Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial - Livro Didático Digital

Livro Didático Digital Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 7th International Conference of the Asian Society for Environmental Chemistry October 1520 2023 Selçuklu Congress Center Konya Turkey Diretor Executivo DAVID LIRA STEPHEN BARROS Gerente Editorial CRISTIANE SILVEIRA CESAR DE OLIVEIRA Projeto Gráfico TIAGO DA ROCHA Autoria NATÁLIA GINDRI FIORENZA MARIA PAULA DE SOUZA SAMPAIO AUTORIA Natália Fiorenza Sou formada em Ciências Biológicas com mestrado e doutorado na área de Ciências da Saúde Passei por diferentes laboratórios de pesquisa publicando trabalhos científicos e participando de muitos Congressos e Cursos em diferentes áreas de saúde e educação Fui professora universitária e tutora durante 4 anos do curso de medicina onde me conectei com minha paixão pela docência e por metodologias ativas de ensino Sou ávida por aprender e ensinar e por trocar conhecimentos quer na área científicoacadêmica quer na área de desenvolvimento humano e autoconhecimento Recebi com muita alegria o convite da Editora Telesapiens para integrar seu elenco de autores independentes pois tenho como propósito transmitir aquilo que sei e auxiliar outras pessoas no início de sua jornada profissional Estarei com você nessa caminhada de muito estudo e trabalho Conte comigo Maria Paula Sampaio Sou graduada em Biomedicina habilitada em Citopatologia Além da prática com a minha habilitação pude realizar um curso avançado em Citopatologia CérvicoVaginal Atualmente sou voluntária de um projeto de pesquisa na Fundação Oswaldo Cruz FIOCRUZ sobre Patologia Mamária Comparada onde fiz iniciação científica por um ano Em minha jornada de estudante pude participar ativamente de congressos e projetos de estudo e sempre tive uma paixão por ensinar Junto com Natália pretendo transmitir todo o ensinamento que obtive até aqui buscando sempre aprender mais Estamos juntos nesse aprendizado ICONOGRÁFICOS Olá Esses ícones irão aparecer em sua trilha de aprendizagem toda vez que OBJETIVO para o início do desenvolvimento de uma nova compe tência DEFINIÇÃO houver necessidade de se apresentar um novo conceito NOTA quando forem necessários obser vações ou comple mentações para o seu conhecimento IMPORTANTE as observações escritas tiveram que ser priorizadas para você EXPLICANDO MELHOR algo precisa ser melhor explicado ou detalhado VOCÊ SABIA curiosidades e indagações lúdicas sobre o tema em estudo se forem necessárias SAIBA MAIS textos referências bibliográficas e links para aprofundamen to do seu conheci mento REFLITA se houver a neces sidade de chamar a atenção sobre algo a ser refletido ou dis cutido sobre ACESSE se for preciso aces sar um ou mais sites para fazer download assistir vídeos ler textos ouvir podcast RESUMINDO quando for preciso se fazer um resumo acumulativo das últi mas abordagens ATIVIDADES quando alguma atividade de au toaprendizagem for aplicada TESTANDO quando o desen volvimento de uma competência for concluído e questões forem explicadas SUMÁRIO Princípios da Eletroforese 12 Eletroforese em Gel 12 Gel de Agarose 16 Equipamentos e Reagentes Necessários 18 Taxa de Migração do DNA Através do Gel de Agarose 19 Eletroforese em Gel de Poliacrilamina 19 SDS Page 19 Blotting com Anticorpo 20 Reação em Cadeia da Polimerase PCR 22 Reagentes Necessários para a Reação 23 PCR 24 RTPCR 25 PCR em Tempo Real 26 Multiplex PCR27 Nested PCR 27 Outros Tipos de PCR 28 PCR Assimétrica 28 PCR de Montagem Polymerase Cycling Assembly PCA 29 PCR Touchdown 29 PCR Digital 29 PCR Suicide 30 VNTR PCR VariAble Number of Tandem Repeats 30 DNA Recombinante e Produção de Material Genético Quimérico 32 Clonagem 32 Biblioteca de DNA 34 Vetor Plasmideal 35 Enzimas de Restrição 41 Transfecção 43 Proteína Recombinante 44 Detecção de DNA 46 Classificação das Sondas 46 Condições que Influenciam a Hibridização 49 Marcadores 51 Síntese de Sondas 52 RNA AntiSenso 53 Abstract Volume Call for Posters All participants are welcome to participate the poster presentation in the conference Please prepare your posters in size of 90 cm x 120 cm Poster presentations will be scheduled parallel with oral sessions 9 UNIDADE 02 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 10 INTRODUÇÃO Todos os seres são formados por estruturas moleculares Isso transforma o tema em algo de grande interesse para nós Nesta disciplina estudaremos de modo geral a organização e a função de diversas moléculas desde as que formam o genoma humana até as que estão envolvidas com a síntese de proteínas Nosso intuito mais fundamental será apresentar a você caro aluno uma visão abrangente da biologia molecular Entendeu Ao longo desta unidade letiva você vai mergulhar neste universo Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 11 OBJETIVOS Seja muito bemvindo à Unidade 2 Nosso objetivo é auxiliar você no desenvolvimento das seguintes competências profissionais até o término desta etapa de estudos 1 Aplicar a técnica de eletroforese em gel de agarose e de poliacrilamida assim como identificar as diferenças existentes nos géis e nos reagentes utilizados diagnosticando e prevenindose contra os principais erros que podem ocorrer 2 Compreender as técnicas de amplificação do DNA e RNA os reagentes utilizados e suas funções os diferentes tipos de técnica e sua importância no diagnóstico laboratorial 3 Entender como se aplica a técnica de DNA recombinante compreendendo os princípios dessa técnica e sua utilização no tratamento da diabetes 4 Identificar os princípios da hibridização de cadeias oligonucleotídicas a partir do princípio da interação Watson Crick e as técnicas em Biologia Molecular que utilizam sondas como forma de diagnóstico Então Preparado para uma viagem rumo ao conhecimento Ao trabalho Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 12 Princípios da Eletroforese OBJETIVO Este capítulo tem o objetivo de introduzir ao leitor a técnica de eletroforese utilizada tanto em rotina laboratorial de diagnóstico quanto em ambiente de trabalhos científicos Serão abordados conceitos da eletroforese suas aplicações e os tipos de géis utilizados O entendimento desta técnica é muito importante para os próximos capítulos Portanto vamos começar o aprendizado Eletroforese em Gel Assim como a descoberta da estrutura do DNA deu brecha para a descoberta de muitos outros processos e moléculas como o RNA o processo replicativo transcricional e a conversão de informação em pares de bases em aminoácidos tradução também deu abertura para as novas técnicas de isolamentos das macromoléculas tão importantes para o organismo humano e de qualquer outro ser vivo DNA RNA e proteínas VOCÊ SABIA A técnica da eletroforese veio no ano de 1964 quando um grupo de cientistas decidiram estudar a mobilidade do DNA quando submetido a uma voltagem elétrica Os resultados desses estudos levaram ao estabelecimento da eletroforese que é a técnica que utiliza a carga elétrica das macromoléculas para a separação das mesmas macromoléculas através do seu peso molecular A densidade dos materiais sempre foi uma característica física avaliada quando o assunto era a separação de substâncias como água e óleo Entretanto como separar moléculas com a mesma densidade Imaginemos uma solução contendo vários fragmentos de DNA de Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 13 mesma densidade porém de tamanhos diferentes A molécula de DNA possui um arcabouço contendo fosfato em sua estrutura como já foi discutido na Unidade 1 portanto sendo carregada negativamente Essa é a característica que será explorada na eletroforese A técnica consiste em fazer com que as amostras corram em um gel podendo ser de acrilamida ou de agarose de um polo ao outro no caso do DNA do negativo ao positivo Entretanto não será somente a característica elétrica da molécula que irá influenciar na corrida da amostra Nessa mesma solução hipotética temos material genético extraído de uma amostra humana Nessa amostra o investigador quer identificar um gene específico dentro de um grande genoma humano Simplesmente correr a amostra tendo como base a característica elétrica da molécula não vai fazêlo encontrar o seu gene de interesse É para isso que são necessárias etapas anteriores à eletroforese como a Reação em Cadeia da Polimerase PCR ou Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição RFLP que serão discutidas posteriormente EXPLICANDO MELHOR Essas técnicas permitem que o pesquisador isole o material genético de interesse podendo assim ser separado pela técnica de eletroforese de acordo com seu tamanho da cadeia ou peso molecular No caso da PCR o trecho genético específico que fora amplificado vai correr o gel invadindo os poros do gel que nesse caso será de agarose porque durante a amplificação aquele trecho em específico será replicado em milhares de cópias até que gere somente cópias daquela região gênica alvo em específico Assim uma região específica tem um peso molecular muito diferente de um genoma inteiro ou seja essa região acaba migrando o gel até parar em um ponto bem distante de sua origem e que esteja equivalente a um peso molecular Já no caso do RFLP o procedimento gerará fragmentos de diferentes tamanhos que durante a corrida da eletroforese irão migrar a pontos Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 14 distintos ou semelhantes a depender do peso molecular interligados ao tamanho da fita dupla ou simples de cada fragmento gerado Em conjunto com as amostras a serem analisadas toda corrida precisa ter uma comparação algo que informe aproximadamente o tamanho ou peso molecular que aquela amostra corrida tem Portanto é utilizado um marcador para peso molecular que vai indicando bandas as quais possuem um determinado peso molecular que vai variar de acordo com o gel Os géis de agarose e poliacrilamida possuem suas especificidades quanto à corrida No gel de agarose a corrida é utilizada para identificar fragmentos longos de DNA 50 20000 pares de bases ou outras macromoléculas de grande tamanho Já o gel de poliacrilamida possui uma alta capacidade resolutiva ao poder separar cadeias diferindo de um par de base ou fragmentos contendo 5 500 pares de base O gel de poliacrilamida é mais utilizado para separar proteínas de diferentes pesos moleculares Apesar do gel de agarose ser capaz de separar trechos de DNA contendo milhares de bases pareadas ela é incapaz de separar DNAs acima de 20 30 kb Essas cadeias altamente longas não podem penetrar nos poros de agarose sendo assim elas ficam serpenteando seu caminho pela matriz com uma extremidade liderando o caminho e a outra seguindo NOTA Moléculas acima desse peso migram de forma semelhante e são incapazes de serem separadas na agarose Entretanto a eletroforese em gel de agarose ganhou uma modificação para que essas moléculas grandes sejam separadas a partir do mesmo princípio do campo eletromagnético porém utilizandoo em formas de pulsos elétricos alternados Ao aplicar a mudança da orientação do campo elétrico as moléculas maiores de DNA serão forçadas a se reorientarem de forma paralela ao campo elétrico de nova orientação antes de migrarem em direção ao polo positivo As moléculas maiores se reorientam de forma mais devagar em Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 15 relação as moléculas mais leves Essa técnica é chamada de eletroforese em gel de campo pulsado utilizada para separar DNAs genômicos Figura 1 Eletroforese em gel de campo pulsado Fonte Wikipédia 2022 Houve muitas teorias acerca do modo de separação do DNA Alguns propuseram que o DNA migrava pelo gel como se tivesse dentro de um tubo Entretanto com o intuito de obter dados sobre a migração do DNA em gel de agarose tanto em eletroforese convencional quanto em campo pulsado utilizou uma técnica de microscopia de fluorescência e corantes que intercalavam a dupla cadeia do DNA Estes experimentos mostraram que em eletroforese convencional as moléculas de DNA migram em um movimento cíclico que envolvem compactação e alongamento de polímeros sempre em paralelo ao campo elétrico A forma alongada se deve ao fato de as cadeias estarem espremidas na porosidade do gel enquanto que a cabeça da cadeia vai sendo atraída pelo polo positivo O DNA é uma molécula que por si só não será capaz de emitir uma cor sendo incapaz a visualização da corrida dessa molécula Para isso métodos de detecção do DNA são necessários para a identificação da migração do DNA pelo gel O brometo de etídio é um marcador fluorescente que ainda hoje é tão utilizado para a identificação da migração do DNA a partir da irradiação de uma luz UV sobre o gel que comumente é de agarose Essa molécula é conhecida como intercaladora já que possui a propriedade de interagir com ambas as cadeias da dupla hélice de uma Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 16 forma perpendicular através de forças de van der Waals com os pares de bases Esse marcador pode ser integrado durante a produção do gel de agarose ou diretamente à amostra de DNA Ao ser inserida diretamente na dupla fita ela é capaz de aumentar a fluorescência emitida em comparação quando incorporada diretamente no gel de agarose Além disso ela é capaz de amenizar a eletronegatividade dos fosfatos da molécula de DNA e aumentar o peso molecular da dupla fita levando a um leve retardo na migração Apesar das vantagens de examinar o gel de agarose diretamente em luz UV bandas mais nítidas são obtidas quando a corrida é realizada em ausência do brometo de etídio A marcação do brometo de etídio viria após a corrida promovendo imersão do gel em um tampão ou água contendo brometo de etídio por 3540 minutos O brometo de etídio está sendo banido por laboratórios devido ao seu efeito carcinogênico afinal ele possui sua característica como intercalante de DNA Uma forma alternativa é o SYBR Gold um marcador fluorescente com alta afinidade ao DNA e um alto índice de melhoramento da fluorescência ao se ligar ao DNA O campo fluorescente do SYBR Gold é mil vezes maior do que o brometo de etídio A utilização desse fluorocromo no gel de agarose é feita antes da corrida da amostra adicionado antes da solidificação do gel O SYBR Gold não pode ser adicionado ao gel de poliacrilamida durante a sua produção já que pode exercer alterações e severas distorções nas propriedades da eletroforese tanto de DNA quanto de RNA Gel de Agarose DEFINIÇÃO A agarose é um polímero composto por alternados resíduos de D e Lgalactose unidas por ligações alfa e betaglicosídicas Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 17 A agarose em solução contém uma aleatória estrutura de bobina enrolada em altas temperaturas Ao resfriar as cadeias de agarose formam feixes de fibras helicoidais mantidos juntos através de ligações de hidrogênio não covalentes A gelificação ocorre em temperaturas ainda mais baixas quando os feixes de fibras se ligam em zonas de junção pela formação de ligações de hidrogênio adicionais Os polímeros de agarose são comercializados para conter 800 resíduos de agarose por cadeia A agarose é realizada ao solubilizar o pó de agarose em um tampão o TrisboratoEDTA TBE ou o Trisacetato EDTA TAE e muitas vezes misturar com o corante brometo de etídio Após misturar esquentar a solução em um microondas até que a agarose tenha um aspecto mais denso significando que aquela estrutura tem agora agarose em forma enrolada tipo bobina Após esquentálo despejálo na cuba apropriada para a eletroforese onde ela irá resfriar formando uma estrutura sólida maleável Nessa estrutura os poros estarão bem estabelecidos para a passagem do material genético Figura 2 Preparação do gel de agarose Fonte Christofoletti 2013 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 18 Equipamentos e Reagentes Necessários O primeiro material é a agarose que é vendida em forma liofilizada em pó para que seja misturada aos tampões que serão utilizados tanto na etapa de fabricação do gel quanto na etapa da corrida propriamente dita Os tampões podem ser o TrisboratoEDTA TBE ou o Trisacetato EDTA TAE O TBE é uma solução composta por uma mistura de base Tris ácido bórico e EDTA IMPORTANTE Essa solução tem a função de deixar o meio em condições levemente básicas desprotonado para que a molécula do DNA consiga ficar dissociada e solúvel em água Além do meio básico fornecido pelo Tris o EDTA tem uma importância função como quelante de cátions divalentes particularmente o Mg2 Esse íon está presente como cofator para enzimas com capacidade de degradar o DNA Sendo assim o EDTA possui uma função protetora do DNA por inibir que atividades enzimáticas sejam ativadas além de prevenir a ação de enzimas modificadoras de DNA como as enzimas de restrição O TAE possui funções parecidas entretanto tem uma capacidade de tamponeamento menor quando comparado ao TBE provavelmente devido ao ácido utilizado para contrapor o Tris que começa a ficar esgotado quando a eletroforese é realizada por tempos prolongados Apesar disso o DNA consegue migrar levemente mais rápido com o TAE ao invés do TBE e tem um melhor poder mesmo que leve de resolução da corrida do que TBE para moléculas com alto peso molecular Após montado o gel despejar em um recipiente chamado de cuba horizontal para eletroforese e esperar o gel esfriar NOTA É necessário adicionar pentes ao gel quente para que ele resfrie formando poços que irão comportar as amostras Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 19 As cubas serão imersas no tampão de corrida TBE ou TAE e os eletrodos serão ligados iniciando a corrida No fim da corrida uma câmara de raios UV irá irradiar o gel para que as bandas de DNA sejam reveladas se o corante utilizado for o brometo de etídio Taxa de Migração do DNA Através do Gel de Agarose A concentração da agarose utilizada determinará o tamanho do DNA a ser investigado Quanto maior a concentração de agarose menor serão os poros formados impactando no tamanho de pares de bases que o DNA a ser investigado poderá ter para se adequar àquela eletroforese Outro fator que poderá influenciar na taxa de migração do DNA é a forma do DNA DNA circular migrará em uma velocidade diferente do DNA linear assim como o DNA cortado Nicked e o super helicoidal terão taxas diferentes Eletroforese em Gel de Poliacrilamina As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas a depender da sua estrutura de aminoácidos Uma proteína para ser separada pode ser submetida a uma eletroforese entretanto em um gel diferente do anteriormente comentado o gel de poliacrilamida Esse gel é formado por poliacrilamidas unidas por ligações altamente cruzadas como uma matriz inerte que é onde as proteínas passam Entretanto o gel de poliacrilamida também pode ser utilizado para a separação de DNA de uma forma mais progressiva já que é capaz de separar moléculas de DNA com 1 par de base de diferença Além do mais consegue acomodar uma quantidade muito maior de DNA do que a do gel de agarose e o DNA corrido nesse gel é extremamente puro e pode ser utilizado para muitas demandas SDS Page Como dito anteriormente as proteínas podem ter cargas diferentes a depender da organização dos aminoácidos Entretanto para resolver essa situação um detergente é aplicado a fim de ligarse a regiões Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 20 hidrofóbicas das proteínas Por criar cadeias polipeptídicas estendidas o Sodium Dodecyl Sulfate SDS influencia o desdobramento proteico Dessa forma são liberadas moléculas proteicas individuais tornandose completamente solúveis na solução detergente Quando uma proteína se liga ao SDS a carga negativa desse detergente supera a própria carga intrínseca da proteína fazendo com que essa proteína migre do polo negativo ao polo positivo da cuba vertical eletroforética As proteínas de mesmo tamanho molecular tendem a migrar em velocidade equiparadas já que suas estruturas estão desnaturadas e lineares podendo ser proteínas diferentes mas possuem o mesmo peso molecular portanto a mesma velocidade de migração Proteínas de diferentes pesos seguirão a regra do maior peso migrar de forma mais lenta e o menor peso migrar de forma mais rápida gerando um mix de bandas proteicas no gel Além disso para quebrar as ligações SS entre as proteínas de modo que todos os polipeptídeos constituintes sejam analisados individualmente outro agente redutor pode ser adicionado Com corando azul Coomassie as proteínas majoritárias podem ser identificadas com relativa facilidade Com esse recurso até mesmo as proteínas menos abundantes são vistas Blotting com Anticorpo Após a eletroforese em poliacrilamida é comum utilizar um anticorpo ligado a um cromóforo como o DAB ou a um radioisótopo para se ligar ao epítopo da proteína de interesse assim identificandoa Afinal muitas proteínas serão migradas na eletroforese e uma proteína pode ter o mesmo peso molecular que o seu alvo Portanto o Western blotting WB é capaz de fazer essa identificação ao transferir as proteínas separadas pelo gel para um papel de nitrocelulose a partir de um campo elétrico forte No final do processo terá a ligação do anticorpo conjugado à camada de nitrocelulose Esse anticorpo será ligado e após um processo de lavagem e de incubação de uma enzima ou outras moléculas como o peróxido de hidrogênio se for necessário haverá a liberação da cor mostrando a sua proteína de interesse Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 21 VOCÊ SABIA O WB é muito utilizado para confirmação de infecção viral do HIV sendo a técnica de padrão ouro SAIBA MAIS Quer se aprofundar neste tema Leia o texto Eletroforese Conceitos E Aplicações acessível aqui RESUMINDO E então Gostou do que lhe mostramos Aprendeu mesmo Agora só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo vamos resumir tudo o que vimos Você deve ter aprendido que a eletroforese é utilizada para separação e purificação de macromoléculas que são na maioria das vezes proteínas ou ácidos nucleicos Compreendeu que a técnica faz com que essas macromoléculas sejam submetidas a um campo elétrico e que elas vão migrar para o polo positivo ou negativo de acordo com a sua carga E esse fluxo é determinado pelo peso molecular de cada molécula Viu que a técnica pode ser aplicada em diversas áreas como genética ciência forense bioquímica ou microbiologia Aprendeu sobre os tipos de géis que podem ser utilizados e quais as suas características e melhores aplicações assim como os tipos de corantes e de tampões utilizados e os tipos de técnicas que existem e a função de cada uma ressaltando as vantagens e desvantagens e a interferência de cada equipamento e material no resultado da corrida do gel da eletroforese Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 22 Reação em Cadeia da Polimerase PCR OBJETIVO Ao término deste capítulo você será capaz de entender como funciona a Reação em Cadeia da Polimerase Isto será fundamental para conseguir reproduzir a técnica de amplificação do DNA ou RNA a partir de um DNA complementar aprendendo sobre seus reagentes sobre a ação do termociclador e os diferentes tipos de PCRs utilizados tanto na pesquisa como no diagnóstico laboratorial E então Motivado para desenvolver esta competência Então vamos lá Avante Após a descoberta da molécula da hereditariedade foram desenvolvidas técnicas de análise para facilitar o estudo dessa molécula tendo grande importância para a ciência e para os profissionais que trabalham com isso A técnica de PCR foi desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores em 1983 dando a Mullis o prêmio Nobel de Química em 1993 VOCÊ SABIA Diversos estudos foram desenvolvidos para compreender a molécula do DNA como o Southern blot por Edwin Southern o Sequenciamento por Frederick Sanger e Walter Gilbert e a Reação em Cadeia da PolimerasePCR por Kary Mullis Essa técnica possui uma grande importância e vem sendo aplicada em amplas áreas como na identificação de polimorfismo genotipagem doenças genéticas e detecção de microrganismos Ela é utilizada para análise de ácidos nucleicos que se encontram em baixas quantidades na maioria dos tecidos vivos É um método eficaz para amplificação de segmentos específicos de DNA realizado inteiramente de forma in vitro Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 23 Reagentes Necessários para a Reação A reação se inicia a partir de um DNA molde seja extraído da amostra ou de uma amostra de RNA transformada em DNA complementar cDNA É importante que o ácido nucleico não contenha impurezas como outro ácido nucleico proteínas reagentes de extração entre outras e é recomendável ser utilizado em concentração mínima de 5µlmL apesar de menores quantidades já terem sido utilizadas A DNA polimerase mais utilizada é a Taqque deve ser utilizada juntamente a uma soluçãotampão composta por íons Na Cl Mg entre outros e pode ser utilizada com detergentes que vão inibir a geração de dímeros das cadeias enzimáticas de proteínas estabilizantes e de substâncias capazes de desnaturar a cadeia molde de DNA como é o caso do βmercaptanoethanol O Cloreto de Magnésio MgCl2 é muito importante para a reação pois é um cofator essencial para a atividade da enzima Os primerssão pequenas sequências de DNA de 12 a 35 bases complementares às bordas que delimitam a área que vão ser ligados os dNTPs na fitamãe Os desoxinucleotídeos são utilizados para a síntese das fitasfilhas e são compostos por nucleotídeos desoxilados no carbono 5 da desoxirribose São adicionados pela polimerase complementar à fitamãe Adiciona se uma mistura de todos os desoxirribonucleotídeos fosfatados dNTPs em concentrações iguais à reação O termociclador gera alterações de temperaturas que levam a desnaturação da molécula de DNA ou cDNA ao anelamento dos primers e ao alongamento das novas cadeias de DNA Revisando O desenvolvimento da técnica depende de amostra primers dNTPs Taq MgCl2 tampão e termociclador Figura 3 Componentes da reação em cadeia da polimerase Fonte Rachel 2011 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 24 PCR A amostra utilizada para essa técnica pode ser sangue biópsia de tecido cabelo unha líquidos corpóreos entre outros Pelo menos um par de primer irá identificar o local do material a ser amplificado os dNTPs irão sintetizar as novas cópias do material genético a ser amplificado a Taq irá sintetizar as novas cadeias de DNA ou de cDNA o MgCl2 junto com o tampão irá auxiliar a atividade da polimerase Após o MIX ser feito com todos os reagentes irá para o termociclador que configurará temperaturas ideais em tempos necessários para as etapas de amplificação Na primeira etapa do PCR o DNA molde é desnaturado através do calor e anelase a oligonucleotídeos iniciadores sintéticos Após isso a DNA polimerase é utilizada para copiar o molde de fita simples pela extensão dos primerse o DNA é desnaturado novamente anelado aos primers e utilizado como molde para uma nova síntese Nesse clico os primers podem iniciar a síntese a partir das fitas de DNA que foram sintetizadas no ciclo anterior ou a partir da síntese de DNA anterior A polimerase prossegue até o fim do molde e lá se desconecta Nesse segundo ciclo o DNA que vai ser sintetizado está cobrindo a sequência de DNA que será amplificada Os ciclos de desnaturação anelamento e síntese do DNA irão produzir segmentos de DNA que correspondem ao intervalo da sequência que foi delimitado pelos primers Figura 4 Reação em cadeia da polimerase Fonte Wikipédia 2022 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 25 O resultado da amplificação pode ser visualizado através da eletroforese que é uma técnica onde uma partícula carregada através de campo elétrico pode se migrar e ser vista em forma de bandas Essa técnica foi abordada mais amplamente no capítulo anterior Existem alguns tipos de reações que podem ocorrer com a polimerase que possuem características diferentes em suas técnicas como Reverse Transcriptase PCR RTPCR Multiplex PCR e Nested PCR RTPCR Esta reação pode ser dividida em duas partes a transcrição reversa e a amplificação O que diferencia essa reação é que não inicia a partir de um molde de DNA extraído da amostra portanto a amostra fornece o RNA que é convertido em cDNA É muito utilizada em estudos de expressão gênica visto que através da avaliação do RNA mensageiro mRNA pode se detectar quais proteínas estão sendo expressas Entretanto o estudo direto do RNA é inviável porque apresenta grande sensibilidade a vários fatores Inicialmente existe síntese de uma fita de DNA adotando como template uma fita de RNA em uma reação catalisada pela enzima transcriptase reversa Também são utilizados primers inespecíficos tipos de oligonucleotídeos em que se encontram várias timinas consecutivas 6 a 35 Esses primers são anelados em torno das regiões PolyA do RNA ricas em adenina Como resultado obtémse o cDNA que será utilizado na PCR IMPORTANTE O round de transcrição reversa não modifica o número de fitas de RNA ou DNA Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 26 Figura 5 Reverse Transcriptase PCR RNA isolation cDNA synthesis reverse transcription RT eDNA amplification PCR Cells or Tissue 1 Denaturation 2 Annealing 3 Extension Fonte Santos et al 2004 PCR em Tempo Real Essa técnica é uma variação da técnica de PCR que permite monitorar o processo de amplificação em tempo real e quantificar os ácidos nucleicos através da emissão e captação de fluorescência durante todo o processo O resultado pode ser acompanhado durante a amplificação da sequência gerando resultados quantitativos mais precisos Essa técnica utiliza um equipamento com monitoramento da emissão da fluorescência Figura 6 Exemplo do resultado gerado pelo equipamento de PCR em tempo real Fonte Georgiadis et al 2010 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 27 Multiplex PCR Em uma única reação mais de um segmento é amplificado cada um com um par de primer específico Essa técnica é muito útil na simplificação de alguns experimentos como em testes de paternidade que devese analisar vários marcadores genômicos Figura 7 Esquematização do multiplex PCR com quatro pares de primers para amplificação Fonte Chora 2008 Nested PCR A PCR aninhada é utilizada para aumentar a especificidade da amplificação reduzindo a ocorrência de amplificação não específica do DNA A técnica utiliza dois pares de primers pares externo e interno para um único locus e dois PCRs sucessivos No primeiro ensaio os primers de par externo são utilizados para gerar produtos de DNA e assim os seus produtos de DNA podem conter fragmentos de DNA amplificados não específicos Esses produtos então entram em uma segunda corrida de PCR utilizando o segundo conjunto de primers internos cujos locais de ligação são de cada primer de par externo usado na primeira reação Logo um segundo produto de PCR é produzido mais curto que o primeiro Se o locus errado foi amplificado por engano no primeiro turno é pouco provável que ele também seja amplificado na segunda vez dessa forma a nested PCR aumenta muito a especificidade da PCR Primers aninhados Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 28 são utilizados como controle importante em experimentos com sequência desconhecida do genoma NOTA Uma desvantagem dessa técnica é que a adição de um segundo par de primers após a primeira corrida de PCR aumenta a chance de contaminação inespecífica Figura 8 Diferenças entre PCR e nested PCR Fonte Yhombi et al 2013 Outros Tipos de PCR PCR Assimétrica Esse tipo de reação amplifica preferencialmente uma fita de DNA em um molde de DNA de fita dupla O processo é semelhante ao do PCR porém utilizase uma quantidade de primer para a fita alvo muito maior que pra fita não alvo Enquanto a PCR assimétrica progride o primer limitador de concentração inferior é incorporado quantitativamente ao DNA de fita dupla recémsintetizado É uma técnica muito útil quando é necessária a amplificação de apenas uma das duas cadeias complementares Entretanto não é muito utilizada pois possui baixa eficiência de reação Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 29 e é difícil otimizar as razões de primeradequadas o número de ciclos de amplificaçãoe as quantidades de material PCR de Montagem Polymerase Cycling Assembly PCA O conjunto de ciclagem de polimerase ou PCR de montagem é um método utilizado para montagem de grandes oligonucleotídeos de DNA a partir de fragmentos mais curtos Esse método utiliza a mesma técnica de PCR porém utiliza a hibridização e o anelamento do DNA assim como a DNA polimerase para amplificar uma sequência de DNA com base nos oligonucleotídeos de fita simples utilizados permitindo a produção de genes sintéticos e até mesmo genomas sintéticos inteiros PCR Touchdown O termo touchdown diz respeito aos ciclos de PCR anteriores onde a temperatura do anelamento é alta abaixo da temperatura de fusão dos pares de primers Após isso a temperatura de anelamento é reduzida O princípio dessa técnica é que a temperatura do anelamento durante a reação do PCR determine a especificidade do anelamento do primer O resultado dessa técnica aumenta bastante a qualidade da PCR PCR Digital Essa técnica é uma nova abordagem para quantificação absoluta de ácidos nucleicos onde uma amostra de DNA ou cDNA é separada em muitas partições em poços e as reações de PCR são realizadas em cada partição Os poços podem ter a molécula alvo positiva ou não negativos tendo reações de PCR positivas e negativas No final as quantidades de resultados positivos e negativos são utilizadas para gerar um número absoluto de moléculas alvo na amostra Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 30 IMPORTANTE Essa técnica possui algumas vantagens seja por não precisar de referências ou controles endógenos ou por possuir alta sensibilidade e precisão devido às várias replicações de PCR É muito utilizada na análise de alterações no número de cópias sequenciamento de próxima geração ou mutações raras PCR Suicide Essa técnica evita amplificações positivas falsas e devido a isso é muito utilizada no estudo do passado através do exame de material genético preservado a partir de resto de organismos antigos paleogenética É utilizada para evitar falsos positivos e garantir a especificidade do fragmento amplificado VNTR PCR VariAble Number of Tandem Repeats A repetição em tandem de número variável é uma região onde ocorre uma sequência nucleotídica curta quando repetidas em tandem Essa técnica pode ser utilizada para identificação parental e pessoal é muito utilizada na genética pesquisa e análise forense A PCR do VNTR tem como alvo a região VNTR a análise de VNTR menores é a base para os bancos de dados de impressões digitais de DNA SAIBA MAIS Quer se aprofundar neste tema Recomendamos que leia o artigo Sensibilidade da técnica de reação em cadeia da polimerase para HIV1 em relação à técnica de ensaio imunoenzimático Rezende et Al acessível aqui Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 31 RESUMINDO E então Gostou do que lhe mostramos Aprendeu mesmo tudinho Agora só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo vamos resumir tudo o que vimos Você deve ter aprendido que a Reação em Cadeia da Polimerase PCR é muito útil em diversos tipos de diagnósticos laboratoriais Viu quais os principais reagentes utilizados na técnica como iniciadores primerse a DNA polimerase Taq e suas etapas que se resumem em desnaturação anelamento e extensão Compreendeu que podem ser utilizadas várias amostras como sangue ou tecido Aprendeu a função de cada um dos reagentes e qual a sua atuação na PCR Soube que existem diversos tipos de técnicas de PCR como PCR em tempo real e multiplex PCR e que cada uma dessas técnicas possui uma especificidade e diversas características que irão determinar o seu uso Entendeu as diferenças entre todas as técnicas assim como as suas utilidades em casos como a paleogenética e análise forense que vão além da detecção de microrganismos e identificação de doenças Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 32 DNA Recombinante e Produção de Material Genético Quimérico OBJETIVO Os tópicos a seguir irão explicar detalhadamente a tecnologia de DNA recombinante abordando todas as suas etapas e aspectos O método de clonagem do DNA será explorado especificadamente a clonagem molecular que é o isolamento de uma fia de DNA para reproduzila via um vetor celular que possa multiplicar o seu próprio material genético e o do DNA alvo Vamos lá Clonagem Na biologia molecular e celular há um termo que define o processo de multiplicar uma região do DNA gene ou fitatrecho em específico clonagem A clonagem pode ser dividida em duas categorias A primeira é a multiplicação via amplificação do material genético produzindo várias cópias idênticas de uma molécula de DNA um processo realizado a partir da técnica recémdiscutida de PCR Entretanto a segunda forma de clonagem é capaz de multiplicar essa mesma molécula de DNA mas não a partir de técnicas de amplificação da molécula mas sim pelo isolamento dessa molécula em uma célula que seja capaz de se replicar e replicar a fita de DNA de interesse Em 1972 um bioquímico chamado Paul Berg teve a ideia de utilizar o Vírus Símio 40 SV 40 para introduzir um gene de interesse em uma célula permitindo que a célula hospedeira conseguisse multiplicar o material genético de interesse e também produzir a proteína desejada O genoma desse vírus nada mais é do que um pedacinho de DNA 600 mil vezes mais curto do que o genoma humano possuindo apenas 7 genes ao contrário dos 21 mil do genoma humano O ponto que mais lhe chamou atenção era que o sv40 poderia coexistir mais ou menos de forma pacífica com certos tipos de células infectadas Ao invés de produzir milhões de novas partículas virais como outros vírus comumente fazem ele insere Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 33 o seu DNA no cromossomo da célula hospedeira e em seguida entra em uma calmaria reprodutiva até ser de alguma forma ativado O caráter compacto do genoma do sv40 e a eficiência que ele podia ser introduzido dentro das células lhe dá uma característica ideal para sua utilização como vetores de entrega de genes como acontece com a técnica do CRISPRCas9 EXPLICANDO MELHOR Alguns vírus são considerados ótimos vetores de entrega de genes em célulasalvos devido a sua capacidade de entrar na célulaalvo sem que haja outros processos de transfecção Hoje em dia as técnicas de edição gênica estão trabalhando muito com esses vetores Um exemplo disso é o CRISPRCas9 que é uma endonuclease guiada por um RNA capaz de clivar um trecho de 20 pares de base de uma cadeia polipeptídica Esse sistema é utilizado por bactérias para se defender de bacteriófagos invasores Seu princípio de ação é bastante utilizado para editar genes mutados de células humanas Para que esse sistema de edição alcance seu alvo um vetor de transfecção precisa colocálo dentro da célula E é aí que alguns vírus como o adenoassociado entram Foi a partir daí que Paul teve a ideia de introduzir um gene bacteriano diretamente no genoma viral para que esse vírus infecte a célulaalvo e leve junto o seu DNA de interesse assim a informação hereditária dessa célula seria alterada podendo produzir uma proteína que antes não produzia Entretanto ele precisava superar suas primeiras barreiras da genética Como pescar um determinado gene de interesse e inserilo no genoma viral para a produção de quimeras genéticas Importante ressaltar que antigamente o trabalho foi mais complicado do que quando feito hoje em dia afinal algumas técnicas formuladas posteriormente como a PCR são utilizadas hoje como um facilitador do processo de construção do DNA quimérico A pesca do material genético não é o único problema afinal tem que haver uma forma de introduzir esse material genético no genoma Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 34 viral ou seja primeiramente precisa forçar a abertura do genoma viral circular pegando como exemplo o sv40 na posição correta para que o gene específico consiga ser inserido de forma exata no genoma viral e que seja totalmente complementar também Para que isso seja possível é necessária a ação de uma enzima capaz de cortar o DNA tanto de interesse quando viral em trechos que permitam o pareamento entre ambos Essa enzima é chamada de enzima de restrição Após a criação do DNA viral quimérico ele estaria apto a infectar uma célula humana e modificar as informações genéticas contidas em seu genoma Mas seria possível um DNA quimérico um genoma viral com um gene bacteriano por exemplo conseguir gerar uma molécula efetora de proteína em uma célula humana As propriedades do código genético veem à tona para esclarecer essas questões de funcionalidade IMPORTANTE O código genético é universal o que significa dizer que uma proteína codificada por uma bactéria pode ser codificada por uma célula humana caso a mesma sequência gênica esteja disponível para atuação da RNA polimerase transcrever em um RNA e do RNA em uma proteína O fluxo de informação genética está presente em todas as técnicas em biologia molecular Biblioteca de DNA Para isolar um gene específico pela técnica de clonagem é necessária a construção de uma biblioteca de DNA que é uma coleção abrangente de DNA clonado em uma célula que normalmente é a Escherichia coli Essa biblioteca inclui no mínimo um fragmento do gene de interesse do pesquisador em todas as moléculas de DNA clonadas Então ao transfectar o vírus na célula humana pegando pelo caso anterior essa célula humana será cultivada em meio de cultura para que ela cresça e se multiplique expandindo também o seu gene inserido através do vetor viral Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 35 Hoje em dia o processo de clonagem do DNA é feito mais com transfecção de plasmídeos recombinantes em células bacterianas ou em leveduras Como a Ecoli se divide mais rapidamente do que um Saccharomyces então os testes são mais utilizados nessa bactéria Outro exemplo de biblioteca de DNA é envolvendo o DNA complementar cDNA O genoma humano é muito extenso então criar uma biblioteca de DNA desse genoma vai envolver vários plasmídeos contendo clones de DNA genômico sendo muitos plasmídeos contendo DNA composto exclusivamente de bases não codificantes íntrons Entretanto para montar uma biblioteca de DNA somente com os genes codificantes que até um gene possui cadeias intronicas será necessário pegar um mRNA já que eles são as moléculas compostas de genes puros sem os íntrons Portanto ao utilizar o mRNA terá que convertê lo ao seu DNA complementar utilizando uma transcriptase reversa em RTPCR O cDNA será um DNA contendo somente os éxons de um gene sendo assim viável para a construção da biblioteca de DNA somente com as regiões codificantes Vetor Plasmideal Os plasmídeos são DNAs circulares que fazem parte do genoma da célula bacteriana Os plasmídeos utilizados para a tecnologia de DNA recombinante são muito menores do que os bacterianos Isso confere uma característica benéfica para o investigador já que esse plasmídeo possui um peso molecular muito menor do que o genoma bacteriano em geral sendo fácil de separálos após uma centrifugação por exemplo já que o genoma bacteriano acaba formando um sedimento no fundo do tubo Para que esses plasmídeos comportem os genes de interesse primeiro ambos precisam passar por um tratamento com enzima de restrição para abrir o DNA circular e formar pontas coesivas capazes de interagirem umas com as outras plasmídeo e DNA de interesse Antes de promover os cortes no vetor plasmideal é preciso primeiro pescar o gene de interesse na célula desejada e para isso devese levar Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 36 em consideração o tipo celular que comporta esse gene de interesse Como visto na unidade passada a transcrição do RNA em procariotos e eucariotos acontece de formas totalmente diferentes Os procariotos não possuem núcleo e muito menos íntrons ou seja o mRNA das bactérias não passa por processos como splicing alternativo e nem por outros processos modificadores da sequência do RNA Eles são formados e diretamente traduzidos Já o mRNA de eucariotos por exemplo as células humanas possuem íntrons e passam por processos de modificação na estrutura do mRNA NOTA Para criar plasmídeos contendo clones de DNA nos eucariotos o processo é muito mais complicado do que os procariotos porque o gene no DNA dos eucariotos não possui íntrons ou seja a pesca pode ser diretamente no DNA das bactérias diferente das células humanas que terão que ser a partir do mRNA transformandoos em cDNA para poder usar sequências exclusivamente decodificantes A pesca será permitida através da técnica de PCR nas bactérias que irá gerar fragmentos com cadeias alvos das enzimas de restrição e pela RTPCR nos eucariotos onde primeiro será necessária a conversão do mRNA em cDNA para sua posterior amplificação O DNA plasmideal possui elementos essenciais para a sua manutenção e função na célula hospedeira O seu tamanho é uma característica fundamental afinal moléculas muito grandes são mais difíceis de se manipular e têm maiores tendências de se degradarem durante o período de purificação Nesse plasmídeo deve haver uma origem de replicação que forneça capacidade ao plasmídeo de multiplicação independente do cromossomo da célula hospedeira Os plasmídeos menores aproveitam as DNA polimerases das células hospedeiras para promover sua própria replicação enquanto plasmídeos maiores comportam genes codificadores nas próprias enzimas de replicação Outra característica é a presença de um promotor forte que irá conter várias sequências iguais e muito próximas umas das outras Além Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 37 disso alguns plasmídeos também terão promotores Lac Tac e T7 O promotor Lac é semelhante ao operon Lac nas cepas selvagens de Ecoli sendo assim expressando o repressor LacI que irá se ligar ao operador Lac na ausência do indutor O promotor Tac possui a região promotora do operon Trp e a região operadora do operon Lac Então ambos os promotores serão transcritos caso haja a ação de um indutor porque esses dois promotores e o operador ficam próximos uns aos outros O operador vai impedir que tanto o promotor Trp quanto o Lac sofra ação da RNA polimerase levando à transcrição do gene de interesse O indutor pode ser ou a lactose ou isopropiltiogalactosídeo IPTG O promotor T7 está presente em plasmídeos um pouco maiores o suficiente para comportar o promotor que transcrever a RNA polimerase do fago T7 Essa RNA polimerase é muito mais ativa do que a bacteriana tendo esse plasmídeo um nível de transcrição basal muito maior Em algumas ocasiões o operador Lac pode estar entre o gene de interesse e o promotor T7 Sendo assim esse promotor só será ativado caso na presença do indutor Figura 9 Promotor T7 nos plasmídeos Fonte Moreira et al 2018 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 38 Todo plasmídeo deve possuir uma região chamada local múltiplo de clonagem onde será o espaço ideal para que o gene de interesse seja inserido para a sua devida transcrição Essa região poderá sofrer ação de múltiplas enzimas de restrição IMPORTANTE Os plasmídeos devem ter somente um local de reconhecimento onde as enzimas irão cortar Caso tenha mais de um local para corte das enzimas o gene ao ser inserido pode acabar entrando em uma região não desejada prejudicando o processo de transcrição dentro da célula hospedeira Portanto somente um local de transcrição aumenta as chances de uma inserção desejada e a decodificação eficiente do gene de interesse Alguns tipos de plasmídeos são capazes de inserirse no genoma bacteriano Estes plasmídeos integrativos ou epissomas podem ser mantidos de um modo estável durante numerosas divisões celulares mas em algum momento irão retornar a seu estado independente Todo plasmídeo de clonagem precisa ter um gene repórter capaz de sinalizar que o processo de transfecção do plasmídeo foi um sucesso Esse gene repórter é um fator de resistência bacteriana a um antibiótico que pode ser o Cloranfenicol ou Ampicilina A bactéria que conseguir captar o plasmídeo de clonagem ao ser incubada em meio de cultura contendo esses antibióticos poderão crescer no meio sinalizando então que o plasmídeo foi transfectado com sucesso Apesar dos plasmídeos bacterianos serem os mais utilizados no processo de clonagem algumas células eucariotas possuem esses DNA circulares autorreplicantes como os Saccharomyces cerevisiae que não são muito recomendados por alguns autores uma vez que sua forma circular não é permanente Além de seus plasmídeos serem utilizados em alguns casos as leveduras também podem ser as células hospedeiras que irão abrigar o DNA quimérico Existem três formas de introduzir o DNA estrangeiro nessas células Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 39 1 Os plasmídeos a serem inseridos têm que possuir centrômeros para que aquele DNA plasmideal participe da mitose onde o fuso mitótico irá distribuílos para as células descendentes 2 O plasmídeo pode ser inserido sem um centrômero tornando a estrutura desse DNA instável e passando para as células descendentes ao acaso 3 O DNA recombinante pode ser inserido diretamente ao cromossomo de uma levedura Apesar dos plasmídeos de menor tamanho serem os mais utilizados nos processos de clonagem de genes há a possibilidade de trabalhar com fragmentos muito grandes de DNAs Pesquisadores começaram a utilizar cromossomos artificiais de leveduras YACs yeast artificial chromosomes para comportar os fragmentos de DNA com 300 mil a 1 milhão de pares de nucleotídeos Outra vertente da mesma aplicabilidade é usar plasmídeos que têm a capacidade de clonar fragmentos muito maiores também os chamados cromossomos artificiais da bactéria BAC bacterial artificial chromosome Esses cromossomos conseguem estar presentes nas bactérias em somente uma ou duas cópias Essa característica tem impacto benéfico devido a capacidade reduzida dos BAC em interagir com outras sequências presentes em outras cópias do plasmídeo Por sua estabilidade habilidade de aceitar grandes insertos de DNA e por serem facilmente manipulados os BACs são agora os vetores preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos incluindo aqueles representando o genoma humano e o de camundongo Os plasmídeos podem ser separados em 2 grupos básicos os conjuntivos e os nãoconjuntivos Os conjuntivos possuem sequências específicas tragene que são capazes da conjugação isto é o processo sexuado das bactérias de repasse de informação hereditária Os não conjuntivos não possuem essa sequência sendo incapazes de participarem da conjugação sozinhos a menos que estejam acompanhados de um plasmídeo conjuntivo Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 40 VOCÊ SABIA A conjugação é responsável pelo evento de resistência bacteriana em algumas infecções Bactérias super resistentes a muitos antibióticos são o grande desafio da medicina moderna e essa resistência é devido à reprodução sexuada das bactérias conjugação que podem passar plasmídeos de uma para outra Esses plasmídeos comumente possuem um fator microbiano que lhes confere resistência aos antibióticos que muitas das vezes são os mais potentes existentes É por esse motivo que o uso de qualquer antibiótico sem a orientação médica é contraindicado já que a bactéria que está infectando aquele organismo pode ser resistente promovendo assim a ação dos antibióticos somente na flora bacteriana fisiológica Caso o antibiótico seja tomado fora do tempo estimado a bactéria patogênica pode criar resistência contra ao antibiótico Os plasmídeos podem ser classificados também quanto às suas funções a Plasmídeo de Fertilidade F Contém apenas transgenes tendo a função de iniciar a conjugação bacteriana b Plasmídeo de Resistência R Contém genes de resistências capazes de codificar fatores de resistência a antibióticos c ColPlasmídeos Contém genes capazes de produzir colicinas proteínas capazes de matar outras bactérias d Plasmídeos degradativos Contém genes que permitem a digestão de moléculas pouco habituais como o ácido salicílico e Plasmídeo de virulência Consegue transformar a bactéria num agente patogênico Os plasmídeos são moléculas extremamente importantes para as bactérias e uma cópia única de um plasmídeo pode desparecer numa célula filha após os eventos da divisão celular Para assegurar que isso não ocorra alguns plasmídeos incluem um sistema viciante Dessa forma produzem ao mesmo um veneno que tem vida longa e um antídoto que tem vida curta Portanto células com uma cópia do plasmídeo sobreviverão enquanto as que não a tiverem por falta de antídoto morrerão Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 41 Enzimas de Restrição Após a pesca do gene alvo será preciso introduzir esse gene dentro do DNA plasmideal para que ele seja introduzido dentro da célula para clonagem e produção das proteínas desejadas Enzimas especializadas em cortar o DNA em segmentos específicos são convocadas para cortar tanto o gene de interesse quanto o DNA plasmideal a fim de formar terminações concisas e equivalentes permitindo a recombinação do gene de interesse com o plasmídeo Junto a esse processo de colagem a DNA ligase participará no processo de união polinucleotídica unindo o arcabouço nucleotídico de ambos os DNAs As enzimas de restrição são encontradas em bactérias A função delas é de autodefesa Durante a invasão de um bacteriófago por exemplo a bactéria terá de se defender por meio de alguns mecanismos O CRISPRCas 9 é um exemplo mas o que realmente importa aqui são as enzimas de restrição Elas têm a capacidade de cortar fragmentos de DNA viral a depender de sequências palindrômicas Após o reconhecimento desses determinados sítios que mudam de enzima à enzima essas proteínas farão cortes no sítio de restrição ou em locais próximos a ele Os cortes podem mudar de conformação a depender da enzima Geralmente existem dois grupos de cortes escalonados e cego O corte escalonado acaba gerando extremidades de fitas simples O corte cego não gera extremidades de fitas simples mas sim extremidades totalmente cortadas sem prolongamento de fitas Essas extremidades de fita simples também são denominadas de extremidades pegajosas IMPORTANTE As extremidades pegajosas são úteis na clonagem porque produzem dois pedaços de DNA do gene de interesse e do plasmídeo que são capazes de interagirem uma com a outra Ao contrário dos cortes cegos também chamados de cortes bruscos que não deixam extremidade e dificultam a ligação das cadeias de DNA Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 42 Uma estratégia utilizada durante o corte é o uso de enzimas de restrição diferentes Ao usar uma enzima para clivar um mesmo DNA em ambos os lados tanto o DNA do gene de interesse quanto o plasmideal podem ser inseridos de forma errada por conta de um looping que o DNA por parte do DNA de interesse levando à ligação da parte que deveria estar a 3 no DNA plasmideal na extremidade 5 ou seja uma ligação de modo inversa Existem diversas enzimas e para cada enzima há uma nomenclatura Exemplo A EcoR1 é uma enzima capaz de promover o corte na região palindrômica G A A T T C Portanto o nome EcoR1 tem que indicar o Gênero a Espécie a estirpe e a ordem de descoberta E Escherichia co coli R RY 13 1 primeira enzima de restrição da Ecoli a ser descoberta Existem outras como HindIII TaqI HaeIII que são capazes de contribuir para o processo de produção de DNA recombinante Tabela 1 Tipos de enzimas de restrição e suas origens Fonte Elaborada pelo autor 2022 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 43 EXPLICANDO MELHOR Quando se diz região palindrômica entendese por uma região que quando lida de traz para frente na sequência complementar é a mesma sequência A sequência complementar dela seria a C T T A A G que lida de traz para frente fica G A A T T C Transfecção Com o DNA plasmideal montado precisava haver a transfecção desse DNA circular na célula hospedeira A forma de transdução já foi explicada que é a utilização de um vetor viral um bacteriófago para uma bactéria capaz de adentrar à célula hospedeira levando junto o gene de interesse Uma outra forma bem conhecida e a mais aplicada é a transformação bacteriana processo descoberto por Griffith em 1928 A transformação é a passagem de um material genético para uma bactéria transformandoa capaz de codificar uma proteína com uma função Entretanto antes que haja a transformação é necessário o processo de competência bacteriana A competência tornará as bactérias competentes a receber o material plasmideal exógeno já que nem todas as bactérias são naturalmente competentes a esse processo A competência é feita ao submeter a bactéria em uma solução fria de cloreto de cálcio por um tempo Se necessário é possível aumentar a eficiência do processo por recursos a outros íons monovalentes ou bivalentes Após esse processo há duas formas de fazer com que o DNA entre na célula O DNA por si só não será capaz de atravessar a barreira da parede bacteriana sendo assim dois processos podem ser realizados capazes de permeabilizar a parede celular bacteriana eletroporação e choque térmico O choque térmico é a retirada da colônia bacteriana ao gelo e passandoa para um local mais quente dando assim um choque térmico em parede celular criando poros permitindo a passagem do DNA A eletroporação consiste em pequenas descargas elétricas Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 44 desestabilizando a tensão elétrica que envolve a parede celular bacteriana criando poros permitindo assim a entrada do DNA plasmideal Proteína Recombinante Quaisquer proteínas pertencentes de quaisquer células estão em pequenas concentrações em seus respectivos meios Sendo assim o seu processo de extração se torna bastante difícil envolvendo uma produção maciça de células para a extração de pequenas quantidades de proteínas como acontecia com a insulina As pessoas diabéticas precisam de insulina para regularizar os níveis de glicose no sangue Entretanto antigamente era muito difícil obter um extrato relativamente razoável de insulina Com a tecnologia de DNA recombinante há a possibilidade de produzir concentrações elevadíssimas de insulina em apenas uma célula melhorando o processo de tratamento dessas pessoas diabéticas Outra aplicação para a técnica é a produção de proteínas de patógenos virais ou bacterianos por exemplo a proteína GP 120 do HIV em células bacterianas para a produção de vacinas a partir dessas proteínas Entretanto após a clonagem nas células hospedeiras além da produção maciça do DNA plasmideal a proteína também vai sendo produzida e concentrações muito elevadas NOTA Será necessária a separação dessas proteínas já que uma bactéria produz outros tipos de proteínas também É para isso que dois processos são utilizados no DNA plasmideal a inserção de um trecho de DNA capaz de codificar uma cauda de histidina ou um gene fluorescente GFP capaz de codificar uma proteína fluorescente Ambos os trechos a mais inseridos no DNA plasmideal permite que a proteína de interesse seja separada facilmente por cromatografia Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 45 SAIBA MAIS Quer se aprofundar neste tema Recomendamos a leitura do artigo A Engenharia Genética disponível aqui RESUMINDO E então Gostou do que lhe mostramos Aprendeu mesmo tudinho Agora só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo vamos resumir tudo o que vimos Você deve ter aprendido que a tecnologia do DNA recombinante possibilita a alteração do material genético de organismos seja pela introdução ou pela supressão de genes estruturais E que existe uma biblioteca de DNA que é utilizada para isolar um gene específico através da técnica de clonagem Aprendeu sobre essa técnica de clonagem e sobre os vetores utilizados principalmente os plasmídeos de bactérias assim como os tipos de plasmídeos existentes e suas funções Conheceu alguns tipos de enzimas de restrição existentes que possuem função de autodefesa Aprendeu sobre a transfecção do DNA circular na célulaalvo e sobre a transformação que é a passagem do material genético para a bactéria Por fim entendeu que existem proteínas recombinantes que são utilizadas na técnica de DNA recombinante na produção de proteínas Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 46 Detecção de DNA OBJETIVO Neste capítulo será abordada uma outra forma de manipulação do DNA que é a utilização do pareamento de bases WatsonCrick para identificar outras cadeias polinucleotídicas o processo denominado de Hibridização No final do capítulo você será capaz de entender o que é uma sonda seus princípios básicos estrutura formas de sintetização e aplicabilidades dessa técnica Classificação das Sondas Após a descoberta do DNA várias técnicas de manipulação do DNA de diferentes aspectos estão disponíveis Uma delas utiliza as características dos pareamentos de fitas anticomplementares para identificar moléculas de DNA e RNA em uma amostra biológica O nome desse processo se chama hibridização A hibridização é realizada ao submeter uma sonda de DNA ou RNA que seja capaz de se parear a uma cadeia polinucleotídica contendo 100 de complementariedade Essa sonda será marcada com alguma molécula capaz de gerar imagem seja ela fluorescente quimioluminescente ou um radioisótopo A sequência alvo será imobilizada em uma membrana para que a ação da sonda seja facilitada Muitas sondas são significantemente menores do que as moléculas alvo para as quais irão se hibridizar As moléculas das sondas conseguem ser bem menores com 20 pares de base e ainda mantem a habilidade de discriminar as sequências altamente complementares em uma amostra contendo todo um genoma celular Essas sondas são construídas com base em ferramentas de bioinformática que terão a capacidade de identificar a região mais estável ou conservada na sequência alvo Tendo encontrado essa região bem conservada haverá a construção da molécula da sonda com base nas características principais do processo da complementariedade além de ter pares de bases complementares Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 47 elas precisam ser invertidas palindrômicas já que a ligação de cadeias ocorre de forma antiparalela NOTA Sondas curtas tendem a se hibridizarem de forma mais rápidas às suas sequências alvos quando comparadas às sondas mais longas Isso pode ser explicado pegando o mesmo raciocínio utilizado para explicar as diferenças de migração entre as cadeias de DNA na eletroforese o peso molecular Uma enorme vantagem na utilização das sondas curtas é que elas podem ser hibridizadas em soluções tampões aquosos livres de formamida E por fim as sondas curtas podem ser projetadas com poucas informações da proteína sendo projetadas sob medida ainda mais se nenhuma sonda estiver disponível A hibridização pode ocorrer de forma com que a sonda e as moléculas alvos estejam flutuando em um meio líquido A hibridização dessas moléculas nesse meio vai ser a base da cinética das colisões aleatórias Entretanto há um jeito mais rápido de obter a hibridização de suas cadeias polinucleotídicas que é o aprisionamento da sequência alvo em uma membrana e a adição direta das sondas Quando essas sondas são adicionadas a um filtro sua sensibilidade é prejudicada EXPLICANDO MELHOR Isso se deve ao fato de ao fixar os ácidos nucleicos no filtro isso acaba tornando alguma dessas moléculas incapazes de hibridizar a uma sonda talvez devido a uma incapacidade estérica já que o sítio de ligação pode estar em uma orientação em que a sonda não seja mais capaz de se ligar àquela molécula Essas sondas são capazes de identificar de forma quantitativa ou qualitativa o nível de expressão que um gene tem inserções e Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 48 deleções gênicas material amplificado rearranjos gênicos translocações cromossômicas mutações pontais tipo polimorfismos e alterações aberrantes em genes que predispõe eventos carcinogênicos As sondas podem ser de diversas formas mas as mais abordadas serão as sondas de DNA e RNA Podem ser sondas feitas de DNA de fita dupla requerendo assim um processo de desnaturação em seus constituintes de fita simples sondas de DNA genômico e sondas de DNA complementar de cadeia simples cDNA sintetizados a partir de mRNA submetido ao processo de transcrição reversa pela RTPCR Esses últimos são usados para identificar sequências que são unicamente presentes em uma ou mais populações de RNA Uma desvantagem do uso de DNA como sondas é que eles são termodinamicamente menos estáveis do que as sondas de RNA Isso é por conta da ausência da hidroxila OH no carbono 2 do DNA Como as moléculas de RNA possuem ao se hibridizarem com outras moléculas como o DNA e RNA a presença dessa hidroxila acaba formando ligações de hidrogênio Sendo assim a interação DNADNA sonda de DNA em uma molécula alvo de DNA é menos estável do que os outros tipos de interações como DNARNA e dsRNA double strand RNA Por essa razão sondas de RNA permitem condições de lavagem e hibridização muito rigorosas sendo então bastante benéficas para o uso nos experimentos envolvendo hibridização Entretanto caso não tenha cuidado essas sondas podem promover ligações inespecíficas extensivas e altamente problemáticas A rigorosidade representa a probabilidade que a associação que os pares de bases têm para formar cadeias de fitas simples Essa definição vem a partir de pares de bases sob condições bastante hostis Portanto só haverá pareamento de bases caso as moléculas mesmo sob condições conturbadas para que haja a hibridização sejam 100 complementares umas com as outras Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 49 Condições que Influenciam a Hibridização A utilização de sondas de RNA se torna uma ótima vantagem quando se quer obter sondas capazes de parear de forma muito mais estável a sequência alvo Entretanto alguns fatores externos também precisam ser levados em conta no momento do experimento afinal eles podem evitar que missmatchs acabem dando resultados falsopositivos Os mismatchings são pareamentos indevidos da sonda em uma cadeia polinucleotídica não totalmente complementar Em uma amostra para análise é comum ter vários DNAs ou mRNAs do genoma humano isso se a amostra a ser analisada for humana Dentro de um genoma tão extenso quanto o do ser humano um eucarioto superior haverá uma sequência de bases similar à sequência alvo da sonda Essa similaridade vai gerar uma ligação imperfeita entre a sonda seja ela DNA ou RNA e a sequência indevida Essa sequência chamaremos de sequência fora do alvo offtarget Sendo assim sequências fora do alvo são capazes de gerar resultados falso positivosOs mismatchs são eventos que querendo ou não naturalmente podem ocorrer Esses eventos fora do alvo podem ser controlados com a manipulação de alguns fatores envolvendo o meio externo tendo interferência também as propriedades estruturais da própria molécula A seguir serão apresentadas variáveis que possam alterar o rendimento da hibridização I Temperatura Talvez seja a variável mais levada em conta na hora de prevenir ou induzir a hibridização entre duas moléculas Isso porque essa variável é fácil de ser manipulada Cada molécula polinucleotídica em dupla fita possui uma temperatura de fusão ou melting temperature Tm o que irá predizer a temperatura necessária para que 50 de uma dupla fita de cadeia polinucleotídica se dissocie formando e 50 de cadeias simples Portanto o aumento da temperatura vai levar no aumento da rigorosidade do meio levando em uma maior dissociação das fitas antiparalelas do DNA Em um meio suficientemente rigoroso as únicas moléculas que irão se parear serão as com 100 de complementariedade sendo assim aumentando a sensibilidade das sondas às suas cadeias alvo Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 50 II Força iônica A rigorosidade do meio é extremamente influenciada pela concentração da força iônica representada pela concentração de sais monovalentes no meio A cadeia dos polinucleotídeos é carregada negativamente por esse fato ambas as fitas carregadas negativamente têm a tendência em se repelirem por natureza Entretanto quando o meio é suplementado com sais monovalentes como o Na do NACl esses íons têm a capacidade de se ligarem aos fosfatos negativos do arcabouço da molécula de DNA por exemplo O uso do EDTA ajuda na quelação desses íons como o cálcio A ação do EDTA também pode prevenir a ação de enzimas dependentes de cofatores capazes interferir na estabilidade do DNA III pH A concentração de íons H no meio pode interferir na cinética da hibridização por motivos semelhantes ao dos sais monovalentes Um meio mais ácidos porém não tão ácido levemente abaixo do 7 é capaz de neutralizar os fosfatos negativos da estrutura do DNA permitindo taxas maiores de hibridização Um meio levemente alcalino permite que a sonda e sua molécula alvo interaja de forma satisfatória inibindo as interações entre cadeias não alvo Um meio muito ácido pode depurinizar ambas as cadeias moleculares sonda e alvo e um meio muito alcalino pode impedir a hibridização entre as cadeias IV Tamanho e concentração da sonda O tamanho da sonda está intimamente interligado com a temperatura Tm e a concentração de bases G e C Por exemplo quanto menor for a sonda maior será sua capacidade de discriminar sequências altamente semelhantes podendo ser diferida de apenas um par de base O tamanho da sonda também influencia na quantidade de energia temperatura necessária para que uma determinada molécula polinucleotídica em dupla cadeia se dissocie O conteúdo de bases C e G também estão interligados já que a interação GC é uma interação que requer uma maior quantidade de energia para que seja dissociada por conta das três ligações de hidrogênio envolvidas nessa interação tornando cadeias ricas em GC termodinamicamente mais estáveis do que AT A concentração vai influenciar na velocidade de hibridização Quanto maior a concentração de sondas no meio maior será a velocidade de hibridização da sonda e seu alvo Entretanto Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 51 concentrações extrapoladas podem favorecer interações inespecíficas fora do alvo V Erros fora do alvo Mismatching Toda sonda de qualidade ao ser comprada tem sua porcentagem de hibridizações com a fita alvo sob condições de alta rigorosidade formando duplex de cadeias polinucleotídicas As implicações de saber os possíveis pareamentos se traduz num maior rigor representado pelo meio impedindo que essas sondas sejam capazes de interagir com qualquer fragmento de DNA genômico Um pareamento imperfeito vai diminuir a velocidade de hibridização do processo e pode acontecer somente om uma única base nitrogenada Podendo representar um polimorfismo de uma base no gene a ser estudado ou erro ao desenhar a sonda VI Formamida e Ureia A formamida é uma cadeia nitrogenada capaz de desestabilizar a dupla fita de moléculas polinucleotídicas através de sua interação nas pontes de hidrogênio formadas entre os pareamentos entre as bases reduzindo assim a temperatura de fusão Entretanto essa é uma molécula tóxica e é bastante volátil em temperaturas necessárias para a hibridização Para evitar a exposição a fumaças tóxicas da formamida a ureia entra como uma via alternativa que também possuí a capacidade de desestabilizar as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas porém em concentrações muito menores quando comparada à formamida Marcadores Toda sonda é conjugada a um marcador com função de identificar ou reportar a presença da sonda caso esteja ligada à sequência alvo O primeiro marcador utilizado era um radioisótopo que se ligava ao arcabouço da cadeia polinucleotídica Essa marcação vinha através de um nucleotídeo marcado com um P radioativo 32P e era inserido na cadeia oligonucleotídica através da técnica de PCR Esse fosfato era transferido através de uma reação enzimática da polinucleotídeos cinase que transferia um único radioisótopo 32P de uma molécula de ATP para a extremidade 5 da nucleotídio Como apenas um átomo de 32P é incorporado pela cinase em cada fita de DNA as moléculas marcadas Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 52 não eram suficientemente radioativas para serem utilizadas como sondas de DNA Entretanto novas metodologias são empregadas com diferentes marcadores quimioluminescente e fluorescentes IMPORTANTE Existem três tipos de métodos para marcação 1 Radiomarcação 2 Incorporação de hapteno que irá suportar uma molécula não radioativa quimioluminescente 3 Marcação enzimática direta Essas técnicas são compatíveis para marcação de DNA e RNA para muitas aplicações Dentre os marcadores não radioativos mais comuns são a biotinilização marcação com digoxigenina DIG marcação com fluoresceína marcação direta enzimática e marcação com fluorocromos A biotina DIG e fluoresceína são marcadores cromogênicos ou seja geram cores por quimioluminescência Os fluorocromos são moléculas que emitem uma coloração específica ao serem excitadas com um feixe de luz a uma determinada amplitude de onda como acontece na Citometria de fluxo A seguir explicaremos como funciona alguns desses marcadores citados Síntese de Sondas Além dos variados métodos para marcação descritos há várias metodologias que permitem a formação das sondas Algumas dessas metodologias serão abordadas a seguir I Reação em Cadeia da Polimerase PCR é um excelente método para síntese de sondas visto que ele é capaz de amplificarduplicar o material genético adicionando novos nucleotídeos que podem ser marcados de formas diferentes Marcação por PCR oferece vantagens tais como velocidade versatilidade eficiência na reação e o fato de muitos Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 53 laboratórios estarem realizando PCR rotineiramente Quando realizados na presença de nucleotídeos marcados as sondas são feitas de modo que os nucleotídeos ficam presentes durante toda a cadeia oligonucleotídica e geralmente mostram um alto grau de marcação II Nick Translation É uma das técnicas mais antigas de criação de sondas Em uma molécula de DNA haverá mini cortes em seu arcabouço pela proteína DNase I Esses minis cortes servirão de moldes para a substituição da cadeia perdida III 5EndLabeling Outro método alternativo é a adição de fosfatos marcados na cadeia da sonda em sua extremidade 5 O método é coloquialmente chamado de reação de cinase ao transferir o β fosfato marcado de um ATP para um nucleotídeo contendo uma extremidade 5 desfosforilada Essa reação é um excelente método para marcar uma sonda curta IV 3 EndLabeling Essa técnica é realizada através da adição de um nucleotídeo marcado à extremidade 3 de um nucleotídeo Essa reação é catalisada por uma transferase terminal Uma característica mais da transferase terminal é que não existe nenhum requisito de molde isto é esta enzima é uma polimerase não dependente do molde Consequentemente qualquer uma de dNTP ou mistura de dNTP pode ser selecionada para adição à extremidade 3 de um polinucleótido RNA AntiSenso Durante a etapa da preparação das sondas de RNA há a transcrição de fita senso e da antisenso A fita de RNA antisenso é complementar ao mRNA sendo assim capaz de parear com ele Esse RNA pode ser utilizado para o estudo transcricional de um gene Além dessa habilidade o RNA antisenso pode inibir a expressão gênica a partir da sua interação com o mRNA formando uma molécula incapaz de ser traduzida devido a formação de uma dupla fita de RNA sendo esse o cerne do RNA de interferência iRNA Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 54 SAIBA MAIS Quer se aprofundar neste tema Recomendamos a leitura do artigo Eletrodos modificados com dna uma nova alternativa em eletroanálise acessível aqui RESUMINDO E então Gostou do que lhe mostramos Aprendeu mesmo tudinho Agora só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo vamos resumir tudo o que vimos Você deve ter aprendido sobre os princípios da hibridização de cadeias oligonucleotídicas a partir do princípio da interação WatsonCrick sobre a detecção de DNA a partir de uma cadeia oligonucleotídica conjugada Aprendeu também que essas cadeias estão conjugadas a um composto capaz de gerar cor podendo ser um fluorocromo cromóforo ou radioisótopo Compreendeu sobre as estruturas de uma sonda e quais os tipos de sondas existentes assim como suas funções e aplicabilidade Conheceu sobre os reagentes necessários para a construção das sondas e os tipos de corantes Viu que existem tipos de hibridização e pôde conhecer um pouco sobre esses tipos como DNA DNA DNARNA e RNARNA Por fim aprendeu sobre as técnicas de biologia molecular que utilizam as sondas como forma de diagnóstico entendendo melhor a sua funcionalidade laboratorial Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial 55 REFERÊNCIAS DESOUZA MT et al Técnicas Básicas em Biologia Molecular 2 ed Brasília Editora UnB 2016 CECCATO VM Biologia molecular Fortaleza EdUECE 2015 ROBERTIS E M de Biologia celular e molecular Rio de Janeiro Guanabara 2014 SARDINHA V dos S Dogma Central da Biologia Molecular Mundo Educação Disponível em httpsmundoeducacaoboluolcom brbiologiadogmacentralbiologiamolecularhtm Acesso em 17 ago 2019 ZAHA A et al Biologia molecular básica Porto Alegre Artmed 2014 Aplicação da Biologia Molecular no Diagnóstico Laboratorial No text found in this image