Extração e Sequenciamento de DNA Genética Médica - Dr Douglas Caldeira Giangarelli

Genética Médica Extração e Sequenciamento de DNA Prof Dr Douglas Caldeira Giangarelli Objetivos Compreender o processo básico da técnica de extração de DNA de material vegetal in natura Conhecer o processo pósextração de DNA Entender a técnica de PCR Conhecer a lógica do processo de sequenciamento de DNA Ácido desoxirribonucleico DNA O que é o DNA Ácido Desoxirribonucleico Pentose fosfato bases nitrogenados Unidade básica informacional do DNA é o gene Tamanho do genoma dos organismos é relativo a sua complexidade Vírus 5 10 pares de bases E Coli 4640 pb Humano 2900000 pb Ácido desoxirribonucleico DNA Onde se localizam as macromoléculas do DNA Núcleo das células eucariontes Qual a composição das membranas celulares Fonte httpsbitly2E7G1cU Lipoproteica e Fluida Bicamada fosfolipídica Glicoproteína Glicolipídios Colesterol Proteínas de membrana Integrais intrínsecas Periféricas extrínsecas Glicocálice Glicoproteínas glicolipídios Reconhecimento celular Fonte httpsbitly2BNJexW Tipos Celulares Célula procariota Célula eucariota animal Célula eucariota vegetal Morango 1 Primeiramente os alunos deverão escolher 3 morangos higienizalos retirar as folhas deixando somente o pseudofruto Procedimentos e instruções 01 2 Colocar o frasco do álcool absoluto na geladeira ou se possível armazenálo no freezer 3 Colocar os morangos dentro de um saco plástico limpo para macerálos com as mãos até que resultem em uma pasta homogênea Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Procedimento 01 Laminário Digital Vídeo 01 Protocolo de Extração de DNA vegetal Procedimentos e instruções 01 Procedimento 1 Extração de DNA vegetal morango 4 Transferir a pasta homogênea resultante da maceração dos morangos para um Becker 5 Becker misturar 150 mL de água destilada uma colher de sopa de detergente líquido neutro uma colher de chá de sal de cozinha Homogeneizar em baixa velocidade para não obter espuma Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Solução de lise Laminário Digital Vídeo 02 Protocolo de Extração de DNA vegetal Procedimentos e instruções 01 Solução de lise Maceração aumenta a superfície de contato com a solução de lise Função de rompimento da membrana plasmática e outras membranas O detergente permite a desestruturação das moléculas de lipídios das membranas biológicas O sal proporciona o ambiente favorável para a extração de DNA neutralizando a carga negativa dos grupos fosfatos dessa molécula Morangos possuem muito DNA 8 cópias de cada conjunto de cromossomos Macios e fáceis de homogeneizar Procedimentos e instruções 01 Procedimento 1 Extração de DNA vegetal morango 6 Adicionar 50 ml da solução tampão no Becker com a pasta de morango e homogeneizar vagarosamente 7 Incubar a solução por 30 minutos durante esse período homogeneizar lentamente a solução Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Laminário Digital Vídeo 03 Protocolo de Extração de DNA vegetal Procedimentos e instruções 01 Procedimento 1 Extração de DNA vegetal morango 8 Após a incubação filtrar a solução em um novo Becker 9 Inserir em um tubo de ensaio 15 mL da solução filtrada 10 Adicionar lentamente pela parede do tubo de ensaio 25 mL de etanol gelado sem misturar o álcool com a solução Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Procedimentos e instruções 01 Procedimento 1 Extração de DNA vegetal morango Precipitação do DNA Álcool gelado diminui a solubilidade do DNA com a ajuda do sal adicionado inicialmente O DNA menos solúvel em álcool formará um aglomerado que precipitará junto com outras moléculas Adicionar o álcool gelado em velocidade lenta auxilia na eficiência de precipitação do DNA Procedimentos e instruções 01 Procedimento 1 Extração de DNA vegetal morango 11 Aguardar a precipitação do DNA 12 Observar o material 13 Passo opcional Usar um palito para enrolar as moléculas de DNA Gire o palito na interface entre a solução e o álcool Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Fonte httpsbitly2GGztWa Laminário Digital Vídeo 04 Protocolo de Extração de DNA vegetal Procedimentos e instruções 01 Observe o DNA precipitado como uma nuvem esbranquiçada no fundo da fase alcoólica A pectina ficará no topo da fase alcoólica Diferenciação do DNA e da Pectina Fonte Rodrigues et al 2008 Disponível em httpbotanicaonlinecombrgeralarquivosbmaterial6pdf Acessado 26 Fev 2019 Procedimentos e instruções 01 Diferenciação do DNA e da Pectina Fonte Rodrigues et al 2008 Disponível em httpbotanicaonlinecombrgeralarquivosbmaterial 6pdf Acessado 26 Fev 2019 Podese observar bolhas na camada de pectina Pectina apresenta consistência de geleia quando retirada com um bastão de vidro pipeta Pasteur ou palito de dente Fonte Rodrigues et al 2008 Disponível em httpbotanicaonlinecombrgeralarquivosbmaterial 6pdf Acessado 26 Fev 2019 Fenol clorofórmio Métodos de Extração laboratoriais Fonte httpsbitly2tCN1cI Fonte httpsbitly2Vk4KSa Fonte httpsbitly2SZiIw4 ChelexR Fonte httpsebayto2VmE9nF Fonte httpsbitly2Tbgmtr Kit de extração Procedimento pósextração Teste de integridade DNA diluído Ficoll Azul de Bromofenol Gel de agarose 08 1 Corrida 100 V 90 minutos Fonte httpsbitly2KCjG9N Espectrofotometria quantificação Espectrofotometria Princípios Procedimento pósextração Fonte Skorpion87Wikimedia Commons Fonte 12KhomchatK Wikimedia Commons Fonte Viv Rolfe Wikimedia Commons Fonte 2Flickr Fonte de luz Colimador Prisma Cubeta com solução Detector Fenda seletora Leitor Fonte Adaptado de Kasvi Procedimento Sequenciamento de DNA Estrutura do DNA Pontes de hidrogênio entre bases complementares Dupla hélice Ponte de hidrogênio Adenina Guanina Timina Citosina Fonte Adaptado de CNX OpenStaxWikimedia Commons Replicação do DNA Fonte httpsbitly412odZk DESNATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO Reação em cadeia da polimerase PCR Fonte Adaptado de New England Biolabs Reagentes usados na PCR Água Tampão Iniciadores primers Nucleotídeos dNTPs Mg cofator DNA PolimeraseTaq DNA molde Procedimentos e instruções 02 Nucleotídeos A T C G Adenina Timina Citosina Guanina A T C G Relações de complementaridade DNA A T e C G Iniciar a cadeia a partir de um primer iniciador de cadeia Procedimentos e instruções 02 A T C C G T G Grupo A Grupo B T C G A A G T Iniciadores Iniciadores A T C G Adenina Timina Citosina Guanina A T C G Laminário Digital Vídeo 05 Simulação do processo de sequenciamento de DNA Procedimentos e instruções 02 A T C C G T G Iniciadores A T C G Adenina Timina Citosina Guanina A T C G Sorteio no saquinho da base complementar Papel branco sorteado adiciona o nucleotídeo na cadeia e repete a operação Papel colorido interrompe a síntese iniciar uma nova cadeia Marcador de pares de bases Simulações da atividade Fitas barbantes com tamanhos diferentes Ordenadas por tamanhos decrescente Simulando a separação dos fragmentos por eletroforese Procedimentos e instruções 02 Laminário Digital Vídeo 06 Simulação do processo de sequenciamento de DNA Sequenciamento de DNA Determinação da sequência nucleotídica do DNA ATGCs Método de Sanger técnica de desoxi método mais usado Dois tipos de marcadores nucleotídeos Normais deoxi polimerização Fluorescentes dideoxinucleotídeos interrompe a sequencia Fonte httpsbitly3zxhknf Sequenciamento de DNA técnica sequenciamento automático Fonte httpsbitly3m7WMP7 Eletroferograma Sequenciamento de DNA técnica sequenciamento automático Alinhamento das sequencias Resultados Como resultados dessa prática espera se que o aluno tenha aplicado as técnicas de extração de DNA e compreendido a importância de todas as etapas e a da utilização adequada dos reagentes Outro ponto de abordagem dessa pratica visa aproximar o conhecimento científico dos alunos de graduação tornando a técnica de sequenciamento de DNA compreensível Resultados Ao final da aula os alunos deverão elaborar um relatório básico que deverá conter os procedimentos realizados materiais e resultados obtidos O relatório deve conter Título Introdução sobre o tema da aula Objetivos Resultados Discussão dos resultados Conclusão