Caracterização da Autoincompatibilidade Gametofítica de Acessos de Banco Ativo de Germoplasma de Coffea canephora

X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES CARACTERIZAÇÃO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE GAMETOFÍTICA DE ACESSOS DE BANCO ATIVO DE GERMOPLASMA DE Coffea canephora1 Carolina Augusto de Souza2 José Roberto Vieira Júnior3 Maurício Reginaldo Alves dos Santos4 Alexsandro Lara Teixeira5 André Rostand Ramalho6 Marcelo Curitiba Espindula7 Maria Amélia Gava Ferrão8 Rodrigo Barros Rocha9 1 Trabalho financiado pelo Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café Consórcio Pesquisa Café 2Bolsista CAPES Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal Porto VelhoRO carolinaaugustohotmailcom 3 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO joserobertovieiraembrapabr 4 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO mauriciosantosembrapabr 5 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO alexsandroteixeiraembrapabr 6 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO andreramalhoembrapabr 7 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO marceloespindulaembrapabr 8 Pesquisador DSc Embrapa Café Vitória ES mariaferraoembrapabr 9 Pesquisador DSc Embrapa Rondônia Porto Velho RO rodrigorochaembrapabr Autor correspondente RESUMO O Coffea canephora é uma espécie alógama que apresenta autoincompatibilidade gametofítica AIG de expressão governada por um único gene multialélico identificado pela letra S Na cafeicultura clonal o plantio de clones não compatíveis pode reduzir a produtividade e a qualidade dos grãos devido a menor eficiência da polinização e aumento na taxa de grãos do tipo moca O objetivo desse trabalho é caracterizar a autoincompatibilidade de acessos do Banco de Germoplasma da Embrapa quantificando a diversidade alélica e genotípica de uma população de melhoramento fornecendo subsídios para manipulação dessa característica no desenvolvimento de novas variedades Para isso foram realizadas hibridações in vitro entre 28 genótipos de um campo de hibridação contendo 80 matrizes das variedades botânicas Conilon e Robusta Os procedimentos de hibridação in vitro se iniciaram um dia antes da antese com a proteção dos ramos doadores utilizando sacos de papel do tipo kraft de 55x25cm e transferência dos estigmas das plantas receptora para meio de cultura sacarose 10 Os genótipos doadores de grãos de pólen BRS 1216 BRS 2299 e BRS 3193 foram utilizados como plantas testadoras dos grupos de compatibilidade I II e III respectivamente A polinização in vitro foi realizada no dia da antese com a raspagem dos grãos de pólen que é colocado em contato com apenas um dos dois estigmas de cada pistilo bífido A compatibilidade das hibridações foi avaliada utilizando coloração com azul de anilina a 1 para visualização do desenvolvimento dos tubos polínicos utilizando microscopia de fluorescência A eficiência de polinização foi estimada pela relação entre o número de estigmas fertilizados e o número total de estigmas polinizados A utilização de plantas testadoras dos grupos de compatibilidade permitiu reduzir o número de hibridações necessárias para caracterizar os genótipos das plantas A polinização in vitro resultou em uma taxa média de pegamento de 603 com amplitude de 11 a 85 de pegamento nas hibridações compatíveis Entre os 28 clones caracterizados 17 genótipos 61 foram incompatíveis com a planta testadora do grupo I 5 clones 18 apresentaram incompatibilidade com a planta testadora do grupo II e 6 clones 21 foram incompatíveis com o testador do grupo III Os resultados parciais da caracterização dessa população de melhoramento indicam a distribuição dos genótipos em três grupos de compatibilidade com as frequências dos alelos S1 S2 e S3 estimadas em 039 041 e 020 respectivamente Apesar da diferença observada entre as frequências alélicas as frequências genotípicas não diferem das proporções esperadas para uma população em Equilíbrio de Hardy Weinberg EHW com 1 de probabilidade A caracterização do genótipo do gene S é importante impactando na eficiência de polinização desse cultivo com o favorecimento natural de cruzamentos compatíveis PALAVRASCHAVE Café canéfora Conilon Robusta compatibilidade CHARACTERIZATION OF THE GAMETHITISTIOUS AUTOINCOMPATIBILITY OF ACCESSES OF GERMOPLASMA ACTIVE BANK OF Coffea canephora ABSTRACT Coffea canephora is an allogeneic species that exhibits gametophytic autoincompatibility AIG an expression governed by a single multilevel gene identified by the letter S In clonal coffee cultivation planting of non compatible clones can reduce grain yield and quality due to lower efficiency of pollination and increase in the mocha type grain rate The objective of this work is to characterize the access autoincompatibility of Embrapa Germplasm Bank quantifying the allelic and genotype diversity of a breeding population providing subsidies to manipulate this trait in the development of new varieties For this purpose in vitro hybridizations were performed between 28 genotypes of a hybridization field containing 80 matrices of the Conilon and Robusta botanical varieties In vitro hybridization procedures were initiated one day prior to anthesis with protection of the donor branches using 55x25cm kraft paper bags and transfer of the stigmas from the recipient plants to the culture medium 10 sucrose The genotypes of pollen grains BRS 1216 BRS 2299 and BRS 3193 were used as test plants of compatibility groups I II and III respectively In vitro pollination was carried out the day before the scraping of the pollen grains which is placed in contact with only one side of the bifid stigma Compatibility of the hybridizations was evaluated using 1 aniline blue staining to visualize the development of the pollen tubes using fluorescence microscopy The pollination efficiency was estimated X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES by the relation between the number of fertilized stigmas and the total number of pollinated stigmas The use of compatibility group testing plants allowed reducing the number of hybridizations required to characterize plant genotypes In vitro pollination resulted in an average adhesion rate of 603 with an amplitude of 11 to 85 of glue in compatible hybridizations Among the 28 clones characterized by 17 genotypes 61 were incompatible with the test plant of group I 5 clones 18 presented incompatibility with the test plant of group II and 6 clones 21 were incompatible with the tester of the group III The partial results of the characterization of this breeding population indicate the distribution of the genotypes in three groups of compatibility with the frequencies of the S1 S2 and S3 alleles estimated at 039 041 and 020 respectively Despite the observed difference between allelic frequencies the genotypic frequencies do not differ from the expected proportions for a Hardy Weinberg Equilibrium EHW population with a 1 probability The characterization of the S gene genotype is important impacting the pollination efficiency of this crop with the natural favoring of compatible crosses KEYWORDS Coffea canephora Conilon Robusta compatibility INTRODUÇÃO A capacidade de se evitar a autofecundação é uma importante característica do sistema reprodutivo de várias espécies vegetais alógamas incluindo a espécie Coffea canephora e que evoluiu como uma forma de evitar os efeitos deletérios da endogamia Castric e Vekemans 2004 A autoincompatibilidade AI é um mecanismo fisiológico que impede uma planta fértil de formar sementes viáveis quando fertilizada por seu próprio pólen SchifinoWittmann e Dallagnol 2002 O impedimento à autofecundação devese a paralisação do desenvolvimento dos tubos polínicos que impossibilita a fertilização do gametófito feminino Berthaud 1980 O C canephora apresenta autoincompatibilidade gametofítica e a reação de incompatibilidade ocorre entre o tubo polínico e o grão de pólen que não deve compartilhar o mesmo alelo da planta receptora Lashermes et al 1996 Nowak et al 2011 Nesta espécie a autoincompatibilidade tem sua expressão governada por apenas um gene multialélico identificado pela letra S Berthaud 1980 Na cafeicultura clonal o plantio de clones não compatíveis pode comprometer a produtividade e a qualidade dos grãos devido a menor eficiência da polinização e aumento na taxa de grãos do tipo moca Ferrão et al 2007 Embora avaliações no centro de origem indiquem a existência de até cinco formas alélicas do gene S Omolaja e Fawole 2004 observações de campo indicam a ocorrência de apenas três formas alélicas na expressão desta característica em germoplasma brasileiro S1 S2 e S3 Moraes et al 2018 Conagin e Mendes 1961 Ferrão et al 2007a Apesar da incompatibilidade do C canephora ter sido relatada ainda na década de 60 poucos trabalham se dedicaram a caracterizar a compatibilidade entre os quais destacamse Devreux et al 1959 observaram que após a autopolinização o tubo polínico para seu desenvolvimento Conagin Mendes 1961 e Berthaud 1980 levantaram evidências de que a autoincompatibilidade deve ser governada pela ação de um único gene com três formas alélicas No centro de origem e de diversificação desta espécie Omolaja e Fawole 2004 quantificaram a interação de cinco formas alélicas na expressão desta característica Lashermes et al 1996 identificaram um marcador molecular associado a essa característica pelo desenvolvimento de populações duplohaploídes homozigotas para o gene S De Franceschi et al 2012 descreveram que a incompatibilidade se deve a interação de glicoproteínas específicas no estigma da flor e nos grãos de pólen que se combinam para formação de dímeros Nowak et al 2011 caracterizaram o polimorfismo deste gene entre várias espécies do gênero Coffea Mais recentemente Ferrão et al 2017 apresentaram uma revisão sobre a importância da compatibilidade para programas de melhoramento Moraes et al 2018 caracterizaram a genealogia do gene S em progênies de C canephora agrupando os genótipos em três grupos de compatibilidade diferentes Lopes 2015 identificou plantas de cada um dos grupos que podem ser utilizadas como plantas testadoras O objetivo desse trabalho é caracterizar a autoincompatibilidade de acessos do Banco de Germoplasma da Embrapa quantificando a diversidade alélica e genotípica de uma população de melhoramento fornecendo subsídios para manipulação dessa característica no desenvolvimento de novas variedades MATERIAL E MÉTODOS Um campo de hibridação contendo 40 matrizes da variedade botânica Conilon e 40 matrizes da variedade botânica Robusta foi instalado no ano de 2017 no campo experimental da Embrapa no município de Porto Velho RO As matrizes foram selecionadas de acordo com a maior divergência genética estimada a partir da avaliação de descritores agronômicos e morfológicos ao longo de três anos Oliveira et al 2018 As matrizes da variedade botânica Conilon se caracterizam pelo seu menor porte maior resistência ao déficit hídrico e maior suscetibilidade a pragas e doenças E as matrizes da variedade botânica Robusta se diferenciam pelo maior porte menor resistência ao déficit hídrico e maior resistência a pragas e doenças Rocha et al 2013 A polinização de pistilos in vitro consiste na deposição de grãos de pólen assépticos no estigma dos pistilos das flores receptoras mantidos em cultura de tecido Lashermes et al 1996 Essa estratégia permite eliminar a contaminação causada pela presença de grãos de pólen de plantas não doadoras X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES Os procedimentos de hibridação in vitro foram realizados nos dias nos dias 25042019 17052019 05062019 e 04072019 acompanhando o florescimento das flores doadoras em campo Um dia antes da abertura floral os ramos doadores foram protegidos em campo utilizando sacos de papel do tipo kraft de 55x25cm e os pistilos foram retirados das flores de acordo com os procedimentos descritos Lashermes et al 1996 e Berthaud 1980 e transferidos para meio de cultura com agar sacarose e antibiótico para serem polinizados Os genótipos BRS 1216 BRS 2299 e BRS 3193 foram utilizados como plantas testadoras dos grupos de compatibilidade I II e III respectivamente No dia da antese ramos previamente protegidos dos genótipos testadores foram levados para laboratório para coleta e transferência dos grãos de pólen Os grãos de pólen das testadoras foram transportados para o estigma das plantas receptoras de modo a polinizar apenas um dos dois estigmas de cada pistilo O diagnóstico da compatibilidade dos cruzamentos fundamentase na avaliação do desenvolvimento dos tubos polínicos diretamente no pistilo das plantas trinta horas após a hibridação artificial As amostras foram preservadas em solução de FAA formaldeído a 10 ácido acético glacial 10 e etanol 80 após esse período No preparo das amostras os pistilos foram retirados do FAA lavados com agua destilada foram imersos em NaOH 1N durante 2 horas lavados com agua destilada e corados durante 12 horas com azul de anilina de 1 preparada em K2PO4 01 M Os pistilos foram colocados em lâminas com o auxílio de água destilada visualizados e analisados em microscópio do modelo Leica DM2500 equipado com sistema de fotodocumentação A visualização dos pistilos foi realizada em microscópio de fluorescência em aumento de 10 e 20 vezes contabilizando o número de pistilos que apresentaram tubos polínicos completamente desenvolvidos Figura 1 Na avaliação da compatibilidade foram avaliadas duas lâminas por cruzamento com dez pistilos em cada lâmina tendo sido considerados compatíveis os cruzamentos que apresentaram tubos polínicos completamente desenvolvidos no estilo do estigma polinizado A eficiência de polinização foi estimada pela relação entre o número de estigmas fertilizados e o número total de estigmas polinizados No cruzamento entre plantas de diferentes grupos de compatibilidade metade da descendência será do mesmo genótipo que planta doadora e a outra metade apresentará genótipo diferente de seus genitores Tabela 1 Uma vez que o mecanismo de AIG impede o desenvolvimento dos tubos polínicos de grãos de pólen com o mesmo genótipo da planta receptora não existe naturalmente genótipos homozigotos para essa característica Do cruzamento entre plantas dos grupos I e III esperase que metade da descendência seja do grupo I e a outra metade do grupo III Considerando a ocorrência de três alelos como sugerido por Moraes et al 2018 pode ocorrer os seguintes cruzamentos Tabela 1 Tabela 1 Descendência esperada do cruzamento entre os genitores compatíveis considerando três formas alélicas ao gene S em população de C canephora Na ocorrência de acasalamentos ao acaso as frequências alélicas e genotípicas se mantém de uma geração para outra Falconer1981 Para determinar as frequências genotípicas e alélicas na população de melhoramento devese considerar a incompatibilidade no momento da polinização de forma que as frequências p q e r associadas às formas alélicas S1 S2 e S3 são dadas por P S1S1 p2 0 cruzamento incompatível P S1S2 2pq P S1S3 2pr P S2S2 q2 0 cruzamento incompatível P S2S3 2 qr P S3S3 r2 0 cruzamento incompatível De forma que as probabilidades de ocorrência dos genótipos podem foram estimadas 2 2 2 1 2 1 2 r q p pq P S S 2 2 2 1 3 1 2 r q p pr P S S 2 2 2 2 3 1 2 r q p qr P S S RESULTADOS E DISCUSSÃO A caracterização da autoincompatibilidade é um desafio para os programas de melhoramento de C canephora A avaliação de poucas dezenas de plantas resulta em um grande número de hibridações devido à relação exponencial entre X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES o número de genótipos e de grupos de compatibilidade Lopes 2015 A utilização de plantas testadoras dos grupos de compatibilidade permitiu reduzir o número de hibridações necessárias para caracterizar os genótipos das plantas A eficiência da polinização foi mensurada a partir da relação entre o número de estigmas polinizados e o número de estigmas fertilizados A polinização in vitro resultou em uma taxa média de pegamento de 603 com amplitude de 11 a 85 de pegamento nas hibridações compatíveis Comparativamente no estudo da genealogia do gene S em progênies de irmãos completos e meios irmãos de C canephora Moraes et al 2018 observaram uma taxa de pegamento de 44 com amplitude de 26 a 77 na avaliação de 80 hibridações realizadas em campo Tabela 2 Métodos de polinização in vitro são utilizados em diferentes espécies vegetais para manipular barreiras prézigóticas que podem impedir a fertilização das angiospermas Torres et al 1998 Maior eficiência da polinização in vitro também foi observada por Lopes 2015 A utilização da microscopia de fluorescência para visualização do desenvolvimento dos tubos polínicos permitiu reduzir o tempo necessário para a avaliação da compatibilidade não sendo necessário avaliar o desenvolvimento dos frutos em campo ao longo de aproximadamente 120 dias O C canephora produz grãos de pólen binucleados protegidos por duas camadas uma camada interna de celulose chamada de intina e uma camada externa rugosa que favorece a fixação dos grãos de pólen chamada de exina Conagin e Mendes 1961 Após a polinização os grãos de pólen que aderem ao estigma germinam formando um tubo polínico que cresce para dentro do estilete O tubo polínico é um alongamento da célula do grão de pólen que cresce em direção ao ovário quimiotropicamente levando os núcleos vegetativo e germinativo O azul de anilina apresenta alta afinidade pelas caloses um polissacarídeo presente em menor concentração nas paredes celulares e em maior concentração nos andrósporos e ginósporos após a divisão meiótica aumentando o contraste dos tubos polínicos permitindo sua identificação das hibridações compatíveis Os genótipos avaliados neste trabalho foram selecionados de uma população de melhoramento contendo 80 matrizes das variedades botânicas Conilon e Robusta Embora estudos mais recentes de mapeamento genético e de genômica funcional não tenham apresentado evidências de ligação entre características produtivas e o gene S Lashermes et al 1996 Nowak et al 2011 devese considerar que por obra do acaso e erros de amostragem a seleção pode reduzir a variabilidade deste gene Nessa população entre os 28 clones caracterizados 17 genótipos 61 foram incompatíveis com a planta testadora do grupo I 5 clones 18 apresentaram incompatibilidade com a planta testadora do grupo II e 6 clones 21 foram incompatíveis com o testador do grupo III Tabela 3 A distribuição dos genótipos nos diferentes grupos de compatibilidade foi interpretada para estimar as frequências dos alelos que determinam a expressão dessa característica monogênica Tabela 3 Apesar da diferença observada entre as frequências alélicas as frequências genotípicas não apresentaram diferenças das proporções esperadas para uma população em Equilíbrio de Hardy Weinberg EHW de acordo com o teste de qui quadrado com 1 de probabilidade Segundo Vekeman e Slatkin 1994 o gene S apresenta genealogia semelhante à de genes neutros que não têm sua frequência alterada pela seleção natural Ao considerar essa característica em uma população em EHW em que as frequências alélicas são idênticas pqrz a probabilidade de um cruzamento ser compatível é de 0 quando estão presentes apenas duas formas alélicas de 667 quando estão presentes três formas alélicas e de 833 quando estão presentes quatro formas alélicas diferentes Charlesworth e Guttman 1997 De forma que quanto maior a variabilidade para esse gene maior será a probabilidade de ocorrência de cruzamentos compatíveis Por se tratar de um mecanismo prézigótico que influencia na taxa de fecundidade dos grãos de pólen a autoincompatibilidade contribui para que nenhuma das formas alélicas do gene S possa se fixar na população a taxa de mudança do gene S seja maior do que de um loco neutro e que os indivíduos sejam heterozigotos para esse gene Em contraste com os resultados de Omolaja e Fawole 2004 que observaram a ocorrência de cinco diferentes formas alélicas avaliações em populações brasileiras tem indicado a existência de apenas três alelos Moraes et al 2018 Conagin e Mendes 1961 Ainda que poucos trabalhos tenham mensurado o efeito prejudicial da autoincompatibilidade em café canéfora Ferrão et al 2007b o plantio de genótipos não compatíveis pode aumentar a taxa de grãos tipo moca e diminuir a produtividade de grãos devido ao isolamento de plantas não compatíveis A possibilidade de identificar novos genótipos com novos alelos do gene S em germoplasma brasileiro abre a possibilidade para um aumento na eficiência de polinização com o favorecimento natural de cruzamentos totalmente compatíveis Tabela 2 Percentual de pegamento dos estigmas polinizados in vitro pelos grãos de pólen das plantas testadoras dos grupos de compatibilidade I II e III respectivamente X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES Tabela 3 Distribuição dos acessos caracterizados de acordo em grupos de compatibilidade determinados pela visualização in vitro do desenvolvimento do tubo polínico 2 Teste de chiquadrado No número observado de plantas em cada um dos grupos de compatibilidade f freqüência simples Ne Número esperado de plantas em cada um dos grupos de compatibilidade X Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil ISSN 19849249 8 a 10 de outubro de 2019 Vitória ES CONCLUSÕES A utilização de plantas testadoras dos grupos de compatibilidade permitiu reduzir o número de hibridações necessárias para caracterizar os genótipos das plantas Métodos de polinização in vitro permitiram aumentar a eficiência da polinização sem apresentar contaminação causada pela presença de grãos de pólen de plantas não doadoras A utilização da microscopia de fluorescência permitiu reduzir o tempo necessário para diagnosticar a compatibilidade entre as hibridações Os resultados parciais da caracterização de uma população de melhoramento indicaram a distribuição dos genótipos em três grupos de compatibilidade com diferentes frequências alélicas Apesar da diferença entre as frequências alélicas as frequências genotípicas observadas não diferem das proporções esperadas para uma população em EHW A caracterização da segregação do gene S nas populações é importante impactando na eficiência de polinização desse cultivo com o favorecimento natural de cruzamentos compatíveis REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BERTHAUD J Incompatibility in Coffea canephora Test Method and Genetic Determinism Cafe Cacao The v24 n4 p267274 1980 CASTRIC V VEKEMANS X Invited Review Plant selfincompatibility in natural populations a critical assessment of recent theoretical and empirical advances Molecular Ecology v13 n10 p28732889 2004 CONAGIN CHTM MENDES AJT Pesquisas citológicas e genéticas em três espécies de Coffea autoincompatibilidade em Coffea canephora Bragantia v20 p787804 1961 CHARLESWORTH D GUTTMAN D S Plant genetics Seeing selection in S allele sequences Current Biology v7 n1 pR34R37 1997 DEVREUX M VALLAYES G POCHER P EBERHART S A RUSSEL W A Stability parameters for comparing varieties Crop Science v6 p3640 1959 FALCONER DS Introdução à genética quantitativa Viçosa UFV p279 1981 FERRÃO M A G et al Origem dispersão geográfica taxonomia e diversidade genética de Coffea canephora In FERRÃO R G et al Café conilon Vitória ES Incaper p6691 2007a FERRÃO M A G RIVASOUZA E M FONSECA A F A da FERRÃO R G Autoincompatibilidade e produção sustentável do café Conilon In FERRÃO R G FONSECA A F A da FERRÃO M A G DE MUNER L H Ed Café Conilon 2 ed atual ampli Vitória ES Incaper p 177191 2017 FERRÃO R G et al Melhoramento genético do Coffea canephora In FERRÃO RG et al Ed Café Conilon Espírito Santo Incaper p121173 2007b FRANCESCHI P DONDINI L SANZOL J Molecular bases and evolutionary dynamics of selfincompatibility in the Pyrinae Rosaceae Journal of Experimental Botany 63 40154032 2012 LASHERMES P et al Inheritance and genetic mapping of selfincompatibility in Coffea canephora Pierre Theoretical and Applied Genetics v93 n3 p458462 1996 LOPES T A Caracterização da autoincompatibilidade gametofíticas de clones superiores de Coffea canephora Dissertação Mestrado Programa de PósGraduação em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente PGDRAUniversidade Federal de Rondônia UNIR 64 f Porto Velho2015 MORAES M S TEIXEIRA A L RAMALHO A R ESPINDULA M C FERRAO M A G ROCHA R B Characterization of gametophytic selfincompatibility of superior clones of Coffea canephora Genetics and Molecular Research v 17 p 111 2018 httpswwwgeneticsmrcomarticles18018 NOWAK M D et al Expression and TransSpecific Polymorphism of SelfIncompatibility RNases in Coffea Rubiaceae Plos One v6 n6 2011 OLIVEIRA L N L ROCHA R B FERREIRA F M SPINELLI V M RAMALHO A R TEIXEIRA A L Selection of Coffea canephora parents from the botanical varieties Conilon and Robusta for the production of intervarietal hybrids Ciência Rural 484 2018 OMOLAJA S S FAWOLE I Determination of the number of selfincompatibility alleles SIA in Coffea canephora and the role of pollenstylar protein in the expression of SIA 20th International Conference on Coffee Science Bangalore India Anais 1115 p684687 2004 ROCHA R B SANTOS D V RAMALHO A R TEIXEIRA A L Caracterização e uso da variabilidade genética de banco ativo de germoplasma de Coffea canephora Pierre ex Froehner Coffee Science v 8 p 478485 2013 SCHIFINOWITTMANN M T DALLAGNOL M Autoincompatibilidade em plantas Ciência Rural v32 p10831090 2002 TORRES AC et al Cultura de tecidos e transformação genética de plantas Brasília EmbrapaSPI Embrapa CNPH 1998 VEKEMAN X SLATKIN M Gene and allelic genealogies at a gametophytic selfincompatibility locus Genetics and Molecular Biology v137 p11571165 1994