Relatório de Práticas de Biologia Molecular

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS TÍTULO DA AULA Ligação de ácidos nucleicos Objetivo da aula Componentes utilizados na reação de ligação e sua função TÍTULO DA AULA Transformação de DNA Princípio da técnica Objetivo da aula Metodologia empregada e seu princípio Resultados e interpretação dos resultados baseado no vetor utilizado TÍTULO DA AULA Seleção de clones recombinantes técnica de tooht pick Princípio da técnica Objetivo da aula Resultados e interpretação dos resultados TÍTULO DA AULA Southern blot Princípio da técnica Componentes utilizados na metodologia e sua função Resultados e interpretação dos resultados TÍTULO DA AULA Expressão de proteínas recombinantes Objetivo da aula Componentes utilizados para a expressão de proteínas recombinantes e sua função Resultados e interpretação dos resultados RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS TÍTULO DA AULA Ligação de ácidos nucleicos Objetivo da aula A primeira aula teve como objetivo entender quais são os componentes e mecanismos das reações de ligação dos ácidos nucleicos com ênfase na aplicação para a clonagem molecular e outras técnicas de biologia molecular como reparo de DNA replicação e recombinação genética Componentes utilizados na reação de ligação e sua função Foram utilizados fragmento do ácido nucleico DNA e RNA enzima DNA ligase enzima que catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre os fragmentos de DNA ATPNAD fonte de energia para a reação acontecer íons de magnésio são cofatores para a ação da DNA ligase e enzimas de restrição gera fragmentos com extremidades compatíveis TÍTULO DA AULA Transformação de DNA Princípio da técnica A técnica transformação do DNA é utilizada para incorporar um DNA exógeno em uma célula hospedeira geralmente utiliza uma bactéria principalmente a Escherichia coli permitindo a expressão de novos genes Objetivo da aula O principal objetivo foi compreender o processo de transformação de DNA o princípio e a aplicação em experimentos de clonagem molecular incluindo a interpretação dos resultados obtidos Metodologia empregada e seu princípio A transformação bacteriana foi realizada utilizando o método de choque térmico ou eletroporação também chamado de método de transformação por cloreto de cálcio onde as células são preparadas para tornálas competentes ao tratamento com cloreto de cálcio os íons conseguem neutralizar as cargas negativas da membrana da bactéria e do DNA diminuindo a repulsão Em seguida é aplicado um choque térmico 37 a 42C gerando poros na membrana dessa forma o DNA consegue entrar na célula A transformação bacteriana também pode ser realizada empregando a técnica de eletroporação onde as bactérias sofrem choque elétrico levando a formação de poros permitindo a entrada do DNA plasmidial Resultados e interpretação dos resultados baseado no vetor utilizado Figura 1 Resultado da aula de transformação de DNA A imagem acima mostra um gel de eletroforese em agarose 10 corado com brometo de etídeo visualizados os produtos de PCR das colônias de células transformadas sendo observado que a transformação da Escherichia coli com o plasmídeo pQE30 contendo o gene gfp foi eficaz TÍTULO DA AULA Seleção de clones recombinantes técnica de tooth pick Princípio da técnica A técnica tem como objetivo a seleção e isolamento de clones recombinantes após a transformação bacteriana Para isso as bactérias transformadas contendo o plasmídeo recombinante é cultivado em placas de petri em meio ágar com um antibiótico e na presença de um indicador de seleção este indica a presença do gene de interesse Dessa forma os clones recombinantes que contém o DNA inserido serão identificados a partir do indicador de seleção resultando em uma coloração distinta Objetivo da aula Os objetivos foram compreender o princípio da técnica de tooth pick aprender a realizar e interpretar os resultados obtidos identificando os clones recombinantes Resultados e interpretação dos resultados Figura 2 Resultado da técnica de tooth pick A eletroforese em gel de agarose foi realizada para comparar o plasmídeo sem inserto pQE30 e os clones de Ecoli com plasmídeo recombinante No controle é observado apenas uma única banda indicando o plasmídeo sem inserto em 1 a 12 é observado as colônias de Ecoli as colônias que possuem o plasmídeo com o inserto apresentam duas bandas no gel sendo uma do plasmídeo e a outra do inserto Sendo os clones com duas bandas chamados de clones recombinantes pois a inserção do gene gfp ocorreu TÍTULO DA AULA Southern blot Princípio da técnica A técnica tem como objetivo detectar sequências específicas de DNA em uma amostras baseado na hibridização das moléculas O DNA é digerido por enzimas de restrição formando fragmentos em diferentes tamanho em seguida é separado em eletroforese de gel de agarose Posteriormente o DNA é desnaturado in situ formando fitas simples e transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose sendo imobilizados através da radiação UV para membrana de nylon e pelo calor para membrana de nitrocelulose A membrana é adicionada no gel com um tampão de salina por capilaridade o tampão passa através do gel levando a transferência dos fragmentos de DNA para a membrana Uma sonda marcada com radioatividade ocorrendo a hibridização com o DNA revelando qual fragmento de restrição contém o gene clonado Componentes utilizados na metodologia e sua função São utilizados as enzimas de restrição BamHI e HindIII com função de cortar fragmentos do DNA gel de agarose utilizado na eletroforese para separar os fragmentos por tamanho membrana de nylon ou nitrocelulose é o local onde o DNA é transferido para hibridização sonda de DNA tem como função marcar o complemento por fluorescência e marcador de massa molecular é utilizado como um controle para os tamanhos do fragmento do DNA servindo para determinar o tamanho Resultados e interpretação dos resultados Figura 3 Resultado da aula de Southern blot No poço 2 pQE 30 digerido com endonucleases a digestão pelas Bam HI e Hind III gerou uma única banda linear confirmando o tamanho esperado do plasmídeo indicando que a sonda hibridiza com a sequência do plasmídeo pQE30 indicando a presença do plasmídeo com o gene de interesse TÍTULO DA AULA Expressão de proteínas recombinantes Objetivo da aula O objetivo foi compreender o processo de expressão de proteínas recombinantes entendendo como o gene de interesse é clonado e expresso para a produção de proteínas recombinantes Além de interpretar os resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida e Western blot Componentes utilizados para a expressão de proteínas recombinantes e sua função pQE30 é o plasmídeo vetor que transporta o gene gfp na célula bacteriana IPT é o promotor induzível com função de controlar a expressão do gene Escherichia coli é a célula bacteriana transformada Eletroforese em gel de poliacrilamida com função de separar as proteínas com base no tamanho para verificar a pureza da proteína recombinante Western blot identificação da proteína recombinante usando o anticorpo monoclonal antihistidina Resultados e interpretação dos resultados Figura 4 Resultado da aula sobre a expressão de proteínas recombinantes No gel de poliacrilamida os poços que não apresentavam indução por IPTG a expressão de gfp não foi observada as bandas corresponder a proteína da células Ecoli sem expressão significativa de gfp enquanto que nos poços cuja cultura foi induzida com IPTG observase a expressão da proteína recombinante A expressão da proteína gfp recombinante foi confirmada através de um Western blot utilizando um anticorpo monoclonal antihistidina Os resultados mostraram que as colônias transformadas com o plasmídeo recombinante expressaram a proteína Gfp após indução com IPTG nos poços 24 e 6 RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS TÍTULO DA AULA Ligação de ácidos nucleicos Objetivo da aula A primeira aula teve como objetivo entender quais são os componentes e mecanismos das reações de ligação dos ácidos nucleicos com ênfase na aplicação para a clonagem molecular e outras técnicas de biologia molecular como reparo de DNA replicação e recombinação genética Componentes utilizados na reação de ligação e sua função Foram utilizados fragmento do ácido nucleico DNA e RNA enzima DNA ligase enzima que catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre os fragmentos de DNA ATPNAD fonte de energia para a reação acontecer íons de magnésio são cofatores para a ação da DNA ligase e enzimas de restrição gera fragmentos com extremidades compatíveis TÍTULO DA AULA Transformação de DNA Princípio da técnica A técnica transformação do DNA é utilizada para incorporar um DNA exógeno em uma célula hospedeira geralmente utiliza uma bactéria principalmente a Escherichia coli permitindo a expressão de novos genes Objetivo da aula O principal objetivo foi compreender o processo de transformação de DNA o princípio e a aplicação em experimentos de clonagem molecular incluindo a interpretação dos resultados obtidos Metodologia empregada e seu princípio A transformação bacteriana foi realizada utilizando o método de choque térmico ou eletroporação também chamado de método de transformação por cloreto de cálcio onde as células são preparadas para tornálas competentes ao tratamento com cloreto de cálcio os íons conseguem neutralizar as cargas negativas da membrana da bactéria e do DNA diminuindo a repulsão Em seguida é aplicado um choque térmico 37 a 42C gerando poros na membrana dessa forma o DNA consegue entrar na célula A transformação bacteriana também pode ser realizada empregando a técnica de eletroporação onde as bactérias sofrem choque elétrico levando a formação de poros permitindo a entrada do DNA plasmidial Resultados e interpretação dos resultados baseado no vetor utilizado Figura 1 Resultado da aula de transformação de DNA A imagem acima mostra um gel de eletroforese em agarose 10 corado com brometo de etídeo visualizados os produtos de PCR das colônias de células transformadas sendo observado que a transformação da Escherichia coli com o plasmídeo pQE30 contendo o gene gfp foi eficaz TÍTULO DA AULA Seleção de clones recombinantes técnica de tooth pick Princípio da técnica A técnica tem como objetivo a seleção e isolamento de clones recombinantes após a transformação bacteriana Para isso as bactérias transformadas contendo o plasmídeo recombinante é cultivado em placas de petri em meio ágar com um antibiótico e na presença de um indicador de seleção este indica a presença do gene de interesse Dessa forma os clones recombinantes que contém o DNA inserido serão identificados a partir do indicador de seleção resultando em uma coloração distinta Objetivo da aula Os objetivos foram compreender o princípio da técnica de tooth pick aprender a realizar e interpretar os resultados obtidos identificando os clones recombinantes Resultados e interpretação dos resultados Figura 2 Resultado da técnica de tooth pick A eletroforese em gel de agarose foi realizada para comparar o plasmídeo sem inserto pQE30 e os clones de Ecoli com plasmídeo recombinante No controle é observado apenas uma única banda indicando o plasmídeo sem inserto em 1 a 12 é observado as colônias de Ecoli as colônias que possuem o plasmídeo com o inserto apresentam duas bandas no gel sendo uma do plasmídeo e a outra do inserto Sendo os clones com duas bandas chamados de clones recombinantes pois a inserção do gene gfp ocorreu TÍTULO DA AULA Southern blot Princípio da técnica A técnica tem como objetivo detectar sequências específicas de DNA em uma amostras baseado na hibridização das moléculas O DNA é digerido por enzimas de restrição formando fragmentos em diferentes tamanho em seguida é separado em eletroforese de gel de agarose Posteriormente o DNA é desnaturado in situ formando fitas simples e transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose sendo imobilizados através da radiação UV para membrana de nylon e pelo calor para membrana de nitrocelulose A membrana é adicionada no gel com um tampão de salina por capilaridade o tampão passa através do gel levando a transferência dos fragmentos de DNA para a membrana Uma sonda marcada com radioatividade ocorrendo a hibridização com o DNA revelando qual fragmento de restrição contém o gene clonado Componentes utilizados na metodologia e sua função São utilizados as enzimas de restrição BamHI e HindIII com função de cortar fragmentos do DNA gel de agarose utilizado na eletroforese para separar os fragmentos por tamanho membrana de nylon ou nitrocelulose é o local onde o DNA é transferido para hibridização sonda de DNA tem como função marcar o complemento por fluorescência e marcador de massa molecular é utilizado como um controle para os tamanhos do fragmento do DNA servindo para determinar o tamanho Resultados e interpretação dos resultados Figura 3 Resultado da aula de Southern blot No poço 2 pQE 30 digerido com endonucleases a digestão pelas Bam HI e Hind III gerou uma única banda linear confirmando o tamanho esperado do plasmídeo indicando que a sonda hibridiza com a sequência do plasmídeo pQE30 indicando a presença do plasmídeo com o gene de interesse TÍTULO DA AULA Expressão de proteínas recombinantes Objetivo da aula O objetivo foi compreender o processo de expressão de proteínas recombinantes entendendo como o gene de interesse é clonado e expresso para a produção de proteínas recombinantes Além de interpretar os resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida e Western blot Componentes utilizados para a expressão de proteínas recombinantes e sua função pQE30 é o plasmídeo vetor que transporta o gene gfp na célula bacteriana IPT é o promotor induzível com função de controlar a expressão do gene Escherichia coli é a célula bacteriana transformada Eletroforese em gel de poliacrilamida com função de separar as proteínas com base no tamanho para verificar a pureza da proteína recombinante Western blot identificação da proteína recombinante usando o anticorpo monoclonal antihistidina Resultados e interpretação dos resultados Figura 4 Resultado da aula sobre a expressão de proteínas recombinantes No gel de poliacrilamida os poços que não apresentavam indução por IPTG a expressão de gfp não foi observada as bandas corresponder a proteína da células Ecoli sem expressão significativa de gfp enquanto que nos poços cuja cultura foi induzida com IPTG observase a expressão da proteína recombinante A expressão da proteína gfp recombinante foi confirmada através de um Western blot utilizando um anticorpo monoclonal antihistidina Os resultados mostraram que as colônias transformadas com o plasmídeo recombinante expressaram a proteína Gfp após indução com IPTG nos poços 24 e 6