra Xylella fastidiosa É conhecido que o processo de interação Methylobacteriumbactéria é coordenado por genes cuja expressão é regulada pelo sistema Quorum Sensing QS o qual utiliza Nacilhomoserina lactonas AHLs como moléculas sinalizadoras importantes entre outras coisas para a formação de biofilme encontrado em muitas plantas como estratégia de colonização bacteriana No entanto os mecanismos envolvidos na interação Methylobacteriumplanta são ainda pouco compreendidos Dessa forma o presente trabalho buscou estudar de diferentes maneiras a interação entre Methylobacterium spp e citros avaliando os efeitos dessas bactérias sobre o crescimento de plântulas e a variação da expressão gênica Neste contexto foi verificado que a especificidade da interação bactériaplanta e a escolha do método de inoculação das bactérias são importantes para a geração de resultados benéficos sobre a germinação de sementes e o desenvolvimento da planta hospedeira Possivelmente a produção de AIA e a fixação biológica de nitrogênio foram os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento de citros por Methylobacterium spp neste estudo Com relação à origem essas bactérias parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas Visando empregar Methylobacterium spp no controle de fitopatógenos em citros M extorquens AR162 foi geneticamente modificada para expressar uma endoglicanase A EglA Por meio de microscopia eletrônica de varredura foi verificado que a bactéria modificada colonizou a superfície e o interior de Catharanthus roseus planta modelo para experimentos com bactérias endofíticas e X fastidiosa Além disso quando inoculada junto com X fastidiosa essas bactérias compartilharam o xilema das plântulas sugerindo que durante a colonização e estabelecimento no hospedeiro estas bactérias poderiam interagir Estudando a ação de uma AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M mesophilicum SR166planta foi observado que a presença dessa molécula foi importante na ativação da expressão dos genes mxaF relacionado ao estabelecimento e metabolismo metilotrófico da bactéria pat relacionado a vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta e acdS envolvido com o metabolismo bacteriano e modulação de níveis hormonais na planta A expressão dos genes crtI e sss envolvidos com respostas a estresse e transporte de compostos respectivamente e do gene phoU relacionado com patogenicidade não foram alterados na presença da AHL nas condições avaliadas Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que Methylobacterium spp interagem com plântulas de Citrus spp demonstrando especificidade entre a espécie de planta e da bactéria endofítica Foi observado também que esta interação ocorre não somente com a planta mas possivelmente com 4 outras bactérias que habitam o xilema de citros Além disso esta interação Methylobacteriumcitrosbactérias do xilema pode ser regulada por AHLs Palavraschave Methylobacterium spp Citrus spp Promoção de crescimento AHL 5 ABSTRACT Evaluation of the interaction between Methylobacterium spp and citrus The bacteriumplant interaction is a complex process that involves several biotic and abiotic factors that may result in neutral beneficial or harmful interactions The Methylobacterium genus has been described as endophytic bacterium in different host plants It could benefit the plants by growth promotion and control of phytopathogens In citrus this endophyte colonizes the same pathogenniche and therefore many species of this genus are interesting candidates to symbiotic control against X fastidiosa It is known that the process of Methylobacteriumbacteria interaction is coordinated by genes whose expression is regulated by the Quorum Sensing QS which uses Nacyl homoserine lactones AHLs as signaling molecules Its importance is associated with the biofilm formation found in many plants as a strategy for bacterial colonization However the mechanisms in Methylobacteriumplant interactions are still poorly understood Thus this work studied in different ways the interaction between Methylobacterium spp and citrus evaluating the effects of these bacteria on the seedling growth and the variation of gene expression In this context it was found that the specificity of bacteriaplant interactions and the bacterial inoculation methods are important to generate beneficial results on seed germination and host plant development Possibly IAA production and nitrogen biological fixation were the major involved mechanisms in citrus growth promotion by Methylobacterium spp These bacteria seem to be transmitted horizontally in citrus plant Aiming to employ Methylobacterium spp to control phytopathogens in citrus plant M extorquens AR162 was genetically modified to express an endoglucanase A EglA enzyme Using scanning electron microscopy was observed that the modified bacteria colonized the surface and interior of the Catharanthus roseus a model plant for experiments with endophytic bacteria and X fastidiosa Furthermore when inoculated with X fastidiosa these bacteria shared the seedlings xylem suggesting that during the colonization and establishment in the host these bacteria could interact Studying the action of a AHL on the expression of genes involved in the interaction between M mesophilicum SR166 plant it was observed that the presence of this molecule was important in the activation of genes expression mxaF related to the establishment and methylotrophic metabolism pat related to adaptive and competitive advantages during the plant colonization acdS involved in bacterial metabolism and modulation of hormone levels in the plant Expression of crtI and sss involved in bacterial stress and transport of compounds respectively and phoU related with pathogenicity were not altered in the presence of AHL in the evaluated conditions The results of this study demonstrated that Methylobacterium spp interact with seedlings of Citrus spp showing specificity between plant species and endophytic bacteria Also it was observed that this interaction occurs not only with the plant molecular modification levels but possibly with other bacteria that inhabit the xylem of citrus Also this interaction Methylobacterium citrusxylem bacteria may be regulated by AHLs Keywords Methylobacterium spp Citrus spp Growthpromotion AHL 6 7 1 INTRODUÇÃO Entender a natureza do estabelecimento das interações bactériaplanta é um constante desafio Potencialmente todas as plantas vivem em associação com bactérias as quais podem colonizar os espaços intercelulares colonização endofítica a superfície vegetal colonização epifítica ou atacar os tecidos causando doenças colonização patogênica sendo que algumas populações podem flutuar entre esses estilos de vida Embora com propósitos diferentes bactérias simbiontes e patogênicas utilizam mecanismos em comum para se estabelecerem na planta mas nenhuma dessas relações é totalmente compreendida embora saibamos que essas comunidades podem ser afetadas por diversos fatores bióticos e abióticos Estudos recentes têm mostrado que a comunicação bactériabactéria eou bactériaplanta pode ser regulada por meio de um sistema denominado Quorum Sensing QS Esse sistema é baseado na produção de sinais moleculares difusíveis que permitem às bactérias controlar mudanças adaptativas e fisiológicas na população Nacilhomoserina lactonas AHLs são as moléculas sinalizadoras predominantes entre bactérias Gramnegativas e são comuns àquelas que estabelecem associação com plantas AHLs são importantes entre outras coisas para a formação de biofilmes uma estratégia chave para a sobrevivência e dominância das bactérias na planta favorecendo o estabelecimento de relações patogênicas ou simbióticas Moléculas que mimetizam AHLs têm sido encontradas em plantas e isso tem sido visto como uma estratégia de adaptação para comunicação com bactérias específicas ou ainda para proteção contra patógenos Nas últimas décadas os estudos sobre bactérias endofíticas têm aumentado focando principalmente na utilização desses microrganismos como agentes de controle biológico de doenças promotores de crescimento vegetal fitoremediadores de áreas poluídas eou vetores para a expressão de genes heterólogos em plantas Methylobacterium é um importante gênero de bactérias endofíticas que interagem de forma simbiótica com diferentes espécies de plantas Em citros tem sido consistentemente isolado como endófito além de ser descrito como o principal gênero na interação entre a comunidade endofítica de citros e X fastidiosa A possibilidade de 8 modificar geneticamente Methylobacterium spp e reintroduzílas em seu nicho original onde existe o problema ou acesso ao patógeno alvo poderia se consistuir de um ponto chave para o controle simbiótico por tais bactérias Além da possibilidade de Methylobacterium spp atuarem como agentes de controle de fitopatógenos através do qual também poderiam exercer efeitos indiretos sobre o crescimento vegetal esses endófitos poderiam ainda favorecer a citricultura promovendo o crescimento vegetal de forma direta possivelmente por meio da produção de fitohormônios e fixação de nitrogênio melhorando assim a produtividade eou a qualidade dos pomares cítricos Isso seria de grande importância à citricultura brasileira uma vez que o Brasil destacase como o maior produtor de citros e também o maior exportador de suco de laranja do mundo Dentro desse contexto o presente trabalho teve como objetivos i avaliar a capacidade de Methylobacterium spp promoverem crescimento de citros ii modificar geneticamente Methylobacterium para expressão heteróloga visando o estudo da interação com X fastidiosa e o controle simbiótico de fitopatógenos em citros iii avaliar o efeito da AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação Methylobacterium planta 9 2 PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE CITROS POR Methylobacterium spp Resumo A habilidade de Methylobacterium spp endofíticas isoladas de Citrus spp Capsicum annuum L e Saccharum officinarum L para induzir a germinação de sementes e o crescimento de portaenxertos de citros limãocravo Citrus limonia Osbeck e tangerina sunki Citrus sunki foi avaliada em viveiro comercial Para isso foram desenvolvidos três experimentos e testadas duas metodologias bacterização de sementes e inoculação das bactérias no substrato A primeira metodologia foi aplicada para testes em limãocravo e tangerina sunki e a segunda em testes com tangerina sunki Quando o método de bacterização das sementes foi utilizado as respostas sobre a germinação variaram de acordo com o portaenxerto utilizado Exceto pelos efeitos negativos gerados por uma linhagem de citros AR162 as demais não afetaram a germinação das sementes de limãocravo Em tangerina sunki foi observado um possível efeito positivo sobre a germinação Porém mais estudos devem ser realizados para a confirmação desse resultado Com o decorrer do tempo de desenvolvimento das mudas foi observada uma maior diferenciação entre as linhagens sendo que aquelas isoladas de citros foram as que melhor promoveram crescimento nos dois porta enxertos tanto em altura quanto em biomassa Quando as bactérias foram inoculadas diretamente no substrato os efeitos sobre a altura das mudas de tangerina sunki foram mais rápidos do que quando foram inoculadas pela metodologia de bacterização de sementes Ao final da produção as linhagens de citros AR162 AR1611 e SR166 e a linhagem de pimentão TP42 promoveram o crescimento dos portaenxertos em condição comercial Os efeitos benéficos sobre o crescimento de tangerina sunki por Methylobacterium spp foram também observados pelo aumento da biomassa das plantas Nenhum efeito sobre o diâmetro do caule foi observado Análises de características funcionais de Methylobacterium spp revelaram a produção de AIA e a capacidade de fixação biológica de nitrogênio sendo esses os possíveis mecanismos envolvidos com a promoção de crescimento das plantas por essas bactérias Por meio de reisolamento em meio de cultura e análise de ARDRA foi confirmado que Methylobacterium spp colonizaram endofiticamente os portaenxertos de citros Conforme verificado com os resultados obtidos com o isolamento de bactérias endofíticas de sementes de limãocravo e tangerina sunki Methylobacterium spp parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas Os resultados sugerem que Methylobacterium spp colonizam endofiticamente a planta hospedeira e têm potencial como promotoras de crescimento de citros em condições comerciais Palavraschave Methylobacterium spp Citrus spp Interação bactériaplanta Promoção de crescimento 10 2 CITRUS GROWTH PROMOTION BY Methylobacterium spp Abstract The ability of endophytic isolates of Methylobacterium spp obtained from Citrus spp Capsicum annuum L and Saccharum officinarum L to induce plant growth and seed germination of rootstocks seedlings Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki was evaluated under commercial nursery conditions For this purpose three experiments were developed and two methodologies were tested bacterization of seeds and inoculation of the bacteria in the substrate The first method was applied to trials with Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki and the second one was only applied to trials with Citrus sunki Using seed bacterization methodology the answers to germination showed variation depending on the rootstock Except for the negative effects generated by one strain of citrus AR162 other strains didnt affect the seed germination of Citrus limonia Osbeck plants In Citrus sunki it was observed a possible positive effect on germination Nonetheless more studies must be carried out in order to confirm these results According to the seedlings development a larger differentiation was observed among the strains Those isolated from citrus improved growth in either rootstocks both in height and in biomass The effects on seedlings height of Citrus sunki plants were faster when the bacteria were inoculated directly in the substrate than when inoculated by seed treatment The citrus strains AR162 AR1611 and SR166 and Capsicum annuum L strain TP42 promoted growth of rootstocks in commercial nursery conditions The positive effects on tangerine sunki growth caused by Methylobacterium spp were also observed by increasing in plant biomass No effect was observed in the stem diameter Analysis of functional characteristics from Methylobacterium spp revealed IAA production and nitrogen biological fixation which can be the possible mechanisms involved with plant growth promotion Through reisolation in culture medium and ARDRA analysis it was confirmed that Methylobacterium spp settled endophytically citrus rootstocks As verified in obtained results regarding the isolation of edophytic bacteria from Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki seeds Methylobacterium spp seem to be transmitted horizontally in citrus plants The results suggest that Methylobacterium spp colonize endophytically the plant host and have potential as citrus growth promoters under commercial nursery conditions Keywords Methylobacterium spp Citrus spp Bacteriaplant interaction Growth promotion 11 21 Introdução As bactérias associadas às plantas têm um papel chave na adaptação do hospedeiro seja em ambientes naturais ou em locais alterados pelo homem numa estratégia de promover uma melhor associação entre esses microrganismos e algumas culturas HALLMANN et al 1997 STURZ NOWAK 2000a Frequentemente os efeitos benéficos das bactérias endofíticas são maiores do que das bactérias que colonizam a rizosfera das plantas PILLAY NOWAK 1997 Assim os endófitos podem ser de particular interesse para aplicação agrícola uma vez que apresentam a vantagem de estarem em um ambiente menos exposto a mudanças ambientais e com um menor número de competidores STURZ CHRISTIE NOWAK 2000b WHIPPS 2001 Algumas bactérias endofíticas são obrigatórias ou seja são estritamente dependentes da planta hospedeira para crescer e se desenvolver sendo transmitidas para outras plantas verticalmente ou via vetores Mas existem também aquelas facultativas que tem um estágio de vida em que podem viver fora do hospedeiro geralmente no solo HARDOIM VAN OVERBEEK VAN ELSAS 2008 Estas últimas constituem a maioria dos endófitos Vivem no ambiente externo e de acordo com as condições oferecidas penetram e se estabelecem no interior do hospedeiro ROSENBLUETH MARTINEZROMERO 2006 Ao se estabelecerem na planta frequentemente as bactérias endofíticas podem afetar as atividades fisiológicas do hospedeiro modulando seu crescimento desenvolvimento causando mudanças na qualidade e produtividade da cultura CONRATH et al 2006 HOLLAND LONG POLACCO 2002 KLOEPPER LIFSHITZ ZABLOTOWICZ 1989 STURZ NOWAK 2000a Os mecanismos pelos quais as bactérias beneficiam o hospedeiro incluem entre outros o aumento da disponibilidade de nutrientes indução de mecanismos de defesa da planta produção de antibióticos competição com patógenos produção de fitohormônios e enzimas GLICK 1995 KLOEPPER LIFSHITZ ZABLOTOWICZ 1989 LODEWYCKX et al 2002 VAN LOON BAKKER 2004 12 A existência do gênero Methylobacterium como endófito de várias culturas o torna potencialmente interessante para aplicação agrícola Vários estudos vêm demonstrando os benefícios diretos dessas bactérias sobre o crescimento vegetal possivelmente pela produção de fitohormônios KOENING MORRIS POLACCO 2002 LEE et al 2006 MADHAIYAN et al 2006 OMER et al 2004b e pela fixação de nitrogênio MADHAIYAN et al 2004 MADHAIYAN et al 2009a SY et al 2001 Além disso podem atuar como agentes de controle biológico de fitopatógenos quando o efeito benéfico sobre o crescimento vegetal seria indireto MADHAIYAN et al 2004 MADHAIYAN et al 2006 A citricultura brasileira possui grande importância social e econômica gerando milhares de empregos diretos e indiretos além de produtos para consumo interno e para exportação Ocupa uma área de 843266 mil hectares concentrada no Estado de São Paulo que participa com 7842 da produção nacional de frutos IBGE 2010 Levantamentos recentes da produção agrícola apontaram uma produção de 19080755 toneladas de laranjas em território nacional em fevereiro de 2010 com rendimento médio da safra estimado em 22627 IBGE 2010 A atividade citrícola tem passado por vários ciclos de negócio que reflete em fases de alta e baixa dos preços NEVES RUMJANEK 2006 Porém a importância econômica da atividade para o país tem permitido a utilização de novas tecnologias o que tende a diminuir gastos com mãodeobra Por outro lado o uso de fertilizantes e defensivos exige um trabalho mais qualificado gerando um aumento na produtividade AMARO VICENTE BAPTISTELLA 2001 o qual juntamente com o aumento da qualidade dos pomares cítricos é obtido por meio da produção de mudas com o uso da enxertia em viveiros comerciais CASTRO KERSTEN1996 Cerca de 85 das plantas cítricas estão enxertadas sobre limãocravo Citrus limonia Osbeck POMPEU JÚNIOR 2005 Mas atualmente existe uma diversificação de portaenxertos e sua escolha deve recair sobre aquele que apresente maior resistência ou tolerância às doenças do local do plantio CARLOS STUCCHI DONADIO 1997 POMPEU JÚNIOR 2001 Outra possibilidade de melhorar a produtividade ou a qualidade de pomares cítricos seria o uso de bactérias endofíticas como promotoras de crescimento vegetal 13 Essa prática poderia ser empregada na fase de produção do portaenxerto visando acelerar o crescimento e reduzir o período que a muda passa em viveiro Devido à importante associação com citros ARAÚJO et al 2002 LACAVA et al 2004 e seu potencial benéfico sobre diversas culturas Methylobacterium spp poderiam ser empregadas para esse fim com chances de obtenção de resultados promissores Assim o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar a possibilidade de Methylobacterium spp atuarem como promotoras de crescimento de plantas cítricas em viveiro de produção comercial mais especificamente i avaliar o efeito de Methylobacterium spp sobre a germinação de sementes de limãocravo e tangerina sunki ii avaliar o efeito de Methylobacterium spp sobre o crescimento de mudas de limãocravo e tangerina sunki Referências 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American Journal of Applied Sciences New York v 1 p 194199 2009 21 3 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE β14ENDOGLICANASE EM Methylobacterium extorquens E COLONIZAÇÃO ENDOFÍTICA DE Catharanthus roseus Resumo Methylobacterium extorquens AR162 foi isolada como endófito de ramos de Citrus sinensis afetados pela CVC causada por Xylella fastidiosa Esta bactéria foi geneticamente transformada para expressar o gene da β14endoglicanase A EglA de Bacillus pumilus A linhagem transformada AREGLA foi introduzida em Catharanthus roseus e o seu estabelecimento bem como a sua interação com X fastidiosa linhagem isolada de citros afetado pela CVC na planta hospedeira foram avaliados por meio de microscopia eletrônica de varredura MEV Foi observado que a linhagem AREGLA colonizou a superfície de C roseus onde formou biofilme confirmando que esta pode ser uma estratégia de estabelecimento na planta hospedeira Esta linhagem AREGLA também foi observada no interior da planta hospedeira colonizando os vasos do xilema Os resultados mostraram que M extorquens e X fastidiosa podem habitar os vasos xilemáticos em C roseus onde podem interagir no interior da planta hospedeira Estes resultados indicam que a utilização de Methylobacterium para o controle da CVC poderá ser viável devido às características apropriadas para introdução neste endófito de citros Palavraschave Methylobacterium extorquens EglA Interação bactériaplanta Controle simbiótico Xylella fastidiosa 3 HETEROLOGOUS EXPRESSION OF A β14ENDOGLUCANASE IN Methylobacterium extorquens AND ENDOPHYTIC COLONIZATION OF Catharanthus roseus Abstract Methylobacterium extorquens AR162 was isolated as endophytic from branches of Citrus sinensis showing symptoms of CVC caused by Xylella fastidiosa This bacterium was genetically transformed to express heterolously an endoglucanase A EglA obtained from Bacillus pumilus The transformed strain AREGLA was introduced in Catharanthus roseus and its establishment and interaction with X fastidiosa strain isolated from citrus affected by CVC in the host plant were evaluated by scanning electron microscopy MEV It was observed that the strain AREGLA colonized the surface of C roseus where formed the biofilm confirming that this way may be an important strategy for establishment in the host plant Also this strain was observed within the xylem vessels The results indicated that M extorquens and X fastidiosa can inhabit the interior of the xylem in C roseus where they can interact within the host plant These results indicates the possibility of Methylobacterium be used for control of CVC due to the appropriate characteristics of the bacterium 22 Keywords Methylobacterium extorquens EglA Bacteriaplant interaction Symbiotic control Xylella fastidiosa 31 Introdução A filosfera e a rizosfera abrigam uma grande diversidade de bactérias que podem interagir com a planta hospedeira de forma benéfica prejudicial ou neutra Esta interação bactériaplanta é regulada por vários metabólitos liberados pela planta hospedeira e também por bactérias epifíticas eou endofíticas Neste contexto as bactérias pertencentes ao gênero Methylobacterium são comumente encontradas em associação com plantas ARAÚJO et al 2001 ARAÚJO et al 2002 HOLLAND POLACO 1994 OMER TOMBOLINI GERHARDSON 2004 podendo promover o crescimento vegetal eou controlar fitopatógenos MADHAIYAN et al 2006 LEE et al 2006 Em citros Methylobacterium foi isolado como um dos principais gêneros presente na comunidade bacteriana de portaenxertos ARAÚJO et al 2001 e também de Citrus sinensis especialmente das plantas afetadas pela CVC causada pela bactéria X fastidiosa ARAÚJO et al 2002 Dessa forma pela primeira vez foi cogitada a possibilidade de interação entre espécies deste gênero e X fastidiosa e posteriormente o controle simbiótico da CVC por meio destas bactérias Segundo hipóteses estabelecidas a respeito da interação entre bactérias endofíticas e X fastidiosa a CVC poderia desempenhar um papel no estabelecimento de Methylobacterium spp na planta hospedeira Esta hipótese foi endossada pela análise da diversidade de Methylobacterium spp pois este gênero foi o mais frequentemente isolado de plantas sintomáticas ARAÚJO et al 2002 LACAVA et al 2004 SANTOS 2005 Além disso resultados de estudos da interação entre Methylobacterium spp e X fastidiosa realizados in vitro sugerem que em alguns casos o crescimento do fitopatógeno pode ser inibido na presença de Methylobacterium LACAVA et al 2004 Posteriormente Andreote et al 2006 demonstraram que a linhagem M mesophilicum SR166 isolada de citros foi capaz de 23 colonizar C roseus e Nicotina clevelandii sugerindo o uso dessas plantas como modelo para o estudo da interação entre Methylobacterium spp e X fastidiosa Com o auxílio da engenharia genética novas formas de controle de fitopatógenos vêm sendo desenvolvidas a partir de bactérias endofíticas A introdução de genes exógenos nessas bactérias possibilita a aquisição de novas características utilizadas no controle de doenças e pragas FAHEY et al 1991 LAMPEL et al 1994 TOMASINO et al 1995 Recentemente Marx e Lidstrom 2001 desenvolveram com base no genoma de M extorquens AM1 uma série de vetores de expressão que estão sob controle do promotor PmxaF gene que codifica para a metanol desidrogenase e isso tem se constituído de uma ferramenta genética que vem sendo empregada não só para uma melhor compreensão do metabolismo metilotrófico ANTHONY GHOSH BLAKEl 1994 LIDSTROM MURRELL DALTON 1992 VORHOLT 2002 proposto como um importante ponto na interação entre Methylobacterium e planta hospedeira ABANDAKNPWATT et al 2006 SY et al 2005 como também para a expressão de genes heterólogos em Methylobacterium Dessa forma o potencial de M extorquens e outras bactérias metilotróficas pode ser aumentado para a produção de moléculas incluindo vitamina B12 TROTSENKO IANOVA DORONINA 2001 polihidroxibutirado PHB BOURQUE POMERLEAU GROLEAU 1995 KOROTKOVA CHISTOSERDORA LIDSTROM 2002 carotenóides VAN DIEN et al 2003 e fitohormônios KOENING MORRIS POLLACO 2002 Além disso a íntima associação entre Methylobacterium spp e a planta hospedeira sugere a possibilidade de manipulação genética com consequente aumento da capacidade destas bactérias em proteger o hospedeiro contra insetos e patógenos Assim Choi et al 2008 clonaram e expressaram o gene cry1Aa de B thuringienses em M extorquens para o controle de Bombyx mori Nesse mesmo sentido o controle simbiótico é uma nova ferramenta de transformação genética que tem sido sugerida para o controle de doenças em plantas Esta ferramenta utiliza o princípio de que microrganismos candidatos que tenham uma associação com um ecossistema com um determinado problema e que ocupem o mesmo nicho ou tenha acesso ao patógeno alvo podem ser manipulados geneticamente e reintroduzidos para controle do patógeno MILLER 2007 24 X fastidiosa é uma bactéria Gramnegativa restrita ao xilema da planta hospedeira que causa a CVC em citros CHANG et al 1993 e doença de Pierce em videira HOPKINS 1989 É disseminada naturalmente por meio de insetos vetores pertencentes às famílias Cicadellidae e Cercopidae que adquirem X fastidiosa após se alimentarem da seiva bruta do xilema em plantas infectadas com a bactéria PURCELL FINLAY 1979 PURCELL HOPKINS 1996 ROSSETTI et al 1990 A hipótese mais aceita para a causa de doenças em plantas por X fastidiosa é a síntese de exopolissacarídeos EPSs da SILVA et al 2001 SIMPSON et al 2000 Como observado em análise de Microscopia Eletrônica de Varredura Figura 1 a produção de EPS nomeado goma fastidiana da SILVA et al 2001 possibilita o agrupamento de células e consequente formação de biofilme levando à obstrução dos vasos xilemáticos Consequentemente os processos fisiológicos vitais da planta como a fotossíntese respiração e distribuição dos nutrientes ficam comprometidos levando em citros aos sintomas da CVC manifestados pela clorose da folhas e redução do tamanho dos frutos MACHADO et al 1992 MACHADO et al 1994 ROSSETTI et al 1990 Figura 1 Eletromicrografia de X fastidiosa infectando os vasos do xilema em Citrus Fonte EW Kitajima ESALQUSP O estabelecimento de várias outras doenças causadas por bactérias fitopatogênicas depende da produção de EPSs COSTERTON STEWART GREENBERG 1999 contribuindo para o estabelecimento do microrganismo na planta e obstrução do xilema Por essa razão a busca por microrganismos com a habilidade 25 em degradar EPSs tem sido considerada uma estratégia para o controle de doenças em plantas Bactérias do gênero Bacillus têm sido descritas como microrganismos potenciais para a degradação de EPSs Nankai et al 1999 elucidaram a via completa de despolimerização de goma xantana por Bacillus sp linhagem GL1 e mostraram que algumas enzimas dentre elas a beta14 Dendoglicanase atuam de forma sequencial para a despolimerização de goma Lima et al 2005 avaliando alguns isolados endofíticos de citros do gênero Bacillus Araújo et al 2001 quanto à produção de endoglicanase selecionaram B pumilus CL16 como o isolado com mais alta atividade para degradação de goma e assim o gene da endoglicanase A eglA foi clonado Segundo Azevedo e Araújo 2003 por colonizarem o mesmo nicho que X fastidiosa em citros Methylobacterium spp poderiam ser geneticamente modificadas e reintroduzidas na planta hospedeira para expressarem genes de despolimerização de goma fastidiana Dentro desse contexto do controle simbiótico Gai et al 2009 transformaram geneticamente M mesophilicum SR166 para expressar a proteína fluorescente verde GFP reintroduziram esta bactéria manipulada geneticamente em C roseus e examinaram a colonização e a transmissão da bactéria por Bucephalogonia xanthophis um dos insetos vetores de X fastidiosa subsp pauca Os resultados mostraram que a bactéria não só foi transmitida pelo inseto vetor para a planta hospedeira mas também ocupou o mesmo nicho que o fitopatógeno em C roseus Assim os autores propuseram este endófito como um candidato ao controle simbiótico contra X fastidiosa subsp pauca Em outros trabalhos realizados em nosso laboratório M extorquens AR162 linhagem oriunda de citros também foi modificada geneticamente para expressar GFP em C roseus Os resultados obtidos mostraram que assim como verificado para M mesophilicum SR166 GAI et al 2009 M extorquens AR162 colonizou a planta hospedeira Com o objetivo de avaliar M extorquens AR162 como candidata ao controle simbiótico contra X fastidiosa o presente estudo relata a transformação genética dessa bactéria para expressão heteróloga do gene da endoglicanase A EglA de B pumilus 26 Referências ABANDANKPWATT D MUSCH M TSCHIERSCH J BOETTNER M SCHWAB W Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings growth promotion methanol consumption and localization of the methanol emission site Journal of Experimental Botany Oxford v 57 n 15 p 40254032 2006 ANDREOTE FD LACAVA PT GAI CS ARAÚJO WL MACCHERONI WJR VAN OVERBEEK LS VAN ELSAS JD AZEVEDO JL Model plants for studying the interaction between Methylobacterium 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2010 Artigo submetido FIGUEIRA MM LARAMEE L MURRELL JC GROLEAU D MIGUEZ CB Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens FEMS Microbiology Letters Amsterdam v 193 p 195200 2000 GAI CS LACAVA PT QUECINE MC AURIAC MC LOPES JRS ARAÚJO WL MILLER TA AZEVEDO JL Transmission of Methylobacterium mesophilicum by Bucephalogonia xanthophis for paratansgenic control strategy of Citrus Variegated Chlorosis The Journal of Microbiology Seoul v 47 n 4 p 448454 2009 HALLMANN J QUADTHALLMANN A MAHAFFEE WF KLOEPPER JW Bacterial endophytes in agricultural crops Canadian Journal of Microbiology Ottawa v 43 p 895914 1997 HOLLAND MA POLACCO JC PPFMs and other contaminants is there more to plant physiology than just plant Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology Palo Alto v 45 p 197220 1994 28 HOPKINS DL Xylella fastidiosa xylem limited bacterial pathogen of plants Annual Review of Phytopathology Palo Alto v 27 p 271290 1989 KOENING RL 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Arachis hypogaea L compared with rot pathogens Current Microbiology New York v 53 n 4 p 270276 2006 MADHAIYAN M POONGUZHALI S SENTHILKUMAR M SUNDARAM SP SA T Nodulation and plantgrowth promotion by methylotrophic bacteria isolated from tropical legumes Microbiological Research Amsterdam v 164 p 114120 2009 MARX CJ LIDSTROM ME Development of improved versatile broadhostrange vectors for use in methylotrophs and other Gramnegative bacteria Microbiology New York v 147 p 414419 2001 MICHELI F Pectin methylesterases cell wall enzymes with important roles in plant physiology Trends in Plant Science Kidlington v 6 p 414419 2001 MILLER TA Symbiotic control in agriculture and medicine Symbiosis Rehovot v 42 p 6774 2007 MONIER JM LINDOW SE Differential survival of solitary and aggregated bacterial cells promotes aggregate formation on leaf surfaces Proceedings of the National Academy of Science of United States of America Washington v 100 p 15977 15982 2003 MONTEIRO PB RENAUDIN J 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CAMARGO LEA CARRARO DM CARRER H COLAUTO NB COLOMBO C COSTA FF COSTA MCR COSTANETO CM COUTINHO LL CRISTOFANI M DIASNETO E DOCENA C EIDORRY H FACINCANI AP FERREIRA AJS FERRERIA VCAFERRO JA FRAGA JS FRANÇA SC FRACNO MC FROHME M FURLAN LR GARNIER M GOLDMAN GH GOLDMAN MHS GOMES SL GRUBER A HO PL HOHEISE JD JUNQUEIRA ML KEMPER EL KITAJIMA JP KRIEGER JE KURAMAE EE LAIGRET F LAMBAIS MR LEITE LCC LEMOS EGM LEMOS MVF LOPES SA LOPES CR MACHADO JA MACHADO MA MADEIRA AMBN MADEIRA HMF MARINO CL MARQUES MV MARTINS EAL MARTINS EMF MATSUKUMA AY MENCK CFM MIRACCA EC MIYAKI CY MONSTEIROVITORELLO CB MOON DH NAGAIS MA NASCIMENTO ALTO NETTO LES NHANI Jr A NOBREGA FG NUNES L OLIVEIRA MA de OLIVEIRA MC de OLIVEIRA RC PALMIERI DA PARIS A PEIXOTO BR PEREIRA AG PEREIRA Jr HA PESQUERO JB QUAGGIO RB ROBERTO PG RODRIGUES V de M ROSA AJ de ROSA Jr VE de SÁ RG SANTELLI RV SAWASAKI HE da SILVA ACR da SILVA AM da SILVA FR SILVA WA da SILVEIRA JF SILVESTRI MLZ SIQUEIRA WJ de SOUZA AA de SOUZA AP TERENZI MF TRUFFI D TSAI SM TSUHAKOM H VALLADA H VAN SLUYS MA VERJOVSKIALMEIDA S VETTORE AL ZAGO MA ZATZ M MEIDANIS J SETUBAL JC The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa Nature New York v 406 p 151157 2000 SOBRAL JK A comunidade bacteriana endofítica e epifítica de soja Glycine max e estudo da interação endófitosplanta 2003 174p Tese Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Universidade de São Paulo Piracicaba 2003 SY A TIMMERS ACJ KNIEF C VORHOLT JA Methylotrophic metabolism is advantageous or Methylobacterium extorquens during colonization of Medicago truncatula under competitive conditions Applied and Environmental Microbiology Baltimore v 71 p 72457252 2005 TEATHER RM WOOD PJ Use of congo redpolysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from bovine rumen Applied and Environmental Microbiology Baltimore v 43 p 777780 1982 32 TOMASINO SF LEISTER RT DIMOCK MB BEACH RM KELLY JL Field performance 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mesophilicum SR166 PLANTA HOSPEDEIRA Resumo Methylobacterium spp são bactérias metilotróficas facultativas que apresentam a capacidade de utilizar metanol como fonte de carbono Essas bactérias são frequentemente encontradas em ambientes terrestres e aquáticos e também em associação simbiótica com as plantas podendo beneficiálas por meio da promoção de crescimento vegetal eou do controle de fitopatógenos Isolados de Methylobacterium tendem a formar agregados na filosfera facilitando a comunicação celular cuja regulação pode ocorrer por meio do sistema Quorumsensing QS Dessa forma as bactérias podem coordenar mudanças adaptativas e fisiológicas na população favorecendo sua adaptação em ambientes específicos como durante a interação bactériaplanta Alguns sistemas QS utilizam as Nacilhomoserina lactonas AHLs como moléculas sinalizadoras comumente encontradas em bactérias Gramnegativas que vivem em associação com plantas incluindo membros do gênero Methylobacterium Dentro desse contexto o presente trabalho avaliou por PCR quantitativo em tempo real a ação da SNdodecanoilHSL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M mesophilicum SR166 e planta hospedeira Para isso foram selecionados genes envolvidos com o metabolismo metilotrófico e o estabelecimento da bactéria na planta mxaF respostas a estresse e transporte de compostos crtI vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta pat metabolismo bacteriano e modulação dos níveis hormonais na planta acdS transporte de compostos e reconhecimento sss e com patogenicidade phoU Nas condições avaliadas foi observado que a expressão dos genes mxaF acdS e pat foi ativada na presença de AHL sugerindo a importância dessa molécula no favorecimento da interação bactériaplanta No entanto a presença da AHL parece não ter influência na expressão dos genes crtI sss e phoU Os resultados obtidos nesse estudo fornecem uma base para futuros estudos das funções reguladas por AHLs em Methylobacterium spp Palavraschave AHL Methylobacterium Interação bactériaplanta 34 4 NACYLHOMOSERINE LACTONE ACTION ON THE GENE EXPRESSION DURING Methylobacterium mesophilicum SR166PLANT INTERACTION Abstract Methylobacterium spp are methylotrophic facultative bacteria that can use methanol as source of carbon These bacteria are commonly found in terrestrial and aquatic environments and also in symbiotic associations with plants can be beneficed by them that act promoting the plantgrowth andor controlling of phytopathogens Methylobacterium isolates tend to form aggregates on the phyllosphere facilitating cell communication whose regulation can occurs through regulation of Quorum Sensing system QS Thus the bacterial cells can coordinate physiological and adaptive changes in their population favoring its adaptation to specific environments such as during bacteriumplant interaction Some QS systems use Nacylhomoserine lactones AHLs as signaling molecules commonly found in Gramnegative bacteria that living in association with plants including members of the Methylobacterium genus Within this context this work evaluated by quantitative real time PCR the action of SN dodecanoilHSL on the expression of genes related in the interaction between M mesophilicum SR166plant For this were selected genes related to methylotrophic metabolism and establishment in the plant mxaF stress sensed by the bacteria and transport of compounds crtI adaptive and competitive advantages during the plant colonization pat bacterial metabolism and modulation of hormone levels in the plant acdS transport of compounds and recognition sss and pathogenicity phoU Under the evaluated conditions it was observed that mxaF acdS and pat were overexpressed in the presence of AHL suggesting the importance of this molecule during the bacteria plant interaction However the AHL presence seems to have not influence on the expression of crtI sss and phoU genes These results provide a basis for future studies of the functions regulated by AHLs in Methylobacterium spp Keywords AHL Methylobacterium Bacteriaplant interaction 35 41 Introdução Methylobacterium spp são bactérias Gramnegativas pertencentes à subclasse 2 de Proteobactéria róseas e metilotróficas facultativas capazes de crescer sobre compostos de um carbono como metanol e metilamina TOYAMA ANTHONY LIDSTROM 1998 Essas bactérias são ubíquas na natureza e frequentemente encontradas no solo ambientes aquáticos VAN AKEN et al 2004 e em associação simbiótica com várias espécies vegetais ARAÚJO et al 2002 MADHAIYAN et al 2009a MADHAIYAN et al 2009b SENTHILKUMAR et al 2009 SY et al 2001 Quando em associação com as plantas Methylobacterium spp podem promover o crescimento vegetal de forma direta possivelmente por meio da produção de fitohormônios e da fixação de nitrogênio LEE et al 2006 MADHAIYAN et al 2005 OMER TOMBOLINI GERHARDSON 2004 SENTHILKUMAR et al 2009 SY et al 2001 ou indiretamente por meio da supressão de fitopatógenos FERREIRA FILHO ARAÚJO KULINSKY SOBRAL 2001 MADHAIYAN et al 2004 MADHAIYAN et al 2006 Methylobacterium spp podem ser a população potencialmente dominante na filosfera CORPE RHEEM 1989 e desde que bactérias metilotróficas tendem a formar agregados sobre as partes aéreas das plantas SY et al 2005 o estudo da regulação do metabolismo bacteriano por Quorum Sensing QS tem ganhado importância para o entendimento desta interação bactériaplanta QS é um mecanismo através do qual as bactérias são capazes de responder às mudanças na densidade populacional e coordenar o comportamento de células individuais em uma população local Isso ocorre por meio de troca de sinais moleculares extracelulares que agem como coindutores para regular a transcrição de genes alvo permitindo assim às bactérias coordenar mudanças adaptativas e fisiológicas na população de forma a beneficiálas em um ambiente particular BAUER MATHESIUS 2004 JOINT 2006 SANCHESCONTRERAS et al 2007 SOTO SANJUÁN OLIVARES 2006 Além de atuar sobre a expressão de genes envolvidos na interação bactériabactéria QS também é importante na regulação de genes envolvidos na interação bactériaplanta BARNARD et al 2007 SANCHES CONTRERAS et al 2007 WHITE WINANS 2007 36 Alguns sistemas QS envolvem as Nacilhomoserina lactonas AHLs como coindutores Essas moléculas são comuns entre bactérias Gramnegativas que vivem em associação com plantas e parecem ser importantes para a colonização do hospedeiro BARNARD et al 2007 CHA et al 1998 CAMILLI BASSLER 2006 LOH et al 2002 SANCHESCONTRERAS et al 2007 WHITE WINANS 2007 Além disso estudos mostram que AHLs podem elicitar uma diversidade de respostas na planta incluindo respostas de defesa hormonais e ativação da regulação gênica BAUER MATHESIUS 2004 A presença de AHLs tem sido descrita para membros do gênero Methylobacterium Penãlver et al 2006 identificaram em M extorquens AM1 a presença de dois sintemas QS e a produção de um novo tipo de AHL contendo uma cadeia acil com ligações duplas insaturadas Poonguzhali Madhaiyan e Sa 2007 caracterizaram a produção de AHLs por Methylobacterium spp isoladas de água potável solo e arroz Recentemente Pomini et al 2009 realizaram um estudo químico das AHLs produzidas por M mesophilicum SR166 endófito de citros ARAÚJO et al 2002 As configurações absolutas de 6 AHLs foram determinadas e duas delas SN 2E7ZtetradecanoilHSL e SN2EdodecanoilHSL foram sintetizadas pela primeira vez Os autores também realizaram estudos relacionados aos efeitos das AHLs sintéticas sobre bactérias endofíticas Grampositivas coisoladas de citros com M mesophilicum SR166 e verificaram que essas moléculas parecem não estar associadas com competição antimicrobiana e consequentemente com a prevalência de M mesophilicum SR166 sobre as demais bactérias em citros Os autores ainda buscam entender os efeitos dessas AHLs sobre a expressão de genes em X fastidiosa Nesse sentido vários outros trabalhos têm sido realizados Estudos de microarranjo com Pseudomonas aeruginosa defectiva para a produção de AHL mostraram que 616 genes nessa espécie tiveram sua expressão afetada com a adição da molécula sendo 222 genes reprimidos WAGNER et al 2003 Análises proteômicas com Sinorhizobium meliloti revelaram que a presença de AHLs exógenas na cultura afetou os níveis de proteínas expressas CHEN et al 2003 Schwartz et al 2007 mostraram por qPCR que alguns genes foram positivamente regulados no biofilme maduro produzido por P aeroginosa na presença de AHLs 37 Em Methylobacterium embora vários trabalhos mostrem a importância da sua associação com as plantas LEE et al 2006 MADHAIYAN et al 2009a MADHAIYAN et al 2009b PIRTTILA et al 2000 SY et al 2001 pouco se conhece sobre a atuação das AHLs na expressão dos genes envolvidos nessa interação Estudos mostram que a produção de biofilme parece ser dependente da produção de AHLs PENÃLVER et al 2006 e que a sua formação sobre a planta pode ser a primeira etapa para a colonização endofítica por Methylobacterium ANDREOTE et al 2006 No entanto muitos aspectos dessa e outras relações ainda devem ser entendidos A maioria dos trabalhos que buscam uma melhor compreensão para o processo de interação bactériaplanta avalia genes diferencialmente expressos na planta em resposta a um microrganismo patogênico BOGACKI OLDACH WILLIANS 2008 WANG et al 2010 Sendo assim também ainda pouco se conhece sobre a diferença na expressão dos genes da bactéria durante a sua interação com a planta Neste contexto Dourado 2010 avaliou a expressão de genes envolvidos na interação entre M mesophilicum SR166planta A autora verificou que a ativação de alguns genes nessa linhagem aumentou sua adaptação à planta favorecendo a interação Em contrapartida a bactéria reprimiu genes associados ao estresse e não expressou genes associados à patogenicidade mostrando que a sua interação com a planta parece não gerar estresse para ambas as partes envolvidas Visando mais informações a cerca da diferença na expressão dos genes de M mesophilicum SR166 o objetivo do presente estudo foi avaliar por qPCR o efeito da SNdodecanoilHSL sobre a expressão dos genes mxaF acdS crtI pat sss e phoU envolvidos na interação da bactéria com a planta Referências ANDERSON DJ MORRIS CJ NUNN DN ANTHONY C LIDSTROM ME Nucleotide sequence of the Methylobacterium extorquens AM1 moxF and moxJ genes involved in methanol oxidation Gene 90 In ANTHONY C The Biochemistry of Methylotrophs London v 31 p 173176 1990 38 ANDREOTE FD LACAVA PT GAI CS ARAÚJO WL MACCHERONI W VAN OVERBEEK LS VAN ELSAS JD AZEVEDO JL Model plants for studying the interaction between Methylobacterium mesophilicum and Xylella fastidiosa Canadian Journal of Microbiology Ottawa v 52 p 419426 2006 ANTHONY C GHOSH M BLAKEl CCF The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrroloquinoline quinone Biochemical Journal London v 304 p 665674 1994 ARAÚJO WL MARCON J MACCHERONI JUNIOR W VAN ELSAS JD VAN VUURDE JWL AZEVEDO JL Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with 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YOKOYAMA T OHYAMA T ASAMIZU E KUWTA C SHIBATA D TABATA S Largescale analysis of gene expression profiles during early stages of root nodule formation in a model legume Lotus japonicus DNA Research Tokyo v 11 p 263274 2004 LACAVA PT LI WB AZEVEDO JL HARTUNG JS Rapid specific and quantitative assays for the detection of the endophytic bacterium Methylobacterium mesophilicum in plants Journal of Microbiology Methods Amsterdan v 65 p 535 541 2006 LAMARCHE MG WANNER BL CRÉPINS S HAREL J The phosphate regulon and bacterial virulence a network connecting phosphate homeostasis and pathogenesis FEMS Microbiology Review Amsterdam v 32 p 461473 2008 LEE HS MADHAIYAN M KIM CW CHOI SJ CHUNG KY SA TM Physiological enhancement of early growth of rice seedlings Oryza sativa L by production of phytohormone of N2fixing methylotrophic isolates Biology and Fertility of Soils Berlim v 42 p 402408 2006 LI Y ZHANG Y PhoU is a persistence swith involved in persister formation and tolerance to multiple antibiotics and stresses in Escherichia coli Antimicrobial Agents an Chemotherapy Washington v 51 p 20922099 2007 LIDSTROM ME CHISTOSERDOVA L Plants in the Pink Cytokinin production by Methylobacterium Journal of Bacteriology Baltimore v 184 p 1818 2003 LOH J CARLSON RW YORK WS STACEY G Bradyoxetin a unique chemical signal involved in symbiotic gene regulation PNAS Washington v 99 p 144 146 2002 LOLKEMA JS SLOTBOOM DJ The major amino acid transporter superfamily has a similar core strcture as Na galactose and Na leucine transporters Molecular Membrane Biology Abingdon v 25 p 567570 2008 MAcDONALD RC FALL R Detection of substantial emissions of methanol from plants to the atmosphere Atmospheric Environment Part A General Topics Oxford v 27 p 17091713 1993 MADHAIYAN M POONGUZHALI S SENTHILKUMAR M SESHADRI S CHUNG HY YANG JC SUNDARAM S SA TM Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar C047 Oryza sativaL by Methylobacterium spp Botanical Bulletin of Academia Sinica Taipei v 45 n 4 p 315324 2004 MADHAIYAN M POONGUZHALI S LEE HS SUANDARAM SP Pinkpigmented facultative methylotrophic bacteria accelerate germination growth and yield of sugarcane clone Co86032 Saccharum officinarum L Biology and Fertility of Soils Berlim v 41 n 5 p 350358 2005 41 MADHAIYAN M SURESH REDDY BV ANANDHAN R SENTHILKUMAR M POONGUZHALI S SUNDARAM SP TONGMIN SA Plant growthpromoting Methylobacterium induces defense responses in groundnut Arachis hypogaea L compared with rot pathogens Current Microbiology New York v 53 n 4 p 270276 2006 MADHAIYAN M POONGUZHALI S KWON SW SA TM Methylobacterium phyllosphaerae sp Nov a pinkpigmented facultative methylotroph from the phyllosphere of rice International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology República da Coréia v 59 p 2227 2009a MADHAIYAN M POONGUZHALI S SENTHILKUMAR M SUNDARAM SP SA T Nodulation and plantgrowth promotion by methylotrophic bacteria isolated from tropical legumes Microbiological Research Amsterdam v 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associação com citros e ocuparem o mesmo nicho que X fastidiosa nessa cultura Methylobacterium spp despertam interesse no que diz respeito à sua aplicação na citricultura visto que esta é uma importante atividade agrícola para o país Dessa forma o estudo da interação entre Methylobacterium spp e citros se torna de grande importância do ponto de vista agronômico No presente trabalho foi observado que Methylobacterium spp de diferentes hospedeiros podem promover o crescimento de duas variedades de portaenxerto de citros em condições comerciais a partir de duas metodologias de inoculação Quando foi utilizada a metodologia de bacterização de sementes foi observado que as respostas sobre a germinação e sobre o desenvolvimento das plântulas parecem ter variado em função da especificidade da interação entre a bactéria e a variedade de portaenxerto utilizada Foi verificado que as linhagens provenientes de citros foram aquelas que geraram melhores resultados sobre o desenvolvimento das mudas Quando as bactérias foram aplicadas diretamente no substrato os efeitos positivos sobre o crescimento das mudas foram mais rápidos e parece ter ocorrido uma melhor interação entre bactériaplanta inclusive entre uma linhagem proveniente de outro nicho A promoção de crescimento observada deve ter sido mediada pela produção de AIA e pela fixação biológica de nitrogênio por Methylobacterium spp Com relação à origem dessas bactérias é sugerido que possivelmente são transmitidas horizontalmente em plantas cítricas Os resultados obtidos mostraram que 45 Methylobacterium spp têm potencial para serem empregadas comercialmente na produção de plantas cítricas visando melhorar a produtividade das mudas e reduzir seu tempo de saída para o mercado Além disso esse estudo reforça a importância de se realizar uma seleção de microrganismos bem como escolher o melhor método de aplicálos num programa de melhoramento vegetal Foi obsevado também que M extorquens AR162 expressando uma endoglicanase A EglA foi capaz de colonizar a planta hospedeira mesmo quando co inoculada com X fastidiosa Dessa forma tendo em vista que o sistema de transformação utilizado gerou resultados satisfatórios existe a possibilidade da obtenção de novas linhagens de Methylobacterium por meio da manipulação genética visando o aumento da produção de compostos de interesse para aplicação agrícola e também biotecnológico Ainda buscando entender os mecanismos pelos quais Methylobacterium spp interagem com a planta hospedeira foi observado que a expressão dos genes mxaF acdS crtI pat sss e phoU de M mesophilicum SR166 foi aumentada ou não se alterou na presença de uma SNdodecanoilHSL Neste contexto foi observado que nas condições avaliadas a presença da AHL parece ser importante para a ativação dos genes mxaF relacionado ao metabolismo metilotrófico e estabelecimento da bactéria na planta pat que parece conferir vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta e do gene acdS importante para o metabolismo bacteriano e para modular os níveis hormonais na planta de modo que esta possa ser beneficiada através da promoção do crescimento vegetal Conforme verificado no Capítulo 2 M mesophilicum SR166 promoveu o crescimento de citros e assim é possível sugerir que este efeito benéfico sobre a planta possa estar associado à ativação do gene acdS nessa linhagem A expressão dos genes crtI phoU e sss não foi alterada pela AHL nas condições avaliadas sugerindo que essa molécula parece não ter um papel relevante para a função desses genes durante a interação da bactéria com a planta Os resultados obtidos abrem prespectivas para mais estudos sobre as funções reguladas por AHLs em Methylobacterium spp Como verificado ainda há muito para se entender sobre as interações bactéria planta Nesse aspecto os dados gerados no presente trabalho vêm contribuir para a 46 geração de novas informações abrindo caminhos para outras investigações sobre os mecanismos envolvidos na interação Methylobacteriumplanta colaborando para futuras aplicações práticas dessas bactérias na agricultura visto que possuem potencial para este fim Com relação à citricultura os resultados obtidos neste estudo abrem boas perspectivas da aplicação de Methylobacterium spp no controle biológico de fitopatógenos e na promoção de crescimento vegetal contribuindo assim para melhorar a qualidade e a sanidade das mudas cítricas