Lesão Miocárdica em Cães com Leishmaniose Visceral - Análise de Indicadores

Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 Avaliação dos indicadores de lesão miocárdica em cães com leishmaniose visceral Changes in myocardial injury indicators in naturally infected dogs with visceral leishmaniasis KCS Godoy1 PH Braz1 AR Assis1 TR Antunes2 DC Gomes3 AI Souza3 1Programa de pósgraduação Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal de Mato Grosso do Sul FAMEZUFMS Campo Grande MS 2Programa de Residência Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal de Mato Grosso do Sul FAMEZUFMS Campo Grande MS 3Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal de Mato Grosso do Sul FAMEZUFMS Campo Grande MS RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar os indicadores laboratoriais eletrocardiográficos e histológicos de lesão cardíaca em diferentes grupos clínicos de cães com leishmaniose visceral Foram analisados marcadores séricos traçado eletrocardiográfico e fragmentos de tecido cardíaco de 41 cães naturalmente infectados distribuídos em três grupos assintomático oligossintomático e sintomático Todos os animais apresentaram aumento na atividade sérica da enzima creatina quinase fração MB No traçado eletrocardiográfico o complexo de baixa voltagem foi o distúrbio de condução mais frequente 810 Na análise histológica 756 dos cães apresentaram reação inflamatória com predomínio de infiltrados linfohistiocítico 1331 de intensidade discreta a moderada e distribuição multifocal As alterações microscópicas identificadas no miocárdio foram independentes dos achados laboratoriais eletrocardiográficos e do quadro clínico apresentado pelos animais estudados A ausência de associação entre alterações histopatológicas e os parâmetros investigados alerta para a dificuldade de identificação de cardiopatia em cães com leishmaniose visceral e ressalta a importância de incluir a leishmaniose visceral no diagnóstico de patologias cardíacas principalmente em regiões endêmicas para o agente Palavraschave cardiomiopatia enzimas Leishmania marcadores bioquímicos miocardite ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the laboratory indicators electrocardiographic and cardiac histological lesions in different clinical groups of dogs with visceral leishmaniasis Serum markers were analyzed in conjunction with the electrocardiographic tracing and heart tissue fragments of 41 naturally infected dogs which were divided into three groups asymptomatic oligosymptomatic and symptomatic All animals showed increased activity in serum creatine kinase MB fraction In the electrocardiographic tracing low voltage complex was the most frequent conduction disorder 812 In the histological analysis 756 of the dogs showed inflammatory reaction with predominance of linfohistiocítico infiltrates 1331 of mild to moderate intensity and multifocal distribution Microscopic changes identified in the myocardium were independent laboratory findings an electrocardiographic and clinical picture presented by the studied animals The lack of association between histopathological changes and the parameters investigated indicate the difficulty in disease identification in dogs with visceral leishmaniasis and highlights the importance of including visceral leishmaniasis in the diagnosis of heart disease especially in endemic regions to the agent Keyword biochemical markers cardiomyopathy enzymes Leishmania myocarditis Recebido em 2 de março de 2015 Aceito em 15 de novembro de 2015 Email kcsgodoygmailcom httpdxdoiorg101590167841628236 Godoy et al 314 Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 INTRODUÇÃO A leishmaniose visceral LV é uma zoonose infectoparasitária com característica multissistêmica e desenvolvimento crônico No Brasil é causada pela Leishmania Leishmania infantum chagasi transmitida vetorialmente por fêmeas infectadas do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis durante o repasto sanguíneo Shaw 2006 Os caninos domésticos são considerados os principais reservatórios urbanos da leishmaniose visceral apresentam intenso parasitismo na pele e alta susceptibilidade à doença Ashford 1996 DantasTorres e BrandãoFilho 2006 A coincidência de agente infectante vetor evolução clínica e resposta imunológica entre as espécies humana e canina faz do cão um bom modelo experimental para a investigação das alterações causadas pelo parasito nos diversos órgãos inclusive o coração Alves et al 2010 A interação parasitohospedeiro é responsável pelas diferentes manifestações clínicas que podem variar de polissintomáticas a assintomáticas Os órgãos afetados são principalmente os do sistema fagocítico e os tecidos cutâneo e renal Silva et al 2013 Observação de sinais clínicos eou laboratoriais de comprometimento cardiovascular são raramente descritos e na maioria das vezes como casos isolados Torrent et al 2005 LópezPeña et al 2009 Apesar da pouca observação dos aspectos clínicos de cardiopatias estudo anatomopatológico em cães que desenvolveram LV após infecção natural constatou a presença de infiltrados inflamatórios em 100 dos miocárdios analisados Rosa et al 2014 Biomarcadores séricos de lesão em cardiomiócitos e avaliação eletrocardiográfica também foram utilizados na leishmaniose visceral canina LVC e julgados bons indicadores do envolvimento do músculo cardíaco contudo novas investigações são sugeridas já que não foi realizada avaliação histopatológica do miocárdio Silvestrini et al 2012 O objetivo deste estudo foi analisar os indicadores laboratoriais eletrocardiográficos e histológicos de lesão cardíaca em diferentes grupos clínicos de cães com leishmaniose visceral MATERIAL E MÉTODOS Um estudo transversal foi realizado com 41 cães sem restrição de sexo e raça idade entre um e cinco anos declarada pelo proprietário peso corporal de até 10 quilos e sorologicamente reagentes para leishmaniose visceral canina cedidos pelo Centro de Controle de Zoonoses do município de Campo Grande MS A infecção foi confirmada em todos os animais por meio da observação de formas amastigotas de Leishmania sp no exame parasitológico de linfonodo eou do baço Animais com presença de anticorpos antiEhrlichia canis verificados por meio de teste imunocromatográfico Senspert Vencofarma Brasil e com histórico de sinais clínicos sugestivos de cardiopatias foram excluídos do estudo Campo Grande está em uma área não endêmica para Trypanosoma cruzi e Dirofilaria immitis portanto infecções para esses agentes não foram consideradas Os animais foram agrupados de acordo com os sinais clínicos externos em assintomáticos ausência de sinais clínicos sugestivos da enfermidade oligossintomáticos presença de até três sinais clínicos entre eles adenopatia linfoide perda de peso e pelo opaco sintomáticos presença de mais de três sinais clínicos principalmente alterações cutâneas alopecia descamação úlceras hiperqueratose onicogrifose emagrecimento e ceratoconjuntivite Para avaliação da bioquímica sérica os cães foram mantidos em jejum alimentar e hídrico por 12 e duas horas respectivamente As amostras de sangue foram coletadas por punção da veia cefálica ou jugular e o soro obtido após centrifugação Todas as amostras foram armazenadas a 80ºC até realização dos ensaios A dosagem da atividade sérica das enzimas creatina quinase CK aspartato transaminase AST e creatina quinase fração MB CKMB e o teste rápido imunocromatográfico troponina I cardíaca cTnI Troponina K085 Bioclin Brasil foram utilizados como marcadores de lesão cardíaca Os valores de normalidade utilizados como referência para as enzimas foram estabelecidos por Kaneko et al 2008 Avaliação dos indicadores Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 315 Os ensaios bioquímicos realizados por método enzimático seguiram os protocolos disponibilizados nos kits comerciais Bioclin Belo Horizonte Minas Gerais Brasil com leitura em analisador bioquímico semiautomático O índice CKMB obtido pela razão CKMBCK foi utilizado para aumentar a especificidade da enzima CKMB Índices menores que 6 entre 620 e superiores a 20 foram considerados como lesão muscular injúria cardíaca e presença de macroenzimas CK macroCK respectivamente Para exclusão de macroenzimas nova dosagem da CKMB foi realizada após aquecimento do soro a 45ºC por 20 minutos de acordo com o protocolo do fabricante do kit diagnóstico Para a avaliação eletrocardiográfica ECG foi utilizado equipamento computadorizado ECGPCVET Tecnologia Eletrônica Brasileira na velocidade de 50mmseg registrada nas derivações I II III aVR aVL e aVF Os traçados eletrocardiográficos foram empregados para avaliar alterações de ritmo e condução elétrica no tecido cardíaco com base nas medidas da duração de onda P Pms amplitude de onda P PmV duração do intervalo PR intervalo QT duração e amplitude do complexo QRS Os valores encontrados foram comparados com os intervalos de referência estabelecidos por Wolf et al 2000 e distribuídos entre os grupos clínicos Após eutanásia os animais foram necropsiados e fragmentos de 1cm³ do tecido miocárdico foram retirados transversalmente da região septoventricular fixados em formol a 10 e submetidos ao processador automático de tecidos Após inclusão em parafina o material foi seccionado a 5µm de espessura e corado com hematoxilina e eosina HE para avaliação dos aspectos morfológicos e caracterização do infiltrado inflamatório no tecido cardíaco As lâminas foram analisadas em toda a extensão em microscopia óptica com objetivas de 4x 10x e 40X observandose a presença de infiltrado inflamatório necrose e fibrose Os infiltrados inflamatórios foram classificados em focal e multifocal a intensidade graduada de forma semiquantitativa em escores de 0 a 2 0 ausência 1 discreta a moderada na presença de pequenas ou médias lesões focais nas áreas estudadas 2 moderada a intensa quando observada a presença de focos maiores ou extensos de processo inflamatório Considerou se ainda o predomínio celular para a classificação do tipo de infiltrado inflamatório presente As alterações histológicas observadas foram distribuídas de acordo com os grupos clínicos A atividade sérica das enzimas assim como os resultados dos parâmetros eletrocardiográficos foi comparada entre os grupos clínicos por meio do teste KruskalWallis ou pelo teste de Dunn O teste quiquadrado 2 foi utilizado para verificar a associação de alterações histológicas com os diferentes grupos clínicos e o traçado eletrocardiográfico A correlação entre dados histológicos e o nível da atividade sérica enzimática foi realizada pelo teste de correlação de Spearman As diferenças foram consideradas significativas quando P005 O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul CEUA UFMS sob protocolo de número 4992013 RESULTADOS Diversas raças participaram do estudo incluindo Poodle 122 Pinscher 49 York Shire 49 Teckel 24 e Pug 24 porém a maioria dos cães eram animais sem raça definida 732 Em relação ao sexo 683 eram fêmeas e 317 machos Entre os sinais clínicos observados houve predomínio de dermatopatias linfadenomegalia e caquexia Após avaliação 171 dos animais foram classificados como assintomáticos 365 como oligossintomáticos e 463 como sintomáticos Os valores referentes à atividade enzimática da CK e da CKMB foram superiores ao intervalo de normalidade para espécie Inversão na proporcionalidade das enzimas CK e CKMB foi evidenciada em 100 das amostras com manutenção do índice CK acima de 20 mesmo após desnaturação das proteínas a 450C Valores das médias e desviopadrão da atividade sérica das enzimas e índice CK são apresentados na Tab 1 Diferença estatística significativa foi observada entre os grupos assintomático e sintomático quando considerados os níveis séricos de atividade enzimática da CKMB A cTnI sérica reagiu positivamente em 49 241 dos animais pesquisados Godoy et al 316 Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 Tabela 1 Valores médios e desviopadrão da atividade enzimática sérica creatina quinase CK creatina quinase fração MB CKMB aspartato transaminase AST e índice CK dos cães com leishmaniose visceral de acordo com os grupos clínicos Grupos CK UL CKMB UL AST UIL Índice CK referência 20220 11388 2366 620 Assintomático n7 24741748a 26301176a 480161a 1242391ª Oligossintomático n15 34922200ab 4884647ab 566251ab 1541539ab Sintomático n19 46852986ab 68123581bb 587220ab 1637611ab Total n41 35462222 52163263 545219 1582549 Médias seguidas por letras diferentes entre as linhas indicam diferença estatística significativa entre os grupos P005 Valores de referência Kaneko et al 2008 Fonte do intervalo de referência para o índice CK Melo et al 2008 No ECG 293 1241 dos animais apresentaram distúrbio na condução elétrica representada principalmente pelo complexo de baixa voltagem do QRS 812 bloqueio atrioventricular de segundo grau Mobitz II 212 alternância elétrica 112 e parada sinusal 112 Fig 1 A maior frequência dessas alterações foi observada nos cães sintomáticos 368 seguidos pelos oligossintomáticos 267 e assintomáticos 143 no entanto sem diferença significativa entre eles P005 Aumento na duração das ondas P 39 e dos complexos QRS 415 também foram evidenciados nos traçados eletrocardiográficos Os valores das médias e do desviopadrão dos parâmetros numéricos do ECG dos cães estão discriminados na Tab2 Figura 1 Representação das alterações eletrocardiográficas observadas nos cães com leishmaniose visceral A Complexos QRS de baixa voltagem setas B Alternância elétrica onda R de amplitude inferior às demais seta C Bloqueio atrioventricular de segundo grau Mobitz II na seta a presença de uma onda P não seguida por um complexo QRS e precedida por intervalos PR uniformes D Parada sinusal intervalo RR seta tracejada maior que intervalo RR seta contínua Traçados mostrados na derivação DII 50ms calibração padrão 1cm1mV Avaliação dos indicadores Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 317 Na análise histológica 756 3141 dos cães apresentaram reação inflamatória no fragmento miocárdico avaliado com predomínio de infiltrados com intensidade discreta a moderada 613 e distribuição multifocal 634 Os infiltrados do tipo linfohistiocítico 42 e linfohistioplasmocítico 355 foram os mais frequentes Vasculite 64 necrose 162 fibrose 129 e infiltrado de adipócitos 64 também foram observados Formas amastigotas no tecido miocárdio não foram visualizadas A classificação dos processos inflamatórios distribuídos de acordo com os grupos clínicos dos cães com LV são apresentados no Tab 3 Nenhuma associação estatística significativa P005 foi identificada entre esses parâmetros Tabela 2 Valores médios e desviopadrão de parâmetros numéricos do eletrocardiograma de cães com leishmaniose visceral distribuídos nos diferentes grupos clínicos Grupos clínicos Parâmetros eletrocardiográficos Pms PRms QRSms QTms PmV RmV Assintomáticos n07 42233ª 844154a 552102ª 1983193a 02101a 1207a Oligossintomático s n15 42867a b 798111a b 522117a b 1986199a b 01701a b 0803ab Sintomáticos n19 42462a b 884143a b 55591ab 1895268a b 01601a b 0905ab Referências 44510 91335 54716 202440 020001 12100 6 Pms duração da onda P ms PRms duração do intervalo PR ms QRSms duração do complexo QRS ms QTms duração do intervalo QT PmV amplitude de onda P mV RmV amplitude da onda R mV Médias seguidas por letras diferentes entre as linhas indicam diferença estatística significativa entre os grupos P005 Fonte Wolf et al 2000 Tabela 3 Classificação dos processos inflamatórios do miocárdio de cães com leishmaniose visceral distribuídos de acordo com os grupos clínicos Processo inflamatório Grupos clínicos Classificação Assintomáticos n 04 Oligossintomáticos n11 Sintomáticos n16 Distribuição Focal 01 250 03 273 01 062 Multifocal 03 750 08 727 15 938 Intensidade Leve a moderada 02 500 07 636 10 625 Moderada a intensa 02 500 04 364 06 375 Tipo do infiltrado Linfohistiocítico 03 750 02 182 08 500 Linfohistioplasmocítico 01 250 05 454 05 312 Linfoplasmocítico 00 000 03 273 03 188 Plasmohistiocítico 00 000 01 091 00 000 Não houve diferença significativa entre os grupos considerandose a frequência das características observadas entre eles ² P005 Correlação estatística não foi observada quando confrontada a intensidade do processo inflamatório e a atividade enzimática da CK P 028 r017 e CKMB P 025 r 018 Não foi identificada diferença estatística quando comparadas as alterações eletrocardiográficas com dados da análise histológica P005 DISCUSSÃO No presente estudo 100 dos animais apresentaram elevação nos valores da atividade sérica do marcador CKMB utilizado na investigação de lesão em cardiomiócitos Essa enzima está presente no citoplasma celular e Godoy et al 318 Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 aumenta consideravelmente sua atividade plasmática na presença de hipóxia ou necrose do miocárdio Diniz et al 2007 Apesar de a enzima CKMB ser considerada específica para injúria cardíaca recomendase a dosagem simultânea da atividade sérica da CK total Em todas as amostras analisadas o índice CK apontou a presença de CK atípicas denominadas de MacroCK mesmo após desnaturação das proteínas Esses valores podem estar associados ao aumento sérico de imunoglobulinas que leva à formação dessas macroenzimas e eleva falsamente os valores da CKMB quando aplicado o método cinético Lee et al 1994 Hoffman et al 2013 Segundo Yuu et al 1980 na presença de IgG as macroenzimas geradas não são inibidas pelos anticorpos antiM que são direcionados para a fração M da enzima mesmo após aquecimento Na LVC quanto maior o número de sinais clínicos maior é a concentração da imunoglobulina Pinelli et al 1994 Alexandre Pires et al 2010 e esses sinais podem justificar a associação estatística identificada entre os valores da CKMB e o grupo dos cães classificados como sintomáticos A cTnI é uma proteína presente unicamente em músculo cardíaco e liberada para a circulação de acordo com o grau de ruptura da membrana dos miócitos Vários trabalhos têm destacado a utilidade desse biomarcador na identificação de miocardiopatias de etiologia infecciosa Barr et al 2005 Diniz et al 2007 Carretón et al 2011 A investigação de lesão miocárdica em cães com LV utilizandose método quantitativo de análise apontou número superior de animais com aumento sérico da cTnI Silvestrini et al 2012 quando comparado aos 49 identificados no presente estudo Essa discrepância pode estar associada à diferença entre as metodologias de análise e a sensibilidade dos testes Testes qualitativos detectam cTnI a partir de 05ngmL enquanto testes quantitativos são capazes de identificar nível sérico inferior a 006 ngmL Outro fato a ser considerado é a variabilidade na liberação da cTnI Maior quantidade da proteína é liberada em injúrias miocárdicas agudas Smith et al 1997 portanto o teste pode apresentar baixa sensibilidade para doenças crônicas como a LVC O registro gráfico da atividade elétrica do coração é também uma importante ferramenta na investigação de cardiopatias O envolvimento miocárdico após quadros infecciosos inclusive a LV resulta no desenvolvimento de transtornos elétricos Souza et al 2008 Diamantino 2010 Sousa et al 2013 Durante a avaliação eletrocardiográfica 293 dos animais do estudo apresentaram distúrbios de condução com maior frequência de complexos de baixa voltagem relatados em processos inflamatórios do tecido cardíaco Pinto et al 2008 No entanto esses achados diferem das alterações observadas em cães com LV e complementam a lista de desordens eletrocardiográficas inespecíficas que podem ser identificadas em enfermidades infecciosas com envolvimento miocárdico Sousa et al 2013 O aumento da duração da onda P e do complexo QRS detectado nos cães estudados pode indicar tanto o aumento de átrio esquerdo e dos ventrículos quanto a presença de miocardiofibrose que provocam uma lentidão na condução elétrica Souza et al 2008 Manifestações clínicas e patológicas da LVC variam de acordo com a região endêmica e dependem de fatores intrínsecos relacionados ao vetor ao ambiente e ao hospedeiro e podem levar a modificações nas características da doença Alves et al 2010 Em inoculação experimental de hamsters com tecido medular de pacientes humanos com LV foi observada a presença de infiltrado inflamatório no miocárdio de 28 dos animais Oliveira 2009 Em humanos portadores da afecção a avaliação microscópica identificou infiltrados inflamatórios com frequência aproximada às do presente estudo e de outros trabalhos que utilizaram a espécie canina como modelo Morais et al 1988 LopezPeña et al 2009 Alves et al 2010 Rosa et al 2014 Esses dados reforçam o uso do cão como excelente modelo experimental para estudo do envolvimento cardíaco provocado pela parasitose Alves et al 2010 A presença de infiltrados inflamatórios de intensidade discreta a moderada no tecido cardíaco dos animais estudados assemelhase às observações de Alves et al 2010 e Rosa et al 2014 no entanto difere nos tipos celulares envolvidos na inflamação com predomínio do tipo linfohistiocítico O mecanismo fisiopatológico desencadeado pela Avaliação dos indicadores Arq Bras Med Vet Zootec v68 n2 p313320 2016 319 doença pode ser responsabilizado pelo afluxo de células ao tecido Até o momento não há um consenso se a resposta cardíaca é reacional em decorrência da ação dos anticorpos circulantes e da deposição de imunocomplexos no miocárdio ou induzida pela ação direta do parasito ao órgão Morais et al 1988 Mendes et al 2014 Rosa et al 2014 A observação de focos inflamatórios fibrose vasculite e infiltrados de adipócitos no miocárdio dos cães mesmo na ausência de transtornos elétricos sugere que a evolução do processo inflamatório pode levar à fibrose difusa ou perivascular Essas modificações teciduais podem alterar a função cardíaca uma vez que levam à rigidez miocárdica à redução do fluxo sanguíneo e à isquemia no órgão Willenheimer 2000 As alterações microscópicas identificadas no miocárdio foram independentes dos achados laboratoriais eletrocardiográficos e do quadro clínico externo apresentado pelos animais estudados CONCLUSÃO Esses dados alertam para a dificuldade de identificação de cardiopatia em cães com leishmaniose visceral quando utilizados esses métodos de investigação e ressaltam a importância de incluir a leishmaniose visceral no diagnóstico de patologias cardíacas principalmente em regiões endêmicas para o agente REFERÊNCIAS ALEXANDREPIRES G BRITO MT ALGUERÓ C et al Canine leishmaniasis Immunophenotypic profile of leukocytes in different compartments of symptomatic asymptomatic and treated dogs Vet Immunol Immunopathol v137 p27583 2010 ALVES GBB PINHO FA SILVA SMMS et al Cardiac and pulmonary alterations in symptomatic and asymptomatic dogs infected naturally with Leishmania Leishmania chagasi Braz J Med Biol Res v43 p310315 2010 ASHFORD RW Leishmaniasis reservoirs and their significance in control Clin Dermatol v4 p523532 1996 BARR SC WARNER KL KORNREIC BG A cysteine protease inhibitor protects dogs from cardiac damage during infection by Trypanosoma 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