Citogenetica Vegetal-Da-Era-Classica-a-Molecular

Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento ISSN 15186512 Dezembro 2007 85 Citogenética vegetal da era clássica à molecular Imagem Sandra Brammer Sandra Patussi Brammer1 Maira Zanotto2 Andréia Caverzan3 Histórico da Citogenética As primeiras atividades envolvendo a citologia datam de 15911608 em que Sachariassen e Jansen desenvolveram o primeiro microscópio composto aumento de 10 vezes Contudo o marco inicial foi quando em 1663 Hooke matemático e microscopista estudando cortiça em microscópio com aumento de apenas 100 a 200 vezes observou que esta era constituída por inúmeras pequenas caixas que chamou de células Seguiramse dois séculos de observações e experimentações para que fosse formulada a Teoria Celular ou seja a célula é a unidade da organização biológica todos os seres vivos são constituídos por células as menores unidades capazes de vida independente Muitos anos posteriores de pesquisa foram necessários para o conhecimento exato dos mecanismos celulares e a compreensão da hereditariedade Desde a época de Mendel a Citologia e a Genética passaram a colocar seus conhecimentos numa área comum mais tarde denominada citogenética A partir disso a citogenética expandiuse enormemente se inserindo em vários outros campos da Biologia como a Taxonomia a Bioquímica a Medicina Clínica e o Melhoramento Animal e Vegetal Guerra 1988 Além do mencionado as observações sobre o comportamento dos cromossomos na mitose meiose e fertilização principalmente na Alemanha no período de 1870 a 1890 forneceram um quadro geral quanto à 1 Pesquisadora Embrapa Trigo caixa postal 451 CEP 99001970 Passo Fundo RS sandracnptembrapabr Núcleo de Biotecnologia Aplicada a Cereais de Inverno Área de Citogenética e Genética Molecular 2 Bióloga Universidade de Passo Fundo UPF 3 Bióloga UPF Mestranda em Biologia Celular e Molecular Centro de Biotecnologia da UFRGS transmissão de geração à geração das estruturas fundamentais responsáveis pela herança Sendo a citogenética o estudo da genética por meio da citologia esta área da ciência engloba todo e qualquer estudo relacionado com o cromossomo isolado ou em conjunto condensado ou distendido tanto no que diz respeito à sua morfologia organização função e replicação quanto à sua variação e evolução É uma das fontes geradoras de questionamentos que impulsionaram a genética molecular embasando a tecnologia de ponta como a biotecnologia e a engenharia genética permanecendo junto às mesmas como um dos recursos de avaliação em várias pesquisas dessa natureza Sacchet 1999 A citogenética clássica desenvolveuse principalmente a partir do início do século passado e seu crescente progresso acompanhou o aprimoramento de técnicas e equipamentos de microscopia A análise cromossômica sempre foi um dos campos estimulantes da Citologia e da Genética tendo relação entre estudos taxonômicos e evolutivos bem como no melhoramento genético e na caracterização de germoplasma Apesar da revolução provocada pela Genética Molecular a análise cromossômica continua sendo a única maneira de observar o genoma de um eucarioto na forma de blocos individualizados de material genético fáceis de serem mensurados diferenciados em subunidades e manipulados de diferentes formas pois de nenhuma outra forma o material genético é tão claramente observado Com a introdução das técnicas moleculares os então chamados corpos corados da Citologia estão cada vez mais brilhantemente corados em cores e pseudocores das mais variadas A obtenção de bons resultados depende do perfeito domínio de diferentes técnicas de coloração Sendo assim a citogenética reúne informações obtidas sobre o material genético estampada em uma simples foto a uma estética própria da área capaz de impressionar iniciantes e profissionais experientes Guerra Souza 2002 Na citogenética molecular a análise cromossômica tem sido de grande importância para o entendimento da evolução genética e estabilidade cariotípica dos materiais estudados Por muito tempo a caracterização cromossômica foi baseada especialmente em parâmetros morfológicos como o tamanho dos braços posição dos centrômeros e localização das constrições secundárias Com a implantação de técnicas de bandeamento que permitem a visualização de blocos de coloração diferenciada bandas a caracterização cromossômica foi melhorada significativamente BrasileiroVidal Guerra 2002 Estrutura celular e seus componentes fundamentais A célula é a unidade da organização biológica capaz de usar substâncias obtidas do meio para manter e produzir o estado vivo A palavra núcleo vem do latim nucleus que significa caroço Esta estrutura foi descrita no século passado por Robert Brown O núcleo é o centro de controle das atividades celulares A presença do núcleo é a principal característica que distingue uma célula eucariótica de uma procariótica A maior parte da informação genética está acumulada no DNA do núcleo Esta estrutura além de conter a informação genética da célula também controla o metabolismo celular por meio da transcrição do DNA nos diferentes tipos de RNA Mesquita 1981 Junqueira Carneiro 2000 Nas últimas décadas estudos celulares têm produzido verdadeiras revoluções nas tecnologias e no conhecimento biológico Atualmente acreditase que o núcleo é o componente celular que mais desperta interesse na comunidade científica mundial Essa organela só pode ser visualizada com seus componentes carioteca cromatina e nucléolo íntegros durante a interfase mas células muito ativas apresentam núcleos volumosos e envoltório com grande quantidade de poros Paiva 2005 Durante a interfase fase em que o núcleo não está se dividindo há presença no seu interior de um ou mais corpos bem evidenciáveis nucléolos de um componente filamentoso ou granuloso cromatina onde se situa o DNA e de um componente fibroso ou de aparência amorfa matriz nuclear Durante a divisão celular a cromatina aparece sob a forma de unidades individualizadas que são então denominadas cromossomos Mello 2001 As primeiras idéias sobre cromossomos surgiram no final do século XIX quando estudos sobre mitose foram realizados Em 1866 Heckel propôs que o núcleo celular era o principal agente responsável pela divisão das células O primeiro cientista entretanto a descrever o processo da divisão celular mitótica de forma clara e objetiva foi o zoólogo alemão Anton Schneider em 1873 Kavalko 2003 Os cromossomos são estruturas complexas localizadas no núcleo das células compostos por DNA histonas e outras proteínas RNA e polissacarídios Eles contêm portanto os fatores genéticos ou genes das células Empregase geralmente o termo cromossomo mitótico para os cromossomos durante a mitose e o termo cromossomo interfásico para os cromossomos durante a interfase Os cromossomos têm forma e número definido para cada espécie sendo estes constituídos de um número variável de filamentos de DNA ligados a proteínas Mesquita 1981 O nucléolo compreende uma estrutura de forma esférica que existe no núcleo das células eucarióticas Geralmente cada núcleo possui um só nucléolo mas existem núcleos com dois ou mais nucléolos como por exemplo as células vegetais Esta estrutura é composta de uma porção granular e uma porção fibrilar ambas as partes são constituídas de RNA proteínas e fosfolipídios Em geral os nucléolos estão associados a um cromossomo que é chamado cromossomo organizador do nucléolo Especificamente neste cromossomo destacase uma constrição secundária em que está associada à Região Organizadora do Nucléolo RON ou do inglês NOR Nesta região estão localizados os genes responsáveis pela produção de rRNAs RNA ribossômico os quais constituem parte do nucléolo A sua importância está em produzir e processar os rRNAs necessários para sintetizar todas as proteínas da célula Os genes ribossômicos estão presentes em múltiplas cópias no genoma ou seja é um tipo de DNA repetitivo Mesquita 1981 O tamanho e forma do nucléolo dependem do estado funcional celular variando conforme a espécie e dentro de uma espécie de tecido para tecido e mesmo de célula para célula e também durante o ciclo celular Segundo descrições clássicas o nucléolo desaparece no fim da prófase reaparecendo na telófase junto aos sítios NORs A reformulação pósmitótica dos nucléolos vai depender da interação de duas entidades diferentes como as regiões NORs e os corpos prénucleolares que aparecem na telófase Mello 2001 Cromossomos e Morfologia Cromossômica Segundo Walker e Rapley 1999 por ocasião do início do século 20 o estudo microscópico de células em divisão mostrava que o número de cromossomos era constante no interior de células de mesma espécie mas variava em número geralmente entre as espécies Em uma célula os cromossomos variavam em tamanho e forma com duas cópias de cada tipo presentes em cada célula somática Também observouse que seu número dobrava para dois pares antes da divisão celular e que cada célula filha recebia um dos pares mantendo o número normal de cromossomos Em preparações coradas vistas à microscopia ótica os cromossomos aparentam possuir poucas características morfológicas definidas pelas quais podese diferenciar os membros de um conjunto uns dos outros Assim as características mais importantes são comprimento posição do centrômero e tamanho relativo dos braços presença de satélites caso haja destacados pelas constrições secundárias Burns 1986 De acordo com Mesquita 1981 no núcleo interfásico os cromossomos estão desespiralizados mas apresentam regiões condensadas que correspondem a heterocromatina Quando a célula vai se dividir os cromossomos se condensam existindo assim constrições Uma das regiões estranguladas que existe em todos os cromossomos constitui o centrômero ou cinetócoro sendo também chamada de estrangulamento primário Conforme revisão em Mesquita 1981 os centrômeros apresentam localizações diferentes nos cromossomos sendo que esta particularidade é usada para a classificação dos mesmos Os cromossomos telocêntricos são aqueles que o centrômero está localizado em uma extremidade Os submetacêntricos apresentam o centrômero localizado na região próxima ao centro dividindo os cromossomos em duas partes desiguais E no caso dos cromossomos metacêntricos o centrômero está localizado no centro dividindo o cromossomo em duas partes iguais Além desta característica os cromossomos têm em geral o aspecto de bastonetes de 02 a 2 m de diâmetro por 02 a 50 m de compr imento sendo separados por dois braços através do centrômero Conforme o tamanho relativo dos braços e a posição do centrômero diferenciamse vários tipos de cromossomos cromossomo em bastão retilíneo cromossomo em V de braços iguais cromossomo em V de braços desiguais cromossomos de braços muito curtos cromossomo puntiforme Na extremidade de um dos braços em alguns cromossomos podese ver uma pequena esfera presa por uma fina trabécula que é o satélite Berkaloff et al 1975 Conforme Berkaloff et al 1975 o estudo morfológico dos cromossomos mostra que existem no núcleo dois exemplares idênticos de cada cromossomo onde se apresentam em pares chamados cromossomos homólogos O número n de cromossomos é característico da espécie apresentando cada núcleo 2n cromossomos ou mais precisamente dois conjuntos idênticos de n cromossomos Portanto chamase haplóide o número n enquanto que diplóide o número 2n de cromossomos Em poucos cromossomos do conjunto cromossômico de cada espécie aparece outra constrição da cromátide denominada de constrição secundária situandose em mais de 80 no braço curto do cromossomo O satélite é o segmento cromossômico entre a constrição secundária e o telômero correspondendo a cerca de 10 da extensão cromossômica cujo tamanho é inferior a 1µm Porém em alguns casos ele pode medir vários micrômetros de extensão e compreender 40 ou mais do tamanho do cromossomo Já do ponto de vista funcional as três regiões cromossômicas que merecem maior destaque são o centrômero a constrição secundária e o telômero No centrômero tanto a constrição primária como a secundária são regiões parcialmente descondensadas com baixa densidade de DNA A constrição secundária é geralmente observada em ao menos um dos cromossomos do conjunto haplóide da cada espécie Os cromossomos que contêm essa constrição são geralmente vistos durante a prófase associados ao nucléolo ou seja na região organizadora do nucléolo Ao contrário das outras duas regiões o telômero não se distingue morfologicamente do restante do braço cromossômico não sendo possível determinar seu limite proximal ou a sua extensão embora se saiba que essa região possui propriedades especiais importantes para o funcionamento cromossômico Guerra 1988 Bandeamento Cromossômico O progresso na identificação positiva dos cromossomos se originou de uma rápida série de estudos que iniciaram em 1968 e 1969 com o trabalho de Caspersson e colaboradores na Suécia Em síntese a base desta mudança foi o fato de que muitos corantes que têm uma afinidade pelo DNA fluorescem sob a luz ultravioleta Após tratamento adequado com esses corantes cada cromossomo mostra zonas brilhantes e escuras ou bandas que são específicas em tamanho e localização para este cromossomo Esta característica é melhor visualizada na metáfase O descobrimento das técnicas de bandeamento cromossômico permitiu um significativo progresso na citogenética geral com a obtenção das imagens reproduzidas das bandas cromossômicas de diferentes tamanhos posição bem como um importante número de outros organismos tanto animais como vegetais Drets 2002 Segundo Guerra 1988 as técnicas de bandeamento cromossômico ampliaram os horizontes da citogenética pois a primeira aplicação foi no pareamento cromossômico e montagem de cariótipos em que cada par cromossômico apresenta um padrão distinto e bem característico de bandas Exemplo disso foi o sucesso considerável obtido com a quinacrina mostarda que produziu bandas fluorescentes de vários graus de brilho as quais foram denominadas de bandas Q No entanto há algumas limitações nesta técnica principalmente a não permanência da fluorescência mas esta dificuldade pode ser superada pela coloração com Giemsa seguidas do tratamento com tripsina ou tampão fosfato que produz um tipo único de bandas conhecidas como bandas G Burns 1986 Contudo a variação no método de Giemsa produz padrões de bandas que são o reverso das bandas G isto é as bandas G escuras são as bandas R claras e vice versa Na modificação do método de Giemsa o tratamento com álcalis proporciona às células uma coloração densa da região do centrômero e isto produz o bandeamento C que é específico para heterocromatina constitutiva A região centromérica que inclui o DNA repetitivo responde apenas à técnica de bandeamento C assim como qualquer região intercalar que contenha DNA repetitivo Burns 1986 Especificamente para as bandas C estas aparecem após o tratamento com soluções ácidas ou alcalinas seguindo o tratamento com solução salina 2SSC solução salina concentrada e coloração com Giemsa Carvalho ReccoPimentel 2001 Os bandeamentos Q G e C são especialmente importantes para a citogenética porque permitem identificar pequenas variações estruturais como deleções duplicações inversões geralmente relacionadas com determinadas anomalias do desenvolvimento Além disso é possível localizar exatamente a região do cromossomo diretamente afetada que seria impossível com a coloração convencional Semelhante em outras espécies essas técnicas têm possibilitado compreender melhor as alterações cromossômicas que se estabeleceram em cada cariótipo Guerra 1988 uma vez que as bandas aparecem por diferenças na distribuição de componentes cromatínicos ou mesmo por diferença na composição química da cromatina ao longo do cromossomo Hibridização in situ Os marcadores citogenéticos como os marcadores de DNA têm sua expressão independente das variações ambientais ou da ativação gênica tornandoos caracteres muito confiáveis Atualmente grande ênfase está sendo dada para a técnica de Hibridização In Situ HIS ou In Situ Hybridization ISH sendo que seu desenvolvimento marcou a transição da era da citogenética clássica para a era da citogenética molecular uma vez que esta técnica proporciona a interação entre conhecimento da biologia celular citogenética clássica e genética molecular Baseiase no fato do DNA ser formado por duas fitas complementares as quais podem ser facilmente desnaturadas e posteriormente renaturadas voltando ao estado de fita dupla Se no momento da renaturação das fitas de DNA houver fragmentos de DNA marcados sonda disponíveis os mesmos hibridizarão na região de homologia dentro da célula permitindo a sua localização precisa tanto em cromossomos como em núcleos interfásicos Com a utilização dos fluorocromos a técnica de HIS começou a ser chamada também por FISH Fluorescent In Situ Hybridization Revisão em Moraes 2007 Esta técnica foi descrita por Pardue Gall 1969 na qual utilizavam primeiramente sondas marcadas radioativamente Atualmente os protocolos usam sondas não radioativas que apresentam vantagens como a alta resolução menor tempo de processamento estabilidade e riscos menores na manipulação A marcação isotópica adiciona enzimas haptenos ou fluorocromos Os protocolos baseados na hibridação in situ não isotópica auxiliam na detecção de diferentes alvos na mesma célula por meio do uso de duas ou mais sondas marcadas diferencialmente Atualmente a detecção é realizada por fluorocromos moléculas que fluorescem quando excitadas por um comprimento de onda de luz ultravioleta específico Rogatto Rainho 2000 O desenvolvimento da técnica de hibridização in situ tem possibilitado a identificação de seqüências de DNA em cromossomos mitóticos ou meióticos em núcleos interfásicos e em fibras de cromatina estendidas Essa técnica envolve a preparação de lâminas o isolamento e a marcação da seqüência de DNA que se deseja localizar in situ e a sua hibridização nos cromossomos O DNA marcado funciona como uma sonda para encontrar as seqüências do DNA cromossomal complementar a ela chamada de DNA alvo Para visualizar as regiões hibridizadas com sonda é preciso associar um corante à sonda e um outro corante ao restante dos cromossomos BrasileiroVidal Guerra 2002 A detecção dessas seqüências de DNA tem originado grandes avanços na citogenética de plantas destacandose a construção de mapas físicos a investigação detalhada da estrutura cromossômica o acompanhamento da quantidade de cromatina introgredida em cruzamentos interespecíficos e a análise de pareamentos intergenômicos em plantas híbridas Através da hibridização in situ muitas seqüências de DNA têm sido visualizadas desde cópias únicas ou com baixo número de cópias até aquelas altamente repetitivas As primeiras seqüências detectadas foram as de DNA repetitivo que as unidades de repetição podem estar distribuídas em tandem ou dispersas ao longo do genoma As seqüências em tandem acontecem em blocos de centenas a milhares de cópias localizadas em um ou mais sítios de um dado genoma Essa categoria inclui DNA codificante como genes para rRNA e nãocodificante como DNA telomérico centromérico e outros A localização desses sítios tem fornecido importantes informações sobre a estrutura e a evolução dos genomas além de permitir a detecção de alterações cromossômicas estruturais BrasileiroVidal Guerra 2002 Segundo Guerra 1988 essa técnica envolve três etapas principais Na primeira etapa o DNA satélite de um indivíduo é isolado e o restante do DNA é colocado num meio contendo timidina tritiada para replicação O DNA sintetizado é uma cópia perfeita do satélite original que é radioativo Como o DNA é uma cadeia dupla após a replicação somente a cadeia recém sintetizada é marcada A mesma é isolada para ser utilizada posteriormente como indicador dos locais onde existe DNA satélite A segunda etapa consiste na preparação de lâminas com cromossomos do mesmo indivíduo que foi utilizado para a extração do DNA satélite Ao preparar a lâmina sem corar os cromossomos são tratados com soluções básicas ou com temperaturas elevadas que induzem a separação das duas cadeias de todo o DNA dos cromossomos A terceira etapa consiste na exposição desses cromossomos com as cadeias separadas à solução contendo as cadeias simples de DNA satélite marcado Esse DNA se pareia com o DNA satélite marcado dos cromossomos com seqüências de nucleotídeos complementares à sua revelando a localização exata desse tipo de DNA sendo assim a heterocromatina constitutiva do cromossomo A HIS pode também utilizar como sonda o DNA genômico total de uma espécie proporcionando a marcação de todos os seus cromossomos Esse tipo de hibridização é denominado de GISH Genomic In Situ Hybridization Neste caso podese distinguir os cromossomos oriundos de diferentes parentais em híbridos interespecíficos ou em espécies alopoliplóides bem como em estudos de similaridade genômica Brasileiro Vidal Guerra 2002 Destacase que as bibliotecas de DNA genômico representam uma importante fonte de seqüências para o mapeamento físico análise estrutural do genoma genômica comparativa e seqüenciamento do genoma além de ser uma fonte de seqüências únicas para o mapeamento cromossômico Hasterok et al 2006 As várias abordagens de hibridização in situ impostas por muitos laboratórios individuais demonstram a natureza do alvo de amostras a serem analisadas Todos os protocolos de ensaio devem levar em conta diversos fatores cruciais como sua sensibilidade poder de discriminação precisão e confiança As células ou tecidos devem ser prétratados de forma que mantenham a morfologia celular a integridade e a posição do alvo O tratamento deve tornar as células permeáveis o suficiente para que seja possível a entrada da sonda do ácido nucléico e a remoção de qualquer sonda não ligada Devem ser utilizados o tipo de seqüência e o comprimento apropriados de sonda de ácido nucléico DNARNA em fita simples ou dupla determinando a especificidade e sensibilidade do método Além do mencionado o tipo de marcação e o sistema de detecção devem ser cuidadosamente selecionados pois determinam o grau de sensibilidade facilidade de detecção e acurácia da quantificação do alvo que podem ser alcançados Portanto as condições de hibridização devem ser escolhidas cuidadosamente de acordo com a natureza da sonda e aplicação desejada Walker Rapley 1999 Referências Bibliográficas BERKALOFF A BOURGUET J FAVARD P GUINNEBAULT M Biologia e fisiologia celular São Paulo Ed Edgard Blücher 1975 287p BRASILEIROVIDAL A N GUERRA M Citogenética molecular em cereais In BRAMMER S P IORCZESKI E J Org Atualização em técnicas celulares e moleculares aplicadas ao melhoramento genético vegetal Passo Fundo Embrapa Trigo 2002 p 277298 BURNS G W Genética uma introdução à hereditariedade Rio de Janeiro Ed Guanabara 1986 558p CARVALHO H F RECCOPIMENTEL S M A célula 2001 São Paulo Ed Manole 2001 287p DRETS M Una saga citogenética el descubrimento de los métodos de bandeo cromosómico Significado y proyección biomédica Revista Médica del Uruguay v 18 p 107121 2002 GUERRA M SOUZA M J Como observar cromossomos Ribeirão Preto Ed Funpec 2002 131p Alopoliplóide um poliplóide que tem todos os conjuntos cromossômicos de espécies diferentes Burns 1986 GUERRRA M Introdução a citogenética geral Rio de Janeiro Ed Guanabara 1988 142p HASTEROK R MARASEK A DONNISON I S ARMSTEAD I THOMAS A KING I P WOLNY E IDZIAK D DRAPER J JENKINS G Alignment of the genomes of Brachypodium distachyon and temperate cereals and grasses using bacterial artificial chromosome landing with fluorescence in situ hybridization Genetics v173 p349362 2006 JUNQUEIRA L C CARNEIRO J Biologia celular e molecular Rio de Janeiro Ed Guanabara Koogan 2000 352p KAVALCO K A citogenética Disponível em httpwwwbiocienciaorgcombr Acesso em 20 de mar 2004 MELLO M L S Nucléolo In CARVALHO H F RECCOPIMENTEL S M A célula 2001 Campinas Ed Manole 2001p 101110 MESQUITA E C Citologia histologia e embriologia São Paulo Ed EPU 1981 134p Coleção Série Currículo de Estudos de Biologia MORAES A P Utilização de marcadores citomoleculares na identificação de cromossomos mitóticos em Citrus e Poncirus 2007 143 f Tese Doutorado em Biologia Vegetal Universidade Federal de Pernambuco Recife PAIVA H Núcleo A central de inteligência da célula Disponível em httpwwwcaradebiologiacombr Acesso em 26 de abr 2005 PARDUE M L GALL J G Molecular Hybridization to radioactive DNA to the DNA of cytological preparations Proceedings of the National Academy of Sciences v 61 p 600604 1969 ROGATTO S R RAINHO C A Citogenética molecular In ROGATTO S R Org Citogenética sem risco Biossegurança e garantia de qualidade 1ª ed Ribeirão Preto Funpec 2000 p 133152 SACCHET A M O F Variabilidade genética ponto de partida para o melhoramento de plantas In SACCHET A M O F Org Genética para que te quero Porto Alegre Ed UFRGS 1999 p 99104 WALKER M R RAPLEY R Guia de rotas na tecnologia do gene São Paulo Ed Atheneu 1999 334p Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Comitê de Publicações da Unidade Presidente Leandro Vargas Ana Lídia V Bonato José A Portella Leila M Costamilan Márcia S Chaves Maria Imaculada P M Lima Paulo Roberto V da S Pereira Rita Maria A de Moraes Expediente Referências bibliográficas Maria Regina Martins Editoração eletrônica Márcia Barrocas Moreira Pimentel BRAMMER S P ZANOTTO M ANDRÉIA CAVERZAN A Citogenética vegetal da era clássica à molecular Passo Fundo Embrapa Trigo 2007 9 p html Embrapa Trigo Documentos Online 85 Disponível em httpwwwcnptembrapabrbibliodopdo85htm