Manual de Laboratórios: Solo, Água, Nutrição Vegetal, Animal e Alimentos

Manual de Laboratórios Solo Água Nutrição Vegetal Nutrição Animal e Alimentos ISBN8586764086 República Federativa do Brasil Luiz Inácio Lula da Silva Presidente Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Conselho de Administração Luiz Carlos Guedes Pinto Presidente Alexandre Kalil Pires Cláudia Assunção dos Santos Viegas Ernesto Paterniani Hélio Tollini Membros Diretoria Executiva Silvio Crestana DiretorPresidente José Geraldo Eugênio de França Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Sá DiretoresExecutivos Embrapa Pecuária Sudeste Nelson José Novaes ChefeGeral Airton Manzano ChefeAdjunto de Administração Alfredo Ribeiro de Freitas ChefeAdjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Sérgio Novita Esteves ChefeAdjunto de Comunicação Negócios e Apoio ISBN 8586764086 Novembro 2005 Manual de Laboratórios Solo Água Nutrição Vegetal Nutrição Animal e Alimentos Editores Ana Rita de A Nogueira Gilberto Batista de Souza São Carlos SP 2005 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Centro de Pesquisa de Pecuária do Sudeste Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na Embrapa Pecuária Sudeste Rod Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 Fone 16 33615611 Fax 16 33615754 Home page wwwcppseembrapabr Email saccppseembrapabr Revisor de texto Edison Beno Pott Normalização bibliográfica Sônia Borges de Alencar Arte Gráfica capa Gerson Luiz Carbonero Tiragem 1000 exemplares ÁREA DE INFORMAÇÃO EDITORAÇÃO Nogueira Ana Rita de A Manual de Laboratório Solo água nutrição vegetal nutrição animal e alimentos Ana Rita de Araújo Nogueira Gilberto Batista de Souza São Carlos Embrapa Pecuária Sudeste 2005 334 p il ISBN 8586764086 Conteúdo Coleta Acondicionamento Preparo de Amostra Análises Químicas 1 Solo Água Nutrição Vegetal Nutrição Mineral Nutrição Humana Nutrição animal Coleta Acondicionamento Amostragem 2 Solo Água Nutrição Vegetal Nutrição Animal Metodologias 3 Laboratório Manual I Nogueira AR de A Ed II BatistaG B Ed CDD 631417202 EMBRAPA2005 APRESENTAÇÃO A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa com o objetivo de melhorar a qualidade e de uniformizar os procedimentos em seus laboratórios apoia desde 1995 reuniões anuais de técnicos de nível médio e superior e pesquisadores diretamente envolvidos em análises laboratoriais Para evitar insucessos no emprego de técnicas analíticas há necessidade de maior controle de qualidade nos laboratórios Esse fato tem suscitado o interesse de pesquisadores na participação em programas interlaboratoriais visando a estabelecer procedimentos a serem observados nas análises em todo o seu processo desde a fase de amostragem no campo até às determinações analíticas no laboratório e se for o caso a introdução de novos métodos Durante o I MET Workshop de Metodologias dos Laboratórios da Embrapa da região Sudeste que ocorreu de 6 a 8 de dezembro de 1995 ficou clara a necessidade de maior intercâmbio entre profissionais que trabalham em laboratórios o que se refletiu no entusiasmo dos participantes e na demanda por manuais técnicos de uso comum Este documento começou a ser elaborado durante as reuniões realizadas a partir do II MET Workshop de Metodologias dos Laboratórios da Embrapa das regiões Sudeste e Centro Oeste realizado entre 27 e 30 de agosto de 1996 na Embrapa Pecuária Sudeste em São Carlos SP Essa segunda reunião contou com a participação de profissionais da Embrapa das regiões Sudeste e CentroOeste e de outras instituições de pesquisa e ensino e priorizou discussões sobre coleta acondicionamento e preparo de amostras Desde então as reuniões adquiriram caráter nacional e têm ocorrido anualmente em diferentes unidades da Embrapa Embrapa Gado de Leite Juiz de Fora MG Embrapa Solos Rio de Janeiro RJ Embrapa Florestas Colombo Pr Embrapa Meio Ambiente Jaguariúna SP e Embrapa Agrobiologia Seropédica RJ A publicação deste material é um dos resultados das reuniões anuais e seguramente se refletirá no padrão de qualidade dos resultados de pesquisa da Empresa além de constituir valioso subsídio para os profissionais que atuam em institutos de pesquisa e em universidades Os primeiros cinco capítulos são uma reedição do manual Coleta acondicionamento e preparo de amostras publicado inicialmente em 1998 Nos capítulos seguintes são apresentados os métodos atualmente empregados nos diferentes centros de pesquisa da Embrapa A continuidade deste trabalho demonstrará mais uma vez a importância da colaboração entre os profissionais que enfrentam os mesmos problemas em seu dia a dia Não há intenção de esgotar o assunto mas sim de dar o primeiro passo para num só documento reunir sugestões de procedimentos utilizados nos laboratórios que realizam análises de amostras de solos água plantas e materiais relacionados à nutrição animal Algumas dessas sugestões são sem dúvida passíveis de alteração em virtude do desenvolvimento e do aprimoramento das técnicas e dos equipamentos utilizados Os Editores SUMÁRIO SOLO ÁGUA NUTRIÇÃO ANIMAL E ALIMENTOS 8 CAPÍTULO 1 SOLOS 18 1 INTRODUÇÃO 18 2 SOLO18 21 INTRODUÇÃO 18 22 AMOSTRAGEM 19 221 CRITÉRIOS PARA A DIVISÃO DA ÁREA DE AMOSTRAGEM 19 222 NÚMERO DE AMOSTRAS SIMPLES OU SUBAMOSTRAS 20 223 PROFUNDIDADE DE COLETA DE SUBAMOSTRAS 21 224 COMPOSIÇÃO DA AMOSTRA 23 225 MATERIAL PARA A AMOSTRAGEM 23 226 ÉPOCA DE AMOSTRAGEM 24 227 FREQÜÊNCIA DE AMOSTRAGEM 25 228 RECOMENDAÇÕES GERAIS PARA A AMOSTRAGEM 25 23 ACONDICIONAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA 26 24 REGISTRO E PREPARO DA AMOSTRA 27 241 REGISTRO 27 242 SECAGEM 27 243 MOAGEM PENEIRAGEM E ARMAZENAGEM 27 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 28 CAPÍTULO 2 ÁGUA 31 1 INTRODUÇÃO 31 2 QUANDO ONDE E COMO AMOSTRAR 32 3 ACONDICIONAMENTO DE AMOSTRAS TIPOS E PROCEDIMENTOS DE LIMPEZA 33 4 PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS 34 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36 CAPÍTULO 3 TECIDOS VEGETAIS 37 1 INTRODUÇÃO 37 2 AMOSTRAGEM 38 3 PROCEDIMENTO PARA COLETA DE AMOSTRAS DE FOLHAS NO CAMPO 42 31 COLETA DA AMOSTRA 42 32 IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA 42 33 MOAGEM 43 34 ARMAZENAGEM 43 35 INTEGRIDADE DA AMOSTRA 43 36 PROBLEMAS DE CONTAMINAÇÃO 44 37 ARQUIVO DE AMOSTRAS 44 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44 CAPÍTULO 4 TECIDOS E PRODUTOS ANIMAIS 46 1 INTRODUÇÃO 46 2 ASPECTOS IMPORTANTES RELACIONADOS À COLETA DE AMOSTRAS 47 3 OBJETIVO DA PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS 47 4 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS 48 41 RECEBIMENTO 48 42 IDENTIFICAÇÃO E REGISTRO 48 43 PRÉACONDICIONAMENTO 49 44 PRÉSECAGEM 50 45 MOAGEM 51 46 ACONDICIONAMENTO 51 47 ETAPAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 53 5 PREPARO DE AMOSTRAS DE INGREDIENTES E SUPLEMENTOS MINERAIS 57 6 OUTROS TIPOS DE AMOSTRAS DE ORIGEM ANIMAL 57 61 OSSO 58 62 FÍGADO 58 63 SANGUE 59 64 LÍQUIDO DE RÚMEN 61 65 LÍQUIDOS DE ABOMASO E DE ÍLEO 62 66 URINA 62 67 EXTRUSA 62 68 LEITE 63 69 PÊLOS 64 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64 CAPÍTULO 5 ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO 65 1 INTRODUÇÃO 65 2 OBJETIVO 66 3 FUNDAMENTO 66 4 EQUIPAMENTOS 66 5 PROCEDIMENTOS 66 51 INSPEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA 67 52 SOLUBILIZAÇÃO DA AMOSTRA 67 53 PREPARO DA AMOSTRA 67 54 CONSERVAÇÃO DA AMOSTRA 68 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68 CAPÍTULO 6 MÉTODOS DE ANÁLISE DE SOLO 71 1 INTRODUÇÃO 71 2 DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ DO SOLO 72 21 ACIDEZ ATIVA 72 213 REAGENTES E SOLUÇÕES 72 214 PROCEDIMENTO 72 22 ACIDEZ TROCÁVEL ALUMÍNIO TROCÁVEL 73 23 ACIDEZ POTENCIAL OU TOTAL COM A SOLUÇÃO DE ACETATO DE CÁLCIO 75 24 ACIDEZ POTENCIAL POR POTENCIOMETRIA EM SOLUÇÃOTAMPÃO SMP PH SMP 77 3 CARBONO ORGÂNICO 78 31 PROCEDIMENTO EMPREGANDO DICROMATO 78 32 PROCEDIMENTO COLORIMÉTRICO 81 4 FÓSFORO DISPONÍVEL E POTÁSSIO TROCÁVEL 82 41 MÉTODO DE MEHLICH 1 CAROLINA DO NORTE OU DO DUPLO ÁCIDO 82 42 MÉTODO DA RESINA RAIJ ET AL 2001 84 5 SÓDIO 88 6 CÁLCIO E MAGNÉSIO 90 61 EXTRAÇÃO COM KCL 10 MOL L1 90 62 MÉTODO DA RESINA 92 7 BORO 95 71 EXTRAÇÃO COM ÁGUA QUENTE 95 72 EXTRAÇÃO COM ÁGUA QUENTE EMPREGANDO RADIAÇÃO MICROONDAS 96 8 ENXOFRE SSO4 2 98 82 VARIAÇÃO DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE SSO4 2 99 9 DETERMINAÇÃO DE COBRE FERRO MANGANÊS E ZINCO 101 91 EXTRAÇÃO COM DTPA 101 92 EXTRAÇÃO COM HCL A 01 MOL L1 104 10 NITROGÊNIO TOTAL 105 101 MÉTODO KJELDAHL 106 102 INCLUSÃO DE NITRATO E NITRITO NA QUANTIFICAÇÃO DO NITROGÊNIO TOTAL 110 103 NITROGÊNIO MINERAL NH4 E NO3 111 11 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA 115 12 ANÁLISE FÍSICA 117 121 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO SOLO MÉTODO DA PIPETA 117 122 CAPACIDADE DE RETENÇÃO DE ÁGUA DO SOLO 121 123 DENSIDADE DO SOLO 123 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 124 CAPÍTULO 7 ÁGUA 127 1 INTRODUÇÃO 127 2 PH 127 3 CÁLCIO E MAGNÉSIO 129 4 SÓDIO E POTÁSSIO 130 5 ALCALINIDADE TOTAL 131 6 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA 133 7 OXIGÊNIO DISSOLVIDO OD 134 8 DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO DQO 136 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 138 CAPÍTULO 8 TECIDO VEGETAL 140 1 INTRODUÇÃO 140 2 DECOMPOSIÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO 141 21 INTRODUÇÃO 141 22 DECOMPOSIÇÃO POR VIA SECA 142 23 DECOMPOSIÇÃO POR VIA ÚMIDA 144 24 PROCEDIMENTOS 145 25 EXTRAÇÃO COM SOLUÇÃO DE ÁCIDOS DILUÍDOS 10 MOL L1 DE HCL OU HNO3 152 3 DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS 153 31 NITROGÊNIO 153 311 SEMIMICRO KJELDAHL 154 312 ESPECTROFOTOMETRIA COM REAGENTE DE NESSLER 156 313 AZUL DE INDOFENOL REAÇÃO DE BERTHELOT 158 314 ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO REAÇÃO DE BERTHELOT 159 32 FÓSFORO 162 321 AZUL DE MOLIBDÊNIO 162 322 AMARELO DE VANADATO 163 33 SÓDIO E POTÁSSIO 165 331 ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ATÔMICA 165 34 CÁLCIO E MAGNÉSIO 167 341 ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA 167 342 TITULAÇÃO COM EDTA 168 35 ENXOFRE 170 36 COBRE ZINCO FERRO E MANGANÊS 172 37 REGRAS BÁSICAS PARA MANUTENÇÃO DE ROTINA EM ESPECTRÔMETROS DE ABSORÇÃO ATÔMICA 173 38 BORO 179 381 AZOMETINAH 179 382 CURCUMINA 180 4 SISTEMA POLIVALENTE PARA DETERMINAÇÃO MULTIELEMENTAR EM ANÁLISE DE PLANTAS 182 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 187 CAPÍTULO 9 ANÁLISE DE ALIMENTOS 188 1 INTRODUÇÃO 188 2 DETERMINAÇÃO DE MATÉRIA SECA 188 21 DETERMINAÇÃO DE MATÉRIA SECA E UMIDADE EM PLANTAS EMPREGANDO RADIAÇÃO MICROONDAS 191 3 DETERMINAÇÃO DE CINZAS 194 ENERGIA BRUTA 196 41 APLICAÇÃO 196 42 APLICAÇÃO PARA BOMBA CALORIMÉTRICA PARR MANUAL DE OPERAÇÕES 197 5 DETERMINAÇÃO DE EXTRATO ETÉREO 201 6 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE UREÁTICA 203 61 PROCEDIMENTO CONVENCIONAL 203 62 TÉCNICA SIMPLIFICADA PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE UREÁTICA AU 205 7 DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS 206 71 MÉTODO DE OXIDAÇÃO COM ÁCIDO PERFÓRMICO SEGUIDA DE HIDRÓLISE ÁCIDA MÉTODO A 206 8 DETERMINAÇÃO DE OXALATOS TOTAIS E OXALATOS SOLÚVEIS EM ÁGUA EM AMOSTRAS DE PLANTAS 214 9 CARBOIDRATOS 217 10 DIGESTIBILIDADE 224 101 DETERMINAÇÃO DE DIGESTIBILIDADE COM PEPSINA MÉTODO A 224 102 DETERMINAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE IN VITRO DA MATÉRIA SECA E DA MATÉRIA ORGÂNICA 228 11 FIBRAS 233 111 DETERMINAÇÃO DE FIBRA DIETÉTICA TOTAL MÉTODO A 233 112 DETERMINAÇÃO DE FIBRA BRUTA MÉTODO B 238 113 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE PLANTAS FORRAGEIRAS MÉTODOS DE VAN SOEST 241 12 DETERMINAÇÃO DE CELULOSE 252 13 DETERMINAÇÃO DE LIGNINA 254 131 MÉTODO DO PERMANGANATO DE POTÁSSIO 254 132 DETERMINAÇÃO DA LIGNINA E DA CELULOSE MÉTODO DO ÁCIDO SULFÚRICO A 72 VV 257 14 DETERMINAÇÃO DA SÍLICA 259 15 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO 261 151 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO TOTAL PELO MÉTODO DE KJELDAHL 261 152 PROTEÍNA BRUTA 264 153 DETERMINAÇÃO DE NITRATO EM TECIDO VEGETAL 265 154 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO AMONIACAL NNH3 267 155 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO INSOLÚVEL EM DETERGENTE NEUTRO NIDN 271 156 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO INSOLÚVEL EM DETERGENTE ÁCIDO NIDA 273 16 DETERMINAÇÃO DE MACROELEMENTOS CA MG K NA S EM PLANTAS 275 POR DIGESTÃO NITROPERCLÓRICA 275 17 DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO PPO4 2 EM PLANTAS 279 171 MÉTODO DE GOMORY DIGESTÃO NITROPERCLÓRICA 279 172 MÉTODO DO VANADATO DIGESTÃO NÍTROPERCLÓRICA 283 173 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE FÓSFORO EM SOLUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO A 2 286 25 DETERMINAÇÃO DE GRANULOMETRIA 289 19 DETERMINAÇÃO DE AMIDO 293 20 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 295 I COLETA ACONDICIONAMENTO E PREPARO DE AMOSTRAS CAPÍTULO 1 SOLOS Amoacy Carvalho Fabrício1 Ana Cândida Primavesi2 César de Rosso3 Celso João Alves Ferreira4 Hélio Teixeira Prates5 Marcos Roberto Ferraz6 Maria José Aguirre Armelin7 Mário Miyazawa8 Odo Primavesi2 Paule Jeanne Mendes9 Pedro L O de A Machado10 coordenador Vera Lúcia Ferracini3 1 INTRODUÇÃO Considerando as atividades passíveis de uniformização nas diferentes situações de uso e de manejo do solo decidiuse sugerir procedimentos de coleta e de preparo de amostras para utilização em determinações de rotina Exceção se faz para o caso da determinação de nitrato Não estão incluídas as orientações para amostras utilizadas em investigações científicas cujos métodos encontramse ainda em fase de estudos 2 SOLO 21 INTRODUÇÃO Qualquer tipo de análise de solo tem por objetivo determinar quantitativamente características químicas físicas ou biológicas que representam os reais valores da respectiva característica dentro de uma faixa de dispersão confiável e estatisticamente fundamentada A condição para isto é que o procedimento analítico juntamente com os preparativos pertinentes não contenha erros sistemáticos também entendidos como declinações ou até erros graves p ex segregantes não considerados 1Embrapa Agropecuária Oeste 2Embrapa Pecuária Sudeste 3Embrapa Meio Ambiente 4Embrapa Soja 5Embrapa Milho e Sorgo 6Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos USP Pirassununga SP 7Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN 8Instituto Agronômico do Paraná IAPAR 9Embrapa Pantanal 10Embrapa Solos Mesmo que essas condições sejam atendidas o dado analítico encontrado somente representará o valor real se o material ou o substrato utilizado para a análise for representativo do todo ao qual ele pertence O problema da representatividade poderia ser evitado se todo o universo do material investigado pudesse ser analisado Isso entretanto é pura teoria exceto para aquelas determinações em amostras de pequeno volume em que se pretende avaliar as condições imediatamente adjacentes ao ponto de amostragem Na prática as determinações podem ser conduzidas apenas em partes do todo ou seja em amostras de cujos resultados seja possível inferir a concentração ou a característica do todo Destarte a amostragem obedecendo a um dos princípios estatísticos da minimização de erros é de grande importância para a exatidão do valor encontrado pela análise ou seja a aproximação máxima possível do valor real Quanto mais passos ou mais procedimentos houver para a coleta da amostra composição de uma amostra a partir de subamostras acondicionamento transporte secagem preparo em laboratório etc mais difícil será a obtenção do valor real A obtenção do valor real também é dificultada quando determinado elemento ou substância analisada não é uma grandeza constante alterandose até o momento da análise podendo levar assim à alteração do valor real p ex teor de água concentração de nitrato ou amônio atividade de microrganismos A amostragem de solo não é prática simples e deve ser rigorosamente executada seguindo as instruções baseadas em considerações de ordem científica HOFFMAN 1991 22 AMOSTRAGEM 221 CRITÉRIOS PARA A DIVISÃO DA ÁREA DE AMOSTRAGEM Um requisito importante para que a amostragem seja bem sucedida é a escolha da área da qual serão retiradas as amostras simples também denominadas de subamostras O tipo de solo é um critério utilizado para a divisão da área ou da gleba mas dentro do mesmo tipo de solo em conseqüência de diferentes coberturas vegetais cor do solo posição no relevo drenagem e histórico da área nova subdivisão deve ser realizada pois cultivos diferentes exigem manejo diferente tais como a adubação mineral ou orgânica ou o controle de plantas daninhas pragas e doenças Essa nova subdivisão é importante principalmente quando se pretende quantificar os teores de nutrientes em plantas ou os resíduos de pesticidas em culturas subseqüentes Áreas mal drenadas formigueiros área com acúmulo de esterco depósitos de adubos área de acúmulo de palhada próxima à trilhadeira etc que não representem a superfície utilizável não devem ser incluídas na amostragem Devese delimitar a área a ser amostrada longe o suficiente 2 a 5 m de rodovias estradas rurais cercas ou depósitos em geral Para solos em que se pratica a olericultura o princípio é o mesmo mas pelo fato de se tratar de áreas menores o distanciamento deve ser menor porém não menor do que 1 m Mesmo quando se divide ou se escolhe uma área considerada homogênea no sentido anteriormente exposto a heterogeneidade ainda pode ocorrer dependendo da característica a ser determinada Segundo HEMINGWAY 1955 a variância do erro na determinação de nutrientes aumenta quando esterco calcário ou adubo mineral são aplicados ao solo Havendo essa heterogeneidade dos solos que pode ser acentuada em solos arenosos em que a fertilidade química é intimamente relacionada com o manejo do material orgânico surge a questão a respeito da quantidade de subamostras a ser coletada para preparar a amostra composta 222 NÚMERO DE AMOSTRAS SIMPLES OU SUBAMOSTRAS Quando se fala no número de amostras simples que deve ser coletado sempre surge a questão referente ao nível de exigência na amostragem sem causar todavia volume de trabalho impraticável ou economicamente inviável Em estudos sobre a coleta de amostras podese identificar a magnitude do erro da amostragem e calcular o número de subamostras necessário para que haja equivalência entre o volume de trabalho laboriosidade e o nível representativo do erro da amostragem Em geral a confiabilidade dos resultados aumenta com o número de subamostras Entretanto para a quantificação de nutrientes que visa à recomendação de adubação 10 a 20 subamostras da camada arável 0 20 cm de uma área de 1 a 2 ha em casos de grande uniformidade do terreno até 4 ha são consideradas suficientes OLSON et al 1958 CAMERON et al 1971 ILK NIMMERVOLL 1974 As subamostras são coletadas em ziguezague em pontos distanciados de 15 a 20 passos um do outro e acondicionadas num recipiente plástico limpo p ex balde de 5 a 10 L para posterior composição da amostra propriamente dita Procedimentos mais refinados de amostragem dos solos podem ser adotados em áreas de investigação científica em áreas críticas ou em áreas agrícolas em que a intensificação do processo produtivo associado ao uso mais criterioso de insumos vai se consolidando Tais procedimentos englobam o estudo da variabilidade espacial das propriedades do solo consideradas objetivando a interpolação dos seus valores possibilitando assim a espacialização e maior precisão nas adubações 223 PROFUNDIDADE DE COLETA DE SUBAMOSTRAS De maneira geral a amostra é retirada até a profundidade de 20 cm devendo representar porção uniforme de 0 a 20 cm Em áreas ainda não preparadas mecanicamente aração gradagem etc ou com cobertura morta devese limpar a superfície do solo nos locais escolhidos para retirar as subamostras removendo folhas ramos ou galhos com cautela suficiente para não descartar parte significativa do solo A adoção das amostragens na profundidade de até 20 cm apresenta vantagens na uniformização do procedimento que permite a comparação de resultados obtidos no passado visando à constituição de um histórico da fertilidade química e também possibilita a comparação com resultados de análise de solos de outras localidades Amostragem nessa profundidade vem sendo normalmente adotada em sistemas de cultivo convencional em que o preparo do solo para a semeadura da cultura anual consiste em uma aração e duas gradagens Nesse sistema o solo sofre revolvimento na camada de 0 a 20 cm Para averiguar o ambiente radicular no subsolo recomendase ainda a amostragem nas profundidades de 20 40 e 40 60 cm Há evidências RAIJ 1988 PAVAN VOLKWEISS 1986 de que nessas profundidades a presença de alta quantidade de alumínio associada à deficiência de cálcio possa atuar como barreira química impedindo o crescimento radicular em profundidade Segundo OLIVEIRA et al 1996 para o algodoeiro o conhecimento das condições de acidez subsuperficial é muito importante pois saturação de alumínio superior a 20 pode comprometer ou até inviabilizar a cultura nessas áreas Esse procedimento de amostragem também é recomendado para áreas novas de cultivo Em pastagens sob manejo extensivo em que raramente se fazem adubações ou renovações também se recomenda a amostragem na profundidade de 0 a 20 cm Em sistemas de plantio direto há tendência de concentração dos nutrientes e da matéria orgânica nos primeiros centímetros de solo o que se deve basicamente ao padrão de mobilidade dos íons no solo à não incorporação de fertilizantes e corretivos mediante o revolvimento e ao enriquecimento das camadas mais superficiais pela decomposição dos resíduos das culturas VIEIRA 1996 Assim para detectar a existência ou não de um gradiente de fertilidade tornase necessário executar amostragens mais estratificadas 0 10 10 20 20 40 e 40 60 cm Tal procedimento deve ser adotado também para pastagens sob manejo intensivo Para culturas perenes p ex café e frutíferas já instaladas amostrar de 0 10 10 20 20 40 e 40 60 cm na projeção da copa que é o local da adubação e nas mesmas camadas entre as linhas de plantio ou no centro das ruas Segundo PAVAN CHAVES 1996 a aplicação de fertilizantes durante vários anos sob a projeção da copa causa não apenas um gradiente de fertilidade vertical como no plantio direto mas também horizontal Segundo os mesmos autores embora as culturas perenes tenham sistema radicular mais profundo elas apresentam menor demanda de nutrientes por volume de solo e por unidade de tempo do que as culturas anuais em razão do crescimento lento e da absorção diferencial de nutrientes durante o ano Isso torna necessário que se avalie maior número de camadas para o diagnóstico da fertilidade Na instalação das culturas a amostragem deve ser feita na profundidade de 0 20 20 40 e 40 60 cm A amostragem em lavouras de canadeaçúcar deve ser feita nas profundidades de 0 25 e 25 50 cm A adubação freqüente de vinhaça nesse sistema torna necessária amostragem também a 0 10 cm A profundidade de amostragem em solos de várzea deve ser variável com o tipo de solo e de acordo com a sua diferenciação vertical Segundo COSTA 1996 os solos de várzea são aqueles encontrados nas planícies dos rios onde se desenvolveram pela deposição de sedimentos Há variações acentuadas não só devidas à sedimentação no sentido horizontal mas também devidas à sedimentação vertical Assim a profundidade de amostragem deve variar de acordo com o tipo de solo e de acordo com sua diferenciação vertical Nos solos do tipo gley pouco húmico amostragens de 0 20 cm e 20 40 cm podem caracterizar a fertilidade do solo Nos solos orgânicos maiores profundidades devem ser exploradas sendo importante determinar o substrato mineral o que pode ocorrer a partir dos 80 cm exigindo assim amostragens a 80 100 cm principalmente no início da exploração da várzea COSTA 1996 A interpretação dos resultados do solo de várzea requer cuidado especial pois as determinações químicas são feitas na presença de atmosfera com oxigênio Nessas condições os elementos reduzidos vão se oxidar com O2 atmosférico As principais alterações químicas são diminuição no valor de pH aumento no teor de Al3 e diminuição nos teores de Fe2 Mn2 S2 e PO4 3 Portanto os resultados das determinações químicas podem não refletir as reais condições das plantas provenientes de várzeas ou de solos inundados As principais dificuldades encontradas quando se deseja analisar amostras provenientes de solos inundados são 1 amostragem sem contato com O2 atmosférico e seu transporte até o laboratório 2 homogeneização e pesagem das amostras e 3 acondicionamento das amostras Em solos em que há reflorestamento recomendase a amostragem a 0 20 e a 20 40 cm A amostragem que visa à quantificação de resíduos de pesticidas em culturas subseqüentes deve ser executada à profundidades de 0 10 cm e de 10 20 cm 224 COMPOSIÇÃO DA AMOSTRA A composição ideal da amostra se dá pelo quarteamento do material ou seja homogeneizar bem as subamostras contidas no recipiente e despejar sobre uma folha de plástico de aproximadamente 70 a 100 cm de lado Em seguida espalhar o material e dividi lo em oito áreas Descartar duas porções de solo de cada lado localizadas frente a frente mas não avizinhadas Figura 1 O material restante deve ser novamente homogeneizado repetindose o mesmo procedimento anteriormente descrito até que se obtenha a amostra desejada Para a determinação de nutrientes a quantidade de 300a 500 g de solo é suficiente Caso o solo apresente grande quantidade de fração grosseira calhaus cascalhos e matacões há a necessidade de 1 a 2 kg de material Em razão da variabilidade existente na densidade dos solos de várzea principalmente nos orgânicos e no gley húmico é importante garantir o envio de amostra de 500 g de solo mesmo que os volumes encaminhados para a análise sejam diferentes COSTA 1996 No local a amostra uma vez composta deve ser seca ao ar e à sombra sobre uma folha de plástico limpa Figura 1 Sugestão de quarteamento do material e de descarte de porções Dependendo da característica a ser analisada p ex nitrato atividade microbiana esta sugestão de composição de amostra de solo deve ser modificada 225 MATERIAL PARA A AMOSTRAGEM A coleta de amostras pode ser feita com diversas ferramentas dependendo da disponibilidade do equipamento e da acurácia exigida Um equipamento adequado para a amostragem de solos é o trado que muitas vezes é concebido e fabricado na própria instituição de pesquisa Constituise de um tubo de aço leve com uma fenda lateral ao longo da profundidade a ser amostrada normalmente mede 15 m e com a extremidade inferior cortante Possui demarcações a cada 5 cm ao longo da fenda e na extremidade superior apresenta um cabo disposto em T É importante frisar que existem firmas internacionais especializadas na confecção desse equipamento Como se pode observar na Figura 2 existem vários tipos de equipamento para a amostragem do solo o trado holandês que tem bom desempenho em qualquer tipo de solo mas exige grande esforço físico o trado de rosca mais adequado para solos arenosos e úmidos o trado caneco ideal para solos secos e compactados que não exige muito esforço físico o calador ideal para amostragem em terra fofa e ligeiramente úmida e a pá de corte ou pá reta equipamento mais disponível e simples para o agricultor e que deve ser usado isoladamente em terra úmida e fofa ou com o enxadão em solo seco e compactado LOPES GUIMARÃES 1989 Há solos extremamente compactados em que se utiliza uma chibanca que é semelhante a um pequeno alvião ou picareta Um problema que se tem observado freqüentemente é o uso de materiais potencialmente contaminantes e relativamente pesados para a tarefa p ex aço galvanizado Ao se proceder a coleta das 15 a 20 subamostras na área delimitada a pessoa que logo entra em cansaço em razão da massa do equipamento passa a considerar a coleta de 7 a 10 subamostras como adequada para a análise É importante que se colete sempre o mesmo volume para cada subamostra Figura 2 Equipamentos mais comuns para a coleta de amostras de solos Fonte LOPES GUIMARÃES 1989 226 ÉPOCA DE AMOSTRAGEM A época de amostragem ideal está entre a colheita e a adubação subseqüente A última adubação entretanto não deve estar muito próxima da amostragem sendo que a adubação orgânica deve ter sido executada há 8 semanas e a mineral há 4 a 6 semanas Para realizar a amostragem deve ter havido precipitação mínima de 10 mm O solo deve permitir preparo mecânico como aração ou gradagem ponto de sazão ou seja quando molhado não deve estar plástico ou muito plástico e quando seco não deve estar duro ou muito duro Após chuva copiosa devese esperar de 2 a 4 dias para atingir a consistência adequada para amostragem com boa homogeneização 227 FREQÜÊNCIA DE AMOSTRAGEM Enquanto segundo o IAPAR 1996 a amostragem de solos pode ser realizada em intervalos de 3 a 5 anos de acordo com RAIJ et al 1985 a amostragem deve ser repetida em intervalos que podem variar de um a quatro anos No entanto para ambos o intervalo das amostragens pode ser diminuído se for observado algum comportamento diferencial no desenvolvimento da cultura caso a gleba receba maior aplicação de adubo ou se houver emprego de novo critério de adubação ou correção do solo indicados pelos órgãos de pesquisa ou de assistência técnica Em áreas irrigadas recomendase amostrar o solo anualmente Em pastagens a amostragem deve ser anual em áreas cultivadas com espécies exigentes sob pastejo p ex capimcolonião gramaestrela capimnapier capineiras p ex capimnapier canadeaçúcar e capimguatemala ou alfafa Em áreas com forrageiras menos exigentes como capimbraquiária capimandropogon e capimgordura a amostragem pode ser feita em intervalos de 2 a 3 anos MARUN 1996 228 RECOMENDAÇÕES GERAIS PARA A AMOSTRAGEM Bem antes da utilização da estatística na amostragem alguns procedimentos gerais para a coleta de amostras se desenvolveram na prática e assim possibilitaram a diminuição de erros Para o caso de solos são considerados importantes os seguintes procedimentos Independentemente do tamanho as amostras oriundas de maior número de subamostras são melhores do que aquelas formadas de poucas subamostras Quanto maior for a quantidade da fração grosseira do solo cascalhos calhaus e matacões tanto maior será a quantidade de subamostras a coletar na área delimitada e mais laboriosa será a tarefa Com o intuito de evitar erros sistemáticos as subamostras devem ser retiradas transversalmente à orientação da linha de plantio de preparo do solo ou de adubação Na amostragem e na elaboração e no preparo da amostra cada cascalho cada calhau ou cada matacão deve ter a mesma chance de estar presente na amostra composta ou nos passos para a sua composição ou seja cada tipo de fração grosseira deve ter a possibilidade de constituir a amostra composta nas mesmas proporções que as encontradas no solo amostrado A amostragem deve ser realizada quando o solo está no seu ponto de sazão ou seja no estado de consistência em que se possa proceder a aração ou a gradagem Não fumar durante a coleta das amostras pois cinzas de cigarro de qualquer natureza podem afetar o resultado da análise de solo principalmente com relação aos teores de potássio 23 ACONDICIONAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA O acondicionamento de amostras para análise que visem ao levantamento da fertilidade deve ser feito em sacos plásticos limpos com capacidade para 1 ou 2 kg dependendo da quantidade de amostra composta ver tópico 14 Na falta de etiqueta o material do saco deve possibilitar identificação com o número a origem da amostra e a cobertura vegetal Para o acondicionamento de amostras que visem à quantificação de nitrato devese proceder da seguinte maneira após a coleta da amostra esta ainda úmida deve ser acondicionada em saco plástico identificada e armazenada em caixas térmicas com gelo reciclável ou em tambor com nitrogênio líquido para transporte até o laboratório Para períodos mais longos de armazenamento a amostra deve ser guardada sob temperatura de 4C Para a quantificação de resíduos de pesticidas as amostras devem ser acondicionadas em tubos de PVC utilizados na amostragem ou em saco plástico de polietileno transparente O transporte deve ser feito o mais rapidamente possível para o laboratório em caixas térmicas com gelo reciclável ou em tambor com nitrogênio líquido Para períodos mais longos conservar em congelador 20C observandose as características do princípio ativo A amostra pode ser identificada da seguinte maneira nome do solicitante data e período da amostragem local da amostragem Estado município nome da propriedade e se possível as coordenadas locais número da amostra profundidade e número de subamostras tamanho da área amostrada tipo de relevo encosta de morro terra plana alto do morro várzea ou baixada observações complementares sobre o estado atual do solo condições climáticas vegetação predominante cultura anterior idade da cultura perene ou semiperene etc informações sobre adubações ou pesticidas indicando tipo e quantidade aplicados LEMOS SANTOS 1996 apresentaram sugestões de fichas para descrição de amostras de solos além de procedimentos para descrição e coleta de solo no campo para a execução de levantamentos pedológicos 24 REGISTRO E PREPARO DA AMOSTRA A amostra de solo ao chegar no laboratório deve estar devidamente identificada ver tópico 2 para ser registrada e posteriormente preparada 241 REGISTRO Cada laboratório possui um sistema de registro específico mas geralmente a amostra recebe um número de laboratório que deverá ser colocado na folha de informação folha de resultado de análise de solo para posterior identificação O número de registro também é colocado nas caixas que contêm as amostras já preparadas 242 SECAGEM Para determinação química e física fertilidade a amostra deve ser espalhada sobre uma mesa ou prateleira com superfície lisa de material não contaminante A secagem ao ar se procede à sombra em que torrões maiores e mais frágeis são quebrados manualmente e em seguida fazse o revolvimento da amostra para agilização da secagem A secagem também pode ser feita em estufa com circulação forçada de ar e sob temperatura que não exceda 40C Temperaturas mais altas podem acarreta r alteração nos teores de fósforo potássio enxofre ferro e manganês dentre outros 243 MOAGEM PENEIRAGEM E ARMAZENAGEM A amostra seca pode apresentar ainda alguns torrões menores aos quais há necessidade de aplicar com as duas mãos um rolo de madeira ou utilizar almofarizes com pistilo de porcelana para uma perfeita moagem Devese ter o cuidado de não moer cascalhos e calhaus Em muitos laboratórios são utilizados moedores automáticos de martelo Após a moagem de cada amostra deve ser feita limpeza do equipamento utilizandose pincéis ar pressurizado etc A contaminação de amostras com elementos do material do próprio equipamento é desprezível Após a moagem a amostra é passada em peneira com malha de 2 mm e posteriormente acondicionada em caixa de papelão ou em pote de vidro ou plástico Embora seja pequena a quantidade de amostra necessária para todas as determinações 50 cm3 devese preparar quantidade maior 300 cm3 para facilitar a utilização do cachimbo ou a pesagem além de permitir eventuais repetições O armazenamento de amostras de solo deve ser feito em local seco e normalmente por um período de 3 meses para o caso de haver solicitação de reanálise Nas instituições de pesquisa em que são realizados estudos de adubação os laboratórios devem ser encorajados a formar um banco permanente de solos pois com os resultados de produção de campos experimentais e das determinações químicas e físicas tornase possível calibrar novos métodos que venham a ser desenvolvidos ou fazer ajustes nos já existentes Nunca é demais reforçar que os locais onde as amostras são manuseadas devem se manter sempre rigorosamente limpos e em ordem evitandose manipular sacos de adubo nas salas de preparo e de estocagem de amostras de solo É importante evitar a presença de produtos de limpeza que possam contaminar as amostras Para a determinação de resíduos de pesticidas o procedimento é idêntico ao descrito anteriormente observandose contudo as características do princípio ativo e do método de análise 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAMERON DR NYBORG M TOOGOOD JA LAVERTY DH Accuracy of field sampling for soil tests Canadian Journal of Soil Science Ottawa v51 n1 p165175 1971 COSTA A Várzeas In IAPAR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina IAPAR 1996 p 2125 IAPAR Circular 90 EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa de Solos Rio de Janeiro RJ Manual de Métodos de Análise de Solos 2 ed Rev Atual Rio de Janeiro 1997 212p EMBRAPA CNPS Documentos 1 HEMINGWAY RG Soil sampling errors and advisory analyses Journal of Agricultural Science Cambridge v46 n 1 p18 1955 HOFFMAN G Methodenbuch Die Untersuchung von Boeden Band I 4 Auflage Darmstadt VDLUFAVerlag 1991 IAPAR Londrina PR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina 1996 28p IAPAR Circular 90 ILK F NIMMERVOLL W Streuung von Analysenergebnissen von Boden und Pflanzen innerhalb eines Weizenfeldes Land und Forstwirtschaftliche Forschung in Oesterreich Band v6 p97102 1974 LEMOS RC SANTOS RD 3ed Manual de descrição e coleta de solo no campo Campinas Sociedade Brasileira de Ciência do Solo 1996 84 p LOPES AS GUIMARÃES PTG Recomendações para o uso de corretivos e fertilizantes em Minas Gerais Lavras Comissão de Fertilidade do Solo de Estado de Minas Gerais 1989 176 p MARUN F Pastagens e capineiras In IAPAR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina 1996 p 2728 IAPAR Circular 90 OLIVEIRA EL PARRA MS COSTA A Plantio convencional In IAPAR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina 1996 p910 IAPAR Circular 90 OLSON RA DREIER AF SORENSEN R The significance of subsoil and soil series in Nebraska soil testing Agronomy Journal Wisconsin v 50 n1 p185186 1958 PAVAN MA VOLKWEISS SJ Efeitos do gesso nas relações soloplanta princípios In SEMINÁRIO SOBRE O USO DO FOSFOGESSO NA AGRICULTURA 1 1986 Brasília AnaisBrasília EMBRAPADDT 1986 p107118 PAVAN MA CHAVES JCD Culturas perenes In IAPAR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina 1996 p 1519 IAPAR Circular 90 RAIJ B VAN SILVA NM BATAGLIA OC QUAGGIO JA HIROCE R CANTARELLA H BELLINAZZI JR DECHEN AR TRANI PE Recomendações de adubação e calagem para o Estado de São Paulo Campinas IAC 1985 107p IAC Boletim Técnico 100 RAIJ B VAN Gesso agrícola na melhoria do ambiente radicular no subsolo São Paulo ANDA 1988 88 p SILVA FC RAIJ B VAN ARCANGELA C BARRETO W O MELO W J MIYAZAWA M CLAESSEN MEC BOARETTO AE MACHADO PLOA NETTO AR GOMES PC SALDANHA MFC PEREZ DV Elaboração do manual de fertilidade do solo Rio de Janeiro EMBRAPA CNPS Programa 01 Recursos Naturais Subprojeto 0109420308 Projeto em andamento 1996 6p VIEIRA MJ Plantio direto In IAPAR Amostragem de solo para análise química plantio direto e convencional culturas perenes várzeas pastagens e capineiras Londrina IAPAR 1996 p1114 IAPAR Circular 90 CAPÍTULO 2 ÁGUA Amoacy Carvalho Fabrício1 Ana Cândida Primavesi2 César de Rosso3 Celso João Alves Ferreira4 Hélio Teixeira Prates5 Marcos Roberto Ferraz6 Maria José Aguirre Armelin7 Mário Miyazawa8 Odo Primavesi2 Paule Jeanne Mendes9 Pedro L O de A Machado10 coordenador Vera Lúcia Ferracini3 1 INTRODUÇÃO O objetivo de amostragem é coletar volume de água pequeno o bastante para ser transportado convenientemente e manuseado no laboratório e que represente o mais acuradamente possível o material coletado Isso significa que as proporções relativas ou as concentrações de todos os componentes na amostra correspondam àquelas no material sendo amostrado e que a amostra seja manuseada de tal forma que nenhuma mudança significativa em composição ocorra antes de as determinações serem realizadas Desse modo devese procurar sempre transportar as amostras do local de coleta para o laboratório em recipientes caixas de isopor caixas térmicas que protejam as amostras da luz e do aumento de temperatura Se o tempo necessário para a coleta e o transporte superar algumas horas o uso de gelo pode ser uma alternativa Entendese por material sendo amostrado a água de abastecimento doméstico e industrial rios lagoas represas estuários chuva água subterrânea solução de solo extratores piezômetros água de escoamento superficial água de irrigação água de refrigeração água de caldeiras ou de alimentação de caldeiras efluentes de estações de tratamento de esgoto doméstico e efluentes industriais e de atividades extrativas minerais Algumas determinações devem ser realizadas no campo tais como pH odor salinidade temperatura e oxigênio dissolvido se medido por potenciometria Quando isso não for possível procurar executar as determinações imediatamente após chegar ao laboratório com exceção das duas últimas variáveis 1Embrapa Agropecuária Oeste 2Embrapa Pecuária Sudeste 3Embrapa Meio Ambiente 4Embrapa Soja 5Embrapa Milho e Sorgo 6Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos USP Pirassununga SP 7Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN 8Instituto Agronômico do Paraná IAPAR 9Embrapa Pantanal 10Embrapa Solos Etiquetar as amostras fornecendo número coletor data hora e local de amostragem Utilizar etiquetas e marcadores resistentes à água ao manuseio e à estocagem Registrar também o tipo de amostra o amostrador utilizado e as condições climatológicas A quantidade de amostra é função das variáveis que serão analisadas mas o volume de 1 L pode ser suficiente para a maioria das determinações Utilizar frascos separados para determinações microbiológicas de pesticidas de oxigênio dissolvido físicas e químicas Dentro do grupo das análises químicas usar frascos plásticos e de vidro quando as variáveis a serem medidas exigirem tal separação 2 QUANDO ONDE E COMO AMOSTRAR Para se obter amostras representativas é necessário levar em consideração que existe grande variedade de condições sob as quais as amostras são coletadas Assim tornase difícil estabelecer o procedimento que seja unânime e ideal em todas as situações A composição de amostras geralmente é considerada como a mistura em proporções iguais de amostras obtidas em diferentes instantes durante deeterminado período Esse período pode ser estabelecido em função das características de operação especialmente para efluentes industriais ou do tipo de material amostrado Algumas águas só serão representativas se a amostragem for realizada no tempo e no espaço Se houver interesse no conhecimento de valores máximos e mínimos as amostras deverão ser coletadas e analisadas separadamente Se o material que estiver sendo amostrado for considerado suficientemente constante em composição ao longo do tempo ou espacialmente uniforme em uma área representativa amostras simples poderão ser coletadas Exemplos que podem ser enquadrados nesse caso são a água de abastecimento urbano a água subterrânea e algumas águas superficiais Quando o material investigado se mostrar variável no espaço como no caso de rios que apresentem variações horizontais e em função da profundidade integradores de amostras tornamse necessários Amostras podem ser integradas da superfície para o fundo no meio do canal ou transversalmente de lado a lado à meia profundidade A velocidade de movimento do amostrador deve ser ajustada de acordo com a velocidade da água Nos rios evitar áreas de excessiva turbulência ou remanso procurando trabalhar nos trechos mais lineares Em lagos a variabilidade espacial é geralmente investigada em pontos de coleta distintos tanto à superfície quanto à profundidade Variação diurna em lagos é objeto de estudo e portanto não é feita composição de amostras como é o caso normalmente de efluentes Coletas em profundidades específicas podem ser realizadas com auxílio de amostradores do tipo Van Dorn ou Kemmerer O bombeamento normalmente utilizado para amostrar águas subterrâneas também pode ser adotado na coleta em profundidade em lagos e grandes rios Para a coleta de água de chuva coletores devem ser instalados em pontos estratégicos e as amostras devem ser coletadas após um período de precipitação Em geral determinase deposição atmosférica chuva poeira cinza etc Exceção ocorre com amostradores modernos que são capazes de se manter fechados e abrr apenas com as primeiras gotas de chuva Tomar os cuidados necessários na coleta de material tóxico volátil ou inflamável Nesses casos utilizar equipamentos de segurança tais como luvas máscaras e óculos durante o manuseio da amostra Nunca fumar durante a operação 3 ACONDICIONAMENTO DE AMOSTRAS TIPOS E PROCEDIMENTOS DE LIMPEZA Os tipos de frasco mais freqüentemente utilizados são os de vidro de borossilicato ou os plásticos inertes e de preferência escuros e resistentes a álcalis Tampas plásticas rosqueáveis constituemse na melhor forma de vedação As tampas de borracha podem se desintegrar ou liberar metaistraço quando na presença de solventes orgânicos e tampas de vidro não são adequadas para soluções alcalinas A Tabela 1 apresenta os frascos ideais para cada variável e o respectivo tipo de preservação recomendado Para a determinação de oxigênio dissolvido os frascos do tipo DBO claros ou escuros são os recomendados para o método de Winkler APHA 1992 Os frascos a serem utilizados devem estar rigorosamente limpos e sempre vedados Para a determinação de coliformes lavar com detergente e água quente enxaguar com água quente e depois com água destilada esterilizar por no mínimo 60 min a 170ºC vidro ou em autoclave a 121ºC por 15 min plástico e vidro Para a determinação de metais utilizar detergentes apropriados p ex Extran e enxaguar com água destilada Os frascos mais indicados são os de polietileno Nalgene ou similar que geralmente apresentam baixa contaminação por íons metálicos Deixar pelo menos 24 h em ácido nítrico pa a 10 vv ou ácido clorídrico pa a 10 vv e enxaguar novamente com água bidestilada Para a determinação de formas de fósforo e de compostos nitrogenados amônia nitrato nitrito e nitrogênio total utilizar detergentes apropriados Extran ou similar e enxaguar com água destilada deixar por algum tempo em ácido clorídrico pa a 10 vv e enxaguar novamente com água desionizada Não utilizar detergentes que contenham fósforo em sua fórmula Na determinação de pesticidas lavar os frascos com detergente apropriado e enxaguar com água desionizada seguido de acetona e finalmente com hexano de alta pureza Para determinação de carbono orgânico o ideal é que o frasco de vidro seja aquecido a 550ºC e mantido vedado com Parafilm para isolar o líquido da tampa se essa for de borracha Para o restante das determinações lavar os frascos com detergente e enxaguálos com bastante água destilada Deixar por algum tempo 24 h em ácido clorídrico pa a 10 vv ou ácido nítrico pa a 10 vv e enxaguar novamente com bastante água destilada e desionizada 4 PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS Técnicas de preservação são utilizadas para retardar as ações biológicas e a hidrólise de compostos químicos e reduzir a volatilidade que continuam a ocorrer após a coleta das amostras Entretanto é importante ter em mente que a completa estabilidade dificilmente será alcançada O tempo máximo permitido entre a coleta de uma amostra e sua análise depende da variável a ser determinada da característica da amostra e das condições de armazenamento Quanto menor for o tempo tanto menor será o risco de alterações O armazenamento de amostras no escuro e em baixa temperatura gelo em cubos ajuda a evitar o crescimento de microrganismos Certas características não são estáveis e portanto devem ser determinadas imediatamente como temperatura da água e gases dissolvidos O ideal é que as amostras sejam mantidas refrigeradas e que as determinações sejam efetuadas o mais brevemente possível Caso a preservação seja inevitável escolher o método mais adequado às determinações que serão realizadas Tabela 1 Usar preservativos químicos somente quando houver certeza de que não haverá interferência nas determinações previstas Íons metálicos podem ser adsorvidos na parede do frasco sofrer precipitação ou oxidação p ex Fe2 Mn2 Esses processos podem ser minimizados por acidificação do meio com ácido nítrico até pH 20 10 mL de HNO3 pa concentrado em 1 L de água Para material em suspensão não existe método de preservação ideal Assim manter as amostras refrigeradas e analisar o mais rapidamente possível Para determinação de carbono orgânico preservar com cloreto de mercúrio pa a 2 mv na proporção de 01 mL para 10 mL de amostra ou acidificar com ácido fosfórico pa a 10 vv ou ácido sulfúrico pa a 10 vv até reduzir o pH 20 TABELA 1 Tipo de frasco e modo e tempo máximo de preservação para algumas características selecionadas CARACTERÍSTICA FRASCO PRESERVAÇÃO ARMAZENAGEM Acidez P V Refrigerar 24 h Alcalinidade P Refrigerar 24 h Alumínio P Refrigerar 28 d Amônia P V Congelar 28 d Boro P Refrigerar 28 d Carbono orgânico total V Refrigerar acidificar 28 d Cloro residual P V Analisar imediatamente Cloreto P V Refrigerar 28 d Clorofila P V Congelar filtros 30 d no escuro Coliformes P V Refrigerar 24 h Condutividade P V Refrigerar 28 d Cor P V Refrigerar 48 h DBO P V Refrigerar 24 h DQO P V Refrigerar acidificar 24 h Dureza P V Refrigerar acidificar 180 d Fósforo solúvel V Congelar 28 d Fósforo total V RefrigAcid 28 d MetaisCa Mg Na K Cu Zn Mn Fe Ni Hg P V Refrigerar acidificar 28 d Nitrato P V Congelar 28 d Nitrito P V Congelar 28 d Nitrogênio Kjeldahl P V Refrigerar acidificar 28 d Odor V Analisar imediatamente O2 dissolvido Winkler V DBO Fixar 24 h Pesticidas V Congelar 7 d PH P V Analisar imediatamente Sílica solúvel P Refrigerar 28 d Sólidos suspensos P V Refrigerar 7 d Sulfato P V Congelar 28 d Turbidez P V Refrigerar 24 h P plástico V vidro V DBO frasco de DBO DBO Demanda biológica de oxigênio DQO Demanda química de oxigênio Fonte APHA 1992 Os filtros para determinação de clorofila deverão ser mantidos no escuro congelados e na presença de sílicagel Amostras para determinação de sílica não devem ser congeladas Mantêlas sob refrigeração e analisar o mais rapidamente possível Para a determinação de compostos nitrogenados e fósforo dissolvido congelar a amostra imediatamente após a filtragem A acidificação pode ser aceita em alguns casos desde que não interfira nas determinações 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION AMERICAN WATER WORKERS ASSOCIATION WATER ENVIRONMENTAL ASSOCIATION USA Standard methods for the examination of water and waste water Washington 1992 1100p BARTZ HR coord Recomendações de adubação e de calagem para os estados do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina 3 ed Passo Fundo SBCSNúcleo Regional Sul 1995 224 p DEPOLLI H coord Manual de adubação para o estado do Rio de Janeiro Itaguaí Rio de Janeiro Universidade Rural 1988 179 p FERREIRA ME CRUZ MCP Amostragem de solo para avaliação da sua fertilidade Jaboticabal UNESPFCAV 1988 21 p GOTHERMAN HL CLYMO RS OHNSTAD MAM Methods for physical and chemical analysis of fresh water Osney Mead Blackwell Sci 1978 216 p IBP Handbooks n8 CAPÍTULO 3 TECIDOS VEGETAIS Alaíde Soares de Oliveira1 Ana Rita de Araujo Nogueira2 Ciríaca A F de Santana do Carmo3 coordenadora Décio Gomes de Almeida4 Francisco Duarte Fernandes4 Gilson Villaça Exel Pitta5 Gonçalo Mourão Carlos4 Henrique de Oliveira6 João Batista Mamão1 Maria José Aguirre Armelin7 Marcelo Francisco C Saldanha3 Mário Miyazawa8 Shirlei Scramin9 Washington de Oliveira Barreto3 Yolanda A Rufini10 1 INTRODUÇÃO A análise química de tecido vegetal consiste na determinação de teores dos elementos principalmente em folhas resultando em diagnóstico do estado nutricional da planta que irá permitir por sua vez avaliação complementar das condições da fertilidade do solo Esse diagnóstico refletirá os efeitos da interação soloplantaclima e também do manejo constituindose ferramenta importante no estabelecimento de um programa racional de adubação que permita o adequado suprimento de nutrientes No entanto para diagnóstico mais seguro devese levar em conta a variação quantitativa dos elementos nos tecidos vegetais Os fatores que influenciam a concentração dos elementos são os seguintes fatores inerentes à planta espécie portaenxerto idade fisiológica sistema radicular fatores inerentes às condições ambientais tipo de solo clima relevo drenagem manejo e fatores inerentes à interação dos fatores citados como por exemplo estado fitossanitário A desconsideração desses fatores pode acarretar erros na interpretação dos resultados das análises com possíveis conseqüências negativas na orientação da adubação a ser empregada É oportuno observar que dentre todas as operações analíticas a etapa de pré tratamento das amostra é a mais crítica Em geral é nessa etapa que se cometem mais erros e que se gasta mais tempo Por isso os passos do procedimento de prétratamento de amostras deverão ser sempre considerados cuidadosamente 1Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 2Embrapa Pecuária Sudeste 3Embrapa Solos 4Embrapa Cerrados 5Embrapa Milho e Sorgo 5Embrapa Agropecuária Oeste 6Embrapa Pantanal 7Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN 8Instituto Agronômico do Paraná IAPAR 9Embrapa Meio Ambiente 10Centro de Energia Nuclear na Agricultura CENAUSP 2 AMOSTRAGEM O princípio básico de amostragem consiste na seleção de partes da planta normalmente folhas que apresentem maior estabilidade possível em relação aos fatores que influenciam sua composição Além disso essas partes devem apresentar alta sensibilidade quanto a variações de composição decorrentes de tratamentos experimentais ou de práticas de manejo da cultura As amostras devem ser colhidas quando as culturas estiverem apresentando seu maior crescimento vegetativo antes de atingirem o florescimento A época adequada de coleta varia de cultura para cultura A parte da planta requerida para amostragem também é de grande importância pois há diferenças no teor de nutrientes entre folhas caules e raízes No caso de determinações para pesquisa recomendase analisar a planta separadamente raiz caule e folhas As folhas recémmaduras são os órgãos que melhor representam o estado nutricional da planta uma vez que são o centro dos processos metabólicos e refletem bem a composição e as mudanças na nutrição Devese levar em consideração a época do ano em que será coletada a posição da folha no vegetal e o número de folhas por planta e por área Devese também tomar as seguintes precauções não misturar folhas de variedades ou de espécies não misturar amostras de plantas que apresentem visualmente sintomas de deficiência nutricional com aquelas de plantas de aparência normal não misturar em nenhum caso folhas com idade fisiológica diferente no caso de plantas perenes não colocar na mesma amostra folhas de ramos produtivos e folhas de ramos vegetativos no caso de plantas perenes enxertadas não misturar folhas de plantas que tenham copa ou portaenxerto diferentes coletar folhas livres de doenças de insetos e de danos mecânicos evitar a mistura na mesma amostra de folhas de plantas que não representem a condição média da lavoura ou do pomar evitar a coleta de amostras de folhas logo após adubação no solo ou foliar eou pulverizações com defensivos e evitar amostras de plantas próximas de estradas ou de carreadores A fim de ilustrar este documento a Tabela 1 apresenta o número a parte da planta e o tipo de folhas que devem ser coletados para a análise assim como a época de amostragem de acordo com a cultura Tabela 1 Procedimento de amostragem para diagnose foliar em diversas culturas Cultura Parte da planta Idade época posição da folha N0 de folhas e n0 de plantas Abacateiro Limbo 3 ou 4 m da brotação da primavera 4 folhas por árvore nos 4 pontos cardeais 25 árvores Abacaxi Folha D inteira No florescimento 1 folha por planta amostra de 50 plantas Aipo Pecíolo Folha mais nova completamente desenvolvida metade do ciclo vegetativo plantas com 25 e 35 cm 1 por planta amostra de 50 plantas Alface Nervura mediana da folha envolvente No aparecimento da cabeça 1 por planta amostra de 50 plantas Alfafa Seção média da haste No florescimento Amostra de 50 plantas Algodão Limbo Da 5a folha a partir do ápice da haste principal no florescimento 1a folha é aquela completamente aberta 1 por planta amostras de 30 plantas Ameixeira Folha com pecíolo Da parte média do ramo do ano situado à altura média da planta no florescimento 4 a 8 folhas por árvore nos pontos cardeais amostras de 25 árvores Amendoim Folha com pecíolo Do 40 ráquis do ramo principal a partir da base sem contar os ramos cotiledonares 1 por planta amostras de 50 plantas Amoreira Limbo Da 1a folha adulta abaixo do ponto de crescimento na época da colheita 2 folhas por planta amostras de 50 plantas Arroz Toda parte aérea 30 dias após a germinação Amostras de 20 plantas Aspargo Ramos No outono 30 cm superiores dos ramos eliminandose a haste Amostras de 25 plantas Aveia Limbo Das 4 primeiras folhas a partir do ápice no florescimento Amostras de 50 plantas Bananeira Folha 10 cm centrais da 3a folha a partir do ápice eliminandose a nervura central na época de emissão da inflorescência 1 folha por planta amostras de 25 plantas Batata Folíolo Da 3a folha a partir do tufo apical aos 30 50 e 70 dias Amostras de 30 plantas Beterraba Limbo A partir da coroa intermediária na metade do ciclo Amostras de 50 plantas Continua Cultura Parte da planta Idade época posição da folha N0 de folhas e n0 de plantas Brócoli Nervura central de folhas externas No início da formação da cabeça Amostras de 50 plantas Cafeeiro Folha com pecíolo 30 par a partir do ápice dos ramos da altura média da planta no verão 4 folhas por planta nos pontos cardeais amostras de 25 plantas Canade açúcar Folhas 20 cm centrais da folha 3 excluída a nervura central aos 9 meses de idade obs para cana de ano a amostragem é feita aos 45 meses de idade 1 por planta amostras de 100 plantas Cenoura Limbo ou toda a parte aérea Das 4 primeiras folhas a partir do ápice no florescimento Amostras de 50 plantas Couvede bruxelas Folhas sem pecíolo Folhas mais novas plenamente desenvolvidas no verão Amostras de 50 plantas Couveflor Nervura central das folhas externas No início da formação da cabeça Amostras de 50 plantas Chá Folhas 2a folha a partir do ápice dos ramos não lignificados de maio a junho 4 folhas por planta amostras de 25 plantas Citros Folha com pecíolo Folhas geradas na primavera com 6 meses de idade nos ramos com frutos 4 folhas por árvore nos pontos cardeais amostras de 25 árvores Ervilha Limbo ou pecíolo Do 3o nó a partir do ápice quando a planta estiver com 8 a 9 nós Amostras de 50 plantas Feijoeiro Folhas Todas as folhas no florescimento Amostras de 10 plantas Fumo Folhas 4a e 6a folhas acima da base no florescimento Amostras de 30 plantas Macieira Folhas com pecíolo Do ramo do ano no florescimento 4 a 8 folhas por árvore nos pontos cardeais na altura média da planta amostras de 25 árvores Mandioca Limbo folíolo Da folha que faz um ângulo de 900 com o caule aproximadamente a 1a folha a partir do ápice da haste principal A 1a coleta quando a planta tiver 13 de sua altura a 2a após a ramificação sobre os ramos primários e a 3a coleta é feita sobre os ramos secundários Amostras de 30 plantas por época Mangueira Folha com pecíolo Da parte média dos ramos do último ano na altura média das plantas no florescimento 4 folhas por árvores nos pontos cardeais amostras de 25 árvores Continua Cultura Parte da planta Idade época posição da folha N0 de folhas e n0 de plantas Milho Folha Colher o terço médio na folha 4 a partir do ápice excluída a nervura central na idade de 9 semanas folha 1 é aquela em que a inserção da bainha com o colmo é visível Amostras de 30 plantas Morangueiro Limbo Das 3as folhas a partir do ápice no florescimento 1 folha por planta amostras de 50 plantas Nogueira pecã Folíolo Um par da parte média da folha com ráquis que aparece nos ramos terminais 6 a 8 semanas após o florescimento 4 partes por árvore nos pontos cardeais na altura média da planta amostras de 25 plantas Pastagens gramíneas de várias espécies Porção da parte aérea retirada pelo gado no pastejo No verão Amostra de aproximadamente 200 g de material fresco Pereira e pessegueiro Folhas com pecíolo Dos ramos do ano no florescimento 4 a 8 folhas nos pontos cardeais na altura média da planta amostras de 25 plantas Pinheiro Folhas agulha Dos ramos do último ano no verão 10 folhas por árvore amostras de 30 árvores Repolho Nervura central da folha externa envolvente No início da formação da cabeça Amostras de 50 folhas Seringueira Folhas sem pecíolo Árvores de até 4 anos 2 folhas da base de um buquê terminal situado no exterior da copa e em plena luz Essas folhas têm de 4 a 6 meses Árvores com mais de 4 anos 4 folhas da base no mesmo buquê Essas folhas devem ter de 10 a 12 meses Amostras de 25 árvores Soja Folha com pecíolo 3as folhas no florescimento Amostras de 30 plantas Sorgo Folha 30 cm do terço médio da folha 4 a partir do ápice excluída a nervura central na idade de 9 semanas Amostras de 30 plantas Tomate Folhas sem pecíolo 1a abaixo do 20 cacho floral na época da sua emissão Amostras de 30 plantas Trigo Limbo ou toda a parte aérea Das 4 primeiras folhas a partir do ápice no florescimento Amostras de 50 plantas Videira Limbo Da 6a folha a partir do ápice no florescimento 1 folha por planta amostra de 25 plantas Fontes TRANNI et al 1983 MILLS JONES JUNIOR 1996 3 PROCEDIMENTO PARA COLETA DE AMOSTRAS DE FOLHAS NO CAMPO O procedimento para coleta de amostras de folhas é semelhante àquele descrito para amostragem de solo caminhamento em ziguezague caminhamento em x e caminhamento em nível As subamostras que formarão a amostra composta devem ter número aproximadamente igual de folhas 31 COLETA DA AMOSTRA O ideal é que a amostra chegue ao laboratório ainda verde no máximo 2 dias após a coleta Entretanto caso não seja possível e para evitar o desenvolvimento de agentes patogênicos eou saprófitas recomendase a lavagem somente das folhas verdes e vigorosas com água corrente e posteriormente com água destilada Em seguida devem ser colocadas em sacos de papel para secar em estufa de circulação forçada de ar em temperatura que não exceda 65C até massa constante No caso de contaminação com terra poeira eou resíduos de pulverização foliar essa lavagem deverá ser realizada com solução de detergente neutro isento dos macronutrientes e dos micronutrientes minerais normalmente determinados nos extratos de tecidos vegetais e o material deverá ser enxaguado várias vezes com água destilada eou desionizada Esse procedimento deve ser realizado antes que as folhas murchem O envio das amostras ao laboratório deve ser feito em sacos de papel comum ou de pano algodão ou em embalagem fornecida pelo laboratório No caso de determinação de boro utilizar papel encerado pois o papel comum contamina a amostra com o elemento Identificar a amostra e preencher o formulário indicando quais os elementos a serem determinados 32 IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA A amostra deve ser identificada no laboratório com breve descrição número de entrada no laboratório nome da cultura nome do coletor local e data da coleta elementos a serem determinados e endereço para o envio dos resultados Informações complementares como temperatura e hora de amostragem também podem constar pois são importantes para análise e interpretação dos resultados 33 MOAGEM A moagem deve ser realizada em moinho de aço inoxidável de bancada moinho de facas do tipo Willey com peneira de cerca de 1 mm 20 a 40 mesh O moinho deve estar limpo e seco Homogeneizar bem a amostra e moer quantidade suficiente para a análise A maioria dos métodos de determinação utiliza entre 05 e 30 g de material moído Material mais fino utiliza amostras na faixa de 05 a 10 g No caso de materiais ricos em óleos ou resinas sugerese maceração em gral Amostras que envolvam grande volume de massa verde 2 kg devem ser trituradas em partículas de 1 a 2 cm de comprimento com picadeiras ou facas de aço inoxidável antes da secagem misturadas uniformemente e então subdivididas 34 ARMAZENAGEM A amostra depois de seca moída e homogeneizada deverá ser acondicionada em frasco limpo e seco podendo ser de vidro policarbonato ou polietileno com tampa plástica hermética A amostra assim acondicionada deverá ser guardada em local fresco e seco ao abrigo da luz Para determinação de elementos voláteis condições especiais de armazenagem deverão ser observadas 35 INTEGRIDADE DA AMOSTRA A integridade da amostra deverá ser preservada por meio de procedimentos adequados de custódia manuseio identificação e acondicionamento desde a coleta no campo até a recepção no laboratório Quando as amostras são recebidas no laboratório devese verificar os seguintes itens danos físicos causados por embalagem e proteção inadequadas perda de amostra por vedação imprópria ou inadequada contaminações possíveis p ex misturas de amostras de diversas origens condições inadequadas de preservação para o transporte p ex temperatura adição de preservativos e alta umidade possíveis efeitos de contaminação por insetos ou microrganismos estabilidade da amostra ou seja o tempo decorrido entre a coleta e a recepção no laboratório A umidade poderá afetar a qualidade da amostra durante a estocagem 36 PROBLEMAS DE CONTAMINAÇÃO O conhecimento das prováveis causas de contaminação é essencial para aumentar a eficiência de um programa de análise de plantas especialmente para determinação de micronutrientes As estufas de secagem devem ser construídas em aço inoxidável e pintadas com tinta epóxi de boa qualidade bandejas galvanizadas não devem ser utilizadas por causa da provável contaminação com zinco Evitar a introdução sistemática ou acidental de elementos estranhos durante as várias operações analíticas Sempre que possível os reagentes devem ser armazenados em frascos de polietileno Para a lavagem da vidraria devem ser utilizados detergentes apropriados e os frascos devem ser enxaguados com água destilada e desionizada Deixar os frascos pelo menos 24 h em ácido nítrico pa a 10 vv ou ácido clorídrico pa a 10 vv e enxaguar novamente com água desionizada 37 ARQUIVO DE AMOSTRAS Após a realização das determinações as amostras devem permanecer arquivadas por um certo período para futuros estudos de confiabilidade 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CHAPMAN HD PRATT PF Methods of Analysis for Soils Plants and Waters Riverside University of California 1961 305 p MILLS HA JONES JR JB Plant Analysis Handbook MicroMacro Publishing Inc 1996 422p MALAVOLTA E VITTI GC OLIVEIRA SA Avaliação do Estado Nutricional das Plantas Princípios e Aplicações Piracicaba Associação Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato 1989 201p MARKET B Sample preparation cleaning drying homogenization for trace element in plant matrices Science Total Enviromental Brussels v176 p4561 1995 QUEVAUVILLER P Conclusions of the Workshop improvements of trace element determination in plant matrices Science Total Enviromental Brussels v176 p141 148 1995 TEDESCO MJ VOLKWEISS SJ BOHNEN H Análise de solo plantas e outros materiais Porto Alegre Faculdade de Agronomia UFRGS 1985 188 p Boletim Técnico de Solos 5 TRANI PE HIROCE R BATAGLIA OC Análise foliar amostragem e interpretação Campinas Cargill 1983 18p CAPÍTULO 4 TECIDOS E PRODUTOS ANIMAIS Armando de Andrade Rodrigues1 Francisco Duarte Fernandes2 Geraldo Maria da Cruz1 Gilberto Batista de Souza1 Gustavo Eugênio Gerhard Barocas3 Hernani Guilherme Barbosa Filho4 Izabela Miranda Castro5 José Roberto Ferreira4 coordenador Marcelo Bastos Chaves5 Mônica Martini6 1 INTRODUÇÃO Além da escolha conveniente do método analítico e do estudo dos possíveis interferentes tornase essencial boa amostragem boa preparação e boa solubilização da amostra para análise Qualquer que seja o tipo de amostra erros significativos poderão ser introduzidos se a etapa de preparação não for satisfatoriamente conduzida PERSTORP ANALYTICAL TECATOR 1995 A amostragem é a primeira fase da análise É preciso haver integração dos responsáveis pela coleta e do laboratório buscandose sincronismo entre a remessa de amostras e a capacidade do laboratório para executar as determinações SILVA QUEROZ 2002 Este capítulo trata da preparação dos seguintes tipos de amostras planta forrageira feno silagem alimentos concentrados fezes ossos pêlos extrusa fígado sangue urina líquidos de rúmen de íleo e de abomaso e leite Em alguns casos é necessário reduzir consideravelmente a dimensão da amostra antes que ela seja introduzida no sistema analítico e possa ser tratada convenientemente BRUNO et al 1995 Para isso algumas etapas são importantes como a secagem a moagem e suas subdivisões O método de preparação utilizado dependerá do tipo de amostra O material coletado deve ser preparado em local apropriado e equipado para essa finalidade Normalmente a atividade de preparação inclui o recebimento o registro o préacondicionamento a secagem a moagem o acondicionamento e a rotulagem das amostras 1Embrapa Pecuária Sudeste 2Embrapa Cerrados 3Embrapa Gado de Corte 4Embrapa Gado de Leite 5Embrapa Agroindústria de Alimentos 6Coordenadoria de Defesa da Agricultura CDA 2 ASPECTOS IMPORTANTES RELACIONADOS À COLETA DE AMOSTRAS Alguns cuidados devem ser observados para garantir a integridade física e química do material coletado Evitar a coleta de amostras sujas de terra ou com excesso de água Identificar devidamente com letras legíveis o recipiente saco de papel saco plástico pote plástico frasco etc que receberá a amostra Cuidado especial deve ser tomado com as amostras que serão armazenadas em baixa temperatura Em muitos casos a identificação tornase ilegível durante o processo de descongelamento Garantir que utensílios embalagens e ferramentas empregados na coleta e no transporte não contaminem a amostra para isso levar em consideração as determinações que serão realizadas Por exemplo se de uma planta pretendese determinar o teor de ferro a ferramenta utilizada para retirar a amostra não deve ter sido confeccionada com esse elemento Em amostras provenientes de experimentos conduzidos em casa de vegetação esse tipo de cuidado deve ser redobrado Documentar cada etapa da coleta incluindo eventos não esperados p ex chuva Especificar todas as características relevantes da área as condições climáticas a população amostrada e as condições de transporte e de secagem A amostra deve ser encaminhada o mais rapidamente possível ao laboratório para que possa ser devidamente processada e armazenada A amostra que chegar ao laboratório sem as informações necessárias para o processamento e a análise deve ser recusada É necessário conhecer o tipo da amostra o que deve ser determinado e quem é o responsável por ela 3 OBJETIVO DA PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS A preparação visa principalmente SILVA QUEROZ 2002 AOAC 1990 BRUNO et al 1995 permitir o armazenamento de forma mais adequada e por período mais longo diminuir problemas relacionados à homogeneidade das amostras reduzir a dimensão da amostra facilitar o ataque dos reagentes durante o processo analítico mediante a diminuição do tamanho das partículas 4 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS 41 RECEBIMENTO As amostras aqui abordadas são plantas forrageiras feno silagem resíduos agrícolas ou agroindustriais e alimentos concentrados Com relação ao recebimento de amostras é importante ressaltar que São necessários no mínimo 15 g de material préseco 65ºC e moído para que se possa realizar as principais determinações em estudos de nutrição animal nitrogênio total matéria seca a 105ºC fibra em detergente neutro FDN fibra em detergente ácido FDA lignina digestibilidade in vitro da matéria seca matéria orgânica cinzas extrato etéreo energia bruta macroelementos e microelementos minerais Em experimentos que produzam pequena quantidade de amostras devem ser discriminadas as determinações necessárias com a quantidade de material possível de se obter Para determinação de pH ácidos graxos voláteis e nitrogênio amoniacal em silagem coletar de 1 a 2 kg de amostra A perda de umidade durante o transporte não terá grande importância desde que os resultados sejam dados apenas na matéria seca total No entanto em amostras provenientes de silagem a umidade é um bom indicador de sua qualidade devendose preservála Quando as determinações não forem realizadas imediatamente em amostras de forragens verdes fezes urina etc é necessário que as amostras sejam conservadas em baixa temperatura entre 18 e 20ºC As amostras de fezes são processadas praticamente da mesma maneira mas se diferenciam de outros tipos de amostras de origem animal e serão consideradas mais adiante 42 IDENTIFICAÇÃO E REGISTRO A identificação e o registro das amostras permitirão o rastreamento dos dados gerados possibilitando ao pesquisador ou ao cliente relacionar os códigos atribuídos pelo laboratório à identificação mais detalhada O mínimo que é preciso anotar na etapa de identificação e registro é SILVA QUEROZ 2002 AOAC 1990 BRUNO et al 1995 EMBRAPA 1996 nome do solicitante da análise data de coleta data de recebimento das amostras tipo de material determinações a serem realizadas númerocódigo de cada amostra documentação de informações relevantes 43 PRÉACONDICIONAMENTO Antes de concluir o processo de preparação das amostras elas são pré acondicionadas de diversas formas 431 AMOSTRAS DE ORIGEM VEGETAL São préacondicionadas em sacos de papel com capacidade para 3 kg Em cada saco que deverá estar identificado com o númerocódigo são colocados aproximadamente 150 g da amostra Para determinação de carboidratos solúveis ácidos graxos voláteis e nitrogênio amoniacal parte da amostra deverá ser separada identificada e imediatamente congelada encerrandose nessa etapa a preparação A amostra só será descongelada horas antes da determinação EMBRAPA 1996 432 AMOSTRA DE FEZES Para o préacondicionamento desse tipo de amostra empregamse recipientes retangulares de vidro do tipo fôrma doméstica colocandose em cada um aproximadamente 150 g da amostra Observação Quando solicitada a determinação da matéria seca ao ar ASA amostra seca em estufa a 65ºC com circulação forçada de ar é feita após o pré acondicionamento Nesse caso é necessário obter a massa exata da amostra que é colocada na bandeja ou recipiente de vidro As massas anotados serão utilizados para o cálculo da porcentagem de matéria seca ao ar ASA 44 PRÉSECAGEM A présecagem das amostras tem os seguintes objetivos facilitar o processo de moagem prolongar a conservação da amostra por meio da destruição de enzimas responsáveis pelo processo de decomposição JONES JUNIOR STEYN 1973 e da diminuição da atividade microbiológica facilitada pela umidade e permitir a determinação da ASA OBSERVAÇÕES 1 No caso de ser necessário o valor da porcentagem de matéria seca devese pesar a amostra antes e depois da présecagem 2 Amostras de plantas destinadas a determinações de macroelementos e microelementos minerais podem necessitar de descontaminação antes da présecagem em razão de poeira ou resíduos de pulverização no local da coleta dependendo dos elementos a serem determinados e das possibilidades de contaminação Se necessário lavar as amostras com solução de detergente neutro entre 01 e 03 vv e em seguida com água desionizada Esse procedimento deve ser rápido para se evitar perda de nutrientes durante a lavagem Se as amostras estiverem secas ou murchas é aconselhável não lavar com água 3 A secagem é feita em sacos de papel limpos em estufa com circulação de ar na temperatura de 65ºC por 48 h ou até massa constante SILVA QUEROZ 2002 BRUNO et al 1995 4 Para o caso de silagem a présecagem deve ser feita a 45ºC por 72 h 5 A carga de cada estufa deve ser definida de modo que a circulação interna de ar não seja prejudicada 6 Amostras de fezes que serão analisadas após secagem e moagem devem ser colocadas em bandejas limpas e secas a 65ºC durante 48 h ou até massa constante Amostras que serão analisadas frescas devem ser colocadas em sacos plásticos sendo então retirado o ar e congeladas até a sua manipulação 7 Determinações de vitamina C caroteno entre outras devem ser feitas na amostra fresca porque tais compostos podem ser perdidos ou alterados durante o processo de secagem 8 A présecagem é necessária quando a amostra possui alto teor de umidade 9 Após a secagem a bandeja ou o saco de papel é retirado da estufa e posto sob condições ambientais do laboratório por 24 h Esse tempo é necessário para que a umidade da amostra entre em equilíbrio com a umidade do ambiente e atinja massa constante 10 No caso de grãos o seguinte procedimento para controle de qualidade da matéria prima é adotado nas indústrias présecagem a 45ºC por 24 h em seguida o grão é triturado ou quebrado e colocado em estufa por 1 h a 130ºC para determinação da matéria seca 45 MOAGEM A moagem das amostras é feita em moinho de facas com peneiras de 1 mm sendo coletado apenas o que passa na peneira SILVA QUEROZ 2002 AOAC 1990 PERSTORP ANALYTICAL TECATOR 1995 EMBRAPA 1996 Toda superfície que tenha contato com a amostra deve ser de aço inoxidável A moagem deve ser realizada em amostras com elevado teor de matéria seca 80 Se a amostra for constituída de pó fino capaz de atravessar a peneira de 40 mesh bastará homogeneizála e reduzila com auxílio do quarteador à porção destinada para análise O procedimento a ser utilizado na moagem entre uma amostra e outra é o seguinte ao retirar a amostra abrir o moinho e limpar adequadamente seu interior não deixando material que possa contaminar a amostra seguinte fechar novamente o moinho colocando pequena quantidade da próxima amostra descartar essa quantidade moída colocar o restante do material coletando o material moído Para quantidades pequenas de amostra o melhor é empregar micromoinhos Não sendo possível aproveitar todo o material inclusive o que fica retido na peneira No caso de algumas amostras como de caroço de algodão é necessário usar moinho especial ou tratar a amostra HCl pa concentrado para facilitar a moagem 46 ACONDICIONAMENTO Após a moagem as amostras são acondicionadas em frascos com tampa com capacidade aproximada para 150 mL identificados com o númerocódigo JEFFERY et al 1992 FERREIRA GOMES 1995 Alguns cuidados devem ser tomados nessa fase Utilizar embalagem limpa e seca que garanta a não interação entre o ambiente e a amostra A embalagem deverá estar adequadamente rotulada O ideal é analisar as amostras logo após a moagem Não sendo possível armazenar em local fresco de preferência refrigerado e protegido da luz É necessário lavar as embalagens destinadas ao armazenamento levandose em conta os tipos de determinação a serem realizados No caso de se determinar macroelementos e microelementos além da lavagem com detergente neutro recomendase a lavagem com solução de HCl pa a 10 vv e em seguida com água desionizada Ao final do acondicionamento as amostras seguem para o laboratório acompanhadas de formulário de registro estando prontas para serem analisadas Quando se tratar de amostras de fezes que contenham marcadores como cromo ou cobalto procurar agrupar os tempos de coleta 1o grupo T0 Animal 1 T0 Animal 2 2o grupo T1 Animal 1 T1 Animal 2 etc Com isso minimizamse a contaminação entre as amostras ou seja processase primeiro as de baixa concentração indo em direção às de concentração mais alta Em todo o trabalho de preparo de amostra é recomendável o uso de luvas e máscara devem ficar imersos em solução de detergente com baixo teor de fosfato lavados com água corrente água desionizada e em seguida deixados em solução de HCl pa a 10 vv por no mínimo 24 h e a seguir lavados com água desionizada antes de serem utilizados 61 OSSO Para a coleta de amostras de osso é necessário a intervenção de um médico veterinário que fará a biópsia Todos os cuidados necessários à perfeita assepsia devem ser tomados evitandose contaminações A amostra retirada é imediatamente lavada com água desionizada e colocada em frasco identificado podendo ser congelada ou conservada em solução de formaldeído pa a 10 vv até ser utilizada A quantidade da solução de formaldeído contida no frasco deve ser suficiente para cobrir toda a amostra e esta deve ser mantida à temperatura de aproximadamente 15ºC EMBRAPA 1996 O preparo da amostra consiste na separação da camada cortical e da camada medular A limpeza da camada cortical utilizada para análise química é feita com bisturi e osteóstomo lavando sempre a amostra com água desionizada A amostra deve ser manipulada com pinça Caso haja necessidade de manuseio devese lavála com água desionizada não sendo aconselhável o uso de luvas cirúrgicas As luvas por conterem talco constituem grande fonte de contaminação EMBRAPA 1996 Atenção especial deve ser dada ao local onde se fará a limpeza evitandose sempre a proximidade de qualquer material que possa contaminar a amostra Para a determinação química de elementos a amostra de osso deve ser seca a 100ºC por 24 h desengordurada com éter de petróleo por 36 h e calcinada a 600ºC por 8 h Para a determinação da porcentagem de cinzas deve ser feita a pesagem da amostra seca a 100ºC antes e depois da calcinação Se for necessária a determinação da densidade da amostra de osso esta deve ser feita após a limpeza e antes da secagem e da extração da gordura 62 FÍGADO 621 BIÓPSIA Como no caso da obtenção de amostra de osso é necessária a presença de um médicoveterinário para a realização da amostragem de fígado A coleta é feita utilizandose trocáter O tecido hepático retirado é colocado em disco de papelfiltro para que o sangue seja absorvido O papelfiltro não deve ser retirado da embalagem muito antes para evitar contaminação A amostra obtida pode ser congelada imediatamente ou conservada totalmente imersa em solução de formaldeído pa a 10 vv e mantida em torno de 15ºC até ser analisada EMBRAPA 1996 622 NECRÓPSIA Para evitar contaminações a amostra de fígado deve ser coletada tão logo o abdome do animal seja aberto Cortar de 50 a 100 g do lobo direito tendose o cuidado de não tocar na porção do fígado a ser amostrada A amostra deve ser conservada em formaldeído ou congelada OBSERVAÇÕES Utilizando pinças e tesouras de aço inoxidável em local e com materiais bem limpos retirar a película ou o envoltório do fígado cápsula de Glisson e cortar em pedaços menores quando for o caso secando a amostra a 105ºC por 12 h Amostras maiores devem ser homogeneizadas por trituração em gral de ágata limpo e exclusivo para essa finalidade antes de serem pesadas para a realização das determinações Muitas amostras obtidas por meio de biópsia que possuem massa seca muito pequena podem ser pesadas para determinação diretamente após a secagem dispensando a etapa de trituração 63 SANGUE As amostras de sangue são coletadas diretamente dos animais por punção venosa na cauda ou na jugular com agulhas de calibre 18 ou maior para prevenir hemólise recolhendo a amostra em tubos de ensaio do tipo Vacutainer Esses tubos são comercializados esterilizados com vácuo e anticoagulante para o caso de obtenção de plasma No caso de determinação de zinco devese evitar as rolhas de borracha desses tubos pois podem ser fonte de contaminação Isso pode ser evitado substituindose as rolhas de borracha por Parafilm para tampar os tubos EMBRAPA 1996 Devese observar a temperatura da amostra e o tempo decorrido até a separação do plasma Para a determinação de elementos químicos o soro ou o plasma deve ser separado logo que possível após a coleta do sangue que deve ser mantido sob refrigeração p ex em água com gelo antes da separação Sob certas condições podese utilizar centrífuga portátil e pipetas automáticas 631 PLASMA Para a obtenção de plasma sangüíneo o tubo de coleta deve conter anticoagulante Tão logo o sangue seja coletado o tubo deve ser invertido cuidadosamente para que ocorra a mistura Na escolha do anticoagulante evitar aqueles que provocam hemólise ou que contaminem a amostra com o elemento a ser determinado Os mais recomendados são a solução de citrato de lítio pa a 20 mv na proporção de 01 mL por 10 mL de sangue ou o etilenodiaminotetracetato dissódico pa na proporção de 1 mg mL1 de sangue Centrifugar as amostras de sangue durante 12 min a 2500 rpm EMBRAPA 1996 Remover o plasma com pipetador automático com o cuidado de não aspirar as células e transferilo para outro tubo 632 SORO A coleta de soro é indicada em locais onde a refrigeração e a centrifugação não são possíveis até 24 h após a coleta da amostra Nesse caso não se utilizam anticoagulantes e o tubo da amostra é deixado em repouso para que ocorra a coagulação e a separação do soro Transferir o soro para outro tubo utilizando pipetador automático O sangue coagulado pode ser centrifugado para separação mais adequada 633 DESPROTEINIZAÇÃO A amostra isenta de proteína é utilizada para determinação de macroelementos para as determinações de microelementos parte do soro ou do plasma deve ser reservada antes da desproteinização Procedimento recomendável para a precipitação das proteínas é o de se adicionar 90 mL de solução a 10 mv de ácido tricloroacético TCA pa a 10 mL de soro ou plasma agitar durante 1 min deixar em repouso durante 10 min e filtrar Notese que esse filtrado representa a diluição de 110 da amostra de soro ou de plasma que a curva de calibração deve ser preparada com mesma proporção de TCA e que uma prova em branco filtrada deve ser preparada OBSERVAÇÕES De cada animal deve ser coletada quantidade de sangue suficiente para se obter volume de soro ou de plasma para as determinações desejadas Após a separação do soro ou do plasma as amostras devem ter coloração amarelada Coloração avermelhada indica que houve hemólise nesse caso a determinação de elementos químicos não é recomendada e devese então descartar a amostra Amostras de soro ou de plasma já desproteinizadas são mais estáveis e podem ser refrigeradas por até quatro semanas No entanto as amostras devem ser congeladas quando o período entre a coleta e a determinação for superior a esse período 64 LÍQUIDO DE RÚMEN Para esse tipo de amostra utilizamse animais com fístula de rúmen Em animais intactos utilizase sonda esofageana A fístula é aberta e com as mãos calçadas com luvas o material é retirado de diversas partes do rúmen e colocado em camadas de gaze limpa A gaze é espremida e o líquido filtrado é recolhido em recipiente adequadamente lavado Do filtrado parte é utilizada para medição do pH parte é utilizada para determinação de nitrogênio amoniacal com um pipetador automático são coletados 50 mL do líquido e colocados em tubo de ensaio com tampa identificado e que contenha 2 gotas de ácido sulfúrico pa a 50 vv no caso de se fazer a determinação do nitrogênio amoniacal imediatamente após a coleta não haverá necessidade de tratar a amostra com ácido sulfúrico o volume de líquido a ser coletado depende do teor de nitrogênio da amostra outra parte é utilizada para determinação de ácidos graxos voláteis são coletados 50 mL do líquido e colocados em tubo de ensaio com tampa identificado e que contenha 10 mL de ácido metafosfórico pa a 25 vv Os tubos com as amostras são congelados até momentos antes da análise 65 LÍQUIDOS DE ABOMASO E DE ÍLEO Para esse tipo de amostra utilizamse animais com fístula de abomaso ou de íleo A boca de um saco plástico é adaptada à saída da cânula O próprio movimento peristáltico ejeta a amostra que cai dentro do saco Coletase volume representativo em torno de 500 mL retirase o saco da cânula fechando sua boca e agitandoo para homogeneização do material Do conteúdo do saco são retirados aproximadamente 50 mL e colocados em um tubo de ensaio que deve ser imediatamente congelado Quando necessário é feita a amostragem composta de várias coletas Para formar a amostra composta as amostras são descongeladas e transferidas para um liqüidificador em que é feita a homogeneização Feita a homogeneização retiramse cerca de 50 mL que serão novamente congelados até momentos antes das determinações São essas amostras compostas que receberão o registro do laboratório 66 URINA A coleta de urina pode ser feita de machos ou de fêmeas sendo nesse último caso utilizada sonda do tipo Folley Quando se tratar de bovinos é utilizado o sistema de luvas prepuciais O sistema possui um dreno ligado a um recipiente plástico com capacidade para 15 a 20 L Para fixação do nitrogênio previamente são adicionados ao recipiente 50 mL de solução de ácido sulfúrico pa a 50 vv EMBRAPA 1996 Do volume obtido de um dia de coleta após agitação são retirados cerca de 20 mL colocados em tubos de ensaio e congelados para o armazenamento Quando a coleta é feita em ovinos não se usam as luvas prepuciais O animal fica contido em gaiola metabólica e a urina é coletada em baldes colocados sob o piso da gaiola Ao balde são adicionados 50 mL de solução de ácido sulfúrico pa a 50 vv Os demais passos são os mesmos descritos anteriormente OBSERVAÇÃO O procedimento descrito é apropriado para determinação de nitrogênio 67 EXTRUSA Designase como extrusa a amostra da dieta coletada via fístula esofágica Animais com fístula no esôfago têm sido amplamente utilizados para a obtenção de amostras da dieta selecionada por ruminantes em pastejo Para a coleta de amostras de extrusa o número de dias e de animais fistulados a serem utilizados varia de acordo com os objetivos da pesquisa Um mínimo de três dias de coleta com quatro animais é necessário para estimar as principais características qualitativas da dieta com razoável exatidão O seguinte procedimento é adotado para a coleta de amostra de extrusa os animais devem ser presos no curral na noite que antecede ao dia da coleta na manhã do dia da coleta retiramse as cânulas dos animais e colocamse as bolsas coletoras os animais são liberados para pastejarem durante 30 a 40 min após esse período de pastejo recolhese os animais ao curral e as amostras são retiradas das bolsas as amostras devidamente homogeneizadas são colocadas em sacos plásticos identificados e acondicionadas em caixa de isopor com gelo comum logo em seguida são transportadas e armazenadas em congelador A etapa de présecagem das amostras de extrusa sempre que possível deve ser feita em liofilizador freeze dryer com temperatura de 40ºC Quando não for possível a présecagem pode ser feita em estufa com ventilação forçada de ar à temperatura de 50ºC por no mínimo 48 h 68 LEITE A particularidade relevante desse tipo de amostra é o fato de ser muito perecível e o congelamento ser inviável por provocar alterações nos resultados das determinações Os frascos para coleta são preparados no laboratório É adicionada solução de dicromato de potássio pa a 125 mv de forma que a concentração de dicromato no leite seja de 1 mgmL1 AOAC 1990 Como existem frascos com capacidade variada o volume de solução de dicromato ou a sua concentração podem variar Após a adição da solução os frascos são colocados em estufa a 50ºC para evaporação de água e recristalização do dicromato Os frascos são retirados e tampados estando prontos para receberem as amostras de leite A coleta é feita da seguinte forma somente uma ordenha coletase o volume final da amostra duas ordenhas manhã e tarde a coleta é feita em volumes proporcionais à produção de leite ou ao intervalo de ordenha e três ordenhas manhã tarde e noite coletase 13 do volume final da amostra em cada ordenha Quando o leite é colocado no frasco é importante aguardar cerca de 20 min e agitar levemente Somente após esse tempo é que os cristais de dicromato de potássio se dissolvem Para que ele atue com eficiência conservando a amostra é necessário que esteja distribuído uniformemente na amostra 69 PÊLOS A amostra de pêlos deve ser coletada da região escapular e sacral colocada em saco plástico podendo permanecer à temperatura ambiente 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASSOCIAÇÃO NACIONAL DOS FABRICANTES DE RAÇÕES ANFAR Métodos analíticos de controle de alimentos para uso animal São Paulo 1992 208p ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS AOAC 15 ed Official methods of analysis Virginia 1990 1298p 2v BRUNO OA CASTRO H COMERÓN EA DIAZ MC GUAITA S GAGGIOTTI MC ROMEROLA Tecnicas de muestreo y parametros de calidad de los recursos forrajeros Argentina Publi 1995 14p INTA Estacion Experimental Agropecuaria Rafaela Publicacion 56 EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite Juiz de Fora MG Metodologias de análises Juiz de Fora 1996 FERREIRA JR GOMES JC Gerenciamento de laboratórios de análises químicas Viçosa Fundação Arthur Bernardes 1995 385p FICK KR DAYRELL M de S ROSA IV Métodos de análises de minerais em tecidos de animais e de plantas 2ed Gainesville University of Florida 1980 paginação irregular VOGEL A JEFFERY GH BASSETT J MENDHAM J DENNEY RC Vogel análise química quantitativa 5ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1992 712p JONES JR JB STEYN WJA Sampling handling and analyzing plant tissue samples In WALSH LM BEATON JD Soil testing and plant analysis Madison Soil Science Society of America 1973 p 249270 PERSTORP ANALYTICAL TECATOR Fiber determination using the Fibertec I M Systems 1995 8p Aplication Note AN 304 SILVA DJ QUEIROZ AC Análises de alimentos métodos químicos e biológicos Viçosa UFV 2002 235p CAPÍTULO 5 ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO Armando de Andrade Rodrigues1 Francisco Duarte Fernandes2 Geraldo Maria da Cruz1 Gilberto Batista de Souza1 Gustavo Eugênio Gerhard Barocas3 Hernani Guilherme Barbosa Filho4 Izabela Miranda Castro5 José Roberto Ferreira4 coordenador Marcelo Bastos Chaves5 Mônica Martini6 1 INTRODUÇÃO As amostras de alimentos podem ser coletadas nos locais de fabricação de preparo de depósito de acondicionamento de transporte e de venda Ponto crucial na análise de alimentos a amostragem tem como requisito essencial a mais ampla representatividade possível do lote de alimentos a ser analisado A exatidão analítica perde totalmente sua importância se a amostragem não for feita cuidadosamente e sob critérios precisos e racionais Os alimentos são muito variáveis em sua composição principalmente os alimentos frescos de origem vegetal Frutas e verduras da mesma variedade têm composição variável segundo as mudanças que podem ocorrer no período póscolheita como resultado de atividade fisiológica descontrolada Além disso os métodos de processamento de alimentos causam modificações adicionais na sua composição Os cuidados a serem tomados durante a amostragem e o preparo das amostras dependerão do grau e da extensão das variações naturais na composição dos alimentos frescos ou processados Por outro lado não somente ocorrem diferenças na composição entre frutas e verduras da mesma variedade mas também entre as várias partes da mesma fruta ou da mesma verdura Isso dependerá da anatomia e da fisiologia particulares do vegetal a ser analisado 1Embrapa Pecuária Sudeste 2Embrapa Cerrados 3Embrapa Gado de Corte 4Embrapa Gado de Leite 5Embrapa Agroindústria de Alimentos 6Coordenadoria de Defesa da Agricultura CDA Além disso diversos tipos de alimentos industrializados são constituídos de partes heterogêneas como sanduíches por exemplo e que não podem ser considerados como um todo Os processos de preparação envolvem diversas etapas como secagem moagem corte e dissolução Cada tipo de amostra irá determinar os processos mais indicados para sua preparação 2 OBJETIVO Neste capítulo são descritos os procedimentos relativos à amostragem para análise preparo e armazenagem de amostras de alimentos para consumo humano 3 FUNDAMENTO O método baseiase nos procedimentos adotados e recomendados na literatura sobre análise de alimentos e por órgãos oficiais de controle de alimentos JOSLYN 1970 NORMAS ANALÍTICAS DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ 1985 4 EQUIPAMENTOS blender com copos de aço de tamanho variado multiprocessador de alimentos congelador refrigerador facas e espátulas moinhos de martelo e de facas estufa de aquecimento com ventilação estufa de aquecimento a vácuo bandeja de aço ou alumínio frascos de vidro de boca larga com tampa plástica sacos de polietileno de alta densidade etiquetas autocolantes chapa de aquecimento com agitação 5 PROCEDIMENTOS 51 INSPEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA Observar antes de efetuar a solubilização se há qualquer anormalidade na amostra quanto a seu aspecto físico odor cor condições da embalagem original e manchas anotar na folha de resultados É importantíssimo que as amostras sejam identificadas com etiquetas em que estejam discriminados seu código de origem eou interno de laboratório sua procedência e eventuais precauções que se fizerem necessárias 52 SOLUBILIZAÇÃO DA AMOSTRA Dividir a amostra recebida pelo laboratório em duas partes aproximadamente iguais Uma das partes será usada na análise e a outra deverá ser guardada como contraprova A contraprova e a amostra para análise esta quando não for destinada para utilização imediata devem ser devidamente acondicionadas em recipientes adequados de acordo com o estado físico do produto para que as modificações químicas bioquímicas ou microbiológicas sejam as mínimas possíveis Amostras líquidas são acondicionadas em garrafas ou frascos com tampa hermética e amostras sólidas em sacos de polietileno ou frascos de vidro ou plástico As amostras destinadas à determinação microbiológica não deverão ser tocadas ou retiradas da embalagem original até que seja retirada a alíquota para aquela determinação 53 PREPARO DA AMOSTRA Para amostras em pó ou granuladas devese proceder ao quarteamento Retirar do todo da amostra porções representativas de vários pontos lado fundos centro etc Juntar as partes e moer em moinho de martelos até obter a menor granulometria possível para boa homogeneidade da amostra Para proceder a qualquer uma das determinações espalhar a amostra sobre uma folha de papelfiltro grande separar em quatro partes semelhantes na forma de cruz e devolver dois segmentos opostos ao frasco ou embalagem da amostra Com os outros dois segmentos juntar e repetir esse processo de quarteamento Usar dois segmentos opostos para pesar a amostra para análise em duplicata Amostras líquidas devem ser cuidadosamente homogeneizadas no frasco ou em chapa de agitação magnética Desgaseificar se for refrigerante por meio da agitação ou em banho de ultrasom Produtos cárneos devem ser separados de ossos pele couro e pêlos e moídos blender ou multiprocessadores até obter amostra finamente dividida Observação Fazer o quarteamento Produtos heterogêneos devem ser homogeneizados em blender liqüidificador ou multiprocessador Se for desejável a determinação em separado de cada uma das partes da amostra devese utilizar processo manual de separação Determinadas amostras podem necessitar de secagem antes das determinações em razão do alto teor de umidade que torna as concentrações dos componentes de interesse muito pequenas ou em razão da maior facilidade de execução de certas determinações na amostra seca Nesse caso muito aplicável a frutas hortaliças e polpas devese espalhar a amostra sobre uma bandeja de alumínio ou aço em tela se possível ou em vidro de relógio grande e colocar para secar em estufa com ventilação ou a vácuo a 45C Para a determinação de metais a temperatura máxima recomendada é de 40C Não se deve esquecer de determinar a umidade na amostra fresca para posterior cálculo das concentrações reais dos constituintes da amostra Após secagem proceder como para amostras granuladas moagem e quarteamento 54 CONSERVAÇÃO DA AMOSTRA Amostras de produtos altamente perecíveis se não forem usadas imediatamente devem ser armazenadas em freezer ou refrigerador até sua utilização obedecendo sua durabilidade nessas condições Antes de serem efetivamente utilizadas essas amostras devem ser descongeladas naturalmente até atingir a temperatura ambiente Produtos sujeitos a reações enzimáticas quando desintegradas por corte moagem maceragem etc não devem ser conservados nesse estado mesmo em baixas temperaturas Nesse caso é preferível conservar o alimento inteiro sem qualquer preparação deixando para fazêla imediatamente antes das determinações No processo de descongelamento devese tomar cuidado de evitar a perda da água congelada da amostra Amostras não facilmente perecíveis podem ser conservadas por algum tempo sem refrigeração mas devem estar fora do alcance de insetos e de condições ambientais prejudiciais como calor luz gases e poeira 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS NORMAS ANALÍTICAS DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ 3 ed São Paulo 1985 v1 JOSLYN MA MAYNARÁ A Methods in Food Analysis AP New York 1970 CAPÍTULO 6 MÉTODOS DE ANÁLISE DE SOLO Ana Cândida Primavesi1 Aluísio G de Andrade2 Bruno José Rodrigues Alves3 César de Rosso4 Edyr M Batista5 Hélio Teixeira Prates6 Fábio R Ortiz7 Jomar Mello7 Marcos Roberto Ferraz8 Nirceu W Linhares9 Pedro LO de A Machado2 coordenador Regina Moeller10 Rita de Cássia Souza Alves11 William Marra Silva12 1 INTRODUÇÃO O solo constitui um dos recursos naturais mais importantes sendo fundamental para a manutenção da vida de ecossistemas naturais e do sucesso de empreendimentos agropecuários e florestais Assim é imprescindível conhecer suas características e suas propriedades químicas e físicas Em continuação ao Capítulo 1 Coleta acondicionamento e preparo de amostras pretendese neste Capítulo descrever alguns dos principais métodos de análise de solos executados em algumas das unidades da Embrapa Grande parte dos procedimentos é rotina em várias instituições de ensino e de pesquisa do Brasil CAMARGO ET AL 1986 VAN RAIJ ET AL 1987 PAVAN ET AL 1992 TEDESCO ET AL 1997 O fato de constar neste manual não implica necessariamente que determinado método seja o procedimento ideal ou o procedimento padrão mas que ele é adotado pelos diversos laboratórios da Embrapa e que têm reconhecidas precisão e exatidão 1Embrapa Pecuária Sudeste 2Embrapa Solos 3Embrapa Agrobiologia 4Embrapa Meio Ambiente 5Embrapa Acre 6Embrapa Milho e Sorgo 7Embrapa Soja 8Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos USP 9Embrapa Cerrados 10Embrapa Amazônia Oriental 11Embrapa Roraima 12Embrapa Agropecuária Oeste 2 DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ DO SOLO 21 ACIDEZ ATIVA 211 PRINCÍPIO Baseiase na atividade hidrogeniônica da suspensão soloágua ou solosolução salina 212 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Potenciômetro 213 REAGENTES E SOLUÇÕES a Cloreto de potássio KCl 1 mol L1 pesar 149114 g 0001 g de KCl e levar com auxilio de funil e pisseta para balão volumétrico de 2 L Dissolver o sal e completar o volume com água destilada ou desionizada b Água desionizada c Cloreto de cálcio CaCl22H2O 001 mol L1 pesar 294 g 0001 g de CaCl22H2O e levar para béquer de 2 L de capacidade Adicionar aproximadamente 15 L de água destilada ou desionizada dissolver completamente o sal e medir o pH Caso o pH não esteja entre 55 e 65 ajustálo com CaOH2 a 01 ou HCl a 01 mol L1 Com auxílio de funil e pisseta transferir a solução para balão volumétrico de 2 L e completar o volume 214 PROCEDIMENTO Colocar 10 mL de terra fina seca ao ar TFSA em copo plástico de 50 mL de capacidade Adicionar ao copo plástico 25 mL de água destilada ou KCl a 1 mol L1 ou ainda CaCl22H2O a 001 mol L1 Agitar com bastão de vidro ou outro agitador disponível no laboratório por 5 min Deixar em repouso por tempo nunca inferior a 30 min e nem superior a 3 h Agitar novamente a amostra com o bastão e fazer a leitura em potenciômetro na suspensão imediatamente após essa segunda a agitação OBSERVAÇÕES 1 O pH determinado em solução de CaCl2 a 001 mol L1 apresenta as seguintes vantagens em relação ao pH determinado em água o pH nessa solução independe da época de amostragem do solo e é o que melhor reflete o grau de saturação de bases nos solos ácidos Além disso a relação solosolução tem menor efeito na concentração de H em solução 2 Ligar o potenciômetro pelo menos 30 min antes de ser utilizado ajustar a temperatura do aparelho para aquela da amostra e aferir o potenciômetro com as soluçõestampão de pH 70 e 40 3 Entre cada leitura recomendase lavar o eletrodo com água destilada utilizando pisseta 4 Durante a leitura a extremidade basal do eletrodo deve estar à meia altura dentro do frasco ou seja entre o fundo do frasco em que se conduz a medição e a superfície da suspensão solosolução 5 Devese ter o cuidado de não encostar o eletrodo no fundo do recipiente para evitar a danificação da membrana Nos períodos em que o potenciômetro não é utilizado os eletrodos devem ser mantidos mergulhados em água e o eletrodo de referência deve ser periodicamente carregado com solução saturada de KCl mantendo se sempre cristais do sal não dissolvido 22 ACIDEZ TROCÁVEL ALUMÍNIO TROCÁVEL 221 PRINCÍPIO Extração com KCl a 1 mol L1 e determinação por titulação com NaOH a 001 mol L1 222 MATERIAL E EQUIPAMENTOS a Cachimbo de 5 cm3 b Béquer com capacidade de 50 mL c Agitador mecânico ou mesa agitadora para frascos do tipo snapcap d Pipeta automática de 10 mL e Bureta de 20 mL graduada de 002 mL f Agitador magnético e barra magnética g Copos plásticos descartáveis ou erlenmeyer 50 mL 223 REAGENTES E SOLUÇÕES a Cloreto de potássio KCl 1 mol L1 pesar 7456 g de KCl seco em estufa a 60ºC dissolver em 800 mL de H20 destilada e completar o volume para 1 L b Soluçõestampão com pH 70 e pH 40 diluir conforme recomendação do fabricante o conteúdo de ampolas encontradas no comércio que contém as soluções tampão Manter as soluções em refrigerador c Azul de bromotimol pH 60 a 76 pesar 100 mg do reagente colocar em almofariz gral adicionar 16 mL de NaOH a 01 mol L1 triturar bem até que o todo fique verde transferir para balão de 100 mL e completar o volume com água destilada d Fenolftaleína a 01 dissolver 01 g do reagente em 60 mL de álcool etílico e completar o volume para 100 mL com água destilada e Solução de NaOH 1 mol L1 pesar 40 g de NaOH e dissolver em 1 L de água destilada Guardar em frasco de polietileno O fator da solução é determinado pela transferência para erlenmeyer de capacidade igual a 125 mL de 2 g de ftalato ácido de potássio KHC8H4O4 PM 20423 Em seguida adicionase 50 mL de água destilada e 4 gotas de fenolftaleína a 01 mv em etanol absoluto solução incolor e titulase com a solução de NaOH a 1 mol L1 O ponto final da titulação é indicado pelo aparecimento de coloração rósea A solução de NaOH deve ser fatorada semanalmente O cálculo do fator é o seguinte F mN x V x PM em que m massa em mg de ftalato ácido de potássio N normalidade da solução de NaOH V volume em mL de NaOH gasto na titulação e PM massa molecular do ftalato ácido de potássio f Solução de NaOH 001 mol L1 Transferir 10 mL da solução de NaOH a 1 mol L1 para balão volumétrico de 1L Completar o volume com água destilada 223 PROCEDIMENTO Extração medir 5 cm3 de TFSA e colocar em erlenmeyer de 125 mL adicionando 50 mL de KCl a 1 mol L1 Agitar por 5 min em agitador horizontal circular e deixar em repouso por uma noite 16 h Determinação transferir sem filtrar 10 mL do sobrenadante extrato obtido no item anterior transferir para copinhos plásticos descartáveis adicionar 10 mL de água destilada e 3 gotas do indicador azul de bromotimol Titular com solução 001 M de NaOH até aparecer coloração azul persistente Cálculo O teor de alumínio trocável na amostra é dado pela igualdade mmol dm3 de Al mL de NaOH a 001 mol L1 gastos com a amostra mL de NaOH a 001 mol L1 gastos com o branco x 10 OBSERVAÇÕES 1 A qualidade do KCl influencia sobremaneira o resultado na determinação do alumínio pois algumas marcas não tem o pH adequado em conseqüência de teores elevados de carbonatos portanto devese atentar para isso pois o pH deverá ser de 55 Caso o pH seja maior que 7 mesmo corrigindoo para 55 não teremos garantia de qualidade na análise 2 No caso de uso de agitador não é necessário agitar novamente a amostra para determinação de pH em CaCl22H2O a 001 mol L1 3 No caso de solos orgânicos há indicações de que ocorre liberação de H das frações orgânicas e que provavelmente com tais solos o resultado da análise de alumínio indica certa quantidade de hidrogênio Assim cuidados devem ser tomados no cálculo da necessidade de calagem com base no teor de alumínio trocável em solos orgânicos 23 ACIDEZ POTENCIAL OU TOTAL COM A SOLUÇÃO DE ACETATO DE CÁLCIO 231 PRINCÍPIO Baseiase na extração de H e Al3 adsorvidos principalmente na matéria orgânica com soluçãotampão forte como de acetato de cálcio CaCH3COO2 a 1 mol L1 em pH 70 e em seguida quantificados por titulometria com solução básica como de hidróxido de sódio NaOH 232 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Agitador mecânico 233 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de acetato de cálcio CaCH3COO2 H2O 10 mol L1 com pH 70 pesar 882 g de CaCH3COO2H2O e dissolver em cerca de 800 mL de água isenta de gás carbônico água destilada recémfervida e ajustar o pH com CH3COOH a 1 mol L1 ou CaOH2 a 1 mv Completar o volume para 1 L com água destilada b Solução de fenolftaleína C20H14O4 a 3 mv pesar 3 g do indicador fenolftaleína e dissolver em 100 mL de álcool etílico absoluto c Solução de hidróxido de sódio NaOH a 01 mol L1 pesar 4 g de NaOH transferir para frasco de 1 L e completar o volume com água destilada A padronização é feita de maneira idêntica ao procedimento para alumínio trocável Num béquer de 50 mL são pesados 04084 g de biftalato de potássio e dissolvidos em 20 mL de água destilada Adicionamse 2 a 3 gotas de fenolftaleína e titulase com solução 01 mol L1 de NaOH Para determinar o fator utilizar a fórmula descrita no procedimento referente ao alumínio trocável A padronização é feita semanalmente d Solução 0025 mol L1 de NaOH transferir 25 mL da solução com 1 mol L1 de NaOH transferir para balão aferido de 1 L e completar o volume com água desionizada 235 PROCEDIMENTO 1 Pesar 10 g 001 g e transferir para erlenmeyer de 250 mL de capacidade Adicionar 150 mL da solução de CaCH3COO2H2O a 1 mol L1 em pH 70 Tampar o frasco agitar por 60 min e deixar em repouso por uma noite No dia seguinte transferir 100 mL do sobrenadante por meio de pipeta para erlenmeyer de 250 mL adicionar 3 gotas de fenolftaleína a 3 e titular com NaOH a 01 mol L1 previamente padronizado até o aparecimento de coloração rósea persistente Anotar o volume gasto Va Fazer também prova em branco Vb Cálculos Considerandose que o rendimento médio da reação é de 90 e f o fator de correção da solução de NaOH H Al3 mmolcdm3 de TFSA Va Vb x 165 x f x 10 236 PROCEDIMENTO 2 Transferir 5 cm3 de terra para erlenmeyer de 125 ml Adicionar 100 ml de acetato de cálcio a 10 mol L1 em pH 70 Fechar com rolha de borracha e agitar durante 15 min a 220 rpm Manter os frascos fechados No dia seguinte transferir 50 ml do líquido sobrenadante Adicionar 3 gotas de fenolftaleína e titular com solução de NaOH a 0025 mol L1 até a viragem para cor rósea persistente Fazer prova em branco Cálculos H Al3 em mmolc dm3 Va VB x 10 OBSERVAÇÕES 1 O CaCH3COO2H2O é altamente higroscópico O sal deve ser armazenado em dessecador 2 A solução tampão CaCH3COO2H2O deverá ter o pH corrigido sempre que for utilizada 24 ACIDEZ POTENCIAL POR POTENCIOMETRIA EM SOLUÇÃOTAMPÃO SMP pH SMP 241 PRINCÍPIO Esta medição se baseia na diminuição causada pela acidez total H Al no pH da solução tampão com posterior correlação entre os valores de pH da soluçãotampão e de acidez total previamente determinados em vários solos representativos da região pelo método do acetato de cálcio 242 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Ver acidez ativa 243 REAGENTES E SOLUÇÕES Soluçãotampão SMP Shoemaker McLean Pratt transferir 1062 g de cloreto de cálcio CaCl2H2O 60 g de cromato de potássio K2CrO4 40 g de acetato de cálcio CaCH3CO22 e 5 mL de trietanolamina para béquer de 500 mL Adicionar 200 mL de água destilada Dissolver 36 g de pnitrofenol em cerca de 200 mL em béquer e aquecer Após a dissolução misturar as duas soluções em balão volumétrico de 1L completando com água destilada Deixar em repouso por um dia e ajustar o pH para 75 com NaOH ou HCl Transferir para recipiente plástico e agitar bem Guardar essa solução por 7 a 10 dias antes do uso agitando de vez em quando e depois ajustar novamente o pH 244 PROCEDIMENTO 1 Medir 10 mL de solo e transferir para copo plástico Adicionar 10 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro Deixar em repouso por 30 min agitar novamente e determinar o pH Adicionar 5 mL da soluçãotampão SMP e agitar com bastão de vidro Deixar em repouso por 20 min agitar novamente e determinar o pH Relacionar o valor do pH SMP com os teores de H Al3 no gráfico de correlação previamente montado 245 PROCEDIMENTO 2 Retomar a suspensão em que foi determinado o pH em CaCl22H2O a 001 mol L1 e adicionar exatamente 5 ml de soluçãotampão SMP Agitar por 15 min no agitador a 220 rpm e deixar em repouso por 1 h Calibrar o potenciômetro com os tampões 70 e 40 e fazer a leitura sem agitar a amostra OBSERVAÇÕES Devem ser feitas curvas de calibração entre o método do pH SMP e a titulação do H Al3 regionalmente com cerca de 100 amostras de solos representativos em que haja ampla variação de H Al3 extraídos pelo método do pH SMP e pelo método do acetato de cálcio a 1 mol L1 Detalhes sobre a metodologia para tal calibração podem ser obtidos em PEREIRA et al 1998 3 CARBONO ORGÂNICO 31 PROCEDIMENTO EMPREGANDO DICROMATO 311 PRINCÍPIO O procedimento consiste na oxidação do carbono orgânico a CO2 por íons dicromato em meio fortemente ácido A oxidação do carbono orgânico se baseia na seguinte reação 2Cr2O7 2 3C0 16H 4Cr3 3CO2 8H2O O dicromato reduzido é considerado como equivalente ao carbono orgânico existente na amostra de solo e o excesso de dicromato é titulado com íons Fe2 obtidos a partir de uma solução padronizada de sulfato ferroso amoniacal Na determinação por titulação o carbono orgânico é determinado pela diferença entre a quantidade de Fe2 gasta na titulação da prova em branco CrVI total adicionado e aquela gasta na titulação do dicromato que restou após a oxidação do carbono da amostra devendose enfatizar que este procedimento considera todo o carbono da matéria orgânica como estando presente no estado de oxidação zero RAIJ et al 2001 NELSON SOMMERS 1996 Esse método permite determinar a matéria orgânica ativa e facilmente decomponível no solo incluindo húmus e resíduos de plantas mas exclui carvão WALKLEY BLACK 1934 WALKLEY 1947 A oxidação do carbono da matéria orgânica não é completa razão pela qual é aplicado um fator de correção 133 Outro fator é utilizado 1724 para a conversão do teor decarbono orgânico para matéria orgânica baseado no pressuposto de que a matéria orgânica do solo contém 58 de C orgânico devendose esclarecer que atualmente outros fatores já foram propostos RAIJ et al 2001 312 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Capela para exaustão dos gases Balança analítica Erlenmeyer de 500 mL Bureta de 50 mL Proveta de 50 mL ou dispensador de 20 mL para H2SO4 Agitador magnético com barra de ímã Cachimbo de 1 cm3 Frasco do tipo snapcap de 100 mL Agitador horizontal circular Espectrofotômetro 313 REAGENTES E SOLUÇÕES a Ácido sulfúrico H2SO4 concentrado pa b Ácido fósforico H3PO4 concentrado pa a 85 c Fluoreto de sódio NaF ou sulfato de prata Ag2SO4 d Dicromato de potássio K2Cr2O7 0167 mol L1 pesar 4904 g de K2Cr2O7 seco em estufa por 2 h a 105ºC e dissolver em 1 L de água destilada e Indicador de difenilamina dissolver 05 g de difenilamina em 50 mL de H2SO4 concentrado pa f Indicador de ferroína usado em substituição ao indicador de difenilamina Pesar 1485 g de ortofenantrolina mono adicionar 0695 g de Fe2SO47H2O e completar o volume para 100 mL com água destilada g Sulfato ferroso amoniacal FeNH42SO426H2O 04 mol L1 pesar 157 g de FeNH42SO426H2O e dissolver em 800 mL de água destilada contendo 20 mL de H2SO4 concentrado e completar o volume para 1 L com água destilada Essa solução eve ser padronizada antes de sua utilização 1000 mL da solução K2Cr2O7 e demais reagentes porém sem o solo h Dicromato de sódio Na2Cr2O72H2O a 0667 mol L1 em H2SO4 a 5 mol L1 pesar 2000 g de Na2Cr2O72H2O e dissolver em 600 mL de água destilada acrescentar 280 mL de H2SO4 concentrado deixar esfriar e completar o volume para 1 L com água destilada i PROCEDIMENTO Procedimento 1 pesar 05 g de TFSA em erlenmeyer de 500 mL adicionar 10 mL de K2Cr2O7 a 1 mol L1 adicionar 20 mL de H2SO4 concentrado agitar levemente aguardar 30 min e adicionar 200 mL de água destilada acrescentar também 10 mL de H3PO4 concentrado e 02 g de NaF 5 gotas de difenilamina e titular com o FeNH42SO426H2O a 05 mol L1 até a viragem do cinzaazulado para verdeturvo Fazer prova em branco Procedimento 2 em erlenmeyer de 500 mL pesar 05 g de TFSA adicionar 10 mL de bicromato de potássio a 1 mol L1 adicionar 20 mL de H2SO4 concentrado Deixar em repouso por 30 min adicionar 200 mL de água destilada e 5 gotas de ferroína e titular com FeNH42SO426H2O a 05 mol L1 até a viragem para o verdeturvo Cálculos MO 1 TS x 103 em que T mL de FeNH42SO426H2O gastos na amostra S mL de FeNH42SO426H2O gastos no branco e 103 10 x 124000 x 1724 x 100005 sendo 10 normalidade do K2Cr2O7 05 massa de solo e 1724 fator de conversão do carbono em matéria orgânica Há também uma variante do método descrito nesta seção em que se substitui o K2Cr2O7 pelo Na2Cr2O7 em H2SO4 e a leitura é feita por colorimetria conforme descrito a seguir OBSERVAÇÕES A determinação do carbono orgânico em material de solo finamente moído em moinho de bola e o uso de sistema de refluxo durante a oxidação da matéria orgânica têm resultado em valores mais exatos 32 PROCEDIMENTO COLORIMÉTRICO 321 PRINCÍPIO Baseiase na medida de intensidade da coloração verde do íon CrIII resultante da oxidação do íon cromato pelo carbono orgânico QUAGGIO RAIJ 1979 Em função de sua maior solubilidade o dicromato de sódio é empregado em lugar do dicromato de potássio 322 PROCEDIMENTO Transferir 1 cm3 de terra para frasco cilíndrico de 100 mL Adicionar com dispensador 10 mL de Na2Cr207 a 0667 mol L1 em H2S04 a 5 mol L1 Agitar durante 10 min a no mínimo 180 rpm em aparelho de agitação com movimento circular horizontal Essa agitação é suficiente para promover a oxidação da matéria orgânica mesmo sem aquecimento Após repouso de 60 min adicionar 50 mL de água promovendo a mistura das soluções e deixar decantar durante a noite É importante adicionar a água e promover turbulência de maneira que a mistura dos líquidos seja otimizada No dia seguinte transferir o líquido sobrenadante para tubo de colorímetro com filtro de transmissão máxima de 650 nm Acertar o zero do aparelho com prova em branco completa A transferência da solução sobrenadante deve ser feita de maneira que não perturbe o resíduo de solo decantado Calcular os resultados a partir da curva de calibração preparada com solos analisados pelo método titulométrico OBSERVAÇÕES Para preparar a curva de calibração devese escolher solos com ampla variação no teor de matéria orgânica desde valores baixos em maior número até cerca de 200 g dm3 É realizada primeiramente a determinação pelo método do dicromato A seguir as mesmas amostras são submetidas ao procedimento colorimétrico sendo as leituras dadas em transmitância ou absorbância A partir desses resultados é montada uma tabela de conversão da leitura colorimétrica em função do teor de matéria orgânica proporcional Entretanto a linearidade geralmente não se verifica acima de 100 g kg1 de matéria orgânica Se os dados forem ajustados matematicamente por regressão devese dar atenção aos dados dos extremos principalmente aos teores muito baixos 4 FÓSFORO DISPONÍVEL E POTÁSSIO TROCÁVEL 41 MÉTODO DE MEHLICH 1 CAROLINA DO NORTE OU DO DUPLO ÁCIDO 411 PRINCÍPIO Baseiase na extração do fósforo e do potássio trocáveis de solos por troca iônica com solução de H2SO4 a 00125 mol L1 HCl a 005 mol L1 seguida de determinação das concentrações de fósforo por colorimetria e de potássio por fotometria de chama 412 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Agitador horizontal Fotômetro de chama Espectrofotômetro para leitura em 660 nm 413 REAGENTES E SOLUÇÕES a Soluçãoestoque de HCl a 25 mol L1 e H2SO4 a 0625 mol L1 em balão volumétrico de 1 L adicionar 207 mL de HCl pa d 119 e 347 mL de H2SO4 pa d 184 em aproximadamente 500 mL de água destilada Agitar bem e completar o volume b Solução de Mehlich em proveta diluir 200 mL da soluçãoestoque para 10 L de água destilada Esta solução contém H2SO4 a 00125 mol L1 e HCl a 005 mol L1 c Solução de molibdato de amônio em béquer de 500 mL pesar 2 g de subcarbonato de bismuto adicionar 500 mL de água destilada e em seguida adicionar 150 mL de H2SO4 concentrado pa Deixar esfriar e homogeneizar bem Noutro béquer pesar 20 g de molibdato de amônio pa adicionar 200 mL de água destilada e homogeneizar a solução Transferir as duas soluções para balão volumétrico de 1 L e completar o volume até a marca com água destilada solução A Em seguida transferir 300 mL da solução A para balão volumétrico de 1 L e completar o volume até a marca com água destilada Solução B d Soluções de calibração de fósforo pesar 04393 g 000001g de KH2PO4 seco em estufa a 120oC por uma noite e dissolver em balão volumétrico de 1 L de capacidade que já contenha cerca de 500 mL de água Adicionar ao balão 3 mL de H2SO4 concentrado agitar e aferir o balão Esta solução contém 100 mgdm3 de P A partir dessa solução preparar a curva de calibração nas seguintes concentrações 00 05 10 20 30 e 40 mgdm3 em solução de Mehlich e Soluções de calibração de potássio secar 3 g de KCl pa em mufla a 105ºC por 2 h e deixar esfriar em dessecador Em seguida transferir 1907 g do sal para frasco de 1 L e completar o volume com água destilada Esta solução contém 1000 mgdm3 de K Transferir 5 10 20 e 40 mL dessa solução para balões volumétricos de 1 L e completar o volume com solução de Mehlich Essas soluções contêm respectivamente 5 10 20 e 40 mg dm3 de K 414 PROCEDIMENTO Transferir 5 cm3 de solo para erlenmeyer de 125 mL de capacidade adicionar 50 mL de solução de Mehlich e agitar por 5 min em agitador horizontal Deixar por uma noite em repouso No dia seguinte transferir 20 mL do sobrenadante em copinhos plásticos semelhantes aos usados para cafezinho para a determinação do potássio e 5 mL em tubos de ensaio de 20 mL para a determinação do fósforo Determinação do potássio após ajuste do aparelho com as soluções de calibração de potássio levar o extrato separado para determinação do potássio em fotômetro de chama selecionando o filtro próprio Cálculo K mg dm3 leitura x fator de diluição x fator da curva de calibração Determinação do fósforo sobre 5 mL do extrato separado para a determinação do fósforo adicionar exatamente 10 mL da solução B e aproximadamente 30 mg de ácido ascórbico Agitar até dissolução e após 30 min fazer a leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 660 nm Fazer a leitura da curva de calibração de fósforo Cálculo mg dm3 de P leitura x fator de diluição x fator da curva de calibração O fator da curva de calibração é o coeficiente angular da reta obtida grafandose os valores de concentração de fósforo da curva de calibração na abscissa e as respectivas leituras na ordenada É importante lembrar que a curva de calibração deve ser construída cada vez que for realizada a determinação OBSERVAÇÕES 1 Em amostras com altos teores de fósforo há necessidade de diluir as soluções até a faixa de concentração linear obtida a partir da curva de calibração 2 Observar a curva de calibração de K linear até 40 mg L1 PAVAN et al 1992 42 MÉTODO DA RESINA RAIJ ET AL 2001 421 PRINCÍPIO Baseiase na transferência do fósforo e do potássio presentes no solo para resina em meio aquoso com subseqüente separação da resina e do solo e extração dos elementos químicos P e K com solução ácida de cloreto de amônio A determinação do teor de fósforo se dá por espectrofotometria da cor azul do complexo fosfomolíbdico formado entre fosfato e molibdato em ácido sulfúrico e reduzido com ácido ascórbico A determinação do teor de potássio se dá pela medição da energia radiante emitida pelo potássio em chama 422 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Cachimbos de 25 cm3 para resina com fundo de tamis com abertura pouco menor do que o diâmetro das resinas 04 mm Dispensador para 25 mL Painel de recuperação de resina Mesa agitadora circular horizontal para no mínimo 220 rpm Diluidordispensador para diluição na proporção de 4 mL de extrato para 16 mL de diluente Fotômetro de chama Espectrofotômetro com transmissão máxima a 720 nm ou 885 nm 423 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água desionizada b Resina trocadora de ânions do tipo base forte Amberlite IRA400 ou similar c Resina trocadora de cátions do tipo ácido forte Amberlite IR120 ou similar d Ácido clorídrico HCl 1 mol L1 adicionar com proveta 166 mL de ácido clorídrico d 118 em balão volumétrico de 2 L em que já tenham sido colocados aproximadamente 500 mL de água desionizada Completar o volume e homogeneizar bem e Hidróxido de sódio NaOH 1 mol L1 pesar 535 g de NaOH e dissolver em balão volumétrico de 2 L Resfriar e completar o volume com água desionizada f Cloreto de amônio NH4Cl 1 mol L1 pesar 534 g de cloreto de amônio em béquer e dissolver em água desionizada Levar para balão volumétrico de 2 L e completar com água desionizada até a marca g Bicarbonato de sódio NaHCO3 1 mol L1 dissolver 168 g de bicarbonato de sódio em béquer utilizando água desionizada Em seguida transferir para balão volumétrico de 2 L e completar o volume h Cloreto de amônio NH4Cl a 08 mol L1 em HCl a 02 mol L1 dissolver 428 g de cloreto de amônio em béquer com água desionizada acrescentar 166 ml de HCL pa e completar o volume para 1L i Ácido clorídrico HCl 02 mol L1 adicionar com proveta 33 mL de ácido clorídrico d 118 em balão volumétrico de 2 L em que já tenham sido colocados aproximadamente 500 mL de água desionizada Completar o volume e homogeneizar bem j Soluçãoestoque de molibdato de amônio dissolver 20 g de molibdato de amônio em 200 mL de água destilada aquecida entre 60 e 70ºC Resfriar a solução Dissolver 070 g de tartarato duplo de antimônio e potássio na solução de molibdato Adicionar lentamente 320 mL de H2SO4 pa concentrado resfriando sob água corrente Deixar esfriar bem e completar o volume para 1 L k Solução diluída de molibdato de amônio medir 50 mL da soluçãoestoque de molibdato e transferir para balão volumétrico de 1 L Adicionar cerca de 500 mL de água desionizada quente e 06 g de gelatina pa Transferir a solução de gelatina para balão volumétrico Acrescentar 1 g de ácido ascórbico agitar até dissolver e completar o volume com água desionizada e homogeneizar l Solução de calibração de estoque de fósforo e potássio pesar 01767 g de fosfato monopotássico pa e 01275 g de cloreto de potássio partindo de reagentes secos em estufa entre 105 e 110oC durante 2 h e esfriados em dessecador Dissolver esses produtos em béquer usando o mínimo possível de HCl a 1 mol L1 60 a 64 mL de ácido e transferir cuidadosamente o conteúdo do béquer para balão volumétrico de 1 L Lavar o béquer com várias porções da solução de NH4Cl a 08 mol L1 em HCl a 02 mol L1 completar o volume com esta última solução e agitar 424 PROCEDIMENTO Précondicionamento da resina misturar partes iguais de resina Amberlite IRA400 e Amberlite IRA120 ou resinas similares previamente passadas em peneira com abertura de malha de 05 mm A cada 100 mL de resina adicionar 10 mL de HCl a 1 mol L1 10 g de KH2PO4 10 g de CaCl2 e 10 g de MgSO47H2O Os sais devem ser dissolvidos previamente num pouco de água desionizada Deixar a suspensão em contato durante 2 a 3 semanas agitando ocasionalmente Uma vez colocada em solução a resina jamais deverá ser seca pois pode perder as propriedades de expansão Lavar 5 vezes a resina com água desionizada em béquer por decantação da resina e eliminação do líquido entre uma lavagem e outra Transferir a resina para o tubo grande no painel de recuperação de resinas Usando fluxo saturado percolar lentamente várias soluções Para cada volume de resina passar em seqüência 5 volumes de água destilada 5 volumes de HCl a 1 mol L1 5 volumes de água desionizada 5 volumes de NaOH a 1 mol L1 5 volumes de água desionizada e 5 volumes de HCl a 1 mol L1 Em seguida passar 10 volumes de NH4Cl a 1 mol L1 e 1 volume de água A resina está précondicionada e deve ser acondicionada em frasco identificado como resina recuperada Preparo da resina para uso preparase o suficiente para o uso diário Retirar resina suficiente para o uso diário do frasco de resina recuperada com cuidado para evitar segregação das resinas catiônicas e aniônicas A resina Amberlite IRA400 tem densidade aparente de 070 g mL1 enquanto nas mesmas condições a densidade da Amberlite IR120 é de 084 g mL1 Dessa maneira é importante o cuidado para evitar a segregação das duas resinas o que se consegue misturando as resinas em frasco com prévia decantação da água mas sem secar Preparar 5 volumes de NaHCO3 a 1 mol L1 com pH 85 para cada volume de resina Colocar a resina em béquer e acrescentar cerca de 13 de solução de bicarbonato Deixar em contato durante pelo menos 2 h antes de usar agitando ocasionalmente até não mais saírem bolhas de CO2 Transferir a resina para tubo de percolação e promover a passagem do restante de NaHCO3 a 1 mol L1 o que deve levar algumas horas Em seguida passar lentamente 20 volumes de água desionizada A resina deve ser usada imediatamente na extração dos nutrientes do solo É conveniente iniciar o preparo com NaHCO3 um dia antes para que o tratamento com bicarbonato de sódio possa ser feito com o devido tempo Iniciar lavagem lenta com água no final da tarde regulando a vazão para que ela se prolongue durante a noite e concluindoa na manhã seguinte EXTRAÇÃO DO FÓSFORO ASSIMILÁVEL E DO POTÁSSIO TROCÁVEL Transferir 25 cm3 de TFSA para frasco plástico de 80 mL provido de tampa Acrescentar 25 mL de água desionizada e uma bolinha de vidro com cerca de 2 cm de diâmetro Fechar o frasco e agitar por 15 min para desagregar o solo isso é necessário para permitir a posterior separação de resina e solo Retirar a bolinha de vidro e acrescentar 25 cm3 de resina medidos com cachimbo Fechar o frasco e agitar durante 16 h em agitador com movimento circular horizontal na velocidade de 220 rpm A agitação pode ser feita durante a noite No dia seguinte abrir o frasco e transferir com jato de água a suspensão de solo e resina para peneira com 04 mm de abertura Lavar a resina com o mínimo de água destilada até que não seja mais observada saída de argila Virar a peneira sobre funil tendo por baixo um frasco cilíndrico de 100 mL de capacidade Transferir a resina da peneira para o frasco de 100 mL usando para isso exatamente 50 mL da solução de NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 Nessa operação podese usar um dispensador para 25 mL Deixar a solução de NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 com a resina em contato por cerca de 30 min para permitir a saída do gás carbônico Em seguida fechar os frascos e agitar por 1 h a 220 rpm O extrato assim obtido está pronto para a determinação de PAssimilável K Ca e Mg trocáveis Juntamente com os extratos de solos devem ser agitadas as soluções de calibração de cálcio magnésio potássio e fósforo diluídas em NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO Transferir 0 1 2 3 4 e 5 mL da solução de calibração de estoque para balões volumétricos de 50 mL identificados por A B C D E e F Completar o volume com a solução de NH4Cl a 08 mol L1 em HCl a 02 mol L1 e agitar Transferir as soluções para frascos plásticos do mesmo tipo usado para receber os extratos finais da resina Acrescentar 25 mL de resina deixar em contato por 30 min e agitar a 220 rpm durante 1 h É conveniente que essas soluções sejam preparadas no dia em forem utilizadas As soluções de calibração A B C D E e F têm a seguinte equivalência de volume de TFSA expressa em mgdm3 de P 0 16 32 48 64 80 respectivamente Diluir 4 mL do extrato de NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 com 16 mL da solução diluída de molibdato com auxílio do diluidordispensador Proceder igualmente com as souções da curva de calibração Após 15 min proceder às leituras em colorímetro ou em espectrofotômetro a 660 nm DETERMINAÇÃO DE POTÁSSIO Transferir a solução de calibração de estoque da mesma forma como foi descrito anteriormente de modo que nos frascos plásticos as soluções tenham a seguinte equivalência de volume de TFSA expressa em mmolcdm3 de K 00 12 22 36 48 e 60 respectivamente Retirar 1 mL dos extratos com NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 da resina adicionar 10 mL de água desionizada e homogeneizar Fazer as leituras no fotômetro de chama Cálculo traçar curva de calibração e determinar o fator para converter as leituras em mmolcdm3 de K OBSERVAÇÕES Recuperação da resina recolher a resina usada em béquer Lavar 5 vezes com água desionizada por decantação da resina e remoção do líquido sobrenadante Transferir a resina de um béquer para outro com auxilio de jato de água de forma que a areia permaneça na parte inferior do primeiro béquer A resina assim tratada pode ser acumulada aproveitando o material de vários dias para só então proceder à recuperação que será feita uma vez por semana Medir em proveta o volume de resina e transferir para tubo de percolação Percolar lentamente 10 volumes de NH4Cl a 1 mol L1 e em seguida 1 volume de água destilada Transferir a resina para um frasco identificado como resina recuperada com o auxílio de água desionizada A resina tratada é armazenada até o dia de sua utilização quando receberá tratamento com bicarbonato de sódio 5 SÓDIO 51 PRINCÍPIO Extração com solução diluída de ácido clorídrico e posterior determinação em fotômetro de chama 52 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Fotômetro de chama 53 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de HCl 005 mol L1 preparar por diluição a partir de ácido concentrado b Solução de calibração de sódio 10 mmolcL1 de Na pesar 0585 g de NaCl previamente seco em estufa a 105oC e dissolver em solução de HCl a 005 mol L1 até completar 1 L c Curva de calibração de Na 1 2 3 e 4 mmolcL1 de Na transferir para balões aferidos de 500 mL os seguintes volumes da solução anterior 50 100 150 e 200 mL Completar o volume com solução de HCl a 005 mol L1 54 PROCEDIMENTO Transferir 10 cm3 de TFSA para erlenmeyer de 200 mL e adicionar 100 mL da solução de HCl a 005 mol L1 Fechar com rolha de borracha e agitar com movimentos circulares evitando molhar a rolha Repetir essa operação várias vezes ao dia Após a última agitação desfazer o montículo que se forma na parte central do fundo do erlenmeyer e deixar em repouso durante uma noite Filtrar e no filtrado determinar o sódio em fotômetro de chama diretamente ou em alíquotas diluídas conforme o teor do elemento químico existente na amostra Cálculo Na em mmolckg1 L x diluição x fNa x 10 em que L leitura da amostra e fNa obtido a partir da equação da reta da curva de calibração de Na OBSERVAÇÃO Quando se tratar de solos aparentemente ricos em sódio provavelmente haverá necessidade de executar várias diluições para se adequar à faixa linear de resposta do Na no fotômetro de chama 6 CÁLCIO E MAGNÉSIO 61 EXTRAÇÃO COM KCL 10 MOL L1 611 PRINCÍPIO A determinação do cálcio e do magnésio é feita após a extração com KCl a 1 mol L1 por titulação complexométrica com ácido etilenodiaminotetracético EDTA ou por absorção atômica 612 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Cachimbo de 5 cm3 Béquer com capacidade 50 mL Agitador mecânico Pipeta automática de 10 mL Bureta de 10 mL com divisão de 001 mL Agitador magnético e barra magnética Copos plásticos descartáveis50 mL Espectrofotômetro de absorção atômica 613 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de KCl 1 mol L1 pesar 7456 g de KCl seco em estufa a 60ºC dissolver em 800 mL de água destilada e completar o volume para 1 L b Solução de EDTA 001 mol L1 pesar exatamente 18613 g de EDTA seco em estufa a 100ºC por 1 h e dissolver em 1 L de água destilada c Soluçãotampão pH 10 dissolver 169 g de cloreto de amônio NH4Cl em 50 mL de água destilada adicionar 150 mL de hidróxido de amônio NH4OH concentrado 0154 g de sulfato de magnésio MgSO427H2O e 0233 g de EDTA e completar o volume para 250 mL com água destilada d Negro de eriocromo T eriochrome black T dissolver 100 mg do indicador em 10 mL de álcool metílico e adicionar 10 mL de trietanolamina pa e Coquetel para Ca Mg misturar 120 mL de soluçãotampão pH 10 70 mL de trietanolamina pa e 18 mL de cianeto de potássio KCN f Coquetel para Ca misturar 80 mL de KCN a 5 25 mL de trietanolamina pa e 100 mL de NaOH a 10 g NaOH a 10 pesar 10 g de NaOH e dissolver em 100 mL de água destilada h KCN a 5 pesar 10 g de KCN e dissolver em 200 mL de água destilada i KCN a 10 pesar 10 g de KCN e dissolver em 100 mL de água destilada j Calcon dissolver 100 mg do indicador em 10 mL de álcool metílico e acrescentar 10 mL de trietanolamina pa k La203 a 10 pesar 117 g de La2O3 umedecer com H2O e adicionar aos poucos 500 mL de HCl concentrado e completar para 1 L com água destilada l Solução de La2O3 a 01 transferir 10 mL da solução e La2O3 e diluir para 1 L com água destilada 614 PROCEDIMENTO a Extração transferir 5 cm3 de TFSA para um béquer e adicionar 50 mL de KCl a 10 mol L1 Agitar por 5 min e deixar em repouso por uma noite b Determinação de cálcio magnésio transferir 10 mL do extrato e adicionar 10 mL de água destilada 1 mL do coquetel item 35 e 3 gotas do indicador de eriocromo item 34 Titular com EDTA a 001 mol L1 até a cor avermelhada passar para azul puro ou azul esverdeado c Determinação separada do cálcio transferir 10 mL do extrato adicionar 10 mL de água destilada 2 mL do coquetel para cálcio item 36 3 gotas do indicador de calcon e titular com EDTA a 001 mol L1 até a viragem para a cor azul d Cálculos mmolcdm3 de Ca mL de EDTA da amostra mL de EDTA do branco x 10 mmolcdm3 de Ca Mg mL de EDTA da amostra mL de EDTA do branco x 10 e Procedimento para a determinação do cálcio e também do magnésio por absorção atômica transferir alíquota de 1 mL do extrato item 51 adicionar 19 mL de La2O3 a 01 e proceder às leituras no espectrofotômetro de absorção atômica aferindo o aparelho conforme as instruções do fabricante Analisar prova em branco com KCl La2O3 nas mesmas concentrações dos extratos De acordo com a linearidade da curva de calibração ajustar o equipamento para leituras diretas e em caso de extrapolação em relação à curva de calibração fazer diluições da amostra Os cálculos nesse caso são mg dm3 de Ca leitura x fc x fd ou resultado direto e mg dm3 de Mg leitura x fc x fd ou resultado direto em que Fc fator de correção e Fd fator de diluição OBSERVAÇÕES 1 Verificar a neutralidade da solução em relação ao Mg e ao EDTA para isso em 50 mL de água destilada adicionar 3 mL da solução e colocar 4 gotas do indicador negro de eriocromo A cor avermelhada deverá virar para o azul puro com no máximo 2 gotas do EDTA a 001 mol L1 2 Alguns laboratórios preferem usar murexida para a análise de Ca e Mg e também Calceina complexona para analisar o Ca separado do Mg por titulação enquanto outros laboratórios usam o espectrofotômetro de absorção atômica Em todos os casos a extração é a mesma diferindo apenas nos procedimentos para a determinação 3 Tanto o óxido de lantânio quanto o cloreto de estrôncio são efetivos como supressores de interferentes 62 MÉTODO DA RESINA 621 PRINCÍPIO Ver procedimento para análise de fósforo RAIJ et al 2001 622 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Ver procedimento para análise de fósforo 623 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de calibração de estoque de cálcio e magnésio pesar 25022 g de carbonato de cálcio pa e 01216 g de magnésio metálico pa partindo de reagentes secos em estufa entre 105 e 110oC durante 2 h e resfriados em dessecador Dissolver os produtos em béquer usando o mínimo possível de HCl a 1 mol L1 60 a 65 mL de ácido e transferir cuidadosamente o conteúdo do béquer para balão volumétrico de 1 L Lavar o béquer com várias porções da solução de NH4Cl a 08 mol L1 em HCl a 02 mol L1 completar o volume com esta última solução e agitar b Soluçãotampão pH 10 dissolver em água 68 g de NH4Cl pa acrescentar 570 mL de hidróxido de amônio concentrado pa 061 g de sulfato de amônio heptahidratado pa 093 g de sal dissódico de EDTA 5 g de cianeto de potássio pa dissolvido em água e 100 mL de trietanolamina pa Completar o volume para 1 L Agitar Verificar se a relação de MgEDTA está correta titulando 10 mL da soluçãotampão diluída em 100 mL de água e 6 gotas de preto de eriocromo T com a solução de EDTA a 001 mol L1 A quantidade de mililitros gastos multiplicada por 0184 dará o número de gramas de EDTA a 2 mol L1 a ser acrescido à soluçãotampão a fim de equilibrar a relação de MgEDTA c Soluçãocoquetel de NaOH a 20 dissolver 200 g de NaOH em água destilada ou desionizada Acrescentar 100 mL de trietanolamina e 5 g de cianeto de potássio previamente dissolvidos em água Completar o volume para 1 L e homogeneizar Guardar a solução em frasco plástico d Preparo da curva de calibração de Ca Mg K e P transferir 0 1 2 3 4 e 5 mL da solução de calibração de estoque para balões volumétricos de 50 mL identificados por A B C D E e F respectivamente Completar o volume com a solução de NH4Cl a 08 mol L1 em HCl a 02 mol L1 e agitar Transferir as soluções para frascos plásticos do mesmo tipo usado para receber os extratos finais da resina Acrescentar 25 cm3 de resina deixar em contato por 30 mins e agitar a 220 rpm durante 1 h É conveniente que essas soluções sejam preparadas no dia de uso As soluções de calibração A B C D E F têm respectivamente a seguinte equivalência de volume de terra expressa em mmoldm3 de Ca 0 20 40 60 80 100 e de Mg 0 4 8 12 16 20 624 PROCEDIMENTO a Transferir 25 cm3 de terra para frasco plástico de 80 mL provido de tampa Acrescentar 25 mL de água destilada e uma bolinha de vidro de cerca de 2 cm de diâmetro Fechar o frasco e agitar por 15 min para desagregar o solo isso é necessário para permitir a posterior separação de resina e solo b Retirar a bolinha de vidro e acrescentar 25 cm3 de resina medida com cachimbo Fechar o frasco e agitar durante 16 h em agitador com movimento circular horizontal na velocidade de 220 rpm c Após abrir o frasco transferir com jato de água a suspensão de solo e resina para peneira de 04 mm de abertura Lavar a resina com o mínimo de água destilada até parar de sair argila Virar a peneira sobre funil tendo por baixo um frasco cilíndrico de 100 mL de capacidade Transferir a resina da peneira para o frasco de 100 mL usando para isso exatamente 50 mL da solução de NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 d Deixar a solução de NH4Cl a 08 mol L1 em contato com a resina por cerca de 30 min para permitir a saída do gás carbônico Em seguida fechar os frascos e agitar por 1 h a 220 rpm O extrato está pronto para a determinação de cálcio e magnésio Juntamente com os extratos de solos devem ser agitadas a curva de calibração de cálcio e magnésio em NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 contendo a resina e Usualmente cálcio e magnésio são determinados em conjunto em pH 10 e o cálcio isoladamente em pH 125 O teor de magnésio é obtido por diferença O indicador mais usado para cálcio magnésio é o negro de eriocromo T Para cálcio usase o azul de eriocromo R ou Calcon f Retirar duas alíquotas de 10 mL dos extratos de NH4Cl a 08 mol L1 HCl a 02 mol L1 proveniente da extração pela resina Transferir também alíquotas da curva de calibração Adicionar água até perfazer cerca de 500 mL Em uma das alíquotas determinar cálcio magnésio Para isso adicionar à solução 5 mL da soluçãotampão pH 10 e após alguns minutos 5 gotas do indicador ériocromo T Titular imediatamente após a adição do indicador até a viragem de vermelhovinho para azul usando a solução a 001 mol L1 de EDTA Usar microbureta A viragem do indicador é lenta e a titulação deve ser feita cuidadosamente gota a gota ao se aproximar do final Determinar cálcio na outra alíquota Para isso adicionar 3 mL da soluçãocoquetel de NaOH a 20 5 gotas de Calcon e titular imediatamente com EDTA a 001 mol L1 até viragem de vermelhorosado para azul g Para calcular os resultados subtrair inicialmente o valor da prova em branco solução A da curva de calibração do volume gasto para titular cálcio magnésio e cálcio tanto da curva de calibração como dos extratos Em seguida plotar o valor esperado contra o volume gasto na titulação para Ca Mg e Ca Estabelecer o fator para converter os resultados da titulação em valores de mmolcdm3 de terra Feito isso obter os valores de magnésio por subtração OBSERVAÇÃO O EDTA forma complexos que têm constantes de estabilidade variável com diferentes metais A constante de estabilidade do cálcio é maior que a do magnésio o que significa que o cálcio é titulado antes do magnésio na solução que contenha os dois elementos Nas titulações de cálcio e magnésio são importantes o pH do meio os indicadores e os agentes que mascaram a interferência 7 BORO 71 EXTRAÇÃO COM ÁGUA QUENTE 711 PRINCÍPIO Extração do boro por água quente e determinação espectrofotométrica Cloreto de bário é adicionado para a precipitação de argilas 712 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Banhomaria Balanças Tubos de polietileno com tampa rosqueável Estante portatubos Centrífuga de alta rotação Pipeta automática de 5 mL Espectrofotômetro 713REAGENTES E SOLUÇÕES ARMAZENAR EM FRASCOS PLÁSTICOS a Soluçãotampão dissolver 173 g de acetato de amônio e 372 g de EDTA em 800 mL de água desionizada Ajustar o pH para 52 com ácido acético ou com ácido sulfúrico a 25 e completar o volume para 1 L com água desionizada b Reagente azometinaH dissolver 06 g de azometinaH e 20 g de ácido ascórbico em 100 mL de água destilada Esta solução poderá ser conservada em geladeira por até 2 dias c Solução com 100 mg L1 de boro pesar 05717 g de ácido bórico e completar o volume para 1 L com água desionizada d Curva de calibração de boro 0 04 08 12 e 16 mg L1 de boro e BaCl2 a 10 pesar 10 g de BaCl2 e dissolver em 100 mL de água desionizada 714 PROCEDIMENTOS a Extração pesar 10 cm3 de TFSA em tubos de polietileno nunca utilizar frascos de vidro Adicionar 20 mL de água desionizada 025 mL de BaCl2 a 10 e fechar hermeticamente Levar à fervura por 7 min em banhomaria Retirar do banhomaria deixar esfriar e em seguida filtrar ou centrifugar a 10000 rpm durante 10 min b Determinação transferir 4 mL das soluções da curva de calibração ou das amostras para tubos de polietileno adicionar 2 mL da soluçãotampão e misturar bem Adicionar 2 mL da solução de azometinaH deixar em repouso por 2 h e proceder às leituras em 420 nm c Cálculos B L x fc x fd10000 ou B mgkg1 L x fc x fd em que L leitura fc fator de correção e fd fator de diluição 72 EXTRAÇÃO COM ÁGUA QUENTE EMPREGANDO RADIAÇÃO MICROONDAS 721 PRINCÍPIO Extração do boro por água quente em forno com radiação microondas e determinação espectrofotométrica Cloreto de bário é adicionado para a precipitação de argilas ABREU et al 1994 722 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Balança analítica Pipeta automática de 4 mL Espectrofotômetro para leitura em 400 nm Forno de microondas Sacos de polipropileno 155 x 25 cm Estante portasaquinho para microondas Papelfiltro de vazão lenta 722 REAGENTES E SOLUÇÕES ARMAZENAR EM FRASCOS PLÁSTICOS Soluçãotampão 250 g de acetato de amônio e 15 g de EDTA em 400 mL de água desionizada adicionar 125 mL de ácido acético glacial concentrado Reagente azometinaH adicionar a 1 L de água destilada 18 g de 1amino8naftol36 dissulfonato de sódio e aquecer para dissolver Filtrar se necessário e ajustar para pH 70 com KOH a 10 Adicionar gotas de HCl com agitação constante e ajustar o pH para 15 Aquecer a solução até 60ºC e adicionar 20 mL de ácido benzóico C7H6O2 vagarosamente e depois agitar vagarosa e continuamente aquecendo por 1 h Deixar esfriar durante a noite em temperatura ambiente Filtrar para coletar o precipitado de azometinaH com funil de Büchner lavando por 5 vezes com álcool etílico pa esperar até que evapore um pouco o álcool etílico usado e depois secar a 100ºC por 3 h Recolher o pó e guardar em dessecador Solução de azometinaH a 9 09 g de azometina e solução de ácido ascórbico a 2 Solução de boro 100 mg L1 pesar 05717 g de ácido bórico e completar o volume para 1 L com água desionizada Curva de calibração de boro 0 04 08 12 e 16 mg L1 de boro BaCl2 a 0125 pesar 0125 g de BaCl2 e dissolver em 100 mL de água desionizada 723 PROCEDIMENTO Colocar 10 cm3 de solo em saquinhos de polipropileno 155 x 25 cm adicionar 20 mL da solução de cloreto de bário a 0125 e 05 cm3 de carvão ativo se a determinação de boro for por colorimetria Com auxílio de uma seladora vedar os saquinhos Fazer um pequeno furo no centro do saquinho para reduzir a pressão interna durante o aquecimento prender com clipe plástico e pendurar os saquinhos na prateleira própria para uso em microondas com prato giratório ou amarrar o saquinho na estante Aquecer por 4 min na potência máxima 700 W e 5 min na potência média 490 W Esfriar 30 min e filtrar a suspensão em papel de filtração lenta Whatman 42 Determinação transferir 4 mL do extrato e das soluções da curva de calibração para tubos de ensaio adicionar 1 mL da soluçãotampão e homogeneizar Acrescentar 1 mL da solução de azometinaH a 09 e agitar Deixar em repouso por 30 min no escuro e proceder às leituras em espectrofotômetro a 420 nm OBSERVAÇÕES 73 Calibração do forno de microondas essa calibração deve ser feita a cada 6 meses Anotar os dados em caderno de controle a ser mantido junto ao equipamento Colocar 1000 g de água desionizada em copo de Teflon e medir a temperatura da água antes do aquecimento Colocar o copo de Teflon no centro do prato giratório do microondas Ligar o forno por 2 min na potência máxima Remover o copo agitar vigorosamente a água e medir novamente a temperatura 74 A potência do forno é determinada por P K x CP x m x DTt1 em que P potência em Watts K fator de conversão de caloria por segundo em Watts 4184 CP capacidade térmica ou calor específico Calg1ºC1 da água 10 DT diferença de temperatura final inicial e t tempo em segundos Usando t 2 minutos e 1000 g de água destilada a equação pode ser simplificada para P 3487 x DT Se as calibrações forem feitas com potência diferente de 100 fazer a correção P 100 3487 x DT da potência usada SOUZA SILVA 2000 Provavelmente haja necessidade de diminuir a potência indicada no programa 8 ENXOFRE SSO4 2 81 TURBIDIMETRIA 811 PRINCÍPIO Quantificação da turbidez formada pela precipitação do sulfato com o cloreto de bário VITTI 1989 812 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Tubos de polietileno Agitador horizontal Centrífuga de alta rotação Frascos do tipo snapcap Copos plásticos descartáveis 50 mL Pipetas automáticas de 5 mL e 10 mL Balança analítica Espectrofotômetro Peneira de 60 mesh malha de 025 mm 813 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução extratora de fosfato monocálcico a 001 mol L1 dissolver 252 g de CaH2PO42H2O em 1 L de água desionizada e adicionar 3 gotas de tolueno b Hidróxido de sódio a 10 mol L1 dissolver 40 g de NaOH em 100 mL de água desionizada c Cloreto férrico a 5 dissolver 50 g de FeCl36H2O em 100 mL de água destilada d Solução de ácido clorídrico com enxofre 100 mL de HCl concentrado 4 mL da solução de 1000 ppm de enxofre completar o volume para 200 mL com água desionizada e Solução de calibração de SSO4 2 1000 mg L1 pesar 54376 g de K2SO4 pa seco a 105ºC e dissolver em 1 L de água desionizada f Ácido clorídrico a 10 mol L1 transferir 83 mL de HCl concentrado para balão de 100 mL e completar o volume com água destilada 814 PROCEDIMENTO Extração transferir 30 g de solo para tubo de centrífuga de 30 mL e adicionar 15 mL da solução extratora Agitar por 24 h em agitador horizontal 100 rpm e em seguida centrifugar a 10000 rpm por 10 min Eliminação da matéria orgânica transferir 8 mL do extrato para tubos de centrífuga adicionar 1 mL de NaOH a 10 mol L1 e 1 mL de FeCl3 a 5 agitar manualmente e em seguida centrifugar a 10000 rpm por 5 min Neutralização do NaOH separar o sobrenadante subitem anterior e adicionar 1 mL de HCl a 10 mol L1 Determinação medir 5 mL do extrato tratado adicionar 05 mL da solução de ácido clorídrico com enxofre agitar e adicionar 025 g de BaCl2 passado em peneira de 60 mesh malha 025 mm aguardar 2 min e proceder às leituras em espectrofotômetro antes de 8 min a 420 mm O tempo é um aspecto importantíssimo Preparar a curva de calibração nas seguintes concentrações 0 2 5 10 15 e 20 mg L1 de SSO4 2 e proceder à determinação nas mesmas condições das amOstras Cálculos mg kg1 de SSO4 2 calculado a partir da equação da reta obtida nas leituras da curva de calibração Considerar as diluições da amostra 82 VARIAÇÃO DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE SSO4 2 821 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Ver procedimento descrito no item anterior 822 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução extratora de CaH2PO42 a 001 mol L1 dissolver 252 g de CaH2PO42H2O em 1 L de água desionizada b Cristais de BaCl22H2O peneirar os cristais em peneiras de 20 e 60 mesh Usar os cristais que ficarem retidos na peneira 60 c Solução de calibração de SSO4 2 1000 mg L1 dissolver 54374 g de K2SO4 pa seco a 105ºC em 1 L de água desionizada d Solução de calibração de SSO4 2 100 mg L1 em balão volumétrico de 100 mL transferir 10 mL da solução de 1000 mg L1 completando o volume com a solução de CaH2PO42H2O a 001 mol L1 e Curva de calibração de SSO4 2 preparar com 0 2 5 10 20 30 e 40 mL da solução de 100 mg L1 de S transferir para balões de 100 mL completar o volume com CaH2PO42 a 001 mol L1 e agitar Essas soluções contêm SSO4 2 nas seguintes concentrações em mg L1 0 2 5 10 20 30 e 40 f Carvão ativado g Solução de ácido clorídrico com enxofre transferir 250 mL de HCl concentrado pa para balão de 500 mL Acrescentar 006 g de K2SO4 Agitar e completar o volume com água destilada 823 PROCEDIMENTO Medir 10 cm3 de terra e colocar em frasco plástico com tampa ou erlenmeyer de 125 mL Adicionar 25 mL da solução extratora e acrescentar 025 g de carvão ativado Para isso podese lançar mão de medida volumétrica previamente calibrada Agitar por 30 min e em seguida filtrar a suspensão Transferir 10 mL do extrato em frasco de polietileno Acrescentar 1 mL da solução de ácido clorídrico com enxofre Adicionar cerca de 05 g de BaCl22H2O peneirado Podese utilizar medida volumétrica calibrada Esperar 1 min e em seguida agitar manualmente até a dissolução dos cristais Ler a absorvância de 2 a 8 min após a dissolução dos cristais em espectrofotômetro a 420 nm Zerar o aparelho com água destilada Essa etapa deve ser feita com no máximo 10 a 12 amostras de cada vez para se fazer a leitura no tempo especificado Caso as leituras dos extratos de solo excedam aquelas do ponto máximo da curva de calibração repetir a determinação pipetando 2 mL do extrato e 8 mL da solução extratora e continuar a partir da adição da solução de ácido clorídrico com enxofre Multiplicar o resultado por cinco OBSERVAÇÃO Curva de calibração transferir 25 mL das soluções de calibração diluídas que contêm 0 2 5 10 20 30 e 40 mg L1 de SSO4 2 Acrescentar 025 g de carvão ativado e agitar por 30 min Em seguida filtrar a suspensão Transferir 10 mL do extrato em frasco plástico Acrescentar 1 mL da solução de ácido clorídrico com enxofre Após adicionar cerca de 05 g de BaCl22H2O peneirado Podese utilizar medida volumétrica calibrada Esperar 1 min e em seguida agitar manualmente até a dissolução dos cristais Ler a absorvância de 2 a 8 minutos após a dissolução dos cristais em espectrofotômetro a 420 nm Zerar o aparelho com água desionizada Essa etapa deve ser feita com no máximo 10 a 12 amostras de cada vez para se fazer a leitura no tempo especificado Construir a curva de calibração plotando o valor de absorbância contra a concentração das soluções de calibração multiplicada por 25 0 5 125 25 50 75 e 100 mg de SSO4 2 por dm3 de solo Calcular a concentração de SSO4 2 no solo com base na curva de calibração 9 DETERMINAÇÃO DE COBRE FERRO MANGANÊS E ZINCO 91 EXTRAÇÃO COM DTPA 911 PRINCÍPIO Extração dos microelementos com solução quelante de ácido dietilenotriaminopentacético DTPA em determinado pH ou com solução extratora mista HCl a 005 mol L1 e H2SO4 a 0025 mol L1 e determinação dos elementos por espectrofotometria de absorção atômica 912 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Espectrofotômetro de absorção atômica Lâmpada de catodo ôco para cada elemento Medidor de pH Mesa agitadora circular horizontal e regulável para 220 rpm Bandejas Dispensador Cachimbos 10 e 5 cm3 Macropipeta automática Papelfiltro quantitativo faixa azul com 11 cm de diâmetro 913 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de DTPA a 0005 mol L1 trietanolamina TEA a 01 mol L1 cloreto de cálcio diidratado CaCl22H2O a 001 mol L1 com pH 730 dissolver 196 g de DTPA em béquer com aproximadamente 200 mL de água destilada e desionizada dissolução parcial Adicionar 149 mL de trietanolamina e em seguida 147 g de CaCl22H2O Transferir para balão volumétrico de 1 L completar o volume com água destilada e desionizada Corrigir o pH com HCl 4 a mol L1 b Solução de HCl a 4 mol L1 adicionar vagarosa e cuidadosamente 331 mL de HCl concentrado em aproximadamente 500 mL de água destilada e desionizada Completar o volume para 1 L c Soluçãoestoque de HCl a 25 mol L1 e H2SO4 a 125 mol L1 em balão volumétrico de 1 L adicionar 207 mL de HCl pa d 119 e 347 mL de H2SO4 pa d184 em aproximadamente 500 mL Misturar bem e completar com água destilada d Solução extratora HCl a 005 mol L1 e H2SO4 a 0025 mol L1 diluir 200 mL da solução estoque em 10 L de água desionizada e Soluções de calibração de estoque de 1000 mg L1 preparadas com soluções comerciais de calibração Titrisol Mn diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada Cu diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada Zn diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada Fe diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada f A seguir sugeremse as seguintes concentrações para a construção da curva de calibração para emprego na determinação por espectrometria de absorção atômica É importante se observar que a concentração deverá ser ajustada para cada elemento de acordo com o manual de instruções do equipamento utilizado Curva de calibração 1 transferir 5 mL da solução de calibração de Fe 1000 mg L1 2 mL da solução de calibraçãoestoque de Mn 1000 mg L1 2 mL da solução de calibração de Cu 1000 mg L1 e 1 mL da solução de calibração de Zn 1000 mg L1 para balão de 100 mL e completar o volume com a solução extratora de DTPA ou da solução de HCl a 005 mol L1 H2SO4 a 0025 mol L1 Essa solução contém 50 mg L1 de Fe 20 mg L1 de Mn 20 mg L1 de Cu e 10 mg L1 de Zn Curva de calibração 2 transferir os volumes indicados a seguir da curva de calibração 1 para balões de 100 mL e completar o volume com a solução extratora de DTPA ou da solução de HCl a 005 mol L1 H2SO4 a 0025 mol L1 Curva de calibração 1 Concentração no extrato mg L1 mL Cu Zn Fe Mn 0 0 0 0 0 5 10 05 25 10 10 20 10 50 20 20 30 20 100 40 25 40 25 125 50 Fazer a calibração do espectroftômetro de absorção atômica utilizando as curvas de calibração OBSERVAÇÃO Para transformar em mgdm3 de solo o valor da concentração em mg L1 deve ser multiplicado por 2 para o DTPA e por 10 para a solução de HCl a 005 mol L1 H2SO4 a 0025 mol L1 914 PROCEDIMENTO Extração com DTPA medir com cachimbo 20 cm3 de solo e transferir para frascos cônicos de polietileno Adicionar 40 mL da solução extratora DTPA TEA CaCl22H2O Tampar os frascos e agitar por 2 h a 220 rpm Filtrar a suspensão por no máximo 1 h Ler diretamente no filtrado a concentração de cobre ferro manganês e zinco em 24 h no máximo após a filtragem Extração com solução de HCl a 005 mol L1 H2SO4 a 0025 mol L1 medir com cachimbo 5 cm3 de solo e transferir para frascos cônicos de polietileno Adicionar 50 mL da solução extratora HCl a 005 mol L1 H2SO4 a 0025 mol L1 Tampar os frascos e agitar por 5 min a 220 rpm Deixar decantar a suspensão durante a noite 15 a 18 h Em seguida transferir 10 mL para copinhos plásticos descartáveis de 50 mL Ler diretamente a concentração de cobre ferro manganês e zinco OBSERVAÇÃO A análise de micronutrientes exige sempre cuidados especiais principalmente em relação à qualidade dos reagentes e às vidrarias utilizados assim como à lavagem e à padronização na seqüência laboratorial 92 EXTRAÇÃO COM HCl A 01 mol L1 921 PRINCÍPIO Extração dos microelementos com solução extratora HCl a 01 mol L1 e determinação dos elementos por espectrofotometria de absorção atômica 922 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Espectrofotômetro de absorção atômica Mesa agitadora circular horizontal regulada para 220 rpm Bandejas Dispensador Cachimbo 10 cm3 Seringa ou macropipeta automática 923 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução extratora de HCl a 01 mol L1 medir 833 mL de ácido clorídrico d 119 e diluir para 10 L com água destilada e desionizada b Soluções de calibração de 1000 mg L1 preparadas com solução comercial padrão Titrisol Cu diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada Zn diluir a solução em balão de 1 L com água destilada e desionizada d A seguir sugeremse as seguintes curvas de calibração para emprego na determinação de Cu e Zn por espectrometria de absorção atômica É importante observar que a concentração deverá ser ajustada para cada elemento de acordo com o manual de instruções do equipamento utilizado e Curva de calibração 1 transferir 2 mL da solução de calibração de Cu 1000 mg L1 e 1 mL da solução de calibração de Zn 1000 mg L1 para balão de 100 mL e completar o volume com a solução extratora de HCl a 01 mol L1 Essa solução contém 20 mg L1 de Cu e 10 mg L1 de Zn f Curva de calibração 2 transferir o seguinte volume da curva de calibração 1 para balão de 100 mL e completar o volume com a solução extratora de HCl a 01 mol L1 Curva de calibração 1 Concentração no extrato mg L1 mL Cu Zn 0 0 0 5 10 05 10 20 10 20 30 20 25 40 25 924 PROCEDIMENTO Medir com cachimbo 10 cm3 de solo e transferir para frascos cônicos de polietileno Adicionar 40 mL da solução extratora de HCl a 01 mol L1 Agitar por 30 min Em seguida deixar decantar a suspensão durante a noite 15 a 18 h Transferir 10 mL para copinhos plásticos descartáveis de 50 mL e determinar diretamente em concentração ou em absorbância os teores de Cu e de Zn OBSERVAÇÕES 1 Fazer a calibração do espectrômetro de absorção atômica utilizando as curvas de calibração Para transformar para mgdm3 de solo o valor da concentração em mg L1 deve ser multiplicado por 4 fator de diluição 2 Expressar o resultado em mgdm3 com uma casa decimal 3 Novas curvas de calibração devem ser preparadas quando a solução extratora for renovada para compensar possíveis contaminações provenientes da água ou do ácido 5 A determinação de micronutrientes exige sempre cuidados especiais principalmente em relação à qualidade dos reagentes e das vidrarias utilizados assim como à lavagem e à padronização na seqüência laboratorial 10 NITROGÊNIO TOTAL 101 MÉTODO KJELDAHL 1011 PRINCÍPIO Conversão do N orgânico do solo em sal de amônia pela oxidação completa da matéria orgânica do solo mediante reação com ácido sulfúrico concentrado e mistura de catalisadores cobre e selênio à temperatura em torno de 300oC O nitrogênio é quantificado por titulação após procedimento de destilação por arraste a vapor BREMNER 1965 ALVES et al 1994 BREMNER MULVANEY 1982 1012 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Balança analítica Capela com exaustor preparada para vapores ácidos Bloco digestor com termostato na faixa de 0 a 400oC Bureta de precisão 001 mL Destilador Manta aquecedora com espaço para balão de fundo redondo com capacidade para 5 L Medida de 11 g para a mistura catalisadora Pipetas volumétricas 2 5 e 10 mL Tubos de digestão ø 25 x 300 mm Conjunto de destilação FIGURA 1 Balão de fundo redondo com capacidade para 5 litros e rolha de borracha A Copo para um volume de 15 mL de NaOH 40 B Balão com boca esmerilhada de 125 mL C Condensador D Funil de proteção contra contaminação por condensação E Erlenmeyer com solução de ácido bórico com indicadores F Registro para controle do fluxo de vapor G Entrada de água do condensador H Entrada do vapor proveniente do balão sob aquecimento da manta I Descarte Ja Junta esmerilhada 1030 Jb Junta esmerilhada 1230 Jc Junta esmerilhada 1938 K Rolha de vidro para liberação do NaOH 40 L Corpo do destilador peça inteira churriada Figura 1 Esquema do destilador usado para as análises de N total do solo e N mineral NH4 e NO3 Modificado de TEDESCO GIANELO 1979 1013 REAGENTES E SOLUÇÕES a Mistura catalisadora 100 g de sulfato de potássio 10 g de sulfato de cobre e 1 g de selênio Os três reagentes antes de serem misturados devem ser finamente moídos 100 mesh b Ácido sulfúrico concentrado H2SO4 c Octanol pa d Ácido bórico a 1 dissolver 100 g de H3BO3 pa em 10 L em água destilada e Indicadores vermelho de metila 70 mg e verde de bromocresol 100 mg dissolvidos em 200 mL de metanol f H2SO4 a 05 mol L1 diluir 27 mL do ácido sulfúrico concentrado para um volume final de 1 L com água destilada g NaOH a 40 dissolver 2 kg do reagente pa em 5 L de água destilada h Água destilada i TRIS trishidroximetilaminometano preparar solução com 00300 mol L1 36342 gL1 j Solução de sulfato de amônio 1 mg10 mL1 de N 4714 mg L1 de NH42SO4 k Solo com teor de N conhecido padrão l Etanol 1014 PROCEDIMENTO Digestão da amostra adicionar 1000 g de amostra de solo TFSA 11 g da mistura catalisadora e 4 mL de ácido sulfúrico concentrado em tubo de ensaio para digestão Reservar 2 tubos para o branco somente mistura catalisadora e ácido sulfúrico e 2 tubos para um padrão interno que deve ser um solo finamente moído cujo teor de N é bem conhecido No caso de o solo apresentar alto teor de matéria orgânica 50 gkg1 adicionar 5 mL de ácido sulfúrico e 3 a 4 gotas de octanol evita a formação de espuma Colocar os tubos de ensaio no bloco digestor que deverá estar dentro de uma capela e aumentar a temperatura gradualmente iniciar com 100oC por 30 min passar a 150oC por 1 h levar a 300oC por 4 a 5 h e desligar o bloco digestor A temperatura ideal é atingida quando for observado o refluxo do ácido a aproximadamente 10 cm de altura no tubo Preparação da solução de ácido bórico indicador adicionar 200 mL da solução de indicadores a 10 L de solução de ácido bórico a 1 Caso seja necessário adicionar gotas de NaOH 01 mol L1 de forma a se obter solução de cor violeta Neste ponto o pH da solução estará muito próximo do ponto de viragem de cor do indicador ou seja mínimas quantidades de amônia que chegarem à solução alterarão significativamente a cor da solução para verdeazulado típica do indicador verde de bromocresol em meio alcalino Preparação da solução de ácido sulfúrico para titulação a escolha da concentração de ácido a ser preparada para titulação das amostras é baseada na provável concentração de N da amostra digerida Recomendase a concentração de ácido sulfúrico que condicione ao uso de cerca de 10 mL na titulação da amostra Podese fazer um pequeno ensaio com a seguinte fórmula Nac 000007144 x de N g100 g ou g100 mL x Pam mg ou Vam em mL em que Nac é a normalidade do ácido a ser usado de N é o teor de N do material a ser analisado Pam é a massa da amostra digerida ou no caso da solução Vam o volume digerido A mínima concentração de ácido que deve ser usada para que a visualização da mudança de cor do indicador seja fácil é de 0005 mol L1 Padronização do ácido sulfúrico para titulação em 3 erlenmeyers de 125 mL colocar 10 mL de da solução de ácido bórico indicador e volume conhecido da solução de TRIS O volume a ser colocado depende da concentração de ácido escolhida para a titulação normalmente utilizamse 5 mL de TRIS para solução ácida com concentração superior a 002 mol L1 e 2 mL para soluções entre 0005 mol L1 e 002 mol L1 Em seguida procede se a titulação com bureta graduada ou automática A concentração do ácido padronizado é calculada por meio da fórmula Nac NTRIS x VTRISVac em que Nac e Vac são a normalidade do ácido e o volume do ácido gasto na titulação do TRIS cuja normalidade e cujo volume usados foram expressos como NTRIS e VTRIS Procedimento de destilação após esfriamento dos tubos iniciase o processo de destilação a vapor Ligar a manta aquecedora que contém o balão com cerca de 5 L de água destilada Para uniformizar a ebulição da água adicionar bolinhas de vidro ou pedacinhos de cerâmica ao balão Ligar a água de resfriamento do condensador C um pouco antes do início da produção de vapor Quando o sistema iniciar a produção de vapor dágua fazer uma limpeza colocandose álcool no balão de boca esmerilhada B e no reservatório de NaOH A e proceder à destilação Em seguida repetese o processo com água destilada para completar a limpeza do aparelho Para avaliar a qualidade do processo de destilação adicionar 10 mL de água destilada no balão de boca esmerilhada e conectálo ao sistema L Colocar 10 mL da solução de ácido bórico a 2 com indicadores em erlenmeyer E deixandoo abaixo da saída do condensador do aparelho de destilação de tal maneira que a saída do condensador fique 4 cm acima da superfície da solução Colocar 15 mL da solução de NaOH 40 no copo A e lentamente deixar escorrer essa solução para o frasco de destilação retirar lentamente a rolha K Abrir a válvula do vapor F e proceder à destilação até o volume da solução no erlenmeyer E que contém a solução de ácido bórico a 2 com indicadores e chegar em 75 mL o que deverá ocorrer num intervalo de 4 min aproximadamente Após a destilação o condensado faz com que a solução de ácido bórico a 2 com indicadores passe do vermelho para o verdeazulado Retirar o erlenmeyer e titular com o ácido sulfúrico padrão Adicionar o ácido até a solução mudar do verdeazulado para o vermelho Repetir o procedimento adicionando 10 mL da solução de calibração de NH42SO4 A água destilada serve como branco para a solução de calibração de NH42SO4 Calcular a quantidade de N existente na solução de calibração e avaliar a condição do sistema Caso a recuperação de N da solução de calibração seja inferior a 98 checar todas as conexões para possível vazamento e limpar novamente o aparelho Uma vez garantido o bom funcionamento do destilador proceder à destilação do material digerido iniciar com um branco e em seguida processar as amostras Recomendase destilar a segunda prova em branco após a destilação de todas as amostras Após a destilação do material digerido limpar o aparelho conforme descrito anteriormente Cálculo Teor gkg1 de N na amostra de solo N Ta Tb x 14 x NapPa x 1000 em que Ta título da amostra em mL Tb título do branco em mL Nap normalidade do ácido sulfúrico padronizado e Pa massa da amostra em mg OBSERVAÇÕES 1 A digestão de Kjeldahl é normalmente conduzida em bloco digestor de alumínio com capacidade para vários tubos em geral 40 unidades e aquecido eletricamente Para fins de monitoramento utilizamse 2 tubos com uma amostrapadrão com teor de N conhecido referência Recomendase que semanalmente se faça a verificação de temperatura em todo o bloco 2 A utilização de tituladores automáticos com leitura digital é conveniente nessas titulações pois diminui os erros de operação 102 INCLUSÃO DE NITRATO E NITRITO NA QUANTIFICAÇÃO DO NITROGÊNIO TOTAL 1021 PRINCÍPIO Redução do nitrato e do nitrito a amônio pela oxidação da liga de Devarda reagente que contém cobre alumínio e zinco na proporção de 50455 em meio ácido Liao 1981 1022 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Balança analítica 1023 REAGENTES E SOLUÇÕES Liga de Devarda Octanol pa Ácido sulfúrico 3 mol L1 diluir 167 mL de ácido sulfúrico concentrado no volume final de 1 L em água destilada 1024 PROCEDIMENTO Em adição ao procedimento de análise de N total do solo após a colocação da amostra 1 g de solo no tubo de digestão acrescentar 02 g de liga de Devarda e 6 mL de ácido sulfúrico a 3 mol L1 Levar ao bloco digestor e manter a temperatura entre 100 e 150C até a solução iniciar a fervura Caso haja formação de espuma adicionar 2 ou 3 gotas de octanol aos tubos Após 30 min retirar os tubos deixar esfriar e adicionar 11 g da mistura catalisadora e 3 mL de ácido sulfúrico concentrado e continuar com o procedimento de digestão para análise de N total OBSERVAÇÕES O método de digestão de Kjeldhal inclui somente a fração do nitrato e do nitrito presente no solo que varia dependendo do solo Como normalmente a fração do N total do solo na forma de NO3 ou NO2 é muito pequena a não inclusão dessas formas de N não resulta em erros significativos A metodologia descrita é recomendada no caso de solos recentemente adubados com fertilizante nitrogenado ou adubo verde quando as formas minerais oxidadas do N se tornam significativas 103 NITROGÊNIO MINERAL NH4 E NO3 1031 PRINCÍPIO Extração de amônio e nitrato e nitrito do solo com solução de KCl a 2 mol L1 sendo a quantificação feita por titulação após arraste a vapor da amônia formada com a alcalinização do extrato pela adição de óxido de magnésio O nitrato e o nitrito é incluído após redução a amônio pela adição da liga de Devarda 1032 MATERIAL E EQUIPAMENTOS Balança 0001 g Medidas de aproximadamente 300 mg para MgO e de 300 mg para a liga de Devarda Bureta de precisão 001 mL Rolo de papelalumínio ou cadinhos de alumínio para dosar umidade do solo Manta aquecedora com espaço para balão de fundo redondo com capacidade para 5 L Pipetas volumétricas 2 5 e 10 mL Balão de fundo redondo com capacidade para 5 L e rolha de borracha Conjunto destilador descrito na FIGURA 1 A não é usado nesta determinação B Balão com boca esmerilhada de 250 mL C Condensador D Funil de proteção contra contaminação por condensação E Erlenmeyer com solução de ácido bórico com indicadores F Registro para controle do fluxo de vapor G Entrada de água do condensador H Entrada do vapor proveniente do balão sob aquecimento da manta I Descarte Ja Junta esmerilhada 1030 Jb Junta esmerilhada 1230 Jc Junta esmerilhada 1938 K não é usado nesta determinação L Corpo do destilador 1033 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de cloreto de potássio 2 mol L1 pesar 149 g de KCl em frasco com volume de 1 L e completar o volume com água destilada b Ácido bórico a 1 100 g de H3BO3 pa no volume final de 10 L em água destilada c Óxido de magnésio calcinado colocar em mufla a 600C por 6 h quantidade de MgO suficiente para a análise d Liga de Devarda e Octanol pa f H2SO4 05 mol L1 diluir 29 mL do ácido sulfúrico concentrado para volume final de 1 L com água destilada g Solução trishidroxiaminometano TRIS preparar solução 003 mol L1 36342 g L1 h Solução de sulfato de amônio e nitrato de potássio 1 mg de NNH4 1 mg de NNO3 em 10 mL i Álcool etílico 1034 PROCEDIMENTO Determinação da umidade da amostra pesar em papelalumínio previamente tarado cerca de 20 g da amostra do solo para análise Anotar a massa e levar para secagem em estufa a 105oC até atingir massa constante cerca de 48 h Anotar a massa da amostra seca Descontando a massa do papelalumínio obtémse o conteúdo de água da amostra por diferença entre a massa da amostra úmida e a massa da mesma amostra seca Extração com KCl 2 mol L1 pesar cerca de 30 g da amostra de solo úmido e colocar em erlenmeyer de 250 mL Adicionar 150 mL da solução de KCl a 2 mol L1 e agitar a 220 rpm por 1 h Filtrar o extrato ou deixar decantar por uma noite Devese recuperar o volume de 150 mL da solução de KCl a 2 mol L1 Se a análise não puder ser efetuada no mesmo dia da extração armazenar os extratos em geladeira no máximo por 1 semana Preparação da solução de ácido bórico indicador adicionar 200 mL da solução de indicadores a 10 L de solução de ácido bórico a 1 Caso seja necessário adicionar gotas de NaOH 01 mol L1 de forma a se obter solução de cor violeta Neste ponto o pH da solução está muito próximo do ponto de viragem de cor do indicador ou seja mínimas quantidades de amônia que chegarem à solução alterarão significativamente a cor da solução para verdeazulado típica do indicador verde de bromocresol em meio alcalino Padronização do ácido sulfúrico para titulação em 3 erlenmeyers de 125 mL colocar 10 mL da solução de ácido bórico indicador e um volume conhecido da solução de TRIS O volume a ser colocado depende da concentração de ácido escolhida para a titulação normalmente utilizamse 2 mL para soluções entre 0005 mol L1 e 002 mol L1 que são as mais comuns nesta análise Em seguida procedese à titulação com bureta graduada A concentração do ácido padronizado é calculada por meio da fórmula Nac NTRIS x VTRISVac em que Nac e Vac são a normalidade do ácido e o volume do ácido gasto na titulação do TRIS cuja normalidade e cujo volume usados são expressos como NTRIS e VTRIS Procedimento de destilação completar o volume do reservatório de água destilada do balão 5 L na manta aquecedora Adicionar uma porção de bolinhas de vidro previamente secas em estufa ao balão Ligar a manta Quando a produção de vapor se iniciar ligar a torneira que fornece água ao condensador C Antes de iniciar a análise preencher o balão 250 mL de amostra B que compõem o sistema de análise com álcool etílico Colocar um erlenmeyer E na saída do condensador para coletar o álcool destilado Destilar o álcool por 5 min Repetir o processo com água destilada Esse processo é feito para limpar o sistema antes de se iniciarem as análises Após a limpeza fazse a verificação do sistema quanto à recuperação de N Iniciase com a destilação de 80 mL de água destilada coletandose o destilado em erlenmeyer que contenha 10 mL de ácido bórico com indicadores E Nesse procedimento após a colocação do extrato no balão do aparelho B adicionase uma medida de óxido de magnésio ao balão e imediatamente encaixase o balão no sistema A destilação deve ser mantida até que o volume do coletado seja de 75 mL Em seguida retirase o balão do aparelho acrescentase a ele uma medida de liga de Devarda e imediatamente recolocase o balão de volta ao aparelho Um novo erlenmeyer com 10 mL da solução de ácido bórico indicador é colocado para coletar o condensado A destilação com óxido de magnésio libera o N amoniacal que é coletado no ácido bórico e é quantificado após titulação com ácido sulfúrico Na segunda etapa a adição de liga de Devarda reduz o nitrato a amônio que é arrastado pelo vapor condensado e coletado no outro erlenmeyer com ácido bórico Em seguida repetese o processo de destilação com o padrão de sulfato de amônio transferir 10 mL da solução de 1 mg de N NH4 ou NO3 10 mL e completar o volume do balão para 80 mL Calculase a quantidade de N recuperado com a equação mg de N Vac Vb x 14 x Nac em que Vac e Nac são o mesmo referido anteriormente e Vb é o volume de ácido gasto com o branco que no caso foi a água destilada A partir desse procedimento podese avaliar o funcionamento do aparelho Caso a recuperação de NNH4 ou NNO3 da solução de calibração seja inferior a 98 ou superior a 102 a análise deve ser repetida Uma vez feita essa avaliação preliminar iniciar a análise dos brancos de KCl filtrados se for o caso e em seguida fazer a análise dos extratos das amostras de solo Após a análise de todas as amostras fazer a limpeza do sistema com o álcool coletado no início do trabalho Cálculos mEqac Vac Vab x Nac em que mEqac quantidade de miliequivalentes de ácido gasta na titulação da amostra Vac volume mL de ácido gasto na titulação da amostra Vb volume mL de ácido gasto na titulação do branco e Nac normalidade do ácido Como as substâncias reagem equivalente a equivalente mEqac mEq da forma de N mineral titulada a quantidade em mg de N NH4 ou NO3 presente na alíquota de extrato analisada é igual ao miliequivalentegrama de N 14007 mg x mEqac ou seja NNH4 ou N NO3 mg 14007 x Nac x Vac Para obter a concentração de Nmineral no extrato basta dividir o resultado obtido no passo anterior pelo volume da alíquota usada na destilação Val Logo NNH4 ou NNO3 mgmL1 14007 x Nac x VacVal Contudo o objetivo principal da ánalise do solo é saber o teor de N no solo Para isso basta multiplicar a equação anterior pelo volume total de extrato utilizado na extração Vt somado ao volume de água preexistente na massa de amostra Vaa usada na extração tomando como base a umidade da amostra determinada e dividir o resultado pela massa do solo seco Ps em kg Logo NNH4 ou NNO3 mgkg1 14007 x Nac x VacVal 1 x Vt VaaPs 1 OBSERVAÇÕES o extrato aquoso de 11 por filtração simples Umidade residual e fator f Pesar 5 g de terra fina em pesafiltro previamente tarado transferir para estufa a 105C e deixar durante uma noite Retirar da estufa colocar em dessecador e pesar com aproximação de 005 g Em seguida calcular a umidade residual e o fator de umidade com as seguintes expressões Umidade residual 5 massa da amostra seca a 105ºC x 20 e Fator f 100 100 umidade residual em Porcentagem de água na pasta de saturação pesar 50 g de terra fina em copo plástico de 100 mL Adicionar pouco a pouco água destilada contida em uma bureta de 50 mL agitando com bastão de vidro Após concluir a operação quando a pasta se tornar fluida e com a superfície espelhada Anotar o volume gasto e calcular a porcentagem de água na pasta de saturação com a seguinte expressão Água na pasta saturada mL de água gastos x 2 x f Valor 2 utilizado para corrigir o volume gasto de água para 100 g de amostra Condutividade elétrica CE no extrato aquoso 11 Após anotar o volume gasto para se obter o extrato de saturação continuar adicionando água até o volume total de 50 mL extrato 11 Em seguida agitar esporadicamente e deixar em repouso por uma noite Filtrar em papelfiltro comum e utilizar o filtrado mesmo sendo turvo para medir a CE na ponte de condutividade Medir a temperatura do extrato e ajustar o condutivímetro para essa temperatura Aferir a leitura do aparelho com solução de KCl a 001 mol L1 CE de 14 dSm1 a 25ºC Calcular o valor da CE correspondente ao extrato de saturação com a seguinte expressão CE no extrato de saturação dSm1 a 25ºC CE no extrato 11 x 100 água na pasta saturada em Para ajustar o valor calculado da capacidade de troca catiônica CTC a valores mais próximos do real CTCaj em mmolcdm3 descontando os cátions que se encontram como sais solúveis na solução do solo utilizase a seguinte equação considerando que 10 x CE dSm1 mmolc de cátions por litro do extrato RICHARDS 1954 CTCaj CTC 01 x CE no extrato de saturação x água na pasta saturada em 12 ANÁLISE FÍSICA 121 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO SOLO MÉTODO DA PIPETA 1211 PRINCÍPIO Baseiase na dispersão química com solução de hexametafosfato de sódio ou hidróxido de sódio e física agitação mecânica dos agregados ou unidades estruturais em partículas primárias areia silte e argila seguida da combinação de tamisação e processo de sedimentação para posterior quantificação proporcional de cada partícula em gkg1 A fração de areia grossa θ 20 a 02 mm e a fração de areia fina θ 02 a 005 mm são separadas por tamisação A fração de argila θ 0002 mm é separada pelo princípio da lei de Stokes STOKES 1851 a qual admite que a sedimentação e a resistência são inteiramente devidas à viscosidade do líquido que as partículas são lisas e esféricas e que não há nenhuma interação entre as partículas na solução A fração de silte θ 005 a 0002 mm é obtida por diferença 1212 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Agitador elétrico de haste vertical Estufa Dessecador Pipetador de borracha Balança analítica 1213 REAGENTES E SOLUÇÕES a dispersante químico solução de hidróxido de sódio naoh 1 mol l1 pesar 40 g do naoh e dissolver em água destilada e completar o volume para 1 l b dispersante químico solução de hexametafosfato de sódio na4p2o710 h2o pesar 357 g do hexametafosfato dissolver em água contida em balão de 1 l adicionar 794 g do carbonato de sódio anidro e completar o volume c álcool a 60 diluir 600 ml de álcool etílico 98ºgl em água até completar 1 l aferir a solução com alcoômetro d água oxigenada a 30 volumes obtida no comércio e solução de hcl a 10 diluir 100 ml de hcl concentrado em água e completar o volume para 1 l 1214 PROCEDIMENTO Transferir 20 g de TFSA em copo plástico de 250 mL adicionar 100 mL de água destilada e 10 mL de solução de carbonato de sódio ou 10 mL de dispersante químico Agitar com bastão de vidro e deixar em repouso durante uma noite cobrindo o copo com vidro de relógio Transferir o conteúdo para copo metálico do agitador elétrico com o auxílio de pisseta com água destilada deixando o volume em torno de 300 mL Colocar o copo no agitador e proceder à agitação durante 15 min para solos argilosos e de textura média e durante 5 min para os arenosos Na dúvida agitar por 15 min Passar o conteúdo em peneira de 20 cm de diâmetro e malha de 0053 mm colocada sobre um funil apoiado em um suporte tendo logo abaixo uma proveta de 1 L Lavar o material retido na peneira e completar o volume do cilindro até o aferimento Transferir a fração de areia grossa e fina para lata de alumínio numerada e de massa conhecida e colocar na estufa Após secagem deixar esfriar e pesar com aproximação de 005 g Preparar prova em branco PB transferindo para proveta de 1 L a mesma quantidade de dispersante 10 mL de solução com 1 mol L1 de hidróxido de sódio ou solução de hexametafosfato de sódio utilizado no copo de plástico de 250 mL e completar com água Medir a temperatura da prova em branco e da amostra e determinar o tempo de sedimentação Tabela 1 Agitar a suspensão com a amostra de solo durante 20 seg com bastão cuja extremidade inferior possua um disco plástico de diâmetro um pouco menor do que o do cilindro ou da proveta e com vários furos Marcar o tempo após concluir a agitação A sedimentação deve ocorrer sob temperatura constante e livre de qualquer agitação Passado o tempo de sedimentação Tabela 1 introduzir cuidadosamente para evitar turbulência pipeta de 50 mL com pipetador automático de borracha no centro da proveta até a profundidade de 5 cm e coletar a suspensão Transferir para cápsula de porcelana ou béquer numerado e de massa conhecida juntamente com a porção de água destilada proveniente da lavagem interna da pipeta Repetir essa operação para a prova em branco Colocar a cápsula na estufa a 105ºC e deixar secar completamente Retirar colocar em dessecador deixar esfriar e pesar com aproximação de 00001 g Calcular os valores das frações de acordo com as seguintes expressões teor de areia gdm3 areia em gramas x 5 000 teor de silte gdm3 10000 argila em gramas areia em gramas e teor de argila gdm3 argila em gramas PB PB x 10000 em que PB prova em branco ou fator de correção do dispersante em gramas Tabela 1 Tempo de sedimentação para a coleta da fração de argila θ 0002 mm com pipeta à profundidade de 5 cm Temperatura ºC Tempo de sedimentação Temperatura ºC Tempo de sedimentação 10 5h 11 23 3h 43 11 5h 03 24 3h 38 12 4h 55 25 3h 33 13 4h 47 26 3h 28 14 4h 39 27 3h 24 15 4h 33 28 3h 19 16 4h 26 29 3h 15 17 4h 20 30 3h 10 18 4h 12 31 3h 07 19 4h 06 32 3h 03 20 4h 00 33 2h 58 21 3h 54 34 2h 55 22 3h 48 35 2h 52 OBSERVAÇÕES 1 Se após proceder à dispersão da amostra de solo com adição de NaOH e agitação mecânica for observada rápida queda da fração de argila ou seja a suspensão passa de turva para clara em até 30 min é necessário que se faça prétratamento para auxiliar na dispersão da amostra Inicialmente tentase a dispersão aplicandose 10 mL de hexametafosfato de sódio Se persistir o problema adicionar 10 mL de HCl a 10 à amostra original e agitar com bastão de vidro até quando não se observar mais efervescência Cobrir com vidro de relógio e deixar em repouso uma noite Adicionar mais 5 a 10 mL do ácido e verificar a ausência de efervescência Transferir a amostra para funil de vidro com papelfiltro Lavar a amostra com água até que uma pequena porção do filtrado não apresente reação de cloretos pelo nitrato de prata Colocar o papelfiltro com a amostra numa bandeja para secar ao ar Homogeneizar a amostra e em seguida pesar a quantidade necessária para a análise granulométrica 2 Para solos ricos em matéria orgânica teor 50 g kg1 coloração escura colocar 50 g de solo em cápsula de porcelana adicionar um pouco de água e porções sucessivas de água oxigenada a 30 volumes 5 a 10 mL Agitar com bastão de vidro e verificar a reação efervescente Suspender a adição da água oxigenada cobrir a cápsula com vidro de relógio e deixar em repouso durante uma noite Repetir a operação até total finalização de reação Colocar a cápsula para secar em estufa entre 50oC e 60ºC e depois adicionar uma última quantidade de água oxigenada 5 mL Passar a amostra para funil de vidro com papelfiltro e lavar várias vezes com água 3 a 5 vezes Secar a amostra ao ar homogeneizar e pesar a quantidade necessária para a análise granulométrica 3 Para separar a areia fina da areia grossa proceder da seguinte maneira lavar a areia retida na peneira de 0053 mm com jato forte de água Com o auxílio de pisseta cuidadosamente transferir a fração de areia grossa fina para recipiente de alumínio de massa conhecida e levar para estufa a 105ºC Após secagem completa colocar o recipiente com a fração de areia grossa fina em dessecador para resfriar e em seguida pesar com aproximação de 005 g Após pesagem passar a fração de areia para peneira com malha de 02 mm no 70 sobre recipiente de metal de mesmo diâmetro normalmente fornecido pelo fabricante das peneiras e separar a areia grossa Passar a areia fina para um recipiente de alumínio previamente tarado e proceder à pesagem 122 CAPACIDADE DE RETENÇÃO DE ÁGUA DO SOLO 1221 PRINCÍPIO Também denominada de umidade obtida no aparelho extrator de Richards RICHARDS 1941 esta análise se baseia na aplicação de diferentes tensões em amostras de solo saturadas até que elas parem de perder água sendo possível assim construir um gráfico relacionando a umidade da amostra com a tensão aplicada no aparelho conhecida como curva característica de retenção de umidade do solo 1222 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Aparelho extrator de Richards Placa de cerâmica de 01 03 e 15 MPa Compressor Estufa Balança analítica 1223 PROCEDIMENTO Podese utilizar amostras indeformadas e deformadas Para amostras deformadas TFSA distribuir anéis de PVC de 5 cm de comprimento e 1 cm de altura na placa porosa e transferir 25 a 30 g de TFSA para o interior dos anéis Compactar levemente com auxílio da base lisa de um recipiente de mesmo diâmetro Adicionar água na placa de cerâmica até que o nível desta fique bem próximo da borda do anel de PVC Deixar as amostras nessas condições até completa saturação geralmente durante uma noite As amostras indeformadas também devem ser saturadas Para isso retirar a tampa da parte superior colocar tecido do tipo morim na borda cortante do cilindro parte inferior prender com elástico e colocar em bandeja com água por 24 h Após a saturação das amostras retirase os cilindros da bandeja e deixase escorrer o excesso de água Em seguida pesase o cilindro e anotase o valor que vai caracterizar a porcentagem de saturação Colocar a placa de cerâmica de 01 MPa por cerca de 2 h para saturar depois introduzila no aparelho extrator de Richards apertar bem os parafusos e abrir os reguladores de pressão gradativamente até que o manômetro acuse 0006 Mpa Quando cessar a drenagem descarregar a pressão abrir o aparelho retirar as amostras e pesar Esse valor é a base do cálculo para o primeiro ponto da curva Retornar a amostra ao aparelho sobre a placa de 01 MPa e regular a pressão para 001 Mpa Repetir essas operações até a última pressão de 15 Mpa em que para as tensões de 05 1 e 15 Mpa utilizar placa de 15 Mpa Após pesar o cilindro retirado da última pressão 15 MPa pesase o elástico que prendia o tecido de morim Levar o cilindro para a estufa a 1050C e no dia seguinte pesar o cilindro com a amostra seca Retirar a amostra do cilindro e pesar o cilindro vazio mais o pedaço de tecido de morim Calcular a umidade obtida em cada tensão aplicada com a seguinte expressão Em pp Umidade MPa 100 a b e b Em pv Umidade MPa 100 a b v em que a massa da amostra após ser submetida à pressão utilizada 001 0033 01 05 1 ou 15 Mpa b massa em gramas da amostra seca a 105oC e v volume em centímetros cúbicos do cilindro πr2h OBSERVAÇÃO O uso de amostras indeformadas é mais recomendável pois essas preservam a estrutura do solo o que interfere na retenção de água especialmente nas tensões abaixo de 15 Mpa quando se deseja calcular a macroporosidade a microporosidade e a capacidade de armazenamento de água disponível CAD 123 DENSIDADE DO SOLO 1231 PRINCÍPIO A densidade do solo ou densidade aparente relaciona a massa do solo ao volume ocupado por essa massa mais seu espaço poroso Dessa forma o método do anel volumétrico baseiase na coleta de amostras com estrutura indeformada utilizando um anel de aço de bordas cortantes cujo volume interno é em geral de 50 cm3 conhecido como anel de Kopecky podendo também se utilizar outro anel de volume similar 1232 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa Balança analítica Anel de Kopecky ou cilindro volumétrico com instrumento guia 1233 PROCEDIMENTO As amostras podem ser coletadas pela superfície do solo ou dentro de uma trincheira na face do horizonte do solo Limpar a superfície com faca ou espátula posicionar o cilindro no solo e acoplar o instrumento guia Inserir o cilindro no solo martelando sutilmente o instrumento guia até que o solo saia 3 mm do cilindro Para retirar o cilindro escavar com excesso de solo nas extremidades do cilindro Cuidadosamente aparar as extremidades do cilindro retirando o excesso de solo com faca ou espátula Transferir o conteúdo amostra de solo do cilindro para saco plástico ou recipiente limpos Transferir a amostra para recipiente de alumínio numerado e de massa conhecida Colocar na estufa a 105ºC e após 24 a 48 h retirar deixar esfriar e pesar Após determinar o volume do cilindro calcular a densidade do solo com a seguinte expressão Densidade do solo kgdm3 ab em que a massa da amostra seca a 105 ºC kg e b volume do anel ou cilindro dm3 OBSERVAÇÃO 1 Se após a retirada da amostra for observado que a massa do solo não preencheu totalmente o anel repetir a amostragem 2 Verificar após a retirada da amostra do anel volumétrico a eficiência da amostragem e registrar se for o caso a presença do enrugamento na extremidade da amostra presença de raízes ou canais 3 Pelo fato de os solos apresentarem alta variabilidade no campo a densidade varia consideravelmente especialmente onde poros maiores ocorrem Assim recomendase várias repetições Rowell 1994 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU CA ABREU MF RAIJ B VAN BATAGLIA OC ANDRADE JC Extraction of boron from soil by microwave heating for ICPAES determination Communications in Soil Science and Plant Analysis v25 p 33213333 1994 ALVES BJR SANTOS JCF URQUIAGA S BODDEY RM Métodos de determinação do nitrogênio em solo e planta In HUNGRIA M ARAUJO RS ed Manual de métodos empregados em estudos de Microbiologia Agrícola Brasília EMBRAPA SPI 1994 p449470 BREMNER JM Inorganic forms of nitrogen In BLACK CA ed Methods of soil analysis Wisconsin American Society of Agronomy 1965 p11791237 BREMNER JM MULVANEY CS Nitrogen Total In PAGE AL MILLER RH KEENEY DR ed Methods of soil analysis chemical and microbiological properties 2ed Madison American Society of Agronomy Soil Science Society of Agronomy 1982 v2 p539579 ASA Agronomy 9 CAMARGO AO DE MONIZ AC JORGE JA VALLADARES JMAS Métodos de análise química mineralógica e física de solos do Instituto Agronômico de Campinas Campinas IAC 1986 94p IAC Boletim Técnico 106 EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa de Solos Rio de Janeiro RJ Manual de métodos de análises de solo 2ed Rio de Janeiro 1997 212p EMBRAPACNPS Documentos 1 KEENEY DR NELSON DW Nitrogen Inorganic forms In PAGE AL MILLER RH KEENEY DR Methods of soil analysis Chemical and microbiological properties Madison American Society of Agronomy Soil Science Society of Agronomy 1982 v2 p643698 ASA Agronomy 9 LIAO CFH Devardas alloy method for total nitrogen determination Soil Science Society of America Journal v45 p852855 1981 NOGUEIRA AR DE A MACHADO PLO DE A CARMO CAF DE S DO FERREIRA JR Manual de Laboratórios Solo Água Nutrição Vegetal Nutrição Animal e Alimentos 1 Coleta acondicionamento e preparo de amostra São Carlos EMBRAPACPPSE 1998 72p PAVAN MA BLOCH MF ZEMPULSKI H da C ZOCOLER DC Manual de análise química de solo e controle de qualidade Londrina IAPAR 1992 40p PEREIRA MG VALLADARES GS SOUZA JMPF PÉREZ DV DOS ANJOS LHC Estimativa da acidez potencial pelo método do pH SMP em solos do Estado do Rio de Janeiro Revista Brasileira de Ciência do Solo Campinas v22 p159162 1998 QUAGGIO JA RAIJ B VAN Comparação de métodos rápidos para a determinação da matéria orgânica em solos Revista Brasileira de Ciência do Solo Campinas v3 p184187 1979 RAIJ B VAN ANDRADE JC CANTARELLA H QUAGGIO J A Análise química para avaliação da fertilidade de solos tropicais Campinas Instituto Agronômico 2001 285p RICHARDS LA A pressuremembrane extraction apparatus for soil solution Soil Science v51 p377386 1941 RICHARDS LA ed Diagnosis and improvement of saline and alkali soils Washington USDA 1954 160p Handbook 60 ROWELL DL Soil Science methods and applications Edimburgh Gate Longman Group 1994 350p SILVA FC EIRA PA DA BARRETO W de O PÉREZ DV SILVA CA Manual de métodos de análises químicas para avaliação da fertilidade do solo Rio de Janeiro EMBRAPACNPS 1998 56p Documentos 3 SOUZA SS SILVA FV Calibração de forno de microondas Experimento 1 IN III Workshop sobre Preparo de Amostras São Carlos SP 2000 STOKES GG On the effect of the lateral friction of fluids on the motion of pendulums Transactions Cambridge Philosophical Society Cambridge v9 p8106 1851 TEDESCO MJ GIANELLO C Conjunto modulado em vidro para destilação a vapor de amônia pelo método Kjeldahl Revista Brasileira de Ciência do Solo Campinas v3 p6163 1979 TEDESCO MJ GIANELLO C BISSANI CA BOHNEN H VOLKWEISS SJ Análise de solo plantas e outros materiais Porto Alegre UFRGS 1997174p VITTI GC Avaliação e interpretação do enxofre no solo e na planta Jaboticabal FUNEP 198937p WALKLEY A A critical examination of a rapid method for determining organic carbon in soils Effect of variation in digestion condition and of inorganic constituents Soil Science Madison v63 p251264 1947 WALCKLEY A BLACK IA An examination of the Degtjareff method for determining soil organic matter and proposed modification of the chromic acd titration method Soil Science Baltimore v37 p2938 1934 CAPÍTULO 7 ÁGUA Ana Cândida Primavesi1 Aluísio G de Andrade2 Bruno José Rodrigues Alves3 César de Rosso4 Edyr M Batista5 Hélio Teixeira Prates6 Fábio R Ortiz7 Jomar Mello7 Marcos Roberto Ferraz8 Nirceu W Linhares9 Pedro LO de A Machado2 coordenador Regina Moeller10 Rita de Cássia Souza Alves11 William Marra Silva12 1 INTRODUÇÃO A água é material vital para a agricultura Assim a análise desse recurso natural tem sido conduzida em diversos laboratórios da Embrapa visando conhecer suas características químicas antes de utilizála para os mais variados fins Além disso o interesse em analisar a água vem crescendo ultimamente com a necessidade de se proteger o ambiente de determinado tipo de poluição ou degradação GREENBERG ET AL 1992 HUNT WILSON 1995 Aqui são apresentados e descritos os procedimentos mais comumente adotados nas Unidades da Embrapa 2 pH 21 Princípio O pH de uma solução se baseia na atividade dos íons de hidrogênio presentes na solução e é definido como log H 1Embrapa Pecuária Sudeste 2Embrapa Solos 3Embrapa Agrobiologia 4Embrapa Meio Ambiente 5Embrapa Acre 6Embrapa Milho e Sorgo 7Embrapa Soja 8Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos USP 9Embrapa Cerrados 10Embrapa Amazônia Oriental 11Embrapa Roraima 12Embrapa Agropecuária Oeste 22 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Potenciômetro Eletrodo de vidro combinado 23 REAGENTES E SOLUÇÕES a padrão de ph 401 ou tampão 401 uso de solução comercial ou em béquer pesar exatamente 14189 g de na2hpo4 previamente seco e 13601 g de kh2po4 dissolvêlos em água e em balão volumétrico completar com água destilada até 1 l manter sob refrigeração 4ºc b padrão de ph 700 ou tampão 700 uso de solução comercial ou em béquer pesar exatamente 51054 g de ftalato ácido de potássio ou biftalato de potássio dissolvêlo em água e em balão volumétrico completar com água destilada até 1 l manter sob refrigeração 4ºc c solução de kcl 3 mol l1 saturada com agcl dissolver 22363 g de cloreto de potássio em cerca de 80 ml de água destilada e adicionar cerca de 007 g de nitrato de prata agno3 e completar para 100 mL Ocorre a formação de um precipitado Guardar em ambiente escuro 24 PROCEDIMENTO Lavar o eletrodo com água destilada usando depois um papel absorvente para retirar a água sem atritar o papel no eletrodo Calibrar o potenciômetro com os padrões de pH de acordo com normas do fabricante do equipamento Transferir parte da amostra para um béquer evitando a agitação da amostra para evitar absorção de gases e assim variação do pH e colocar o eletrodo de vidro Esperar a estabilidade da resposta se o potenciômetro não fizer compensação automática da temperatura medila e ajustar o aparelho e fazer a leitura Evitar que o bulbo do eletrodo toque nas paredes ou no fundo do béquer OBSERVAÇÕES 1 Remova a tampa que cobre o respiro apenas durante a medida mantendoo tampado quando em repouso 2 O nível da solução do eletrodo de referência deve ser mantido próximo ao respiro 05 1 cm abaixo Completar se necessário com KCl a 3 mol L1 saturado com AgCl 3 A resposta do eletrodo deve ser superior a 95 da resposta teórica Alguns aparelhos fornecem a estabilidade do eletrodo drift e valores aceitáveis estão na faixa de 2 mVmin 4 Amostras que contém sulfeto tendem a afetar o diafragma que faz contato elétrico entre o eletrodo de referência e a solução quanto menor for o teor de sais dissolvidos mais lenta será a resposta do eletrodo 3 CÁLCIO E MAGNÉSIO 31PRINCÍPIO Baseiase na determinação de teores de cálcio e de magnésio dissolvidos em amostras de água em espectrofotômetro de absorção atômica 32 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Espectrofotômetro de absorção atômica 33 REAGENTES E SOLUÇÕES Solução de lantânio a 10 pesar em béquer 117 g de óxido de lantânio La2O3 umedecer com água e adicionar aos poucos 500 mL de HCl concentrado em capela Após esfriar completar o volume com água para 1 L Solução de lantânio a 11 medir 11 mL da solução de lantânio a 10 e diluir com água para 100 mL 34 PROCEDIMENTO As determinações são efetuadas em espectrofotômetro de absorção atômica Em 10 mL das amostras e da curva de calibração 00 e 10 mg L1 de Ca e Mg é adicionado 1 mL da solução de lantânio a 11 resultando em concentração final de 1000 mg L1 de La nos extratos de leitura Os resultados são expressos em mg L1 4 SÓDIO E POTÁSSIO 41PRINCÍPIO Quando uma solução que contém diversas substâncias é atomizada e as minúsculas partículas da solução são projetadas sobre uma chama há excitação dos átomos isto é há deslocamento de certos elétrons a níveis energéticos mais elevados quando os átomos voltam ao seu nível energético natural há emissão da energia absorvida na forma de radiação Os átomos excitados do elemento de interesse emitem luz em certos comprimentos de onda discretos e característicos do elemento A radiação de comprimento de onda de interesse é separada da radiação emitida remanescente e sua intensidade é medida Essa medida de intensidade pode ser relacionada diretamente com a concentração do elemento de interesse comparandose a intensidade medida com uma curva de calibração 42 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Fotômetro de chama Vidrarias Pipetas volumétricas 43 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Solução 1000 mg L1 de potássio dissolver 19067 g de KCl pa seco em estufa a 100ºC por 2 h e completar o volume a 1000 mL com água Armazenar em frasco de polietieno sob refrigeração c Curva de calibração de potássio em balões volumétricos de 100 mL transferir 00 05 10 15 e 20 mL da solução 1000 mg L1 K completando o volume com água desionizada Essas soluções contêm respectivamente 00 50 100 150 e 200 mgL1 de K d Solução 1000 mg L1 de sódio dissolver 25421g de NaCl pa seco em estufa a 100ºC por 2 h completando o volume a 1000 mL com água Armazenar em frasco de polietieno sob refrigeração e Curva de calibração de sódio em balões volumétricos de 100 mL transferir 00 05 10 15 e 20 mL da solução 1000 mg L1 Na completando o volume com água desionizada Essas soluções contêm respectivamente 00 50 100 150 e 200 mgL1 de Na 44 PROCEDIMENTO A determinação de Na e K deverá ser realizada diretamente nas amostras de água Calibrar o fotômetro de chama com os pontos 0 e 20 mg L1 de K da curva de calibração Quando da estabilização do aparelho iniciar as leituras da curva de calibração e das amostras O mesmo procedimento deverá ser feito para a determinação de Na Observações 1 Os teores de Na e K nas amostras são obtidos a partir da relação entre a porcentagem de emissão x concentração 2 Para facilitar o trabalho podese preparar curva de calibração mista K e Na 3 O espectrômetro de absorção atômica deverá ser preferencialmente utilizado no modo emissão Porém os custos serão mais elevados em função da utilização de acetileno em lugar de propano fotômetro de chama 4 ICP OES apresenta maior sensibilidade podendo ser vantajoso seu emprego em caso de análises multielementares 5 ALCALINIDADE TOTAL 51 PRINCÍPIO A alcalinidade total baseiase na concentração total de hidróxidos carbonatos e bicarbonatos dissolvidos e determinados por titulometria com soluçãopadrão de ácido clorídrico 52 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Microbureta ou bureta de pistão 53 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de ácido clorídrico 005 mol L1 em capela diluir cerca de 42 mL de ácido clorídrico concentrado em 100 mL de água destilada e completar para 1 L b Solução indicadora de vermelho de metila dissolver 02 g de vermelho de metila em 60 mL de etanol e diluir com água destilada até 100 mL c Solução indicadora de fenolftaleína dissolver 1 g de fenolftaleína em 60 mL de etanol pa e completar o volume para 100 mL com água destilada d Solução indicadora de alaranjado de metila dissolver 02 g de alaranjado de metila em água destilada quente esfriar filtrar se necessário e diluir para 100 mL 54 PROCEDIMENTO Padronização lavar a microbureta internamente uma ou duas vezes com a solução de ácido clorídrico a ser padronizada Pesar entre 008 e 01 g de tetraborato de sódio Na2B4O710H2O anotando exatamente a massa pesada e transferir quantitativamente para béquer de 50 mL usando cerca 20 mL de água destilada Adicionar de 3 a 5 gotas de solução indicadora de vermelho de metila manter com agitação moderada constante e titular até mudança de cor do amarelo para o rosaclaro No caso de se utilizar bureta de 25 ou 50 mL aumentar a massa de bórax para 04 a 05 g A concentração do ácido em mol L1 é dada pela equação CHCl Mborax x 52433 VHCl em que Mborax massa exata de bórax g e VHCl volume de HCl gasto na titulação mL Determinação da alcalinidade total em béquer de 250 mL colocar alíquota de 100 mL de amostra e de 3 a 5 gotas de fenolftaleina Se a solução ficar vermelha titular até a viragem para incolor Adicionar então de 3 a 5 gotas de alaranjado de metila e continuar a titulação até a viragem do amarelo para o alaranjado A alcalinidade total expressa em mg L1 é calculada pela equação C 5 x 104 x CHClVamostra x Vtit em que CHCl concentração da solução padrão do ácido clorídrico Vamostra volume de amostra utilizado e Vtit volume total de ácido consumido na titulação OBSERVAÇÕES 1 Este parâmetro é usado juntamente com o pH e a dureza da água para avaliação de características corrosivas ou incrustantes da amostra 2 A padronização com bórax é mais prática do que com carbonato de sódio pois nesta última é necessária uma etapa de aquecimento para eliminação do CO2 formado 3 Variar o volume de amostra se necessário 4 Para a determinação precisa em águas com alcalinidade abaixo de 200 mg L1 de CaCO3 é recomendável o uso de métodos potenciométricos com detecção do ponto de inflexão pelo método de Gran por exemplo uma vez que nesse caso o pH do ponto de inflexão ponto final ou ponto de viragem é função da própria alcalinidade do meio 6 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA 61 PRINCÍPIO A condutividade elétrica é a medida da capacidade da solução de conduzir corrente elétrica Ela depende dos tipos de íons presentes e de suas concentrações assim como da temperatura da solução Na análise de águas fornece indicação da concentração total de íons em solução 62 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Condutivímetro e célula condutivimétrica eletrodos 63 REAGENTES E SOLUÇÕES Solução de referência de KCl 001 mol L1 dissolver 07456 g de cloreto de potássio seco por um noite a 110oC e guardado em dessecador até atingir a temperatura ambiente em água destilada e diluir para 1 L Esta solução tem condutividade elétrica de 142 dSm1 a 25oC 64 PROCEDIMENTO Calibração do aparelho colocar a célula condutivimétrica em um pequeno béquer que contenha a solução de referência de KCl e esperar a estabilização da leitura cerca de 20 seg Para condutivímetros com compensação manual de temperatura medila e ajustar o aparelho para a temperatura correspondente Ajustar o aparelho para a condutividade da solução de referência Determinação da conduvidade elétrica colocar a célula condutivimétrica recémlavada com água destilada em um pequeno béquer que contenha a amostra esperar a estabilização do sinal e fazer a leitura diretamente OBSERVAÇÕES 1 Quando não estiver sendo utilizada a célula deve ser mantida em água destilada 2 Para o uso de solução de referência de KCl em outra concentração deve ser consultada uma tabela para verificação da condutividade elétrica dessa nova solução uma vez que a correlação entre condutividade e concentração de KCl não é linear 7 OXIGÊNIO DISSOLVIDO OD 71 PRINCÍPIO A determinação de oxigênio dissolvido baseiase na oxidação de MnII pelo oxigênio do ambiente levando à formação de um precipitado de óxido de MnIV Este é então redissolvido e reduzido pelo iodeto em meio ácido formando iodo sendo em seguida quantificado com tiossulfato de sódio método de Wincler 72 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Frascos 150 300 mL especiais para OD Microbureta ou bureta de pistão com precisão igual a pelo menos 005 mL 73 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de sulfato manganoso dissolver 1827 g de MnSO4H2O ou 2007 g de MnSO42H2O ou 2367 g MnSO44H2O em água destilada recémfervida e diluir para 500 mL b Solução de iodetoazida dissolver 500 g de NaOH e 150 g de KI em cerca de 900 mL de água destilada resfriar em banho de água ou gelo adicionar 10 g de azida sódica NaN3 dissolvida em 40 mL de água destilada e diluir para 1 L Descartar quando esta solução diluída e acidificada ficar azul com algumas gotas de solução de amido c Soluçãoestoque de tiossulfato 025 mol L1 dissolver 6205 g de tiossulfato de sódio Na2S2O75H2O acrescentar 1 mL de clorofórmio e diluir para 1 L d Solução de tiossulfato de sódio 00125 mol L1 retirar alíquota de 50 ml da solução estoque de tiossulfato a 025 mol L1 acrescentar 1 ml de clorofórmio e diluir para 1 l e Solução de amido dissolver 05 g de amido num pouco de água destilada e adicionar a 50 ml de água destilada fervente Manter o aquecimento até se obter solução límpida Descartar a solução de amido quando se apresentar turva ou com fungos Alternativamente podese adicionar 01 g de ácido salicílico como preservativo f Soluçãopadrão de dicromato de sódio 00125 mol L1 dissolver 061218 g de K2Cr2O7 previamente seco por 2 h e guardado em dessecador até esfriar e completar para 1 L g Soluçãopadrão de iodato de potássio 00250 mol L1 dissolver 08917 g de iodato de potássio KIO3 seco a 120oC por 1 h em água destilada e completar para 1 L Manter em frasco de vidro âmbar e sob refrigeração 74 PROCEDIMENTO Amostragem a amostra de água é transferida de uma garrafa coletora do tipo Kermmerer ou Van Dorn para o frasco de OD por meio de mangueira imersa sem muita agitação e deixando transbordar 2 a 3 vezes o volume do frasco Adicionase 1 mL de solução de sulfato manganoso e 1 mL de solução de iodetoazida O frasco deve ser fechado sem guardar bolhas de ar Padronização do tiossulfato de sódio Método 1 com dicromato de potássio dissolver 1 g de iodeto de potássio em erlemmeyer com 100 mL de água destilada e adicionar com cuidado cerca de 1 mL de ácido sulfúrico concentrado ou 20 mL de ácido sulfúrico a 18 mol L1 e 10 mL de soluçãopadrão de dicromato de potássio a 00125 mol L1 tampar e manter em repouso no escuro por 5 min Adicionar mais cerca de 100 mL e titular com a solução de tiossulfato a ser padronizada até se obter solução amareloclara Acrescentar algumas gotas de amido e continuar a titular até o desaparecimento da cor azul Calcular a média do volume gasto em mL de duas ou três repetições Nefetiva Ndicrom x VdicromVgasto 0125Vgasto f NefetivaNnominal f 10 mLVgasto Método 2 com iodeto de potássio similar ao método 1 substituindo porém os 10 mL da soluçãopadrão de dicromato de sódio por exatos 5 mL da solução de iodato de sódio a 0025 mol L1 Nefetiva 0125Vgasto f 10 mLVgasto Determinação de OD adicionar 10 mL de ácido sulfúrico concentrado com cuidado sem produzir bolhas tampar e agitar para dissolver o precipitado Deixar em repouso no escuro por cerca de 20 min retirar alíquotas de 50 mL e titular com a solução de tiossulfato de sódio 00125N até ocorrer coloração amareloclara Acrescentar algumas gotas de amido e continuar a titulação até o desaparecimento da cor azul Cálculos O2 mg L1 Ntio x VtioValíquota x 79994 x 103 2f x Vtio em que f fator determinado na padronização do tiossulfato de sódio e Vtio média do volume gasto de tiossulfato de sódio a 00125 mol L1 em duas ou três repetições OBSERVAÇÕES 1 Procedimento aplicável para amostras com teores de O2 dissolvido superiores a 01 mg L1 e teores de FeIII e FeII inferiores a 200 mg L 1 e 10 mg L1 respectivamente Outros oxidantes e redutores fortes amostras com alcalinidade elevada e matéria orgânica facilmente oxidável apresentam interferências 2 A amostragem deve ser realizada de forma a não haver movimentação brusca da águade forma a evitar o aumento na oxigenação 8 DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO DQO 81PRINCÍPIO Baseiase no teor de substâncias oxidáveis pelo ácido permangânico que fornece um indicativo do consumo de oxigênio necessário para oxidar todas essas substâncias 82 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Chapa aquecedora Bureta graduada 83 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução de oxalato 005 mol L1 pesar 670 g de oxalato de sódio Na2C2O4 previamente seco em estufa a 105C durante aproxim adamente 2 h Dissolver em água quente esfriar e completar o volume para 1 L Armazenar em frasco de polietileno b Solução de KMnO4 002 mol L1 dissolver 32 g de permanganato de potássio KMnO4 em água recentemente fervida deixar esfriar em temperatura ambiente e completar o volume para 1 L Ferver a solução durante 1 h e deixar em repouso durante aproximadamente 24 h Filtrar em fibra de vidro isenta de materiais redutores e padronizar com a solução de oxalato 005 mol L1 Armazenar em frasco de vidro escuro ou recoberto com papel alumínio Padronizar periodicamente c Solução de KMnO4 00025 mol L1 medir 125 mL da solução de permanganato a 002 mol L1 e diluir para 1 L com água recentemente fervida e esfriada em temperatura ambiente Armazenar em frasco de vidro escuro Preparar semanalmente d Solução de oxalato 00062 mol L1 medir 125 mL da solução de oxalato a 005 mol L1 e diluir com água para 1 L 84 PROCEDIMENTO Medir 100 mL das amostras e transferir para erlenmeyer de 500 mL Adicionar 10 mL de H2SO4 e 10 mL da solução de KMnO4 a 00025 mol L1 Fazer prova em branco completa com água desionizada Aquecer os erlenmeyers em chapa durante 15 min após o início da ebulição Caso o permanganato descore repetir a digestão utilizando maior quantidade de KMnO4 a 00025 mol L1 Em seguida adicionar em cada erlenmeyer 10 mL da solução de oxalato a 00062 mol L1 Titular em seguida com a solução de KMnO4 a 00025 mol L1 até o aparecimento da primeira coloração rósea persistente por mais de 15 seg Cada mL gasto da solução de KMnO4 a 00025 mol L1 equivale a 1 mg L1 de oxigênio consumido devendose subtrair a leitura do branco OBSERVAÇÕES 1 Seu teor é superior à DBO que indica o consumo de oxigênio causado pela ação bacteriana 2 Este parâmetro expressa apenas a estimativa do consumo de oxigênio Assim não é possível saber com precisão se essas substâncias viriam a ser oxidadas na água em análise 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GREENBERG AE CLESCERI LS EATON AD Standard methods for the examination water and wastewater 18ed Washington DC American Public Health Association American Water Works Association American Environment Federation 1992 Paginação irregular HUNT DTE WILSON AL The chemical analysis of water general principles and techniques 2ed Gateshead The Royal Society of Chemistry Athaenaeum Press Ltd 1995 683p ANEXO Fatores de conversão usados para adequação dos valores das análises de solo e tecido vegetal entre as unidades de medida tradicionais e do Sistema Internacional SI Variável Unidade de medida Tradicional Para converter para Unidades SI multiplicar por cmolc dm3 Mmolc dm3 Mg dm3 g kg1 mg kg1 Al Ca e Mg meq 100cm3 1 10 K meq 100cm3 1 10 391 P K B Cu Fe Mn Zn ppm 1 Acidez potencial HAl Soma de bases CTC efetiva t e potencial T meq 100cm3 1 10 Matéria orgânica 10 Granulometria areia silte e argila 10 N P K Ca Mg S 10 B Cu Fe Mn Zn ppm 1 CAPÍTULO 8 TECIDO VEGETAL Ana Rita A Nogueira1 Areolino de Oliveira Matos2 Ciríaca A F de Santana do Carmo3 Coordenadora Daví J Silva4 Flávio Lages Monteiro5 Gilberto Batista de Souza1 Gilson Villaça Exel Pitta6 Gonçalo Mourão Carlos7 Henrique de Oliveira8 José Aniíbal Comastri Filho9 Mario Miyazawa10 Waldemar de Oliveira Neto11 1 INTRODUÇÃO Os teores dos elementos N P K Ca Mg S B Cl Cu Fe Na Mn Mo e Zn encontrados nos tecidos vegetais constituem um dos parâmetros mais eficientes para avaliar o estado nutricional das plantas As análises químicas do tecido vegetal em conjunto com a análise de solo são amplamente utilizadas na agricultura para diagnóstico do estado nutricional das plantas constituindo um dos mais valiosos instrumentos de auxílio na recomendação de um programa racional de adubação principalmente no caso de culturas perenes e semiperenes como as fruteiras e a canadeaçúcar Essas determinações são normalmente realizadas nas folhas por ser esse o órgão que melhor reflete se a planta está bem nutrida ou não se há falta ou excesso de nutrientes Para a determinação dos teores dos elementos químicos presentes nas plantas são utilizados diferentes métodos analíticos Muitos são os fatores envolvidos na escolha dos métodos e os mais importantes são fatores de segurança periculosidade toxidez disponibilidade do equipamento elemento a ser determinado precisão e exatidão tempo necessário para obtenção dos resultados limites de detecção e determinação capacitação do analista e custo Os resultados fornecidos são referentes aos teores dos elementos presentes na matéria seca do tecido vegetal 1Embrapa Pecuária Sudeste 2Embrapa Amazônia Oriental 3Embrapa Solos 4Embrapa SemiÁrido 5Embrapa Agrobiologia 6Embrapa Milho e Sorgo 7Embrapa Cerrados 8Embrapa Agropecuária Oeste 9Embrapa Pantanal 10Instituto Agronômico do Paraná IAPAR 11Embrapa Soja Neste documento estão descritos alguns dos principais métodos de análise de plantas normalmente executados em laboratórios da Embrapa São métodos tradicionais já devidamente avaliados e publicados que são adotados por apresentarem boas condições de precisão e de exatidão analíticas 2 DECOMPOSIÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO 21 INTRODUÇÃO Para a determinação dos teores de elementos químicos individuais em amostras de plantas normalmente é necessária a transformação da matriz orgânica original em uma forma inorgânica simples A grande maioria das técnicas analíticas exige que o analito esteja dissolvido em meio aquoso Em razão da baixa solubilidade das plantas em água para que o analito de interesse esteja disponível para análise é necessária a decomposição do material orgânico com agentes oxidantes eou altas temperaturas para sua incineração e aumento da capacidade oxidante dos ácidos Apesar de não estarem sendo tratadas neste trabalho existem técnicas que requerem que as amostras estejam na forma sólida como espectrometria atômica com arco faísca ablação com laser e aquelas baseadas em reações de combustão Outras técnicas podem ainda ser aplicadas às amostras tanto na forma sólida como na forma líquida tais como análise por ativação neutrônica instrumental e espectrometria de fluorescência de raios X KRUG 2000 Normalmente a dissolução de plantas é realizada por um dos seguintes métodos via seca mediante alta temperatura de combustão e via úmida digestão em meio ácido As duas técnicas apresentam resultados semelhantes quando realizadas de maneira apropriada Na escolha de uma técnica ideal para a dissolução de uma amostra devese sempre ter em mente os resultados esperados tais como os teores aproximados dos analitos na amostra e os níveis de sensibilidade da técnica que se deseja empregar AOAC 1995 MILLS JONES 1996 QUEVAULIEE 1995 Assim o método deve ser capaz de disponibilizar completamente o elemento de interesse e ser razoavelmente rápido os reagentes não devem atacar o recipiente em que será feita a reação o que pode provocar perdas por adsorção eou absorção e não conter contaminantes que possam interferir nos resultados Devese ainda verificar as temperaturas de trabalho para que não haja perdas por volatilização ou formação de aerossóis e a solução final deverá conter todos os analitos de interesse Item fundamental a ser considerado é a segurança pois o procedimento deverá apresentar o mínimo de insalubridade e de periculosidade devendose atentar para o uso correto dos equipamentos de proteção coletiva e individual 22 DECOMPOSIÇÃO POR VIA SECA 221 PRINCÍPIO Baseiase na queima da fração orgânica da amostra obtendose resíduo inorgânico na forma de cinza solúvel em solução diluída de ácido HCl HNO3 ou de álcali NH4OH NaOH A amostra de tecido vegetal é colocada em cadinho quartzo porcelana etc e incinerada em forno tipo mufla elétrico a uma temperatura entre 500 e 550ºC na atmosfera ambiente O oxigênio da atmosfera atua como agente oxidante e o resíduo proveniente da queima é constituído por óxidos de metais sulfatos não voláteis fosfatos silicatos e outros Por este método podem ser determinados os seguintes elementos K Ca Mg S Fe Mn Cu B Mo e Al 222 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Forno do tipo mufla com controle de temperatura b Cadinhos de porcelana c Pinça metálica para manuseio dos cadinhos 223 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Ácido nítrico HNO3 10 mol L1 diluir 714 mL de HNO3 concentrado em cerca de 400 mL de água esfriar e transferir para balão volumétrico de 1000 mL Completar o volume com água c Ácido clorídrico HCl 10 mol L1 diluir 833 mL de HCl concentrado em cerca de 400 mL de água esfriar e transferir para balão volumétrico de 1000 mL Completar o volume com água 815 PROCEDIMENTO Transferir para cadinho de porcelana 050 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Colocar o cadinho em forno do tipo mufla com temperatura controlada e aumentar gradativamente a temperatura para 500 a 550oC Incinerar a amostra durante 2 a 4 h após atingir a temperatura desejada até a obtenção de cinzas claras Esfriar recuperar em 50 mL de HCl ou HNO3 a 10 mol L1 Transferir para balão volumétrico de 25 mL completar o volume com água e filtrar A solução está pronta para determinação elementar O extrato poderá sofrer novas diluições para obter a concentração do elemento desejado dentro da faixa analítica do instrumento OBSERVAÇÕES 1 A temperatura do forno do tipo mufla deve ser elevada lentamente até atingir de 500 a 550ºC As amostras não devem nunca ser colocadas em forno quente nem a porta do forno ser aberta durante a fase inicial da queima Atualmente também são comercializados fornos do tipo mufla que utilizam radiação microondas como fonte de aquecimento 2 Em certos casos as perdas por volatilização podem ser evitadas pela adição de modificadores Por exemplo adição de H2SO4 os cloretos relativamente voláteis tais como PbCl2 CdCl2 e NaCl são convertidos em sulfatos não voláteis As perdas de ânions como os de cloreto e os que contêm arsênio fósforo ou boro podem ser evitadas pela adição de várias bases geralmente óxidos ou hidróxidos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos carbonatos de alcalinos nitrato de metais alcalino terrosos e acetato de magnésio 3 Amostras com altos teores de carboidratos requerem o tratamento com agentes modificadores auxiliares para a completa queima do carbono existente na amostra A presença dos modificadores também pode acelerar a oxidação prevenir a volatilização de certos componentes das cinzas e prevenir as reações entre os componentes da cinza com o material do cadinho A seguir é descrito procedimento que pode ser adotado nesse caso Transferir 050 g 0001 g de amostra seca e moída para cadinho Adicionar 10 mL de solução do agente auxiliar 7 mv de nitrato de magnésio MgNO326H2O e colocar o cadinho em banho de areia ou sobre chapa aquecedora até completa secagem Após esse procedimento o cadinho é colocado no forno do tipo mufla e a temperatura deve ser lentamente elevada até 500ºC permanecendo nessa temperatura durante 4 h A amostra é resfriada e as cinzas são dissolvidas em HNO3 ou HCl a 20 vv ou água régia 1 parte de HNO3 concentrado para 3 partes de HCl concentrado para solubilização das cinzas VANTAGENS a Não utilização de solução de ácidos oxidantes concentrados b Possível utilização de massas elevadas de amostras o que permite a determinação de elementos presentes em baixas concentrações LIMITAÇÕES a Perdas por volatilização de alguns elementos Co Pb Se As dentre outros b Baixa velocidade analítica c Alto consumo de energia elétrica d O esmalte de cadinhos de porcelana mais comumente utilizados pode reagir com silicatos fosfatos e óxidos presentes nas amostras Em casos especiais é recomendável trabalhar com cadinhos de quartzo ou de platina 23 DECOMPOSIÇÃO POR VIA ÚMIDA 231 PRINCÍPIO É o método mais utilizado para decomposição de material vegetal As amostras são solubilizadas com ácidos oxidantes concentrados ou mistura desses com peróxido de hidrogênio Os ácidos ou as misturas mais utilizados são HNO3 H2SO4 HCl HClO4 HNO3 HCl HNO3 HClO4 HNO3 H2O2 HNO3 HCl04 H2SO4 HClO4 H2SO4 e H2SO4 H2O2 A maioria das amostras é totalmente oxidada deixando os elementos a serem determinados na solução ácida em formas inorgânicas simples e apropriadas para análise A utilização individual do ácido ou da mistura depende da natureza da amostra e do elemento a ser analisado Este método é recomendado para determinação dentre outros dos elementos K Ca Mg Cu Fe Mn Zn Al Na Cr Ni V Pb Cd Co e Mo Pode também ser usado para a determinação de N P e S entre os nãometais Entretanto alguns elementos podem ser perdidos completa ou parcialmente por volatilização aqui podendo ser incluídos os halogênios além de Sb As B Hg e Se dependendo do procedimento utilizado Além dos blocos digestores a digestão por via úmida também pode ser realizada em fornos com radiação microondas específicos para utilização em laboratórios Esses fornos podem operar com sistemas fechados com alta pressão ou sistemas com radiação focalizada que operam à pressão atmosférica As microondas constituem energia eletromagnética não ionizante que causa movimento pela migração de íons e pela rotação dos dipolos A fonte de energia para a solubilização das amostras são ondas de rádio de cerca de 2450 MHz cuja potência varia de 600 a 1000 W 232 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Capela de exaustão resistente a ácidos oxidantes b Bloco digestor com controlador de temperatura itens A B E e F c Forno de radiação microondas com controladores de pressão e temperatura sistema fechado de alta pressão item C c Forno com radiação microondas focalizadas pressão atmosférica item D d Tubos de digestão em vidro borossilicato medindo 25 x 250 mm itens A B E e F e Frascos de borossilicato Teflon ou quartzo item C f Vidrarias pipetas balões volumétricos funis etc itens A a F Observação A B C D E e F referemse aos procedimentos descritos no item 234 233 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução nitroperclórica HNO3 HClO4 na proporção de 21 Misturar 400 mL de HNO3 a 65 vv 200 mL de HClO4 a 72 vv item A b Solução nitroperclóricosulfúrica HNO3 HClO4 H2SO4 na proporção de 311 item C c Solução de peróxido de hidrogênio ácido sulfúrico H2O2 H2SO4 na proporção de 11 item D d Ácido nítrico HNO3 a 65 vv item B C e D e Peróxido de hidrogênio H2O2 a 30 item B C e D f Ácido sulfúrico concentrado 97 a 98 g Mistura catalítica pesar 100 g de sulfato de potássio 100 g de sulfato de cobre misturar bem e triturar em almofariz Observação A B C e D referemse aos procedimentos descritos no item 234 ATENÇÃO Lembrese de que você está manuseando ácidos Use os equipamentos de proteção individual óculos avental e luvas 24 PROCEDIMENTOS A DECOMPOSIÇÃO COM MISTURA ÁCIDA ÁCIDO NÍTRICO E ÁCIDO PERCLÓRICO Transferir para tubo de digestão 050 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Adicionar 60 mL do reagente 233a misturar bem e deixar à temperatura ambiente por aproximadamente 4 h ou por uma noite Colocar os tubos no bloco de digestão e aquecer gradativamente até 120ºC manter nessa temperatura até cessar totalmente o desprendimento de NO2 vapor castanho Aumentar a temperatura lentamente até atingir 210ºC temperatura que é mantida até que se obtenham fumos brancos de HClO4H2O e que o extrato se apresente incolor 20 min Esfriar e completar o volume para 500 mL com H20 Nessas condições a solução final estará em meio de HClO4 a 025 mol L1 OBSERVAÇÕES 1 Retirar os tubos do bloco se houver indício de perda do material 2 Não utilizar ácido perclórico em concentração superior a 72 3 A diluição dependerá da concentração do analito na amostra para se atingir a concentração necessária dentro da faixa analítica da técnica instrumental utilizada podendo ser menor ou maior 4 Em algumas amostras com alto teor de sílica p ex palha de arroz ocorre extravasamento do tubo de análise podendo provocar perdas de solução e de analito Nesse caso é recomendado o emprego da mistura de ácidos item 233c pois o H2SO4 ajuda a prevenir esse problema VANTAGENS a As plantas são decompostas quase que totalmente com essa combinação de ácidos oxidantes b Método mais empregado para dissolução de plantas c O ácido nítrico modera a ação oxidante do ácido perclórico reagindo com materiais facilmente oxidáveis que poderiam reagir com o ácido perclórico de maneira perigosa LIMITAÇÕES a Por ser empregado na forma oxidada e a quente o ácido perclórico apresenta perigo de explosão quando em contato com material orgânico Ler por exemplo descrição de mais de 30 casos de explosões violentas no Handbook of Laboratory Safety Boca Raton CRC Press 2nd ed 1971 854p b Necessidade de utilização de capelas especiais c Utilização de ácidos concentrados e de difícil aquisição pois se trata de produtos controlados pelo Exército pela Polícia Civil e pela Polícia Federal d Emissão de vapores tóxicos B DECOMPOSIÇÃO COM ÁCIDO NÍTRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO Transferir para tubo de digestão 050 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Adicionar 40 mL de HNO3 concentrado 65 deixar em repouso por uma noite Aquecer lentamente o bloco digestor até 120ºC e manter nessa temperatura por 1 h Retirar os tubos do bloco e deixar esfriar Adicionar 40 mL de H2O2 30 retornar ao bloco e repetir a adição de peróxido de hidrogênio até a solução se tornar incolor Deixar esfriar transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com água OBSERVAÇÃO Mistura adequada para amostras com alto teor de carbono VANTAGENS a Não utilização de ácido perclórico b H2O2 é um agente oxidante poderoso O poder oxidante do ácido nítrico é aumentado com a utilização do peróxido de hidrogênio que atua como agente oxidante auxiliar c H2O2 é comercializado com alto grau de pureza LIMITAÇÕES a A amostra não é totalmente decomposta b Emissão de vapores tóxicos C DECOMPOSIÇÃO ASSISTIDA POR RADIAÇÃO MICROONDAS EM FRASCOS DE ALTA PRESSÃO O tecido vegetal é solubilizado com ácido nítrico e peróxido de hidrogênio em sistema fechado a cerca de 180ºC e pressão de 20 a 25 bar KRUG 2000 É importante que o equipamento seja equipado com sensores de pressão e temperatura Pesar 025 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Transferir para frasco de decomposição adequado fornecido pelo fabricante do equipamento PTFE modificado quartzo etc Adicionar 50 mL de HNO3 a 65 vv e 20 mL de H2O2 em cada frasco Se necessário deixar a mistura em repouso por alguns minutos até que diminuam eventuais reações com a amostra Um dos frascos do equipamento deve ser reservado para o branco em que é adicionado o mesmo volume de reagentes sem amostra Colocar os discos de segurança fechar os frascos e colocálos no carrossel conforme descrito no manual do equipamento Programar a rampa de aquecimento conforme o programa adequado para a amostra e iniciar a digestão Esfriar transferir para balão volumétrico 25 a 100 mL e completar o volume com água OBSERVAÇÕES 1 A proporção de amostraácido e o programa de aquecimento são definidos de acordo com a amostra e em função das características específicas do forno de microondas utilizado 2 Tomar sempre o cuidado de ter uma amostra no frasco de controle de pressão e temperatura para o correto controle da decomposição 3 Os polímeros modificados e o quartzo são empregados por serem materiais que não absorvem energia das microondas e resistem aos ácidos oxidantes a quente 4 Em amostras com altos teores de sílica poderá ser utilizado ácido fluorídrico nesse caso não pode ser utilizado frasco de quartzo 5 A diluição dependerá da concentração do analito na amostra para se atingir a concentração necessária dentro da faixa analítica da técnica instrumental utilizada podendo ser menor ou maior VANTAGENS a Método rápido e preciso b Menor consumo de reagentes c Mínimo de contaminação d Desprendimento de gases e vapores tóxicos é controlado e Não há perda de analitos por volatilização f Temperatura e pressão de trabalho mais elevadas LIMITAÇÕES a Segurança há risco de explosões b Número reduzido de amostras por análise c Limitação na massa de amostra máximo 05 g d Possíveis efeitos de memória em conseqüência da porosidade do frasco e Necessidade de resfriamento antes da abertura do frasco f Alto custo do forno de microondas e dos acessórios D DECOMPOSIÇÃO DE PLANTAS ASSISTIDA POR MICROONDAS COM RADIAÇÃO FOCALIZADA Pesar e transferir para frasco apropriado de 05 a 50 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Operar o sistema conforme as instruções fornecidas pelo manual de operações do equipamento Normalmente é utilizado maior volume de ácido do que no sistema fechado Esses ácidos são adicionados durante a execução do programa de aquecimento Esfriar transferir para balão volumétrico 25 a 100 mL e completar o volume com água OBSERVAÇÕES 1 A utilização de frascos abertos operados sob pressão atmosférica viabiliza a programação de adição de reagentes durante o ciclo de aquecimento 2 É adequado para o tratamento de elevadas massas de amostras orgânicas que poderiam causar problemas de segurança se tratadas em sistemas fechados convencionais 3 Neste tipo de equipamento a radicação microondas é focalizada individualmente em cada frasco sendo o sistema equipado com sensores individuais de temperatura permitindo o controle da temperatura em cada cavidade 4 A diluição dependerá da concentração do analito na amostra para se atingir a concentração necessária dentro da faixa analítica da técnica instrumental utilizada podendo ser menor ou maior VANTAGENS a Método rápido e preciso b Maior segurança trabalha em pressão atmosférica c Adequado para o tratamento de elevadas massas de amostra d Adição de reagentes de maneira seqüencial e Alta eficiência e controle da energia fornecida à reação LIMITAÇÕES a Número reduzido de amostras por análise b Alto custo c Maior consumo de reagente quando comparado com sistemas fechados d Possibilidade de contaminação e Desprendimento de gases e vapores tóxicos recolhidos em coletores f Pode haver perda de analitos por volatilização E DECOMPOSIÇÃO POR VIA ÚMIDA COM ÁCIDO SULFÚRICO Pesar 020 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Transferir para tubo de digestão de 25 x 250 mm adicionar 07 g de mistura catalítica K2SO4 CuSO4 101 item 233i e 25 mL de H2SO4 concentrado 233h levar ao bloco digestor e iniciar o aquecimento a 50ºC aumentando a temperatura gradativamente até 350ºC depois de as amostras clarearem manter por mais 1 h no bloco digestor O final da digestão é indicado pela coloração verdeclara da solução Esperar esfriar e transferir para balão volumétrico de 100 mL completando o volume com água desionizada OBSERVAÇÕES 1 Mistura utilizada para determinação de nitrogênio fósforo e proteína total 2 Para diminuir o tempo de decomposição poderá ser adicionado 10 mL de H2O2 a 30 antes de se iniciar o aquecimento 3 Para análise de nitrogênio poderá ser destilada a amostra total Nesse caso não há necessidade de fazer esta diluição apenas deverão ser adicionados aproximadamente 10 mL de água desionizada para que não haja cristalização da amostra 4 A utilização de ácido sulfúrico não é recomendada para plantas com alto teor de Ca Pode haver a formação de sulfato de cálcio CaSO4 relativamente insolúvel reduzindo o teor de cálcio na solução e causando decréscimo no valor de outros elementos em conseqüência de coprecipitações VANTAGENS a Método adequado para grande número de amostras b Mais utilizado para a determinação de proteínanitrogênio LIMITAÇÕES a Desprendimento de gases e vapores tóxicos b Manuseio de ácidos corrosivos e controlados pelo Ministério do Exército pela Polícia Civil e pela Polícia Federal F DECOMPOSIÇÃO POR VIA ÚMIDA COM ÁCIDO SULFÚRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO Transferir para tubo de digestão de 010 a 030 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Adicionar 20 mL de H2SO4 concentrado misturar bem Esfriar e depois adicionar lentamente 20 mL de H2O2 a 30 pela parede do tubo com o tubo em rotação Aguardar o início da reação e colocar o tubo no bloco digestor Aquecer a 350ºC até o aparecimento de fumos brancos e continuar o aquecimento por mais 30 min Remover o tubo do bloco de digestão e deixar a amostra esfriar Lentamente adicionar 08 mL de H2O2 e colocar de volta no bloco digestor Aquecer até o aparecimento de fumos por 20 min Depois de o extrato ficar incolor remover o tubo do bloco digestor esperar esfriar transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água OBSERVAÇÕES 1 Mistura utilizada para determinação de nitrogênio fósforo e proteína total 2 Se a coloração amarelada persistir adicionar mais algumas gotas de H2O2 antes de transferir o extrato para balão volumétrico 3 A utilização de ácido sulfúrico não é recomendada para plantas com alto teor de Ca Pode haver a formação de sulfato de cálcio CaSO4 que é relativamente insolúvel reduzindo o teor de cálcio na solução e causando decréscimo no valor de outros elementos em conseqüência de coprecipitações VANTAGENS a Método rápido b Adequado para grande número de amostras LIMITAÇÕES c Desprendimento de gases e vapores tóxicos d Manuseio de ácidos corrosivos e controlados pelo Ministério do Exército pela Polícia Civil e pela Polícia Federal c Baixo número de elementos disponibilizados para análise devido a problemas de co precipitação d Amostra não totalmente digerida silicatos 25 EXTRAÇÃO COM SOLUÇÃO DE ÁCIDOS DILUÍDOS 10 mol L1 de HCl ou HNO3 251 PRINCÍPIO Os elementos químicos do tecido vegetal são solubilizados na solução ácida diluída a 10 mol L1 MIYAZAWA et al 1984 A decomposição da matéria orgânica não é completa porém essa extração apresenta alta correlação na determinação de alguns elementos B Ca Cu K Mg Mn Na P Zn e NO3 com outros métodos em que a decomposição da matéria orgânica é total como a decomposição por via seca ou por via úmida itens 22 e 23 252 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Banho com termostato Frasco de vidro borossilicato ou tubo de polietileno de 50 mL Agitador circular de mesa com controle de velocidade Funil de 15 mL Papelfiltro quantitativo do tipo Whatman 42 de 15 mm de diâmetro 253 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução com 10 mol L1 de HCl ou HNO3 254 PROCEDIMENTO Pesar e transferir para frasco apropriado de 05 g 0001 g de amostra previamente seca a 65oC por 48 a 72 h e moída em moinho de facas com peneira de 10 mm Adicionar 250 mL de solução com 10 mol L1 de HCl ou HNO3 e anotar a massa total Aquecer por 15 min no banho com termostato a 80oC agitar durante15 min no agitador circular a 250 rpm Esfriar repor a água evaporada até massa inicial com água e filtrar OBSERVAÇÕES 1 Método completo descrito em Miyazawa M Pavan M Bloch MFM Análise química de tecido vegetal Instituto Agronômico do Paraná IAPAR Londrina 1992 Circular no 74 2 A recuperação do P é total quando determinado em espectrômetro de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado ICP OES altas temperaturas permitem a determinação de P orgânico em solução além do P inorgânico 3 Para análise de tecido vegetal na rotina anotar a massa total frasco amostra e solução ácida extratora para facilitar a reposição da água evaporada 4 Como alternativa em lugar de pesar é possível adicionar o ácido aquecer e a seguir completar o volume em balão volumétrico mediante diluição apropriada 25 ou 50 mL e filtrar o extrato 5 Seringa descartável de 10 mL pode ser utilizada em substituição ao funil com a vantagem de ocupar menos espaço e exigir papelfiltro com menor diâmetro 15 mm cortado com vazador de 15 cm VANTAGENS a Menor poluição do ambiente do laboratório com gases e vapores tóxicos ou corrosivos b Não há necessidade de aparelhagem específica como capela mufla e bloco digestor c Simples rápido e facilmente adaptável para análises em rotina d Baixo custo LIMITAÇÕES a Extração parcial dos elementos Al Fe e S 3 DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS 31 NITROGÊNIO 311 SEMIMICRO KJELDAHL 3111 PRINCÍPIO Técnica de decomposição por via úmida seguida por destilação a vapor e titulação para a quantificação do nitrogênio amoniacal NNH4 Proposta por Kjeldahl em 1883 a técnica permanece a mesma com pequenas modificações Muito utilizada para determinação indireta de proteínas em várias amostras biológicas assim como de nitrogênio em plantas para avaliação do estado nutricional O ácido sulfúrico H2SO4 na presença de K2SO4 para elevar o ponto de ebulição do ácido e de um catalisador CuSO4 decompõe a proteína e os aminoácidos do tecido vegetal em NNH4 Como este é uma espécie iônica não há problemas de perda por volatilização A mistura é alcalinizada com NaOH aquoso e o NH4 é reduzido a NH3 que é destilado por arraste a vapor complexado em ácido bórico com indicador misto e titulado com solução padronizada de H2SO4 ou HCl MALAVOLTA et al 1989 MILLS JONES 1996 3112 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Bloco digestor b Balança analítica c Destilador semimicro de Kjeldahl d Tubo para digestão de 25 250 mm e Pipeta automática f Bureta de 200 mL g Erlenmeyer de 500 mL 3113 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Hidróxido de sódio 130 mol L1 pesar 5200 g de NaOH e dissolver em 1000 mL de água c Álcool etílico 99º GL d Ácido sulfúrico concentrado pa 97 a 98 e Ácido bórico a 2 mv dissolver cerca de 200 g de ácido bórico em cerca de 800 mL de água desionizada agitando até dissolver o sal Após dissolução adicionar 150 mL de verde de bromocresol a 01 mv 60 mL de vermelho de metila a 01 mv e 20 mL de NaOH a 01 mol L1 Completar para 1000 mL com álcool f Verde de bromocresol a 01 mv pesar 01g de verde de bromocresol e dissolver em álcool etílico Completar o volume para 100 mL com álcool g Vermelho de metila a 01 mv pesar 01g de vermelho de metila e dissolver em 2 mL de álcool etílico Completar o volume para 100 mL com água h TRIS trishidroximetilaminometano padrão primário 02 mol L1 pesar 24228 g de TRIS transferir para balão volumétrico de 100 mL dissolver e completar o volume com água isenta de CO2 i Ácido sulfúrico 10 mol L1 em balão volumétrico de 1000 mL com aproximadamente 500 mL de água adicionar lentamente 275 mL ou 5052 g de ácido sulfúrico concentrado densidade de 184 g cm3 e 96 a 98 em massa esperar esfriar e completar o volume com água soluçãoestoque j Ácido sulfúrico 01 mol L1 em balão volumétrico de 1000 mL com aproximadamente 500 mL de água desionizada adicionar lentamente 100 mL da soluçãoestoque 3113i e completar o volume com água Essa solução deverá ser padronizada com solução de TRIS 3113h k Padronização do ácido sulfúrico 01 mol L1 em erlenmeyer de 125 mL adicionar 10 mL de TRIS a 02 mol L1 3113h 10 mL de solução de H3BO3 3113e 10 mL de água isenta de CO2 e titular com o H2SO4 a 01 mol L1 3113j A concentração exata do ácido é dada pela seguinte expressão C1 x V1 C2 x V2 em que C1 e V1 é a concentração e o volume do H2SO4 e C2 e V2 a concentração e o volume de TRIS 3114 PROCEDIMENTO A destilação é realizada por arraste a vapor Em sistema de destilação colocar na saída do condensador erlenmeyer de 125 mL com 10 mL de solução de ácido bórico item 3113e e transferir alíquota de 20 mL ou toda a solução obtida da amostra solubilizada de acordo com o item 234E Adicionar 10 mL de solução de NaOH item 3113b e imediatamente dar início à destilação coletando aproximadamente 35 mL de destilado Titular com solução de ácido sulfúrico a 01 mol L1 item 3113j OBSERVAÇÕES 1 Prova em branco deve ser feita juntamente com as amostras para verificação de possibilidade de contaminação dos reagentes 2 10 mL de H2SO4 a 01 mol L1 neutraliza 28 mg de N 3 Método mais empregado para a determinação de proteínas e nitrogênio total em plantas 4 A saída do condensador deverá estar mergulhada na solução de ácido bórico para evitar perdas de NH3 VANTAGEM a Baixo custo b Aplicável para diversos tipos de matrizes c Possibilidade de automatização no mercado já existem equipamentos de destilação automatizados LIMITAÇÕES a Baixa velocidade analítica b Uso de reagentes corrosivos como o ácido sulfúrico e o hidróxido de sódio 312 ESPECTROFOTOMETRIA COM REAGENTE DE NESSLER 3121 PRINCÍPIO Método proposto por J Nessler em 1856 Aplicase para soluções que contenham nitrogênio na forma de amônio Fundamentase na reação da amônia livre com solução alcalina de iodeto de mercúrio II em iodeto de potássio Essa reação produz um composto colorido castanhoalaranjado cuja intensidade da cor é proporcional à concentração de nitrogênio presente na solução apresenta resposta linear na faixa de 5 a 40 mg L1 A reação do íon amônia com o reagente de Nessler pode ser assim representada 2 K2 Hg I4 2 NH3 NH2 Hg2 I3 4 KI NH4 I 3122 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Bloco digestor b Balança analítica c Espectrofotômetro d Tubo para digestão de 25 250 mm e Micropipeta automática com volume regulável de 10 a 50 mL f Frasco de vidro do tipo snapcap de 100 mL g Copos plásticos descartáveis de 50 mL h Dispensador de líquidos de 200 mL i Agitador de tubos 3123 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Reativo de Nessler pesar 455 g de HgI2 e 349 g de KI juntar os dois reagentes e transferir para balão volumétrico de 1000 mL Adicionar 500 mL de água agitando sempre até dissolver Juntar 1120 g de KOH previamente dissolvidos em 300 mL de água agitar bem e completar o volume Deixar em repouso por três dias para decantar o sedimento ou centrifugar a 3000 rpm O reagente é bastante estável se armazenado em frasco escuro e arrolhado c Solução de hidróxido de sódio 25 mol L1 pesar 100 g de NaOH dissolver em água transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água d Solução de metassilicato de sódio a 10 mv pesar 100 g de Na2SiO3 dissolver em água transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água A seguir filtrar a solução utilizando papelfiltro de filtragem semilenta Esse reativo tem a finalidade de evitar a turbidez da reação e Solução mista de hidróxido de sódio metassilicato de sódio 11 misturar partes iguais das soluções de NaOH item 3123c e de Na2SiO3 item 3123d f Solução reagente solução mista e solução de Nessler item 312cb na proporção de 10 mL da solução mista e 05 mL da solução de Nessler A mistura deve ser preparada imediatamente antes da leitura g Solução analítica de NNH 4 pesar 04714 g de NH2SO4 pa seco em estufa a 105ºC e completar o volume até 1000 mL com água Essa solução contém 100 mg L1 de nitrogênio h Soluções analíticas 00 10 20 30 e 40 mg L1 de N preparadas a partir de diluições apropriadas da solução com 100 mg L1 de N 3124 PROCEDIMENTO Transferir 10 mL do extrato item 234F ou das soluções analíticas item 3123h para copos plásticos descartáveis Adicionar 200 mL de água e 15 mL da solução de trabalho item 3123f Proceder a leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda igual a 480 nm VANTAGENS a A coloração do complexo formado é estável no intervalo de 5 min até 12 h b Não existe interferências de outros cátions Al Fe Zn Mn ou Mg c Método rápido e preciso d Alta sensibilidade e Adequado para grande número de amostras LIMITAÇÃO a O método utiliza o metal Hg extremamente tóxico e volátil 313 AZUL DE INDOFENOL REAÇÃO DE BERTHELOT 3131 PRINCÍPIO Os compostos de nitrogênio com a digestão sulfúrica transformamse em NH 4 que em meio alcalino reage com NaOCl e C6H5OH formando o azul de indofenol cuja coloração é proporcional à concentração de amônio presente na amostra 3132 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Espectrofotômetro b Vidrarias 3133 REAGENTES E SOLUÇÕES a Solução do sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético EDTA pesar 127 g de EDTANa2 e dissolver em cerca de 900 mL de água Ajustar o pH da solução para 100 com solução de 001 mol L1 de NaOH transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água b Solução diluída de EDTA pesar 30 g de NaOH adicionar 300 mL da solução de EDTA Na2 com pH 100 item 3133a transferir para balão volumétrico de 2000 mL e completar o volume com água solução A c Solução de fenol pesar 100 g de fenol e 005 g de nitroprussiato de sódio Dissolver em água transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água solução B OBSERVAÇÃO conservar em frasco escuro e na geladeira d Solução de NaOCl pesar 50 g de NaOH 94 g de Na2HPO212H2O e 318 g de Na3PO412H2O e medir 200 mL de NaOCl Misturar os reagentes dissolver em água transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água solução C OBSERVAÇÃO conservar em frasco escuro e na geladeira e Solução analítica de NNH 4 pesar 4714 g de NH2SO4 pa seco em estufa a 105ºC e completar o volume até 1000 mL com água Essa solução contém 1000 mg L1 de N f Soluções analíticas 50 100 200 400 600 e 800 mgL1 de N preparadas a partir de diluições apropriadas da solução com 1000 mgL1 de N 3133e OBSERVAÇÃO Antes de completar o volume com água adicionar quantidade de ácido sulfúrico concentrado de acordo com a concentração desse ácido na amostra 3134 PROCEDIMENTO Diluir 10 vezes o extrato obtido no item 234E e transferir 10 mL dessa solução para tubo de ensaio de 30 mL Adicionar 70 mL da solução A item 3133b 10 mL da solução B item 3133c e 10 mL da solução C item 3133d Deixar reagir durante 2 h e proceder a leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda igual a 630 nm As soluções que serão empregadas como padrão para a curva de calibração deverão ser submetidas ao mesmo procedimento que o realizado com a amostra inclusive a diluição inicial 10 vezes VANTAGEM a Possibilidade de automação b Método altamente seletivo LIMITAÇÃO a Utilização de fenol e nitroprussiato compostos altamente tóxicos 314 ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO REAÇÃO DE BERTHELOT 3141 PRINCÍPIO Os sistemas de análise em fluxo conhecidos por FIA flow injection analysis se baseiam na injeção da amostra em um fluxo transportador impulsionado por uma bomba peristáltica originando uma zona de amostra reprodutível que sofre dispersão contínua durante seu transporte RUZICKA HANSEN 1988 Após receber os reativos necessários para serem misturados à amostra o fluxo é direcionado ao detector onde são realizadas as leituras pertinentes com base na intensidade do sinal analítico resultante No método aqui descrito o amônio reage com NaOCl e C6H5OH em meio alcalino formando o azul de indofenol cuja coloração é proporcional à concentração de amônio item 3131 No entanto aqui o ácido salicílico é empregado em lugar de fenol em virtude de sua menor toxidez NOGUEIRA et al 1996 3142 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Bomba peristáltica com 8 canais b Tubos de Tygon para bombeamento das soluções c Injetorcomutador de acrílico do tipo 13 d Espectrofotômetro com célula de fluxo e Registrador potenciométrico f Tubos de polietileno 08 mm d i 3143 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Ácido sulfúrico 12 mol L1 150 mL de H2SO4 concentrado empregado como fluxo transportador C Fig 1 c Hidróxido de sódio 075 mol L1 dissolver 30 g de NaOH em 1000 mL de água R1 Fig 1 d Solução de ácido salicíliconitroprussiato preparada em meio de NaOH a 035 mol L1 citrato de sódio a 5 mv para evitar precipitações de hidróxidos de metais nitroprussiato a 050 mv como agente que catalisa a velocidade de formação do cromóforo e 02 mol L1 de ácido salicílico R2 Fig 1 e Solução comercial de hipoclorito de sódio com 20 a 25 de cloro ativo R3 Fig 1 f Soluçãoestoque de 1000 mgLl de N dissolver 4716g de NH42SO4 em 1000 mL de água g Soluções analíticas de trabalho entre 5 e 100 mg L1 de N devem ser preparadas a partir de diluições apropriadas da soluçãoestoque item 3143f OBSERVAÇÕES 1 Para prevenir diferenças entre os tempos e as temperaturas durante a digestão as soluções analíticas devem ser preparadas seguindo o mesmo procedimento aplicado às amostras Para isso adicionase 00 branco 10 20 40 60 80 e 100 mL da soluçãoestoque de 1000 mg L1 de N em tubos de digestão sendo em seguida adicionada a mistura catalisadora 25 mL de H2SO4 e digerindo em bloco digestor juntamente com cada lote de amostras item 234E 2 Os teores de NH4 nas amostras são obtidos a partir da relação entre valor de absorbância x concentração 3144 PROCEDIMENTO a Diagrama de fluxo O diagrama de fluxos utilizado está descrito na Fig 1 A amostra A obtida a partir da decomposição com ácido sulfúrico item 234E é aspirada para preencher a alça de amostragem comprimento 10 cm 50 µL que define o volume exato de amostra a ser introduzida no sistema sendo o excesso descartado D A porção selecionada é introduzida no fluxo transportador C 20 mL min1 atravessa a bobina B1 30 cm para uma perfeita homogeneização recebe NaOH R1 40 mL min1 reagente ácido salicíliconitroprussiato R2 06 mL min1 e hipoclorito R3 04 mL min1 e após passar pela bobina de reação B2 300 cm 37ºC a amostra processada atinge a célula de fluxo λ 660 nm apresentando sinal proporcional ao conteúdo total de nitrogênio na amostra sendo em seguida descartada D Figura 1 Diagrama de fluxos para a determinação de nitrogênio A amostra C fluxo transportador B1 e B2 bobinas de reação R1 R2 e R3 reagentes D descarte λ detector banho termostatizado Mais informações no texto VANTAGENS a Substituição de fenol por ácido salicílico não sendo necessário prétratamento da solução descartada b Alta velocidade analítica c Sistema automatizado LIMITAÇÕES a Utilização de nitroprussiato reagente tóxico b Altamente sensível aos valores de pH Pequenas variações na acidez final do extrato poderão resultar em erros de análise Este problema é contornado com o acompanhamento da curva de calibração em cada lote de análise 32 FÓSFORO 321 AZUL DE MOLIBDÊNIO 3211 PRINCÍPIO O método está baseado na complexação do íon ortofosfato PO4 3 em presença de ácido molíbdico H2MoO4 que em meio fortemente ácido e com um redutor apropriado p ex ácido ascórbico converte o Mo6 em Mo3 produzindo o ácido fosfomolíbdico H3PMo3O10H2O de coloração azul devida ao molibdênio cuja intensidade da cor é proporcional à quantidade do fosfato contida na amostra apresentando o máximo de absorção em 660 nm 3212 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Espectrofotômetro b Agitador de tubos para homogeneização das amostras 3213 REGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Solução de molibdato de amônio a 2 mv dissolver 200 g de NH4 6Mo70244H2O em 200 mL de água Em outro frasco que contenha 500 mL de água dissolver 20 g de subcarbonato de bismuto e adicionar 150 mL de H2SO4 concentrado Esfriar misturar as duas soluções e completar o volume para 1000 mL com água solução A c Solução diluída de molibdato transferir 300 mL da solução A 3213a para frasco de 1000 mL e completar o volume com água d Solução analítica concentrada 1000 mgL1 de P transferir 43928 g de KH2PO4 pa em frasco de 1000 mL adicionar 30 mL de H2SO4 concentrado e completar o volume com água e Soluções analíticas de trabalho preparar soluções de 00 05 10 20 30 e 40 mgL1 de P a partir de diluições da solução de 1000 mgL1 de P f Ácido ascórbico pa 3214 PROCEDIMENTO Transferir 50 mL de solução analítica de fósforo ou do extrato obtido a partir da decomposição da amostra item 22 234A ou 234E para tubo de ensaio de 45 mL adicionar 10 mL da solução diluída de molibdato item 3213c aproximadamente 40 mg de ácido ascórbico e agitar Após 30 min efetuar a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 660 nm OBSERVAÇÃO Os teores de P nas amostras são obtidos a partir da relação entre valor de absorbância x concentração VANTAGENS a Alta sensibilidade b Não utiliza reagente tóxico LIMITAÇÕES a Baixa estabilidade do complexo fósforomolibdico b Possível interferência de As em amostras tratadas com pesticida c Sensível a variações de acidez 322 AMARELO DE VANADATO 3221 PRINCÍPIO O ânion H2PO4 reage com MoO4 2 e VO3 2 em meio ácido formando um complexo de coloração amarela que absorve a luz na região de 420 nm 3222 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Espectrofotômetro b Agitador de tubos para homogeneização das soluções 3223 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Solução de molibdato a 5 mv dissolver 500 g de NH46MoO24 pa em 800 mL de água quente esfriar e completar o volume para 1000 mL com água c Solução de vanadato a 025 mv dissolver 250 g de NH42VO3 pa em 500 mL de água quente e adicionar 350 mL de HNO3 a 65 esfriar e completar o volume para 1000 mL com água d Solução reagente misturar em partes iguais as soluções de molibdato item 3223b e de vanadato item 3223c imediatamente antes do uso e Solução analítica concentrada 1000 mgL1 de P item 3213d f Soluções analíticas de P preparar soluções que contenham 00 50 100 150 e 200 mg L1 de P em H2SO4 02 mol L1 a partir de diluições da solução analítica concentrada de 1000 mg L1 de P 3224 PROCEDIMENTO Transferir 50 mL de solução analítica de fósforo ou do extrato obtido a partir da decomposição da amostra item 22 ou 234A para tubo de ensaio de 45 mL Adicionar 20 mL da mistura de reagentes item 3223d Após 10 min efetuar a leitura em espectrofotômetro λ 420 nm OBSERVAÇÕES 1 Os teores de P nas amostras são obtidos a partir da relação entre valor de absorbância x concentração 2 O método amarelo de vanadato é menos sensível que o azul de molibdênio porém sua coloração é mais estável 3 É o método mais usado para determinação de P em amostras vegetais VANTAGENS a Apresenta boa estabilidade do complexo formado 10 min até 24 h b Adequado para análises em rotina c Possibilidade de automação d Ausência de interferência de outros íons e Alta velocidade analítica LIMITAÇÃO a Menor sensibilidade quando comparado ao método azul de molibdênio 33 SÓDIO E POTÁSSIO 331 ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ATÔMICA 2531 PRINCÍPIO Quando uma solução que contém diversas substâncias é atomizada e as minúsculas partículas da solução são projetadas sobre uma chama há excitação dos átomos isto é há deslocamento de certos elétrons a níveis energéticos mais elevados quando os átomos voltam ao seu nível energético natural há emissão da energia absorvida na forma de radiação Os átomos excitados do elemento de interesse emitem luz em certos comprimentos de onda discretos e característicos do elemento p ex λ 766 a 767 nm para o potássio e 589 a 5896 nm para o sódio A radiação de comprimento de onda de interesse é separada da radiação emitida remanescente e sua intensidade é medida Essa medida de intensidade pode ser relacionada diretamente com a concentração do elemento de interesse comparandose a intensidade medida com uma curva de calibração 3112 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS b Fotômetro de chama c Vidrarias d Pipetas volumétricas 3113 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Solução 1000 mg L1 de potássio dissolver 19067 g de KCl pa seco em estufa a 100ºC por 2 h e completar o volume a 1000 mL com água Armazenar em frasco de polietieno sob refrigeração c Curva de calibração de potássio em balões volumétricos de 100 mL transferir 00 05 10 15 e 20 mL da solução 1000 mg L1 de K 3113b completando o volume com solução de 025 mol L1 de HClO4 Essas soluções contêm respectivamente 00 50 100 150 e 200 mgL1 de K d Solução 1000 mgL1 de sódio dissolver 25421g de NaCl pa seco em estufa a 100ºC por 2 h completando o volume a 1000 mL com água Armazenar em frasco de polietieno sob refrigeração e Curva de calibração de sódio em balões volumétricos de 100 mL transferir 00 05 10 15 e 20 mL da solução 1000 mgL1 de Na item 3113d completando o volume com solução de 025 mol L1 de HClO4 Essas soluções contêm respectivamente 00 50 100 150 e 200 mgL1 de Na 3114 PROCEDIMENTO Diluir o extrato obtido na decomposição da amostra item 234A para a faixa ideal de trabalho Como norma em função dos teores médios de K em amostras vegetais podese diluir 10 vezes Calibrar o fotômetro de chama com as soluções analíticas 0 e 20 mg L1 de K 3113c Quando da estabilização do aparelho iniciar as leituras da curva de calibração e das amostras A determinação de Na deverá ser realizada diretamente no extrato obtido pela decomposição da amostra item 234A Calibrar o fotômetro com as soluções analíticas de 0 e 20 mg L1 de Na item 3113e Quando da estabilização do aparelho iniciar as leituras da curva de calibração e das amostras OBSERVAÇÕES 5 Os teores de Na e K nas amostras são obtidos a partir da relação entre a porcentagem de emissão x concentração 6 Para facilitar o trabalho podese preparar curva de calibração mista K e Na 7 Poderão ser utilizadas concentrações de até 500 mg L1 de Na ou K na curva de calibração porém devese observar o comportamento Se não for uma reta devese utilizar a equação quadrática para calcular os resultados 8 O espectrômetro de absorção atômica deverá ser preferencialmente utilizado no modo emissão Porém os custos serão mais elevados em função da utilização de acetileno em lugar de propano fotômetro de chama 9 ICP OES apresenta maior sensibilidade podendo ser vantajoso seu emprego em caso de análises multielementares Porém deve ser ressaltado que os teores de Na e K em amostras de plantas são elevados não apresentando problemas devido à sensibilidade VANTAGENS a Alta velocidade analítica b Alta sensibilidade c Adequado para análises em rotina LIMITAÇÃO a Estreita faixa linear fotômetro de chama 34 CÁLCIO E MAGNÉSIO 341 ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA 3411 PRINCÍPIO A técnica analítica se baseia na absorção de radiação das regiões visível e ultravioleta do espectro eletromagnético por átomos no estado fundamental O espectrômetro de absorção atômica é constituído de fonte de radiação sistema de atomização conjunto monocromador e detector transdutor A amostra é nebulizada e em chama aracetileno ou oxido nitroso acetileno é vaporizada produzindo átomos no estado fundamental que podem absorver a energia radiante proveniente de uma lâmpada de catodo oco que emite radiação com comprimento de onda específico Os átomos absorvem essa luz ocorrendo transição para um nível de maior energia A intensidade dessa transição é relacionada com a concentração original dos átomos no estado fundamental 3412 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Espectrômetro de absorção atômica b Lâmpadas de catodo oco de Ca eou de Mg c Pipetas e balões volumétricos 3413 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Acido clorídrico concentrado 37 c Ácido perclórico a 70 d Solução de lantânio ou estrôncio a 10 mv transferir 1170 g de La203 ou 3020 g de SrCl26H2O para frasco de 1000 mL adicionar lentamente 125 mL de HCl concentrado Esfriar e completar o volume com água e Solução de lantânio ou estrôncio a 01 mv diluir 100 vezes a solução 3413d f Solução analítica concentrada para absorção atômica de Ca e Mg 1000 mgL1 g Soluções analíticas de Ca e Mg diluir as soluções de referência item 3413f preparando soluções com misturas de Ca 00 10 20 e 40 mg L1 e Mg 00 02 04 e 08 mg L1 Essas soluções deverão ser preparadas em meio de 025 mol L1 de ácido perclórico 3414 PROCEDIMENTO Transferir 10 mL do extrato obtido mediante a decomposição da amostra item 2 para recipiente adequado completar o volume para 20 mL com a solução diluída de La ou Sr item 3413f verificar as condições adequadas do equipamento item 37 OBSERVAÇÕES 1 Método mais utilizado para determinação de Ca e Mg 2 A adição de lantânio ou de estrôncio é necessária para a supressão da ionização do Ca e do Mg evitando a reação com fosfato e alumínio presentes e a formação de compostos refratários termicamente estáveis 3 ICP OES apresenta maior sensibilidade podendo ser vantajoso seu emprego em caso de análises multielementares Porém deve ser ressaltado que os teores de Ca e Mg em amostras de plantas são elevados não apresentando problemas devido à sensibilidade VANTAGENS d Alta velocidade analítica e Alta sensibilidade f Adequado para análises em rotina 342 TITULAÇÃO COM EDTA 3421 PRINCÍPIO Cálcio e magnésio são quantificados por complexação com o sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético EDTANa2 a partir da eliminação de interferentes e da utilização de diferentes complexantes e valores de pH Negro de eriocromo T sal sódico do ácido 2 hidróxi2naftilazo6nitronaftalinosulfônico é empregado para a quantificação de Ca Mg em valores de pH 10 Azul de eriocromo R ácido calconcarboxílico ou calcon é utilizado para a determinação do Ca após elevação dos valores de pH para 12 para precipitar o magnésio presente na solução Fosfatos são eliminados na forma de fosfato férrico Cobre zinco níquel e cobalto são mascarados com cianeto de potássio e ferro alumínio e manganês são mascarados com trietanolamina 3422 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Vidraria graduada b Bureta automática com precisão de 001 mL c Agitador magnético d Papelfiltro quantitativo de filtração rápida 3423 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Solução de EDTANa2 001 mol L1 transferir para balão volumétrico de 1000 mL 37225 g de EDTANa2 previamente seco em estufa entre 70 e 80ºC durante 2 h e resfriado em dessecador dissolver e completar o volume com água c Solução de negro de eriocromo T a 05 mv dissolver 125 mg de negro de eriocromo T em 25 mL de álcool metílico d Solução de calcon a 10 mv dissolver 100 mg de calcon em 100 mL de álcool metílico e Solução com pH 10 dissolver 7 g de NH4Cl em 58 mL de NH4OH adicionar 5 g de KCN cuidado 15 mL de trietanolamina e completar o volume para 100 mL com água Armazenar em frasco plástico f Solução de cloreto férrico 10 mgmL1 de Fe3 transferir 48 g de FeCl36H2O para balão volumétrico de 1000 mL adicionar 20 mL de HCl concentrado e completar o volume com água g Solução de ácido acético a 11 diluir 50 mL de H3CCOOH com 50 mL de água h Solução de vermelho de metila a 01 mv transferir para balão volumétrico de 100 mL 01 g de vermelho de metila dissolver e completar o volume com álcool etílico i Solução de hidróxido de amônio a 25 vv transferir para balão volumétrico de 1000 mL 250 mL de NH4OH e completar o volume com água j Solução com pH 12 dissolver 20 g de NaOH em 25 mL de água esfriar adicionar 5 g de KCN cuidado e 15 mL de trietanolamina e completar o volume para 100 mL em balão volumétrico Armazenar em frasco plástico OBSERVAÇÃO Cuidado o KCN é extremamente tóxico Em meio ácido forma HCN volátil sendo necessária sua utilização em meio básico para evitar maior toxicidade Utilizar equipamentos de proteção individual EPI 3424 PROCEDIMENTO a Transferir 50 mL da solução da amostra decomposta item 2 para béquer de 250 mL Para eliminação do fosfato adicionar 30 mL de solução de FeCl36H2O item 3423f 10 mL de solução de ácido acético item 3423g 2 gotas de solução de vermelho de metila item 3423h e adicionar solução de NH4OH item 3423i até viragem do indicador acrescentando mais 1 mL em excesso Aquecer a solução e deixar em ebulição por 5 min filtrar ainda quente e lavar com pequenas porções totalizando 10 mL de água a aproximadamente 80ºC Transferir o filtrado para balão volumétrico de 100 mL esfriar e completar o volume com água solução A b Cálcio transferir para erlenmeyer de 250 mL 250 mL da solução A item 3424a acrescentando aproximadamente 50 mL de água e sob agitação 60 mL de solução com pH 12 item 3423j e 5 gotas de solução de calcon item 3423d Titular com solução de EDTANa2 item 3423b até obtenção de cor azul estável que indica o ponto final da titulação c Cálcio magnésio transferir para erlenmeyer de 250 mL 250 mL da solução A item 3424a acrescentando aproximadamente 50 mL de água e sob agitação 70 mL de solução com pH 10 item 3423e e 5 a 7 gotas de solução de negro de eriocromo T item 3423c Titular com solução de EDTANa2 item 3423b até obtenção de cor azul estável que indica o ponto final da titulação OBSERVAÇÃO 1 10 mL de EDTANa2 a 001 mol L1 é equivalente a 04 mg de Ca VANTAGENS a Baixo custo b Boa repetibilidade LIMITAÇÕES a Utilização de reagentes altamente tóxicos e venenosos b Método sujeito a sérios problemas de interferência 35 ENXOFRE 351 TURBIDIMETRIA 3511 PRINCÍPIO Baseiase na quantificação da turbidez provocada pela precipitação do íon enxofre pelo cloreto de bário na forma de sulfato de bário BaSO4 MALAVOLTA et a 1989 3512 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Espectrofotômetro ou turbidímetro b Agitador do tipo Vortex 3513 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Cristais de BaCl2 passados em peneira de 60 mesh malha 025 mm c Solução analítica concentrada de S 1000 mgL1 de SSO4 pesar 5434g de K2S04 seco em estufa dissolver em água e completar o volume para 1000 mL d Soluções analíticas de enxofre 00 100 150 200 300 400 e 500 mgL1 de S em balões volumétricos de 100 mL adicionar respectivamente 00 10 15 2025 3040 e 50 mL da solução analítica concentrada de enxofre item 3513c completando o volume com água e Solução de HCl 6 mol L1 com 20 mgL1 de S dissolver 01087g de K2SO4 seco previamente em estufa em 200 mL de água Em seguida adicionar 500 mL de HCl Agitar até completa dissolução do sal e completar o volume para 1000 mL com água 3514 PROCEDIMENTO Transferir 20 mL do extrato obtido na decomposição da amostra item 234A ou da solução analítica de S item 3513d e completar o volume para 200 mL com água Em seguida transferir 100 mL dessa solução para tubo de 300 mL adicionando 10 mL da solução de HCl item 3513e e 05 g de BaCl2 item 3513b Agitar vigorosamente por 30 s e após 4 min cronometrados efetuar leitura no espectrofotômetro em comprimento de onda de 420 nm ou no turbidímetro OBSERVAÇÃO A leitura deve ser realizada impreterivelmente entre 4 e 8 min uma vez que o precipitado de BaCl4 decantase rapidamente VANTAGEM Baixo custo LIMITAÇÃO Baixa sensibilidade 36 COBRE ZINCO FERRO E MANGANÊS 361 PRINCÍPIO O tecido vegetal pode ser decomposto por via úmida item 23 e a determinação do elemento é realizada diretamente no extrato por espectrometria de absorção atômica 3612 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Espectrômetro de absorção atômica com lâmpada de catodo oco de Cu Zn Fe e Mn 3613 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Soluções de ácido clorídrico 60 mol L1 e 20 mol L1 c Solução analítica concentrada de cobre com 100 mg L1 de Cu dissolver 0393 g de CuSO4 5H2O em solução de HNO3 a 02 mol L1 d Solução analítica concentrada de ferro com 100 mg L1 de Fe pesar e dissolver 0702 g de sulfato ferroso amoniacal NH42FeSO46H2O em 50 mL de água desionizada que contenha 100 mL de H2SO4 concentrado e completar o volume para 1000 mL com água desionizada e Solução analítica concentrada de manganês com 100 mg L1 de Mn pesar 031 g de MnSO4H2O e dissolver em solução de HNO3 a 02 mol L1 completando o volume para 1000 mL f Solução analítica concentrada de zinco com 100 mg L1 de Zn pesar e dissolver 0440 g de ZnSO47H2O em solução de HNO3 02 mol L1 completando o volume para 1000 mL com esta solução OBSERVAÇÃO Para evitar problemas devidos a contaminações eou alterações no estado físicoquímico dos sais recomendase o uso de soluções analíticas concentradas disponíveis no comércio g Curva de calibração mista de cobre ferro manganês e zinco a partir das soluções analíticas concentradas itens 3613c d e f transferir para balão volumétrico de 100 mL alíquotas apropriadas para que a curva de calibração final se encontre dentro da faixa linear respectiva de cada elemento completando o volume mantendose a mesma condição de acidez final das amostras 3614 PROCEDIMENTO Para cada elemento calibrar o equipamento com a curva de calibração mista item 3613g e proceder às leituras diretamente no extrato obtido a partir da decomposição da amostra item 23 Verificar o alinhamento da lâmpada e a adequação da chama item 37 37 REGRAS BÁSICAS PARA MANUTENÇÃO DE ROTINA EM ESPECTRÔMETROS DE ABSORÇÃO ATÔMICA Instrumentos em boas condições de operação devem ser considerados prioridade em qualquer laboratório de análises Para isso é necessário implantar um programa de manutenção manutenção geral do instrumento manutenção no fornecimento de gás manutenção dos componentes da chama e manutenção dos componentes do forno visando ao aumento da vida útil do instrumento ao tempo de parada reduzido e à melhoria geral no desempenho do instrumento dando ao operador maior confiança na validade de seus resultados analíticos Este tópico foi extraído no manual operacional da Embrapa Pecuária Sudeste 371 MANUTENÇÃO GERAL DO INSTRUMENTO Poeira e vapores condensados podem se acumular no invólucro do instrumento e líquidos corrosivos podem espirrar no instrumento Para minimizar os danos limpe o instrumento com pano macio úmido usando água ou solução detergente fraca Não use solventes orgânicos Nas janelas do compartimento da amostra e nas janelas da lâmpada podem se acumular poeira ou marcas digitais Nesses casos limpe as janelas com pano macio umedecido com álcool isopropílico Se as janelas não estiverem limpas o operador observará sinais de ruído das lâmpadas e resultados analíticos não reprodutíveis Evitar a instalação do equipamento em locais onde haja alta concentração de poeira e vapores O equipamento não deverá ser exposto à incidência direta de raios do sol e a corrente elétrica deverá ser estabilizada visando ao aumento da vida útil dos componentes eletrônicos Os componentes óticos vedados deverão ser limpos por especialistas da assistência técnica autorizada 372 MANUTENÇÃO DO FORNECIMENTO DE GÁS A chama tem a finalidade de transformar íons e moléculas em átomos no estado fundamental Os gases mais apropriados para uso em espectrometria de absorção atômica por chama são o ar ou o óxido nitroso empregados como gases de suporte da combustão e o acetileno empregado como gás combustível Cada gás é fornecido ao instrumento por meio de sistema de fornecimento dotado de tubos e mangueiras de borracha Tubulação de cobre pode ser utilizado para os gases oxidantes e o acetileno só deve ser fornecido por meio de tubulação de aço inoxidável Verificar regularmente as conexões da rede de gases para prevenir possíveis vazamentos especialmente quando os cilindros são trocados usando solução de detergente ou mistura de etanol e água O tipo de chama mais utilizado em espectrometria de absorção atômica é a mistura aracetileno numa proporção relativamente elevada de oxidante em relação ao combustível chama azul A mudança na proporção oxidantecombustível pode alterar o equilíbrio e pode melhorar significativamente a eficiência de atomização A chama redutora amarela é obtida aumentandose a quantidade de acetileno em relação ao ar promovendo aumento da pressão parcial de uma série de produtos da combustão por exemplo CO isso facilita a atomização de elementos com tendências de formação de óxidos refratários Por outro lado a chama oxidante azul clara é obtida diminuindo a quantidade de acetileno em relação ao ar o que favorece aqueles elementos cuja eficiência de atomização se dá pela formação de óxidos Quanto à manutenção devese verificar se as mangueiras de borracha ligadas ao instrumento estão gastas ou rachadas Além disso a cada troca de carga dos gases verificar se os reguladores e as válvulas estão funcionando corretamente Por serem usados ou produzidos gases potencialmente tóxicos na chama é necessário usar um sistema de exaustão apropriado com capacidade mínima de 6 m3min ou o recomendado pelo fabricante do instrumento 373 AR COMPRIMIDO O ar pode ser fornecido ao instrumento a partir de cilindros ou de um compressor de ar sendo os cilindros fonte mais dispendiosa Se for utilizado ar comprimido produzido por um compressor um conjunto de filtro e regulador na linha de entrada para o instrumento deverá ser instalado O fornecimento deve ter pressão de entrada de 60 psi e o ar deve ser limpo seco e livre de óleo Excesso de ruído na leitura poderá ser atribuído ao ar contaminado O conjunto de filtro de ar constitui um componente essencial do espectrômetro de absorção atômica e sua inclusão na instalação de fornecimento de ar é obrigatória Semanalmente verifique se o filtro contém acumulo de partículas e de umidade Quando necessário desmonte o conjunto de filtro de ar e limpe o elemento filtrante o vaso e os componentes da válvula de drenagem 374 ACETILENO O acetileno é o único gás combustível normalmente usado em espectrometria de absorção atômica por chama O gás deve ser empacotado em acetona e ter grau de pureza de pelo menos 996 e especificação grau AA A pressão de entrada deve ser regulada e nunca exceder 15 psi Verificar o manual de operações do instrumento para que a pressão seja corrigida em conformidade com as exigências do fabricante Verificar diariamente a pressão do cilindro de acetileno evitando que seja inferior a 100 psi para impedir que a acetona entre na linha de gás provocando degradação dos resultados analíticos e causando danos ao instrumento 375 ÓXIDO NITROSO O óxido nitroso usado para a espectrometria de absorção atômica por chama deve ser livre de óleo Se não for usado um regulador aquecido pode ocorrer a perda da regulagem devida ao efeito de expansão por resfriamento Isto pode levar a resultados errados e criar o potencial para uma situação de retorno de chama com unidades de controle manual de gás 376 MANUTENÇÃO DOS COMPONENTES DA CHAMA A manutenção dos componentes da chama deve ser rotineira para garantir o bom desempenho do seu equipamento Esses componentes são divididos em nebulizador câmara de aspersão e queimador 377 ATOMIZAÇÃO POR CHAMA O atomizador é uma parte de extrema importância na espectrometria de absorção atômica pois neste dispositivo serão formados os átomos que absorverão a radiação proveniente da lâmpada de catodo oco e em função disso será determinada a concentração do elemento de interesse O atomizador de chama mais comum possui um dispositivo chamado nebulizador que pode ser constituído por uma agulha de metal ou um sistema de vidro Em qualquer dos casos a função do nebulizador é formar um aerossol da solução aquosa que se deseja analisar Esse aerossol é constituído por pequenas gotículas que entram em uma câmara de nebulização e chegam ao queimador arrastado pelos gases combustível e oxidante O nebulizador normalmente é constituído em aço inoxidável e o queimador em titânio para resistir às elevadas temperaturas A parte interna da câmara de nebulização deve ser de material inerte à corrosão podendo ser metálico ou plástico OLIVEIRA et al 2000 A área do nebulizador do componente de chama consiste do tubo capilar e do corpo do nebulizador Tenha sempre cuidado para que o tubo capilar usado para aspirar as soluções esteja corretamente adaptado ao capilar do nebulizador Quaisquer vazamentos de ar curvaturas estreitadas ou pancadas causarão leituras instáveis não reprodutíveis Algumas vezes o tubo capilar de plástico pode entupir e será necessário cortar a seção entupida ou adaptar novo pedaço de tubo capilar Em qualquer caso devese verificar com cuidado para ter certeza de que o tubo capilar esteja corretamente adaptado ao capilar do nebulizador Este também pode apresentar entupimento Se isto ocorrer proceda da seguinte maneira apague a chama remova o tubo capilar de polietileno remova o nebulizador de sua base e desmonteo conforme descrito no manual de operação do instrumento Coloque o nebulizador em um limpador ultrassônico que contenha solução de detergente líquido a 05 Triton X100 Se este procedimento não for eficaz passe um arame de nebulizador livre de aparas cuidadosamente através do nebulizador e em seguida repita o procedimento de limpeza ultrasônica monte e instale novamente o nebulizador de acordo com as instruções Caso formem bloqueios e se eles não forem removidos o sinal analítico cairá continuamente até que não se observe nenhuma absorbância Os problemas com o nebulizador podem ser minimizados tendose o cuidado de sempre aspirar de 50 a 500 mL de água no final de cada dia de trabalho 378 CÂMARA DE ASPERSÃO Quando a amostra sai do nebulizador ela vai de encontro à esfera de impacto e se divide em gotículas do tipo aerossol A eficiência da esfera pode ser comprometida pela ocorrência de ranhuras superficiais nas quais poderá ocorrer acumulação de material sólido A redução na eficiência da esfera de impacto pode causar diminuição nos valores de absorbância e ruídos no sinal analítico Ao remover o nebulizador para inspeção certificar se de que o mecanismo de ajuste funcione adequadamente e que a esfera esteja posicionada corretamente sobre a saída do nebulizador Juntamente com o nebulizador e a esfera de impacto a câmara de aspersão e o retentor de líquido devem também ser removidos para limpeza com detergente neutro e água Enxaguar completamente com água desionizada e secar todos os componentes Encher novamente o retentor de líquidos e montar a câmara de aspersão verificando possíveis deformações nos anéis de vedação ou nos bloqueios das entradas de gás Verificar diariamente o nível do rejeito descartálo num tanque de armazenagem para posterior tratamento dos resíduos 379 QUEIMADOR O componente final de interesse do sistema da chama é o queimador Durante a aspiração de certas soluções podem se formar depósitos de carvão eou sais no queimador causando alteração na razão combustíveloxidante e no perfil da chama corte potencial do feixe ótico e degradação do sinal analítico Para minimizar o acúmulo de sais uma solução diluída de ácido nítrico pode ser aspirada entre as amostras Se os sais continuarem a se acumular desligar a chama e usar a tira de limpeza fornecida com o instrumento Introduza a tira na abertura do queimador e movaa para trás e para a frente através da abertura Isto deve deslocar quaisquer partículas que serão então afastadas logo que a chama seja acesa e a água aspirada Não use objetos afiados tais como lâminas de barbear para limpar o queimador pois podem causar ranhuras na abertura formando áreas onde os sais e o carvão possam se acumular em velocidade acelerada Se este tipo de limpeza não for eficiente remova o queimador invertao e embebao em água morna com sabão Uma escova facilitará a limpeza Também pode ser embebido em solução de ácido nítrico a 05 vv Uma alternativa para a limpeza são os banhos ultrasônicos com detergente nãoiônico diluído Após a limpeza enxágüeo completamente com água desionizada e seque antes de instalálo no instrumento Nunca desmonte o queimador para limpeza pois se for montado incorretamente ocorrerá vazamento de misturas gasosas com potencial para causar explosões Esta manutenção deve ser feita semanalmente Após o término das análises devese aspirar de 50 a 100 mL de água desionizada para limpar o nebulizador a câmara de aspersão e o queimador 3710 PROGRAMA DE MANUTENÇÃO PERIÓDICA Diariamente Verificar o gás Verificar o sistema de exaustão Esvaziar o receptáculo de drenagem Limpar as janelas do compartimento de amostra e Enxaguar a câmara de aspersão com 100 mL de água destilada Semanalmente Desmontar a câmara de aspersão e verificar a esfera de impacto e os componentes do nebulizador e Lavar a câmara de aspersão e o retentor de líquidos limpar o queimador trocar o líquido do retentor verificar os anéis de vedação verificar o conjunto de filtros de ar e limpar o instrumento com pano No momento da troca dos gases Verificar vazamentos pressão dos reguladores e mangueiras de fornecimento de gás 38 BORO 381 AZOMETINAH 3811 PRINCÍPIO Técnica de espectrometria de absorção molecular cuja determinação é baseada na formação de um complexo de coloração amarela resultante da reação do ácido bórico com o reagente azometinaH WHO 1998 WOLF 1971 Em soluções aquosas o reagente é amarelado e se dissocia de acordo com a seguinte reação WOLF 1971 O ácido bórico desloca o equilíbrio para a esquerda aumentando a intensidade da coloração amarela proporcionalmente à concentração de boro Esse deslocamento é relativamente lento 3812 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Cadinho de porcelana b Forno do tipo mufla c Tubos de ensaio de polipropileno d Espectrofotômetro VIS 3813 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Ácido clorídrico 01 mol L1 dissolver 83 mL de HCl concentrado em 1000 mL com H20 destilada Armazenar em frasco plástico c Solução de ácido ascórbicoL a 1 pesar e dissolver 1 g de ácido ascórbicoL em 100 mL de água d Soluçãotampão pesar e dissolver 500 g de acetato de amônio e 30 g de EDTA em 800 mL de água Adicionar lentamente 250 mL de ácido acético glacial e homogeneizar e Solução de azometinaH dissolver 045 g de azometinaH em 100 mL da solução de NH2 OH O3S HO3S CHO OH N OH C HO H3BO3 H2O Ácido H Aldeído Salicílico Azometina H H NH2 OH O3S HO3S CHO OH N OH C HO H3BO3 H2O Ácido H Aldeído Salicílico Azometina H H NH2 OH O3S HO3S CHO OH N OH C HO H3BO3 H2O Ácido H Aldeído Salicílico Azometina H H ácido ascórbico item 3813a Esta solução deve ser preparada semanalmente armazenada em frasco escuro e conservada no refrigerador f Solução analítica concentrada de boro 500 mg L1 dissolver 0286 g de ácido bórico em HCI a 01 mol L1 completar o volume para 1000 mL com o ácido Armazenar em frasco plástico g Curva de calibração transferir para balões volumétricos de 100 mL 00 05 10 20 30 40 e 50 mL da solução analítica concentrada e completar o volume com HCI a 01 mol L1 guardando em frascos plásticos Essas soluções contêm respectivamente 00 025 05 10 15 20 e 25 mg L1 de boro 3814 PROCEDIMENTO 38141 Preparo do extrato Incinerar 250 mg da amostra seca e moída a 5000C durante cerca de 2 h Dissolver as cinzas com 10 mL de solução de HCl a 01 mol L1 Homogeneizar 38142 Determinação Transferir para tubos de ensaio de polipropileno alíquota de 20 mL da curva de calibração ou da amostra Juntar 20 mL da soluçãotampão e homogeneizar Adicionar 20 mL da solução de azometinaH a 045 e agitar Após 30 min transferir as soluções amarelo avermelhadas para tubos do espectrofotômetro e proceder às leituras em filtro azul em 420 nm acertando o zero do aparelho com HCI a 01 mol L1 VANTAGENS a Método rápido e preciso b Alta sensibilidade LIMITAÇÕES a Alto custo operacional b Uso de reagentes tóxicos e irritantes azometinaH 382 CURCUMINA 3821 PRINCÍPIO O método fundamentase na reação entre o ânion borato e a curcumina em presença de ácido oxálico havendo a formação de um composto constituído predominantemente de rubrocurcumina solúvel em álcool etílico e medido espectrometricamente WHO 1998 WOLF 1971 3822 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Cadinhos de porcelana b Forno do tipo mufla c Copos plásticos d Banho termostatisado e Centrífuga f Espectrofotômetro 3823 REAGENTES E SOLUÇÕES a Água destilada e desionizada b Ácido clorídico 01 mol L1 ver item 3813b c Álcool etílico 96GL d Curcumina e Ácido oxálico f Ácido clorídrico g Solução de álcool etílico 96GL livre de boro h Solução de curcumina em ácido oxálico dissolver 004 g de curcumina finamente moída e 50 g de ácido oxálico em 100 ml de álcool etílico a 95 Guardar em frasco escuro em refrigerador preparar semanalmente i Solução analítica concentrada de boro 500 mgL1 ver item 3813f j Curva de calibração ver item 3813g 3824 PROCEDIMENTO 38241 Preparo do extrato Ver item 38141 3842 Determinação Transferir 10 mL do extrato ou da curva de calibração para frascos plásticos de 50 mL Juntar 40 mL da solução de curcumina em ácido oxálico e misturar Colocar os frascos em banhomaria e mantêlos a 55 3ºC de modo que a parte que contenha as soluções fique uniformemente mergulhada Alternativa colocar os frascos em estufa na mesma temperatura Deixar secar e conservar os frascos com as amostras no banho por mais 15 min Retirar os frascos e esfriar em temperatura ambiente Juntar exatamente 25 mL de álcool etílico 95 96 friccionando com bastonete de vidro com ponta de borracha até dissolver todo o resíduo Transferir as soluções para tubos do espectrômetro e ler até 1 2 h após usando filtro verde 540 nm acertando o zero com solução de HCl a 01 mol L1 VANTAGENS a Alta sensibilidade b Método preciso LIMITAÇÃO O extrato deve ser lido no máximo até 60 min após a estabilização da coloração 4 SISTEMA POLIVALENTE PARA DETERMINAÇÃO MULTIELEMENTAR EM ANÁLISE DE PLANTAS 41 PRINCÍPIO O sistema polivalente por injeção em fluxo consiste na utilização de um único sistema capaz de realizar diferentes determinações Não são necessárias modificações no módulo de análise para a determinação de um ou outro elemento O sistema polivalente foi projetado para determinação de ferro cobre manganês zinco cálcio magnésio e fósforo em plantas As medidas espectrofotométricas podem ser realizadas após apropriadas modificações dos reagentes das suas concentrações do volume de amostra injetada eou do comprimento de onda SILVA et al 1998ab A determinação do ferro total baseiase na reação entre o FeII e a ofenantrolina após prévia redução do FeIII do digerido por ácido ascórbico A determinação de cobre explora o efeito catalítico dos íons cúpricos na oxidação dos íons férricos pelo tiossulfato A coloração avermelhada do complexo intermediário FeS2O32 decresce proporcionalmente à concentração de cobre do digerido A formaldoxima atua como reagente cromogênico para determinação de manganês Em meio alcalino ela forma solução avermelhada com os íons Mn II Como o ferro tornase uma espécie potencialmente interferente empregase o KCN pois complexa o ferro sem afetar o sinal analítico do composto Mnformaldoxima formado A determinação de zinco baseiase na formação do complexo azul ZnZincon A ocresolftaleína complexona CPC é o reagente cromogênico utilizado nas determinações de cálcio e magnésio após adição de ácido bisaminoetilglicoeterNNNNtetraacético EGTA ou oxina e soluçãotampão adequada para melhoria na seletividade A presença de ferro em concentrações 10 mg L1 conduz à redução pronunciada do sinal analítico do magnésio Para minimizar esse efeito a adição de 30 mv de KCN ao reagente R1 deve ser empregada e nessa situação a concentração de ferro tolerada é de aproximadamente 50 mg L1 A determinação do fósforo baseiase na metodologia do amarelo de indofenol Em meio ácido o fósforo reage com os íons do reagente R1 para formar um complexo amarelo Esta reação apresenta sensibilidade e seletividade adequadas para análises de plantas 42 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Bomba peristáltica com 8 canais c Tubos de Tygon para bombeamento d Injetorcomutador de acrílico do tipo 13 e Espectrofotômetro com célula de fluxo f Registrador potenciométrico g Tubos de polietileno 08 mm d i 43 REAGENTES E SOLUÇÕES Todas as soluções devem ser preparadas com reagentes químicos de grau analítico e água destilada e desionizada A matéria orgânica é mineralizada por via seca 025 g de tecido vegetal seco finamente moído e peneirado é incinerado e os resíduos são recuperados em 50 mL de 10 mol L1 de HCl e diluídos 5 vezes com água apresentando concentração final aproximada de 02 mol L 1 de HCl sendo esta a concentração utilizada no fluxo transportador C Fig 1 Considerandose os teores esperados de zinco cobre manganês ferro cálcio magnésio e fósforo dos digeridos curvas de calibração mistas são preparadas em 02 mol L1 de HCl contendo de 000 a 200 mg L1 de Zn Cu e Mn 00 a 100 mg L1 de Fe e Mg 00 a 160 mgL1 de PP04 00 a 400 mg L1 de Ca As soluçõesestoque são de 10000 mgL1 de Zn Cu Fe ou Ca com base em ZnSO4 CuCl2 FeCl32H2O ou CaCO3 em HCl e de 2500 mgL1 de Mg ou P MgSO47H2O ou KH2PO4 Ferro R1 Fig 2 solução com 20 mv de ácido ascórbico preparada diariamente e estocada em frasco escuro R2 solução com 20 mol L1 de acetato de amônio mais 025 mv de 110 ofenantrolina fen preparada a partir da solubilização de 1542 g de NH4CH3COOH 025 g de fen em 100 mL de água e R3 água Cobre R1 solução com 010 mol L1 de tiossulfato de sódio preparada a partir da solubilização de 248 g Na2S2O3 em 100 mL de água R2 água e R3 solução com 005 mol L1 de sulfato férrico preparada a partir da solubilização de 13 g de FeCl32H2O em 100 mL de água Zinco R1 solução com 20 mv de ácido ascórbico preparada diariamente e estocada em frasco escuro R2 solução com 05 mol L1 de Na2B4O7 07 mol L1 de NaOH 05 mv de KCN preparada a partir da solubilização de 280 g de NaOH 05 g de KCN 101 g de Na2B4O7 em aproximadamente 80 mL de água quente sob agitação ajustando o pH para 94 20 mol L1 de NaOH ou 60 mol L1 de HCl e completandose o volume para 100 mL com água e R3 solução com 004 mv de Zincon 2carboxi2hidroxi5 sulfoformazilbenzeno 037 mv de formaldeído preparada pela solubilização de 004 g de Zincon e 10 mL de soluçãoestoque com 37 mv de formaldeído padronizado Manganês R1 solução com 20 mv de ácido ascórbico R2 solução com 20 mol L1 de NaOH 30 mv de KCN dissolvidos em água e R3 solução com 05 mol L1 de formaldoxima preparada pela solubilização de 70 g de cloreto de hidroxilamina 30 mL de formaldeído a 37 mv em 100 mL de água Cálcio R1 solução com 05 mol L1 de NaOH 30 mv de KCN R2 soluçãotampão 05 mol L1 de NH3NH4 pH 105 preparada pela solubilização de 267 g de NH4Cl 200 g NaOH em cerca de 800 mL de água ajustandose o pH para 105 e completandose o volume com água para 1000 mL e R3 solução com 001 mv de ocresolftaleína complexona CPC oxina a 02 mv preparada pela dissolução de 0002 g de CPC e 04 g de oxina em 20 mL de 50 mol L1 de HCl completando o volume para 200 mL com água Magnésio R1 solução com 05 mol L1 de NaOH 30 mv de KCN R2 soluçãotampão 05 mol L1 de NH3NH4 pH 105 45103 mol L1 de EGTA 50103 mol L1 de BaCl22H2O preparada pela solubilização de 200 g de NaOH 267 g de NH4Cl 121 g de BaCl22H2O 171 g de EGTA em 1000 mL de água e R3 solução com 003 mv de CPC Fósforo R1 água R2 solução com 16 mv de molibdato de amônio preparada pela dissolução de 160 g de NH46Mo7O244H2O em aproximadamente 800 mL de água quente e completandose o volume para 1000 mL com água e R3 solução com 008 mv de metavanadato de amônio preparada pela dissolução de 080 g de NH4VO3 em água quente adicionandose 1120 mL de HNO3 concentrado e completandose o volume para 1000 mL com água 44 PROCEDIMENTO O diagrama de fluxos é mostrado na Fig 2 O comprimento da alça de amostragem L através da qual a amostra é aspirada 40 mLmin1 é de 50 cm cerca de 250 µL para Fe Cu Zn e Mn de 20 cm cerca de 100 µL para P e Mg ou de 10 cm cerca de 50 µL para determinação de Ca Após modificação da posição do injetorcomutador a alíquota da amostra selecionada é introduzida no fluxo transportador 40 mLmin1 A zona de amostra estabelecida recebe os reagentes R1 R2 e R3 10 mLmin1 passa pelas bobinas B1 B2 e B3 30 50 e 300 cm e alcança a unidade de detecção A passagem da amostra processada através da célula de fluxo resulta em um sinal transiente proporcional à concentração do analito contido na amostra monitorado no comprimento de onda adequado Tabela 1 Após o registro do sinal analítico o injetorcomutador retorna à posição inicial na Fig 2 para que nova alíquota da amostra seja introduzida no fluxo transportador W W C IC R1 R2 R3 B3 S L B1 B2 D Figura 2 Sistema polivalente por injeção em fluxo IC injetorcomutador A amostra L alça de amostragem C fluxo transportador 40 mLmin1 R1 R2 R3 reagentes 10 mLmin1 B1 B2 B3 bobinas de reação 30 50 200 cm D detector W descarte Linha pontilhada posição alternativa do IC com a movimentação da porção central setas direção de bombeamento Outras indicações sobre as dimensões do sistema encontramse na Tabela 1 Tab 1 Concentrações dos reagents comprimento de onda linearidade e equações de calibração para determinação de Fe Cu Mn Zn Ca Mg e P em plantas por sistema polivalente por injeção em fluxo Elemento L1 cm λ nm linearidade mg L1 R1 10 mL min1 R2 10 mL min1 R3 10 mL min1 Ferro 50 512 até 100 20 wv ácido ascorbico 025 wv fen 20 M NH4OAc H2O Zinco 50 630 20 20 wv ácido ascorbico 05 wv KCN 07 mol L1 NaOH 05 mol L1 Na2B4O7 004 wv Zincon 10 wv HCHO 002 mol L1 NaOH Manganês 50 455 20 20 wv ácido ascorbico 30 wv KCN 20 mol L1 NaOH 05 mol L1 formaldoxina Cobre 50 550 20 010 mol L1 Na2S2O3 H2O 0050 mol L1 Fe III Cálcio 10 575 300 05 mol L1 NaOH 30 wv KCN 05 mol L1 NH3NH4 pH 105 001 wv CPC 02 wv oxina Magnésio 20 570 100 05 mol L1 NaOH 30 wv KCN 00045 mol L1 EGTA 0005 mol L1 Ba II 05 mol L1 NH3NH4 pH 105 003 wv CPC Fósforo 20 420 300 H2O 16 wv NH46Mo7O24 4H2O 008 wv NH4VO3 1 Alça de amostragem diâmetro 08 mm 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOAC Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists International 16 ed Arlington 1995 v1 cap3 KRUG FJ Métodos de Decomposição de Amostras IN III Workshop sobre Preparo de Amostras São Carlos SP 2000 148p MALAVOLTA E VITTI GC OLIVEIRA SA Avaliação do estado nutricional das plantas princípios e aplicações Piracicaba Associação Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato 1989 201p MILLS HA JONES JR JB Plant Analysis Handbook II A practica sampling preparation analysis and interpretation guide 2ed Athens Georgia MicroMacro Publishing Inc 1996 422p MIYAZAWA M PAVAN MA BLOCH MFM Determination of Ca Mg K Mn Cu Zn Fe and P in coffee soybean corn sunflower and pasture grass leaf tissues by a HCl Extraction Method Communications in Soil Science Plant Analysis 15 141 1984 NOGUEIRA ARA SOUZA GB BATISTA LAR Determinação Espectrofotométrica de Nitrogênio em Digeridos de Plantas em Sistema de Análise por Injeção em Fluxo Química Nova v19 1 p33361996 OLIVEIRA PV KRUG FJ NÓBREGA JA Espectrometria de Absorção Atômica Apostila Curso em Análise Química Piracicaba 2000 QUEVAUVILLER P Conclusions of the Workshop improvements of trace element determination in plant matrices Science Total Enviromental Brussels v176 p141 148 1995 RUZICKA J HANSEN EH Flow injection analysis 2 edNew York John Wiley 1988 497p SILVA FV NOGUEIRA ARA SOUZA GB ZAGATTO EAG A polyvalent flow injection system for multielemntal spectrophotometric analysis of plant material Analytica Chimica Acta v 370 p3946 1998a SILVA FV SOUZA GB NOGUEIRA ARA Utilização de sistemas de análise por injeção em fluxo em laboratório de nutrição animal Sistema polivalente para determinação multielementar em plantas São Carlos EMBRAPACPPSE 1998b 27p Boletim de Pesquisa 3 WHO Boron Environmental health criteria No204 A WHO monograph Genova Switzerland World Heath Organization 1998 WOLF B The determination of boron in soil extracts plant materials composts manures water and nutrient solutions Soil Science and Plant Analysis 2 5 363374 1971 CAPÍTULO 9 ANÁLISE DE ALIMENTOS Ana Rita de Araujo Nogueira1 Ari Luiz de Castro2 Carlos Roberto Bernardi3 Dirceu Luís Zanotto3 Gilberto Batista de Souza1 Coordenador Gustavo Eugênio Gerhard Barrocas4 Heloísa Carneiro5 Janice Ribeiro Lima6 José Roberto Ferreira5 Mônica Martini7 Nilva Gaudereto Martins5 Sidnéa Cordeiro de Freitas8 Valéria Saldanha Bezerra9 1 INTRODUÇÃO A análise química do alimento é fundamental quando o objetivo é a avaliação da sua qualidade a partir de informações sobre os teores de nutrientes para viabilizar dietas balanceadas A quantificação dos nutrientes presentes nos alimentos para animais proporciona maior conhecimento do seu valor nutritivo possibilita adequar dietas mais eficientes e racionaliza a utilização dos recursos As metodologias descritas nesse capítulo foram catalogadas com base em informações fornecidas pelos responsáveis pelos laboratórios de nutrição animal e humana nos diferentes centros da Embrapa São procedimentos já testados e publicados em outras fontes e maiores detalhes poderão ser obtidos nas referências bibliográficas de cada procedimento 2 DETERMINAÇÃO DE MATÉRIA SECA 21 Procedimento convencional 211 APLICAÇÃO Produtos e subprodutos de origem animal vegetal e mineral e rações e concentrados 1 Embrapa Pecuária Sudeste 2Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia USP Campus Pirassununga 3Embrapa Suínos e Aves 4Embrapa Gado de Corte 5Embrapa Gado de Leite 6Embrapa Agroindústria Tropical 7Coordenadoria de Defesa da Agricultura CDA 8Embrapa Agroindustria de Alimentos 9Embrapa Amapá 211 PRINCÍPIO O método é baseado na evaporação da água presente na amostra pela ação do calor Sua determinação é importante porque os resultados de outras determinações são corrigidos e fornecidos com base na matéria seca SILVA QUEIROZ 2002 COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1998 O teor de matéria seca em percentagem é obtido pela diferença das pesagens entre o recipiente com a amostra úmida e o recipiente com a amostra seca O termo amostra seca ao ar ASA referese à secagem a 65ºC em estufa com circulação forçada de ar enquanto a amostra seca em estufa ASE referese à secagem em estufa a 105ºC após a amostra ter sido inicialmente secada a 65oC ASA e moída A matéria seca é o resultado da multiplicação entre as secagens ASA x ASE 213 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança precisão de 001 g Balança analítica precisão de 00001 g Estufa de secagem com circulação forçada de ar 65ºC Estufa de secagem 105ºC Dessecador com cloreto de cálcio e sílicagel como indicador de umidade Recipiente para pesagem da ASA sacos de papel com capacidade para 3 kg para folhas e grãos ou formas de vidro refratário tipo Pyrex para amostras pastosas ou líquidas Recipiente para pesagem da ASE cadinho ou cápsula de porcelana béquer de vidro pesafiltro ou cápsula de alumínio Pinça de aço inoxidável Espátula de aço inoxidável meia cana 214 REAGENTES E SOLUÇÕES Não são empregados reagentes e soluções nesta determinação 215 PROCEDIMENTO 2151 Amostra seca ao Ar ASA secagem em estufa estufa a 65ºC Pesar precisão de 001 g o recipiente que irá conter a amostra saco de papel ou forma de vidro M1 Obs O recipiente deve estar limpo e seco Adicionar a amostra aproximadamente 150 g registrando a massa M2 Colocar o recipiente com a amostra em estufa com circulação forçada de ar regulada para 65ºC por 72 h Retirar da estufa deixar esfriar no ambiente por 30 min e registrar a massa precisão 001 g M3 Obs Quando a umidade do ar for alta é recomendável deixar a amostra esfriar em dessecador Reservar a amostra seca para moagem e posterior determinação da ASE 2152 Amostra seca em estufa a 105ºC ASE Secar durante 2 h em estufa a 105ºC o recipiente em que será colocada a amostra Retirar o recipiente da estufa colocar em dessecador por 1 h e pesar precisão de 00001 g M4 Adicionar de 1 a 5 g da amostra ao recipiente e pesar novamente M5 Transferir o recipiente com a amostra para estufa a 105ºC até massa constante aproximadamente 6 h Podese pesar maior número de amostras e colocálas na estufa ao final do expediente retirandoas na manhã seguinte Obs A abertura freqüente da estufa ou a presença de outros materiais úmidos ou com teor elevado de umidade na estufa pode requerer tempo maior para secagem das amostras Retirar da estufa deixar resfriar em dessecador por 1 h e pesar M6 2153 Cálculos ASA M1 massa g do recipiente M2 massa g do recipiente mais a amostra antes de secar M3 massa g do recipiente mais a amostra seca ASE M4 massa g do recipiente M5 massa g do recipiente mais a amostra seca a 65ºC M6 massa g do recipiente mais a amostra seca a 105ºC Matéria seca MS ASA M3 M1 x 100 M2 M1 ASE M6 M4 x 100 M5 M4 MS ASA x ASE 100 OBSERVAÇÕES 1 Na determinação da ASA se a balança possuir o recurso de tara é conveniente utilizálo pois eliminase a massa inicial do recipiente facilitando as anotações e os cálculos posteriores Assim quando se calcula a percentagem da ASA basta fazer as adequações necessárias na fórmula descrita no item anterior 2 A maioria dos resultados das determinações realizadas por laboratórios da área de Nutrição Animal e Alimentos é expressa em percentagem da matéria seca Para isso é necessária a determinação da percentagem de ASE mesmo que a matéria seca não tenha sido solicitada 3 Para alguns tipos de amostra por exemplo de silagem não se deve empregar a temperatura de 65ºC para a determinação da percentagem da ASA pois esse tipo de amostra normalmente contém compostos que podem ser volatilizados nessa temperatura Nesse caso recomendase empregar temperatura em torno de 50ºC 4 Umidade 100 matéria seca 22 DETERMINAÇÃO DE MATÉRIA SECA E UMIDADE EM PLANTAS EMPREGANDO RADIAÇÃO MICROONDAS 221 PRINCÍPIOS Alternativa ao método convencional de secagem emprega o aquecimento por radiação microondas para a secagem do material SOUZA et al 2002 222 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a Forno de microonda doméstico b Balança analítica c Frasco dessecador com placa de porcelana e sílica gel com indicador de umidade d Bequers de polietileno ou polipropileno capacidade de 250 mL e de 1000 mL e Balão volumétrico capacidade de 1000 mL 223 PROCEDIMENTO 2231 Calibração do forno de microondas A calibração do forno de microondas é importante pois possibilita verificar a reprodutibilidade de aquecimento do forno e também conhecer o valor da temperatura e potência real de trabalho em geral a potência nominal máxima fornecida pelos fabricantes de fornos domésticos é de 700 W As seguintes etapas devem ser executadas a Equilibrar um grande volume de água à temperatura ambiente 23 2C b Pesar 1 kg de água 10000 g 01 g em um frasco ou bequer de fluorcarbono polipropileno ou policarbonato ou algum outro material que não absorva significativamente energia microondas vidros absorvem microondas e não são recomendados Podese usar a medida de 10 L de água em balão volumétrico c Meça a temperatura inicial da água Ti que deve ser de 23 2C medida com precisão de 005C d Coloque o bequer coberto para aquecer no prato do forno de microondas durante 2 min 120 s à potência indicada como máxima 100 e Remova o bequer e agite a água vigorosamente Registre a temperatura Tf dentro de no máximo 30 segundos após terminado o aquecimento com precisão de 005C f Substitua a água aquecida por outra à temperatura ambiente g Repita as etapas 2 3 4 5 e 6 para 80 60 40 e 20 de potência h Devem ser realizadas três medidas a cada potência medida i Calcule a potência da unidade de microondas de acordo com a equação Com o emprego das condições experimentais descritas 2 min e 1 kg de água destilada capacidade calorífica a 25C 09997 cal g 1 C 1 a equação de calibração pode ser simplificada para P 3486T Essa equação deve ser avaliada periodicamente Caso uma mudança significativa for detectada 10 W a calibração deve ser refeita Observação A tensão nominal da rede não deve apresentar variação superior a 2 V para que a calibração seja correta Estabilizador deve ser utilizado caso haja instabilidade na rede elétrica 2232 Determinação dos teores de matéria seca MS e de umidade UM em amostras de silagem e de forragens frescas a Pesar o bequer de 250 mL massa A b Pesar 20 g de silagem ou capim picado massa B c Secar em forno de microondas doméstico com a seguinte rampa de aquecimento 3 min a 165 watts 6 min a 626 watts e 5 min a 338 watts OBSERVAÇÃO Valores que se referem a respectivamente 20 100 e 50 da potência do forno de microondas utilizado durante o desenvolvimento deste método que após calibração apresentou a seguinte equação P watts 5755 potência 50300 r2 09963 d Retirar os frascos do forno esperar esfriar em dessecador e pesar a amostra seca massa C e O procedimento deve ser realizado em duplicata Cálculos OBSERVAÇÕES 1 Deve ser observado que este método é proposto apenas para verificação dos teores de umidade razão pela qual pode ser empregado forno de microondas doméstico Nunca retirar a proteção metálica existente na porta do equipamento O uso deste tipo de forno para o preparo de amostras empregando ácidos deve ser evitado por razões de segurança Quando um ácido como o ácido nítrico é empregado na digestão de amostra em microondas seja em frascos abertos ou frascos fechados equipados com sistema de liberação de pressão ocorre o desprendimento de gases que corroem os sistemas de segurança que protegem o magnetron e desligam o equipamento quando a porta está aberta podendo expor o operador à energia das microondas 2 Atualmente existem no mercado diversos fabricantes que fornecem fornos específicos para utilização em laboratórios Esses equipamentos são dotados de todas as proteções adequadas para um funcionamento seguro Existem inúmeras recomendações operacionais específicas MS C A 100 B A UM 100 MS fornecidas pelos fabricantes dos equipamentos de uso em laboratórios Esses cuidados estão fora do escopo desse documento sugerindose a consulta de publicações específicas sobre operação segura dos equipamentos e frascos adequados para cada necessidade 3 DETERMINAÇÃO DE CINZAS 31 APLICAÇÃO Produtos e subprodutos de origem animal vegetal e mineral rações e concentrados 32 PRINCÍPIO A amostra é calcinada em forno do tipo mufla para eliminar a matéria orgânica Por diferença de pesagem entre a massa do cadinho vazio e a massa do cadinho com o resíduo encontrase o teor das cinzas SILVA QUEIROZ 2002 COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1998 33 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa para secagem de material Forno do tipo mufla Balança analítica precisão de 00001 g Dessecador com cloreto de cálcio e sílicagel como indicador de umidade Pinça de metal Cadinho ou cápsula de porcelana capacidade de aproximadamente 50 mL Espátula de aço inoxidável meia cana 34 REAGENTES E SOLUÇÕES Não são empregados reagentes ou soluções 35 PROCEDIMENTO Colocar o cadinho ou a cápsula de porcelana previamente lavado e secado em estufa a 105ºC por 1 h em forno do tipo mufla a 550600ºC durante 30 min Retirar do forno deixar resfriar em dessecador por 1 h e pesar M1 Transferir de 1 a 2 g da amostra para o cadinho ou a cápsula e pesar M2 Levar ao forno do tipo mufla a 300ºC por 30 min Em seguida aumentar lentamente a temperatura até 600ºC Deixar nessa temperatura durante 4 h Desligar e esperar que a temperatura do forno atinja aproximadamente 100ºC Transferir a amostra para dessecador deixar esfriar por 1 h e pesar M3 Cálculos M1 massa g do cadinho ou da cápsula vazio M2 massa g do cadinho ou da cápsula mais a amostra M3 massa g do cadinho ou da cápsula mais o resíduo após calcinação OBSERVAÇÕES 1 Sempre manusear o cadinho ou a cápsula com a pinça de metal 2 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a percentagem de matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado percentagem de cinzas por 100 e dividir pela percentagem de matéria seca a 105ºC ASE item 153 3 Para amostras com alto teor de gordura devese fazer préextração da gordura antes da incineração Para isso adicionar à amostra duas ou três gotas de ácido nítrico concentrado HNO3 e deixar sobre chapa aquecedora até secagem do ácido Esse procedimento evita que haja perda de material em função de eclosão da amostra 4 O resíduo obtido pode não representar toda a substância inorgânica presente na amostra alguns sais sofrem redução ou volatilização na faixa de temperatura empregada 5 Quando não se obtiver cinzas claras após o período mínimo de calcinação recomendase a adição de duas a três gotas de HNO3 ou de peróxido de hidrogênio H2O2 a 30 mv e o retorno ao forno do tipo mufla por mais 1 h 6 Como alternativa a préqueima pode ser efetuada em placa aquecedora ou chama antes de ser transferida ao forno do tipo mufla 550ºC 600ºC Cinzas mm M3 M1 x 100 M2 M1 4 ENERGIA BRUTA 41 PROCEDIMENTO CONVENCIONAL 411 APLICAÇÃO Amostras de alimento em geral 412 PRINCÍPIO Determinação da quantidade de calor liberada em kcalkg ou calg com a oxidação da amostra em atmosfera saturada de oxigênio sob condições adiabáticas 25 a 30 atm SILVA QUEIROZ 2002 413 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Calorímetro adiabático 414 PROCEDIMENTO Verificar as condições indicadas pelo fabricante quanto ao abastecimento de água do calorímetro Certificarse da presença de água no sistema Ligar o calorímetro à rede elétrica verificar a voltagem correta e proceder às condições de aquecimento indicadas pelo fabricante Observar se há saída de água pelo canal de escoamento ATENÇÃO se não houver fluxo de água no sistema não ligar o aquecedor e nem o refrigerador Prensar cerca de 08 g de amostra utilizando prensa apropriada peletizador ATENÇÃO Nunca ultrapassar 10 g de amostra principalmente se o material a analisar for pouco conhecido Caso isso aconteça poderá ocorrer a liberação de grande quantidade de energia calorífica no momento da queima da amostra ocasionando até mesmo a explosão da bomba dentro do calorímetro Pesar a cápsula de amostra acessório do calorímetro P1 Transferir a amostra previamente prensada para a cápsula e pesar P2 Cortar 10 cm do fio platina ou algodão que será empregado como fusível e inserílo em local previamente definido entre os eletrodos da bomba calorimétrica Colocar a cápsula com a amostra no eletrodo apropriado fazendo com que a extremidade do fusível toque a superfície da amostra porém sem deixar que toque a borda da cápsula Se o calorímetro estiver seco adicionar cerca de 1 mL de água desionizada Seguir os procedimentos indicados pelo fabricante para fechar e adicionar oxigênio ao sistema Se o procedimento for manual fechar cuidadosamente a bomba calorimétrica para evitar a ocorrência de impactos fortes sobre a cápsula com a amostra ATENÇÃO a pressão de oxigênio deve ser ajustada para 30 atm Jamais deverá ser superior a 35 atm evitando com isso possíveis explosões O tubo alimentador de oxigênio deverá ser fechado antes de ser desconectado da bomba calorimétrica Abrir o calorímetro e seguir os procedimentos indicados pelo fabricante para a introdução da bomba calorimétrica Normalmente deve ser utilizada pinça apropriada procurandose encaixar a bomba na parte circular do fundo do recipiente Encaixar os conectores dos fios dos eletrodos do calorímetro nos adaptadores do cabeçote da bomba e colocar 2 L de água desionizada com cuidado dentro do recipiente Ligar o calorímetro e aguardar que as temperaturas entrem em equilíbrio o que normalmente é indicado no manual do equipamento Após ser atingido o equilíbrio térmico aguardar aproximadamente 4 min acionar o acessório que provoca vibração 5 s anotar a temperatura inicial Ti registrada pelo medidor de temperatura e acionar a ignição O início da combustão será indicado por um dispositivo luminoso Se isso não ocorrer pode ser indício de falha na ignição devendo ser verificado o circuito de ignição Após o início da combustão aguardar aproximadadamente 9 min intervalo necessário para novo equilíbrio entre as temperaturas do sistema decorrido esse tempo acionar o vibrador e anotar a temperatura final Tf Desligar abrir o calorímetro e retirar dos cabeçotes os conectores dos fios dos eletrodos Retirar a bomba do balde com a pinça abrir a válvula de escape para desprendimento do oxigênio remanescente bem como dos gases provenientes da queima do material Retirar o cabeçote remover a cápsula e lavála com água desionizada recolhendo a água de lavagem em erlenmeyer de 125 mL Proceder da mesma maneira com o cabeçote e a parte interna da bomba calorimétrica Medir os pedaços remanescentes do fio que atuou como fusível durante a combustão Titular com solução de carbonato de sódio 00725 mol L1 a água de lavagem recolhida no erlenmeyer usando solução de alaranjado de metila como indicador 42 APLICAÇÃO PARA BOMBA CALORIMÉTRICA PARR MANUAL DE OPERAÇÕES 421 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa para secagem de material Balança analítica Peletizador Calorímetro adiabático PARR Parr Instrument Company EUA com acessórios Fusível metálico Bureta de vidro com capacidade de 50 mL 422 REAGENTES E SOLUÇÕES Carbonato de sódio Na2CO3 00725 mol L1 Vermelho de metila solução alcoólica a 02 vv 423 PROCEDIMENTO Abrir a torneira do abastecimento de água para o calorímetro e verificar se a torneira da célula purificadora de água está aberta caso não esteja abríla girandoa ¼ de volta Verificar se há água no sistema Ligar o calorímetro à rede elétrica 110 V e acionar o interruptor de controle manual do painel para posição quente hot e observar se há saída de água pelo cano de escoamento do calorímetro Se houver escoamento constante voltar a alavanca do interruptor para a posição central ATENÇÃO se não houver fluxo de água no sistema não ligar o aquecedor e nem o refrigerador Peletizar cerca de 08 g de amostra utilizando prensa apropriada peletizador Nunca ultrapassar 10 g de amostra principalmente se o material a analisar for pouco conhecido Caso isso aconteça poderá produzir no momento da queima da amostra grande quantidade de energia calorífica levando até mesmo à explosão da bomba Pesar a cápsula de metal acessório do calorímetro e anotar o valor M1 Colocar o pélete na cápsula de metal pesar e anotar o valor M2 Cortar 10 cm de fusível metálico e instalar entre os eletrodos da bomba fazendo um laço Colocar a cápsula com a amostra no eletrodo apropriado fazendo com que a extremidade do laço do fusível toque a superfície do pélete porém sem deixar que o fusível metálico toque na borda da cápsula Se a bomba calorimétrica estiver seca adicionar cerca de 1 mL de água desionizada Colocar o cabeçote na bomba calorimétrica e fechar cuidadosamente evitando que a cápsula com o pélete sofra impactos fortes Adaptar a válvula de entrada de gases à bomba calorimétrica e adicionar o oxigênio lentamente até 30 atm ATENÇÃO a pressão jamais deverá ser superior a 35 atm evitando com isso possíveis explosões Quando atingidas as 30 atm fechar os reguladores de pressão retirar o oxigênio que fica no tubo que o conduz para a bomba comprimindo a pequena alavanca da válvula de escape localizada na parte inferior do regulador de pressão Somente com esse procedimento será possível desconectar o tubo da bomba calorimétrica Abrir o calorímetro adiabático colocando o balde em seu interior Pegar a bomba com pinça apropriada e colocar dentro do balde procurando encaixála na parte circular do fundo do balde Encaixar os conectores dos fios dos eletrodos do calorímetro nos adaptadores do cabeçote da bomba e colocar 2 L de água desionizada com cuidado dentro do balde Ligar o calorímetro e aguardar que as temperaturas do banhomaria e do balde entrem em equilíbrio Isso é sinalizado pelas luzes âmbar e branca que passam a se acender alternadamente com intervalos de 5 seg aproximadamente OBS A água do balde deve ter a temperatura mínima do termômetro do balde sendo indicada a temperatura de aproximadamente 25ºC Se houver diferença para menos de mais de 3ºC no termômetro do calorímetro em relação ao termômetro da bomba acionar a alavanca do controle manual para posição quente hot e assim será introduzida água aquecida fazendo com que as temperaturas entrem em equilíbrio Se a diferença for de mais de 3ºC acima da temperatura do termômetro da bomba acionar a alavanca para a posição fria cold assim será introduzida água fria no calorímetro e o equilíbrio será estabelecido Se depois de obtido o equilíbrio das temperaturas for observado ainda diferença superior a 005ºC estabelecer o equilíbrio dentro desse limite destravando e girando o botão do controle de balanço balance no painel para a direita ou para a esquerda Depois de estabelecido o equilíbrio das temperaturas esperar 4 min acionar o vibrador por 5 seg anotar a temperatura inicial Ti do termômetro da bomba e acionar o dispositivo de ignição O piloto deve acender indicando que houve o início da combustão Caso a lâmpada não acenda provavelmente não houve ignição verificar o problema no circuito de ignição Após o início da combustão aguardar por 9 min esse intervalo é suficiente para que ocorra novamente o equilíbrio das temperaturas do calorímetro e do balde decorridos 9 min acionar o vibrador e anotar a temperatura final Tf do termômetro do balde Desligar abrir o calorímetro e retirar dos cabeçotes os conectores dos fios dos eletrodos Retirar a bomba do balde com a pinça abrir a válvula de escape para desprendimento do oxigênio remanescente bem como outros gases provenientes da queima do material Retirar o cabeçote remover a cápsula e lavála com água desionizada recolhendo a água de lavagem em erlenmeyer de 125 mL Proceder da mesma maneira com o cabeçote e a parte interna da bomba calorimétrica Medir os pedaços remanescentes do fio que atuou como fusível durante a combustão Titular com solução de carbonato de sódio 00725 mol L1 a água de lavagem recolhida no erlenmeyer usando solução de alaranjado de metila como indicador Cálculo Onde EB calg energia bruta em calorias por grama E equivalente hidrotérmico da bomba calorimétrica Tf e Ti temperaturas final e inicial Calfus caloria do fusível queimado centímetro de fusível queimado x 23 CalNa2CO3 caloria referente ao volume gasto VNa2CO3 x 10 M2 massa da cápsula de metal mais o pélete em gramas M1 massa do pélete em gramas OBSERVAÇÕES 1 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de EB calg por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 2 O fator E da fórmula é obtido empregando o procedimento descrito anteriormente fazendo a substituição do pélete da amostra por uma pastilha comprimido padrão de ácido benzóico fornecida pelo fabricante do calorímetro A pastilha tem como valor fixo energia equivalente a 6318 calg Substituindo esse valor na fórmula de cálculo já apresentada pode ser determinado o fator E 3 Existe como acessório opcional um controlador para o calorímetro adiabático do fabricante PARR que realiza diversas funções facilitando a operação do calorímetro e os cálculos EB calg E x Tf Ti Calfus CalNa2CO3 x 100 P2 P1 5 DETERMINAÇÃO DE EXTRATO ETÉREO 51 APLICAÇÃO Produtos ou subprodutos de origem animal e vegetal rações e concentrados desde que não submetidos a processo de extrusão 52 PRINCÍPIO O éter de petróleo entre outros solventes tem como propriedade a grande capacidade de solubilizar gorduras e outras substâncias tais como fosfatídeos esteróis colesterol e clorofila Explorando essa propriedade é feita a extração desses compostos presentes na amostra sendo o teor de extrato etéreo determinado pela diferença de massas AOAC 1980 COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1998 SILVA QUEIROZ 2002 53 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Estufa de secagem 105ºC Aparelho do tipo Goldfisch ou do tipo Soxhlet com acessórios para extração de gordura e outros compostos solúveis em éter de petróleo Papelfiltro qualitativo filtração rápida ou cartucho de cerâmica ou de celulose Dessecador com cloreto de cálcio e sílicagel como indicador de umidade Pinça de metal Algodão hidrófilo desengordurado 54 REAGENTES E SOLUÇÕES Éter de petróleo ponto de ebulição de 30 60ºC pa 55 PROCEDIMENTO Preparar o papelfiltro enrolandoo e dobrandoo até formar uma espécie de cartucho de tamanho compatível com o acessório receptor de amostra do aparelho de Goldfisch ou do extrator de Soxhlet ou usar cartucho de cerâmica ou de celulose comercialmente disponível Pesar de 2 a 5 g da amostra M1 transferir para o cartucho ou para o papelfiltro No caso de se usar o cartucho fechar sua extremidade superior com algodão hidrófilo desengordurado No caso de usar o papelfiltro pesar a amostra diretamente nele enrolandoo de forma que a amostra fique em seu interior Secar o cartucho com a amostra em estufa a 105ºC durante 2 h ou até massa constante Retirar e deixar esfriar em dessecador até atingir a temperatura ambiente Colocar o cartucho dentro do acessório receptor de amostra e adaptálo ao equipamento de Goldfisch Usando o extrator de Soxhlet colocar o cartucho ou o papelfiltro dentro da parte intermediária do extrator Secar o copo de Goldfisch ou o balão do extrator de Soxhlet em estufa a 105ºC por 1 h em seguida deixar esfriar em dessecador até atingir a temperatura ambiente e pesar M2 Adicionar quantidade suficiente de éter de petróleo ao copo equipamento de Goldfisch ou ao balão extrator extrator de Soxhlet conectandoo ao equipamento ou ao extrator Ajustar o conjunto ao condensador Abrir a torneira para refrigeração do condensador e iniciar o aquecimento de tal forma que se obtenha de duas a quatro gotas por segundo Manter o refluxo por no mínimo 6 h Recuperar o éter em frasco apropriado Completar a secagem do copo de Goldfisch ou do balão extrator mais o extrato em estufa a 105ºC por 30 min Retirar deixar esfriar em dessecador até atingir a temperatura ambiente e pesar M3 Repetir a operação de secagem e de resfriamento até que a diferença entre as duas últimas pesagens seja inferior a 01 da massa da amostra Cálculos Onde M1 massa da amostra em g M2 massa do copo de Goldfisch ou do balão extrator vazio em g M3 massa do copo de Goldfisch ou do balão extrator mais o extrato em g OBSERVAÇÕES 1 Terminado o tempo de extração desligar o equipamento de Extrato Etéreo M3 M2 x 100 M1 Goldfisch ou a fonte de aquecimento do extrator de Soxhlet e fechar o registro da água de resfriamento do condensador 2 Sempre manusear o cartucho o copo de Goldfisch ou o balão extrator com pinça de metal Podese também segurálos com as mãos utilizando luvas evitandose contaminação pela presença da gordura das mãos 3 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado de percentagem de extrato etéreo por 100 e dividir pela percentagem de matéria seca a 105ºC ASE 4 Conduzir sempre uma prova em branco e fazer a correção se necessário 5 Utilizar éter de boa qualidade e isento de peróxidos 6 Atualmente existe no mercado equipamento que permite a mecanização do procedimento ANKON EUA Neste caso embora o princípio seja o mesmo as amostras são pesadas em saquinhos apropriados de PTFE seladas em seladora e colocadas nos locais indicados no equipamento A vantagem do procedimento é o grande número de amostras que pode ser analisada simultaneamente até 70 além da economia de reagentes gerando menos resíduos que podem ser recuperados em destilador acoplado ao equipamento 6 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE UREÁTICA 61 PROCEDIMENTO CONVENCIONAL 611 APLICAÇÃO Grãos de soja e de feijão e seus subprodutos Determinase a atividade de urease em sementes de leguminosas No farelo de soja a atividade ureática é utilizada para indicar o grau de tostagem do farelo Alta atividade de urease indica falta de tostagem AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY 1979B AOAC 1980 COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1980 QUIN ET AL 1996 612 PRINCÍPIO Baseiase na variação de pH em função da amônia liberada pela ação enzimática da urease A urease é uma enzima presente em todas as sementes de leguminosas que desdobra a uréia em gás carbônico CO2 e amônia NH3 A amostra é incubada em meio tampão com pH 70 que contenha uréia como substrato para a enzima à temperatura de 30ºC Alta variação no pH durante o tempo que a amostra fica incubada indica alta atividade ureática sendo o valor expresso pela diferença em unidades de pH Para identificar se a tostagem de farelo de soja foi satisfatória a diferença de pH durante a incubação com o substrato uréia e o branco varia de 005 a 020 unidades de pH 613 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica precisão 01 mg Banho termostático 30ºC precisão 05ºC Béquer de 10 mL Pipetas volumétricas de 10 mL Potenciômetro sensibilidade de 001 unidade de pH Tubos de ensaio 25 x 150 mm com rolhas de borracha 614 REAGENTES E SOLUÇÕES Fosfato monobásico de potássio KH2PO4 pa Fosfato dibásico de potássio K2HPO4 pa Uréia CH4N2 pa Ácido fosfórico H3PO4 pa Hidróxido de potássio KOH pa Soluçãotampão de fosfato 005 mol L1 com pH 700 Pesar 34022 g de fosfato monobásico de potássio e 43545 g de fosfato dibásico de potássio Dissolver separadamente em meio aquoso o fosfato monobásico de potássio e o fosfato dibásico de potássio Transferir as duas soluções para balão volumétrico de 1000 mL completar o volume e homogeneizar Conferir o pH e se necessário ajustar para 700 com solução de HCl ou NaOH 10 mol L1 O prazo de validade dessa solução é de 30 dias Solução tamponada de uréia pH 700 Dissolver 15 g de uréia em 50 mL da soluçãotampão de fosfato Ajustar o pH a 700 com solução concentrada de ácido fosfórico ou solução 02 mol L1 de hidróxido de potássio Preparar esta solução momentos antes do uso Solução tamponada de uréia a 3 mv Dissolver 30 g de uréia em 1000 mL de soluçãotampão de fosfato com pH 700 ajustar o pH se necessário Preparar esta solução momentos antes do uso 615 PROCEDIMENTO Moer a amostra evitando aquecimento de maneira que pelo menos 60 passe em peneira de 0425 mm Pesar exatamente duas porções de 02 g 200 mg 01 mg de amostra e transferir para dois tubos de ensaio A e B Adicionar 10 mL de soluçãotampão de fosfato com pH 700 ao tubo A Agitar levemente sem inverter tampar colocar em banho termostático a 30C 05C e anotar o tempo Esta será a prova em branco Os tubos devem ser agitados levemente sem inverter a cada 5 min Adicionar 10 mL de solução tamponada de uréia com pH 700 ao tubo B Proceder conforme o item anterior Para facilidade operacional manter entre os procedimentos nos tubos A e B o intervalo de 5 min Transcorridos exatamente 30 min retirar os tubos do banho Transferir o líquido sobrenadante para béquer de 10 mL e medir o valor do pH nos tubos A e B Cálculo Atividade Ureática pH da amostra B pH da amostra A OBSERVAÇÕES 1 A não estabilização do potenciômetro pode ser causada pela obstrução do eletrodo de calomelano por uma película da fração solúvel de proteína da soja Devese proceder à limpeza apropriada empregando se solução de pepsina a 1 vv em que o eletrodo deverá ficar imerso 2 O pH das soluções A e B o tempo e a reação enzimática e a temperatura da prova devem ser observados rigorosamente pois são fatores críticos na precisão da análise 62 TÉCNICA SIMPLIFICADA PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE UREÁTICA AU 621 PROCEDIMENTO Pesar 06 g de amostra e transferir para tubo de ensaio teste Pesar 06 g de amostra e transferir para tubo de ensaio branco Adicionar 300 mL de solução de uréia tamponada no tubo do teste Adicionar 300 mL de soluçãotampão de fosfato no tubo do branco Agitar vigorosamente por 5 min os tubos do teste e do branco Não inverter os tubos Deixar descansar por alguns segundos em seguida passar o sobrenadante para um béquer pequeno Medir o pH do sobrenadante Cálculo Os cálculos são realizados e interpretados da mesma maneira que a técnica anterior para determinação da atividade ureática AU pH do teste pH do branco Os reagentes também são preparados de acordo com a técnica anterior Solução de uréia tamponada estável por 1 dia Soluçãotampão de fosfato estável por 30 dias 7 DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS 71 MÉTODO DE OXIDAÇÃO COM ÁCIDO PERFÓRMICO SEGUIDA DE HIDRÓLISE ÁCIDA 711 APLICAÇÃO Determinação de aminoácidos incluindo metionina e cistina em alimentos Não aplicável para determinação de fenilalanina tirosina histidina e triptofano 712 PRINCÍPIO A oxidação com ácido perfórmico é realizada previamente à hidrólise para oxidar cistina e metionina para ácido cistéico e sulfona de metionina respectivamente O ácido hidrobromídrico é adicionado para decompor o ácido perfórmico Os aminoácidos são liberados pela hidrólise da proteína com HCl 6 mol L1 As amostras hidrolisadas são diluídas com solução tamponada de citrato de sódio com pH 22 Os aminoácidos livres são separados por cromatografia de troca iônica O triptofano é destruído pela hidrólise A tirosina a fenilalanina e a histidina são destruídas durante o processo de oxidação e pela reação com bromina e não podem ser analisados precisamente FOUNTOULAKIS LAHM 1998 LLAMES FONTAINE 1994 SLOCUM et al 1987 SPINDLER et al 1984 SPITZ 1973 713 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Analisador de aminoácidos resina de troca iônica e derivatização com ninidrina ninhydrin póscoluna Agitador magnético Potenciômetro sensibilidade de 001 de pH Evaporador rotativo Balança analítica precisão de 001mg Balança precisão 10 mg Bloco de digestão ou bloco com banho de areia Bomba de vácuo Maçarico a gás Frasco de polietileno com capacidade de 50 mL ou frasco de penicilina com capacidade de 5 a 20 mL Tubo de digestão ou ampola de vidro com capacidade para 10 mL Filtro Milipore com porosidade de 022 µm Condensador de refluxo Béquer de 250 e 1000 mL erlenmeyer de 150 mL frasco de evaporação de 1000 mL proveta graduada de 100 500 e 1000 mL balão volumétrico de 1000 mL e pipeta volumétrica de 10 e 20 mL Filtro com porosidade de 10 a 15 µm Banho de gelo Seringas descartáveis Dessecador de vidro Kit para microfiltragem de 13 mm de diâmetro 714 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido fórmico a 88 vv Ácido hidrobromídrico a 48 ou ácido bromídrico a 48 vv Peróxido de hidrogênio a 30 mv DLnorleucina cristais Ácido clorídrico HCl concentrado fumegante a 37 vv Hidróxido de sódio pa Fenol cristais Tiodiglicol solução a 98 Citrato trissódico desidratado Soluçõestampão com pH 20 40 e 70 Kit de calibração de aminoácidos Nitrogênio comum Nitrogênio superseco SS Gás liquefeito de petóleo Soluçãotampão Beckman NaA Soluçãotampão Beckman NaB Soluçãotampão Beckman NaD Soluçãotampão Beckman NaE Soluçãotampão Beckman NaF Solução solvente Beckman NaS Solução reagente Beckman NaR Solução de ninidrina Beckman NinRX Soluçãotampão de citrato de sódio com pH 220 pesar 1960 g de citrato trissódico desidratado em béquer de 1000 mL e dissolver em 800 mL de água desionizada Adicionar 10 mL de solução de tiodiglicol a 98 sob agitação e 15 mL de HCl concentrado Transferir a solução para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água desionizada Filtrar a solução com filtro de vidro Ajustar o pH para 220 com HCl concentrado ou NaOH 20 mol L1 Solução de fenolHCl 60 mol L1 pesar 1 g de cristais de fenol em béquer de 1000 mL Dissolver os cristais em 500 mL de água desionizada Sob agitação adicionar vagarosamente 500 mL de HCl concentrado Obs alguns laboratórios empregam HCl 6 mol L1 sem adição de fenol Solução de HCl 1 mol L1 Em balão volumétrico de 1000 mL com 800 mL de água desionizada adicionar 833 mL de HCl concentrado e completar o volume com água desionizada Solução de HCl 01 mol L1 Em balão volumétrico de 1000 mL com 800 mL de água desionizada adicionar 100 mL de HCl 1 mol L1 e completar o volume com água desionizada Solução de calibração de norleucina Pesar de 195 a 200 mg de DL norleucina num frasco erlenmeyer de 150 mL Dissolver os cristais com 100 mL de HCl 10 mol L1 Transferir a solução para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água desionizada Reagente de ácido perfórmico Preparar em capela Pesar 25 mg de cristais de fenol em tuboteste de 25 mL adicionar 05 mL de água oxigenada a 30 e 45 mL de solução de ácido fórmico a 88 Fechar o tuboteste e deixar a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 30 min Após colocar o tuboteste em banho de gelo e resfriar a mistura durante 15 min Preparar o reagente para uso imediato Obs Alguns laboratórios utilizam 1 mL de peróxido de hidrogênio a 30 e 9 mL de ácido fórmico a 88 sendo a solução estocada sob refrigeração a 0C Solução de NaOH Pesar 800 g de NaOH em béquer de 1000 mL Vagarosamente dissolver as pastilhas de NaOH com 600 mL de água desionizada Resfriar a solução e transferir para balão volumétrico de 1000 mL Completar o volume com água desionizada Solução de calibração de norleucina evaporar em evaporador rotativo 1 mL da solução de calibração de norleucina a 25 µmol mL1 e redissolver com 25 mL da solução de NaS sample dilution buffer armazenar sob refrigeração Solução de calibração de aminoácidos evaporar em evaporador rotativo 1 mL da solução de calibração de aminoácidos de 25 µmolmL e redissolver com 25 mL de solução de NaS sample dilution buffer armazenar sob refrigeração Procedimento empregado na Embrapa Suínos e Aves Solução de calibração de aminoácidos mais ácido cistéico sulfona de metionina e sulfóxido de metionina evaporar conjuntamente em evaporador rotativo 1 mL da solução de calibração de aminoácidos de 25 µmol mL1 1 mL da solução de calibração de ácido cistéico 1 mL da solução de calibração de sulfona de metionina e 1 mL da solução de calibração de sulfóxido de metionina Redissolver com 25 mL da solução de NaS sample dilution buffer armazenar sob refrigeração Solução de calibração de aminoácidos com norleucina misturar 500 µL da solução de calibração de norleucina com 500 µL da solução de calibração de aminoácidos Solução de calibração de aminoácidos mais ácido cistéico sulfona de metionina e sulfóxido de metionina com norleucina Método utilizado na Embrapa Suínos e Aves misturar 500 µL da solução de calibração de norleucina com 500 µL da solução de calibração de aminoácidos mais ácido cistéico sulfona de metionina e sulfóxido de metionina 715 PROCEDIMENTO Oxidação com Ácido Perfórmico AOAC 1995 Moer a amostra para passar em peneira de 025 mm Pesar de 100 a 1000 mg da amostra moída com aproximação de 01 mg equivalente ao conteúdo de 10 mg de N em tubo de digestão devidamente identificado Cálculo aproximado da quantidade de amostras a ser usado Ws 1000Ns em que Ns conteúdo de N da amostra em Ws massa da amostra equivalente ao conteúdo de 10 mg de N em mg Colocar os tubos com as amostras em banho de gelo com barra magnética em cada tubo Após resfriamento durante 15 min adicionar 5 mL de ácido perfórmico nos tubos de amostras fechar os tubos com tampas de vidro e agitar durante 15 min em agitador magnético Recolocar os tubos de amostras no banho de gelo e deixar em oxidação durante 16 h Após a oxidação retirar as tampas e decompor o ácido perfórmico adicionando 070 mL de ácido bromídrico a 48 Agitar a amostra por 30 min para liberar a bromina Transferir a amostra para o evaporador rotativo e rotacionar a solução sob vácuo à temperatura ambiente até o retorno da cor alaranjada para o amarelo Remover o tubo do evaporador para o suporte Oxidação com Ácido Perfórmico Procedimento empregado pela Embrapa Suínos e Aves Pesar o equivalente a 4 mg de proteína da amostra finamente moída e transferir para ampola de vidro com capacidade de 10 mL Adicionar 2 mL da solução de ácido perfórmico e fechar a ampola com Parafilm Deixar a mistura reagir durante 16 h a 0C Após a reação adicionar 030 mL de HBr a 48 retirando a amostra do banho de gelo logo em seguida Evaporar em evaporador rotativo sob temperatura de 40C usando aproximadamente 20 mL de NaOH 10 mol L1 no frasco coletor para absorver a bromina Alternativa para evaporação levar as ampolas a um dessecador de vidro que contenha em sua porção inferior uma camada de NaOH em lentilhas mantendo sob vácuo até a completa evaporação Hidrólise AOAC 1995 Adicionar 50 mL da solução de HClfenol 6 mol L1 na amostra e agitar brevemente Retirar a barra magnética e lavar com pequeno volume de HCl 01 mol L1 Adicionar duas a três pérolas de vidro na solução da amostra Hidrolisar a amostra sob refluxo durante 24 h a 110 120ºC usando bloco de digestão Cuidado a produção de vapores ácidos deve ser neutralizada Remover as amostras do bloco digestor e resfriar até a temperatura ambiente Adicionar 20 mL da solução de calibração de norleucina em cada amostra Misturar a solução Filtrar a amostra hidrolisada em filtro de vidro para frasco de evaporação de fundo redondo de 1000 mL Evaporar a solução da amostra a 60ºC até secura usando evaporador rotativo Lavar a amostra com 20 mL de água e evaporar novamente Repetir a lavagem e evaporar por mais duas vezes Remover o frasco do evaporador e adicionar 50 mL de tampão de citrato de sódio na amostra misturando bem Transferir a amostra tamponada para frascos de polietileno de 50 mL devidamente identificados Proceder à determinação ou congelar a amostra Hidrólise Procedimento empregado pela Embrapa Suínos e Aves Adicionar 3 mL de HCl 6 mol L1 na ampola com a amostra oxidada e evaporada Selar a ampola sob vácuo e N2 utilizando maçarico a gás alternar vácuo e N2 no mínimo duas vezes para evitar a presença de oxigênio Hidrolisar durante 22 h em estufa com banho de areia à temperatura 110C Tirar as amostras da estufa e deixar esfriar Se as amostras não forem processadas no mesmo dia elas deverão ser guardadas em geladeira Abrir as ampolas com as amostras hidrolisadas e evaporar em evaporador rotativo ou dessecador sob vácuo com uma camada de NaOH em lentilhas Redissolver o resíduo da amostra evaporada com 5 mL da solução de NaS sample dilution buffer Filtrar a amostra redissolvida para frasco de penicilina usando papelfiltro de porosidade média 3892 Filtrar novamente em membrana com porosidade de 02 µm e diâmetro de 13 mm com o auxílio de um conjunto para microfiltragem Transferir a amostra filtrada para frasco de penicilina e proceder à determinação ou armazenar sob refrigeração Determinação AOAC 1995 Diluir a aliquota da amostra hidrolisada com tampão de citrato de sódio Quando for usado hidrolisado neutralizado diluir a alíquota com água destilada Ajustar o pH para 220 com NaOH 20 mol L1 Filtrar em membrana de 022 µm para tubo autoamostrador e injetar no analisador Obs O volume da alíquota e a diluição dependem da resposta no analisador Calibrar o analisador com solução de calibração de aminoácidos que contenha norleucina solução de calibração de aminoácidos com norleucina Determinação Procedimento empregado pela Embrapa Suínos e Aves Injetar no analisador a alíquota da solução de calibração de aminoácidos que contenha norleucina solução de calibração de aminoácidos com norleucina Misturar 500 µL da solução de calibração de norleucina solução de calibração de norleucina e 500 µL da amostra hidrolisada Injetar a alíquota da mistura no analisador Cálculos Método da oxidação com ácido perfórmico seguida de hidrólise ácida e Método da hidrólise ácida AOAC 1995 Calcular o fator resposta Rfaa para cada aminoácido como a seguir em que Paa área do pico do aminoácido Pn área do pico da norleucina Waa massa molecular do aminoácido em mg Wn massa molecular da norleucina em mg Calcular o fator do padrão interno IS como a seguir em que mg de norleucina conteúdo de norleucina em 20 mL de padrão de norleucina Rfaa Pn x Waa Paa x Wn IS Wn x 2 x 102 Calcular o conteúdo de aminoácido AA da amostra como a seguir Em que Paa área do pico do aminoácido Pn área do pico da norleucina Ws massa da amostra em mg RFaa fator resposta do aminoácido IS fator do padrão interno Cálculos Método da oxidação com ácido perfórmico seguida de hidrólise ácida e Método da hidrólise ácida Embrapa Suínos e Aves em que PM massa molecular do aminoácido Sa área do pico do aminoácido na amostra Sp área do pico do aminoácido na solução de calibração a número de micromoles do aminoácido na solução de calibração V1 volume da amostra injetada V2 volume da amostra redissolvida V3 volume da amostra evaporada V4 volume da amostra hidrolisada pa massa da amostra em mg fc fator de correção da norleucina Cálculo do fator de correção em que V1 005 mL V2 5 mL mais a diluição com norleucina 5 x 2 10 V3 3 mL e 1 mL para aminoácidos sulfurados Método A e nãosulfurados Método B respectivamente V4 3 mL e 1 mL para aminoácidos sulfurados Método A e não sulfurados Método B respectivamente Observação Para cálculo da metionina somar as quantidades de sulfona de metionina e de sulfóxido de metionina fc Sp Norleucina Sa Noeleucina AA Paa x RFaa x IS x 100 Pn x Ws AAs PM x Sa x a x V2 x V4 x 100 x fc Sp x V1 x V3 x pa x 1000 8 DETERMINAÇÃO DE OXALATOS TOTAIS E OXALATOS SOLÚVEIS EM ÁGUA EM AMOSTRAS DE PLANTAS 81 APLICAÇÃO Extração e determinação de oxalatos totais e oxalatos solúveis em água e em amostras de plantas 82 PRINCÍPIO Em amostras de Plantas secas e moídas é feita extração com água a 70ºC para determinação de oxalatos solúveis em água ou com ácido clorídrico a 025 mol L1 para oxalatos totais A partir do extrato filtrado é feita dupla precipitação do oxalato presente em baixa temperatura e em meio ácido na forma de oxalato de cálcio que é praticamente insolúvel e é separado por centrifugação O precipitado é então lavado secado dissolvido e titulado com solução de permanganato de potássio MOIR 1953 83 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Balões volumétricos de 100 500 e 1000 mL Banhomaria Funis de vidro para filtração Papéisfiltro do tipo filtração lenta Tubos de vidro para centrífuga com capacidade para 10 mL Pipetas volumétricas de 1 e 5 mL Geladeira Agitador de tubos de ensaio Centrífuga Estufa Titulador automático do tipo seringa ou bureta com precisão de 001 mL 84 REAGENTES E SOLUÇÕES Solução de ácido clorídrico a 025 mol L1 transferir 207 mL de ácido clorídrico concentrado pa para balão volumétrico de 1000 mL com aproximadamente 800 mL de água desionizada Agitar e completar o volume com água desionizada Reagente precipitante Solução A pesar 965 g de acetato de sódio anidro pa dissolver por aquecimento em água desionizada e transferir para balão volumétrico de 250 mL Deixar esfriar e completar o volume com água desionizada Solução B misturar 125 mL de ácido acético glacial pa e 125 mL de água desionizada Nesta mistura dissolver 18 g de acetato de cálcio anidro pa Misturar a solução A com a solução B deixar em refrigerador por 48 h e depois filtrar O reagente se mantém indefinidamente quando guardado em refrigerador porém deve ser filtrado antes do uso se necessário Reagente de lavagem do oxalato de cálcio misturar 240 mL de álcool etílico a 96 pa com 125 mL de hidróxido de amônio concentrado pa em balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada Solução de ácido sulfúrico a 1 mol L1 transferir 555 mL de ácido sulfúrico concentrado pa para balão volumétrico de 1000 mL com aproximadamente 800 mL de água desionizada Agitar deixar esfriar e completar o volume com água desionizada Solução de permanganato de potássio a 002 mol L1 pesar 316075 g de permanganato de potássio pa transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água desionizada Esta solução deve ser mantida em frasco escuro Solução de permanganato de potássio a 0004 mol L1 transferir 100 mL da solução 01 mol L1 para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água desionizada Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do uso 85 PROCEDIMENTO 851 DETERMINAÇÃO DE OXALATOS TOTAIS Pesar 1 g com precisão de 01 mg de amostra de planta seca e moída transferir para balão volumétrico de 100 mL adicionar 90 mL de solução de HCl a 025 mol L1 e deixar o balão em banhomaria a 70C por 1 h Depois de esfriar completar o volume do balão com solução de HCl a 025 mol L1 e misturar bem Filtrar aproximadamente 10 mL em papelfiltro Whatman no 42 ou similar e descartar Filtrar outra porção de 10 mL no mesmo papelfiltro e transferir 5 mL para tubo de centrífuga de 10 mL Resfriar o tubo até 10C adicionar 1 mL do reagent e precipitante e misturar bem com o auxílio de um agitador de tubos Deixar precipitar durante a noite em refrigerador centrifugar por cinco minutos a 2700 rpm descartar o líquido sobrenadante inclinando cuidadosamente o tubo e retirar a gota da borda do tubo absorvendoa com papelfiltro Dissolver o precipitado em 5 mL de solução de HCl a 025 mol L1 e novamente fazer a precipitação e a separação como descrito acima Adicionar então 5 mL do reagente de lavagem do oxalato de cálcio e misturar com auxílio de um agitador de tubos Após centrifugar e descartar o liquido sobrenadante aquecer o tubo a 100C em estufa durante 30 min Dissolver o precipitado em 5 mL de solução de H2SO4 a 1 mol L1 aquecer em banho de água fervente por 5 min e titular com solução de KMnO4 a 0004 mol L1 em bureta automática com precisão de 001 mL agitando o tubo a cada adição Chegase ao ponto final da titulação quando for feita a adição de solução de permanganato de potássio a 0004 mol L1 e a sua coloração lilás persistir após a agitação do tubo 852 DETERMINAÇÃO DE OXALATOS SOLÚVEIS EM ÁGUA Pesar 1 g com precisão de 01 mg de amostra de planta seca e moída transferir para balão volumétrico de 100 mL adicionar 90 mL de água desionizada e deixar o balão em banhomaria a 70C por 1 h Depois de esfriar completar o volume do balão com água desionizada e misturar bem Filtrar aproximadamente 10 mL em papelfiltro Whatman no 42 ou similar e descartar Filtrar outra porção de 10 mL no mesmo papelfiltro e transferir 5 mL para um tubo de centrífuga de 10 mL Adicionar 012 mL de ácido clorídrico concentrado pa agitar e aquecer em banho maria a 70C por 20 min Se houver formação de precipitado este é removido por centrifugação e o líquido sobrenadante é transferido para outro tubo de 10 mL Com outra centrifugação por alguns segundos com aproximadamente 02 mL de água desionizada a gota remanescente no fundo do tubo pode ser transferida quase completamente O oxalato é então precipitado e titulado da mesma forma que a descrita para a determinação do oxalato total Cálculos O mesmo cálculo é valido para as determinações de oxalatos totais e solúveis em água O resultado é expresso em percentagem de ácido oxálico no peso seco e por isso uma subamostra deve ser secada a 105C por uma noite p ara a determinação da percentagem de matéria seca 9 CARBOIDRATOS 91 INTRODUÇÃO Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza representam a principal reserva da energia fotossintética das plantas constituindo cerca de 50 a 80 da matéria seca e são extremamente importantes para a nutrição animal como a principal fonte primária de energia na dieta dos ruminantes VAN SOEST 1994 Para muitos carboidratos a fórmula geral é CH2On daí o nome carboidrato ou hidratos de carbonoOs carboidratos podem ser classificados de acordo com o número de unidades monoméricas em açúcares simples polissacarídeos nãoestruturais e polissacarídeos estruturais MOORE HATFIELD 1994 São moléculas que desempenham ampla variedade de funções entre elas fonte de energia reserva de energia estrutura e matéria prima para a biossíntese de outras biomoléculas Os açúcares simples monossacarídeos glicose frutose etc e dissacarídeos sacarose celobiose etc são rapidamente fermentados no rúmen produzindo ácidos graxos voláteis os quais são absorvidos através da parede do rúmen e caem na circulação sanguínea BALDWIN ALLINSON 1983 Os polissacarídeos devem ser degradados em açúcares simples para então ser utilizados O amido a pectina e os principais polissacarídeos nãoestruturais apresentam taxa de degradação rápida e são geralmente degradados no rúmen HATFIELD 1989 No entanto os polissacarídeos estruturais tais como a celulose e a hemicelulose são lentamente e incompletamente degradados A degrabilidade da celulose de forrageiras varia de 25 a 90 e a da hemicelulose de 45 a 90 PIGDEN HEANEY 1969 MOORE HATFIELD 1994 Ácido oxálico anidro Volume da titulação mL x 180072 Matéria seca 92 DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES 921 DEFINIÇÃO Os monossacarídeos ou glicídios simples não são hidrolisáveis isto é não podem ser divididos em unidades menores De acordo com o número de carbonos da molécula 3 4 5 6 ou 7 denominamse respectivamente trioses tetroses pentoses hexoses ou heptoses Açúcares redutores são carboidratos doadores de elétrons reduzem os agentes oxidantes por possuírem grupos aldeído CHO ou cetona CO livres ou potencialmente livres capazes de reduzir oxidantes Oxidamse em meio alcalino sendo essa propriedade empregada na determinação dos açúcares redutores 922 APLICAÇÃO Alimentos gramíneas leguminosas rações e alimentos para uso humano 923 PRINCÍPIO Os métodos de análise dos açúcares se baseiam nas propriedades físicas das soluções tais como densidade índice de refração e rotação ótica de suas moléculas ou na característica dessas moléculas de se oxidarem em meio alcalino O procedimento aqui descrito baseiase na determinação por gravimetria do óxido de cobre formado pela oxidação dos açúcares presentes nos alimentos mediante precipitação com solução de Fehling Está baseado nos métodos descritos por Munser e Walker gravimétrico e de Lane Eynon volumétrico Inicialmente é necessária a solubilização dos açúcares presentes Esse procedimento explora a solubilidade dos açúcares em meio alcoólico Neste meio as proteínas o amido e a celulose são insolúveis A extração é feita inicialmente com solução de etanol a 50 vv sendo essa concentração elevada gradualmente de modo a precipitar os polissacarídios Após a extração a solução é clarificada com soluções de acetato de chumbo ou de hidróxido de bário e sulfato de zinco para remoção de pigmentos e outros interferentes 924 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica precisão de 01 mg Estufa a 105C Banhomaria Condensador de refluxo Erlenmeyer com boca esmerilhada de 500 mL Béquers de 300 e 600 mL Funil analítico de 8 cm Papel de filtração rápida de 15 cm Balões volumétricos de 100 250 500 e 10000 mL Provetas graduadas de 100 e 250 mL Papelfiltro Whatman no 40 Pipeta graduada de 10 mL Pipetas volumétricas de 25 e 50 mL Papel indicador de pH universal Cadinho filtrante de porcelana Bastão de vidro Lã de vidro Frasco âmbar com capacidade de 1000 mL Espátula Funil de Büchner 925 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido clorídrico HCl pa d 1125 Álcool etílico C2H5OH 95 GL Solução alcoólica C2H5OH a 50 vv Solução alcoólica C2H5OH a 90 vv Hidróxido de bário BaOH2 Solução de hidróxido de bário BaOH2 a 45 mv Sulfato de zinco ZnS04 Solução de sulfato de zinco ZnS04 Hidróxido de sódio Na0H Sulfato de cobre Cu2S04 Tartarato de potássio e sódio C4H4O6KNa Solução alcoólica a 50 vv Adicionar 250 mL de álcool etílico 95 GL em balão volumétrico de 500 mL e completar o volume final com água destilada Solução alcoólica a 90 vv Em balão volumétrico de 100 mL adicionar 90 mL de álcool etílico 95 GL e completar o volume final com água destilada Solução de hidróxido de bário a 45 mv BaOH2 Pesar 45 g de hidróxido de bário em balão volumétrico de 100 mL e completar com água destilada Solução de sulfato de zinco ZnS04 a 5 mv Dissolver 5 g de sulfato de zinco em balão volumétrico de 100 mL e completar com água destilada Solução de Fehling A sulfato de cobre Cu2SO4 Pesar exatamente 6926 g de sulfato de cobre em béquer e dissolver com aproximadamente 400 mL de água destilada com ajuda de bastão de vidro Transferir para balão volumétrico de 1000 mL e lavar o béquer várias vezes até alcançar o volume final do balão Solução de Fehling B tartarato de potássio e sódio C4H4O6KNa Pesar 346 g de tartarato de potássio e sódio em béquer Adicionar aproximadamente 300 mL de água destilada e aquecer em banho para ser dissolvido Em béquer de plástico pesar 100 g de hidróxido de sódio adicionar aproximadamente 300 mL de água destilada e misturar com bastão de vidro até dissolver por completo Depois de esfriar as soluções misturá las e transferílas para balão de 1000 mL lavando várias vezes o béquer até alcançar o volume final do balão Este balão deverá ser guardado em lugar escuro Depois de 48 h filtrar em funil de Büchner com papel de filtração rápida recolhendo o filtrado em um frasco escuro 926 PROCEDIMENTO Pesar 10 g da amostra em béquer de 50 mL e transferir para erlenmeyer de boca esmerilhada de 500 mL Adicionar 200 mL de solução alcoólica a 50 e agitar Adaptar o condensador de refluxo em banho e deixar em ebulição por 1 h Esfriar e adicionar 100 mL de álcool etílico e homogeneizar Descansar por 30 min e filtrar Lavar o erlenmeyer com 50 mL de solução alcoólica 90 Evaporar o filtrado em banho e reduzir o volume a 100 mL Esfriar e transferir para balão volumétrico de 500 mL Adicionar 50 mL de solução de sulfato de zinco a 5 e 50 mL de solução de hidróxido de bário a 45 Deixar em repouso por meia hora e completar o volume Filtrar com papel de filtragem rápida para béquer de 600 mL Transferir alíquota de 50 mL para balão volumétrico de 250 mL e completar o volume com água destilada Transferir 50 mL de amostra e transferir para béquer de forma alta de 300 mL Adicionar 25 mL de solução de Fehling A e 25 mL de solução de Fehling B Aquecer regulando a chama para que a ebulição somente comece após 4 min e continue em ebulição por exatamente 2 min Filtrar a solução ainda quente em cadinho filtrante de porcelana tarado lavando o precipitado com água quente Secar em estufa a 105ºC até massa constante Cálculo Óxido de cobre em que Cu2O g massa do óxido de cobre em gramas C2 massa em g do cadinho e resíduo de Cu2O após secagem na estufa C1 massa em g do cadinho vazio seco 93 DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES TOTAIS 931 APLICAÇÃO Alimentos 932 PRINCÍPIO O mesmo de açúcares redutores item 82 933 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica precisão de 01 mg Estufa a 105C Banhomaria Condensador de refluxo Erlenmeyer com boca esmerilhada de 500 mL Béquers de 50 e 300 mL Béquer de plástico de 600 mL Funil analítico de 8 cm Papel de filtração rápida de 15 cm Balões volumétricos de 100 250 500 e 1000 mL Provetas graduadas de 25 50 100 e 250 mL Pisseta Papelfiltro Whatman no 40 Pipeta graduada de 1mL Pipetas volumétricas de 25 e 50 mL Papel indicador de pH universal Cadinho filtrante de porcelana Cu2O g C2 C1 Bastão de vidro Lã de vidro Frasco âmbar com capacidade para 1000 mL Espátula Funil de Büchner 934REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido clorídrico HCl pa densidade 1125 gcm3 Álcool etílico C2H5OH 95 GL Solução alcoólica C2H5OH a 50 vv Solução alcoólica C2H5OH a 90 vv Hidróxido de bBário BaOH2 Solução de hidróxido de bário BaOH2 a 45 mv Sulfato de zinco ZnS04 a 5 mv Solução de sulfato de zinco ZnS04 Hidróxido de sódio Na0H Solução de hidróxido de sódio NaOH a 40 mv Sulfato de cobre Cu2S04 Solução de Fehling A Cu2S04 Tartarato de potássio e sódio C4H4O6KNa Solução de Fehling B C4H4O6KNa e NaOH Solução alcoólica a 50 vv Em balão volumétrico de 500 mL adicionar 250 mL de álcool etílico 95 GL e completar o volume final com água destilada Solução alcoólica a 90 vv Em balão volumétrico de 100 mL adicionar 90 mL de álcool etílico 95 GL e completar o volume final com água destilada Solução de hidróxido de bário a 45 mv BaOH2 Pesar 45 g de hidróxido de bário em balão volumétrico de 100 mL e completar com água destilada Solução de sulfato de zinco ZnS04 a 5 mv Dissolver 5 g de sulfato de zinco em balão volumétrico de 100 mL e completar com água destilada Solução de hidróxido de sódio Na0H a 40 mv Dissolver 40 g de hidróxido de sódio em balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada Solução de Fehling A Sulfato de cobre Cu2SO4 Pesar 6926 g de sulfato de cobre em béquer de plástico e dissolver completamente com aproximadamente 400 mL de água destilada com ajuda de bastão de vidro Transferir para balão volumétrico de 1000 mL e lavar o béquer várias vezes até alcançar o volume final do balão Solução de Fehling B Tartarato de potássio e sódio C4H4O6KNa Pesar 346 g de tartarato de potássio e sódio em béquer de plástico Adicionar aproximadamente 300 mL de água destilada e aquecer em banho para ser dissolvido Em béquer de plástico pesar 100 g de hidróxido de sódio adicionar aproximadamente 300 mL de água destilada e misturar com bastão de vidro até dissolver por completo Depois de esfriar as soluções misturálas e transferílas para balão de 1000mL lavando várias vezes o béquer até alcançar o volume final do balão Este balão deverá ser guardado em lugar escuro Depois de 48 h filtrar em funil de Büchner com papel de filtração rápida recolhendo o filtrado em um frasco escuro 935 PROCEDIMENTO Pesar 10 g da amostra em béquer de 50 mL e transferir para erlenmeyer de boca esmerilhada de 500 mL Adicionar 200 mL de solução alcoólica a 50 e agitar Adaptar o condensador de refluxo em banhomaria e deixar em ebulição por 1 h Esfriar adicionar 100 mL de álcool etílico e homogeneizar Descansar por 30 min e filtrar Lavar o erlenmeyer com 50 mL de solução alcoólica a 90 Evaporar o filtrado em banhomaria e reduzir o volume a 50 mL Esfriar e transferir para balão volumétrico de 100 mL Adicionar 5 mL de solução de sulfato de zinco a 5 e 5 mL de solução de hidróxido de bário a 45 Deixar em repouso por meia hora e completar o volume Filtrar com papel de filtragem rápida para béquer ou erlenmeyer Transferir alíquota de 50 mL para balão volumétrico de 250 mL Adicionar 1 mL de ácido clorídrico concentrado deixando o balão no banhomaria em temperatura entre 6770C por 10 min Esfriar e neutralizar com hidróxido de sódio a 40 usando papel indicador universal e completar o volume Transferir 50 mL de amostra e transferir para béquer de forma alta de 300 mL Adicionar 25 mL de solução de Fehling A e 25 mL de solução de Fehling B Aquecer regulando a chama para que a ebulição somente comece após 4 min e continue em ebulição por exatamente 2 min Filtrar a solução ainda quente em cadinho filtrante de porcelana tarado lavando o precipitado com água quente Secar em estufa a 105ºC até massa constante Cálculo Óxido de cobre em que Cu2O g massa do óxido de cobre em gramas C2 massa do cadinho e resíduo de Cu2O após secagem na estufa em gramas C1 massa do cadinho vazio seco em gramas Açúcares totais em que Açúcares totais teor de açúcares totais em percentagem fator fator encontrado na tabela de Munson Walker correspondente à massa de Cu2O encontrado no item anterior P massa da amostra em gramas OBSERVAÇÕES Existe também outra forma de fazer clarificação utilizandose ferrocianeto de potássio e acetato de zinco usando para a mesma quantidade de amostra 6 e 7 mL desses reagentes respectivamente 10 DIGESTIBILIDADE 101 DETERMINAÇÃO DE DIGESTIBILIDADE COM PEPSINA MÉTODO A 1011 APLICAÇÃO Produtos e subprodutos de origem animal MATERIAL CONCENTRAÇÃO DE PEPSINA Farinha de penas farinha de penas e vísceras farinha de vísceras 002 mm Farinha de carne farinha de peixe e farinha de sangue 002 mm 1012 PRINCÍPIO A pepsina catalisa a hidrólise da cadeia de peptídeos e aminoácidos Esses compostos Cu2O g C2 C1 Açúcares totais fator x 500 P nitrogenados são solubilizados e separados por centrifugação do resíduo de proteína insolúvel Determinandose a proteína da fração solubilizada ou alternativamente do resíduo é posível a determinação da digestibilidade pela comparação com a proteína bruta COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1998 1013 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Agitador do tipo Wagner 15 rpm ou equivalente Balança analítica precisão 01 mg Cadinho de vidro de borossilicato com placa porosa 90 150 µm ou funil de Büchner com papelfiltro quantitativo faixa preta filtragem rápida ou equivalente Estufa a 45ºC precisão 2ºC com tampa Estufa de secagem a 105ºC precisão 1ºC Frasco com tampa ou erlenmeyer de 500 mL Proveta de 250 mL Erlenmeyer de 250 mL 1014 REAGENTES E SOLUÇÕES Acetona C3H6O pa Ácido clorídrico HCl pa Pepsina com atividade 110000 Carbonato de sódio Na2CO3 pa Vermelho de metila Álcool etílico pa Solução alcoólica indicadora de vermelho de metila a 01 Dissolver 01 g de vermelho de metila pa em aproximadamente 60 mL de álcool etílico Transferir para balão volumétrico de 100 mL completar o volume e homogeneizar Solução volumétrica padronizada de ácido clorídrico 0075 mol L1 Medir 128 mL de HCL pa concentrado e transferir para balão volumétrico de 2000 mL com aproximadamente 500 mL de água desionizada Esfriar completar o volume e homogeneizar Padronização Pesar exatamente 3974 g de carbonato de sódio Na2CO3 pa previamente secado a 270ºC por 1 h Dissolver em água destilada transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume Transferir 20 mL da solução de Na2CO3 e transferir para erlenmeyer de 250 mL Adicionar três gotas de solução de vermelho de metila a 01 mv Titular até viragem para coloração rósea Aquecer à ebulição para eliminar o gás carbônico Esfriar e prosseguir a titulação Repetir essa operação até coloração rósea permanente Cálculo da concentração molar do HCl em que M massa em miligrama de Na2CO3 na alíquota V volume gasto de HCL 0075 mol L1 E equivalentegrama de Na2CO3 C concentração molar real do HCl Obs Ajustar a solução de HCl a exatamente 0075 mol L1 Solução reagente de pepsina a 002 mv em ácido clorídrico 0075 mol L1 Pesar em béquer exatamente 20 g de pepsina 110000 Adicionar aproximadamente 50 mL de solução de HCl 0075 mol L1 dissolver transferir para balão volumétrico de 100 mL completar o volume com solução de HCl 0075 mol L1 e homogeneizar Transferir 10 mL dessa solução transferir para balão volumétrico de 1000 mL completar o volume com solução de HCl 0075 mol L1 e homogeneizar Preparar essa solução imediatamente antes de usar Solução reagente de pepsina a 0002 mv Diluir na relação 110 a partir da solução a 002 mv com solução de HCl 0075 mol L1 1015 PROCEDIMENTOS Pesar 1 g de duas amostras moídas Desengordurar secar à temperatura ambiente em capela de exaustão e transferir para frascos de 500 mL com rolha esmerilhada previamente identificados como A ácido pepsina e B ácido Ao frasco A adicionar 75 mL de solução de pepsina a 0002 em HCl 0075 mol L1 e ao frasco B 75 mL de solução de HCl 0075 mol L1 previamente aquecidas a 4245ºC Tampar os frascos fixar no agitador e incubar por 16 h a 45ºC com agitação constante de 15 rpm agitador do tipo Wagner ou equivalente Filtrar sob sucção em cadinho de vidro de borossilicato ou papelfiltro ajustado a funil de Büchner ou sistema equivalente previamente identificados com A e B Lavar o resíduo com 2 a 3 porções de água destilada a 4550ºC e após com duas porções de acetona pa Transferir o resíduo ou papelfiltro resíduo para balões de Kjeldahl ou tubos de digestão identificados como A e B C mol L1 M V x E Proceder conforme descrito nos métodos para determinação de proteína bruta 10151 PROCEDIMENTO ALTERNATIVO Pesar 1 g de duas amostras moídas Desengordurar secar à temperatura ambiente em capela de exaustão e transferir para frascos de 500 mL com rolha esmerilhada previamente identificados como A ácido pepsina e B ácido Ao frasco A adicionar 75 mL de solução de pepsina a 0002 mv em HCl 0075 mol L1 e ao frasco B 75 mL de solução de HCl 0075 mol L1 previamente aquecidas a 42 45ºC Tampar os frascos fixar no agitador e incubar por 16 h a 45ºC com agitação constante de 15 rpm agitador do tipo Wagner ou equivalente Transferir cerca de 30 mL do sobrenadante para tubos de centrífuga identificados com A e B sem derramar o sedimento Centrifugar a 2300 rpm durante 15 min Verificar se o sobrenadante está límpido e transferir cuidadosamente para béqueres de 50 mL identificados com A e B evitandose a transferência de qualquer sedimento Transferir 10 a 20 mL e transferir para balão de Kjeldhal ou tubo de digestão Proceder conforme descrito nos métodos para determinação de proteína bruta considerando no cálculo a massa da amostra na alíquota Cálculos Resíduo em que A percentagem de proteína no resíduo com ácido pepsina B percentagem de proteína no resíduo com ácido sem pepsina Sobrenadante em que A percentagem de proteína no sobrenadante com ácido pepsina B percentagem de proteína no sobrenadante com ácido sem pepsina PB percentagem de proteína bruta OBSERVAÇÕES Em substituição ao agitador do tipo Wagner poderá ser utilizado banho Digestibilidade em pepsina a 0002 B A x 100 B Digestibilidade em pepsina a 0002 B A x 100 PB B termostático com agitação tipo Kline ou similar A velocidade de agitação deverá ser ajustada de maneira que o resultado obtido seja semelhante ao método indicado 102 DETERMINAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE IN VITRO DA MATÉRIA SECA E DA MATÉRIA ORGÂNICA MÉTODO A 1021 APLICAÇÃO Estimativa da digestibilidade de plantas forrageiras e de concentrados utilizados na alimentação animal sendo uma das variáveis utilizadas para estimar o seu valor nutritivo 1022 PRINCÍPIO A técnica consiste em dois estágios de incubação em que se tenta reproduzir as condições predominantes no rúmenretículo do animal em tubos de ensaio ou seja ausência de oxigênio e temperatura de 39ºC Na primeira etapa digestão microbiana por processo fermentativo a amostra é incubada em líquido ruminal na presença de uma solução tampão a pH 69 soluçãotampão de McDougall conhecida como saliva artificial por 48 h Na segunda etapa a atividade microbiana é paralisada pela adição de ácido clorídrico pH 20 em presença de pepsina e a amostra é incubada por mais 48 h Nessa etapa ocorre a digestão enzimática de proteínas que escaparam da digestão microbiana Essa segunda etapa é recomendável principalmente para amostras de alta digestibilidade e ricas em proteína A quantidade de matéria seca ou de matéria orgânica que desaparece se solubiliza após os dois períodos de incubação é considerada como a parte digerida da amostra que é determinada por diferença de massas AOAC 1995 SILVA QUEIROZ 2002 PEREIRO ROSSI 1995 TILLEY TERRY 1963 1023 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Estufa Forno do tipo mufla Potenciômetro Banhomaria Incubadora Garrafa térmica Tubos de ensaio de 100 mL Bastão de vidro com ponta recoberta de borracha Rolhas de borracha para os tubos com válvula do tipo Bunsen Dióxido de carbono Conjunto para filtração à vácuo Dessecador Cadinhos filtrantes com placa porosa ou do tipo gooch Lã de vidro Gaze Reservatório de vidro ou de plástico de até 4 L Béqueres provetas e pipetas Esta válvula é composta de um tubo de vidro que atravessa a rolha na extremidade superior do tubo é ajustado um pedaço de mangueira de borracha ou de silicone com um corte longitudinal de aproximadamente 6 mm de comprimento para escape de gás a mangueira é fechada na extremidade livre com um pedaço de bastão de vidro 1024 REAGENTES E SOLUÇÕES A quantidade das soluções a serem preparadas deve ser calculada de acordo com o número de amostras a ser incubado Saliva Artificial Soluçãotampão de McDougall Dissolver separadamente as seguintes quantidades de reagentes em água destilada ou desionizada misturálos e completar o volume para 1 L 98 g de bicarbonato de sódio NaHCO3 pa 70 g de fosfato de sódio dibásico heptaidratado Na2HPO47H2O pa 057 g de cloreto de potássio KCl pa 047 g de cloreto de sódio NaCl pa 012 g de sulfato de magnésio heptaidratado MgSO47H2O pa No caso de se utilizar fosfato de sódio dibásico anidro pa adicionar 371 g do reagente por litro da solução Solução de cloreto de cálcio a 4 Dissolver 40 g de cloreto de cálcio anidro CaCl2 pa ou 53 g de cloreto de cálcio diidratado CaCl22H2O em 100 mL de água destilada ou desionizada Imediatamente antes do uso adicionar 1 mL da solução de cloreto de cálcio a 4 por litro de soluçãotampão Solução de ácido clorídrico a 20 vv Adicionar 200 mL de ácido clorídrico HCl concentrado pa em certo volume de água destilada ou desionizada e completar o volume para 1 L Solução de pepsina a 5 mv Dissolver 5 g de pepsina a 110000 em 100 mL de água destilada ou desionizada com o auxílio de um agitador magnético Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do uso Liquido ruminal O animal doador deve ter dieta estabilizada por no mínimo uma semana e deve ser alimentado apenas com uma porção de farelo de soja ver observações uma hora e meia antes da coleta de líquido ruminal Somente após a coleta alimentálo com feno Bovinos ovinos ou caprinos a serem utilizados como animais doadores devem ter fístula ruminal permanente Com luvas de cano longo retirar o material ruminal e espremêlo sobre um funil com quatro camadas de gaze e uma de lã de vidro e recolher o filtrado em uma garrafa térmica pré aquecida internamente a 39ºC Para evitar contato mais prolongado com o ar e manter a anaerobiose devese encher a garrafa até a tampa e evitar demora no procedimento de coleta e alteração da temperatura que podem matar os microrganismos 1025 PROCEDIMENTO Determinar a matéria seca da amostra para a correção do resultado da digestibilidade in vitro No caso de haver interesse na digestibilidade in vitro da matéria orgânica determinar também a matéria orgânica da amostra Pesar cerca de 05 g com precisão de 01 mg da amostra secada a 65ºC moída e passada em peneira de 1 mm e transferir para os tubos de ensaio de 100 mL Adicionar 2 mL de água destilada ou desionizada para umedecer as amostras e colocar em banhomaria a 39ºC Transferir a saliva artificial para o recipiente de plástico ou de vidro de até 4 L colocar em banhomaria a 39ºC deixar tempo suficiente para que a temperatura se estabilize e borbulhar dióxido de carbono CO2 até o pH da solução ficar na faixa entre 69 e 71 Adicionar então o líquido ruminal na proporção de uma parte para cada quatro partes de saliva artificial e continuar borbulhando dióxido de carbono por mais 10 min Adicionar 50 mL do inóculo constituído da mistura de saliva artificial e líquido ruminal por tubo de amostra eliminar imediatamente o ar presente com dióxido de carbono e tampar os tubos com as rolhas de borracha com válvulas do tipo Bunsen Preparar de dois a quatro tubos sem adição de amostra para provas em branco Colocar em seguida os tubos em banhomaria ou incubadora com temperatura constante de 39ºC O conteúdo dos tubos deve ser agitado vagarosamente para assegurar que todas as partículas da amostra estejam em contato com o inóculo Esta agitação deve ser repetida duas vezes no primeiro dia e três vezes no segundo Após 48 h de incubação agitar vagarosamente os tubos retirar as rolhas e lavar para dentro dos tubos quaisquer partículas que porventura tenham aderido às rolhas usando um mínimo de água destilada ou desionizada Adicionar lentamente 6 mL de ácido clorídrico a 20 em três etapas a cada tubo1 mL 1 mL 4 mL para que a formação de espuma não cause a perda de amostra Adicionar 2 mL de solução de pepsina a 5 agitar e retornar os tubos para o banhomaria ou a incubadora por mais 48 h a 39ºC Antes da filtração os cadinhos devem ser lavados secados a 105ºC resfriados em dessecador e pesados No caso de se utilizar cadinhos do tipo gooch forrar com lã de vidro dentro de capela e com luvas de cano longo e passar água destilada ou desionizada quente sob vácuo antes de secar resfriar e pesar Filtrar com vácuo esfregando as paredes do tubo com um bastão de vidro com ponta recoberta de borracha para evitar perdas de material não digerido e lavando com água destilada ou desionizada quente Secar o cadinho com o resíduo da filtração em estufa a 105ºC durante uma noite esfriar em dessecador e pesar Calcinar em forno do tipo mufla a 500ºC por 3 h esfriar em dessecador e pesar Cálculos Em que DIVMS digestibilidade in vitro da matéria seca DIVMO digestibilidade in vitro da matéria orgânica PS massa da amostra corrigido pela matéria seca PC massa do cadinho PCR massa do cadinho resíduo da filtração PCb massa do cadinho da prova em branco PCRb massa do cadinho resíduo da filtração da prova em branco PSMO massa da matéria orgânica da amostra corrigido pela matéria seca PCRC massa do cadinho resíduo da filtração após calcinação PCRCb massa do cadinho resíduo da filtração da prova em branco após calcinação OBSERVAÇÕES DIVMS PS PCR PC PCRb PCb x 100 PS DIVMO PSMO PCR PCRC PCRb PCRCb x 100 PSMO 1 Dois fatores muito importantes nessa determinação são a anaerobiose e a temperatura Todos os cuidados devem ser tomados para evitar contato mais prolongado do líquido ruminal e do inóculo líquido ruminal com saliva artificial com o ar atmosférico assim como para manter a sua temperatura O banhomaria ou a incubadora deve ter bom controle de temperatura que deve ser mantida a 39ºC durante toda a incubação Caso contrário durante o primeiro estágio os microrganismos do rúmen podem não sobreviver comprometendo assim os resultados da análise 2 A dieta do animal doador deve ser estabilizada à base de feno de gramíneas de boa qualidade e de preferência semelhante às amostras que estão sendo analisadas Para um animal de 500 kg a suplementação diária recomendada é de 900 g de farelo de soja divididos em duas porções 75 g de suplemento mineral 50 g de fosfato bicálcico isento de flúor e 20000 UI de vitamina A 3 Se a dieta do animal doador de líquido ruminal não for balanceada em proteína e energia devese adicionar 5 mL de solução de uréia pa a 5 mv e 5 mL de solução de glicose pa a 5 mv a cada 300 mL de saliva artificial antes de estabilizar a temperatura e borbulhar o dióxido de carbono 4 O processo de filtração das amostras pode ser feito com cadinhos de placa porosa porosidade grossa ou em papelfiltro de porosidade média a vácuo Em ambos os casos o uso de Celite aproximadamente 07 g por amostra pode auxiliar na filtração 5 A filtração em cadinhos de porcelana do tipo gooch forrados com lã de vidro é muito mais rápida e evita o entupimento que ocorre nos cadinhos de placa porosa Porém no caso da determinação da digestibilidade in vitro da matéria orgânica como os cadinhos com os resíduos das amostras devem ser calcinados a lã de vidro deve ser previamente testada pois não deve perder massa a 500ºC 6 Como esta metodologia envolve muitos fatores biológicos que influenciam o resultado da análise é recomendável que seja feita com repetição utilizandose a média de dois valores As repetições devem ser feitas preferencialmente em semanas diferentes 7 Nos cálculos os valores PCRb PCb e PCRb PCRCb devem ser a média do número de provas em branco utilizadas 11 FIBRAS 111 DETERMINAÇÃO DE FIBRA DIETÉTICA TOTAL MÉTODO A 1111 APLICAÇÃO Alimentos O método se aplica na determinação dos constituintes insolúveis após a digestão enzimática de alimentos 1112 PRINCÍPIO A fibra dietética total FDT é determinada após tratamento enzimático da amostra que elimina o amido e parte das proteínas que são digeríveis no intestino A fibra solúvel é precipitada com etanol e o resíduo obtido é secado e pesado sendo então relacionado com a massa da amostra obtendose o teor de FDT O valor de FDT é corrigido pela subtração dos teores de proteína e de cinzas presentes no resíduo AOAC 1995 1113 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica precisão de 01 mg Agitador com banhomaria e com tampa a 60ºC Agitador com banhomaria e com tampa a 100ºC Refrigerador mantido entre 05ºC Potenciômetro medidor de pH e padrões de calibração Bomba de vácuo Estufa com ventilação a 105ºC Forno do tipo mufla mantido a 525ºC Cronômetro Placa de aquecimento Placa de agitação Agitadores magnéticos Béquer de 400 mL de forma alta Papel de alumínio Dessecador com sílicagel Provetas graduadas de 10 50 e 500 mL Pipeta volumétrica de 10 mL Kitassato para filtração a vácuo 1114 REAGENTES E SOLUÇÕES Água desionizada Acetona CH32CO Soluções de etanol a 78 e 95 vv C2H5OH Filtro Celite Soluçãotampão MES 2Nmorpholino ethane sulfonic acid Soluçãotampão TRIS tris hydroxymethyl amino methane trizma base Soluções de ácido clorídrico HCl a 5 e 12 concentrado 6 e 0312 mol L1 Soluções de hidróxido de sódio NaOH a 5 e 0205 mol L1 Enzimas αamilase termoestável Termamyl No 120L solução Novozymes Laboratories CT 06897 Protease referência Sigma P3910 Amidoglicosidase referência Sigma A9913 ou kit Sigma com as 3 enzimas TDF 100A Soluções de ácido clorídrico 6 mol L1 adicionar 50 mL de ácido clorídrico 12 mol L1 HCl concentrado a 50 mL de água desionizada Solução de ácido clorídrico a 5 adicionar 1875 mL de ácido clorídrico 12 mol L1 a 375 mL de água desionizada Solução de ácido clorídrico 0312 mol L1 adicionar 12 mL de ácido clorídrico 12 mol L1 a aproximadamente 1700 mL de água desionizada em balão volumétrico de 2000 mL Misturar bem as soluções e completar o volume com água desionizada Soluções de hidróxido de sódio a 5 mv Dissolver 5 g de hidróxido de sódio em 100 mL de água desionizada Solução de hidróxido de sódio 0205 mol L1 Dissolver 164 g de hidróxido de sódio em aproximadamente 1700 mL de água desionizada em balão volumétrico de 2000 mL Completar o volume com água desionizada Soluçãotampão MESTRIS dissolver 427 g de MES em 2000 mL de água desionizada dissolver 242 g de TRIS em 2000 mL de água desionizada misture as duas soluções num frasco de 4000 mL Ajustar o pH a 60 com ácido clorídrico 6 mol L1 Solução etanol a 78 vv Adicionar 207 mL de água desionizada num balão volumétrico de 1000 mL Completar o volume com solução de etanol 95 Solução de protease Adicionar 50 mg de protease em 1 mL de soluçãotampão MESTRIS 1115 PROCEDIMENTO OBSERVAÇÃO Amostras que contenham mais de 10 de lipídios devem ser desengorduradas antes da análise de FDT Ligar os dois agitadores com banhosmaria a 60ºC e a 100ºC Verificar o nível da água completando se necessário sempre com água destilada Colocar os cadinhos filtrantes na estufa a 105ºC por 1 h esfriar em dessecador até temperatura ambiente Adicionar 1 g de filtro celite a cada cadinho e pesar Pesar 1 g da amostra e transferir para o béquer de 400 mL forma alta Analisar cada amostra em duplicata Correr um ensaio em branco de cada vez Colocar uma barra magnética em cada béquer e adicionar 50 mL da soluçãotampão MESTRIS pH 6 a cada béquer sob agitação magnética Cobrir cada béquer com papelalumínio Colocar os béqueres em banho a 95 100ºC por 20 min para gelatinizar o amido Retirar os béqueres do banho colocando numa bandeja Retirar o papelalumínio e adicionar sob agitação magnética 01 mL da enzima Termamyl Cobrir novamente os béqueres com a folha de alumínio Colocar os béqueres no agitador com banhomaria a 95 100ºC por 35 min sob contínua agitação OBS certificarse de que as amostras tiveram o tempo de incubação correto na faixa de 95 100ºC Pode ocorrer que a temperatura do banho diminua com a colocação dos béqueres Remover as amostras do banho resfriar até 60ºC e remover o papelalumínio Ajustar o pH de cada amostra para 75 01 com de 10 mL de solução de hidróxido de sódio 0205 mol L1 Obs caso seja necessário ajustar o pH com de solução de ácido sulfúrico a 5 ou solução de hidróxido de sódio a 5 Adicionar 50 mL da solução de protease Cobrir os béqueres com papelalumínio incubando sob contínua agitação mecânica no agitador com banhomaria a 60ºC por 30 min Remover as amostras do banho e remover o papelalumínio Ajustar o pH de cada amostra para 45 02 com 10 mL de solução de ácido clorídrico 0312 mol L1 OBSSERVAÇÃO Caso seja necessário ajustar o pH com solução de ácido clorídrico a 5 ou solução de hidróxido de sódio a 5 Adicionar 150 mL da solução de amiloglicosidase sob agitação magnética e cobrir o béquer com papelalumínio Incubar por 30 min com contínua agitação mecânica no agitadorr com banhomaria a 60ºC Aquecer a solução de etanol a 95 em placa de aquecimento até 60ºC Retirar as amostras do banho colocandoas numa bandeja Adicionar 285 mL de solução de etanol a 95 préaquecido a 60ºC A proporção volume de etanolvolume da amostra deve ser de 41 Cobrir todos os béqueres com novas folhas de alumínio e deixar o precipitado se formar à temperatura ambiente no mínimo durante 60 min e no máximo por 75 min Instalar o sistema de filtração kitassato adaptadores de borracha bomba de vácuo e cadinho filtrantes com Celite tarados Antes de iniciar a filtração das amostras passar cerca de 15 mL de solução de etanol a 78 aplicando vácuo em cada cadinho de modo a formar um leito homogêneo de celite no interior do cadinho Filtrar as amostras através do sistema de filtração com o cadinho com filtro sinterizado celite usando vácuo regulado em 5 2 polegadas de Hg Transferir todo o resíduo do béquer usando solução de etanol a 78 Lavar o resíduo 2 vezes com 15 mL de solução de etanol a 78 depois 2 vezes com 15 mL de solução de etanol a 95 e finalmente 2 vezes com 15 mL de acetona Obs em algumas amostras um filme parecido com uma goma pode se formar impedindo a filtração Caso isso ocorra devese romper esse filme com o auxílio de uma espátula sem no entanto alterar o leito de celite Levar o cadinho à estufa 105ºC por 1 h esfriar em dessecador e pesar Após a pesagem em uma das duplicatas será analisada proteína e na outra será determinado o teor de cinzas Cinzas Colocar o cadinho Celite resíduo na mufla a 525ºC por 5 h Resfriar em dessecador e pesar Proteína Transferir cuidadosamente com o auxílio de espátula apropriada o material do cadinho Celite resíduo para um tubo de digestão de Kjeldhal Após a digestão dosar a proteína pelo método de Kjeldhal Cálculos FDT P2 P1 A B x 100 M em que FDT teor de fibra da dieta total g100g P1 massa do cadinho Celite após secagem na estufa em gramas P2 massa do cadinho Celite resíduo após secagem na estufa em gramas M massa da amostra em gramas P correção de proteínas A correção de cinzas B branco Correção de proteínas P P NVfácidomeqNFalimento 1000 P2 P1 resíduo P P x resíduog x 1 100 Logo P NVfácidomeqNFalimento x 100 x resíduog x 1 NVfácidomeqNFalimento P2P1 resíduo 100 Então P N x V x fácido x 00014 x Falimento Correção de cinzas A A A0 P1 A massa das cinzas em gramas A0 massa do cadinho Celite resíduo após secagem no forno do tipo mufla a 525ºC em gramas P1 massa do cadinho Celite após secagem na estufa a 105ºC em gramas Branco em que B massa do resíduo do branco em gramas P1 massa do cadinho Celite resíduo impurezas após secagem na estufa em gramas P0 massa do cadinho Celite após secagem na estufa a 105ºC em gramas B P1 P0 112 DETERMINAÇÃO DE FIBRA BRUTA MÉTODO B 1121 APLICAÇÃO Produtos ou subprodutos de origem vegetal rações e concentrados 1122 PRINCÍPIO Denominase fibra bruta a porção dos carboidratos totais que resiste à hidrólise ácida e alcalina constituindose basicamente de celulose e lignina insolúvel A amostra seca é submetida à digestão ácida e básica por 30 min em cada digestão Por diferença de pesagem antes e após o processo encontrase o teor de fibra bruta SILVA QUEIROZ 2002 AOAC 1995 BATEMAN 1970 ANFAR 1992 1123 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa de secagem e esterilização Balança analítica com precisão de 01 mg Cadinho filtrante de vidro de borossilicato com placa porosa de vidro sinterizado de porosidade de média a grossa 100 a 160 µm Forno do tipo mufla Conjunto digestor equipado com controladores de temperatura e condensadores Bomba de vácuo Dessecador com sílicagel com indicador de umidade ou cloreto de cálcio Béquer de forma alta com capacidade para 600 mL Funil filtrante de Büchner com placa porosa de média a grossa de aproximadamente 60 mm de diâmetro Tela de náilon de poliéster ou de aço inoxidável malha 200 Balão volumétrico de 1 L Béquer graduado de 50 mL Pipeta graduada de 10 mL Espátula de aço inoxidável meia cana Pinça de aço média 1124 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido sulfúrico H2SO4 a 125 vv 01275 mol L1 Hidróxido de sódio NaOH a 125 mv 0313 mol L1 Álcool etílico 96 98 Éter etílico Antiespumante tributilfosfato ou álcool isoamílico pa ou álcool isooctílico 1125 PROCEDIMENTO Empregando cadinhos que se adaptam ao conjunto digestor Colocar os cadinhos vazios em estufa a 105ºC por no mínimo 3 h Retirar os cadinhos da estufa colocálos num dessecador e deixálos esfriar Pesar o cadinho vazio P1 Pesar aproximadamente 1 g de amostra no cadinho P2 Levar o cadinho para a unidade de extração a quente e adicionar 100 mL de ácido sulfúrico a 125 0255 N fervente Assim que começar a fervura deixar digerindo por 30 min A fervura deve iniciar dentro de 1 min Terminada a digestão ácida fazer várias lavagens com água destilada fervente até que o material fique praticamente neutro Proceder então a digestão básica com hidróxido de sódio a 125 0313 mol L1 fervente Seguir os mesmos princípios da destilação ácida lavando com água destilada quente Na unidade de extração a frio do conjunto digestor lavar o material com cerca de 20 mL de álcool etílico e posteriormente com éter etílico cerca de 10 mL a fim de facilitar a secagem e eliminar compostos provenientes das digestões Fazer a secagem do cadinho com o resíduo em estufa a 105ºC por aproximadamente 8 h Retirar da estufa e colocar no dessecador para esfriar Pesar o cadinho com o resíduo seco P3 Levar o cadinho para o forno do tipo mufla e deixar atingir 600ºC Alcançada essa temperatura deixar durante 1 h Decorrido esse tempo desligar o forno e esperar o material esfriar Toda a fibra será oxidada restando somente os minerais Pesar novamente o cadinho P4 Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra em gramas P3 massa do cadinho mais o resíduo fibroso após as digestões e a FB P3 P4 x 100 P2 P1 secagem P4 massa do cadinho mais o resíduo mineral após a calcinação em gramas Empregando béquer de 600 mL e cadinhos filtrantes Em béquer de 600 mL pesar de 1 a 3 g de amostra P1 Adicionar 200 mL de ácido sulfúrico a 125 em ebulição Levar ao conjunto digestor e deixar em ebulição por exatamente 30 min Filtrar a quente sob vácuo em funil de Büchner provido de tela de náilon ou de aço inoxidável Realizar lavagens sucessivas do resíduo com água fervente até completa neutralização Retornar o resíduo ao béquer lavando a tela com 200 mL de hidróxido de sódio a 125 em ebulição Levar ao conjunto digestor e deixar em ebulição por exatamente 30 min Transferir o resíduo para cadinho de vidro com placa porosa ou cadinho de gooch que contenha amianto purificado Com auxílio de vácuo filtrar e proceder lavagens sucessivas com água fervente até completa remoção do hidróxido de sódio Lavar com aproximadamente 20 mL de álcool etílico e 20 mL de éter etílico Colocar em estufa de secagem a 105ºC por aproximadamente 8 h Retirar os cadinhos colocar em dessecador e deixar esfriar Pesar o cadinho com o resíduo P2 Incinerar em forno do tipo mufla a 600 ºC por 1 h Desligar o forno e esperar esfriar até aproximadamente 180ºC Retirar e colocar no dessecador Esperar atingir a temperatura ambiente e pesar P3 Cálculo em que P1 massa da amostra colocada no béquer em gramas P2 massa do cadinho com o resíduo em gramas P3 massa do cadinho mais o resíduo mineral após calcinação em gramas OBSERVAÇÕES 1 Usar as soluções de ácido sulfúrico e hidróxido de sódio com título exato H2SO4 01275 mol L1 e NaOH 0313 mol L1 FB P2 P3 x100 P1 2 Observar o tempo exato de 30 min para cada etapa da digestão é importante que a fervura se dê 1 min após a amostra entrar em contato com o ácido ou com a base 3 As filtrações devem ser efetuadas o mais rápidamente possível sem deixar o material esfriar 4 Material rico em gordura deve ser previamente desengordurado para evitar excesso de saponificação durante a hidrólise básica e conseqüentemente prevenir a formação de espuma 5 As lavagens devem ser feitas com água fervente 6 Durante as digestões utilizar de uma a duas gotas de antiespumante para cada 100 mL quando necessário 7 Normalmente expressase o resultado corrigido tendo como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de fibra bruta por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 8 Em substituição à tela de náilon ou de aço inoxidável poderá ser utilizado tecido de linho com textura equivalente 9 Se necessário juntar três a cinco gotas de álcool isoamílico para evitar formação de espuma 10 O amianto deverá ser previamente calcinado tratado com solução ácida e alcalina conforme o ensaio e lavado cuidadosamente de maneira a eliminar todo o resíduo depois calcinar novamente A camada de amianto no cadinho deverá ter após boa compactação espessura suficiente para não permitir a passagem de partículas de resíduos 11 Para a análise a amostra deve ser previamente secada a 65ºC e triturada em moinho com peneira de malha 30 a 40 113 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE PLANTAS FORRAGEIRAS MÉTODOS DE VAN SOEST 1131 PRINCÍPIO Fibra em detergente neutro Por meio de um detergente neutro o conteúdo celular parte da forragem solúvel no detergente neutro constituído principalmente de proteínas gorduras carboidratos solúveis pectina e outros constituintes solúveis em água é separado da parede celular celular parte da forragem insolúvel no detergente neutro Essa parte insolúvel no detergente neutro denominada de fibra em detergente neutro FDN é constituída basicamente de celulose hemicelulose lignina e proteína lignificada No caso de amostras com alto teor de amido a enzima amilase e a uréia são adicionados no processo de digestão com o objetivo principal de degradar os compostos amiláceos o que facilitará o processo de filtração através da placa porosa do cadinho O método de determinação da qualidade de plantas forrageiras proposto por VAN SOEST 1965 e descrito por SILVA QUEROZ 2002 está baseado na obtenção dos componentes solúveis e insolúveis em meio detergente neutro Fibra em detergente ácido Método proposto por VAN SOEST 1965 e descrito por SILVA QUEROZ 2002 propicia conhecer os constituintes menos solúveis da parede celular Posteriormente poderão ser determinados celulose lignina nitrogênio insolúvel em detergente ácido nitrogênio lignificado cinzas insolúveis em ácido e sílica Devese ressaltar que o valor dessa análise não deve ser utilizado para estimar a digestibilidade dos alimentos VAN SOEST 1990 O conteúdo celular e a hemicelulose são extraídos a quente com solução de detergente ácido restando principalmente a lignina e a celulose que constituem a fibra em detergente ácido A amostra é tratada com uma solução denominada de detergente ácido a qual solubiliza o conteúdo celular a hemicelulose e a maior parte da proteína insolúvel no entanto o nitrogênio lignificado a lignina solúvel em álcali a lignina insolúvel a celulose e a sílica fazem parte do resíduo denominado de fibra em detergente ácido FDA 1132 DETERMINAÇÃO DA FIBRA EM DETERGENTE NEUTRO 11321 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa calibrada a 105ºC Balança analítica precisão de 01 mg Aparelho digestor FIBERTECTECATOR Unidades de extração a quente e a frio Bomba de vácuo Forno do tipo mufla Dessecador com sílicagel como indicador de umidade ou cloreto de cálcio Pinça de metal Frasco kitassato de 5 L Pisseta de plástico de 500 mL Recipiente para depósito de solução de detergente neutro Cadinho filtrante de vidro forma alta porosidade de média a grossa e capacidade de 50 mL específico para o aparelho FIBERTECTECATOR Agitadoraquecedor para preparo de soluções Garrafão de vidro para preparo de soluções Proveta de 500 mL Funil grande de vidro Espátula de aço inoxidável meia cana 11322 REAGENTES E SOLUÇÕES EDTA sal dissódico C10H12CaN2Na2O8 pa Borato de sódio tetraborato de sódio B4Na2O710H20 pa Sulfato láurico de sódio dodecilsulfato de sódio ou laurilsulfato de sódio C12H25NaO4S pa 2metoxietanol C3H8O2 Fosfato de sódio dibásico anidro Na2HPO4 pa Acetona C3H6O pa ou comercial Enzima amilase termosensível estocar sob refrigeração Uréia pa Solução 1 Pesar 1861 g de EDTA sal dissódico 681 g de borato de sódio e 456 g de fosfato de sódio dibásico anidro transferir para um béquer capacidade de 3000 mL Adicionar 2000 mL de água desionizada e aquecer até dissolução Solução 2 Pesar 300 g de sulfato láurico de sódio e transferir para um béquer de 3000 mL Adicionar 2000 mL de água desionizada Solução de detergente neutro Em recipiente com capacidade de 20 L adicionar as soluções 1 e 2 Completar o volume para 10 L e adicionar 100 mL de 2metoxietanol Deixar em agitação com agitador magnético por 30 min A solução de detergente neutro deve ter pH entre 69 e 71 Corrigir se necessário com solução de ácido clorídrico a 10 para abaixar o pH ou de solução de hidróxido de sódio a 10 para elevar o pH 11323 PROCEDIMENTO Amostra com teor de amido reduzido Colocar o cadinho em estufa a 105ºC durante 3 h Transferir para dessecador e deixar esfriar Pesar o cadinho vazio P1 Pesar no cadinho 05 g da amostra P2 triturada em moinho com peneira de 1 mm malha 30 a 40 e homogeneizada Levar para o aparelho digestor FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente e adicionar 100 mL da solução de detergente neutro Fazer a digestão durante 60 min a partir do início da ebulição Desligar o aquecimento do aparelho Filtrar em cadinho filtrante de vidro por sucção a vácuo Essa filtração deverá ser feita imediatamente após a digestão do material isto é quando ainda estiver bem quente A sucção deve ser lenta no início e mais forte no final Lavar o resíduo com água destilada quente Retirar a bateria de cadinhos da unidade de extração a quente passar para a unidade de extração a frio e lavar com acetona pelo menos quatro vezes Secar em estufa a 105ºC até massa constante 3 a 6 h Transferir para o dessecador e deixar esfriar até a temperatura ambiente Pesar o cadinho mais o resíduo P3 Transferir o cadinho para o forno do tipo mufla a 450ºC por 4 h para calcinação do resíduo Desligar o forno deixar esfriar e lavar o cadinho deixandoo pronto para outra análise Amostra com alto teor de amido Colocar o cadinho em estufa a 105ºC durante 3 h Transferir para dessecador e deixar esfriar Pesar o cadinho vazio P1 Pesar no cadinho 05 g da amostra P2 previamente triturada em moinho com peneira de 1 mm malha 30 a 40 e homogeneizada Levar para o aparelho digestor FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente e adicionar nessa ordem 30 mL de solução de uréia 8 mol L1 02 mL de amilase e100 mL da solução de detergente neutro Iniciar o aquecimento até a fervura Em seguida reduzir a temperatura das resistências do aparelho ao nível mínimo o suficiente apenas para manter a fervura Isso evitará a formação de muita espuma Deixar digerindo por 40 min contados a partir do início da ebulição Decorrido esse tempo adicionar pela parte superior do aparelho mais 01 mL de amilase Deixar em digestão por mais 20 min Desligar o aquecimento do aparelho Filtrar em cadinho filtrante de vidro por sucção a vácuo Essa filtração deverá ser feita imediatamente após a digestão do material isto é quando ainda estiver bem quente A sucção deve ser lenta no início e mais forte no final Lavar o resíduo cerca de quatro vezes com água destilada quente Retirar a bateria de cadinhos da unidade de extração a quente passar para a unidade de extração a frio Lavar o material com água quente 90 a 100ºC dentro do cadinho filtrante Repetir essa operação duas vezes tendo o cuidado de quebrar a crosta com a ajuda de um bastão de vidro a fim de facilitar a lavagem e remover todo o complexo gelatinoso formado Lavar com acetona pelo menos três vezes cada porção em torno de 40 mL Retirar o cadinho e secar em estufa a 105ºC até massa constante 3 a 6 h Transferir para o dessecador e deixar esfriar até a temperatura ambiente Pesar o cadinho mais o resíduo P3 Transferir o cadinho para o forno do tipo mufla a 450ºC por 4 h para calcinação do resíduo Desligar o forno deixar esfriar e lavar o cadinho deixandoo pronto para outra análise Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra em gramas P3 massa do cadinho mais o resíduo em gramas Obs válido para amostras com baixo ou alto teor de amido OBSERVAÇÕES 1 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de FDN por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 2 O aparelho de determinação de fibra FIBERTECTECATOR consiste de duas unidades uma para extração a quente e outra a frio Permite fazer seis análises simultâneas com operação semiautomática 1133 DETERMINAÇÃO DA FIBRA EM DETERGENTE ÁCIDO 11331 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa calibrada a 105ºC Balança analítica precisão de 01 mg Aparelho digestor FIBERTECTECATOR unidades de extração a quente e a frio Bomba de vácuo Forno do tipo mufla Dessecador com sílicagel como indicador de umidade ou cloreto de cálcio Pinça de metal Frasco kitassato de 5 L Pisseta de plástico de 500 mL Recipiente para depósito de solução de detergente ácido Cadinho filtrante de vidro forma alta com porosidade de média a grossa e capacidade de 50 mL específico para o aparelho FIBERTECTECATOR Agitadoraquecedor para preparo de soluções Garrafão de vidro para preparo de soluções Proveta de 500 mL FDN P3 P1 x 100 P2 P1 Funil grande de vidro Espátula de aço inoxidável meia cana 11332 REAGENTES E SOLUÇÕES Brometo de NcetilN N Ntrimetilamônio C19H42BrN pa Ácido sulfúrico H2SO4 05 mol L1 Acetona C3H6O pa ou comercial Solução de detergente ácido Pesar 200 g de brometo de NcetilN N Ntrimetilamônio pa completar o volume para 10 L e adicionar 278 mL de ácido sulfúrico 05 mol L1 previamente padronizado Deixar em agitação com agitador magnético por 2 h 11333 PROCEDIMENTO Colocar o cadinho em estufa a 105ºC durante 3 h Transferir para dessecador e deixar esfriar Pesar o cadinho vazio P1 Pesar no cadinho 05 g da amostra P2 triturada em moinho com peneira de 1 mm malha 30 a 40 e homogeneizada Levar para o aparelho digestor FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente e adicionar 100 mL da solução de detergente ácido Fazer a digestão durante 60 min a partir do início da ebulição Desligar o aquecimento do aparelho Filtrar no cadinho filtrante de vidro por sucção a vácuo Essa filtração deverá ser feita imediatamente após a digestão do material isto é quando ainda estiver bem quente A sucção deve ser lenta no início e mais forte no final Lavar o resíduo com água destilada quente Retirar a bateria de cadinhos da unidade de extração a quente passar para a unidade de extração a frio e lavar com acetona pelo menos quatro vezes Secar em estufa a 105ºC até massa constante 3 a 6 h Transferir para o dessecador e deixar esfriar até a temperatura ambiente Pesar o cadinho mais o resíduo P3 Transferir o cadinho para o forno do tipo mufla a 450ºC por 4 h para calcinação do resíduo Desligar o forno deixar esfriar e lavar o cadinho deixandoo pronto para outra análise Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra em gramas P3 massa do cadinho mais o resíduo em gramas OBSERVAÇÕES 1 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de FDA por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 2 O aparelho de determinação de fibra FIBERTECTECATOR consiste de duas unidades uma para extração a quente e outra a frio Permite fazer seis análises simultâneas com operação semiautomática 1134 DIGESTÃO EM APARELHO DO TIPO SEBELIN OU BLOCO DIGESTOR MACRO E MICROMÉTODOS A DETERMINAÇÃO DA FIBRA EM DETERGENTE NEUTRO 11341 PRINCÍPIO Simplificação dos procedimentos analíticos originais sem alteração dos princípios do método SOUZA et al 1999 11342 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa de secagem e esterilização Cadinho filtrante de vidro de borossilicato com placa porosa de vidro sinterizado com porosidade de média a grossa 100 a 160 µm Balança analítica precisão de 01 mg Dessecador a vácuo com luva tampa e fundo em vidro de borossilicato equipado com placa de porcelana e sílicagel azul Forno do tipo mufla com controlador de temperatura Conjunto digestor do tipo Sebelin equipado com controladores de temperatura e condensadores Sistema de vácuo Copo de Berzelius forma alta com capacidade para 600 mL FDA P3 P1 x 100 P2 P1 11343 REAGENTES E SOLUÇÕES Laurilsulfato de sódio Etilenodiaminotetracetato dissódico EDTA sal dissódico Na2C10H14N2O82H2O pa Borato de sódio decaidratado Na2 B4O710H2O pa Fosfato ácido de sódio anidro Na2HPO4 pa 2metoxietanol ou éter monometílico do etilenoglicol C3H8O2 ponto de ebulição de 124ºC pa Sulfito de sódio anidro Na2SO3 pa Acetona pa Decahidronaftaleno decalina pa Enzima alfaamilase termoestável Termamyl 120 L Solução de detergente neutro em béquer de 500 mL pesar 1861 g de EDTANa2 e 681 g de borato de sódio dissolver em aproximadamente 400 mL de água desionizada sob leve aquecimento Em outro béquer de 1000 mL pesar 30 g de laurilsulfato de sódio dissolver em aproximadamente 400 mL de água desionizada sob leve aquecimento Dissolver separadamente 456 g de fosfato ácido de sódio em aproximadamente 100 mL de de água desionizada sob leve aquecimento Transferir as soluções anteriores para balão volumétrico de 1000 mL adicionar 10 mL de 2metoxietanol e completar o volume com água desionizada O pH dessa solução deverá estar entre 69 e 71 sendo necessário corrigir quando estiver fora dessa faixa para isso utilizar solução de NaOH ou HCl 30 mol L1 Solução de uréia 8 mol L1 Dissolver 4805 g de uréia com água desionizada completando o volume para 1000 mL 11344 PROCEDIMENTOS Em béquer de 600 mL pesar de 05 a 10 grama PA de amostra secada a 65ºC e triturada em moinho com peneira de malha 20 a 30 Adicionar 100 mL de solução de detergente neutro e 05 g de sulfito de sódio levar ao conjunto digestor do tipo Sebelin conectar o condensador e deixar em ebulição a aproximadamente 125ºC por exatamente 60 min Transferir para cadinho filtrante previamente tarado por 1 h a 105ºC PC e com auxílio de vácuo filtrar lavando o resíduo por aproximadamente três vezes com água fervente ou até não haver mais presença de espuma em seguida lavar duas vezes com aproximadamente 40 mL de acetona Levar os cadinhos com o resíduo para estufa de secagem calibrada a 105ºC após aproximadamente 8 h ou até massa constante retirálos colocar em dessecador que contenha sílicagel azul esperar atingir a temperatura ambiente e proceder à pesagem PB em balança analítica A percentagem dos constituintes da parede celular ou fibra em detergente neutro com base na matéria seca ao ar a 65 ºC é obtida por diferença entre as pesagens ou seja FDN PB PC x 100PA sendo PA a massa da amostra em gramas PB a massa do cadinho mais o resíduo e PC a massa do cadinho vazio OBSERVAÇÕES 1 Utilizar a matéria seca a 105ºC para corrigir os resultados com base em 100 da matéria seca 2 Se houver formação de espuma durante a digestão adicionar 10 mL de decalina como antiespumante 3 Para amostras com alto teor de amido deverá ser feito tratamento preliminar adicionando 30 mL de solução de uréia 80 mol L1 02 mL de amilase termoestável incubar a 80 90ºC por 5 min ou 4 h à temperatura ambiente A seguir adicionar a solução de detergente neutro levar à ebulição e após 40 min adicionar mais 02 mL de enzima e completar a digestão até 60 min Em continuação seguir os procedimentos descritos no item 163 4 Durante a filtração recomendase utilizar bastão de vidro para auxiliar na lavagem do resíduo 5 Para limpeza dos cadinhos estes poderão ser calcinados em forno do tipo mufla por 1 h a 500ºC 6 Como opção poderão ser reduzidas proporcionalmente as quantidades de amostra e soluções ou seja em tubo medindo 25 x 300 mm adicionar 035 g de amostra 35 mL de solução de detergente neutro colocar na boca do tubo uma esfera de vidro para que os vapores se condensem evitando a perda de solução detergente B DETERMINAÇÃO DA FIBRA EM DETERGENTE ÁCIDO 11345 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa de secagem e esterilização Cadinho filtrante de vidro de borossilicato com placa porosa de vidro sinterizado com porosidade de média a grossa 100 a 160 µm Balança analítica com precisão de 01 mg Dessecador com vácuo com luva tampa e fundo em vidro de borossilicato equipado com placa de porcelana e sílicagel azul Forno do tipo mufla com controlador de temperatura Conjunto digestor do tipo Sebelin equipado com controladores de temperatura e condensadores Sistema de vácuo Copo de Berzelius forma alta com capacidade para 600 mL 11346 REAGENTES E SOLUÇÕES Brometo de cetiltrimetilamônio CTAB C16H33NCH33Br pa Acetona pa Decaidronaftaleno decalina pa Ácido sulfúrico concentrado H2SO4 a 97 98 vv pa Solução de ácido sulfúrico 05 mol L1 Transferir 275 mL de ácido sulfúrico concentrado transferir para balão volumétrico de 1000 mL com aproximadamente 500 mL de água desionizada homogeneizar esperar esfriar e completar o volume Antes de utilizar essa solução recomendase proceder a sua padronização com solução de carbonato de sódio ou trishidroximetilaminometano corrigindo seu título para 05 mol L1 se necessário Solução de detergente ácido Em béquer de 500 mL pesar 200 g de CTAB dissolver em aproximadamente 400 mL de solução de ácido sulfúrico 05 mol L1 sob leve aquecimento Transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com solução de ácido sulfúrico 05 mol L1 11346 PROCEDIMENTO Em béquer de 600 mL pesar de 05 a 10 grama PA de amostra secada a 65ºC e triturada em moinho com peneira de malha 20 a 30 Adicionar 100 mL de solução de detergente ácido levar ao conjunto digestor do tipo Sebelin conectar o condensador e deixar em ebulição aproximadamente 125ºC por exatamente 60 min Transferir para cadinho filtrante previamente tarado por 1 h a 105ºC PC e com auxílio de vácuo filtrar lavando o resíduo por aproximadamente três vezes com água fervente ou até não haver mais presença de espuma em seguida lavar duas vezes com acetona aproximadamente 40 mL Levar os cadinhos com o resíduo para estufa de secagem calibrada a 105ºC após aproximadamente 8 h ou até massa constante retirálos colocar em dessecador que contenha sílicagel azul esperar atingir a temperatura ambiente e proceder à pesagem PB em balança analítica A percentagem da fibra em detergente ácido com base na matéria seca ao ar a 65ºC é obtida por diferença entre as pesagens ou seja FDA PB PC x 100PA sendo PA a massa da amostra em gramas PB a massa do cadinho mais o resíduo FDA e PC a massa do cadinho vazio VAN SOEST et al 1991 GOERING H K VAN SOEST 1970 SILVA UEIROZ 2002 VAN SOEST 1963 VAN SOEST MOORE 1966 OBSERVAÇÕES 1 Utilizar a matéria seca a 105ºC para corrigir os resultados com base em 100 da matéria seca 2 Se houver formação de espuma durante a digestão adicionar 10 mL de decalina como antiespumante 3 Durante a filtragem recomendase utilizar bastão de vidro para auxiliar na lavagem do resíduo 4 Para limpeza dos cadinhos estes poderão ser calcinados em forno do tipo mufla por 1 h a 500ºC 5 Como opção poderão ser reduzidas proporcionalmente as quantidades de amostra e soluções ou seja em tubo medindo 25 x 300 mm adicionar 035 g de amostra 35 mL de solução de detergente ácido item 462 e colocar na boca do tubo uma esfera de vidro para que os vapores se condensem evitando a perda de solução detergente 12 DETERMINAÇÃO DE CELULOSE 121 APLICAÇÃO Plantas forrageiras silagem feno concentrado e fezes 122 PRINCÍPIO A fibra em detergente ácido FDA é composta de lignina celulose e sílica cinza insolúvel Uma vez determinado seqüencialmente o teor de FDA e de lignina efetuase a incineração do resíduo da lignina A celulose corresponde à parte do resíduo que se perde com a incineração O que sobra corresponde à cinza residual que contém a sílica A celulose é calculada por diferença de pesagem levandose em conta o massa do cadinho com o resíduo da lignina e massa do cadinho com o resíduo após a incineração SILVA QUEIROZ 2002 123 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Béquer graduado de 2 L Bandeja de vidro forma do tipo Pyrex Bastão de vidro pequeno Béquer de 50 mL Proveta de 500 mL Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a frio Cadinho filtrante de vidro forma alta com porosidade de média a grossa e capacidade de 50 mL específico para o aparelho Balança analítica Estufa a 105ºC Bomba de vácuo Forno do tipo mufla Dessecador com sílicagel como indicador de umidade ou cloreto de cálcio 124 REAGENTES E SOLUÇÕES Na determinação da celulose especificamente não é necessário nenhum tipo de reagente ou solução 125 PROCEDIMENTO Determinar a fibra em detergente ácido FDA e a lignina usandose aproximadamente 1 g de amostra Anotar a massa do cadinho vazio P1 a massa do cadinho com a amostra P2 e a massa do cadinho com o resíduo da celulose massa final da determinação da lignina P3 Após a determinação da lignina colocar o cadinho com o resíduo em forno do tipo mufla a 500ºC por 2 h Em seguida desligar o forno e esperar que a temperatura abaixe até 100ºC aproximadamente Transferir o cadinho para um dessecador deixar esfriar e pesar P4 Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra em gramas P3 massa do cadinho mais o resíduo com a celulose massa final da determinação lignina em gramas OBSERVAÇÕES Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de celulose por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 13 DETERMINAÇÃO DE LIGNINA 131 MÉTODO DO PERMANGANATO DE POTÁSSIO 1311 APLICAÇÃO Plantas forrageiras silagem feno concentrado e fezes 1312 PRINCÍPIO A determinação da lignina é feita a partir da fibra em detergente ácido FDA A fibra em detergente ácido lignocelulose é composta de lignina celulose e sílica cinza insolúvel A lignina é oxidada por meio de solução tamponada de ácido acético e permanganato de potássio que contém ferro trivalente e prata monovalente como catalisadores Os óxidos de ferro e de manganês depositados são dissolvidos numa solução alcoólica com ácido oxálico e ácido clorídrico solução de desmineralização deixando no cadinho apenas celulose e minerais insolúveis A lignina é calculada por diferença de pesagem entre a massa do cadinho com o resíduo da FDA e a massa do cadinho com o resíduo após este tratamento 1313 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Béquer graduado de 2 L Bandeja de vidro forma tipo Pyrex Celulose P3 P4 x 100 P2 P1 Bastão de vidro pequeno Béquer de 50 Ml Proveta de 500 mL Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a frio Cadinho filtrante de vidro forma alta com porosidade de média a grossa e capacidade de 50 mL específico para o aparelho Balança analítica Estufa a 105ºC Bomba de vácuo Forno do tipo mufla Dessecador com sílicagel como indicador de umidade ou cloreto de cálcio 1314 REAGENTES E SOLUÇÕES Permanganato de potássio KMNO4 pa Nitrato férrico nonaidratado FeNO339H2O pa Nitrato de prata AgNO3 pa Ácido acético glacial pa Acetato de potássio CH3COOK pa Álcool butlíco terciário C4H10O pa Ácido oxálico diidratado H2C2O42H2O pa Álcool etílico absoluto etanol a 95 Ácido clorídrico concentrado 12 mol L1 pa Acetona pa Solução 1 Dissolver 50 g de permanganato de potássio em 1 L dágua destilada Proteger da luz solar usandose recipiente escuro ou cobrindo um recipiente claro com papel alumínio Soluçãotampão Dissolver 60 g de nitrato férrico nonaidratado e 015 g de nitrato de prata em 100 mL de água destilada Adicionar 500 mL de ácido acético glacial 5 g de acetato de potássio e 400 mL de álcool butílico terciário Misturar Solução combinada de permanganato potássio e tampão 21 Misturar a solução 1 com a soluçãotampão na razão de 21 vv antes de usar Essa solução deve ser guardada no refrigerador ou em lugar frio na ausência de luz A solução deve ficar de cor vermelha purpúrea e não conter precipitado pois este dificulta a filtração Solução de desmineralização Dissolver 50 g de ácido oxálico diidratado em 700 mL de etanol a 95 Adicionar 50 mL de ácido clorídrico concentrado 12 mol L1 250 mL de água destilada e misturar 1315 PROCEDIMENTO Determinar a fibra em detergente ácido FDA usandose aproximadamente 1 g de amostra Anotar a massa do cadinho vazio P1 a massa do cadinho com a amostra P2 e a massa com a FDA P3 Colocar o cadinho com a FDA em bandeja de vidro forma do tipo Pyrex com uma lâmina dágua de 2 a 3 cm Adicionar 30 mL da solução combinada de permanganato de potássio e tampão 21 no cadinho O nível dágua na bandeja deve ser o mesmo da solução do cadinho Colocar um pequeno bastão de vidro no cadinho para agitar o conteúdo e permitir que a solução 21 entre em contato com todas as partículas por cerca de 15 min Filtrar Trocar a água da bandeja e colocar cerca de 30 mL de solução combinada de permanganato de potássio e tampão 21 no cadinho deixando em repouso por aproximadamente 90 10 min A cor purpúrea deve estar presente durante todo o tempo da oxidação Em seguida o cadinho é novamente succionado fazendo a filtração Colocar o cadinho em outra bandeja de vidro forma do tipo Pyrex limpada com água e adicionar de 20 a 30 mL da solução de desmineralização Depois de 10 minutos fazer nova sucção procedendo a filtração até que o resíduo esteja com aspecto seco Renovar a solução de desmineralização e deixar nessa solução até que a fibra fique com cor amarela Lavar o cadinho com etanol a 95 filtrar usando sucção até que o resíduo esteja com aspecto seco Repetir a lavagem duas vezes com etanol Lavar duas vezes com acetona e filtrar de maneira similar à descrita acima Colocar em estufa a 105ºC durante uma noite e pesar o cadinho com o resíduo P4 Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra Lignina P3 P4 x 100 P2 P1 em gramas P3 massa do cadinho mais a FDA resíduo em gramas P4 massa do cadinho mais o resíduo após secar em estufa em gramas OBSERVAÇÕES 1 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de lignina por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 2 O uso do método do permanganato de potássio é mais recomendado por ser mais rápido permitindo determinar também o teor de celulose e de sílica da amostra É menos corrosivo além de ser menos influenciado pela temperatura 132 DETERMINAÇÃO DA LIGNINA E DA CELULOSE MÉTODO DO ÁCIDO SULFÚRICO A 72 vv 1321 APLICAÇÃO Este método proposto por VAN SOEST 1968 propicia conhecer a fração menos digestível das plantas forrageiras posteriormente poderão ser determinadas celulose cinzas insolúveis em ácido e sílica 1322 PRINCÍPIO BUTLER BAILEY 1973 referemse à lignina como um polímero de 3metóxifenilpropenol e 35 dimetóxifenilpropenol ligados em proporções variadas e em seqüência casualizada originando assim grande variedade de produtos o que dificulta a sua exata definição A partir do resíduo de lignocelulose da fibra em detergente ácido a lignina é oxidada por meio de uma solução de ácido sulfúrico a 72 VAN SOEST et al 1991 GOERING H K VAN SOEST 1970 SILVA UEIROZ 2002 VAN SOEST 1963 VAN SOEST MOORE 1966 1323 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Estufa de secagem e esterilização Cadinho filtrante de vidro de borossilicato com placa porosa de vidro sinterizado com porosidade de média a grossa 100 a 160 µm Balança analítica precisão de 01 mg Dessecador com vácuo com luva tampa e fundo em de vidro borossilicato equipado com placa de porcelana e sílicagel azul Forno do tipo mufla com controlador de temperatura Bandeja de vidro do tipo Pyrex Sistema de vácuo 1324 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido sulfúrico concentrado H2SO4 a 97 98 vv pa Solução de H2SO4 a 72 vv d 1634 g cm3 Em béquer de 2000 mL de capacidade pesar 4274 g de água desionizada transferir o béquer para uma cuba de plástico com gelo lentamente adicionar 12066 g de H2SO4 concentrado fazendo com que escoe pelas paredes do béquer com auxílio de um bastão de vidro homogeneizar quando a solução atingir a temperatura de 15ºC verificar a densidade e corrigíla se necessário 1325 PROCEDIMENTOS Nos cadinhos que contém a fibra em detergente ácido adicionar solução de ácido sulfúrico a 72 e homogeneizar a mistura até que se forme uma massa pastosa distribuída no fundo do cadinho Transferir para bandeja de vidro adicionar novamente solução de ácido sulfúrico aproximadamente 30 ml agitar o conteúdo fazendo com que a solução entre em contato com todas as partículas manter por 3 h deixando que o ácido escoe lentamente completar o volume do cadinho freqüentementea amostra precisa ficar coberta com o H2SO4 a 72 após proceder à filtragem até remoção completa da solução ácida succionar lavando por três vezes com água fervente o resíduo e o cadinho por fora Levar os cadinhos com o resíduo lignina e cinzas insolúveis para estufa de secagem calibrada a 105ºC após aproximadamente 8 ou até massa constante retirálos colocar em dessecador que contenha sílicagel azul esperar atingir a temperatura ambiente e proceder à pesagem PC em balança analítica Transferir os cadinhos para forno do tipo mufla e proceder à incineração do resíduo por 3 h a 500ºC esperar esfriar retirálos e colocar em dessecador após atingir a temperatura ambiente proceder à pesagem PD em balança analítica A percentagem da lignina com base na matéria seca ao ar a 65ºC é obtida por diferença entre as pesagens Cálculos PA a massa da amostra em gramas PB a massa do cadinho mais a FDA C a massa do cadinho mais lignina e cinzas insolúveis e PD a massa do cadinho mais cinzas OBSERVAÇÕES 1 Utilizar a matéria seca a 105ºC para corrigir os resultados com base em 100 da matéria seca 2 Para limpeza dos cadinhos estes poderão ser calcinados em forno do tipo mufla por 1 h a 500ºC 3 Durante a filtragem recomendase utilizar bastão de vidro para auxiliar na lavagem do resíduo 14 DETERMINAÇÃO DA SÍLICA 141 APLICAÇÃO Plantas forrageiras silagem feno concentrado e fezes 142 PRINCÍPIO A fibra em detergente ácido FDA é composta de lignina celulose e sílica cinza insolúvel Uma vez determinado seqüencialmente o teor de FDA de lignina e de celulose obtémse o resíduo mineral que é tratado com ácido bromídrico HBr a 48 Após esse tratamento permanece apenas a sílica no cadinho A sílica é calculada por diferença de pesagem levandose em conta a massa do cadinho com a cinza e a massa do cadinho após o tratamento com ácido bromídrico Esta determinação é de grande valor quando o teor de cinza residual for superior a 2 indicando assim alto teor de sílica na amostra em análise VAN SOEST et al 1991 VAN SOEST 1963 VAN SOEST MOORE 1966 GOERING VAN SOEST 1991 143 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Bandeja de vidro Pipeta graduada de 5 mL Béquer graduado de 2 L Lignina C D x 100 A Celulose C B x 100 A Bandeja de vidro forma do tipo Pyrex Bastão de vidro pequeno Béquer de 50 mL Proveta de 500 mL Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a quente Aparelho FIBERTECTECATOR unidade de extração a frio Cadinho filtrante de vidro forma alta com porosidade de média a grossa e capacidade de 50 mL específico para o aparelho Balança analítica Estufa a 105ºC Bomba de vácuo Forno do tipo mufla Dessecador com sílicagel como indicador de umidade ou cloreto de cálcio 144 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido bromídrico HBr a 48 145 PROCEDIMENTO Determinar a fibra em detergente ácido FDA a lignina e a celulose usandose aproximadamente 1 g de amostra Anotar a massa do cadinho vazio P1 a massa do cadinho com a amostra P2 a massa do cadinho com o resíduo da lignina P3 e a massa do cadinho com a cinza residual P4 Após pesar o cadinho com a cinza residual colocálo na bandeja de vidro Adicionar suficientes gotas de ácido bromídrico a 48 não mais de 4 mL umedecendo assim toda a cinza do cadinho Deixar em repouso por 90 min e adicionar mais algumas gotas de ácido bromídrico a 48 caso persistir coloração vermelha no filtrado Após esse tempo succionar o excesso de ácido com vácuo e lavar duas vezes com acetona 30 a 40 mL Não usar água na lavagem Levar ao forno do tipo mufla durante 30 min à temperatura de 500ºC Desligar o forno e deixar a temperatura baixar até 100ºC aproximadamente Transferir para o dessecador deixar esfriar e pesar P5 A sílica é obtida pela diferença entre a massa do cadinho sílica e o cadinho vazio Cálculo em que P1 massa do cadinho vazio em gramas P2 massa do cadinho mais a amostra em gramas P5 massa do cadinho mais a sílica em gramas OBSERVAÇÃO Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado da percentagem de sílica por 100 e dividir pela percentagem da matéria seca a 105ºC 15 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO 151 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO TOTAL PELO MÉTODO DE KJELDAHL 1511 APLICAÇÃO Tecidos produtos ou subprodutos de origem animal e vegetal rações e concentrados desde que não submetidos a processo de extrusão 1512 PRINCÍPIO Os compostos nitrogenados são decompostos por ação do ácido sulfúrico a quente em sulfato de amônio Este na presença de solução de hidróxido de sódio libera amônia que é recebida em solução de ácido bórico A amônia é titulada com ácido clorídrico ou ácido sulfúrico de título conhecido Assim obtémse o nitrogênio total Para determinar o teor de proteína bruta basta multiplicar o teor de nitrogênio total pelo fator de nitrogênio correspondente à amostra que está sendo analisada Este método baseiase no trabalho publicado por Kjeldahl 1883 com modificações posteriores sendo caracterizado como microKjeldahl em função da quantidade de amostra que é empregada nas determinações COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL 1998 SILVA QUEIROZ 2002 AOAC 1995 BATEMAN 1970 A determinação do nitrogênio total NT proposta por Kjeldahl em 1883 fundamentase na decomposição da matéria orgânica dos alimentos pelo ácido sulfúrico em presença de sulfato de cobre como catalisador a aproximadamente 400ºC O nitrogênio presente na Sílica P5 P1 x 100 P2 P1 solução ácida resultante é determinado por destilação por arraste a vapor seguida de titulação com ácido diluído AOAC 1990 1513 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Bloco digestor ou conjunto para digestão Capela para exaustão de gases ou outro sistema de recolhimento dos gases produzidos durante a fase de digestão Microdestilador de Kjeldahl ou conjunto automatizado de destilaçãotitulação Bureta de 5 ou 10 mL Erlenmeyer de 125 mL Espátula de aço inoxidável meia cana Balança analítica Tubo de ensaio com borda reforçada 25 x 250 mm ou balão de digestão de Kjeldahl de 100 mL Frascos dosadores de reagentes ou pipeta graduada de 10 mL Pera de borracha ou silicone para pipetagem Papel impermeável cortado em pedaços de 9 x 65 cm ou papelfiltro disco de 9 cm de diâmetro 1514 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido sulfúrico H2SO4 d 184 pa concentrado Hidróxido de sódio NaOH a 40 mv Sulfato de sódio Na2SO4 Sulfato de cobre pentaidratado Cu2SO45H2O Selênio em pó Ácido clorídrico HCl 01 mol L1 ou ácido sulfúrico H2SO4 005 mol L1 Solução alcóolica de verde de bromocresol a 01 mv Solução alcóolica de vermelho de metila a 01 mv Solução de ácido bórico H3BO3 a 2 mv Mistura catalisadora Pesar 1000 g de sulfato de sódio pesar 50 g de sulfato de cobre secado em estufa e peneirado e pesar 25 g de sêlenio em pó Em um recipiente misturar os três reagentes e em seguida acondicionar em frasco com tampa Solução receptora indicadora Misturar 1000 mL de solução de ácido bórico a 2 6 mL de solução alcóolica de vermelho de metila a 01 e 15 mL de solução alcóolica de vberde de bromocresol a 01 1515 PROCEDIMENTO Pesar usando a espátula de aço inoxidável meia cana de 01 a 02 g da amostra seca e moída em papel impermeável ou papelfiltro Fazer um embrulho e introduzir no tubo de digestão ou balão de Kjeldahl de 100 mL Realizar uma prova em branco que só não conterá a amostra sendo necessário colocar nela inclusive o pedaço do papel impermeável Adicionar aproximadamente 2 g de mistura catalisadora Podese usar espátula ou colher para medir a quantidade necessária da mistura catalisadora Adicionar 5 mL de ácido sulfúrico concentrado empregando frascos dosadores de reagentes ou pipeta de 10 mL No caso de se usar pipeta fazer a pipetagem com o auxílio de um pipetador de borracha ou de silicone Levar os tubos para a capela de exaustão de gases ou adaptálos ao sistema de recolhimento de gases Colocar os tubos ou os balões de digestão no bloco ou no conjunto de digestão 350ºC e manter em aquecimento até quando a mistura estiver completamente clara com coloração verde brilhante A média de tempo de digestão é de aproximadamente 45 min podendo variar de acordo com a natureza da amostra e com o tipo de sistema de digestão Para materiais com muita matéria orgânica recomendase realizar o aumento gradativo da temperatura de digestão Durante a digestão observar se existe material aderido nas paredes do tubo ou no balão e que não sofreu completa digestão É recomendável durante a digestão agitar o tubo ou o balão por duas vezes mais ao final da digestão de forma que o material aderido volte à mistura e seja digerido completamente Retirar do bloco ou do conjunto de digestão e deixar esfriar à temperatura ambiente Colocar no tubo ou no balão de digestão aproximadamente 20 mL de água destilada para evitar a cristalização da mistura Transferir a mistura para o microdestilador lavar o tubo ou o balão três vezes com 10 mL de água destilada transferindo a água de lavagem para o microdestilador Alguns sistemas permitem o encaixe do tubo ou do balão diretamente no microdestilador dispensando a lavagem Colocar 10 mL da solução recepetoraindicadora em erlenmeyer de 125 mL Mergulhar o bico de saída do condensador do sistema de destilação na solução receptoraindicadora contida no erlenmeyer Adicionar ao destilador cuidadosamente 15 mL de hidróxido de sódio a 40 e iniciar o aquecimento Nesse momento os registros do sistema de destilação devem estar todos fechados sendo que a saída do vapor que será produzido se dará para o condensador do sistema Destilar por aproximadamente 10 min A destilação só finalizará quando o erlnmeyer totalizar de cerca de 50 mL Durante a destilação devese observar se o condensado na saída do condensador está próximo à temperatura ambiente Caso esteja acima diminuir um pouco a temperatura do destilador Retirar o erlenmeyer do tubo de saída do condensador lavar a ponta do tubo com água destilada recolhendoa no próprio erlenmeyer e mantendo o tubo ainda no erlenmeyer porém não mergulhado na solução deixar destilar mais alguns segundos para que o condensado lave a parede interna da ponta do tubo A coloração final da solução no erlenmeyer deverá estar verde cristalina Titular usando bureta VA o conteúdo do erlenmeyer com ácido clorídrico 01 mol L1 ou ácido sulfúrico 005 mol L1 até coloração rósea clara Anotar o volume VA de solução ácida gasto na titulação da amostra Anotar o volume VB da solução ácida gasta na titulação do branco Cálculo NITROGÊNIO em que N teor de nitrogênio total em percentagem VA volume da solução de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico gasto na titulação da amostra em mililitros VB volume de solução de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico gasto na titulação do branco em mililitros P1 massa da amostra em gramas 152 PROTEÍNA BRUTA 1521 PRINCÍPIO Na determinação de proteína bruta multiplicase o valor do nitrogênio total encontrado com o método Kjeldahl por um fator que converte o nitrogênio em proteína Esse fator é específico pois depende da percentagem de nitrogênio encontrada na composição de cada N VA VB x 01 x 0014 x 100 P1 proteína P ex para amostras de leite o fator é de 638 para ovos é 668 Convencionalmente em amostras de alimentos para animais plantas forrageiras rações concentradas etc a proteína bruta PB é expressa pelo fator 625 considerando que a maioria das proteínas contém nas suas moléculas aproximadamente 16 de nitrogênio Cálulos em que PB teor de proteína bruta em percentagem FN fator específico para cada tipo de material em análise Para amostras de forrageiras e concentrados empregase o fator 625 Para outros tipos de materiais é necessário empregar o fator adequado OBSERVAÇÕES 1 Recomendase fazer análise com repetição 2 Normalmente expressase o resultado corrigido tendose como base de correção a matéria seca a 105ºC Para correção basta multiplicar o resultado de percetnagem de cinzas por 100 e dividir pela percentagem de matéria seca a 105ºC ASE 3 No caso de se empregar equipamentos automáticos ou semi automáticos nas etapas de destilação titulação e cálculo seguir rigorosamente as instruções do fabricante 4 Mesmo que o laboratório possua equipamento automático ou semi automático é necessário manter pelo menos um sistema convencional para fazer verificações do desempenho desses equipamentos 153 DETERMINAÇÃO DE NITRATO EM TECIDO VEGETAL 1531 APLICAÇÃO O teor de nitrato nas plantas tem sido utilizado como meio de diagnóstico do estado nutricional de nitrogênio A maior parte do nitrogênio mineral encontrado nas plantas está sob a forma de amônio nitrato e nitrito Nitrato e nitrito do tecido vegetal seco são solúveis em água entretanto a extração quantitativa do amônio requer a utilização de soluções salinas TEDESCO et al 1985 PB N x FN 1532 PRINCÍPIO O procedimento descrito a seguir utiliza a extração por cloreto de potássio 10 mol L1 e a determinação de amônio NNH4 e de nitrito mais nitrato NNO2 NNO3 Se o objetivo for a determinação de nitrato e nitrito poderá ser utilizada extração com água nas mesmas proporções Se houver necessidade de determinar nitrito separadamente devese adotar a metodologia adequada tratandose o extrato com ácido sulfâmico BREMNER KEENEY 1966 Nos extratos obtidos com H2O ou KCl 10 mol L1 são quantificados amônio nitrato e nitrito utilizando sistema de destilação por arraste a vapor modificado por TEDESCO GIANELLO 1979 TEDESCO et al 1985 1533 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Microdestilador de Kjeldahl ou conjunto automatizado de destilaçãotitulação Bureta de 5 ou 10 mL Balança analítica Frascos dosadores de reagentes ou pipeta graduada de 10 mL Mesa agitadora com movimento orbital e controle de velocidade 1534 REAGENTES E SOLUÇÕES Cloreto de potássio KCl 10 mol L1 dissolver 745 g de KCl em 1000 mL de água desionizada Ácido sulfúrico H2SO4 00025 mol L1 preparar a solução diluindo 25 mL de solução 10 molL1 de H2SO4 para 1000 mL Antes de ser utilizada esta solução deverá ser titulada com solução padrão de trishidroximetilaminometano Óxido de magnésio calcinado aquecer o MgO em forno do tipo mufla a 700ºC por 2 h deixar esfriar e armazenar em frasco com tampa para evitar a absorção de CO2 do ar que resulta em formação de carbonatos Liga de Devarda em pó Cu 50 Al 45 Zn 5 Solução receptora H3BO3 a 1 mv dissolver sob leve aquecimento 10 g de ácido bórico em aproximadamente 700 mL de água desionizada esfriar e adicionar 10 mL de solução alcóolica de verde de bromocresol a 01 mv e 7 mL de solução alcóolica de vermelho de metila a 01 mv homogeneizar e completar o volume com água para 1000 mL A seguir esta solução deverá ser ajustada conforme o seguinte procedimento transferir 25 mL da solução receptora para frasco erlenmeyer e adicionar 100 mL de água desionizada se a solução apresentar coloração vermelha titular com solução de NaOH 001 molL1 até obter coloração cinzaneutro Adicionar 40 vezes o volume de NaOH gasto na titulação à solução receptora Para checar o procedimento realizar prova em branco utilizando 25 mL de solução receptora o ideal é que o volume gasto na titulação do branco fique na faixa de 005 a 015 mL de titulante se necessário fazer novos ajustes com NaOH 001 molL1 ou HCl 001 molL1 1535 PROCEDIMENTO Quantificação do amônio NNH4 Transferir 10 g 01 mg de tecido vegetal secado a 65ºC e moído em peneira de 05 mm para frasco de destilação de 100 mL Adicionar 15 mL de solução de KCl 10 molL1 Agitar por 5 min adicionar 02 g de MgO e proceder à destilação coletando de 30 a 35 mL do destilado em 5 mL de solução receptora de ácido bórico Titular com solução de H2SO4 00025 molL1 Quantificação do nitrato nitrito se o interesse for somente nitrato nitrito a extração poderá ser feita apenas com água desionizada Após a destilação anterior adicionar 02 g de liga de Devarda Proceder nova destilação Titular conforme procedimento anterior Destilar primeiramente a prova em branco que deverá gastar entre 005 e 015 mL de titulante OBSERVAÇÃO O cloreto de potássio não deverá conter mais do que 5 mg kg1 de nitrogênio na forma de amônio como contaminante pois o volume gasto na titulação do branco deverá ficar na faixa de 005 a 015 mL de titulante 154 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO AMONIACAL NNH3 1541 APLICAÇÃO Líquido ruminal e silagem 1542 PRINCÍPIO O método está baseado na determinação de nitrogênio presente na forma amoniacal NH3 em amostras de silagem A principal fonte de nitrogênio livre em silagens é proveniente da degradação de proteínas por proteólise Alta concentração de amônia indica redução na qualidade da silagem O nitrogênio amoniacal contido no rúmen é proveniente principalmente de nitrogênio nãoprotéico da dieta do animal O método a seguir baseiase na destilação por arraste a vapor seguida de titulação com solução diluída de ácido sulfúrico de concentração conhecida sendo o resultado expresso em percentagem do nitrogênio total 1543 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Destilador de nitrogênio baseado no método microKjeldahl Liquidificador Tubo de vidro acessório do destilador Pipeta volumétrica de 2 mL ou pipetador automático Pipeta volumétrica de 10 mL ou pipetador automático Béquer de 250 mL Faca doméstica Proveta graduada de 250 mL Refrigerador Espátula de metal meia cana Erlenmeyer de 125 mL Bureta de 25 ou 50 mL ou titulador automático Funil de vidro com borda Papelfiltro Suporte para funil de vidro Bastão de vidro Frasco de vidro com tampa para coletar filtrado 1544 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido clorídrico HCl 01 mol L1 ou ácido clorídrico 001 mol L1 Cloreto de potássio KCl pa Óxido de magnésio MgO3 pa Álcool etílico CH3COOH pa Ácido bórico H3BO3 a 4 Vermelho de metila pa Verde de bromocresol pa Solução receptora indicadora Preparar solução de ácido bórico a 4 Para melhor e mais rápida dissolução do ácido recomendase aquecer um pouco água durante a preparação Preparar solução alcoólica de vermelho de metila a 1 e solução alcoólica de verde de bromocresol a 1 Adicionar para cada 100 mL da solução de ácido bórico a 4 06 mL de solução alcoólica de vermelho de metila a 1 e 15 mL de solução alcoólica de verde de bromocresol a 1 e agitar por alguns segundos 1545 PROCEDIMENTO Líquido Ruminal No tubo de vidro acessório do destilador adicionar 2 mL de líquido ruminal V1 Realizar a prova em branco adicionando a outro tubo 2 mL de água destilada e proceder conforme descrito a seguir como se fosse uma amostra Acrescentar 10 mL de cloreto de potássio a 15 e 250 mg de óxido de magnésio pa Conectar o tubo de vidro ao destilador de nitrogênio e proceder à destilação da amostra recolhendo o destilado em erlenmeyer de 125 mL com 10 mL da solução receptora indicadora Deixar destilando até que o volume do erlenmeyer atinja 50 mL no mínimo Ao iniciar a destilação a solução receptora indicadora deverá passar de coloração avermelhada para esverdeada Titular o destilado com solução de HCl 01 mol L1 ou 001 mol L1 usando bureta até que se perceba a mudança de cor no destilado passando de tonalidade esverdeada para cinza avermalhada Anotar o volume de solução de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra V2 e o volume gasto na titulação do branco V3 A concentração da solução de ácido clorídrico pode variar em função da concentração de nitrogênio amoniacal da amostra Para concentrações mais elevadas sugerese a solução 01 mol L1 e para as mais baixas é melhor usar a solução 001 mol L1 Cálculo Em que NNH3 Concentração de nitrogênio amoniacal em 100 mL de amostra de líquido ruminal V1 volume de líquido ruminal empregado na análise em mililitros V2 volume de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra em mililitros V3 volume de ácido clorídrico gasto na titulação do branco em mililitros C concentração molar do ácido clorídrico Silagem NNH3 V2 V3 x C x 0014007 x 1000 x 100 V1 Pesar em béquer 50 g de amostra de silagem fresca e picada Anotar a massa P1 Transferir para o liquidificador adicionando com auxílio de proveta 200 mL de cloreto de potássio a 15 previamente resfriado em congelador Triturar a amostra no liquidificador durante 10 a 15 min Filtrar em papelfiltro e funil de vidro recolhendo o filtrado em frasco de vidro com tampa No tubo de vidro acessório do destilador adicionar 10 mL do filtrado V1 Realizar a prova em branco adicionando a outro tubo 10 mL de água destilada e proceder conforme descrito a seguir como se fosse uma amostra Acrescentar 250 mg de óxido de magnésio pa ao tubo de vidro do destilador Conectar o tubo de vidro ao destilador de nitrogênio e proceder à destilação da amostra recolhendo o destilado em erlenmeyer de 125 mL com 10 mL da solução receptora indicadora Deixar destilando até que o volume do erlenmeyer atinja 50 mL no mínimo Ao iniciar a destilação a solução receptora indicadora deverá passar de coloração avermelhada para esverdeada Titular o destilado com ácido clorídrico 01 mol L1 ou 001 mol L1 usando bureta até que se perceba a mudança de cor no destilado passando de tonalidade esverdeada para cinza avermalhada Anotar o volume de solução de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra V2 e o volume gasto na titulação do branco V3 A concentração da solução de ácido clorídrico pode variar em função da concentração de nitrogênio amoniacal da amostra Para as concentrações mais elevadas sugerese a solução 01 mol L1 e para as mais baixas é melhor usar a solução 001 mol L1 Cálculo Concentração de nitrogênio amoniacal em 100 g de amostra de silagem verde in natura Em que NNH3 concentração de nitrogênio amoniacal em 100 g de amostra de silagem verde in natura V1 volume do filtrado empregado na análise em mililitros V2 volume de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra em mililitros V3 volume de ácido clorídrico gasto na titulação do branco em mililitros P1 quantidade de silagem empregada na análise em gramas C concentração molar do ácido clorídrico Concentração de nitrogênio amoniacal em 100 g de matéria seca NNH3 V2 V3 x C x 0014007 x 1000 x 200 x 100 P1 x V1 NNH3 na MS NNH3 x 100 MS em que NNH3 na MS concentração de nitrogênio amoniacal em 100 g de matéria seca MS matéria seca da amostra NNH3 concentração de nitrogênio amoniacal em 100 g de amostra de silagem verde como oferecida Matéria seca em que MS matéria seca ASA amostra seca ao ar ou seja secada a 65ºC por 72 h em percentagem ASE amostra secada em estufa a 105ºC em percentagem Percentagem de nitrogênio amoniacal em relação ao nitrogênio total NT OBSERVAÇÕES 1 Existem no mercado vários tipos de destiladores baseados no método de Kjeldahl que podem ser empregados na determinação do nitrogênio amoniacal Porém para esse tipo de determinação uma característica é importante não deve haver registros e tubos com passagens muito estreitas O óxido de magnésio no processo de destilação tende a formar grumos que podem entupir passagens de registros e tubos se esses forem muito estreitos Se isso acontece há aumento da pressão no destilador causado pelo vapor dágua o que pode levar à explosão do equipamento com risco de o operador se acidentar 2 Na coleta da amostra de silagem recomendase dividíla em duas porções uma para ser secada e moída para as demais análises e outra mantida in natura para a determinação do nitrogênio amoniacal 3 Não havendo possibilidade de realização de análise logo após a coleta congelar a amostra a 10ºC descongelandoa pouco antes da análise 155 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO INSOLÚVEL EM DETERGENTE NEUTRO NIDN MS ASA x ASE 100 NNH3 NNH3 na MS x 100 NT 1551 APLICAÇÃO Plantas forrageiras silagem feno concentrado fezes e líquidos de rúmen íleo e abomaso 1552 PRINCÍPIO Após a extração da fibra em detergente neutro FDN o resíduo dessa análise é digerido por meio de digestão sulfúrica e o nitrogênio insolúvel em detergente neutro NIDN ou nitrogênio residual é determinado pelo método microKjeldahl O resultado é expresso em percentagem do nitrogênio total 1553 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Empregamse os mesmos materiais e equipamentos que são utilizados na determinação de fibra em detergente neutro e na determinação de nitrogênio total 1554 REAGENTES E SOLUÇÕES Empregamse os mesmos reagentes que são utilizados na determinação de fibra em detergente neutro e na determinação de nitrogênio total 1555 PROCEDIMENTO Proceder conforme o método descrito para determinação de fibra em detergente neutro FDN Após a última pesagem retirar o resíduo do cadinho com auxílio de uma espátula de polipropileno e pesálo em papel impermeável tarado sobre a balança Anotar a massa P1 Embrulhar o resíduo no papel Introduzir o resíduo já embrulhado no papel em um tubo de digestão de vidro procedendo a partir daí conforme o método descrito para determinação de nitrogênio total NT Cálculo Assim como na determinação de nitrogênio total a destilação a titulação e o cálculo são feitos automaticamente pelo KJELTEC AUTO SAMPLE SYSTEM 1035 ANALYZER TECATOR sendo a massa do resíduo P1 uma variável introduzida na memória do equipamento OBSERVAÇÃO 1 Como o nitrogênio é determinado no resíduo da FDN e como esse resíduo passa pela estufa no final da análise não é necessário fazer a correção tomandose como base a matéria seca a 105ºC pois o resultado obtido já está nessa base 2 O resultado obtido ao final da destilação é da percentagem de nitrogênio em 100 de FDN para converter na amostra original basta multiplicálo pela percentagem de FDN na MS e dividir por 100 156 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO INSOLÚVEL EM DETERGENTE ÁCIDO NIDA 1561 APLICAÇÃO Plantas forrageiras silagem feno concentrado fezes e líquidos de rúmen íleo e abomaso Este método aplicase na determinação de formas de nitrogênio insolúveis na solução de detergente ácido e que estão contidas na parede celular de amostras de plantas forrageiras fenos silagens concentrados e fezes Esta fração é composta pelas formas de nitrogênio associadas à lignina e aos taninos e pelos compostos de Maillard 1562 PRINCÍPIO Após a extração da fibra em detergente ácido FDA o resíduo dessa análise é digerido por meio de digestão sulfúrica e o nitrogênio insolúvel em detergente acido NIDA ou nitrogênio residual é determinado pelo método microKjeldahl O resultado é expresso em percentagem do nitrogênio total 1563 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Empregamse os mesmos materiais e equipamentos que são utilizados na determinação de fibra em detergente ácido e na determinação de nitrogênio total 1564 REAGENTES E SOLUÇÕES Empregamse os mesmos reagentes que são utilizados na determinação de fibra em detergente ácido e na determinação de nitrogênio total 1565 PROCEDIMENTO Proceder conforme o método descrito para determinação de fibra em detergente ácido FDA Após a última pesagem retirar o resíduo do cadinho com auxílio de uma espátula e pesálo em papel impermeável tarado sobre a balança Anotar a massa P1 Embrulhar o resíduo no papel NIDN NFDN x FDN MS 100 Introduzir o resíduo já embrulhado no papel em um tubo de digestão de vidro Proceder a partir daí conforme o método descrito para determinação de nitrogênio total Cálculo Assim como na determinação de nitrogênio total a destilação a titulação e o cálculo são feitos automaticamente pelo KJELTEC AUTO SAMPLE SYSTEM 1035 ANALYZER TECATOR sendo a massa do resíduo P1 uma variável introduzida na memória de cálculo do equipamento OBSERVAÇÃO 1 Como o nitrogênio é determinado no resíduo da FDA e como esse resíduo passa pela estufa no final da análise não é necessário fazer a correção tomandose como base a matéria seca a 105ºC pois o resultado obtido já está nessa base 2 O resultado obtido ao final da destilação é da percentagem de nitrogênio em 100 de FDA para converter na amostra original basta multiplicálo pela percentagem de FDA MS e dividir por 100 NIDA NFDA x FDA na MS 100 16 DETERMINAÇÃO DE MACROELEMENTOS Ca Mg K Na S EM PLANTAS POR DIGESTÃO NITROPERCLÓRICA 161 APLICAÇÃO Este procedimento é utilizado para a quantificação das concentrações totais dos macroelementos cálcio magnésio potássio sódio e enxofre presentes em amostras de forragens rações concentradas fezes etc 162 PRINCÍPIO A amostra seca e moída é digerida com mistura de ácidos nítrico e perclórico concentrados em alta temperatura aprox 210ºC A matéria orgânica é oxidada ficando os minerais disponíveis em solução aquosa para posterior determinação analítica Cada mineral será quantificado por técnica apropriada MORAES J F V RABELO 1996 SALINAS JG GARCIA 1985 BATAGLIA et al 1983 163 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Bloco digestor Capelas de exaustão Espectrofotômetro de absorção atômica Fotômetro de chama Tubos de ensaio de 75 mL para bloco digestor Dispensador de líquidos para reagentes Diluidor automático Estufa Agitador de tubos Parafilm M Frascos de plástico de 50 mL para armazenamento de extratos Balões volumétricos de 100 e 1000 mL Pipetas volumétricas de diversos volumes Funis de vidro pequenos diâmetro de boca 9 cm Papelfiltro qualitativo de 9 cm de diâmetro A capela de exaustão a ser utilizada para a digestão nítroperclórica deve ser apropriada para esse fim pois a utilização de capelas comuns pode causar explosões por causa da formação de percloratos orgânicos explosivos por fricção pelo contato dos vapores ácidos com materiais orgânicos 164 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido nítrico HNO3 pa concentrado Ácido perclórico HClO4 pa concentrado Óxido de lantânio La2O3 a 01 mv Ácido clorídrico HCl pa concentrado Cloreto de bário BaCl2 pa Gelatina p a Solução de lantânio a 01 mv preparar solução de lantânio a 1 mv a partir do óxido de lantânio Pesr 1173 g do sal e dissolver em 50 mL de ácido clorídrico concentrado utilizando béqueres de 500 mL Transferir para balão volumétrico de 1000 mL Esfriar e completar o volume com água desionizada Preparar solução a 01 vv mediante diluição da solução a 1 mv Solução de ácido clorídrico com enxofre solução semente 100 mL de HCl concentrado 4 mL da solução de 1000 mg L1 de SSO4 2 completar o volume para 200 mL com água desionizada Soluções para preparo da curva de calibração para Ca Mg K Na e S a partir das soluções estoque de 1000 mg L1 de cálcio magnésio potássio sódio e enxofre preparar separadamente as soluções intermediárias de 100 mg L1 transferindo alíquotas da solução de 1000 mg L1 para balão volumétrico de 100 mL completar o volume com água desionizada A partir das soluções de 100 mg L1 de Ca Mg K Na e S preparar os pontos da curva de calibração de acordo com sua faixa de trabalho e completar o volume com solução de lantânio a 01 Exemplos Ca 05 10 20 30 e 40 mg L1 Mg 01 02 03 04 e 05 mg L1 K 10 20 30 40 e 50 mg L1 Na 05 10 20 30 e 40 mg L1 165 PROCEDIMENTO Preparação de material Cuidados especiais deverão ser tomados no procedimento de limpeza de materiais que entram em contato com amostras e com as soluções de calibração Material que continha outras amostras deve ser lavado com água corrente antes de ser colocado de molho em solução aquosa de detergente Extran a 3 diluído em água desionizada Tirar o detergente esfregar com escova lavar várias vezes com água da torneira e três vezes com água desionizada Lavar três vezes com HCl a 5 ou deixar de molho em solução de HCl a 3 por uma noite Finalmente enxaguar três vezes com água desionizada Secar em estufas reguladas para cada tipo de vidraria e estocar em sacos de plástico Preparo do extrato líquido Pesar em balança analítica 03 g de amostra moída e seca 01 mg em papel manteiga e transferir para tubo de digestão de 75 mL Adicionar 3 mL de mistura de HNO3 e HClO4 na proporção de 21 vv Colocar o suporte com os tubos no bloco digestor Iniciar gradativamente o aquecimento até atingir 160ºC e deixar nessa temperatura até o volume ser reduzido à metade aproximadamente 40 min Aumentar a temperatura para 210ºC e deixar nessa temperatura até se formarem fumos brancos de HClO4 e o extrato se apresentar incolor 20 min Esfriar completar o volume com água desionizada e tampar os tubos com Parafilm Preparar a prova em branco o mesmo procedimento sem adicionar amostra para verificação de contaminações Quando houver interesse na análise de sódio transferir o extrato imediatamente para frascos de plástico em vista da contaminação desse elemento causada por frascos de vidro Após a leitura descontar o valor da prova em branco em razão do contato com o vidro dos tubos de digestão Deixar em repouso durante a noite para que a sílica contida nas amostras que não é solubilizada precipite nos frascos antes de se iniciar as determinações dos elementos Se as leituras forem realizadas no mesmo dia filtrar com funil e papelfiltro qualitativo Determinações Cálcio Diluir a 18 o extrato líquido com solução de lantânio a 01 transferir 1 mL do extrato e adicionar 7 mL de solução de lantânio a 01 agitar e fazer a leitura em espectrofotômetro de absorção atômica zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Qualquer diluição adicional ou intermediária deve ser feita com solução de lantânio a 01 Magnésio A partir da primeira diluição feita para o cálcio fazer uma segunda diluição de 15 transferir 1 mL e adicionar 4 mL de solução de lantânio a 01 agitar e fazer a leitura em espectrofotômetro de absorção atômica zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Qualquer diluição adicional ou intermediária deve ser feita com solução de lantânio a 01 Potássio A partir da primeira diluição feita para o cálcio fazer uma segunda diluição de 15 transferir 1 mL e adicionar 4 mL de solução de lantânio a 01 agitar e fazer a leitura em espectrofotômetro de absorção atômica ou fotômetro de chama zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Qualquer diluição adicional ou intermediária deve ser feita com solução de lantânio a 01 Sódio fazer a leitura em fotômetro de chama diretamente do extrato líquido ou se necessário diluir com água desionizada zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Enxofre transferir 1 mL do extrato líquido transferir para tubos de ensaio de 15 mL adicionar 4 mL de solução de ácido perclórico a 225 vv 5 mL de solução semente item 164 e agitar Adicionar 2 mL de solução de gelatina com cloreto de bário agitar e deixar em repouso por 20 min antes de fazer a leitura Nesse caso a diluição a partir do extrato fica igual a 5 Transferir 5 mL das soluções da curva de calibração e da prova em branco e proceder da mesma maneira que para as amostras sem diluir com solução de ácido perclórico a 225 Nesse caso a diluição das amostras a partir do extrato líquido é igual a 5 Qualquer diluição maior ou menor necessária a partir do extrato liquido deve ser feita com a solução de ácido perclórico a 225 vv Fazer a leitura da curva de calibração da prova em branco e das amostras em colorímetro no comprimento de onda de 420 nm acertando a transmitância em 100 com o branco da curva de calibração Cálculos Ca Mg K Na e S para o cálculo da quantidade do elemento em percentagem na matéria seca devese fazer a curva de calibração de cada elemento para determinar sua concentração em mg L1 no extrato em que foi feita a leitura diluído ou não e aplicar a seguinte fórmula OBSERVAÇÕES 1 No caso de não se determinar a matéria seca da amostra devese colocála em estufa a 65ºC durante a noite antes de pesar Nesse Elemento mineral Leitura BR x b a x Dil Inicial x Dil 1 x Dil 2 x Dil 3 x 100 ASg x 1000 ASE caso considerar MS100 para efeito de cálculos 2 A solução de lantânio a 01 que é utilizada nas diluições para determinações de cálcio e magnésio tem a finalidade de retirar a interferência do fósforo nas leituras por espectrofotometria de absorção atômica Em substituição a esse reagente pode ser utilizada a solução de estrôncio a 03 em HCl 02 mol L1 913 g de SrCl26H2O pa e 166 mL de ácido clorídrico concentrado pa e o volume completado para 1 L com água desionizada Nesse caso o reagente deve também ser adicionado proporcionalmente à curva de calibração em substituição ao lantânio 3 No preparo da solução de gelatina e de cloreto de bário a dissolução da gelatina pode ser feita no dia anterior e deixála esfriar coberta durante a noite para a posterior adição do cloreto de bário 4 Na determinação do enxofre a gelatina tem a função de manter o precipitado de sulfato de bário formado em suspensão porém é recomendável agitar os tubos imediatamente antes da leitura no espectrofotômetro Após alguns minutos de repouso já começa a formação do precipitado 5 Tanto nas diluições como nas leituras diretas do extrato líquido devese ter o cuidado para durante o seu manuseio não suspender a sílica que fica depositada no fundo dos frascos Caso contrário podese ter interferência nas leituras ou entupimentos no fotômetro de chama e no espectrofotômetro de absorção atômica 17 DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO PPO4 2 EM PLANTAS 171 MÉTODO DE GOMORY DIGESTÃO NITROPERCLÓRICA 1711 APLICAÇÃO Este procedimento é empregado para a determinação dos teores de fósforo em amostras de materiais vegetais MORAES RABELO 1986 SALINAS GARCIA 1985 BATAGLIA et al 1983 1712 PRINCÍPIO A amostra de material vegetal seca e moída é tratada com mistura de ácido nítrico e ácido perclórico concentrados em alta temperatura A matéria orgânica é oxidada e os macroelementos presentes estão solubilizados no extrato líquido O fósforo é então determinado por espectrofometria em 650 nm após tratamento desse extrato com diluições e reações com reagentes químicos O fósforo na forma de fosfato inorgânico reage com ácido molibdico formando ácido fosfomolibdico que é reduzido por um reagente redutor a óxidos de molibdênio de cor azul sendo a intensidade da cor proporcional à concentração de fósforo da amostra como segue 1713 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Bloco digestor Capelas de exaustão Espectrofotômetro colorímetro Tubos de ensaio de 75 mL para bloco digestor Dispensador de líquidos para reagentes Diluidor automático Estufa Agitador de tubos Parafilm M Frascos de 50 mL para armazenamento de extratos Balões volumétricos de 100 e 1000 mL Pipetas volumétricas de diversos volumes Funis de vidro pequenos diâmetro de boca 9 cm Papelfiltro qualitativo de 9 cm de diâmetro A capela de exaustão a ser utilizada para a digestão nítroperclórica deve ser apropriada para esse fim pois em capelas comuns podem ocorrer explosões pela formação de percloratos orgânicos explosivos por fricção pelo contato dos vapores ácidos com materiais orgânicos 1714 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido nítrico HNO3 pa concentrado Ácido perclórico HClO4 pa concentrado Ácido clorídrico HCl pa concentrado H3PO4 12H2MoO4 H3PO4 x 12MoO3 12H2O H3PO4 x 12MoO3 8e 8H MoO22 MoO4 4H2O Azul de Molibdênio Molibdato de sódio Na2MoO42H2O Fosfato ácido de potássio KH2PO4 Ácido sulfúrico H2SO4 pa concentrado Bissulfito de sódio HNaO3S PhotoRex 4 sulfato de metilaminofenol C14H20N2O6S Reagente 1 Solução de molibdato de sódio Na2MoO42H2O a 5 mv Dissolver 25 g de molibdato de sódio em H2O desionizada e transferir para balão volumétrico de 500 mL Reagente 2 Ácido sulfúrico H2SO4 50 mol L1 Em erlenmeyer de 500 mL colocar 150 mL de H2O desionizada adicionar lentamente e com agitação constante 70 mL de ácido sulfúrico concentrado Resfriar e transferir para balão volumétrico de 250 mL e completar o volume com água desionizada Reagente 3 Molibdico sulfúrico Transferir 800 mL de molibdato de sódio Na2MoO42H2O a 5 do reagente 1 para balão de 2000 mL adicionar 400 mL de H2SO4 5 mol L1do reagente 2 e completar o volume com H2O desionizada Homogeneizar e transferir para frasco de cor âmbar Reagente 4 Reagente redutor Transferir 1 g de PhotoRex 4 sulfato de metilaminofenol C14H20N2O6S e 3 g de bissulfito de sódio HNaO3S para balão volumétrico de 100 mL Dissolver e completar com H2O desionizada homogeneizar e transferir para frasco âmbar Reagente 5 Solução de calibração de 1000 mg L1 de P Transferir 439 mg de fosfato ácido de potássio KH2PO4 secado em estufa a 105ºC para balão de 100 mL dissolver com H2O desionizada completar o volume e transferir para frasco de armazenagem e guardar em geladeira Curva de calibração de fósforo 10 20 30 e 40 mg L1 a partir da solução de calibração de 1000 mg L1 de fósforo transferir alíquotas de 1 mL 2 mL 3 mL e 4 mL para balões volumétricos de 100 mL e acrescentar 2 mL de HNO3 e 1 mL de HClO4 Completar o volume com água desionizada 1715 PROCEDIMENTO A Preparação de material Cuidados especiais deverão ser tomados no procedimento de limpeza de materiais que entram em contato com amostras e soluções de calibração Toda a vidraria deve ser lavada com água corrente e com detergente neutro isento de fósforo O detergente deve ser diluído 3 vv em água desionizada Lavar em água corrente e deixar em banho ácido solução de HCl a 3 vv por no mínimo 12 h Retirar do banho enxaguar com água desionizada secar em estufas reguladas para cada tipo de vidraria e estocar em sacos de plástico B Preparo do extrato líquido Pesar em balança analítica 03 g de amostra moída e seca com precisão de 01 mg em papelmanteiga e transferir para tubo de digestão de 75 mL Adicionar 3 mL de mistura de HNO3 e HClO4 na proporção de 21 vv Colocar o suporte com os tubos no bloco digestor Iniciar gradativamente o aquecimento até 160ºC e deixar nessa temperatura até o volume ser reduzido à metade aproximadamente 40 min Aumentar a temperatura para 210ºC e deixar nessa temperatura até se formarem fumos brancos de HClO4 e o extrato apresentar se incolor 20 min Esfriar completar o volume com água desionizada e tampar os tubos com Parafilm Preparar prova em branco o mesmo procedimento sem adicionar amostra para verificação de contaminações Transferir o extrato imediatamente para os frascos ou deixar em repouso durante a noite para que a sílica das amostras que não é solubilizada precipite antes de iniciar as determinações do elemento Se a leitura for realizada no mesmo dia filtrar usando funil e papelfiltro qualitativo Transferir alíquota de 05 mL da amostra ou da curva de calibração para tubos de ensaio e adicionar 2 mL do reagente 3 molibdico sulfúrico mais 1mL do reagente 4 reagente redutor Agitar e deixar em repouso por 30 min Fazer a leitura no colorímetro no comprimento de onda de 650 nm zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Cálculos Fósforo Para o cálculo da quantidade do elemento em percentagem na matéria seca devese fazer a curva de calibração para determinar sua concentração em percentagem no extrato em que foi feita a leitura diluído ou não e aplicar a seguinte fórmula OBSERVAÇÕES Elemento Mineral Leitura BR x b a x Dil Inicial x Dil 1 x Dil 2 x Dil 3 x 100 ASg x 05 x 1000 ASE No caso de não se determinar a matéria seca da amostra devese colocá la em estufa a 65ºC durante a noite antes de pesar Nesse caso considerar MS100 para efeito de cálculo 172 MÉTODO DO VANADATO DIGESTÃO NÍTROPERCLÓRICA 1721 APLICAÇÃO Procedimento empregado para a determinação da concentração do fósforo em amostras de materiais vegetais 1722 PRINCÍPIO A amostra de material vegetal seca e moída é tratada com mistura de ácido nítrico e ácido perclórico concentrados em alta temperatura A matéria orgânica é destruída e os macroelementos presentes estão solubilizados no extrato líquido O fósforo é então determinado por espectrofometria em 420 nm após tratamento desse extrato com diluições e reações com reagentes químicos A concentração do fósforo total em plantas pode variar de 01 a 15 da matéria seca mas os valores mais comumente encontrados estão entre 01 e 03 Vanadato molibdato e ortofosfato reagem formando um complexo amarelo em soluções ácidas A concentração ótima de HNO3 é de 05 mol L1 Não há desenvolvimento de cor se a concentração for menor do que 02 mol L1 e há desenvolvimento muito lento acima de 16 mol L1 A acidez dos extratos de plantas pode ser compensada adicionando às soluções de calibração quantidades equivalentes dos ácidos residuais usados no preparo dos extratos 1723 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Bloco digestor Capelas de exaustão Espectrofotômetro colorímetro Tubos de ensaio de 75 mL para bloco digestor Dispensador de líquidos para reagentes Diluidor automático Estufa Agitador de tubos Parafilm M Frascos de 50 mL para armazenamento de extratos Balões volumétricos de 100 e 1000 mL Pipetas volumétricas de diversos volumes Funis de vidro pequenos diâmetro de boca 9 cm Papelfiltro qualitativo de 9 cm diâmetro A capela de exaustão a ser utilizada para a digestão nítroperclórica deve ser apropriada para esse fim pois em capelas comuns podem ocorrer explosões decorrentes da formação de percloratos orgânicos explosivos por fricção pelo contato dos vapores ácidos com materiais orgânicos 1724 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido nítrico HNO3 pa concentrado Ácido perclórico HClO4 paconcentrado Ácido clorídrico HCl pa concentrado Molibdato de amônio NH46Mo7O244H2O Vanadato de amônio NH4VO3 Fosfato ácido de potássio KH2PO4 Ácido sulfúrico H2SO4 pa concentrado Reagente 1 Solução de molibdato de amônio NH46Mo7O244H2O a 5 mv Dissolver 5 g de molibdato de amônio em mais ou menos 80 ml de H2O desionizada aquecer ligeiramente para dissolução Esfriar e transferir para balão volumétrico de 100ml e completar o volume com água desionizada Reagente 2 Solução de vanadato de amônio NH4VO3 a 025 mv Dissolver 25 g de vanadato de amônio em mais ou menos 500 ml de H2O desionizada fervente Esfriar e adicionar 350 mL de ácido nítrico concentrado Esfriar e completar o volume com água desionizada em balão volumétrico de 1000 ml Reagente 3 Solução de estoque de 1000 mg L1 de fósforo Dissolver 439 g de fosfato ácido de potássio secado em estufa em 300mL de H2O desionizada Esfriar e completar o volume com água desionizada em balão volumétrico de 1000ml Reagente 4 Reagente misto Misturar partes iguais da solução de molibdato 1 e vanadato 2 esta solução deverá ser preparada imediatamente antes da leitura Reagente 5 Solução para preparar a curva de calibração de fósforo A partir da solução de calibração de estoque de 1000 mg L1 de fósforo preparar a solução intermediária de 100 mg L1 de fósforo transferindo 10 mL da solução 1000 mg L1 para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada A partir da solução de 100 mg L1 de fósforo preparar os pontos da curva de calibração de acordo com sua faixa de trabalho colocar 2 mL de HNO3 e 1ml de HClO4 e completar o volume com água desionizada Exemplo P concentração 25 60 80 e 100 mg L1 1725 PROCEDIMENTO Preparação de material Cuidados especiais deverão ser tomados no procedimento de limpeza de materiais que entram em contato com amostras e soluções de calibração Toda a vidraria deve ser lavada com água corrente e com detergente neutro isento de fósforo O detergente deve ser diluído 3 vv em água desionizada Lavar em água corrente e deixar em banho ácido solução de HCl a 3 vv por no mínimo 12 h Retirar do banho enxaguar com água desionizada secar em estufas reguladas para cada tipo de vidraria e estocar em sacos de plástico Preparo do extrato líquido Pesar em balança analítica 03 g de amostra moída e seca 01 mg em papelmanteiga e transferir para tubo de digestão de 75 mL Adicionar 3 mL de mistura de HNO3 e HClO4 na proporção de 21 vv Colocar o suporte com os tubos no bloco digestor Iniciar gradativamente o aquecimento até 160ºC e deixar nessa temperatura até o volume ser reduzido à metade aproximadamente 40 min Aumentar a temperatura para 210ºC e deixar nessa temperatura até se formarem fumos brancos de HClO4 e o extrato apresentarse incolor mais ou menos 20 min Esfriar e completar o volume com água desionizada e tampar os tubos com Parafilm Preparar prova em branco o mesmo procedimento sem adicionar amostra para verificação de contaminações a Transferir o extrato imediatamente para os frascos ou deixar em repouso durante a noite para que a sílica das amostras que não é solubilizada precipite antes de se iniciar as determinações do elemento Se as leituras forem realizadas no mesmo dia filtrar usando funil e papelfiltro qualitativo Transferir alíquota de 5 mL da amostra e dos pontos da curva 20 40 60 80 100 mg L1 para tubos de ensaio e adicionar 2 mL do reagente misto Agitar deixar em repouso por 10 min Fazer as leituras no colorímetro no comprimento de onda de 420 nm zerando o aparelho com o branco da curva de calibração Cálculos Fósforo Para o cálculo da quantidade do elemento em percentagem na matéria seca devese fazer a curva de calibração para determinar sua concentração em percentagem no extrato em que foi feita a leitura diluído ou não e aplicar a seguinte fórmula OBSERVAÇÃO No caso de não se determinar a matéria seca da amostra devese colocá la em estufa a 65ºC durante a noite antes de pesar Nesse caso considerar MS 100 para efeito de cálculo 173 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE FÓSFORO EM SOLUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO A 2 1731 APLICAÇÃO Este procedimento visa estimar a solubilidade do fósforo presente em fosfatos naturais e industrializados e em misturas minerais BRASIL 1991 MOARAES RABELO 1986 SALINAS GARCIA 1985 1732 PRINCÍPIO A técnica consiste em solubilizar por agitação em solução de ácido cítrico a 2 a fração de fósforo solúvel contida na amostra determinar colorimetricamente por espectrofotometria e comparar com o fósforo total para se obter o valor da solubilidade 1733 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Espectrofotômetro colorímetro Agitador de frascos do tipo Wagner ou mesa agitadora para análise de solos Agitador de tubos Diluidor Elemento Mineral Leitura BR x b a x Dil Inicial x Dil 1 x Dil 2 x Dil 3 x 100 ASg x 05 x 1000 ASE Balões volumétricos de 100 250 e 1000 mL Pipetas volumétricas de diversos volumes Funis para filtração Papel de filtro quantitativo filtração média Tubos de ensaio capacidade 10 mL 1734 REAGENTES E SOLUÇÕES Ácido cítrico a 2 mv pesar 20 g de ácido cítrico pa transferir para balão volumétrico de 1000 mL dissolver e completar o volume com água desionizada Molibdato de amônio a 5 mv pesar 50 g de molibdato de amônio pa transferir para balão volumétrico de 1000 mL dissolver com água desionizada quente e quando atingir a temperatura ambiente completar o volume com água desionizada Vanadato de amônio a 025 mv pesar 25 g de vanadato de amônio pa transferir para balão volumétrico de 1000 mL e adicionar com cuidado e vagarosamente 500 mL de água desionizada fervente Deixar esfriar adicionar 335 mL de ácido nítrico concentrado pa e completar o volume com água desionizada quando atingir a temperatura ambiente Reagente molibdatovanadato misturar as soluções de molibdato de amônio a 5 e de vanadato de amônio a 025 em partes iguais pouco antes do uso Reagente molibdatovanadato diluído misturar 3 partes do reagente molibdatovanadato com 2 partes de água desionizada Solução de calibração 100 mg L1 de fósforo a partir da solução estoque de 1000 mg L1 de fósforo preparar por diluição com água desionizada a solução de 100 mg L1 transferir 10 mL da solução de 1000 mg L1 em balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água desionizada Curva de calibração de fósforo transferir em balões volumétricos de 100 mL as quantidades das soluções conforme a tabela abaixo completando o volume dos balões com água desionizada A concentração de fósforo na curva de calibração também é dada na tabela Balão de 100 mL Volume mL de solução de 100 mg L1 de fósforo Concentração final de fósforo em mg L1 A 2 2 B 4 4 C 6 6 D 8 8 E 10 10 Branco 0 0 1735 PROCEDIMENTO Determinar inicialmente o teor total de fósforo fazendo a digestão da amostra e a leitura colorimétrica do fósforo no extrato obtido p ex digestão nítroperclórica Pesar 10 g da amostra 01 mg e transferir para balão volumétrico de 250 mL Adicionar 100 mL de solução de ácido cítrico a 2 Agitar durante 30 min na velocidade de 30 a 40 rpm agitador do tipo Wagner No caso de se utilizar outro sistema a agitação deve ser branda mas suficiente para provocar a revolução completa do material Completar o volume do balão com água desionizada homogeneizar e filtrar em papelfiltro Transferir 5 mL de extrato líquido e adicionar 5 mL de molibdatovanadato diluído agitar aguardar 10 min e fazer a leitura da transmitância em colorímetro no comprimento de onda de 420 nm Preparar a prova em branco com a solução de ácido cítrico a 2 e a curva de calibração da mesma forma que as amostras Se alguma amostra estiver muito concentrada diluir o extrato líquido com água desionizada adicionar 5 mL de molibdato vanadato diluído agitar aguardar 10 min e fazer nova leitura Cálculos Para fazer a curva de calibração devese primeiramente transformar os valores de percentagem de transmitância T para absorbância A utilizandose a seguinte fórmula A 2 log T Para efeito de cálculo não se deve considerar as diluições dos testes para o fósforo pois elas também são feitas na curva de calibração Para o cálculo da quantidade de fósforo solúvel em percentagem devese calcular a equação de regressão da curva de calibração para determinar sua concentração em mg L1 no extrato em que foi feita a leitura diluído ou não e aplicar a seguinte fórmula Em que C concentração do elemento em ppm no extrato no qual foi feita a leitura obtida por meio da curva de calibração subtraído o valor da prova em branco quando for o caso V volume final do extrato líquido no caso 250 mL D diluição total feita a partir do extrato líquido no caso de leituras diretas sem diluição considerase D 1 P massa da amostra nesse caso se a pesagem foi exata P 10 g 10000 fator utilizado para transformar o resultado de ppm para percentagem Para o cálculo da solubilidade do fósforo em ácido cítrico utilizase a seguinte fórmula em que PS quantidade de fósforo solúvel em percentagem na amostra Pt quantidade de fósforo total previamente determinado em percentagem na amostra OBSERVAÇÕES 1 Para a agitação das amostras podese utilizar mesa agitadora regulandose a velocidade conforme citado no procedimento 2 Se após a filtração da amostra o extrato estiver turvo filtrar novamente utilizando papelfiltro de menor porosidade filtração lenta 25 DETERMINAÇÃO DE GRANULOMETRIA 1 APLICAÇÃO Produtos ou subprodutos de origem animal vegetal ou mineral e misturas que os contenham 2 PRINCÍPIO Consiste no fracionando da amostra utilizandose um conjunto de peneiras com malhas de diversas aberturas Para o milho e os demais cereais moídos que se destinam à produção de rações para suínos e aves mediante a quantidade de amostra retida em cada peneira podese calcular o módulo de finura MF o índice de uniformidade IU e o diâmetro geométrico médio DGM das partículas do ingrediente COMPÊNDIO P solúvel PS C x V x D P x 1000 Solubilidade do fósforo em ácido cítrico a 2 PS x 100 Pt BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMA 1998 ZANOTTO BELLAVER 1996 3 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Aparelho vibrador para peneiras Ar comprimido ou pincéis para limpeza das peneiras Balança precisão 01g Conjunto de peneiras metálicas com tampa e fundo com 203 cm de diâmetro Conjunto de peneiras ABNT números 5 10 16 30 50 100 e fundo correspondendo às seguintes aberturas de malhas 4 2 120 060 030 015 e 0 mm respectivamente 4 PROCEDIMENTO Pesar individualmente as peneiras e a bandeja fundo Montar o conjunto de peneiras no aparelho vibrador sobrepondoas em ordem crescente de abertura das malhas Pesar de 100 a 200 g da amostra e transferir para a peneira superior do conjunto Tampar e fixar o conjunto no vibrador Ajustar o reostato do equipamento na posição 10 ou na regulagem recomendada pelo fabricante correspondente a 750 vibraçõesmin Ligar e deixar em vibração durante 10 min Pesar individualmente as peneiras e o fundo com as frações retidas Cálculo Em que A massa da peneira ou do fundo amostra retida em gramas B massa da peneira ou do fundo em gramas P massa da amostra em gramas Cálculo do módulo de finura MF do índice de uniformidade IU e do diâmetro geométrico médio DGM Para milho e demais cereais moídos que se destinam a produção de rações para suínos e aves Retido A B x 100 P Calcular a massa da fração do ingrediente retido em cada peneira ou fundo em que PR massa da amostra retido na peneira ou no fundo A massa da peneira ou do fundo amostra retida em gramas B massa da peneira ou do fundo em gramas Calcular a percentagem da amostra retida em cada peneira ou fundo R Em que R percentagem de amostra retida em cada peneira ou fundo PR massa da amostra retido na peneira ou no fundo P massa da amostra A R é multiplicada por fatores Ki convencionados e constantes que decrescem de seis a zero com o decréscimo das malhas das peneiras conforme o exemplo seguinte Massa Retida PR A B R PR x 100 P Exemplo de cálculo do módulo de finura MF índice de uniformidade IU e diâmetro geométrico médio DGM das partículas de ingredientes Peneiras Massa retido Retido Fator Produto ABNTNo Malhas mm PR g R Ki Ki x R 5 4 5 25 6 150 10 2 19 95 5 475 16 12 40 200 4 800 30 06 76 380 3 1140 50 03 37 185 2 370 100 015 23 115 1 115 Fundo 0 0 0 0 0 Total 200 100 3050 Cálculo do módulo de finura O MF é dado pela soma dos produtos 305 dividido por 100 Cálculo do índice de uniformidade O IU é dado dividindose por 10 a soma das R nas peneiras ou no fundo ABNT 5 e 10 259510 12 Partículas grossas ABNT 16 e 30 203810 58 Partículas médias ABNT 50 100 e fundo 185115010 30 Partículas finas O IU é expresso da seguinte forma 12 58 30 e corresponde à proporção de 12 de partículas maiores do que 2 mm 58 de partículas entre 2 e 060 mm e 30 de partículas menores do que 060 mm Cálculo do diâmetro geométrico médio MF 3050 305 100 DGM mm 10414 x 2MF DGM 10414 x 2305 862 µm O DGM é calculado pela equação OBSERVAÇÕES 1 O número de peneiras e o tamanho das malhas deverão ser estabelecidos conforme o tipo do produto 2 A secagem da amostra em estufa a 105ºC e o posterior equilíbrio com a temperatura ambiente aproximadamente 2 h antes da pesagem evitam a aderência de partículas finas nas malhas que obstruem a passagem da amostra 3 O MF é representado por um índice que pode assumir qualquer valor compreendido entre zero e seis e correlacionase positivamente com o aumento do tamanho das partículas do ingrediente 4 O IU indica a proporção relativa entre partículas grossas médias e finas que são definidas segundo os diâmetros maior do que 2 mm entre 2 e 060 mm e menor do que 060 mm respectivamente 5 O DGM representa o diâmetro geométrico médio das partículas do ingrediente 19 DETERMINAÇÃO DE AMIDO 191 APLICAÇÃO Alimentos ou preparados de farinha ou amido suscetíveis à hidrólise ácida 192 PRINCÍPIO O método se baseia primeiramente na hidrólise ácida do amido contido na amostra e a seguir na determinação do conteúdo de açúcares redutores provenientes da hidrólise Essa última etapa é executada de acordo com o método de determinação de açúcares redutores em farinhas 193 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Balança analítica Agitador mecânico Erlenmeyer de 500 mL de boca esmerilhada Erlenmeyer de 125 mL Proveta de 25 mL Proveta de 50 mL Proveta de 250 mL Pipetas graduadas de 1 mL Funil analítico de colo longo de 7cm Funil de Büchner Papelfiltro Whatman no 40 rápido de 15cm Papelfiltro Whatman no 41 Bureta graduada de 50 mL Tornassol papel indicador universal Balão volumétrico de 500 mL 194 REAGENTES E SOLUÇÕES Solução de iodo I2 05 mol L1 Solução de hidróxido de sódio NaOH a 10 mv Ácido clorídrico HCl pa concentrado d 118 Solução de ácido clorídrico HCl 05 mol L1 195 PROCEDIMENTO Pesar 2 g de amostra triturada e moída em erlenmeyer de 125 mL Adicionar 50 mL de água fria evitando formação de grumos Deixar sob agitação mecânica por 1 h Filtrar sob vácuo em Büchner usando papel de filtração Wathman no 41 identificar amido no filtrado com gotas de solução de iodo 05 mol L1 e lavar com 250 mL de água fria Transferir o resíduo para erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada com 200 mL de água e 15 mL de ácido clorídrico e aquecido sob refluxo por 25 h Esfriar e neutralizar imediatamente com solução de hidróxido de sódio a 10 mv evitando excesso de álcali voltase com gotas de solução de HCl 05 mol L1 utilizando tornassol como indicador Transferir para balão aferido de 500 mL e completar o volume Filtrar em papel de filtração rápida Whatman no 40 Determinar os açúcares pelo método de Munson e Walker Cálculos Óxido de Cobre Cu2O g C2 C1 Em que Cu2O g massa do óxido de cobre em gramas C2 massa do cadinho resíduo de Cu2O após secagem em gramas C1 massa do cadinho vazio seco em gramas Em que Amido teor de amido em percentagem fator fator encontrado na coluna de inverted sugar da tabela de MunsonWalker correspondente a massa de Cu2O encontrado no item anterior P massa da amostra em gramas 20 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY 1979B UREASE ACTIVITY AOCS OFFICIAL METHOD CD 853 1979 ANFAR ASSOCIAÇÃO NACIONAL DOS FABRICANTES DE RAÇÕES Métodos Analíticos de Controle de Alimentos para Uso Animal Ministério da Agricultura e Reforma Agrária Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária Departamento Nacional de Defesa Animal Divisão de Laboratório Animal São Paulo 1992 AOAC Association of Official Analytical Chemistis Official methods of analysis 11TH ed WASHINGTON DC AOAC 19801051 p BATAGLIA OC FURLANI AMC TEIXEIRA JPF FURLANI PR GALLOJR Método de análise química de plantas Instituto Agronômico de Campinas SP Boletim técnico n 78 1983 BATEMAN JV Nutrición Animal Manual de Métodos AnalíticosMéxico Editora Herrero Hermanos SA 1970 469p BRASIL Ministério da Agricultura e da Reforma Agrária Portaria n 108 de 4 de setembro de 1991 Aprova os métodos analíticos para controle de alimentos para uso animal Diário Oficial da República Federativa do Brasil Brasília 17 set Seção 1 p1981319842 1991 BREMNER JM KEENEY D R Determination and isotope ratio analysis of different Amido fator x 1000 x 0925 P forms of nitrogen in soils III Exchangeable ammonium nitrate and nitrate by steam distillation methods Soil Science Society of America Proceedings v30 p577582 1966 BUTLER GW BAILEY RW Chemistry and biochemistry or herbage London Academic Press 1973 416p COMPÊNDIO BRASILEIRO DE NUTRIÇÃO ANIMAL In Métodos Analíticos ANFAR SINDIRAÇÕES Ministério da Agricultura e Reforma Agrária Colégio Brasileiro de Nutrição Animal São Paulo p11 1998 FOUNTOULAKIS M LAHM H W Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins Journal of Chromatography A v826 p 109134 1998 GOERING H K e VAN SOEST P J Forage Fiber Analisys Apparatus reagents procedures and some applications Agriculture Handbook Forest Service U S Washington v379 p120 1970 LLAMES C R FONTAINE J Determination of amino acids in feeds collaborative study Journal of AOAC International v776 p13621402 1994 MOIR KW The determination of oxalic acid in plants The Queensland Journal of Agricultural Science v101 p957 1953 MORAES J F V RABELO N A Um método simples para a digestão de amostras de plantas Brasília DFEMBRAPADDTEMBRAPACNPAF 1986 12p EMBRAPA CNPAF Documentos 12 PEREIRA JRA ROSSI Jr P Manual Prático de Avaliação Nutricional de Alimentos Piracicaba ESALQ FEALQ 1995 34p QIN G TER ELST E R BOSCH M W VAN DER POEL A F B Thermal processing of whole soya bens Studies on the inactivation of antinutritional factors and effects on ileal digestibility in piglets Animal Feed Science Technology v57 p313324 1996 SALINAS J G GARCIA R Métodos químicos para el análisis de suelos ácidos y plantas forrajeras Cali Centro Internacional de Agricultura Tropical Programa de Pastos Tropicales 1985 83p SLOCUM R LEE P ARRIZONLOPEZ V Standard protein hydrolyzate analysis alternate third buffer NaD System 63007300 Application Notes Beckman Instruments Inc Palo Alto CA 1987 SOUZA GB NOGUEIRA ARA RASSINI JB Determinação de matéria seca e umidade em solos e plantas com forno de microondas doméstico São Carlos Embrapa Pecuária Sudeste 2002 9p Circular Técnica 33 SOUZA GB NOGUEIRA ARA SUMI LM BATISTA LAR Método alternativo para a determinação de fibra em detergente neutro e detergente ácido São Carlos Embrapa Pecuária Sudeste 1999 Boletim de Pesquisa 4 SPINDLER M STADLER R TANNER H Amino acid analysis of feedstuffs determination of methionine and cystine after oxidation with performic acid and hydrolysis Journal of Agricultural and Food Chemistry v32 p13661371 1984 SPITZ H D Amino acid determination hydrolysis procedure Analytical Biochemistry v 56 p 6673 1973 TEDESCO MJ GIANELLO C Conjunto modulado em vidro para destilação a vapor de amônio pelo método Kjeldahl Revista Brasileira de Ciência do Solo v3 p6163 1979 TEDESCO MJ VOLKWEISS SJ BOHNEN H Análises de solos plantas e outros materiais Boletim técnico no 05 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Agronomia Departamento de Solos 1985 95p TILLEY JMA TERRY RA A twostage Technique for the in vitro Digestion of Forage Crops Journal British Grassland Society v 18 p104111 1963 VAN SOEST PJ MOORE LA New chemical methods for analysis of forages for the purpose of predicting nutritive value In Proc IX International Grassland Congress São Paulo p783789 1966 VAN SOEST PJ WINE RH Determination of lignin and celulose in acid detergent fiber with permanganate Journal of Association of Official Agricultural Chemistry v51 p78085 1968 VAN SOEST PJ Use of detergents in the analysis of fibrous feed II A rapid method of the determination of fiber and lignin Journal of Association of Official Agricultural Chemistry 46582935 1963 VAN SOEST PJ ROBERTSON JBLEWIS BA Symposium Carbohydrate metodoloy metabolism and nutritional implications in dairy cattle Methods for dietary fiber neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition Journal of Dairy Science v74 p358397 1991 ZANOTTO D L BELLAVER C Método de determinação da granulometria de Ingredientes para rações de suínos e aves Comunicado Técnico CT215CNPSA Dez96 p15 Concórdia SC 1996 ENDEREÇOS DOS AUTORES PARTICIPANTES Embrapa Acre Rodovia BR364 km 14 Cx Postal 321 69908970 Rio Branco AC Fone 68 2123200 Fax 68 2123284 Internet httpwwwcpafacembrapabr Email saccpafacembrapabr Embrapa Agrobiologia Rodovia BR 465 km 47 Cx Postal 74505 23851970 Seropédica RJ Fone 21 26821500 Fax 21 26821230 Internet httpwwwcnpabembrapabr Email saccnpabembrapabr Embrapa Agroindústria de Alimentos Av das América 29501 Guaratiba 23020470 Rio de Janeiro RJ Fone 21 24107400 Fax 21 24101090 Internet httpwwwctaaembrapabr Email sacctaaembrapabr Embrapa Agroindústria Tropical Rua Dra Sara Mesquita 2270 Pici 60511110 Fortaleza CE Fone 85 299 1800 Fax 85 299 1803 Internet httpwwwcnpatembrapabr Email saccnpatembrapabr Embrapa Agropecuária Oeste Rodovia BR 163 km 2536 Cx Postal 661 79804970 Dourados MS Fone 67 4255122 Fax 67 4250811 Internet httpwwwcpaoembrapabr Email saccpaoembrapabr Embrapa Amapá Rodovia Juscelino Kubitschek km 5 Cx Postal 10 68903000 Macapá AP Fone 96 2411551 Fax 96 2411480 httpwwwcpafapembrapabr Email saccpafapembrapabr Embrapa Amazônia Oriental Trav Dr Enéas Pinheiro snº Marco 66095100 Belém PA Fone 91 2766333 Fax 91 2760323 Internet httpwwwcpatuembrapabr Email saccpatuembrapabr Embrapa Cerrados BR 020 km 18BrasíliaFortaleza73301970 Planaltina DF Fone 61 3889898 Fax 61 3899879 Internet httpwwwcpacembrapabr Email saccpacembrapabr Embrapa Gado de Corte Rodovia BR 262 km 4 Cx Postal 154 79002970 Campo Grande MS Fone 67 3682000 Fax 67 3682150 Internet httpwwwcnpgcembrapabr Embrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento 610 Dom Bosco 36038330 Juiz de Fora MG Fone 32 32494700 Fax 32 32494701 Internet httpwwwcnpglembrapabr Email saccnpglembrapabr Embrapa Meio Ambiente Rodovia SP 340 km 1275 Tanquinho Velho Cx Postal 69 13820000 Jaguariúna SP Fone 19 38678700 Fax 19 38678740 Internet httpwwwcnpmaembrapabr Email saccnpmaembrapabr Embrapa Milho e Sorgo Rodovia MG 424 km 65 Cx Postal 151 35701970 Sete Lagoas MG Fone 31 37791000 Fax 31 37791088 Internet httpwwwcnpmsembrapabr Email saccnpmsembrapabr Embrapa Pantanal Rua 21 de Setembro 1880 Cx Postal 109 79320900 Corumbá MS Fone 67 2332430 Fax 67 2331011 Internet httpwwwcpapembrapabr Email saccpapembrapabr Embrapa Pecuária Sudeste Rodovia Washington Luiz km 234 Cx Postal 339 13560970 São Carlos SP Fone 16 2615611 Fax 16 2615754 Internet httpwwwcppseembrapabr Email saccppseembrapabr Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Parque Estação Biológica PqEB snº Av W5 NorteFinal Plano Piloto 70770900 Brasília DF Fone 61 4484700 Fax 61 4483624 Internet httpwwwcenargenembrapabr Email saccenargenembrapabr Embrapa Roraima BR174 km 08 Distrito Industrial Cx Postal 133 69301970 Boa Vista RR Fone 95 6267125 Fax 95 6267104 Internet httpwwwcpafrrembrapabr Email saccpafrrembrapabr Embrapa SemiÁrido Rodovia BR 428 km 152 Zona Rural Cx Postal 23 56300970 Petrolina PE Fone 87 38621711 Fax 87 38621744 Internet httpwwwcpatsaembrapabr Email saccpatsaembrapabr Embrapa Soja Rodovia Carlos João Strass LondrinaWarta C Postal 231 Acesso Orlando Amaral Distrito de Warta 86001970 Londrina PR Fone 43 3371 6000 Fax 43 3371 6100 Internet httpwwwcnpsoembrapabr Email saccnpsoembrapabr Embrapa Solos Rua Jardim Botânico1024 22460000 Rio de JaneiroRJ Fone 2l 22744999 Fax 21 22745291 Internet httpwwwcnpsembrapabr Email saccnpsembrapabr Embrapa Suínos e Aves Rodovia BR 153 km 110 Vila Tamanduá Cx Postal 21 89700000 Concórdia SC Fone 49 4428555 Fax 49 4428559 Internet httpwwwcnpsaembrapabr Email saccnpsaembrapabr Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de zootecnia USP Av Duque de Caxias Norte 225 Pirassununga SP CEP 13635 000 Fone 19356540004180 Email rslacerduspbr Centro de Energia Nuclear na Agricultura Av Centenário 303 Cx Postal 96 13400970 Piracicaba SP Fone 19 34294600 Fax 19 34294610 Internet httpwwwcenauspbr Email iorufunicenauspbr Coordenadoria de Defesa da Agricultura CDAAASSP Av Brasil 2340 Campinas SP CEP 13073001 Fone 1932414700 Email samantaddaspgovbr Iapar Instituto Agronômico do Paraná Rodovia Celso Garcia Cid km 375 Três Marcos Caixa Postal 481 86001970 Londrina PR Fone 43 33762000 Fax 43 33762101 Email fdalbertoprgovbr Home Page httpwwwprgovbriapar Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN Av Prof Lineu Prestes 2242 Cidade Universitária CEP 005508000 São Paulo SP Fone 1138169289 Email marmelincuriangoipenbr