PCR Tipos Metodos e Aplicacoes na Microbiologia Molecular e Biotecnologia para Biomedicina

Materia Microbiologia Molecular e Biotecnologia Curso Biomedicina Metodos Tipos de PCR qPCR nestedPCR PCRRFLP PCR digital NSG Nanopore e Ilumina Princípios do métodos Vantagens e desvantagens Aplicaçoes INTRODUÇÃO A técnica de PCR Reação em Cadeia da Polimerase é um método amplamente utilizado na biologia molecular para amplificar uma sequência específica de DNA É importante conhecer os diferentes tipos de PCR e suas aplicações para garantir a eficiência e confiabilidade dos resultados em pesquisas e diagnósticos As principais técnicas de PCR são qPCR nestedPCR PCRRFLP PCR digital e NSG Nanopore e Ilumina qPCR Os princípios do teste qPCR Polymerase Chain Reaction em Tempo Real são baseados na amplificação de ácidos nucleicos por meio da técnica de PCR que permite a detecção e quantificação de DNA ou RNA específico em uma amostra biológica Um deles é que o teste qPCR utiliza um fluoróforo que se liga ao produto da amplificação permitindo a detecção e quantificação em tempo real Ademais a técnica é baseada no uso de primers específicos que se ligam ao DNA ou RNA alvo permitindo a amplificação seletiva do material genético desejado O teste qPCR utiliza um ciclo de aquecimento e resfriamento para a amplificação do DNA ou RNA permitindo a detecção de quantidades muito pequenas de material genético em uma amostra As vantagens do teste qPCR são a alta sensibilidade e especificidade na detecção de ácidos nucleicos específicos possibilidade de quantificação do material genético presente na amostra Detecção em tempo real permitindo a análise dos resultados imediatamente após a amplificação e alta velocidade de amplificação Já as desvantagens incluem a possibilidade de contaminação da amostra durante o processo de amplificação o que pode levar a resultados falsos positivos ou negativos A possibilidade de interferência de inibidores presentes na amostra que podem afetar a eficiência da amplificação Ademais têmse a necessidade de equipamentos específicos e reagentes caros para a realização da técnica e a possibilidade de variação nos resultados devido a diferenças na eficiência da amplificação em diferentes amostras Com relação às aplicações do teste qPCR ele pode ser usado para detecção de patógenos em amostras clínicas como vírus bactérias e fungos monitoramento da expressão gênica em diferentes tecidos e condições experimentais análise de mutações genéticas em amostras tumorais identificação de espécies em alimentos e produtos agrícolas diagnóstico prénatal de doenças genéticas e detecção de organismos geneticamente modificados em alimentos NestedPCR Os princípios do NestedPCR são baseados na técnica da Reação em Cadeia da Polimerase PCR que é uma técnica utilizada para amplificar uma região específica do DNA in vitro ou seja em um tubo de ensaio ao invés de um organismo A NestedPCR é uma variação da PCR convencional que utiliza dois pares de primers em duas reações de PCR sequenciais para aumentar a especificidade e sensibilidade da amplificação As vantagens da NestedPCR é que o mesmo possui uma maior especificidade e uma maior sensibilidade Já as desvantagens são que a NestedPCR envolve a manipulação de produtos amplificados há um maior risco de contaminação cruzada entre as amostras Ademais a necessidade da execução de de duas reações de PCR sequenciais aumenta a complexidade do procedimento e o tempo necessário para a obtenção dos resultados No que concerne às aplicações desse teste ele é frequentemente utilizado na detecção de agentes infecciosos como vírus e bactérias em amostras clínicas realiza a identificação de mutações específicas em genes associados a doenças genéticas e pode ser utilizada para analisar a diversidade genética em populações de organismos como a diversidade de espécies de microrganismos em amostras ambientais PCRRFLP A PCRRFLP Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism é uma técnica que combina a PCR e a análise RFLP A PCR é usada para amplificar uma região específica do DNA enquanto a análise RFLP envolve a digestão do DNA amplificado com enzimas de restrição específicas e a separação dos fragmentos resultantes por eletroforese em gel As vantagens são que a PCRRFLP é uma técnica sensível e específica que pode detectar variações genéticas em nível de sequência de nucleotídeos Além de ter várias aplicações incluindo diagnóstico de doenças genéticas mapeamento de genomas identificação de criminosos em análises forenses e testes de paternidade Já as desvantagens são que a PCRRFLP requer conhecimento prévio dos dados de sequência para projetar os primers de PCR e selecionar as enzimas de restrição apropriadas além de que a técnica exige a obtenção de quantidade suficiente de DNA da amostra para análise o que pode ser difícil em algumas situações como estudos forenses O teste pode ser aplicado para diagnóstico de doenças genéticas mapeamento de genomas análises forenses testes de paternidade e estudos filogenéticos PCR digital A PCR digital segue os mesmos princípios básicos da PCR tradicional passando por etapas de desnaturação anelamento e extensão Na PCR digital as amostras são divididas em muitas partições individuais e cada partição é analisada separadamente permitindo a detecção e quantificação de sequências raras de DNA As vantagens são a detecção de sequências raras monitoramento de mutações e duplicações e detecção de cargas virais Já as desvantagens são o custo mais alto pois possui a necessidade de equipamentos e reagentes específicos além de ser mais complexo e demorado O PCR digital pode ser utilizado no diagnóstico e monitoramento de câncer detecção e monitoramento de cargas virais e na pesquisa em biologia molecular NSG Nanopore e Ilumina Os testes NSG Nanopore e Illumina são tecnologias de sequenciamento de DNA Os princípios do nanopore são que o sequenciamento é realizado passando uma única molécula de DNA através de um poro nanométrico A sequência de bases é determinada medindo as alterações na corrente elétrica conforme as bases passam pelo poro Já o Illumina é baseado em síntese de DNA em ponte e detecção de fluorescência As moléculas de DNA são amplificadas e ligadas a uma superfície sólida A sequência é determinada pela adição de bases fluorescentemente marcadas e detecção das cores emitidas As vantagens do sequenciamento Nanopore são que ele pode gerar leituras mais longas o que facilita a montagem do genoma e a detecção de variações estruturais e possibilita o sequenciamento em tempo real permitindo análises rápidas Já a desvantagem do sequenciamento Nanopore é a precisão do sequenciamento é menor em comparação com a tecnologia Illumina No que concerne às vantagens do Illumina é a alta precisão e capacidade de sequenciamento permitindo a análise de grandes conjuntos de dados E a desvantagem é que gera leituras mais curtas o que pode dificultar a montagem do genoma e a detecção de variações estruturais e requer um tempo maior para a análise dos dados Ambos os tipos podem ser aplicados para pesquisa genômica diagnóstico clínico e análise forense CONCLUSÃO Para garantir a qualidade e confiabilidade dos resultados dos diferentes tipos de PCR é necessário saber de qual forma ele age quais reagentes utilizar e quando usar REFERÊNCIA VIEIRA BSc Daniel Perez Técnicas de PCR Aplicações e Padronização de Reações Acesso em v 18 2011 INTRODUÇÃO A técnica de PCR Reação em Cadeia da Polimerase é um método amplamente utilizado na biologia molecular para amplificar uma sequência específica de DNA É importante conhecer os diferentes tipos de PCR e suas aplicações para garantir a eficiência e confiabilidade dos resultados em pesquisas e diagnósticos As principais técnicas de PCR são qPCR nestedPCR PCRRFLP PCR digital e NSG Nanopore e Ilumina qPCR Os princípios do teste qPCR Polymerase Chain Reaction em Tempo Real são baseados na amplificação de ácidos nucleicos por meio da técnica de PCR que permite a detecção e quantificação de DNA ou RNA específico em uma amostra biológica Um deles é que o teste qPCR utiliza um fluoróforo que se liga ao produto da amplificação permitindo a detecção e quantificação em tempo real Ademais a técnica é baseada no uso de primers específicos que se ligam ao DNA ou RNA alvo permitindo a amplificação seletiva do material genético desejado O teste qPCR utiliza um ciclo de aquecimento e resfriamento para a amplificação do DNA ou RNA permitindo a detecção de quantidades muito pequenas de material genético em uma amostra As vantagens do teste qPCR são a alta sensibilidade e especificidade na detecção de ácidos nucleicos específicos possibilidade de quantificação do material genético presente na amostra Detecção em tempo real permitindo a análise dos resultados imediatamente após a amplificação e alta velocidade de amplificação Já as desvantagens incluem a possibilidade de contaminação da amostra durante o processo de amplificação o que pode levar a resultados falsos positivos ou negativos A possibilidade de interferência de inibidores presentes na amostra que podem afetar a eficiência da amplificação Ademais têmse a necessidade de equipamentos específicos e reagentes caros para a realização da técnica e a possibilidade de variação nos resultados devido a diferenças na eficiência da amplificação em diferentes amostras Com relação às aplicações do teste qPCR ele pode ser usado para detecção de patógenos em amostras clínicas como vírus bactérias e fungos monitoramento da expressão gênica em diferentes tecidos e condições experimentais análise de mutações genéticas em amostras tumorais identificação de espécies em alimentos e produtos agrícolas diagnóstico prénatal de doenças genéticas e detecção de organismos geneticamente modificados em alimentos NestedPCR Os princípios do NestedPCR são baseados na técnica da Reação em Cadeia da Polimerase PCR que é uma técnica utilizada para amplificar uma região específica do DNA in vitro ou seja em um tubo de ensaio ao invés de um organismo A NestedPCR é uma variação da PCR convencional que utiliza dois pares de primers em duas reações de PCR sequenciais para aumentar a especificidade e sensibilidade da amplificação As vantagens da NestedPCR é que o mesmo possui uma maior especificidade e uma maior sensibilidade Já as desvantagens são que a Nested PCR envolve a manipulação de produtos amplificados há um maior risco de contaminação cruzada entre as amostras Ademais a necessidade da execução de de duas reações de PCR sequenciais aumenta a complexidade do procedimento e o tempo necessário para a obtenção dos resultados No que concerne às aplicações desse teste ele é frequentemente utilizado na detecção de agentes infecciosos como vírus e bactérias em amostras clínicas realiza a identificação de mutações específicas em genes associados a doenças genéticas e pode ser utilizada para analisar a diversidade genética em populações de organismos como a diversidade de espécies de microrganismos em amostras ambientais PCRRFLP A PCRRFLP Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism é uma técnica que combina a PCR e a análise RFLP A PCR é usada para amplificar uma região específica do DNA enquanto a análise RFLP envolve a digestão do DNA amplificado com enzimas de restrição específicas e a separação dos fragmentos resultantes por eletroforese em gel As vantagens são que a PCRRFLP é uma técnica sensível e específica que pode detectar variações genéticas em nível de sequência de nucleotídeos Além de ter várias aplicações incluindo diagnóstico de doenças genéticas mapeamento de genomas identificação de criminosos em análises forenses e testes de paternidade Já as desvantagens são que a PCRRFLP requer conhecimento prévio dos dados de sequência para projetar os primers de PCR e selecionar as enzimas de restrição apropriadas além de que a técnica exige a obtenção de quantidade suficiente de DNA da amostra para análise o que pode ser difícil em algumas situações como estudos forenses O teste pode ser aplicado para diagnóstico de doenças genéticas mapeamento de genomas análises forenses testes de paternidade e estudos filogenéticos PCR digital A PCR digital segue os mesmos princípios básicos da PCR tradicional passando por etapas de desnaturação anelamento e extensão Na PCR digital as amostras são divididas em muitas partições individuais e cada partição é analisada separadamente permitindo a detecção e quantificação de sequências raras de DNA As vantagens são a detecção de sequências raras monitoramento de mutações e duplicações e detecção de cargas virais Já as desvantagens são o custo mais alto pois possui a necessidade de equipamentos e reagentes específicos além de ser mais complexo e demorado O PCR digital pode ser utilizado no diagnóstico e monitoramento de câncer detecção e monitoramento de cargas virais e na pesquisa em biologia molecular NSG Nanopore e Ilumina Os testes NSG Nanopore e Illumina são tecnologias de sequenciamento de DNA Os princípios do nanopore são que o sequenciamento é realizado passando uma única molécula de DNA através de um poro nanométrico A sequência de bases é determinada medindo as alterações na corrente elétrica conforme as bases passam pelo poro Já o Illumina é baseado em síntese de DNA em ponte e detecção de fluorescência As moléculas de DNA são amplificadas e ligadas a uma superfície sólida A sequência é determinada pela adição de bases fluorescentemente marcadas e detecção das cores emitidas As vantagens do sequenciamento Nanopore são que ele pode gerar leituras mais longas o que facilita a montagem do genoma e a detecção de variações estruturais e possibilita o sequenciamento em tempo real permitindo análises rápidas Já a desvantagem do sequenciamento Nanopore é a precisão do sequenciamento é menor em comparação com a tecnologia Illumina No que concerne às vantagens do Illumina é a alta precisão e capacidade de sequenciamento permitindo a análise de grandes conjuntos de dados E a desvantagem é que gera leituras mais curtas o que pode dificultar a montagem do genoma e a detecção de variações estruturais e requer um tempo maior para a análise dos dados Ambos os tipos podem ser aplicados para pesquisa genômica diagnóstico clínico e análise forense CONCLUSÃO Para garantir a qualidade e confiabilidade dos resultados dos diferentes tipos de PCR é necessário saber de qual forma ele age quais reagentes utilizar e quando usar REFERÊNCIA VIEIRA BSc Daniel Perez Técnicas de PCR Aplicações e Padronização de Reações Acesso em v 18 2011