Biotecnologia Farmacêutica

Autores Prof Juliano Rodrigo Guerreiro Profa Enny Fernandes Silva Colaborador Prof Luiz Henrique Cruz de Mello Biotecnologia Farmacêutica Professores conteudistas Juliano Rodrigo Guerreiro Enny Fernandes Silva Juliano Rodrigo Guerreiro Graduado em FarmáciaBioquímica pela Universidade de São Paulo FCFUSP 2004 e Doutor em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo IQUSP 2009 Realizou pósdoutorado com ênfase em Bioquímica de Plantas pela Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo ESALQUSP entre 2009 e 2012 Tem formação de especialista em Mariologia pela Universidade Dehoniana 2017 É coordenador do curso de Farmácia desde 2008 e professor titular da UNIP desde 2009 Enny Fernandes Silva Graduada em Ciências Biológicas modalidade médica bacharel em Biomedicina pela Universidade Santo Amaro Unisa 1981 possui especialização em Clonagem em Bacillus subtilis pelo Public Health Department of the City of New York 1982 mestrado em Bioquímica na área de Biologia Celular e Molecular 1989 e doutorado em Bioquímica na área de Biologia Celular e Molecular 2003 ambos pela Universidade de São Paulo USP Tem pósdoutorado na Faculdade de Medicina da USP com Dr Roger Chammas na área de Adesão Celular Atualmente é docente titular da Universidade Paulista UNIP Todos os direitos reservados Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma eou quaisquer meios eletrônico incluindo fotocópia e gravação ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista Dados Internacionais de Catalogação na Publicação CIP G934b Guerreiro Juliano Rodrigo Biotecnologia Farmacêutica Juliano Rodrigo Guerreiro Enny Fernandes Silva São Paulo Editora Sol 2022 140 p il Nota este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP Série Didática ISSN 15179230 1 Fermentação 2 Cultura 3 Nanotecnologia I Guerreiro Juliano Rodrigo II Silva Enny Fernandes III Título CDU 6631 U51476 22 Prof Dr João Carlos Di Genio Reitor Profa Sandra Miessa Reitora em Exercício Profa Dra Marilia Ancona Lopez ViceReitora de Graduação Profa Dra Marina Ancona Lopez Soligo ViceReitora de PósGraduação e Pesquisa Profa Dra Claudia Meucci Andreatini ViceReitora de Administração Prof Dr Paschoal Laercio Armonia ViceReitor de Extensão Prof Fábio Romeu de Carvalho ViceReitor de Planejamento e Finanças Profa Melânia Dalla Torre ViceReitora de Unidades do Interior Unip Interativa Profa Elisabete Brihy Prof Marcelo Vannini Prof Dr Luiz Felipe Scabar Prof Ivan Daliberto Frugoli Material Didático Comissão editorial Profa Dra Christiane Mazur Doi Profa Dra Angélica L Carlini Profa Dra Ronilda Ribeiro Apoio Profa Cláudia Regina Baptista Profa Deise Alcantara Carreiro Projeto gráfico Prof Alexandre Ponzetto Revisão Larissa Wostog Kleber Souza Sumário Biotecnologia Farmacêutica APRESENTAÇÃO 9 INTRODUÇÃO 9 Unidade I 1 INSUMOS E PRODUTOS OBTIDOS POR PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS 13 11 Ingrediente farmacêutico ativo IFA 13 12 Insumos para antibióticos βlactâmicos penicilina e cefalosporina 14 13 Insumos para proteínas terapêuticas recombinantes 19 14 Insumos para fatores de coagulação sanguínea recombinantes e anticoagulantes heparinas 22 15 Insumos para anticorpos 24 16 Insumos para eritropoetina EPO fator de crescimento hematopoiético 27 17 Insumos para vacinas 29 171 IFAs para vacinas contra covid19 31 2 TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS 32 21 Início do processo 34 211 Meios de culturas e seus suplementos mosto temperatura e pH 34 212 Microrganismo selecionado microrganismos de importância para a indústria farmacêutica 35 213 Presença ou ausência de oxigênio estéril ar comprimido 35 214 Método de esterilização da dorna 35 215 Agitadores 36 22 Durante o processo 38 23 Final do processo 38 3 EXEMPLOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS 39 31 Fermentação alcoólica canadeaçúcar 39 32 Fermentação alcoólica cerveja 40 33 Fermentação alcoólica vinho 41 34 Fermentação lática iogurte 43 35 Fermentação do pão 44 36 Fermentação para a produção de vitaminas 44 37 Fermentação para a produção de soros e vacinas 45 38 Fermentação para a produção de antibióticos 46 39 Fermentação para a produção de esteroides 46 4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA TÉCNICAS E APLICAÇÕES 47 41 Métodos de extração e purificação de DNA e RNA 47 42 Técnicas de DNA recombinante clonagem molecular construção de vetores e enzimas de restrição 48 43 Sequenciamento de DNA 53 44 Aplicações 57 Unidade II 5 DESENVOLVIMENTO FARMACÊUTICO DE MEDICAMENTOS BIOLÓGICOS BIOFÁRMACOS 65 51 Técnica de produção de proteínas recombinantes 66 52 Medicamentos fabricados por DNA recombinante 68 53 Biossimilares 71 54 Comercialização 71 55 Produção de biofármacos em cultura de células animais hibridomas 72 551 Cultura celular 72 552 Cultura de células primárias 73 553 Células tumorais 76 554 Linhagens celulares 78 56 Produção de fármacos 80 6 NANOTECNOLOGIA FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES 81 61 Aplicação da nanotecnologia no desenvolvimento de vacinas 85 611 O que é vacina 86 612 Tipos de imunização 88 613 Tipos de vacina89 614 Desenvolvimento de vacinas 92 615 Aplicação da nanotecnologia no desenvolvimento de novas vacinas 95 7 TECNOLOGIAS DE PREPARAÇÃO DE SISTEMAS ORAIS DE LIBERAÇÃO MODIFICADA 96 71 Projeto racional de sistemas de liberação modificada 97 72 Formas de dosagem oral de dispersão rápida 99 73 Liberação entérica modificada 99 74 Liberação pulsátil 100 75 Técnicas de formação de floss 100 76 Tecnologia de impressão tridimensional 3D na preparação de sistemas de liberação oral 100 77 Tecnologia de deposição eletrostática para revestimento farmacêutico em pó 101 78 Vantagens e desvantagens da liberação modificada 101 79 Nanotecnologia aplicada aos cosméticos inteligentes 102 791 Lipossomas 104 792 Niossomas 107 793 Nanocristais 108 794 Nanopartículas lipídicas sólidas SLN 108 795 Nanopartículas superparamagnéticas e magnéticas 109 796 Nanopartículas metálicas 110 797 Nanoesferas110 798 Dendrímeros 111 799 Nanotubos de carbono 111 7910 Cubossomos 112 8 NANOTECNOLOGIA NA ÁREA FARMACÊUTICA APLICAÇÕES 113 81 Medicamentos biológicos no tratamento do diabetes 113 811 Vias de administração da insulina 116 82 O microambiente tumoral como estratégia de direcionamento de nanopartículas 122 83 Medicamentos biológicos para o tratamento de doenças raras 125 9 APRESENTAÇÃO Este livrotexto possui linguagem didática dirigida primordialmente para a fundamentação básica do aluno com o objetivo de proporcionar o uso racional de horas de estudo e a consolidação dos conhecimentos teóricos que servirão de subsídio a outras disciplinas durante o curso A organização do presente material segue uma estrutura de apresentação de conceitos de forma a facilitar o aprendizado obedecendo também aquela utilizada nas aulas presenciais Os tópicos contemplam os aspectos que envolvem conceitos fundamentais em bioengenharia Dessa forma primeiramente falaremos sobre o histórico e a definição de bioengenharia Depois abordaremos aspectos básicos sobre engenharia genética cultivo de células e transgenia Adiante o estudo estará mais voltado para as célulastronco e os aspectos de biossegurança relacionados à utilização de ferramentas de bioengenharia Além disso exibiremos os conceitos e os métodos de fabricação de soros e vacinas Por fim trataremos de temas como sequenciamento genético aplicações dessa técnica na saúde técnicas de nanotecnologia e produção de biomateriais Assim ao final da leitura deste livrotexto você aluno deverá ser capaz de compreender os principais conceitos que envolvem DNA recombinante cultura celular técnicas de transgenia vacinas e sequenciamento Além disso você deverá estar a par dos principais aspectos referentes à biossegurança e à produção de biomateriais assim como desenvolver habilidades dentro do campo da bioinformática uma vez que esta vem sendo utilizada como ferramenta valiosa dentro da biotecnologia Boa leitura INTRODUÇÃO Segundo a Organização das Nações Unidas ONU biotecnologia significa qualquer aplicação tecnológica que utilize sistemas biológicos organismos vivos ou seus derivados para fabricar ou modificar produtos ou processos para utilização específica ONU 1992 p 9 Podemos sugerir que a biotecnologia se iniciou há muito tempo talvez milhares de anos atrás com processos de fermentação que utilizava seres vivos como bactérias e leveduras para produzir bebidas ou alimentos como pão ou queijo e que após muitos anos foram aprimorados para obtenção de proteínas de diferentes funções antibióticos ou outros medicamentos aminoácidos vitaminas solventes industriais pigmentos pesticidas entre outros produtos Há alguns anos estamos acompanhando um aprimoramento na área da biotecnologia principalmente nas ciências ômicas epigenômica genômica proteômica transcriptômica e metabolômica e no estudo de dados epidemiológicos levandonos ao melhor entendimento do funcionamento das células isoladas dos tecidos e dos órgãos chegando a relacionar vários mecanismos que levam a doenças bem como identificar potenciais alvos terapêuticos 10 Caso em uma via metabólica ocorra deficiência de determinada enzima ou proteína elas poderão ser produzidas em diferentes sistemas de expressão por exemplo bactérias leveduras células de plantas insetos e mamíferos sendo posteriormente purificadas e comercializadas Quando administradas essas proteínas aumentam a expectativa de vida do paciente Após a primeira aprovação do biofármaco insulina humana recombinante Humulin para o uso em seres humanos em 1982 produzida pela indústria farmacêutica Eli Lilly novos biofármacos entraram no mercado farmacêutico e impulsionaram a tecnologia No que se refere a medicamentos produzidos por biologia molecular podemos citar aqueles que usam bactérias por exemplo Escherichia coli ou leveduras por exemplo Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris como hospedeiros de vetores construídos para a produção de produtos biológicos que não necessitam de modificações póstraducionais mais complexas Caso haja necessidade dessas modificações para se ter estabilidade proteica e atividade biológica completa são necessárias outras células eucarióticas como hospedeiros que tenham condições de inserir por exemplo cadeias de carboidratos em regiões específicas da cadeia de aminoácidos de determinada proteína no processo chamado glicosilação Como exemplo podemos citar diversas linhagens celulares que são empregadas na expressão de proteínas recombinantes como as células de mamíferos HEK 293 células de rim humano embrionário CHO Chinese hamster ovary ou células de ovário de hamster chinês e BHK baby hamster kidney ou células de rim de filhotes de hamster Atualmente já existem estudos com uso de coelhos e cabras transgênicas como biorreatores industriais cujo produto de interesse a proteína recombinante é produzida pelo tecido das glândulas mamárias geneticamente modificadas desses animais e liberada solúvel no leite Como exemplo de medicamento produzido dessa maneira destacase o Atryn antitrombina alfa recombinante A biotecnologia como é muito abrangente pode ser relacionada e classificada em cores mediante o setor de atuação Biotecnologia verde aplicada na agricultura especialmente na criação de sementes e plantas geneticamente modificadas para obter plantações mais resistentes às pragas e substâncias químicas pesticidas e agrotóxicos por exemplo além de poder melhorar o teor vitamínico e levar a produção mais sustentável de baixa agressão ao meio ambiente Biotecnologia vermelha associada à cor do sangue está relacionada com o desenvolvimento de novos tratamentos diagnósticos ou medicamentos Biotecnologia azul visa procurar moléculas em plantas ou animais marinhos como algas para o tratamento de doenças Biotecnologia marrom analisa plantas solo animais e clima de ambientes desérticos Biotecnologia branca ligada a processos industriais com substâncias menos poluentes matériasprimas reaproveitáveis processos enzimáticos e fermentativos biorreatores para microrganismos plantas animais e células modificadas geneticamente ou não São exemplos 11 a produção de imunobiológicos alimentos biocombustíveis compostos bioquímicos vacinas fármacos cosméticos tratamento de efluentes e águas Biotecnologia laranja voltada aos campos de informação divulgação científica e ensino para disseminar os conhecimentos da área que envolvam materiais e estratégias educacionais para que ao ser ensinada nas escolas possa angariar novos discípulos para seu desenvolvimento Biotecnologia roxa relacionada com questões legais e de regulamentação abordadas em biodireito bioética proteção intelectual e industrial regulamentações e bioempreendedorismo Biotecnologia dourada relacionada com as chamadas ciências ômicas e bioinformática Envolve a compreensão do funcionamento molecular dos seres vivos com o estudo de genômica proteômica transcriptômica metabolômica sequenciamentos e mapeamento de relações entre moléculas e funções biológicas Biotecnologia cinza ligada à preservação do meio ambiente e da biodiversidade principalmente da biodiversidade genética Como exemplos podemos citar a construção de banco de materiais genéticos banco de células e organismos monitoramento da biodiversidade e do meio ambiente caracterização genética e biomolecularômicas manejo e conservação da biodiversidade e de ecossistemas hábitats e biomas brasileiros evolução cuidados com solos e águas biorremediação etc Biotecnologia preta ligada ao malefício do saber usa o conhecimento para o mal como no bioterrorismo que tem como lema desenvolver armas biológicas com toxinas e microrganismos desenvolvidos em laboratórios que podem causar doenças em seres humanos animais e vegetações na intenção de escravizar uma parte da população Se adicionarmos à área da biologia a área de exatas como engenharia mecânica biofísica eletroeletrônica e de materiais chegamos à produção de próteses biomateriais para enxertos biossensores e equipamentos inovadores de diagnóstico médico Gregor Mendel em um trabalho publicado em 1866 discutiu mecanismos da hereditariedade ou herança biológica com estudos de cor e forma das ervilhas e desde então o conhecimento nessa área não parou mais Observação A área da genética como alvo da biotecnologia também será contemplada neste livrotexto O melhoramento genético de plantas e animais pode trazer vários benefícios como o aumento na produção de proteína animal entre outras qualidades Em relação às plantas podemos citar mudanças no tempo de amadurecimento o que ampliaria o tempo de prateleira e em relação aos seres humanos 12 podemos citar experiências enfocando a terapia gênica que permitiria identificar a predisposição a algumas doenças genéticas e intervir nos genes responsáveis ainda na fase de gestação como em síndrome de Hunter atrofia muscular espinhal AME e outras Contudo é importante ter em mente que a edição de genes em plantas e animais racionais ou irracionais deve seguir conceitos éticos que nunca devem beirar a discriminação ou o benefício de uns em detrimento de outros Saiba mais Para saber mais a respeito do uso da genética no tratamento de doenças raras leia o artigo a seguir GIUGLIANI R Terapia gênica uma esperança para as pessoas com doenças raras Veja Saúde 20 maio 2021 Disponível em httpscuttlySUndHtS Acesso em 28 dez 2021 Como a genética se complementa com a bioquímica podem ser observados neste livrotexto a biologia molecular e o uso da bioinformática para a análise de dados O avanço do conhecimento modificou completamente o mundo atual tornando possível por exemplo criar clones alimentos transgênicos resistentes às pragas realizar testes de paternidade e solucionar crimes mapear doenças e realizar aconselhamento genético Em nosso livrotexto enfocaremos mais as biotecnologias vermelha dourada e branca que estão relacionadas aos processos médicos e de saúdedoença tanto humana quanto veterinária principalmente na área de reprodução artificial que nos leva ao cultivo celular in vitro de órgãos e tecidos animais inseminação artificial fertilização in vitro novas terapias e métodos de diagnóstico Técnicas usadas em genética imunologia fisiologia biofísica biologia molecular célulastronco oncobiologia neurobiologia entre outras são estudadas e adaptadas para terapia celular terapia gênica e manipulação cromossômica fabricação de anticorpos análise citogenética e diagnóstico molecular conforme veremos a seguir 13 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Unidade I 1 INSUMOS E PRODUTOS OBTIDOS POR PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS Matériasprimas também conhecidas como insumos são as substâncias que serão transformadas nos produtos ou no próprio produto final caso elas sejam o elemento importante do medicamento o princípio ativo como antibióticos proteínas terapêuticas recombinantes anticorpos eritropoetina e vacinas Os insumos biológicos ou bioinsumos podem ser provenientes de microrganismos materiais vegetais orgânicos ou naturais essenciais para a produção de determinado produto farmacêutico ativo ou ingrediente farmacêutico ativo IFA 11 Ingrediente farmacêutico ativo IFA Ingrediente ou insumo farmacêutico ativo IFA também chamado de princípio ativo é a substância que possui efeito terapêutico ou ação farmacológica por exemplo o vírus inativado no caso de vacina Em alguns casos o IFA é o nome da molécula usada nos medicamentos genéricos por exemplo ácido acetilsalicílico ou AAS associado com a concentração correspondente no medicamento 10 mg 40 mg que pode ser comercializada com o nome comercial ou fantasia Aspirina O Brasil não fabrica mais IFAs para diversos medicamentos pois as indústrias farmacêuticas transferiram a produção para outras filiais Cerca de três décadas atrás o Brasil fabricava metade de todo o IFA usado no país mas atualmente somente 5 é feito no território brasileiro o restante é importado No início dos anos 1990 houve a transferência da fabricação de penicilina e de outros medicamentos como heparina para outros países fato que nos leva ao aumento de dependência em relação à China e à Índia países que concentram a produção de insumos e IFAs mundiais Lembrete A empresa farmacêutica deve comprovar que o nível de risco dos IFAs é baixo ou está controlado sendo necessário o gerenciamento de riscos e de boas práticas de fabricação dos medicamentos ANVISA 2019 inclusive a validação da limpeza levandose em consideração que a exposição diária permitida PDE do inglês permitted daily exposure dos funcionários é uma importante ferramenta de análise toxicológica e do sistema de qualidade farmacêutica Com esse tipo de dependência qualquer problema nos países fabricantes irá impactar em nossa produção interna como foi possível perceber no caso da produção das vacinas CoronaVac e Covishield AstraZenecaOxford que são purificadas e envasadas nos laboratórios do Instituto Butantan em São 14 Unidade I Paulo e da Fiocruz no Rio de Janeiro a partir dos IFAs provenientes da China e da Índia Pensando em se precaver o Brasil realizou acordos de transferência de tecnologia respectivamente com os laboratórios Sinovac e AstraZeneca Sofrendo com a submissão aos países mais desenvolvidos em termos farmacológicos em 1996 foi aprovada a Lei de Patentes Lei n 92791996 a qual estabelece que um fármaco só pode ser produzido no país pela empresa detentora da patente ou seja a que detém a propriedade intelectual Geralmente o prazo de uma patente farmacêutica é de 20 anos para que seu titular possa explorar economicamente o ativo Quando chega a data de expiração da patente de um medicamento sua fórmula entra em domínio público ou seja todos terão acesso aos detalhes técnicos daquela invenção e qualquer laboratório poderá produzir aquele medicamento sem ter que pagar algo para o titular da patente É nessa fase que surgem os medicamentos genéricos cujas fórmulas já são de domínio público O fato de qualquer laboratório poder produzir os medicamentos de domínio público justifica o fato de os medicamentos genéricos serem mais baratos Entretanto nem sempre o percurso da patente até sua expiração segue esse caminho A legislação que trata de patente Lei n 92791996 permite algumas flexibilizações e uma delas se chama licença compulsória A licença compulsória é uma antecipação da expiração da patente ou seja a patente entra em domínio público antes do prazo comum Da mesma forma que ocorre em qualquer processo de expiração de patente o titular não deixa de ter lucros com o ativo e sim uma queda deles caso outros laboratórios queiram produzir o medicamento A primeira quebra de patente na América Latina ocorreu no Brasil em 2007 com o medicamento Efavirenz utilizado no tratamento de síndrome da imunodeficiência adquirida Aids tornando o acesso ao fármaco mais facilitado pois seu custo diminuiu e consequentemente sua oferta aumentou Em alguns casos a indústria farmacêutica reduz o preço do medicamento no período próximo à expiração da patente na tentativa de deixálo mais popular 12 Insumos para antibióticos βlactâmicos penicilina e cefalosporina Podemos conceituar antibiótico como uma substância capaz de matar bactérias bactericidas ou inibir o crescimento de bactérias bacteriostáticos não afetando nossas células da mesma forma que afeta os microrganismos Observação Caso ocorra alguma manifestação de bactérias ou seja se formos afetados de alguma maneira esses sinais são chamados efeitos adversos Os antibióticos naturais são produzidos por microrganismos cada um com necessidades diferentes o que leva ao uso de matériasprimas ou meios de cultura diferentes Esse medicamento natural produzido por um ser vivo bactéria fungo ou planta pode ser modificado na indústria recebendo 15 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA então a denominação semissintético Os medicamentos sintéticos diferem dos semissintéticos por serem sintetizados totalmente em laboratórioindústria com o auxílio de técnicas de química farmacêutica Para fabricar por exemplo penicilina G ou V tipos de antibiótico natural necessitamos de inóculo microrganismo meio de cultura agitação bem como condições de pH e temperaturas controlados dorna ou tanque de fermentação e métodos físicoquímicos de purificação O microrganismo inicial para produção de penicilina é um fungo filamentoso chamado inóculo que pode ser Penicillium chrysogenum Penicillium notatum ou Aspergillus nidulans Estes serão inoculados em dornas biorreatores ou tanques de fermentação de aço inoxidável com meio de cultura microbiológico sopa de nutrientes devidamente esterilizados ou seja sem contaminação com outros microrganismos O meio de cultura pode ter por exemplo água de milho arroz ou trigo como fonte de nitrogênio glicose ou melaço como fontes de carbono e substâncias especiais como aminoácidos essenciais ácido αaminoadípico valina e cisteína que são fundamentais para o crescimento desses fungos Para o processo de esterilização a dorna e o meio de cultura são expostos ao calor úmido vapor por determinado tempo Nessa dorna ocorrerá o processo chamado fermentação que modifica o meio de cultura chamado mosto por conta das reações provenientes do metabolismo do microrganismo mudando o nome de mosto para vinho O tema fermentações será abordado mais adiante A penicilina foi o primeiro antibiótico descrito em literatura Apesar de ter sido descoberta por Alexander Fleming em 1928 foi usada em seres humanos para tratar tuberculose apenas em 1940 sendo o primeiro de muitos outros antibióticos descobertos provenientes de diversos microrganismos e de diferentes ecossistemas aquáticos ou terrestres como a estreptromicina a partir de colônias de Streptomyces griseus descoberta em 1944 a cefalosporina proveniente de Cephalosporium acremonium em 1945 o cloranfenicol proveniente de Streptomyces venezuelae em 1947 o antibiótico vancomicina em 1956 e a gentamicina proveniente de Streptomyces orientalis em 1963 entre outros Observação Em bioquímica caracterizamos como fermentação um processo que ocorre nas células quando não há ou há pouco oxigênio Na indústria o termo é usado por ser um processo que utiliza microrganismos Apesar de o processo para obtenção de antibióticos ser chamado fermentação necessita de ar estéril pois não é possível contaminar o crescimento de determinada cepa bem como de seu produto com ar que contenha milhões de bactérias esporos sólidos e líquidos indesejáveis além de necessitar de agitação e temperatura controlada quase sempre entre 25 C e 27 C e pH em torno de 65 No caso específico da produção de penicilina o vinho ou meio de cultura modificado será filtrado para retirar o micélio hifas do fungo e serão iniciadas várias extrações com diferentes solventes orgânicos como acetato de butila ou amila em pH baixo e temperatura baixa adsorção em resinas 16 Unidade I filtração e precipitação da penicilina com acetona Em seguida a partir da fração líquida fazse a cristalização por meio de isopropanol centrifugação e secagem Pelo processo de fermentação do fungo Penicillium chrysogenum é possível produzir formas diferentes de penicilinas como F G K O X e V Na prática clínica são usadas somente as penicilinas G e V produzidas mediante os percursores adicionados ao meio de cultura que ficarão ligados na cadeia lateral os quais determinam características antibacterianas e farmacológicas distintas Se adicionar à dorna sais de ácido fenilacético AFA será produzida a penicilina G ou benzilpenicilina se forem adicionados sais de ácido fenoxiacético AFNA obtémse penicilina V ou fenoximetilpenicilina e a partir destes obtémse o 6APA constituído de um anel com quatro carbonos chamado de βlactâmico e um anel de cinco carbonos chamado tiazolídinico ligado a AFA ou a AFNA O ácido 6aminopenicilânico 6APA é precursor para a família de penicilinas conforme mostrado na figura a seguir Caso sejam adicionados outros radicais ao 6APA teremos outras penicilinas chamadas semissintéticas uma parte natural e outra fabricada em laboratório de acordo com o quadro a seguir Cadeia lateral Anel tiazolidina Anel betalactâmico CH3 CH3 COOH S N C O N H H C O R Figura 1 Estrutura geral das penicilinas no R radical do 6APA onde serão adicionados os radicais Quadro 1 Penicilinas e seus radicais mais comuns Radical R Penicilina correspondente nome usual CH2 Benzilpenicilina penicilina G CH3CH2CH CHCH2 2 pentenilpenicilina penicilina F CH3CH2 CHCH2CH2 3 pentenilpenicilina CH3CH24 N amilpenicilina di hidropenicilina F CH3CH26 N heptilpenicilina penicilina K CH2 HO P hidroximetilpenicilina penicilina X OCH2 Fenoximetilpenicilina penicilina V Fonte Campbell et al 2001 p 78 17 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA As penicilinas naturais são penicilina G cristalina penicilina G procaína penicilina G benzatina ou benzilpenicilina e penicilina V As penicilinas semissintéticas atualmente disponíveis para uso clínico no Brasil são as aminopenicilinas ampicilina e amoxacilina Como algumas bactérias patogênicas possuem a enzima βlactamase que pode clivar o anel penicilânico anel 6APA a indústria farmacêutica pode associar as penicilinas com inibidores de betalactamases como o ácido clavulânico que também possui ação bactericida O uso descontrolado dos antibióticos pela população sem prescrição médica e em posologia errada chamado automedicação juntamente com a facilidade de compra nas farmácias levou à resistência bacteriana ou seja a adaptação a esses medicamentos sem que haja morte dos microrganismos refletindo no aumento do tempo de internação e da piora do estado do paciente que só se recuperará com o auxílio de outros antibióticos Essa foi uma das causas que levou à necessidade de produção de outras penicilinas com cadeias laterais diferentes e os grupos funcionais adicionados à sua estrutura mudando a ação biológica Observação Desde 24 de outubro de 2010 foi determinado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa por meio da Resolução da Diretoria Colegiada n 44 que os antibióticos vendidos nas farmácias e drogarias do país só poderão ser entregues ao consumidor mediante receita de controle especial em duas vias A primeira deve ficar retida no estabelecimento farmacêutico e a segunda deve ser devolvida ao paciente com carimbo para comprovar o atendimento ANVISA 2009 No caso da produção da cefalosporina outro antibiótico betalactâmico é usado o fungo Acremonium anteriormente conhecido como Cephalosporium O antibiótico é obtido como produto da fermentação do ácido 7aminocefalosporânico 7ACA figura a seguir e da mesma forma que acontece na produção das penicilinas pode ter radicais incorporados em R1 R2 e R3 o que gera as cefalosporinas de 1ª 2ª 3ª 4ª e 5ª gerações cada uma com o espectro de ação e resistência à degradação enzimática diferenciadas COH R2 R3 R1 NH H O S N A B 7 3 O Figura 2 Estrutura de 7ACA Observe a presença de R1 R2 e R3 que podem ser substituídos por vários ligantes 18 Unidade I A descoberta da cefalosporina se deu com o pesquisador italiano Giuseppe Brotzu Ele não compreendia por que a febre tifoide era menos virulenta em sua cidade e por que muitos jovens que nadavam no mar perto de onde era liberado esgoto não eram acometidos pela doença Esse fato intrigante o levou em 1945 a analisar uma amostra de água dos esgotos que eram liberados no mar Ele isolou um fungo produtor de uma substância que atacava bactérias Gramnegativas como a Enterobacteriaceae a Salmonella spp e a Salmonella typhi que recebeu o nome de Cephalosporium acremonium atualmente Acremonium chrysogenum Para estudos complementares Brotzu enviou uma amostra para Oxford e tão logo relatado à comunidade científica em 1960 a indústria farmacêutica norteamericana Eli Lilly fundada em 1876 lançou as primeiras cefalosporinas no mercado Para a produção de cefalosporina as matériasprimas insumos em termos de fonte de carboidratos são glicose usada na primeira parte da fabricação para o crescimento celular chamado metabolismo primário e sacarose para o chamado metabolismo secundário que tem a função de produzir a cefalosporina C encontradas em água de maceração de milho ou adicionadas separadamente O meio de fermentação deve conter metionina ácido αaminoadípico valina e cisteína que podem estar contidos em extrato de carne ou serem adicionados separadamente além de ácido oleico fosforo e acetato de amônio como maior fonte de nitrogênio em pH 70 com temperatura de 25 C a 28 C e oxigênio Na estrutura do 7ACA podemos observar R1 R2 e R3 no 7ACA cefalosporina C ao qual pode se ligar vários radicais que permitem o aparecimento de muitas combinações levando a diferentes propriedades farmacocinéticas e espectros de atividade Em geral o radical R1 leva a mudanças no espectro de atividade antibacteriana e no R2 altera propriedades farmacocinéticas até mesmo possibilitando o uso por via oral ou via parentérica As cefalosprinas podem ser sintetizadas das seguintes maneiras Primeiras cefalosprinas cefalotina cefaloridina cefradina cefadroxil cefazolina cefalexina e cefatrizina a partir da união do 7ACA com acilo do cloreto de ácido Cefalosporinas de segunda geração cefamandol cefaclor cefuroxima cefonicida cefoxitina e cefotetan pela união 7ACA com o grupo metoximino na posição 7 Cefalosporinas de terceira geração cefotaxima cefsulodina ceftazidima cefoperazona ceftriaxona e cefixima com o radical acetil Cefalosporinas de quarta geração cefepime e cefpiroma com a adição de grupos acídicos na posição 7 Cefalosporinas de quinta geração muito usadas contra estafilococos meticilinorresistentes como MRSA VISA e VRSA e como opção para alérgicos a oxacilina ou glicopeptídeos ceftaroline e ceftobiprole com o anel 13tiazol ligado ao núcleo na posição 3 e ao grupo oximino em C7 19 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Da mesma maneira que ocorre na purificação da penicilina ocorrerão centrifugação e filtrações extrações com solventes orgânicos e adsorção e por fim cromatografia de troca iônica para posterior cristalização Saiba mais Além de agir em microrganismos existem antibióticos que agem em células tumorais Seu mecanismo de ação não é exatamente o mesmo dos antimicrobianos pois em sua maioria são agentes intercalantes do DNA como as antraciclinas doxorrubicina e daunorrubicina No tratamento do câncer podem ser feitas associações entre medicamentos quimioterápicos para tentar interromper o desenvolvimento das células cancerígenas levandoas à citotoxicidade Para saber mais leia o seguinte artigo ALMEIDA V L et al Câncer e agentes antineoplásicos ciclocelular específicos e ciclocelular não específicos que interagem com o DNA uma introdução Química Nova v 28 n 1 p 118129 2005 Disponível em httpscuttlydUnMfdX Acesso em 28 dez 2021 13 Insumos para proteínas terapêuticas recombinantes De forma geral sabemos que a expressão gênica ocorre quando o DNA gera um RNA mensageiro que será traduzido pelos ribossomos em proteínas Ao utilizar DNA recombinante inserido em células de bactérias fungos ou mamíferos podemos utilizar a maquinaria de tradução de tais células e obter essas proteínas de estudo cuja origem é o DNA manipulado Em 1978 a empresa Genentech desenvolveu o primeiro biofármaco a partir de bactérias a insulina recombinante humana Em 1982 a empresa fez parceria com a Eli Lilly and Company e iniciou sua produção após obter aprovação para uso humano pela Food and Drug Administration FDA Atualmente utilizase Saccharomyces cerevisiae para a produção em larga escala Podemos classificar as várias proteínas terapêuticas conforme sua função em anticorpos monoclonais usados como biofármacos peptídeos anticorpos e vacinas A produção de medicamentos biológicos biofármacos e biossimilares produtos biológicos semelhantes aos biofármacos de referência geralmente são destinados ao tratamento de enfermidades complexas como câncer artrite reumatoide e outras doenças autoimunes Desde 1980 com os primeiros biofármacos obtidos a partir da utilização de células geneticamente modificadas que produzem proteínas terapêuticas o uso da tecnologia do DNA recombinante bem como os avanços biotecnológicos foram determinantes para produzir os medicamentos biológicos de alta complexidade impossíveis de serem produzidos por via sintética pelo fato de as reações de 20 Unidade I síntese serem extremamente complicadas em larga escala e via fermentação cujos princípios ativos são extraídos e purificados para serem usados pelos pacientes O exemplo mais comum é o dos anticorpos monoclonais recombinantes muito importantes no tratamento de doenças como câncer pois têm como alvo específico uma via metabólica ou uma célula transformada e não as células sadias porque tais células possuem receptores de membrana expressos de maneira diferente levando ao menor comprometimento da estrutura e funcionalidade das células sadias Esses biofármacos podem ser classificados como de primeira ou de segunda geração mediante a sequência de aminoácidos se for semelhante à das proteínas naturais são chamados de primeira geração caso as proteínas tenham sequência alterada para aumentar o tempo de vida ou imunogenicidade são chamados de segunda geração Um dos exemplos de proteínas recombinantes mais famoso é o hormônio insulina cuja estrutura pode ser visualizada na figura a seguir Anteriormente esse hormônio era extraído de bovinos e suínos mas havia problemas quanto à sua imunogenicidade Dessa forma a primeira proteína produzida por meio da técnica de DNA recombinante foi esse hormônio hipoglicemiante recebendo inclusive alterações na molécula para se obter ação prolongada ou ação rápida Figura 3 Estrutura da insulina glargina nome dado à insulina produzida pela metodologia do DNA recombinante que difere da insulina humana pela substituição da asparagina da posição 21 pela glicina e pela adição de duas argininas no final que prolongam a duração da ação Fonte Campbell et al 2001 p 224 Após esse feito em três anos a indústria farmacêutica colocou à disposição o primeiro hormônio de crescimento humano recombinante cuja estrutura é apresentada na figura a seguir por meio da mesma técnica mas produzido em culturas de E coli Foi um grande benefício pois o hormônio do crescimento era extraído de cadáveres que além de encarecer o produto poderia ser contaminado com 21 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA príon transmissor da doença degenerativa cerebral conhecida como doença de CreutzfeldtJakob descoberta em 1982 como a versão humana da doença da vaca louca Figura 4 Estrutura do hormônio do crescimento humano Fonte Guyton e Hall 1997 p 177 O terceiro fármaco a ser produzido com a técnica do DNA recombinante foi o grupo de medicamentos que congrega os interferons α utilizados no tratamento de hepatites B e C linfoma não Hodgkin algumas formas de leucemia e carcinoma renal As citocinas como os interferons e as interleucinas são produzidas em células da bactéria E coli ou em células CHO Já os interferons β usados em tratamento de esclerose múltipla podem ser produzidos em E coli pois não precisam ser glicosilados levando à ação rápida no corpo humano Caso a proteína seja produzida a partir de células CHO recebe modificações póstraducionais como a glicosilação que no caso do interferon reflete em ação farmacêutica lenta Para cultivo dessas células o insumo sintético ou matériaprima que é o meio mínimo essencial de cultivo MEM é constituído de muitos sais minerais como cloreto de cálcio cloreto de potássio cloreto de sódio e sulfato de magnésio bem como vitaminas podendo ser acrescidos soro bovino fetal ou outros aminoácidos 22 Unidade I Observação Originadas em 1956 as células CHO são hospedeiras seguras utilizadas há muito tempo e aceitas pelas agências reguladoras na obtenção de biofármacos sendo uma linhagem de células responsável por 70 da produção de proteínas ou glicoproteínas recombinantes com fins terapêuticos ou diagnósticos Pelo fato de serem provenientes de mamíferos podem fazer modificações póstraducionais em proteínas que somente os mamíferos conseguem realizar como a glicosilação ou glicação assemelhandose às moléculas que produzimos em nosso organismo fato que não ocorre com as proteínas expressas por bactérias como E coli que são procariotos e não possuem as enzimas necessárias para essa modificação póstraducional apesar de serem muito mais fáceis de cultivar Outros pesquisadores obtiveram linhagens derivadas da primeira ao implantar deleções de genes para melhor controle do crescimento e da produção de proteínas Entre as várias proteínas produzidas nessa linhagem celular podemos citar os ativadores de plasminogênio tPA potente antiagregante plaquetário proteína que ativa o plasminogênio à plasmina e degrada a fibrina diminuindo os efeitos da trombose da embolia pulmonar e do infarto agudo do miocárdio bem como a molécula da eritropoetina humana recombinante EPOhr proteína que estimula a medula óssea a produzir mais glóbulos vermelhos Os interferons γ e α usados no tratamento da doença granulomatosa crônica são obtidos em E coli K12 que são bactérias derivadas da E coli modificadas por mutação para não serem capazes de crescer em qualquer meio de cultura Geralmente usase meio Luria Bertani LB que fornece as necessidades nutricionais de cepas recombinantes de E coli como triptona ou peptona que fornece nitrogênio e carbono vitaminas e alguns oligoelementos provenientes do extrato de levedura crescido de cloreto de sódio com pH final 70 02 Entre as interleucinas recombinantes podemos citar a IL2 proteína que regula as atividades dos leucócitos frequentemente linfócitos em resposta a infecções microbianas e a fatores externos induzindo a maturação de linfócitos B e de células T Também são utilizadas na quimioterapia do controle do câncer principalmente o renal com o intuito de fortalecer o sistema imunológico das células e induzir a produção de mais citocinas além de serem responsáveis pela imunidade produzida por biologia molecular usada no tratamento do carcinoma renal e do melanoma metastático 14 Insumos para fatores de coagulação sanguínea recombinantes e anticoagulantes heparinas Neste momento estudaremos a importância da obtenção de proteínas recombinantes que levam à falta de coagulação por exemplo na doença hemofilia ou ao excesso de coagulação trombose A hemostasia mantém o sangue fluindo em nossos vasos sanguíneos corretamente e impede a 23 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA hemorragia que é contida pela coagulação bem como a destruição desses trombos ou coágulos O esquema da cascata de coagulação pode ser observado na figura a seguir Via intrínseca Via extrínseca Ativação por contato CAPM PK XII IX IX XI II Fibrinogênio Fator tecidual XIIa IXa VIIIa Xa Va X XIa IIa Fibrina Figura 5 Esquema da cascata de coagulação Fonte Macfarlane 1964 p 325 A hemofilia é um distúrbio hemorrágico hereditário causado pela deficiência de fator VIII ou de fator IX e é classificada em dos tipos A e B A hemofilia do tipo A é caracterizada pela deficiência de fator VIII e na hemofilia do tipo B os pacientes são deficientes de fator IX As pessoas com essas deficiências têm sangramentos relacionados à quantidade menor do fator presente no plasma Anteriormente isolavamse os fatores de coagulação obtidos a partir do sangue de doadores chamados pdFVIII e pdFIX que são derivados de plasma para o tratamento da hemofilia fato que provocou vários casos de contaminação por Aids e hepatite C o que foi sanado quando houve a produção de fatores VIII e IX pela técnica de DNA recombinante chamados rFVIII e rFIX que são recombinantes com risco mínimo de transmissão por agentes infecciosos Clonado desde 1984 o gene do FVIII proteína altamente glicosilada pode ser expresso em cultivo de células CHO e em linhagem de fibroblastos BHK21 isolada de cinco hamsters de um dia de idade Os insumos ou as matériasprimas para o cultivo dessas células se baseiam na necessidade de serem semelhantes ao fluido biológico que as permeia que contém açúcares sais vitaminas lipídios proteínas ácidos orgânicos aminoácidos com ou não suplementação de soro bovino fetal sempre com controle das condições de temperatura pH osmolaridade concentração de oxigênio e concentração de dióxido 24 Unidade I de carbono Os meios comerciais ou seja vendidos comercialmente são GMEMS BD Animal Component Free BD Cell Quantum Yield DMEM e F12 Na trombose há o impedimento do fluxo sanguíneo normal nas veias e artérias por trombos que podem se soltar do local em que foram criados e ir para o cérebro os pulmões o coração ou outros órgãos semelhante ao que ocorre na trombose venosa profunda TVP Extraída anteriormente da mucosa intestinal do porco a heparina agora purificada via DNA recombinante previne o tromboembolismo venoso ou arterial e a embolia pulmonar pois esse carboidrato da família dos glicosaminoglicanos tem forte função anticoagulante Outros trombolíticos ou fibrinolíticos destruidores de trombos ou coágulos produzidos pela técnica de DNA recombinante como o rtPA fator ativador do plasminogênio tecidual recombinante são usados principalmente na fase aguda do infarto de miocárdio IAM e do acidente vascular encefálico AVE antigamente chamado de AVC acidente vascular cerebral podendo inclusive ser inseridas algumas mutações no DNA original para prolongar seus efeitos farmacológicos 15 Insumos para anticorpos Os anticorpos ou imunoglobulinas são glicoproteínas produzidas pelos linfócitos B capazes de reconhecer e inativar moléculas estranhas ao organismo chamadas antígenos como bactérias e vírus Com formato de Y apresentam quatro cadeias polipeptídicas duas cadeias pesadas chamadas H com 5 tipos α µ γ δ e ε e duas cadeias leves chamadas L com 2 tipos κκe λ idênticas entre si e ligadas por ligações não covalentes e pontes dissulfeto Tais combinações entre as cadeias resultam em vários tipos de imunoglobulinas classificadas em IgA IgM IgG IgD e IgE Cadeia leve L COOH COOH COOH COOH NH2 NH2 NH2 NH2 S S S S S S S S Cadeia pesada P Figura 6 Esquema da estrutura da imunoglobulina humana Fonte Abbas e Lichtman 2013 p 88 As regiões amino das cadeias L e H se ligam ao antígeno pelas chamadas regiões determinantes da complementaridade CDR uma zona variável pois modifica seus aminoácidos para melhor ligação ao antígeno 25 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Existem dois tipos de anticorpos os policlonais e os monoclonais Os anticorpos policlonais são produzidos em mamíferos como coelhos camundongos equinos bovinos ovinos ou aves normalmente galinhas como resposta a diferentes porções do antígeno enquanto o animal imunizado fabrica anticorpos diferentes a chamada resposta policlonal a partir do linfócito B Caso esses anticorpos sejam produzidos em laboratório o processo é simples e de baixo custo Os anticorpos policlonais recebem esse nome pois há formação de muitos clones célulasfilhas ou cópias de células linfócito B cada uma reconhecendo uma porção diferente de determinado antígeno presente em um vírus ou bactéria obtendose assim centenas de linfócitos B que reconhecem centenas de diferentes pedaços de diversos antígenos de um mesmo patógeno Ao utilizar o princípio de que o antígeno é aplicado e gera um anticorpo neutralizante um anticorpo pode ser produzido em laboratório por biotecnologia e neutralizar ou atacar qualquer tipo de alvo molecular como uma enzima ou receptor de alguma via metabólica que faria papel de determinante antigênico ou epítopo O anticorpo produzido por sua vez agiria nesses alvos atacando e interrompendo doenças cardiovasculares autoimunes câncer e a rejeição a transplantes Por serem muito específicos vão direto para a célula que possui essa enzima ou receptor não atacando células não transformadas ou sadias diminuindo os efeitos adversos Esses anticorpos podem sinalizar a quantidade de determinado receptor ou proteína o que possibilita sua utilização em kits diagnóstico de laboratório clínico Observação O fator de crescimento epidermal EGF se liga ao receptor do fator de crescimento epidérmico EGFR em inglês epitelial growth factor receptor que se dimeriza e se fosforila ativando as proteínas citoplasmáticas GRB2 e SOS que por sua vez ativam as proteínas RAS RAF MEK ERK e MAPK as quais se dirigem ao núcleo e estimulam o DNA e a proliferação celular Essa via é normal mas caso alguma dessas proteínas esteja mutada ocorre proliferação descontrolada culminando no câncer O princípio ativo cetuximabe Erbitux fabricado pela Merck é um anticorpo monoclonal quimérico que inativa o receptor do fator EGFR porque se conecta em seu domínio extracelular de ligação do EGF sendo um antagonista competitivo que bloqueia a regulação do crescimento e da proliferação celular Produzidos a partir de células de camundongos por isso são chamados murinos os primeiros anticorpos monoclonais mAb em inglês monoclonal antibodies foram obtidos por volta de 1986 e tinham por objetivo diminuir a rejeição a transplantes mas por serem murinos e não humanos foram observadas reações adversas A Organização Mundial da Saúde OMS estabeleceu regras para a nomenclatura dos anticorpos monoclonais elencadas a seguir 26 Unidade I Anticorpos monoclonais terminação com o sufixo mabe de monoclonal antibodies Restante dos anticorpos Provenientes de murinos o Exemplo omabe Quiméricos xi ximabe fragmentos murinos unidos a humanos Humanizados zu maior parte humana e com o componente murino minimizado Exemplo zumabe anticorpo monoclonal humanizado Humanos u umabe anticorpo monoclonal humano gerado em ratos Oncológicos tu Exemplo tumabe Imunológicos li ou lim Exemplo limabe Caso a proteína esteja ligada por biotecnologia a uma parte do receptor são chamadas proteínas de fusão e receberão o sufixo cepte por exemplo etanercepte segmento de um anticorpo receptor do fator de necrose tumoral Entre outros exemplos podemos citar Infliximabe Inf li imunológico xi quimérico mabe mAb imunológico usado para artrite reumatoide e doença de Crohn Adalimumabe ada lim imunológico uhumano mabe usado para artrite reumatoide Imunoconjugados para uso oncológico Ibritumomabe ibri tum oncológico o murino mabe Rituximabe ri tu oncológico xi quimérico mabe Trastuzumabe tras tu oncológico zu humanizado mabe Observação Em 2019 o primeiro biossimilar Vivaxxia foi produzido pela farmacêutica Libbs empresa farmacêutica 100 brasileira na fábrica de biossimilares Biotec primeira fábrica de anticorpos monoclonais em escala industrial do país localizada em Embu das Artes SP O fármaco original anticorpo monoclonal rituximabe foi desenvolvido pela empresa norteamericana Genentech e comercializado no Brasil com o nome de MabThera indicado para o tratamento de linfoma não Hodgkin artrite reumatoide e outras doenças autoimunes 27 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Para a produção do insumo farmacêutico ativo IFA final que será o anticorpo monoclonal mais usado que o policlonal deverá ser estudado qual é o melhor animal a receber o antígeno em geral camundongo pela facilidade Uma vez escolhido o animal produtor de anticorpos inoculase o antígeno e verificase a produção dos anticorpos Se tudo estiver correto isolamse células B do baço desse animal e é feita uma cocultura cultura conjunta com células de mieloma tipo de câncer que se fundem e se tornam uma colônia ou hibridoma Essas colônias são isoladas e estudadas para a escolha do melhor anticorpo visto que serão vários hibridomas a produzir diversos tipos de anticorpos cada um específico para uma região do antígeno Os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são colocados em cultura isolados e purificados Observação A produção industrial in vitro é um método caro pois é realizado em biorreator de uso único equipado com saco de plástico especial descartável Nesse método ocorre pouco crescimento celular e há grande chance de ocorrer contaminação mas por outro lado o saco plástico usado é incinerado respeitando o meio ambiente O processo industrial in vivo é mais econômico e rápido pois utiliza líquido retirado de ascite de ratos sendo necessário maior treino de funcionários e muito controle em relação aos animais idade espécie e gênero Contudo há restrições em alguns países quanto ao uso de animais para produção em larga escala de anticorpos Para obter o insumo purificado ou seja o anticorpo monoclonal produzido a partir de células crescidas em meio de cultura foram desenvolvidas estratégias de purificação com alta taxa de recuperação e com elevado grau de pureza do produto mas como a complexidade do processo de purificação é alta elevase o custo final Vários processos físicoquímicos serão usados como centrifugação cromatografia de filtração molecular separação por tamanho precipitação por sulfato de amônio separação por solubilidade cromatografia de troca iônica separação por carga e cromatografia de afinidade coluna de cromatografia com a proteína escolhida como antígeno imobilizada na coluna levando o anticorpo a se ligar a ele 16 Insumos para eritropoetina EPO fator de crescimento hematopoiético Os rins mais especificamente o córtex renal produzem um hormônio da classe das glicoproteínas chamado eritropoetina EPO com peso molecular de 34 kDa que é liberado devido à hipóxia ou a grandes altitudes estimulando a eritropoiese ou seja estimulando a medula óssea a produzir mais glóbulos vermelhos o que promove a diferenciação de célulastronco precursoras de glóbulos vermelhos nesse local que expressam os receptores de EPO EpoR pois quando os eritrócitos estão maduros não apresentam mais os EpoR 28 Unidade I Cadeias glicídicas Figura 7 Estrutura da EPO humana Observe as pontes dissulfeto e as glicosilações Fonte Lai et al 1986 p 35 Observação Fígado cérebro e útero também produzem uma fração pequena de EPO e podem estar relacionados com outras funções como redução do estresse oxidativo modulação da inflamação e diminuição da apoptose das células epiteliais tubulares No sistema nervoso central a EPO está envolvida na neuroproteção e na angiogênese ligadas à neurovascularização de uma zona isquêmica e ao aumento da chegada do oxigênio Situações como anemias graves causadas por quimioterapia e problemas renais graves levam ao uso de EPO pois esta é responsável por manter a concentração de hemoglobina Hb constante e evitar a transfusão de sangue no tratamento de anemia por esse motivo é chamado de medicamento antianêmico e em situações em que pode ocorrer diminuição na fabricação da eritropoetina pelos rins como por exemplo na insuficiência renal crônica ou na necessidade de diálise A expressão da eritropoetina humana recombinante rhEPO foi testada em plantas insetos bactérias leveduras e em células COS1 CHO e BHK mas o melhor resultado foi obtido a partir das células CHO e BHK Existem cinco isoformas de rHuEPOs EPO recombinante humano que diferem entre si pela glicosilação alfa beta gama episilon e ômega As terapêuticas são alfa e beta epoetina α epoetina β epoetina Ω2 A glicosilação pode ter até 14 ácidos siálicos carboidrato de 9 carbonos na EPO que terá como resultados direcionamento do hormônio aos sítiosalvo influência na semivida plasmática 29 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA diminuindo a metabolização rápida pelo fígado fato que afeta a eficácia clínica e mudanças nas propriedades biológicas e farmacocinéticas Para se obter o insumo farmacêutico ativo EPO devese ter controle das condições de cultivo de células pois é a partir desse ambiente nutrientes oxigênio temperatura pH que se obtém crescimento satisfatório e biofármaco uniforme e com qualidade técnica Recentemente o Centro de Engenharia Genética e Biotecnologia CIGB entrou em processo de transferência parcial ou total da produção do IFA a eritropoetina humana recombinante EPOhr para o Instituto de Tecnologia em Imunológicos BioManguinhosFiocruz culminando na fabricação nacional Após crescimento das células a purificação ou processamento downstream do sobrenadante do cultivo pode ser realizada por métodos físicoquímicos como precipitação diferencial cromatografia de interação hidrofóbica iônica de exclusão molecular ou líquida de alta pressão e concentração e filtração 17 Insumos para vacinas Podese dizer que a história das vacinas se inicia com Edward Jenner 17491823 que se atentou quando as ordenhadoras de vacas acometidas por cowpox doença parecida com a varíola humana tinham imunidade contra a varíola humana ou uma versão mais suave da doença Fazendo uma analogia com o acontecido Jenner inoculou o pus extraído de feridas de vacas contaminadas em um menino de 8 anos com arranhões no braço e após certo tempo a criança teve o líquido da ferida de um paciente com varíola inoculado Como resultado não desenvolveu a doença demonstrando a imunização por uma vacina antivariólica vacina provém do latim vaccinae vacca significa vaca Esse fato juntamente com o processo de vacinação anual levou ao sucesso na erradicação da varíola em 1980 No Brasil a vacinação foi responsável pela erradicação não só dessa doença infecciosa mas também da poliomielite paralisia infantil Quanto ao IFA das vacinas em primeiro lugar devemos analisar contra qual patógeno ele será usado bactéria ou vírus Devese fazer crescer esses microrganismos no caso de bactérias ou célula de eucarioto em meio de cultura e os vírus em outro organismo como embriões de galinha e purificálos Em algumas situações um IFA eficaz não precisa ser o microrganismo pode ser uma proteína ou toxina se for vírus ou bactéria inteira pode estar morta ou atenuada As vacinas para bactérias e vírus podem ser produzidas com bactérias inteiras mortas ou inativadas usando formalina óxido de etileno ou radiação raios X ou gama para neutralização Exemplos vacina inativada meningocócicas B C e ACWY hepatite A hepatite B HPV e dTpa difteria tétano e coqueluche bactérias vivas atenuadas ou enfraquecidas com calor produtos químicos ou radiação Exemplos BCG rotavírus febre amarela tríplice viral tetraviral varicela herpeszóster e dengue com polissacarídeos proteínas nativas que estimulam a resposta imune 30 Unidade I com toxoides diftérico e tetânico e componentes da cápsula da bactéria da coqueluche Bordetella pertussis ácido nucleico que usa DNA ou RNAm do patógeno como hepatite A São encontradas em algumas vacinas de RNAm contra covid19 expressas em diferentes vetores São as chamadas vacinas inovadoras Para as vacinas contra vírus usase como célula hospedeira o embrião da galinha contido no ovo para proliferação dos vírus são necessários cerca de 120140 mil ovos para a produção de 1L de vacina de forma que cada mL equivale a aproximadamente 400 doses e todo o processo de produção leva entre 20 e 28 semanas Retirados dos embriões os vírus passam por algumas etapas de purificação como câmara trituradora centrifugação e liofilização Entre os exemplos de doenças que são alvo de vacinas e que são causadas por vírus podemos citar gripe influenza catapora varicela sarampo rubéola caxumba poliomielite hepatite B hepatite A Aids herpeszóster raiva febre amarela e dengue Muitas vacinas bem como o antígeno utilizam o sal de alumínio como adjuvante uma vez que este potencializa a resposta imunológica o fenoxietanol como conservante pois impede que a vacina seja contaminada depois de aberto o frasco açúcares aminoácidos glicina gelatina ou proteínas como estabilizadores visto que impedem reações químicas entre componentes e a adesão de moléculas no frasco cloreto de sódio para se assemelhar ao conteúdo de sal do sangue e água esterilizada como diluente Observação O Instituto Oswaldo Cruz IOCFiocruz comunicou a comunidade científica a respeito da realização de testes clínicos em seres humanos com a vacina antiparasitária Sm14 nome da proteína do verme Schistosoma mansoni causador da esquistossomose doença também conhecida como barriga dágua Muitos estudos realizados para uma vacina contra malária foram comunicados e recentemente a fabricante indiana de medicamentos Serum Institute juntamente com a empresa norteamericana de desenvolvimento de vacinas Novavax comunicaram estudos sobre a vacina R21MatrixM contra a malária que é uma das principais causas de mortalidade infantil na África Depois de isolado o IFA podem ser agregados água estéril soro fisiológico conservantes e estabilizantes por exemplo albumina fenóis e glicina além dos chamados adjuvantes que potencializam a resposta imune ou seja melhoram a eficácia da proteção da vacina Algumas vezes o IFA pode conter quantidades pequenas de proteína do ovo de galinha empregada para crescimento do vírus patogênico algum antibiótico usado no processo de produção com o meio de cultura ou no armazenamento do produto para evitar contaminação ou timerosal conservante com mercúrio com a finalidade de evitar a contaminação e o crescimento de bactérias potencialmente prejudiciais 31 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA A pesquisa clínica demonstra que para uma vacina ser comercializada devese respeitar as fases Fase laboratorial na qual se estuda o tipo de resposta imunológica in vitro e in vivo e são escolhidos o melhor antígeno e a melhor composição ou desenvolvimento da formulação mortos ou atenuados por exemplo Fase clínica na qual se estuda a resposta imunológica em seres humanos que culmina na fase seguinte Fase de vigilância farmacêutica na qual haverá avaliação dos pacientes após vários anos de uso Geralmente um lote de vacina demora entre 6 e 22 meses para o produto final estar pronto para uso Podem ser utilizados os seguintes sistemas celulares de expressão procariotos Escherichia coli e Bacillus subtilis leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris fungos Aspergillus e Trichoderma células de mamíferos CHO e células de insetos Autographa californica No Brasil a primeira vacinação ocorreu no ano de 1804 contra a varíola Em torno de 1830 muitas pessoas pararam de se vacinar quando descobriram que o IFA era obtido de vacas doentes fato que culminou na Revolta da Vacina de 1904 no Rio de Janeiro Esse levante da população teve como fato preponderante o decreto imperial que determinava a vacinação obrigatória na tentativa de diminuir o número de internações mas muitas pessoas se negavam a se vacinar então o governo as perseguiu e as prendeu sendo algumas até mortas Após análise dos fatos houve a revogação desse decreto 171 IFAs para vacinas contra covid19 Para produzir o IFA das vacinas contra covid19 é necessário selecionar o tipo de vacina a ser usada algumas utilizam o vírus inteiro partes do vírus ou o RNA mensageiro RNAm Apesar da etapa inicial ter sido a proliferação do vírus em células vivas geralmente embriões de galinha seja para obter o vírus inteiro ou para obter partes ou material genético o vírus deverá ser isolado e nos casos de vacinas que tenham somente a proteína spike ou o RNAm dessa proteína deverá ser isolado o adenovírus de chimpanzé que receberá via técnica de biologia molecular essas informações e se proliferará em biorreatores Uma vez realizado o cultivo o IFA vírus da covid19 ou o manipulado geneticamente em hospedeiro como adenovírus deve ser purificado a fim de remover restos celulares ou outras proteínas que não são de interesse e podem ocasionar reações na população Os IFAs importados são embarcados em aviões em câmaras frigoríficas controladas para armazenamento dentro dos parâmetros de qualidade e após receber a licença de exportação chegam ao Brasil para serem envasados Para se chegar à imunidade de rebanho ou imunidade coletiva que ocorre quando aproximadamente 70 da população está vacinada e a cadeia de transmissão é interrompida deve ser realizada a vacinação ou recuperação da doença As vacinas mais usadas contra a covid19 são 32 Unidade I CoronaVac ButantanSinovac vacina de vírus vivo inativado com duas injeções com intervalo de 2 a 4 semanas desenvolvida pela empresa farmacêutica chinesa Sinovac parceira do Instituto Butantan que envasa as doses no Brasil Pfizer e BioNTech proveniente da empresa farmacêutica alemã BioNTech é administrada em duas doses com intervalo maior ou igual a 21 dias Utiliza RNAm com o trecho do código genético da espícula ou proteína spike do SarsCoV2 Covishield AstraZenecaOxford fabricada pela empresa inglesa parceira da Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz unidade BioManguinhos que envasa as doses no Brasil Produzida por meio de um vetor viral não replicante com a proteína spike do coronavírus deve ser usada em duas doses com intervalo entre 4 e 12 semanas Moderna também utiliza a tecnologia de RNAm da proteína spike específica do vírus SarsCoV2 que tem a função de auxiliar na invasão das células humanas Janssen fabricada pela companhia Johnson Johnson é administrada em dose única Possui adenovírus não replicante com parte da proteína spike semelhante à Covishield Sputnik V usada em duas doses diferentes É fabricada pela empresa russa Instituto Gamaleya e foi construída com adenovírus que carrega a proteína spike Saiba mais Para mais explicações sobre as vacinas contra covid19 sugerimos a consulta ao seguinte artigo ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE OMS Os diferentes tipos de vacinas COVID19 Genebra 2021 Disponível em httpscuttlyUUWWFPo Acesso em 29 dez 2021 2 TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS Desde 6000 aC bebidas alcoólicas são fabricadas por fermentação Em 2000 aC já se tem conhecimento da fabricação de pães e em 1875 dC Louis Pasteur demonstrou que o vinho azedava por causa de microrganismos que o contaminaram e fermentavam o açúcar existente transformandoo em vinagre assim foi desenvolvido o processo de pasteurização para eliminar os contaminantes Por volta de 1950 os processos fermentativos para obtenção de antibióticos já estavam sendo aprimorados e em 1982 ocorreu a produção de insulina humana por biologia molecular Em bioquímica quando falamos a palavra fermentação rapidamente pensamos em um processo metabólico em que há pouco ou nenhum oxigênio cujo início se dá a partir da glicose figura a seguir resultando em produtos como ácido lático fermentação lática etanol fermentação alcoólica e ácido 33 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA acético fermentação acética Em termos industriais podemos citar como exemplos dessas fermentações citadas os produtos iogurte pão cerveja ou outras bebidas alcoólicas e vinagre Ácido pirúvico Glicose Glicólise CO2 Etanol Ácido acético Ácido lático Figura 8 Esquema das fermentações alcoólica lática e acética Contudo na prática industrial não é esse o significado da palavra fermentação Usase esse nome para indicar que são utilizados microrganismos como protagonistas do processo industrial A fermentação passa por várias escalas iniciando na bancada aumentando para piloto e terminando na escala industrial Neste momento estudaremos várias etapas que levarão à obtenção de vacinas ou medicamentos como antibióticos em larga escala Após o estudo em laboratório ou planta piloto é utilizado um sistema de fermentação dessas culturas e o produto será purificado de alguma forma como por meio da cromatografia Na figura a seguir podemos observar um resumo de um processo fermentativo genérico Microrganismo selecionado Preparo do inóculo etapa de laboratório Preparo do inóculo etapa industrial germinadores Biorreator industrial Matériasprimas Meio de cultura selecionado Esterilização Células Separação das células Caldo fermentado Recuperação do produto Tratamento de efluentes Produto Esterilização do ar Compressor Ar Figura 9 Esquema geral de uma fermentação Fonte Schimidell at al 2001 p 81 34 Unidade I Analisandose o esquema genérico de fermentação podemos dividilo em partes que serão estudadas posteriormente Início do processo quando analisamos os meios de cultura matériaprima ou insumos e seus suplementos mosto o microrganismo selecionado a presença ou a ausência de oxigênio estéril o material da dorna ou do tanque fermentador a temperatura e o pH ideais Durante o processo quando o mosto se transforma em vinho mosto modificado a partir de reações metabólicas que se realizam nas células dos microrganismos para que sobrevivam Depois do processo também chamado downstreaming Ocorre quando serão retiradas substâncias restos celulares e ocorrerá a separação e a purificação do produto Lembrete A fermentação é um processo de obtenção de energia que ocorre sem a presença de gás oxigênio portanto tratase de uma via de produção de energia anaeróbia Nesse processo o aceptor final de elétrons é uma molécula orgânica Essa via é muito utilizada por fungos bactérias e células musculares esqueléticas de nosso corpo que estão em contração vigorosa 21 Início do processo 211 Meios de culturas e seus suplementos mosto temperatura e pH O meio de cultura escolhido deve levar em consideração o preço dessas matériasprimas além de como e por quanto tempo será realizada a armazenagem Também se deve pensar na facilidade da separação e no tratamento de efluentes Os meios de cultura podem ser naturais e artificiais ou sintéticos Entre os naturais podemos citar melaço farinhas caldo de cana e água de maceração de milho mas tenhamos em mente que a composição química dessas substâncias será desconhecida e possivelmente variável pois depende de solo safra clima etc Os meios de cultura sintéticos são aqueles vendidos comercialmente e que apresentam composição fixa e definida como extrato de levedura extrato de carne e peptona Devese lembrar que a composição do meio reflete no pH e na formação de espuma características que podem complicar a condução da fermentação A temperatura varia conforme o organismo utilizado leveduras mesófilas geralmente se mantêm entre 25 C e 35 C a maioria das linhagens celulares humanas de mamíferos e de bactérias são mantidas entre 36 C e 37 C enquanto as células de insetos são cultivadas a 27 C O pH do meio varia com o organismo e deve ser tamponado Se forem usadas células de mamíferos estas geralmente são tamponadas para ficarem semelhantes ao sangue com o sistema bicarbonatoCO2 35 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA 212 Microrganismo selecionado microrganismos de importância para a indústria farmacêutica A fermentação é empregada para a obtenção de alimentos bebidas e medicamentos vitaminas etc Lactobacillus Saccharomyces cerevisiae por exemplo são responsáveis por si só pela produção de iogurte bebidas pães entre outros produtos Com o uso de técnicas de biologia molecular várias proteínas podem ser clonadas em diversos veículos de clonagem e expressas pelos hospedeiros também chamados sistema celular de expressão que podem ser procariotos Escherichia coli e Bacillus subtilis leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris fungos Aspergillus e Trichoderma células de mamíferos CHO e células de insetos Autographa californica 213 Presença ou ausência de oxigênio estéril ar comprimido Na indústria o conceito de fermentação é diferente do conceito bioquímico em si pois o processo fermentativo pode ser classificado quanto à presença ou não de oxigênio em Anaeróbicos sem utilização de oxigênio Exemplo fermentação alcoólica Aeróbicos necessitam de oxigênio Exemplo fermentação acética Sem aeração forçada não necessitam de anaerobiose estrita como a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae Com aeração forçada o ar deve ser estéril sem umidade sem óleo etc Para inserir ar estéril dentro dos fermentadores devese retirar esporos fungos bactérias e vírus superiores a 001 µm de tamanho que podem contaminar o produto Para isso usamse filtros especiais que retêm 999999 dos contaminantes Antes de passar pelos filtros a esterilização de ar começa com calor ou por radiações pois produtos químicos podem contaminar o ar O ar é enviado por um compressor o qual passa por um filtro industrial que utiliza calor cerca de 218 C por pelo menos em 24 segundos por radiações principalmente ultravioleta raios gama não são usados pois os custos de investimento inviabilizam o uso ou por energia sônica que são raios catódicos de alta energia podendo depois desse tratamento passar por membranas que retêm 9999 das bactérias uma vez que algumas bactérias e esporos são resistentes ao calor seco ou outra modalidade de esterilização escolhida 214 Método de esterilização da dorna O fluxo de vapor dágua é liberado na linha que funciona como canos os quais levam o meio de cultura ao biorreator geralmente em aço inoxidável O vapor agente esterilizante segue para o biorreator e o mosto se for em grande quantidade ou autoclave se for em pequena quantidade Após esfriar colocase o inóculo 36 Unidade I Na esterilização em batelada ou descontínuo uma só operação ou tudo junto o tempo de esterilização é maior em comparação à esterilização contínua meio e equipamentos esterilizados separadamente A vantagem da esterilização em batelada é que evita contaminações nas diferentes etapas mas há prejuízo na composição do meio de cultura pois os nutrientes podem se degradar em altas temperaturas por longos períodos A esterilização contínua por injeção direta de vapor ou aquecimento indireto com vapor tem como vantagem a preservação da integridade dos constituintes do meio em que os ciclos de esterilização são mais curtos usase menos energia elétrica e reduzse a perda de nutrientes 215 Agitadores Os agitadores geralmente produzidos em material inoxidável e acoplados ao tanque não serão usados apenas para misturar as substâncias com as células mas apresentam outras finalidades como proporcionar maior fluxo de ar e dissipar gases e calor Entre os agitadores usados na indústria há vários tipos como hélice turbina âncora serra e roda dentada cada um priorizando um tipo de movimento ou fluxo Os tipos de fluxos adotados podem ser os seguintes Fluxo tangencial atua na direção da tangente e gera fluxo circular em torno do eixo que impulsiona o meio de cultura líquido para a parede formando vórtex de superfície Apresenta alto consumo de potência e elevado investimento inicial Tem como principais funções homogeneizar resinas misturar fluidos viscosos e dissolver materiais sólidos Não mistura o líquido longitudinalmente Fluxo radial apresenta fluxos perpendiculares ao eixo do agitador e às paredes do fermentador impulsionando as partículas contra a parede Com alto consumo de potência é usado para dispersão de gases transferência de massa e dissolução de materiais sólidos Tem como exemplos turbina pás âncora e grade Fluxo axial fornece fluxo paralelo ao eixo do agitador e impulsiona as partículas contra o fundo do tanque Com baixo consumo de potência é usado para misturar produtos líquidos deixar sólidos em suspensão e transferência de calor Como exemplos destacamse hélice e turbina de pás inclinadas Tangencial Radial Axial Figura 10 Fluxo dos diferentes tipos de agitadores Adaptada de Joaquim Jr et al 2012 p 28 37 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Hélice propeler naval Hélice pbt palhetas inclinadas Hélice turbina rushton Hélice pbtd Hélice caules Hélice retrátil Figura 11 Exemplos de agitadores ou impelidores Fonte Joaquim Jr et al 2012 p 45 Observação Há três tipos de fermentação alcoólica lática e acética A fermentação alcoólica comumente utilizada na produção de cervejas e vinhos recebe essa denominação devido à produção de etanol CO2 em seu produto possibilitada inicialmente pela descarboxilação do ácido pirúvico é realizada principalmente pela levedura Saccharomyces cerevisiae A fermentação lática é realizada de maneira exclusiva por bactérias especificamente por lactobacilos e ocorre quando a glicólise tem como principal mediador a glicose ou a galactose obtida a partir da quebra de uma molécula de lactose açúcar presente no leite Na glicólise com os derivados da lactose temos a formação de ácido pirúvico ATP e NADH2 em vez de NADH Usase esse tipo fermentativo na produção de leites e iogurtes A fermentação acética caracterizase pelo ácido acético principal composto do vinagre como seu componente final e ocorre quando o etanol entra em contato com espécies específicas de bactérias Pseudomonadaceae Acetobacter ou Gluconobacter transformandoo em ácido acético por oxidação Esses processos biológicos para obtenção de energia são comumente observados no estudo bioquímico para a compreensão do funcionamento de diversos organismos e seu papel no meio ambiente bem como para nos auxiliar no dia a dia nas atividades industriais Assim podemos concluir que a ciência está sempre mais perto do que imaginamos 38 Unidade I 22 Durante o processo A fermentação pode ocorrer mediante a entrada do meio de cultura na dorna O processo de fermentação pode ser classificado em descontínuo ou em batelada descontínuo alimentado semicontínuo contínuo O método mais empregado é o descontínuo ou em batelada em que o inóculo microrganismo inicial é colocado na fase log junto à dorna já completamente cheia de meio de cultura e depois de certo tempo o processo é finalizado com a retirada do produto Classificamos o processo como fechado ou seja nada é adicionado durante a fermentação o que faz que o volume seja constante diminuindo muito a chance de contaminação Na fermentação descontínua alimentada ocorre a alimentação do meio na dorna de forma intermitente até chegar ao volume final destinado ao processo o que aumenta a massa celular e evita o fenômeno de repressão catabólica em que alguns subprodutos podem inibir enzimas importantes dificultando o crescimento celular A fermentação semicontínua é mais lenta O meio e o inóculo são colocados como na fermentação descontínua ou em batelada retirase uma parte geralmente a metade do mosto fermentado chamado agora de vinho que é colocada em outra dorna limpa e completase o volume com meio Assim esse processo se torna descontinuo do tipo em batelada A fermentação continua iniciase como descontínua e após certo tempo começa a ser retirado o vinho e ser colocado mosto ou meio de cultura na mesma vazão geralmente por transbordamento por isso é chamado processo aberto Nesse procedimento ficou demonstrada a diminuição do uso de funcionários mão de obra tempos mortos no que se refere a esvaziamento limpeza e enchimento de dorna contudo a desvantagem é o aumento da possibilidade de contaminações e mutações das cepas de microrganismos usados 23 Final do processo Uma vez terminada a fermentação os componentes encontrados no vinho mosto modificado devem ser separados e alguns subprodutos por exemplo restos celulares células vivas e substâncias do meio de cultura como extrato de carne extrato de levedura glicose ácidos graxos aminoácidos e proteínas podem ou não ser aproveitados O produto esperado por sua vez será isolado e purificado 39 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Em primeiro lugar devemos retirar as células em geral por um processo unitário chamado centrifugação por meio de centrífugas industriais O líquido é separado passa por tratamentos com diversos solventes e até colunas com resinas de troca iônica Verificada a pureza do produto geralmente por HPLCcromatografia líquida de alta performance haverá um encaminhamento a depender de sua finalidade podendo ser desidratado e comprimido como o que ocorre com os produtos das fermentações de antibióticos A seguir veremos as fermentações com grande importância nas áreas alimentícia e econômica 3 EXEMPLOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS 31 Fermentação alcoólica canadeaçúcar No processo de fermentação alcóolica da canadeaçúcar esta é colhida na plantação lavada e moída O bagaço é queimado e gera energia e o caldo de cana garapa vai para a dorna onde pode ou não ser diluído O inóculo levedura Saccharomyces cerevisiae em fase log é acrescentado ao mosto sem a necessidade de injeção de ar Depois de certo tempo o mosto se transforma em vinho de cana pois as leveduras se alimentam de alguns dos componentes e secretam os produtos da fermentação entre eles o etanol Para purificar esse produto devese separar as células que poderão se tornar ração para gado O líquido por sua vez será submetido à destilação que gera álcool hidratado ou anidro O processo de produção do etanol pode ser visualizado na figura a seguir Bagaço Outras utilizações Cachaça Padronizadora Engarrafadora Envelhecedora Ração Moagem Queima Comercialização Adubo Distribuição Filtração Decantação Diluição do caldo 10 a 20 Produção de açúcar mascavo eou rapadura Fermentação Vinho Destilação Vinhoto Figura 12 Fluxograma da produção de etanol 40 Unidade I Caso o etanol proveniente da garapa seja usado como bebida alcoólica é chamado cachaça ou pinga sendo caracterizado como aguardente de canadeaçúcar Os produtores de álcool podem usar a garapa cozinhála e após a centrifugação obter o mel e o açúcar de primeira linha Em uma segunda centrifugação agora do mel a garapa pode ser novamente cozida e centrifugada produzindo melaço e açúcar de segunda linha Observação Aguardente é qualquer bebida obtida a partir da fermentação de vegetais doces 32 Fermentação alcoólica cerveja Com as matériasprimas água levedura lúpulo e uma fonte de amido que pode ser malte cevada germinada trigo ou milho colocados juntos em uma dorna chegaremos ao produto final cerveja A primeira etapa chamada maltagem ou malteação é dividida em molha ou maceração que dura no mínimo 2 dias germinação de no mínimo 5 dias e secagem A cevada é colhida e molhada para que ocorra a germinação transformandose em malte Na fase de germinação as enzimas como amilases e proteases são parcialmente ativadas e digerem açúcares fermentescíveis como o amido em açúcares mais simples como maltose e posteriormente frutose e glicose Logo após o malte sofrer secagem passa pela moagem no processo que se chama brassagem e expõe o interior do grão onde está o amido processo também chamado de sacarificação em que ocorre a ativação das enzimas do malte digerindo todo amido em outros açúcares Depois ocorre a torrefação O malte mais torrado deixa a cerveja escura e o menos torrado deixa a cerveja mais clara fato que confere características aromáticas à cerveja Em seguida iniciase a etapa de filtração e clarificação na qual ocorre a separação do líquido mosto e do bagaço do grão fase em que se usa muita água para lavar os grãos O mosto filtrado sofrerá o processo de ebulição junto ao lúpulo Esse cozimento tem várias funções esterilizar o líquido coagular as proteínas extrair e solubilizar os alfaácidos e os betaácidos do lúpulo e eliminar substâncias voláteis indesejáveis O lúpulo Humulus lupulus é uma planta trepadeira encontrada em locais frios da Europa de cuja planta se retira a flor que contém lupulina e vários óleos essenciais responsáveis pelo sabor amargo e pelo aroma além de proteger a cerveja contra contaminações microbiológicas Posteriormente iniciase o resfriamento em que o mosto lupulado é resfriado até aproximadamente 25 C e colocado na dorna As leveduras são inoculadas e em um primeiro momento que dura cerca de 12 horas elas absorvem o oxigênio e se multiplicam e em um segundo momento que dura cerca de 7 dias agora com pouco oxigênio realizam a fermentação ou seja os açúcares do mosto são transformados em etanol e dióxido de carbono A fermentação para obtenção da cerveja é um processo descontínuo 41 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA com dornas de fermentação fechadas para evitar a perda de CO2 e ter controle de temperatura Durante a fermentação são produzidos outros metabólitos tais como aldeídos álcoois superiores e ésteres Finalizada a fermentação a cerveja passará por um processo chamado maturação no qual em temperatura adequada ocorre a liberação dos componentes voláteis indesejáveis ao aroma e ao sabor Após a estabilização ao frio 0 C 10 C será submetida à clarificação decantação das leveduras que auxilia a remoção de outros compostos turvadores como polifenóis e proteínas e ao processo mecânico de retenção de sólidos chamado filtração deixando a cerveja clara e brilhante Nesse momento a cerveja pode ser acondicionada em barris em garrafas eou em latas por enchimento asséptico com pasteurização ou filtração estéril prévia O chope não passa por pasteurização e a cerveja sim Outra diferença é que a cerveja contém conservantes antioxidantes e estabilizantes enquanto o chope não os tem As leveduras para a produção de cerveja podem ser de fermentação alta pois as leveduras S cerevisiae são encontradas na parte superior da dorna em temperatura entre 18 C e 24 C resultando em cervejas do tipo Ale que passam por uma fermentação mais rápida de poucos dias ou semanas de duração atribuindo a elas a característica de serem mais alcoólicas Na fermentação baixa em que as leveduras ficam no fundo da dorna S uvarum em temperaturas de 9 C a 13 C a fermentação é mais lenta resultando em cervejas tipo Lager mais carbonatadas e mais consumidas no Brasil A água tem um importante papel nessa fermentação pois as cervejas apresentam em média de 90 a 95 de água potável e filtrada com pH em torno de 65 a 7 A água deve ser livre de sais pois magnésio sódio bicarbonatos cálcio cloretos e sulfatos influenciam diretamente o gosto da cerveja Para cada litro de cerveja produzida são necessários de 5 a 7 litros de água Lembrete A produção de cerveja se inicia na preparação dos ingredientes e se estende até a embalagem O conceito da fabricação da bebida é a conversão da fonte de amido em mosto líquido em que se coloca a levedura As etapas são as seguintes maltagem brassagem fervura resfriamento fermentação condicionamento e embalagem 33 Fermentação alcoólica vinho Alguns dizem que Noé plantou um vinhedo e produziu o primeiro vinho do mundo apesar de haver indícios de que sua origem remonta a 7000 anos no Oriente Médio próximo a Síria Líbano e Jordânia Algumas pinturas e registros egípcios também mostram o vinho em celebrações e rituais datados de 3000 aC Do Egito em 2000 aC a viticultura propagouse para o norte da África Grécia Itália França e Espanha A partir de 2500 aC os vinhos egípcios já eram exportados para Europa África Central e Ásia Os gregos por volta de 700 aC provavelmente introduziram as primeiras plantações de uvas na França chegando logo após na Itália 42 Unidade I O vinho é resultante da fermentação por leveduras do mosto que é o suco de uvas frescas No Brasil pode ser encontrado na Serra Gaúcha Bento Gonçalves Garibaldi Caxias do Sul e outros municípios no Nordeste Vale do Rio São Francisco em Santa Maria da Boa Vista PE e nos estados de Minas Gerais Paraná Santa Catarina e São Paulo municípios de Jundiaí e São Roque A colheita da uva madura se faz manualmente com muito cuidado para não romper a casca e dar início à fermentação pois as leveduras são encontradas na casca Logo depois são retirados os engaços cabos em um processo de nome desengace Logo após a uva é esmagada formando um suco que ainda na presença das cascas além de liberar as leveduras Saccharomyces cerevisiae e S uvarum responsáveis pela fermentação alcoólica também libera substâncias que se agregam ao mosto o que resulta em sabor e cor Para a produção de vinhos branco e rosê a temperatura de fermentação é mais baixa que para produção de vinhos tintos O vinho branco é preparado com uvas claras e o tinto com uvas mais escuras por essa razão possui maior quantidade de polifenóis que o branco O rosê pode ser produzido por mistura de vinho tinto com vinho branco ou por uma leve maceração das uvas escuras Na verdade o vinho não passa apenas por um mas por dois processos tipos de fermentação A primeira fermentação é chamada tumultuosa pois libera muito gás carbônico enquanto ocorre a digestão dos açúcares por vários tipos de fermentação gerando diversos produtos como etanal ou aldeído acético descarboxilação do ácido pirúvico ácido acético constituinte essencial da acidez volátil ácido succínico e ácido lático Após a separação do bagaço descuba pela gravidade pois fica na parte de baixo do tanque e a transferência trasfega do vinho para outro tanque a fermentação tumultuosa ainda persiste por alguns dias apesar de diminuir a intensidade pelo fato de a maioria dos açúcares já ter sido consumida iniciando a chamada fermentação lenta A última fase de obtenção do vinho de uva é a fermentação malolática em que bactérias láticas Oenococcus oeni e Lactobacillus sp fermentam e transformam o ácido málico em ácido lático suavizando a acidez com a liberação de gás carbônico Os cocos usam o ácido málico em pH de aproximadamente 323 e os bacilos em pH de aproximadamente 338 para transformação em ácido lático e gás carbônico A maturação ou o envelhecimento do vinho acontece geralmente em tanques de aço inoxidável ou barris de carvalho e podem levar muitos anos Nessa fase ocorre a estabilização da cor e do sabor a diminuição da acidez e a adição dos aromas e sabores provenientes da madeira baunilha coco nozes frutas vermelhas entre outros Finalmente a pasteurização com temperatura de cerca de 80 C elimina as bactérias restantes e neutraliza as enzimas indesejáveis além de auxiliar na precipitação das proteínas que porventura estiverem no vinho 43 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA 34 Fermentação lática iogurte O iogurte é o resultado da fermentação do leite pelas bactérias Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus Na primeira fase chamada préaquecimento o leite é aquecido a uma temperatura de 50 C a 60 C para otimizar homogeneização consistência cremosidade sabor e digestibilidade do iogurte A próxima fase será a pasteurização na qual haverá destruição dos microrganismos para que somente os que sejam colocados junto ao leite sejam responsáveis pela mudança das características dele Saiba mais O iogurte é um produto lácteo obtido através da fermentação lática do leite por meio da ação de duas bactérias ácidoláticas específicas Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus As etapas de fabricação do iogurte são recepção do leite mistura pasteurização homogeneização fermentação resfriamento e embalagem Para saber mais sobre o processo fabricação do iogurte recomendamos a leitura do seguinte artigo SILVA A M T da et al Elaboração de iogurte com propriedades funcionais utilizando Bifidobacterium lactis e fibra solúvel Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais Campina Grande v 16 n 3 p 291298 2014 Disponível em httpscuttly3PSU5Iz Acesso em 29 dez 2021 Para a fermentação ocorrer devese resfriar o leite entre 42 C e 43 C temperatura que será ideal para a inoculação das bactérias O início do processo ocorre com S thermophilus em acidez maior que 20 D graus Dornic chegando até 46 D quando o S thermophilus para de crescer e é dado início ao crescimento de L bulgaricus que produz acetaldeído responsável pelo aroma do iogurte Quando a acidez aumenta por volta de pH 46 ocorre a precipitação da caseína mas a fermentação continua até acidez de 85 D a 90 D Após a coagulação o iogurte é colocado em embalagens individuais e acondicionado em câmaras de fermentação geralmente a 42 C onde permanece por 2 a 3 horas até que a acidez atinja de 90 D a 95 D A consistência e a viscosidade do iogurte estão relacionadas com o teor de proteínas Observação Grau Dornic ºD é a unidade de valor do índice de acidez quando a solução de hidróxido de sódio utilizada tem normalidade igual a N9 33 Índice de acidez é o número de mililitros de hidróxido de sódio necessários para neutralizar o ácido lático presente em 1 mL de amostra 44 Unidade I 35 Fermentação do pão Para a fermentação do pão os ingredientes essenciais são farinha de trigo água fermento biológico Saccharomyces cerevisiae e sal enquanto os ingredientes não essenciais são açúcar gordura leite enzimas e outros Quando ocorre a mistura dos ingredientes e é formada uma massa esta deverá permanecer em repouso para que ocorra a mudança da estrutura do glúten e a fermentação dos açúcares cujo produto é o CO2 que infla a massa ou seja é responsável pelo crescimento dela A fermentação anaeróbica principal resulta em produção de álcool e gás carbônico responsáveis pelo sabor e pelo aroma do pão A fermentação secundária faz com que a massa fique mais maleável para o boleamento e depois de a massa descansar por 5 a 20 minutos vai para a câmara de fermentação a uma temperatura mais alta onde ocorre a fermentação final por cerca de 40 a 120 minutos bem como a destruição das leveduras e a evaporação do álcool A massa fica mais um período descansando descanso final para finalizar sua textura Lembrete No processo de fabricação do pão ocorrem outras fermentações como a lática a butírica e a acética 36 Fermentação para a produção de vitaminas As vitaminas são classificadas em lipossolúveis vitaminas A D E e K que são solúveis em lipídios e absorvidas quando a bile é liberada no intestino e hidrossolúveis vitaminas do complexo B e C solúveis em água e liberadas pela urina Como nosso corpo não produz vitaminas e necessita delas para fazer reações básicas se não forem ingeridas na alimentação devem ser suplementadas por intermédio de fórmulas farmacêuticas Caso contrário podem ocorrer doenças carenciais como anemia bem como problemas neurológicos e oculares Geralmente o mosto pode ter água de maceração de milho sorbitol glicose glicerol e amido de milho e entre os microrganismos usados em várias fermentações submersas podemos citar Propionibacterium freudenreichii Propionibacterium shermanii Pseudomonas denitrificans Bacillus megaterium Streptomyces olivaceus Acetobacter suboxidans e Saccharomyces cerevisiae Para a produção industrial via fermentação em anaerobiose de vitamina B12 são usados os microrganismos Propionobacterium freudereichii P shermanii e Pseudomonas denitrificans Na fermentação industrial para produção de riboflavina vitamina B2 usase Ashbya gossypii que transforma a glicose em Dribose e esta pentose em riboflavina O betacaroteno tem como precursor a vitamina A e seu inóculo é Blakeslea trispora Fusarium sp Saccharomyces cerevisiae e Candida podem ser usados na produção de ergosterol ou provitamina D2 O ergosterol é transformado em vitamina D sob ação da luz raios ultravioletas 45 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Para produzir vitamina C utilizase Saccharomyces cerevisiae e Zygosaccharomyces bailii em fermentação submersa O ácido Lascórbico vitamina C é produzido industrialmente a partir de glicose que é reduzida a sorbitol e oxidado a Lsorbose pelo Acetobacter suboxydans que posteriormente resulta em um composto chamado ácido 2cetogulônico Este é oxidado a ácido 2Loxogulônico que após a remoção dos grupos isopropilidênicos obtémse o ácido Lascórbico Foi estudada a bactéria geneticamente modificada de Erwinia herbícola que pode converter diretamente a Dglicose em ácido Loxogulônico precursor da vitamina C A produção industrial de αtocoferol vitamina E tem como microrganismo responsável a alga verde Euglena gracilis A forma de isolamento das vitaminas em geral se baseia em separação da biomassa de bactérias ou fungos por centrifugação ou filtração enquanto a fase líquida é enviada a cromatografias com vários solventes diferentes para que sejam cristalizadas 37 Fermentação para a produção de soros e vacinas A primeira vacina descoberta foi a de varíola em 1796 por Edward Jenner Em 1885 Louis Pasteur descobriu a vacina de raiva em 1888 Roux e Yersin descobriram a vacina da difteria em 1898 Dr Vital Brazil descobriu a vacina da peste bubônica Os soros contêm anticorpos já prontos para o uso necessários para combater determinada doença ou intoxicação e as vacinas contêm antígenos que induzem o sistema imunológico a produzir anticorpos Entre os soros podemos citar os destinados a veneno de animais peçonhentos ou a toxinas de agentes infecciosos como os causadores de difteria botulismo e tétano Os soros geralmente são de origem equina por hiperimunização de cavalos por cerca de 40 dias Na produção de soros antipeçonhentos é retirada a peçonha veneno de animais peçonhentos como serpentes aranhas escorpiões e taturanas O veneno é liofilizado antígeno e quando for usado deve ser reconstituído com soro fisiológico diluindoo e injetandoo no cavalo até que depois de certo tempo o animal fique imune ao veneno período em que se irá fazer a sangria Nessa fase ocorre a sangria exploratória com a qual se mede a quantidade de anticorpos e quando se chega na quantidade desejada é feita a sangria final com a retirada de cerca de quinze litros de sangue de um cavalo de 500 kg em três etapas com um intervalo de 48 horas Para a fabricação de soros contra difteria botulismo e tétano usase toxoide toxina atenuada como antígeno enquanto no soro antirrábico é utilizado vírus rábico inativado como inóculo no cavalo A sangria final é feita depois de certo tempo sendo necessários 15 litros de sangue em um animal de 500 kg para purificação e concentração do plasma que é o soro repleto de anticorpos Esse soro é submetido a testes físicoquímicos de controle de qualidade e as hemácias são devolvidas ao cavalo plasmaferese Como explicado anteriormente as vacinas possuem diversas origens entre elas viral e bacteriana Quando é necessário obter vírus para seu isolamento ocorre replicação em alguma célula por exemplo 46 Unidade I em ovos embrião de galinha Já se a vacina é bacteriana deve crescer em caldo de fermentação para se obter a bactéria e proceder à fabricação e ao posterior processamento final 38 Fermentação para a produção de antibióticos Conforme anteriormente explicado os antibióticos em sua maioria têm origem biológica e são subprodutos do crescimento de microrganismos ou seja do metabolismo secundário de fungos e bactérias com capacidade de impedir o crescimento ou levar à morte outros microrganismos podendo ser sintéticos ou naturais 39 Fermentação para a produção de esteroides As glândulas suprarrenais e as glândulas sexuais produzem os hormônios esteroides que têm como estrutura principal o núcleo esteroide também chamado de ciclo pentanoperidrofenentreno obtido a partir do colesterol Podem ser classificados em glicocorticoides por exemplo a cortisona mineralocorticoides por exemplo a aldosterona e hormônios sexuais por exemplo a testosterona a progesterona e o estrógeno cada um com função orgânica determinada fundamental para o bom funcionamento do corpo humano Por isso se houver deficiência de algum deles algumas doenças surgirão Em 1937 Mamoli e Vercellone isolaram a cortisona de uma fermentação com determinadas leveduras e em 1949 Hench percebeu que poderia usar essa substância para aliviar a dor de pacientes com artrite reumatoide Já em 1952 Peterson e Murray usando Rhizopus arrhizus obtiveram progesterona A biotransformação ou fermentação para obtenção de esteroides como as demais necessita de mosto microrganismos e condições adequadas de temperatura e pH O mosto pode conter estigmasterol encontrado no feijão de soja que é o substrato que resulta na progesterona além do βsitosterol e do campesterol intermediários da androstenediona androstadienediona ou diosgenina encontrada no barbasco Dioscorea mexicana planta herbácea encontrada nas Américas e na Europa e o colesterol que pode ser obtido a partir da lanolina cera de lã o qual é transformado nos intermediários androstenediona e androstadienediona O processo se inicia com o crescimento do microrganismo e depois adicionase o esteroide à cultura que terá sua estrutura modificada por transformações químicas produzidas durante a cultura Logo após removese os microrganismos a fim de extrair o esteroide As transformações bioquímicas mais importantes são hidroxilação epoxidação e desidrogenação realizadas geralmente pelos fungos filamentosos Rhizopus arrhizus e Rhizopus nigricans obtendose progesterona Septomyxa affinis que produz prednisolona e prednisona e Septomyxa affinis e Arthrobacter simplex que produzem hidrocortisona A fermentação pode ser direta quando se tem o crescimento do microrganismo em meios sólidos juntamente com o esteroide como substrato que é adicionado diretamente ao meio de cultura Também pode ocorrer fermentação dupla na qual primeiramente há o crescimento microbiano e depois mudase o meio de cultura utilizado 47 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Lembrete Esteroides são hormônios produzidos pelo córtex da glândula suprarrenal ou pelas gônadas os quais são responsáveis por diversas funções no organismo como controle metabólico ou de características sexuais 4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA TÉCNICAS E APLICAÇÕES A biologia molecular antigamente chamada de engenharia genética analisa estuda e manipula DNA RNA e proteínas A história se inicia em 1866 com Gregor Mendel que analisou a herança genética em ervilhas Johann Friedrich Miescher em 1869 descobriu os ácidos nucleicos quando estudava o núcleo de glóbulos brancos do pus de feridas Rosalind Franklin desde 1946 estudava difração dos raios X de DNA até que em 1953 James Watson e Francis Crick mostraram para a comunidade científica a estrutura de dupla hélice do DNA Graças ao estudo dos genes no Projeto Genoma que mapeou o código genético de diversos tipos de organismos temos agora a Genômica Funcional que pode ser classificada em Transcriptoma estudo do conjunto de RNAs mensageiros Proteoma estudo das proteínas produzidas por parte de um genoma Epigenoma que estuda por exemplo o perfil de metilação de indivíduos com quadros sindrômicos sem variantes genéticas detectadas e Metaboloma estudo dos metabólicos aminoácidos nucleotídeos carboidratos proteínas etc de um organismo 41 Métodos de extração e purificação de DNA e RNA Para se obter DNA retirado das células procariotas bactérias ou eucariotas sangue plantas fungos insetos etc devese lisar quebrar a membrana plasmática e separar ou precipitar tudo que não é material genético como restos celulares organelas proteínas e só depois precipitar o material genético para suspendêlo em volume pequeno de solução tampão Para isso existem muitos protocolos ou kits comerciais mas de maneira geral usase lisozima para clivar a membrana juntamente com uma grande concentração de sal e detergente SDS dodecil sulfato de sódio Após essa ruptura devese centrifugar a mistura e submeter o sobrenadante ao tratamento com fenolclorofórmio para extração das proteínas O material resultante deve ser precipitado com álcool absoluto e ressuspenso em tampão e se não for usado no mesmo momento deve ser estocado em geladeira Vários são os cuidados que se deve ter durante a extração de DNA por exemplo utilizar material esterilizado para diminuir a contaminação luvas e bancada limpa Para se saber a pureza e a concentração do DNA podemos usar gel de agarose ou análise em espectrofotômetro Em gel de agarose comparase a amostra com um DNA padrão do bacteriófago Lambda que corre no mesmo gel em concentrações conhecidas Podemos avaliar por análise da densidade óptica DO a quantidade de DNA presente na amostra pois o DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas em 280 nm Mediante a 48 Unidade I relação 1 DO260 50 µg de DNA de dupla hélice a concentração de DNA na amostra pode ser obtida pelo seguinte cálculo Concentração de DNA leitura da DO260 50 fator de diluição usado na leitura Caso se faça a relação DO260DO280 e resulte em valores menores que 18 significa que há contaminação com proteínas e a amostra deve ser purificada novamente Na extração do RNA devese tomar mais cuidados que na extração do DNA pois o RNA é muito instável e pode ser degradado por enzimas chamadas RNAses encontradas na saliva na mão etc Há kits que usam um método muito rápido de extração por meio da solução de TRIZOL solução pronta produzida na indústria que contém fenol isotiocianato de guanidina e outros componentes Após a mistura das células com TRIZOL devese fazer extração com clorofórmio e álcool isopropílico e precipitar com álcool etílico O precipitado é ressuspenso em solução tampão estéril e pode ser analisado em espectrofotômetro 260 nm e 280 nm para se conhecer sua concentração e pureza Preparações puras de RNA têm uma relação A260A280 de entre 18 e 20 Se houver contaminação com proteínas ou fenol a relação A260A280 é menor devendo ser reprecipitado e purificado novamente As aplicações práticas após a extração desses ácidos nucleicos são várias e vão desde o estudo de identificação de doenças genéticas o estudo de vírus e bactérias testes de paternidade até a modificação de plantas ou animais OGMorganismos geneticamente modificados que se adaptam melhor ao ambiente ou nos causam benefícios variados como produção de antibióticos ou hormônios O sequenciamento do DNA pode ser usado para vários fins até mesmo para validar matériasprimas e insumos bem como para a validação da higienização 42 Técnicas de DNA recombinante clonagem molecular construção de vetores e enzimas de restrição Após purificação do DNA devese fazer a digestão da amostra e dependendo do que se deseja fazer devese analisar o DNA fazendo um mapa de restrição que consiste em submetêlo à digestão de enzimas de restrição correr um gel e verificar o tamanho dos fragmentos de DNA e a partir desses fragmentos construir um mapa com os locais onde determinada enzima faz o corte Observação As enzimas de restrição são exemplos de endonucleases ou seja clivam DNA internamente caso clivassem nas extremidades se chamariam exonucleases Em meados do século XX cientistas descobriram que algumas enzimas produzidas por bactérias eram capazes de cortar moléculas de DNA em pontos específicos na mesma sequência de nucleotídeos Elas foram denominadas enzimas de restrição ou endonucleases de restrição Acreditase que é uma forma de proteção das bactérias contra patógenos que queiram parasitálas 49 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA As enzimas de restrição funcionam como uma espécie de tesoura molecular elas identificam sequências de pares de bases nitrogenadas específicas nas moléculas de DNA e as cortam nessas regiões Cada tipo de endonuclease de restrição identifica e corta somente dada série de nucleotídeos geralmente composta de quatro ou seis pares de bases O local onde a molécula de DNA é clivada pela enzima recebe o nome de sítio de restrição cujos exemplos podem ser observados no quadro a seguir Quadro 2 Sítio de clivagem de algumas enzimas de restrição Enzima Bactéria cuja enzima é isolada Sequência reconhecida Tipo de extremidade gerada após clivagem BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5 G GATCC 3 3 CCTAG G 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato EcoRI Escherichia coli 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato HaeIII Haemophilus aegyptius 5 GG CC 3 3 CC GG 5 Extremidades cegas HindIII Haemophilus influenzae 5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato NotI Nocardia otitidiscaviarum 5 GC GGCCGC 3 3 CGCCGG CG 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato PstI Providencia stuartii 5 CTGCA G 3 3 G ACGTC 5 Extremidades coesivas extensão 3 hidroxila XhoI Xanthomonas holcicola 5 C TCGAG 3 3 GAGCT C 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato É muito provável que as enzimas de restrição tenham sido desenvolvidas pelas bactérias ao longo de seu processo evolutivo com uma forma de proteção contra os ataques de bacteriófagos Assim quando uma molécula de DNA do vírus é introduzida na bactéria rapidamente é clivada nos sítios de restrição deixando de funcionar Isso não acontece com as moléculas de DNA da própria bactéria pois existem enzimas protetoras que evitam a ação das endonucleases de restrição no genoma bacteriano Os fragmentos de DNA obtidos a partir do corte da molécula com uma enzima de restrição podem ser isolados uns dos outros por meio de uma técnica chamada eletroforese Após a corrida de eletroforese os fragmentos das moléculas de DNA são analisados permitindo por exemplo o reconhecimento preciso de uma pessoa A análise do padrão eletroforético de fragmentos de DNA é hoje largamente utilizada em investigações policiais e em processos judiciais como os de comprovação de paternidade 50 Unidade I Para se obter determinada proteína em grandes quantidades por fermentação devese fazer uma clonagem molecular de preferência por meio da técnica do DNA recombinante Para isso necessitamos de um enxerto ou DNAalvo um veículo de clonagem e um hospedeiro Em primeiro lugar devemos escolher o chamado enxerto do DNA do organismo doador que é o gene que tem a informação da proteína Esse fragmento que contém o gene de estudo deve ser isolado em gel de agarose e purificado Classes de risco A OMS define a classe de risco mediante o microrganismo a ser estudado em classe de risco classes 1 2 3 e 4 da seguinte maneira Classe de risco 1 organismos que oferecem baixo risco individual e baixo risco para a comunidade e que não causam doença ao homem ou aos animais Classe de risco 2 organismos que oferecem risco individual moderado e risco limitado para a comunidade ou seja não oferecem risco a quem os manipula Podem ser provenientes de pessoas com doenças como o Staphylococcus aureus e o Vibrio spp Classe de risco 3 organismos que oferecem elevado risco individual e risco limitado para a comunidade Apresentam risco para quem os manipula e para pessoas ou animais Causam sérias doenças como Bacillus anthracis Mycobacterium spp Salmonella paratyphi e Shigella typhi Classe de risco 4 organismos que oferecem elevado risco individual e elevado risco para a comunidade por exemplo o vírus ebola e o vírus da varíola O veículo pode ser um fago cosmídeo ou plasmídeo que deve ter seu DNA purificado e clivado com a mesma enzima com a qual se obteve o gene enxerto Logo após são ligados em enzima DNA ligase e o conjunto vetor de clonagem enxerto colocado em um hospedeiro que pode ser bactéria fungo planta ou animal em um processo chamado transformação Os organismos que têm o material construído são identificados e selecionados O próximo passo é analisar a proteína que é produzida e purificála para que seja usada conforme a figura a seguir 51 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Bactéria Cromossomo bacteriano Plasmídeo Um vetor como um plasmídeo é isolado DNA recombinante plasmídeo O gene é inserido no plasmídeo O DNA é clivado em fragmentos por uma enzima O plasmídeo é incorporado por uma célula como a de uma bactéria As células com o gene de interesse são clonadas Bactéria transformada As cópias do gene são purificadas Plasmídeo RNA Produto proteico As proteínas desejadas são purificadas O hormônio do crescimento humano é utilizado no tratamento de casos de deficiência do crescimento Amilase celulase e outras enzimas preparam os tecidos para a fabricação de roupas Um gene altera bactérias de modo que elas possam fazer a limpeza de resíduos tóxicos Um gene para resistência a uma peste é inserido em plantas O objetivo pode ser a obtenção do produto proteico do gene ou As células produzem a proteína Gene de interesse DNA contendo o gene de interesse O objetivo pode ser a produção de cópias do gene 6A 7 6B 5 4 3 2 1 Figura 13 Visão geral da tecnologia do DNA recombinante Etapas envolvidas na construção de uma célula recombinante e alguns exemplos de aplicação Fonte Tortora Funke e Case 2012 p 248 Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA com pelo menos um gene que confere resistência a um antibiótico Essas moléculas são inseridas em bactérias e podem receber um enxerto de DNA pequeno o fago ou bacteriófago λ funcionando como um vírus da E coli e aceitando enxertos maiores de até 15 kb Já os cosmídeos uma mistura de plasmídeo e fago aceitam sequências para clonagens maiores entre 35 kb a 40 kb como mostra a figura a seguir 52 Unidade I DNA plasmideal Quebra mediada por enzima de restrição DNA de interesse inserto OH OH OH OH OH HO O O O O O O Incisão Ligação fosfodiéster Transformação Célula hospedeira P O P O OH OH HO HO P P Quebra mediada por enzima de restrição Tratamento com fosfatase alcalina DNA ligase de T4 Ligação fosfodiéster Incisão Figura 14 Esquema de clonagem de um fragmento de DNA de interesse em um plasmídeo Note a necessidade de digestão com enzima de restrição no vetor e no enxerto Em um mesmo tubo é colocado tampão nucleotídeos e DNA ligase que ligará o conjunto Fonte Glick Pasternack e Patten 2010 p 61 Atualmente podemos dizer que as principais técnicas usadas nos estudos de biologia molecular são Reação em Cadeia da Polimerase PCR utilizada para ampliar cópias do DNA e aprimorar a análise de suas mutações clonagem e manipulação de genes eletroforese em gel de agarose ou acrilamida usada para separar proteínas DNA e RNA através da diferença entre suas massas Southern Blot que usa a transferência da corrida do gel para um papel específico que permite a hibridização do DNA com uma pequena sequência de DNA sonda marcada com material radioativo ou fluorescência demonstrando ser homólogo Northern Blot que é semelhante à Southern Blot mas utiliza o material RNA e Western Blot semelhante à Southern Blot mas é usada para analisar proteínas 53 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA 43 Sequenciamento de DNA Em 2003 o genoma humano foi totalmente sequenciado com a ajuda de muitos pesquisadores Ao conhecer a sequência dos nucleotídeos que contêm as bases nitrogenadas A T C e G do DNA podemos saber qual seria a sequência do RNA mensageiro e por consequência da proteína Conhecendo a sequência correta podemos entender como as mutações sequências incorretas podem por exemplo levar a doenças genéticas Essa técnica é chamada cDNA complementary DNA pois é a sequência que complementa a do molde de RNA onde o DNA é sintetizado a partir de um molde de RNAm maduro do qual já houve a retirada dos íntrons extraído pelas técnicas de extração de RNA discutidas anteriormente no qual as enzimas transcriptase reversa e DNA polimerase são usadas Esse procedimento é empregado para criar bibliotecas de cDNA nas quais as sequências dos RNAsm de determinada célula ou organismos são armazenadas para estudos futuros Lembrete Íntrons e éxons são sequências de nucleotídeos de um gene porém os íntrons são removidos do RNAm pelo processo chamado splicing sobrando apenas os éxons no RNAm maduro que serão efetivamente expressos Procariotos não têm maturação do RNA somente os eucariotosÉ Éxon Éxon Éxon Núcleo Íntron Íntron DNA de um gene eucariótico RNA 1 2 3 4 5 RNAm Um gene composto de éxons e íntrons é transcrito em RNA pela RNApolimerase Enzimas processadoras no núcleo renovam o RNA derivado dos íntrons e unem o RNA derivado dos éxons para formar o RNAm Isolamento de RNAm da célula e adição de transcriptase reversa A primeira fita de DNA é sintetizada O RNAm é digerido pela transcriptase reversa Adição de DNApolimerase para sintetizar a segunda fita de DNA Fita de DNA sendo sintetizada cDNA DNA do gene sem íntrons Citoplasma Figura 15 Síntese do cDNA A figura ilustra as etapas envolvidas na síntese de cDNA a partir de um gene eucarioto Fonte Tortora Funke e Case 2012 p 255 54 Unidade I Uma vez com o fragmento de DNA ou gene separado podemos descobrir sua sequência analisandoa podemos descobrir sequências diferentes que ocasionam doenças genéticas Há várias metodologias para sequenciamento desde a primeira chamada de sequenciamento capilar por Sanger até os novos métodos ou nova geração de sequenciamento Para a análise de pequenas regiões genômicas ou microssatélites são empregadas as seguintes técnicas SNP em inglês single nucleotide polymorphism variações pontuais encontradas ao longo do DNA isto é são diferenças em um único nucleotídeo em uma população SNV em inglês single nucleotide variant substituição de um único nucleotídeo por outro em um único indivíduo da população InDel em inglês insertiondeletion variações de comprimento por inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos e pequenas duplicações de um único paciente Para esses métodos utilizase o sequenciador capilar ou método de Sanger que apesar de caro é a melhor opção Apesar de SNP e SNV estarem relacionadas com a mudança em um só nucleotídeo as SNPs estão diretamente relacionadas com a predisposição a certas doenças genéticas como câncer e são observadas em uma frequência maior na população enquanto as SNVs não Observação A série de TV CSI Criminal Scientific Investigation apresenta um grupo de policiais que desvendam crimes a partir de várias técnicas laboratoriais de biologia molecular extraindo DNA de fios de cabelo gotas de sangue ou sêmen em roupas Com a técnica de fenotipagem por DNA forense FDP em inglês forensic DNA phenotyping utilizamse análises dos SNPs para desvendar características do dono da amostra como a cor dos olhos da pele e do cabelo ou ainda informações sobre sua ancestralidade Para sequenciar grande número de regiões ou fragmentos de mais de um paciente de uma vez só em um mesmo experimento adotase a técnica NGS nextgeneration sequencing que possibilita construir painéis estudo de mais de um gene oncológicos de doenças raras de distrofinopatias de epilepsias etc 55 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA No sequenciamento capilar método de Sanger também chamado método de terminação de cadeia enzimática são colocados no mesmo tubo de reação nucleotídeos que não permitem a continuidade da polimerização ou o crescimento da cadeia de DNA O procedimento se inicia com o DNAalvo que será sequenciado submetido a aquecimento para que ocorra a desnaturação separação das fitas do DNA molde e depois resfriamento No mesmo tubo de reação são colocados primers ou iniciadores chamada etapa de PCR que se ligam a uma pequena parte da fita do alvo que agora está simples e não dupla enzima e nucleotídeos Esse tubo de reação tem sua temperatura elevada para que a enzima DNA polimerase sintetize um novo DNA começando pelo primer com os quatro nucleotídeos do DNA dATP dTTP dCTP e dGTP até que um dideoxinucleotídeo ddATP ddTTP ddCTP e ddGTP marcados com fluoróforos entre na fita Quando isso ocorre nenhum outro nucleotídeo se unirá pois não possuem um grupo hidroxila no carbono 3 e a fita para de crescer gerando fragmentos de diferentes comprimentos Dideoxinucleotídeo ddNTP Deoxinucleotídeo dNTP H H H O OCH2 Base OH H H P P P H H H O OCH2 Base H H H P P P Figura 16 Estrutura de dNTP e ddNTP Note que o ddNTP não possui um grupo hidroxila no terceiro carbono da desoxirribose Fonte Rye et al 2016 O aparelho de sequenciamento é programado para fazer vários ciclos de aqueceesfria para que no aquecimento as fitas se separem e outro primer se ligue a outra fita e comece a crescer amplificando várias vezes a quantidade de DNA Após a eletroforese observamos diferentes bandas de DNA marcadas com cores quando iluminadas com laser permitindo uma leitura do menor fragmento para o maior conforme mostrado na figura a seguir 56 Unidade I ATGCTACAG ATGCTACAGT ATGCTACAGTT ATGCTACAGTTG ATGCTACAGTTGC ATGCTACAGTTGCC ATGCTACAGTTGCCA ATGCTACAGTTGCCAA Sequênciaalvo 3 TACGATGTCAACGGTT 5 5 ATGCTACA 3 Primer Produtos de amplificação Produtos de amplificação Extensão do primer com ddNTPs Eletroforese e leitura Figura 17 Esquema de sequenciamento de primeira geração desenvolvido por Fred Sanger 1977 em que cada um dos dideoxinucleotídeos A T C G é marcado com uma fluorescência diferente cuja leitura é feita pelas cores Fonte GarridoCardenas et al 2017 p 4 Há plataformas de sequenciamento que foram se aprimorando para segunda terceira e quarta gerações de sequenciadores Os sequenciamentos genéticos de segunda geração chamada de técnica de Shotgun podem decifrar por reações de Sanger grande número de pequenos fragmentos resultantes de digestão ou sonicação de um fragmento maior de DNA e os resultados são montados como um quebracabeça Observação Usando a tecnologia de Shotgun Craig Venter fundou a Celera Genomics o The Institute for Genomic Research e o J Craig Venter Institute que desvendou e sequenciou o genoma humano em 2001 Podem ser usadas várias plataformas ou equipamentos de diversas indústrias de biotecnologia O sequenciamento de nova geração NGS e de segunda geração pulam a etapa de PCR Como exemplos dessas plataformas podemos citar 454Roche Illumina Genome Analyser SOLEXA e ABISOLID sequencing by oligonuclotide ligation and detection que podem sequenciar DNA em algumas horas ou vários dias dependendo da capacidade dos equipamentos criando painéis completos sequenciamento de alguns genes em exomas transcriptomas e metilomas A técnica de pirosequenciamento como na plataforma 454Roche permite que a cada nucleotídeo colocado seja emitida fluorescência que gera um pico referente ao nucleotídeo adicionado em tempo real e com isso um rápido sequenciamento 57 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA No sequenciamento baseado em cores Illumina Genome Analyser no qual os fragmentos são amplificados e se ligam a primers que estão presos em uma matriz crescendo e se dobrando para alcançar o outro primer formam uma ponte e após a polimerização têm sua sequência analisada pela emissão de cores No sistema ABISOLID o DNA fragmentado é ligado a esferas e é combinado com primers universais de sequenciamento enzima ligase e a sondas marcadas O sequenciamento ocorre por hibridização de sondas fluorescentes com o alvo O sequenciamento genético de transição entre a segunda e a terceira gerações são mais sofisticados e tem as plataformas Ion Torrent Thermo Fisher Scientific e PacBioRS como exemplos O sequenciamento Ion Torrent ou sequenciamento com semicondutor é semelhante ao SOLid mas o fragmento de DNA é ligado a uma matriz beads sendo oferecido um nucleotídeo por vez a esse local que será lavado Se houver a ligação o pH é mudado e um sinal na tela aparece Thermo Fisher Scientific PacBio da Pacific Biosciences conhecida pela sigla SMRT singlemolecule real time tem DNA polimerase ligada a nanotubos enquanto o DNA se liga a enzimas Quando ocorre a adição de nucleotídeos fosfoligados com fluorescência ocorre a liberação de fluorescência A 3ª geração usa sequenciadores portáteis chamada tecnologia de MinION da Oxford Nanopore sequenciador em forma de uma espécie de pendrive que possui um chip chamado flow cell membranas com vários poros por onde o DNA entra e são emitidas variações na corrente elétrica da flow cell que identificam o nucleotídeo que está passando A partir do ano de 2016 a Fiocruz iniciou o Projeto ZIBRA que pretende sequenciar o genoma do zika vírus obtendo amostras de pessoas infectadas no Brasil para serem sequenciadas com o MinION sendo expandidas para análises de arboviroses emergentes como o vírus da chikungunya e o vírus da febre amarela Em 2020 fomos surpreendidos com a pandemia de SarsCoV2 também conhecido como novo coronavírus um vírus de RNA que interferiu na vida de todas as pessoas do mundo O genoma desse vírus desde os primeiros casos confirmados no Brasil foi sequenciado e identificado no início da pandemia por meio da tecnologia Nanopore com o software MinKNOW que permite a aquisição de dados e sua análise em tempo real viabilizando o gerenciamento de protocolos de qualidade Com esse conhecimento as informações foram cruzadas com bancos de dados internacionais e os estudos de origem e disseminação do vírus foram iniciados em nosso país 44 Aplicações Identificação de pessoas por perfil genético de regiões denominadas variable number of tandem repeats VNTRs e de regiões compostas chamadas short tandem repeats STRs têm relação com os polimorfismos que são variações nas sequências de bases que compõem o gene Caso haja troca de 58 Unidade I uma única base será chamada single nucleotide polymorphism SNP se houver repetição em série de número variado de bases será chamado VNTR Os STR são repetições curtas em sequência chamadas também marcadores microssatélite MMS que auxiliam na identificação genética individual humana como usados em medicina forense na análise de restos cadavéricos e em testes de paternidade Para uso cotidiano há vários kits comerciais como o Minifile Applied Biosystems formado por nove marcadores de STRs que após a ligação no DNA são amplificados e separados em um sequenciador para a análise dos perfis de STRs em um software usandose para isso o estudo de MMS do DNA do pai da mãe e do filho Outra aplicação entre várias está relacionada com o estudo genético de pacientes com tumores e sua predisposição O câncer é uma neoplasia maligna de origem genética que acomete aproximadamente uma em cada quatro pessoas em todo o mundo Pode ter origem hereditária 5 a 10 dos casos ou esporádica 90 a 95 dos casos e seu desenvolvimento está ligado a SNPs Essas mutações SNPs podem ser do tipo missense e nonsense e caso a proteína produzida seja mutada sua função também pode ser mudada até mesmo levando ao aumento ou à diminuição da expressão de proteínas que controlam a proliferação e o reparo do DNA ou pode ser uma mutação silenciosa quando não interfere na produção de proteínas Contudo não são só as mutações que irão iniciar o câncer mas são necessários fatores externos como o tabagismo que irão colaborar para seu desenvolvimento Há várias técnicas usadas para esse tipo de estudo entre elas sequenciamento genético baseado na metodologia de NGS focado em SNPs e InDels em diferentes painéis poligênicos FISH fluorescence in situ hybridization que procura em biópsias de tecidos algum gene relacionado com câncer MLPA multiplex ligationdependent probe amplification que detecta microdeleçõesduplicações nos genes relacionados com determinados tipos de câncer microarrays ou chips de DNA que consistem em um suporte com vários fragmentos de DNA presentes em diferentes tipos de câncer servem como sondas e quando colocados com o DNA da amostra ligamse a seus semelhantes Saiba mais Para complementar as técnicas citadas os alunos poderão assistir aos seguintes vídeos FLUORESCENT in situ hybridization FISH assay 2018 1 vídeo 4 min Publicado pelo canal Creative Bioarray Disponível em httpscuttlyJIr98kt Acesso em 11 jan 2022 HOW does MLPA work 2017 1 vídeo 7 min Publicado pelo canal MRC Holland Disponível em httpscuttlyvPHXfjq Acesso em 11 jan 2022 59 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA NEXT generation sequencing NGS an introduction 2015 1 vídeo 9 min Publicado pelo canal Applied Biological Materials Disponível em httpscuttlypIr3Yh1 Acesso em 11 jan 2022 MICROARRAYS 2008 1 vídeo 2 min Publicado pelo canal Genome BC Disponível em httpscuttlykIr8XRa Acesso em 11 jan 2022 Resumo Nesta unidade estudamos primeiramente os principais insumos farmacêuticos utilizados e como eles são obtidos ou produzidos Eles representam o início da cadeia produtiva da indústria farmacêutica Para assegurar a qualidade na produção de medicamentos a Anvisa é responsável pela autorização de funcionamento das empresas e pelo controle sanitário dos insumos farmacêuticos mediante a realização de inspeções sanitárias e a elaboração de normas A Anvisa também implementou o cadastramento dos insumos farmacêuticos ativos para as empresas que exerçam as atividades de fabricação importação exportação fracionamento armazenamento expedição embalagem e distribuição As notificações de insumos farmacêuticos com desvios de qualidade comprovados também são avaliadas pela Anvisa Posteriormente foram estudados os processos fermentativos os equipamentos e as estratégias utilizadas para que a fermentação ocorra bem como tipos ou exemplos de aplicação Inicialmente os processos fermentativos são caracterizados pela ausência de oxigênio em seu processo bioquímico em meio a fungos e bactérias como forma de obtenção de energia para manutenção de sua sobrevivência no meio Independentemente do que esteja realizando a fermentação ela sempre ocorre no citosol da célula com ajuda de enzimas catalizadoras com a finalidade de obtenção de ATP molécula responsável pelo fornecimento de moeda de troca energética da célula Podese dizer então que a fermentação é uma via de produção energética que ocorre após a glicólise A glicólise por sua vez é um processo químico no qual fosfatos P são incorporados à molécula de glicose para obtenção de energia após a quebra da mesma molécula Finalmente foram estudados e apresentados princípios da biologia molecular da manipulação genética e da produção de proteínas recombinantes A biologia molecular tem como campo de estudo as interações bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do material genético e na síntese proteica É uma área intimamente ligada à genética e à bioquímica A biologia molecular consiste principalmente em estudar as interações entre os vários sistemas da célula partindo da relação entre o DNA o RNA e a síntese de proteínas e o modo como essas interações são reguladas 60 Unidade I Exercícios Questão 1 Leia o texto a seguir Indubitavelmente as estratégias de garantir qualidade dos medicamentos disponibilizados no mercado nacional são altamente desejáveis tanto para os segmentos dos medicamentos industrializados e magistrais quanto para o usuário final desses produtos Nesse contexto parece evidente que o foco principal está centrado na qualidade do medicamento final direcionada fundamentalmente para a garantia do efeito terapêutico isento de efeitos colaterais provocados por interferências externas derivadas de sistemas e processos envolvidos na produção dos IFA ou de insumos inertes Por outro lado a certificação em torno da importação de IFA traz à tona a discussão do problema da dependência externa do país em torno da importação dos IFAs Uma avaliação da história da indústria farmacêutica e de química fina brasileira em termos dessa dependência externa torna evidente que nunca houve esforços nem políticas de Estado no sentido de pelo menos minimizar esse problema Adaptado de Oliveira e Silveira 2021 Conforme destacado no texto a produção de IFA é um processo que exige tecnologia e muito cuidado para que seja criado um produto de qualidade e seguro para os profissionais da saúde e seus usuários com altos índices de eficácia e pouco ou nenhum efeito colateral Diante de todas essas exigências não são todos os países que têm capacidade de produzir tal insumo ficando dependentes de importações que são processos demorados e custosos Considerando a importância do IFA e as exigências de alta qualidade em sua produção avalie as afirmativas I Quando o tema é vacina apenas os IFAs de vacinas contra bactérias podem ser produzidos já que os vírus apresentam uma estrutura muito complexa para serem trabalhados além de termos de considerar as frequentes mutações que afetam esses patógenos II O procedimento padrão para a produção do IFA envolve o crescimento de bactérias em meios de cultura enquanto os vírus são colocados para crescer em outro organismo como embriões de galinha III Após o processo de crescimento dos patógenos a amostra deve passar pelo processo de purificação para que sobrem apenas os materiais necessários à estimulação da resposta imune IV O IFA não é composto apenas de patógenos ou moléculas derivadas deles A esse material podem ser acrescentadas substâncias por exemplo água estéril soro fisiológico conservantes albumina fenóis e glicina que irão facilitar o transporte e o armazenamento e principalmente irão aumentar a resposta imune e a proteção gerada pela vacina 61 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA É correto o que se afirma em A II III e IV apenas B II e III apenas C I III e IV apenas D III e IV apenas E I II III e IV Resposta correta alternativa A Análise das afirmativas I Afirmativa incorreta Justificativa a tecnologia envolvida na produção de IFA permite o desenvolvimento desses insumos para vacinas contra bactérias vírus e até mesmo parasitas eucariontes como o Schistosoma mansoni O processo de produção sofre alterações para cada um desses patógenos II Afirmativa correta Justificativa a produção do IFA necessita de grandes quantidades do patógeno antes da purificação Esse crescimento é realizado em condições específicas e controladas respeitandose as exigências de cada patógeno ou seja meios de cultura para bactérias e células eucariontesseres vivos para vírus III Afirmativa correta Justificativa a etapa da purificação do IFA envolve por exemplo câmara trituradora e equipamentos para centrifugação e liofilização Tratase de uma fase importante para retirar da amostra eventuais substâncias que poderão diminuir a eficácia da vacina eou causar efeitos colaterais mais graves IV Afirmativa correta Justificativa de fato parte do IFA corresponde a água estéril soro fisiológico conservantes e estabilizantes que estão ali para garantir que o insumo tenha alta qualidade e possa gerar vacinas eficientes e seguras para a população Vale destacar que para a composição do IFA devese optar pelo material que for mais adequado à estimulação da resposta imune e que apresentar o menor grau de efeitos colaterais Assim podem ser usados patógenos inteiros mortos ou inativados inteiros vivos porém atenuados enfraquecidos proteínas ou ácidos nucleicos 62 Unidade I Cabe notar que o IFA é fundamental na formulação de um fármaco porque está nele a substância capaz de produzir o efeito desejado Nas vacinas é o IFA que tem a informação que faz com que o organismo comece a preparar suas defesas contra um microrganismo invasor No caso de imunizantes como a CoronaVac chamados de vacinas de vírus inativado o IFA é o ingrediente que contém o corpo do microrganismo morto incapaz de se replicar e provocar uma infecção Ao receber a vacina o corpo da pessoa vacinada passa a conhecer a estrutura do coronavírus e produz defesas específicas contra suas formas de ataque Outras vacinas usam plataformas tecnológicas diferentes como as vacinas genéticas da PfizerBioNTech e da Moderna que utilizam o RNA mensageiro do coronavírus para que o corpo humano conheça a proteína S chamada de spike Nesse caso o IFA contém tal RNA que é produzido sinteticamente Já vacinas como a OxfordAstraZeneca e Sputnik V têm a tecnologia de vetor viral em que um vírus inofensivo é modificado para transportar informações do coronavírus A vacina de Oxford usa adenovírus de chimpanzé como vetor de informações da proteína spike que é inserida dentro do antígeno O IFA então é um concentrado viral que contém esses vírus modificados geneticamente LISBOA 2021 Questão 2 Leia o texto a seguir A biologia sintética é a tentativa de criar sistemas vivos a partir do início e dotálos de novas funções Esses novos organismos criados podem ter diferentes funções de que a humanidade necessita para sua sobrevivência Portanto a biologia sintética é um ramo da ciência que está avançando exponencialmente devido às descobertas com que os pesquisadores e estudantes da área estão deparando No entanto com o foco em sintetizar novos remédios bactérias antipoluentes novos tecidos biológicos e demais outras possibilidades ela está se tornando uma área atraente pela qual vários pesquisadores de outras linhas de pesquisa estão se interessando e ingressando nesse grupo Adaptado de Souza et al 2018 O texto faz considerações acerca dos esforços realizados na chamada biologia sintética para o desenvolvimento de novos seres vivos que colaborem em diferentes situações de sobrevivência do ser humano Sobre a biologia sintética e os procedimentos envolvidos nesse ramo da ciência avalie as afirmativas I O sequenciamento do DNA é uma importante etapa que permite a observação da sequência inteira de nucleotídeos que formam o DNA das espécies De posse dessa informação podese estabelecer a sequência correspondente ao RNA mensageiro e quais proteínas serão produzidas a partir dele bem como eventuais mutações que podem levar a doenças genéticas 63 BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA II Outra técnica importante no âmbito da biologia sintética é o DNA recombinante ou clonagem molecular Nesse procedimento um trecho de DNA escolhido é adicionado ao DNA de outra espécie isto é plasmídio para que então seja inserido em um hospedeiro por exemplo bactéria fungo planta ou animal Assim podese controlar a produção de proteínas específicas e que tenham alguma função para os seres humanos ou outros animais III Um dos processos envolvidos é o que faz a extração e a purificação de DNARNA A partir dessas moléculas extraídas é possível fazer a identificação de doenças genéticas o estudo de patógenos por exemplo vírus e bactérias e a modificação de plantas ou animais podem ser benéficos ao ser humanos produzindo antibióticos ou hormônios Assinale a alternativa correta A Apenas a afirmativa I é correta B Apenas a afirmativa II é correta C Apenas as afirmativas II e III são corretas D Todas as afirmativas são corretas E Nenhuma afirmativa é correta Resposta correta alternativa D Análise das afirmativas I Afirmativa correta Justificativa de fato o sequenciamento genético ou do DNA é um procedimento fundamental para a biologia sintética porque ao revelar a sequência de monômeros dessa molécula nucleotídeos fornece a chave para que sejam identificados os trechos do DNA ligados a determinadas características físicas fisiológicas e até doenças genéticas Em muitos casos essas sequências específicas podem ser editadas ou alteradas no âmbito da biologia molecular por exemplo DNA recombinante e clonagem molecular II Afirmativa correta Justificativa a clonagem molecular é no campo da biologia molecular um importante ramo que tem ajudado diferentes áreas como a medicina humana a medicina veterinária o setor agropecuário o mapeamento genético e o meio ambiente São muitas as suas aplicações e em farmacologia destacamse a produção de insulina humana em escala comercial fatores de coagulação hormônio do crescimento e mais recentemente medicamentos para o tratamento de câncer e Aids As etapas fundamentais são aquelas indicadas na afirmativa 64 Unidade I III Afirmativa correta Justificativa a extração e a purificação de ácidos nucleicos são procedimentos básicos dentro da chamada biologia sintética Isso ocorre porque a criação de novos seres vivos capazes de nos auxiliar está fundamentada no uso e na manipulação do material genético O conhecimento dessa molécula e do código genético a ela associado permite uma variedade de aplicações algumas delas citadas na própria afirmativa