Roteiro de Aula Prática: Fungos do Ar

Universidade Federal do Pará CURSO Biomedicina Profª Solange Costa Instituto de Ciências Biológicas Micologia 1 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA FUNGOS DO AR 1 INTRODUÇÃO Os fungos são seres cosmopolitas e ubíquos pois estão amplamente distribuídos na natureza sendo encontrados nos diversos ecossistemas aquáticos e terrestres Como decompositores desempenham um importante papel na reciclagem de carbono e minerais mas também podem causar doenças no homem e em outros seres vivos Esporos fragmentos do micélio e outras estruturas podem se constituir em elementos de disseminação dos fungos A principal via de dispersão é o ar atmosférico onde os propágulos podem ser veiculados a longas distancias Outras vias podem ser utilizadas incluindo o homem outros vetores e a água Desta maneira é possível isolar fungos de diferentes locais e substratos tais como madeira alimentos de lesões de animaishomem micoses e de vegetais do solo da água etc Para isto é necessário que sejam fornecidas condições ambientais temperatura pH umidade e nutrientes adequados para possibilitar o desenvolvimento destes microrganismos no meio de cultura Meio de cultura são preparações químicas que possuem em sua composição nutrientes necessários ao desenvolvimento cultivo de microrganismos fora do seu meio natural Podem ser classificados em sólido 120 ágar semissólido 0075 a 05 ou líquido Isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura Isolar uma colônia de um microrganismo separando esta dos outros que se encontra em um determinado substrato O isolamento do fungo é requerido em diversos estudos tais como Estudo da micobiota de determinada região Monitoramento ambiental No diagnóstico de micoses o isolamento permite a identificação do agente etiológico Obtenção de amostras de interesse biotecnológico Na análise de alimentos e medicamentos 2 OBJETIVO Conhecer técnicas de rotina laboratorial em micologia incluindo método de coleta isolamento e estudo macro e microscópico 3 CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO Temperatura ambiente Atmosfera aerobiose Tempo de crescimento Leveduras 2448h Fungos filamentosos 37 dias contaminantes Patogênicos em torno de 5 a 30 dias de acordo com a espécie 4 ROTEIRO PARA PESQUISA DE FUNGOS DO AR METODOLOGIA Técnica da Sedimentação Expor ao ambiente as placas de Petri contendo Ágar Sabouraud ou outro meio de cultura durante 15 minutos 1 metro acima do solo Fechar a placa identificar e incubar à temperatura ambiente Realizar observações diárias das colônias e posterior isolamento em tubos contendo meio de cultura Observação Macroscópica Observação Microscópica Universidade Federal do Pará CURSO Biomedicina Profª Solange Costa Instituto de Ciências Biológicas Micologia 2 OBSERVAÇÃO MACROSCÓPICA Para o estudo macroscópico é necessário isolar as colônias em tubos de ensaio ou em placas de Petri As características macroscópicas são mais bem observadas em placas de Petri cujo crescimento das colônias pode ser medido com auxílio de uma régua bem como é possível a análise das bordas e outras características Para o estudo macroscópico das colônias macromorfologia são analisados diversos aspectos morfológicos devendose anotar tais características visando a descrição macroscópica Seguem abaixo alguns aspectos mas podem utilizar literatura disponível tais como LACAZ et al e Sidrim Rocha 2004 Meio de Cultura anotar em que meio foi semeado o fungo Período de incubação dias horas temperatura constante em estufa ou temperatura ambiente Crescimento limitado rápido invasivo Bordas na periferia das colônias podem ser observados muitos desenhos que variam desde de formas bem delimitadas até achados de projeções irregulares com aspecto de franjas Pode ocorre também uma variação da coloração desses desenhos em relação ao centro Aspecto da Colônia analisar se apresentam sulcos pregas bordas lisas ou onduladas etc Se são planas elevadas cerebriformes entre outras características Textura um dos mais importantes achados para a caracterização da colônia Exemplos Granulosa ou arenosas apresentamse como areia fina Pulverulenta lembrando poeira apresenta densa produção de esporos Furfurácea lembram um punhado de substância farinácea espalhadas na superfície Penugentas lembram pequenos fragmentos de penugem de aves Velutina ou aveludada com micélio aéreo baixo lembrando veludo Cotonosa ou algodonosa colônias com micélio aéreo denso e alto apresentando aspecto de algodão Glabrosa colônias de superfície lisa não produzem micélio aéreo aspecto de cera ou manteiga mais comum em leveduras Membranosa como películas ou membranas Coriácea Colônias endurecidas lembram couro Feltrada ou camurçada Cremosa colônias típicas de leveduras e bactérias Relevo referese à topografia da colônia Exemplos 1 Colônias cerebriformes com topografia de altos e baixos lembrando circunvoluções do cérebro 2 Colônias rugosas com pregas topográficas menos evidentes que as cerebriformes 3 Colônias crateriformes colônias que se aprofundam no meio assumindo o aspecto de uma cratera Pigmento verificar a produção de pigmentos extracelular no anverso e reverso da colônia Anotar a cor Gotículas exsudato escassas eou abundantes transparentes opacas brilhantes ou coloridas Cor Referir a cor exata do anverso e reverso da colônia se há anéis concêntricos de diferentes cores Universidade Federal do Pará CURSO Biomedicina Profª Solange Costa Instituto de Ciências Biológicas Micologia 3 OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA Exame direto entre lâmina e lamínula método de retalhamento Colocar uma gota de Azul de Amann sobre uma lâmina de vidro Retirar um pequeno fragmento da colônia do fungo filamentoso ou uma alíquota da colônia leveduriforme com o auxílio de alça de inoculação previamente esterilizada flambar e resfriada Se estiver trabalhando na placa use o estilete Colocar o fragmento da cultura sobre a gota do líquido de montagem e homogeneizar leveduras ou fragmentar com auxílio de um ou dois estiletes Cobrir a lamínula e para selar contorne as margens da lamínula com esmalte incolor Examinar ao microscópio nas objetivas de 10 localizar o material e 40 vezes analisar as microestruturas Sugestão de referências SIDRIM JJC BRILHANTE RSN ROCHA MFG Cap 8 Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa In SIDRIM JJC ROCHA MFG Micologia Médica à luz de autores contemporâneos Guanabara Koogan Rio de Janeiro 2004 p 8386 MEIO DE CULTURA PARA FUNGOS ÁGAR SABOURAUD Peptona10g Dextrose40g Ágar15 20g Água destilada1000ml PH 56 Modo de Preparo Misturar os ingredientes e levar ao banho maria até fundir o meio Distribuir em tubos de ensaio e leválos à autoclave para esterilização Esterilizar durante 15 minutos a 120o C Inclinar os tubos para solidificar Guardálos em geladeira até o uso CORANTE PARA PREPARO E MONTAGEM DE LÂMINAS AZUL DE AMANN Àc Lático20g Cristais de fenol ác fênico 20g Glicerina20g Água destilada20ml Azul de algodão005g Fundir os cristais de fenol em banho maria e juntar aos demais ingredientes Deixar por 24h e filtrar Siga o modelo da FICHA DE IDENTIFICAÇÃO e registre os dados das colônias isoladas pela equipe individualmente Estes dados servirão de subsídios para a composição do RELATÓRIO FINAL a ser entregue pela equipe no dia Universidade Federal do Pará CURSO Biomedicina Profª Solange Costa Instituto de Ciências Biológicas Micologia 4 FICHA DE IDENTIFICAÇÃO ESTUDO MACROSCÓPICO 1 MACROSCOPIA Colônia leveduriforme levedura colônia filamentosa bolor 2 BORDOS DA COLÔNIA franjado liso ondulado outro 3 TEXTURA lisa rugosa cerebriforme cremosa mucóide algodonosa aveludada pulverulenta felrtrada granulosa outra 4 RELEVO sulcada pregueada elevada centro saliente 5 COR anverso reverso 6 PRESENÇA DE PIGMENTO difusível no meio de cultura OBS Estas são algumas das características analisadas na macroscopia das colônias porém não significa que a sua colônia apresente todos os itens acima 7 Com base nas observações acima descreva as características macroscópicas da colônia descrevêlas individualmente Ex Anverso Colônia de fungo filamentoso leveduriforme crescimento lento rápido invasivo textura algodonosa velutina cremosa relevo cerebriforme com sulcos radiados lisa rugosa etc bordos regulares irregulares coloração verde claro verde musgo bege salmão etc Reverso Coloração branca creme castanho preto presença ou ausência de pregas sulcos pigmento difusível referir a cor ESTUDO MICROSCOCÓPICO Após preparo das lâminas analisar ao Microscópio óptico e anotar as características O que observar ao microscópio hifas septadas hialinas hifas septadas escuras hifas cenocíticas hialinas leveduras Forma leveduras com pseudohifas rizoides Outros Estruturas reprodutivas clamidosporos artrosporos blastosporos Esporos e esporóforos conidióforos esporangióforos ascomas etc Com base nas observações descreva as características microscópicas Micélio septado hialino conídios hialinos formandos em conidióforos simples ramificados ou capitados etc Incluir somente o que for observado Desenhar as microestruturas identificálas e se possível classificar o fungo até a categoria possível Reino Filo Classe Gênero