Relatorio Coloração de Gram: Metodologia, Resultados e Aplicações

TÓPICOS COLORAÇÃO DE GRAM INTRODUÇÃO O oque é falar brevemente sobre os corantes utilizados e as bactérias que foram realizadas a coloração Staphylococcus aureus e Escherichia coli OBJETIVO MATERIAIS alça bico de Bunsen fósforo amostra de bactéria liquida amostra na placa de petri h2o estéril corante violeta lugol álcool absoluto fucsina óleo de imersão lâmina e microscópio optico METODOLOGIA coleta da amostra fomos orientadas pelo professor DR Mauricio a usar as amostras já cultivadas deixadas pela técnica do laboratório nesta amostra havia crescido bactérias que era o ideal para realizarmos a coloração de gram CULTURA BACTERIANA SOLIDA NA PLACA DE PETRIconsiste em flambar a alça deixar esfriar perto do bico de Bunsen colocar uma gota de agua estéril na lamina com a ajuda da alça flambar novamente e alça e retirar um pouco de bactéria da placa de petri levar a amostra ate a a gota de agua depositada sobre a lamina e homogeneizar com movimentos circulares passar sobre o bico de bunsen como se tivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra CULTURA BACTERIANA EM MEIO LÍQUIDO consiste em flambar a alça deixar esfriar perto do bico de Bunsenmergulhar a alca no frasco com a amostraesfregar sobre a lamina com movimentos circulares passar sobre o bico de bunsen como se tivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra COLORAÇÃO DE GRAM como foi feitoa lamina com o esfregaço deve ser colocada em um suporte dentro da pia deve se cobrir a lamina com cristal violeta por 1 minuto logo sem seguida despejar um jato de agua corrente cobrese a lamina com lugol e deixe agir por 1 minuto lavar novamente a laminaEXPLICAR O PORQUE DO USO DOS CORANTES com a lamina lavada cobrese a mesma com álcool absoluto lavase com agua por ultimo cobrese a lamina com fucsina deixando agir por 30 segundos após a coloração a lamina e seca com papel toalha e lavada para o microscópio com 1 gota de óleo de imersão na objetiva de 1000 VISUALIZAÇÃO NO MICROSCÓPIO OPTICO RESULTADOS so foi possível visualizar a bactéria cultivada em placa de petri Staphylococcus aureus Não foi possível visualizar a bactéria de meio líquido Escherichia coli pois possivelmente era uma amostra antiga não estava preservada para uma boa avaliação DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERENCIAS 1 INTRODUÇÃO Em microbiologia a identificação de bactérias é uma etapa comumente trabalhada em laboratório e de extrema importância para se caracterizar e classificar as bactérias presentes em uma colônia MANHIQUE 2015 A coloração de Gram é um dos métodos de identificação mais empregados uma vez que a maioria das bactérias é corada por meio deste Em 1884 o médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram desenvolveu este método de coloração em que é possível diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com alguns tipos de corantes químicos PADILHA Entretanto este método não permite a observação de estruturas internas das células sendo então utilizado como uma forma de classificar as bactérias de forma geral como grampositivas e gramnegativas Este método consiste em três etapas primeiro tratar um esfregaço bacteriano fixado em uma lâmina com calor com os reagentes cristal violeta e lugol segundo descolorir a lamina com etanol e terceiro colorir novamente com fucsina básica As bactérias grampositivas adqquirem a coloração azul violeta enquanto que as gramnegativas tornamse avermelhadas SANTOS 2016 Nesta prática serão avaliadas as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli A primeira faz parte do grupo dos cocos grampositivos da família Staphylococcaceae que faz parte da microbiota humana e pode provocar desde infecções simples como furúnculos até doenças mais graves como pneumonia e meningite SANTOS 2007 Já a segunda tratase de uma bactéria gramnegativa da família Enterobacteriaceae patogênica em formato de bastonete que coloniza o trato gastrointestinal e w responsável por provocar infecções urinárias diarreia e colite hemorrágica DE JESUS MAMONA 2017 Assim com o intuito de estudar a técnica de coloração de Gram é suas aplicações estas duas bactérias foram escolhidas como modelo de estudo para representar os grupos grampositivos e gramnegativos 2 OBJETIVO 21 Objetivo Geral Identificar as bactérias presentes em uma colônia por meio do método de coloração de Gram 22 Objetivos Específicos Aprender os conceitos por meio do método de coloração de Gram Por em prática o método de coloração de bactérias Verificar a diferença de coloração das bactérias gramnegativas e gram positivas 3 MATERIAIS E METODOLOGIA 31 Reagentes e Vidrarias Alça Bico de Bunsen Fósforo Amostra de bactéria líquida Amostra na placa de petri Água estéril Corante violeta Lugol Álcool absoluto Fucsina Óleo de imersão Lâmina Microscópio óptico 32 MÉTODOS As amostras foram previamente cultivadas pela técnica do laboratório sendo então realizadas as etapas de coloração e identificação 321 Cultura Bacteriana Sólida Para esta etapa a alça metálica foi flambada e deixouse esta esfriar ao lado do bico de Bunsen Em seguida colocouse uma gota de água estéril na lâmina com a ajuda da alça A alça foi novamente esterilizada no fogo e com o auxílio desta retirouse um pouco de bactéria da placa de petri cultivada A amostra foi levada até a gota de água depositada sobre a lamina e homogeneizada com movimentos circulares A lâmina foi então passada sobre o bico de bunsen como se estivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra 322 Cultura Bacteriana Líquida Esterilizouse a alça no fogo e deixouse esfriar perto do bico de Bunsen Em seguida a alça foi mergulhada no frasco com a amostra e esfregada sobre a lâmina com movimentos circulares A lâmina foi então passada sobre o bico de bunsen como se tivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra assim como no procedimento anterior 323 Etapa da Coloração A lâmina com o esfregaço foi ser colocada em um suporte dentro da pia e coberta com cristal violeta por 1 minuto Logo em seguida despejouse um jato de água corrente cobriuse a lâmina com lugol e deixouse agir por 1 minuto A lâmina foi lavada novamente Com a lâmina lavada cobriuse a mesma com álcool absoluto e depois lavouse com água Por último cobrese a lâmina com fucsina deixando agir por 30 segundos Após a coloração a lâmina é seca com papel toalha Ao ser observada no microscópio pipetase uma gota de óleo de imersão sobre ela devido ao uso da objetiva de 100x 4 RESULTADOS 41 Visualização no Microscópio Óptico As lâminas foram analisadas em um Microscópio óptico utilizandose uma objetiva de ampliação de 1000x Quando analisada as amostras sólidas cultivadas em placa de Petri só foi possível observar apenas as colônias de Staphylococcus aureus Figura 1 Figura 1 Imagem das lâminas de Staphylococcus aureus coloridas pelo método de Gram As bactérias Staphylococcus aureus formam colônias em formato de cachos de uva e apresentam uma coloração azulvioleta como observado na primeira figura A Na figura 1B também são visíveis as estruturas de cocos azularroxeadas mas devido a maior abundância de colônias há maior impregnação do regente químico o que prejudica um pouco a identificação da lâmina Com relação a cultura líquida de bactérias não foi possível visualizar a bactéria pois possivelmente se tratava de uma amostra antiga Ainda assim é possível observar ampliando a imagem pouquíssimas bactérias em forma de bastonetes Figura 2 Imagem da lâmina de bactérias advindas da cultura líquida 5 DISCUSSÃO Existem diferentes graus de permeabilidade ao corante nas membranas celulares das bactérias devido a sua composição que pode variar de micro organismo para microorganismo Em bactérias grampositivas a sua parede celular é composta por uma espessa cadeia de peptidoglicanos um polímero constituído por açúcares e aminoácidos que é capaz de reter o cristal violeta Porém em bactérias gramnegativas esta camada de peptidoglicanos é mais fina e por isso não retém o cristal violeta em sua superfície como nos micro organismos grampositivos Desse modo após a lavagem o reagente violeta sai e o corante fucsina ou safranina então aderese a parede celular adquirindo a coloração avermelhada RODRIGUESSILVA 2014 Para poder observar as bactérias que possuem um tamanho de cerca de 02 a 15 μm foi utilizado uma objetiva de 100x que deve ser utilizada em conjunto com um óleo de imersão para que o índice de refração seja o mesmo para a lâmina de vidro e o óleo Possuindo o mesmo índice de refração os raios luminosos não se dispersam ao atravessarem o conjunto lâminaóleo e permite portanto a entrada de uma grande quantidade de luz na objetiva obtendo maior resolução DA SILVA E R DE SOUZA A S 2013 As bactérias Staphylococcus aureus foram obtidas da cultura sólida e conforme previsto na literatura para bactérias grampositivas apresentaram uma coloração azulvioleta e formato de cocos que formam colônias em forma de cachos Uma das amostras tinha uma alta densidade de microorganismos o que reteve um pouco do corante fucsina mas ainda foi possível visualizar a absorção azulvioleta pelas bactérias Infelizmente a cultura de Escherichia coli era muito antiga o que pode ter levado a morte das bactérias Mesmo assim foi possível visualizar algumas poucas bactérias em forma de bastonetes que provavelmente teriam uma coloração avermelhada 6 CONCLUSÃO Neste trabalho foi avaliado o método de coloração de Gram para identificação de bactérias Foi possível preparar as lâminas colorilas e observá las no microscópio óptico de modo que se pode aprender sobre como esta prática é feita nas rotinas de laboratório As bactérias Staphylococcus aureus obtidas da cultura sólida em placa de Petri ao passarem pelo método de coloração apresentaram uma coloração azul violeta caracterizandose como bactérias grampositivas Entretanto a cultura líquida de Escherichia coli não estava adequada para a análise e não foi possível ver a coloração devido ao número reduzido de bactérias Assim ao final desta prática percebese que o método de coloração de Gram é um meio confiável e eficiente para identificação e caracterização de bactérias e outros microorganismos e é de suma importância para análises laboratoriais principalmente quando se possui uma amostra desconhecida para avaliar 7 REFERÊNCIAS DE JESUS MAMONA Bruna Detecção e Identificação de Adesinas das Amostras de Escherichia coli Isoladas de Bezerro com Diarreia em Cruz das Almas BAHIA Anais dos Seminários de Iniciação Científica n 21 2017 MANHIQUE Lena et al Proficiência dos Laboratórios da Rede nacional de Moçambique na técnica de gram Revista Moçambicana de Ciências de Saúde v 2 n 1 p 33 2015 PADILHA Cátia Martins Leite Citologia como método para o diagnóstico da candidíase oral 2014 113 f Dissertação Mestrado em Patologia Programa de PósGraduação em Patologia Faculdade de Medicina Universidade Federal Fluminense Niterói 2014 RODRIGUESSILVA Caio et al Ocorrência e degradação de quinolonas por processos oxidativos avançados Química Nova v 37 p 868885 2014 SANTOS André Luis dos et al Staphylococcus aureus visitando uma cepa de importância hospitalar Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial v 43 p 413423 2007 SANTOS Sandna Larissa Freitas et al Desenvolvimento de uma cartilha educativa sobre coloração de gram em microbiologia no ensino superior Revista Expressão Católica Saúde v 1 n1 p 67 74 2016 DA SILVA Edilsa Rosa DE SOUZA Aparecida Sônia Introdução ao estudo da microbiologia teoria e prática Editora IFB Brasília DF 2013 1 INTRODUÇÃO Em microbiologia a identificação de bactérias é uma etapa comumente trabalhada em laboratório e de extrema importância para se caracterizar e classificar as bactérias presentes em uma colônia MANHIQUE 2015 A coloração de Gram é um dos métodos de identificação mais empregados uma vez que a maioria das bactérias é corada por meio deste Em 1884 o médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram desenvolveu este método de coloração em que é possível diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com alguns tipos de corantes químicos PADILHA Entretanto este método não permite a observação de estruturas internas das células sendo então utilizado como uma forma de classificar as bactérias de forma geral como grampositivas e gramnegativas Este método consiste em três etapas primeiro tratar um esfregaço bacteriano fixado em uma lâmina com calor com os reagentes cristal violeta e lugol segundo descolorir a lamina com etanol e terceiro colorir novamente com fucsina básica As bactérias grampositivas adqquirem a coloração azul violeta enquanto que as gramnegativas tornamse avermelhadas SANTOS 2016 Nesta prática serão avaliadas as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli A primeira faz parte do grupo dos cocos grampositivos da família Staphylococcaceae que faz parte da microbiota humana e pode provocar desde infecções simples como furúnculos até doenças mais graves como pneumonia e meningite SANTOS 2007 Já a segunda tratase de uma bactéria gramnegativa da família Enterobacteriaceae patogênica em formato de bastonete que coloniza o trato gastrointestinal e w responsável por provocar infecções urinárias diarreia e colite hemorrágica DE JESUS MAMONA 2017 Assim com o intuito de estudar a técnica de coloração de Gram é suas aplicações estas duas bactérias foram escolhidas como modelo de estudo para representar os grupos grampositivos e gramnegativos 2 OBJETIVO 21 Objetivo Geral Identificar as bactérias presentes em uma colônia por meio do método de coloração de Gram 22 Objetivos Específicos Aprender os conceitos por meio do método de coloração de Gram Por em prática o método de coloração de bactérias Verificar a diferença de coloração das bactérias gramnegativas e grampositivas 3 MATERIAIS E METODOLOGIA 31 Reagentes e Vidrarias Alça Bico de Bunsen Fósforo Amostra de bactéria líquida Amostra na placa de petri Água estéril Corante violeta Lugol Álcool absoluto Fucsina Óleo de imersão Lâmina Microscópio óptico 32 MÉTODOS As amostras foram previamente cultivadas pela técnica do laboratório sendo então realizadas as etapas de coloração e identificação 321 Cultura Bacteriana Sólida Para esta etapa a alça metálica foi flambada e deixouse esta esfriar ao lado do bico de Bunsen Em seguida colocouse uma gota de água estéril na lâmina com a ajuda da alça A alça foi novamente esterilizada no fogo e com o auxílio desta retirouse um pouco de bactéria da placa de petri cultivada A amostra foi levada até a gota de água depositada sobre a lamina e homogeneizada com movimentos circulares A lâmina foi então passada sobre o bico de bunsen como se estivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra 322 Cultura Bacteriana Líquida Esterilizouse a alça no fogo e deixouse esfriar perto do bico de Bunsen Em seguida a alça foi mergulhada no frasco com a amostra e esfregada sobre a lâmina com movimentos circulares A lâmina foi então passada sobre o bico de bunsen como se tivesse cortando a chama para secar e fixar a amostra assim como no procedimento anterior 323 Etapa da Coloração A lâmina com o esfregaço foi ser colocada em um suporte dentro da pia e coberta com cristal violeta por 1 minuto Logo em seguida despejouse um jato de água corrente cobriuse a lâmina com lugol e deixouse agir por 1 minuto A lâmina foi lavada novamente Com a lâmina lavada cobriuse a mesma com álcool absoluto e depois lavouse com água Por último cobrese a lâmina com fucsina deixando agir por 30 segundos Após a coloração a lâmina é seca com papel toalha Ao ser observada no microscópio pipetase uma gota de óleo de imersão sobre ela devido ao uso da objetiva de 100x 4 RESULTADOS 41 Visualização no Microscópio Óptico As lâminas foram analisadas em um Microscópio óptico utilizandose uma objetiva de ampliação de 1000x Quando analisada as amostras sólidas cultivadas em placa de Petri só foi possível observar apenas as colônias de Staphylococcus aureus Figura 1 Figura 1 Imagem das lâminas de Staphylococcus aureus coloridas pelo método de Gram As bactérias Staphylococcus aureus formam colônias em formato de cachos de uva e apresentam uma coloração azulvioleta como observado na primeira figura A Na figura 1B também são visíveis as estruturas de cocos azularroxeadas mas devido a maior abundância de colônias há maior impregnação do regente químico o que prejudica um pouco a identificação da lâmina Com relação a cultura líquida de bactérias não foi possível visualizar a bactéria pois possivelmente se tratava de uma amostra antiga Ainda assim é possível observar ampliando a imagem pouquíssimas bactérias em forma de bastonetes Figura 2 Imagem da lâmina de bactérias advindas da cultura líquida 5 DISCUSSÃO Existem diferentes graus de permeabilidade ao corante nas membranas celulares das bactérias devido a sua composição que pode variar de microorganismo para microorganismo Em bactérias grampositivas a sua parede celular é composta por uma espessa cadeia de peptidoglicanos um polímero constituído por açúcares e aminoácidos que é capaz de reter o cristal violeta Porém em bactérias gramnegativas esta camada de peptidoglicanos é mais fina e por isso não retém o cristal violeta em sua superfície como nos microorganismos grampositivos Desse modo após a lavagem o reagente violeta sai e o corante fucsina ou safranina então aderese a parede celular adquirindo a coloração avermelhada RODRIGUESSILVA 2014 Para poder observar as bactérias que possuem um tamanho de cerca de 02 a 15 μm foi utilizado uma objetiva de 100x que deve ser utilizada em conjunto com um óleo de imersão para que o índice de refração seja o mesmo para a lâmina de vidro e o óleo Possuindo o mesmo índice de refração os raios luminosos não se dispersam ao atravessarem o conjunto lâminaóleo e permite portanto a entrada de uma grande quantidade de luz na objetiva obtendo maior resolução DA SILVA E R DE SOUZA A S 2013 As bactérias Staphylococcus aureus foram obtidas da cultura sólida e conforme previsto na literatura para bactérias grampositivas apresentaram uma coloração azulvioleta e formato de cocos que formam colônias em forma de cachos Uma das amostras tinha uma alta densidade de microorganismos o que reteve um pouco do corante fucsina mas ainda foi possível visualizar a absorção azulvioleta pelas bactérias Infelizmente a cultura de Escherichia coli era muito antiga o que pode ter levado a morte das bactérias Mesmo assim foi possível visualizar algumas poucas bactérias em forma de bastonetes que provavelmente teriam uma coloração avermelhada 6 CONCLUSÃO Neste trabalho foi avaliado o método de coloração de Gram para identificação de bactérias Foi possível preparar as lâminas colorilas e observálas no microscópio óptico de modo que se pode aprender sobre como esta prática é feita nas rotinas de laboratório As bactérias Staphylococcus aureus obtidas da cultura sólida em placa de Petri ao passarem pelo método de coloração apresentaram uma coloração azulvioleta caracterizandose como bactérias grampositivas Entretanto a cultura líquida de Escherichia coli não estava adequada para a análise e não foi possível ver a coloração devido ao número reduzido de bactérias Assim ao final desta prática percebese que o método de coloração de Gram é um meio confiável e eficiente para identificação e caracterização de bactérias e outros microorganismos e é de suma importância para análises laboratoriais principalmente quando se possui uma amostra desconhecida para avaliar 7 REFERÊNCIAS DE JESUS MAMONA Bruna Detecção e Identificação de Adesinas das Amostras de Escherichia coli Isoladas de Bezerro com Diarreia em Cruz das Almas BAHIA Anais dos Seminários de Iniciação Científica n 21 2017 MANHIQUE Lena et al Proficiência dos Laboratórios da Rede nacional de Moçambique na técnica de gram Revista Moçambicana de Ciências de Saúde v 2 n 1 p 33 2015 PADILHA Cátia Martins Leite Citologia como método para o diagnóstico da candidíase oral 2014 113 f Dissertação Mestrado em Patologia Programa de PósGraduação em Patologia Faculdade de Medicina Universidade Federal Fluminense Niterói 2014 RODRIGUESSILVA Caio et al Ocorrência e degradação de quinolonas por processos oxidativos avançados Química Nova v 37 p 868885 2014 SANTOS André Luis dos et al Staphylococcus aureus visitando uma cepa de importância hospitalar Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial v 43 p 413423 2007 SANTOS Sandna Larissa Freitas et al Desenvolvimento de uma cartilha educativa sobre coloração de gram em microbiologia no ensino superior Revista Expressão Católica Saúde v 1 n1 p 67 74 2016 DA SILVA Edilsa Rosa DE SOUZA Aparecida Sônia Introdução ao estudo da microbiologia teoria e prática Editora IFB Brasília DF 2013