Diagnóstico Molecular de Doenças Genéticas - Aula 3: FISH

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DOENÇAS GENÉTICAS Citogenética Aula 3 Profa Thaís Furtado Nani MSc PhD GenéticaCitogenética Assessora Técnica Científica Molecular Biotecnologia e Representações LTDA FISH Fluorescence InSitu Hybridization FISH chromosome on microscope slide denature DNA double helix Make complementary probe labelled with fluorescent marker Nick Translation denature hybridize probe to denatured chromosome cMYC MYC Breakapart COMO É FEITO O EXAME DE FISH Sample Preparation FISH Protocol Hybridization Wash Counter Stain Examine P16 CDKN2A Deletion COMO É FEITO O EXAME DE FISH Sample Preparation FISH Protocol Hybridization Wash Counter Stain Examine E2A TCF3 Breakapart Sample Preparation FISH Protocol Hybridization Wash Counter Stain Examine Hyperdiploidy FISH Aplicar a sonda Cobrir com lamínula Vedar com cola removível TELAML1 ETV6RUNX1 Translocation Dual Fusion FISH Favor Melhor regulação da temperatura Contra Processo manual dificultado denaturação de muitas lâminas ao mesmo tempo Favor Menos manual Várias lâminas ao mesmo tempo Contra Inconsistência de temperatura nas posições do hibridizador Perda de humidade Picos de temperatura durante a transição Chapa aquecedora X Hibridizador MLL KMT2A Breakapart FISH Regulação das temperaturas é super crítico para um bom resultado Chapa aquecedora Favor Melhor regulação da temperatura Contra Processo manual dificultado denaturação de muitas lâminas ao mesmo tempo BCRABLABL1 Translocation Dual Fusion FISH IGH Breakapart COMO É FEITO O EXAME DE FISH FISH Atenção Tirar a lamínula pH do SSC 7 1 FISH Dicas Temperatura do SSC 721C verificar a temperatura do SSC não da água Usar jarros de cerâmica Mantem melhor a temperatura e não sofre choque térmico Jarros de plástico acumulam mais resíduos Bolinhas de plástico ajudam a manter a temperatura FISH COMO É FEITO O EXAME DE FISH Sample Preparation FISH Protocol Hybridization Wash Counter Stain Examine Material a ser estudado Direto DNA vivo Denaturação Denaturação Hibridação Detecção DIRETA Sonda Indireto Denaturação Marcação FISH Processo de Detecção Detecção INDIRETA FISH Detecção e amplificação do sinal Aplicações Fiber FISH Outros alvos de tamanho muito reduzidos FISH Contracorar os cromossomos com DAPI FISH em amostras FFPE Marcar a área tumoral com caneta de diamante nas costas da lâmina Coloração com Hematoxilina e Eosina para identificação da área tumoral Cortes histológicos Desparafinização e digestão enzimática do citoplasma FISH em amostras FFPE Marcar a área tumoral com caneta de diamante nas costas da lâmina Coloração com Hematoxilina e Eosina para identificação da área tumoral Cortes histológicos Desparafinização e digestão enzimática do citoplasma Reagente 1 Solução de pré tratamento pH 70 98 100C por 15 minutos Lavar em PBS em temperatura ambiente TA por 23 minutos Reagente 2 Digestão enzimática Cobrir o tecido com pepsina 100200μl por 10 minutos em TA structure Lavar em PBS em temperatura ambiente TA por 23 minutos Série alcoolica70 85 95 e 100 por 2 minutos FISH em amostras FFPE Dicas para digestão enzimática Aquecer a enzima antes Não permitir que a solução evapore sobre o material cobrir com plástico filme ajuda FISH em amostras FFPE FISH em amostras FFPE Marcar a área tumoral com caneta de diamante nas costas da lâmina Coloração com Hematoxilina e Eosina para identificação da área tumoral Cortes histológicos Desparafinização e digestão enzimática do citoplasma FISH COMO É FEITO O EXAME DE FISH Sample Preparation FISH Protocol Hybridization Wash Counter Stain Examine Denature 75C 5 min Humidified box 37C 1672 hrs 2X SSC Room temp 5 min 2X SSC 03 NP40 7375C 12 min DAPI Passos críticos da técnica 22 Preparo da amostra Qualidade da amostra de origem celulas Aplicação da sonda Denaturação adequada Hibridização Hibridizador ou estufa Lavagens pH 71 TemperaturaSSC 72C DAPI e análise hipotônica e fixação Espalhamento das células Digestão enzimática Passos críticos da técnica 23 Preparo da amostra Qualidade da amostra de origem celulas Aplicação da sonda Denaturação adequada Hibridização Hibridizador ou estufa Lavagens pH 71 TemperaturaSSC 72C DAPI e análise Desidratação Temperatura 24 Manchas de sangue na lâmina Recommendações Tratamento das lâminas com cloreto de Potássio por 10 minutos e depois nova fixação com Carnoy fresco Análise fixação foi boa 25 Recommendações Thermotron oferece ótimas condições para espalhamento da amostra 24C 48 50 de humidade relativa Alternativa coloque a lâmina sobre um suporte de água quente ou um banho maria 37 C e depois pingue a amostra Análise espalhamento foi bom 26 Lâminas Superfrost carregadas positivamente são projetadas para maior adesão de tecidos FFPE Para outras amostras utilizar lâminas de rotinaSuperfrost Análise a escolha da lâmina foi boa Escolha errada da lâmina pode trazer background muito forte 27 Amostra ruim Cromossomos sobrepostos Citoplasma visível Aparência em 3D Amostra boa Espalhamento bom Livre de citoplasma Verificar densidade de células na amostra e índice mitótico antes de seguir para a FISH Sonda é o componente mais caro da técnica Não é recomendado sua aplicação em lâminas de má qualidade Análise tem citoplasma 28 Solução Usar menor volume de amostra na lâmina lavar lâminas em solução fixadora Aumentar o tempo de digestão com pepsina e lavagem com SSC em casos de amostras FFPE Análise tem citoplasma 29 Solução Usar amostras novas refazer a cultura se possível Verificar as condições de assepsia da cultura periodicamente Não reaproveitar reagentes Análise houve contaminação por bactéria 30 Consequência sinais fracos ou ausentes Sem aquecimento e sem envelhecimento Com aquecimento e alta desidratação Solução Evitar altas e prolongadas temperaturas 45C e envelhecimentodesidratação em etanol 100 Gasto de tempo sem benefícios analíticos Etapas utilizadas em protocolos antigos de FISH Análise fiz superaquecimento das lâminas eou envelhecimento 31 Solução Cobrir as sondas com papel alumínio e mantêlas à 20C freezer quando fora de uso Aliquotar as sondas evitando exposição e diversos ciclos de descongelamento 4 horas de exposição das sondas sob luz natural 1 hora de exposição Análise deixei a sonda exposta à luz 32 1 Controle 2 1uL de sonda 3 Sonda diluída Recomendações Diminuir a quantidade de sonda ou diluir vai produzir sinais mais fracos O uso de lamínulas muito grandes também causa efeito de diminuir a quantidade de sonda Usar o volume de sonda geralmente 10 uL e lamínulas recomendadas pelo fabricante Análise diluí a sonda para render mais 33 1 Controle 2 Parafilm 3 Plástico filme 4 Lâminas não vedadas Recommendações Usar lamínulas apropriadas Selar adequadamente para evitar evaporação Análise a vedação da lamínula foi eficiente 34 ALTA temperatura ou tempo em excesso Ex 94C por 10mins Causa muitos sinais inespecíficos no decorrer de todo cromossomo Solução Obedecer 75C por 2mins Verifique a temperatura do hotplatehibridizador Análise denaturação em excesso 35 BAIXA temperatura ou tempo insuficiente Causa ausência de sinais inclsive dos controles positivos Solução Obedecer 75C por 2mins Verifique a temperatura do hotplatehibridizador Análise denaturação ineficiente 36 Controle Estringência alta Solução Refazer o SSC conferindo o pH7 tempos e temperaturas 721C Análise alta ou baixa estringência 37 Baixa estringência vai produzir alto background e sinais inespecíficos Solução Refazer o SSC conferindo o pH7 e temperaturas 721C Controle 04xSSC à 65C P5317c IGH breakapart PMLRARA P5317c PMLRARA IGH breakapart Análise baixa estringência 38 Dicas Depois de aplicar o DAPI deixar as lâminas em repouso por 10 minutos antes da visualização para garantir a coloração de todo o cromossomo Manter as lâminas a 20C freezer por uma hora pode melhorar o contraste dos sinais Altas concentrações de DAPI permite melhor captura de sinais para sistemas automatizados cuidado Análise DAPI 39 Background forte e azul brilhante pode minimizar os sinais da sonda Análise DAPI muito concentrado 40 Aparencia de nuvem sobre o material de análise Solução Lavar as lâminas com 2xSSC005 Tween e reaplicar DAPI limpar com papel filtro não muito eficiente mas dica útil quando não se tem muito material para repetição Análise mistura de óleo de imersão com DAPI 41 Dicas Fazer manutenção mensal do equipamento Se o background é grande o sinal fica menor Evitar ligar e desligar a lâmpada pois diminui sua vida útil Uso de filtros separados para Texas Red FITC e aqua são melhores para confirmação de sinais do que filtros múltiplos Usar o filtro correto para o fluorocromo Análise microscópio com manutenção em dia 42 LPS014 SYT breakapart Sarcoma LPS016 MDM2 amplification Sarcoma Alto background endêmico na lâmina Ok Se for em toda a lâmina é porque o corte está muito espesso Usar navalhas novas e colocar bloco no gelo por alguns minutos pode ajudar Análise espessura do corte está correta 43 Solução Mais lavagens por mais tempo na etapa de retirar a parafina Característica Parafina tem afinidade com FITC A lâmina ficará com a cor verde mais evidente Análise quando há excesso de parafina 44 Características Núcleos com aparência de fantasma Ausência de DAPI em algumas áreas Morfologia dos tecidos destruída Perda de sinais de hibridização em algumas células Solução diminuir o tempo de digestão Análise digestão prolongada 45 Características Núcleos com aparência de nuvem coloração por DAPI inconsistente na lâmina Redução de sinal de sonda Solução Aumentar tempo de digestão Verificar a eficiência de digestão em contraste de fase no micrsocópio de luz antes de seguir para a FISH Análise digestão insuficiente 46 Tissue type Pretreatment time mins Enzyme digestion mins Breast 30 20 Lung 25 15 Ovary 20 10 Kidney 20 20 Colon 30 20 Schwann cells nerve tissue 30 15 Brain 30 18 Análise digestão insuficiente Protocolo de FISH Convite Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Rotina de análise Vantagem de se avaliar muitas células em um só campo Livre da necessidade de se avaliar apenas metáfases Pular a etapa de cultivo celular Interpretação de resultado Interpretação de resultado ATM em verde e TP53 em vermelho Interpretação de resultado ATM em verde e TP53 em vermelho Validação da sonda Avaliação do tamanho do sinal Se a distância entre dois sinais for menor que o próprio sinal considerase apenas um sinal Avaliação de células falso positivas Realização do teste em amostras conhecidamente negativas para se avaliar a de células com resultado falso positivo Essa será o corte para liberação do resultado Validação de uma sonda em laboratório Liberação de resultado FISH Interpretação de resultado Sinais verde e vermelho fundidos podem ser visualizados na cor amarela ou muito próximo um do outro Interpretação de resultado Interpretação de resultado Interpretação de resultado Interpretação de resultado Alteração não visualizada facilmente com cito convencional FISH foi fundamental para o diagnóstico de leucemia Interpretação de resultado Alteração não visualizada facilmente com cito convencional FISH foi fundamental para o diagnóstico de leucemia Interpretação de resultado SRY gene da determinação do sexo Masculino XY 1R 1G 1B Deleção do gene SRY 1G 1B XY fenótipo feminino Feminino XX 1R 2B fenótipo masculino Ex de sonda utilizada para estudo da Leucemia Linfóide Aguda LLA Translocação envolvendo TCF3 é um dos mais comuns rearranjos na LLA em crianças t119q23p13 ou t1719q22p13 fusões gênicas TCF3PBX1 ou TCF3HLF inv19p13q13 fusão gênica TCF3 com TFPT Interpretação de resultado Interpretação de resultado Célula normal 2 vermelhos 2 verdes 2 azuis 2R 2G 2B t 1 19 q23 p133 deve mostrar um vermelho um verde dois azuis e dois sinais de fusão amarelos podem aparecer como sinais vermelho e verde juntos 1R 1G 2B 2Y der 19 t 1 19 q23 p133 devem mostrar dois sinais vermelhos um verde dois azuis e um amarelo 2R 1G 2B 1Y 2G2R2Aq NORMAL 1G2R1Aq2GAqF TCF3HLF Balanced E2A TCF3 CROMOSSOMO 19 PBX1 CROMOSSOMO 1 HLF CROMOSSOMO 17 1G1R2Aq2RGF TCF3PBX1 Balanced Acute Lymphoblastic Leukaemia LPH 080 E2APBX1 Plus Translocation Dual Fusion Probe Interpretação de resultado Case Study Cytocell E2APBX1 Plus TCDF Probe PBX1 Red TCF3 19p13 PBX1 1q233 HLF 17q22 TCF3 E2A Green HLF Aqua TCF3HLF Fusion GreenAqua Interpretação de resultado Painel FISH AS SONDAS MÚLTIPLAS ESTRATÉGIAS DE PESQUISAS MULTI PROBE Estas sondas são hibridizadas de maneira espacialmente separadas em uma mesma lâmina permitindo uma rápida pesquisa das alterações cromossômicas em um único experimento de hibridização Painel FISH Nova aplicação da técnica de FISH Deteçção do vírus 2019nCoV em tecidos pulmonares ou fluidos bronquionasais 46XYish del22q112q112D22S75 Nomenclatura FISH Técnica FISH Região da sonda Locus cromossômico presença ou ausência x n de sinais n de cromossomos Cromossomos sexuais 46XXish 22q112 D22S75x2 Nomenclatura FISH Técnica FISH Região da sonda Locus cromossômico n de sinais n de cromossomos Cromossomos sexuais ish del22q112 q112D22S75 Nomenclatura FISH Análise por citogenética convencional não foi realizada Apenas FISH Região da sonda Locus cromossômico deleção Nomenclatura FISH ish del22q112 q112D22S75 del22q112 q112D22S75 Deleção dessa região nos dois pares cromossômicos ish 22q112HIRAx2 del22q133ARSA Coquetel de sondas 2 cópias do gene HIRA e deleção de uma cópia do gene ARSA Nomenclatura FISH 46XXdel15q112q13ish del15q112q112SNRPND15S10 Resultado obtido por meio de FISH sonda abrange duas regiões cromossômicas Resultado obtido por meio da citogenética convencional Dúvidas