PCR e RT-PCR no estudo do receptor androgênico em câncer de próstata resistente à castração

UNIVERSIDADE VEIGA DE ALMEIDA Disciplina Biotecnologia 20231 O câncer de próstata é o segundo tipo de câncer mais comum nos homens do Brasil O estímulo androgênico está totalmente relacionado com o seu crescimento e sua letalidade Ou seja maiores níveis de testosterona circulantes no sangue conferem maior velocidade de progressão e agressividade do câncer Dessa forma o tratamento inicial é baseado na terapia de deprivação androgênica onde através de fármacos a produção de testosterona natural do paciente é muito reduzida Ainda assim alguns cânceres desenvolvem um estado de resistência no qual ocorre progressão de doença apesar de níveis sanguíneos baixos de testosterona o que é chamado de câncer de próstata resistente à castração Dada a relevância do tema um estudante de mestrado adotou esse tema como seu projeto de pesquisa e resolveu investigar os mecanismos responsáveis pela resistência nesses casos A primeira ideia dele foi comparar os genes do receptor androgênico das células saudáveis com as células cancerosas do mesmo paciente Para tal ele coletou células cancerosas da próstata e células do sangue para fazer um PCR 1 a Produza primers para o gene do receptor androgênico seguindo as regras para desenho de primers de forma a amplificar toda a região codificante sequência do gene do receptor androgênico no final deste arquivo R b Depois de realizar o PCR o estudante de mestrado revelou os resultados por eletroforese representado na imagem abaixo Interprete o resultado explicando as diferenças observadas entre as amostras O gene nas duas células tem o mesmo tamanho Apresentam a mesma quantidade R 2 Não contente o mestrando dessa vez resolve realizar um RTPCR buscando entender se há alguma perda ou mudança de informação após a transcrição do gene a Explique qual a diferença no processo entre o PCR com base no DNA e o PCR com base no RNA R b Desenhe os primers para a reação com o cDNA R c Da mesma forma os resultados foram revelados por eletroforese representado na imagem abaixo Interprete o resultado R 3 O próximo passo da sua investigação é compreender o funcionamento do receptor androgênico na célula saudável comparado com a célula cancerosa O receptor androgênico quando inativo está ligado à proteína HSP90 Com a chegada da testosterona na célula a testosterona se liga ao receptor causando o desligamento da HSP90 logo ativando o receptor Uma vez ativo ele migra para o núcleo e exerce sua função influenciando na expressão gênica da célula Ou seja a chegada de testosterona desliga a HSP90 tornando o receptor androgênico ativo Para entender a atividade dos receptores o estudante isolou as células saudáveis e cancerosas em laboratório e após fornecer uma dose de testosterona decidiu medir a quantidade de HSP90 livre nas células ao longo do tempo Interprete o resultado do gel de eletroforese R 4 Sugira uma hipótese válida para justificar a diferença entre o resultado obtido no PCR e no RTPCR sabendo que a geração de um câncer normalmente está associada a uma mutação genética R Sequência genética para o receptor androgênico humano Região em vermelho éxons ACCCTCTGTTTTCCCCCACTCTCCTGCCTTCCCCCACCCCGAGTGCGGAGCCAGAGATCAAGATGAAAAG GCAGTCAGGTCTTCAGTAGCCAAAAAACAAAACAAACAAAAACAAAAAAGCCGAAATAAAAGAAAAA GATAATAACTCAGTTCTTATTTGCACCTACTTCAGTGGACACTGAATTTGGAAGGTGGAGGATTTTGTTT TTTTCTTTTAAGATCTGGGCATCTTTTGAATCTACCCTTCAAGTATTAAGAGACAGACTGTGAGCCTAGC AGGGCAGATCTTGTCCACCGTGTGTCTTCTTCTGCACGAGACTTTGAGGCTGTCAGAGCGCTTTTTGCG TGGTTGCTCCCGCAAGTTTCCTTCTCTGGAGCTTCCCGCAGGTGGGCAGCTAGCTGCAGCGACTACCGC ATCATCACAGCCTGTTGAACTCTTCTGAGCAAGAGAAGGGGAGGCGGGGTAAGGGAAGTAGGTGGAA GATTCAGCCAAGCTCAAGGATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGGGAAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCA AGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCC AGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTTGCTGCTGCTGCAGCAGCAGCAGC AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGAGACTAGCC CCAGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGGTGCGTCCCACTCCTTGTGCCCCATTGGCCGAATGCAAAGGTTC TCTGCTAGACGACAGCGCAGGCAAGAGCACTGAAGATACTGCTGAGTATTCCCCTTTCAAGGGAGGTT ACACCAAAGGGCTAGAAGGCGAGAGCCTAGGCTGCTCTGGCAGCGCTGCAGCAGGGAGCTCCGGGAC ACTTGAACTGCCGTCTACCCTGTCTCTCTACAAGTCCGGAGCACTGGACGAGGCAGCTGCGTACCAGAG TCGCGACTACTACAACTTTCCACTGGCTCTGGCCGGACCGCCGCCCCCTCCGCCGCCTCCCCATCCCCAC GCTCGCATCAAGCTGGAGAACCCGCTGGACTACGGCAGCGCCTGGGCGGCTGCGGCGGCGCAGTGCC GCTATGGGGACCTGGCGAGCCTGCATGGCGCGGGTGCAGCGGGACCCGGTTCTGGGTCACCCTCAGC CGCCGCTTCCTCATCCTGGCACACTCTCTTCACAGCCGAAGAAGGCCAGTTGTATGGACCGTGTGGTGG TGGTGGGGGTGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC GAGGCGGGAGCTGTAGCCCCCTACGGCTACACTCGGCCCCCTCAGGGGCTGGCGGGCCAGGAAAGCG ACTTCACCGCACCTGATGTGTGGTACCCTGGCGGCATGGTGAGCAGAGTGCCCTATCCCAGTCCCACTT GTGTCAAAAGCGAAATGGGCCCCTGGATGGATAGCTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCGTAA TTATATTTGGTTCCAGATCACACCTGATGCCATGTACTTGTGAGAGAGGATGCAGTTTTGTTTTGGAAG CTCTCTCAGAACAAACAAGACACCTGGATTGATCAGTTAACTAAAAGTTTTCTCCCCTATTGGGTTTGAC CCACAGGTCCTGTGAAGGAGCAGAGGGATAAAAAGAGTAGAGGACATGATACATTGTACTTTTTTTTT ACCCCTAGTTCAAG UNIVERSIDADE VEIGA DE ALMEIDA Disciplina Biotecnologia 20231 O câncer de próstata é o segundo tipo de câncer mais comum nos homens do Brasil O estímulo androgênico está totalmente relacionado com o seu crescimento e sua letalidade Ou seja maiores níveis de testosterona circulantes no sangue conferem maior velocidade de progressão e agressividade do câncer Dessa forma o tratamento inicial é baseado na terapia de deprivação androgênica onde através de fármacos a produção de testosterona natural do paciente é muito reduzida Ainda assim alguns cânceres desenvolvem um estado de resistência no qual ocorre progressão de doença apesar de níveis sanguíneos baixos de testosterona o que é chamado de câncer de próstata resistente à castração Dada a relevância do tema um estudante de mestrado adotou esse tema como seu projeto de pesquisa e resolveu investigar os mecanismos responsáveis pela resistência nesses casos A primeira ideia dele foi comparar os genes do receptor androgênico das células saudáveis com as células cancerosas do mesmo paciente Para tal ele coletou células cancerosas da próstata e células do sangue para fazer um PCR 1 a Produza primers para o gene do receptor androgênico seguindo as regras para desenho de primers de forma a amplificar toda a região codificante sequência do gene do receptor androgênico no final deste arquivo R Para o desenho dos primers do gene receptor inicialmente foram removidas as regiões íntrons deixando somente os éxons Posteriormente verificouse as regiões conservadas pelo algoritmo Clustal Omega em seguida a sequência do gene disponibilizada foi inserida na plataforma Primers 3 Plus sendo demarcada a região conservadas para se obter os desenhos dos primers considerando os parâmetros primordiais para o funcionamento da reação como tamanho da molécula quantidade de citocinas e guanina e temperatura de anelamento Desenho dos Primers obtidos Primer Fw CGTACCAGAGTCGCGACTAC Primer Rv CTGCTCCTTCACAGGACCTG b Depois de realizar o PCR o estudante de mestrado revelou os resultados por eletroforese representado na imagem abaixo Interprete o resultado explicando as diferenças observadas entre as amostras O gene nas duas células tem o mesmo tamanho Apresentam a mesma quantidade R De acordo com o resultado obtidos de PCR o gene do receptor androgênico está presente tanto nas células do sangue como nas células Próstata Esse gene apresenta a mesma quantidade de pares de bases em ambas as células Pois segundo o resultado de eletroforese as duas bandas ficaram na mesma posição aproximadamente 1500bp o gene do receptor androgênico 2 Não contente o mestrando dessa vez resolve realizar um RTPCR buscando entender se há alguma perda ou mudança de informação após a transcrição do gene a Explique qual a diferença no processo entre o PCR com base no DNA e o PCR com base no RNA R No contexto informado a PCR com base em DNA informa a presenta do gene sem levar em considerações o produto gerado pela transcrição deste gene Enquanto a PCR com base no RNA verifica a expressão dos transcritos ou seja da proteína produzida pela ativação do gene alvo em questão b Desenhe os primers para a reação com o cDNA R Para o desenho de primers a partir do cDNA utilizouse a sequência disponibilizada e foi verificada no algoritmo ORF finder para obter a proteína predita A sequência da proteína foi contrastada com o banco de dados do NCBI utilizando o tblastn para recuperar a sequência do receptor Assim por meio dessa sequência desenhouse o primer pelo algoritmo Primer 3 Plus Sendo este confirmado por análise in sílico por meio do Blast Primer FW ACACGACAACAACCAGCCCG Primer Rv TCGCCAGCCCATGGCAAACA c Da mesma forma os resultados foram revelados por eletroforese representado na imagem abaixo Interprete o resultado R De acordo com os resultados obtidos o gene do receptor androgênico foi expresso nas células sanguíneas e da próstata Porém fortemente expresso na próstata uma vez que a banda está maior acentuada que a da célula sangue e desta vez apresentaram tamanhos diferentes célula sanguínea aproximadamente 1500bp e célula da próstata aproximadamente 1000 pares de base 3 O próximo passo da sua investigação é compreender o funcionamento do receptor androgênico na célula saudável comparado com a célula cancerosa O receptor androgênico quando inativo está ligado à proteína HSP90 Com a chegada da testosterona na célula a testosterona se liga ao receptor causando o desligamento da HSP90 logo ativando o receptor Uma vez ativo ele migra para o núcleo e exerce sua função influenciando na expressão gênica da célula Ou seja a chegada de testosterona desliga a HSP90 tornando o receptor androgênico ativo Para entender a atividade dos receptores o estudante isolou as células saudáveis e cancerosas em laboratório e após fornecer uma dose de testosterona decidiu medir a quantidade de HSP90 livre nas células ao longo do tempo Interprete o resultado do gel de eletroforese R De acordo com a imagem a quantidade da proteína HSP90 apresentou aumento 1h após a aplicação do tratamento com testosterona porém é reduzido no tempo de 24h em células saudáveis No entanto para células cancerígenas a expressão de HSP90 não é alterada com o tempo o que gera o bloqueio do receptor e aumento de testosterona 3 Sugira uma hipótese válida para justificar a diferença entre o resultado obtido no PCR e no RTPCR sabendo que a geração de um câncer normalmente está associada a uma mutação genética R As diferenças obtidas entre a PCR e a RTPCR devese a sensibilidade que a técnica de RTPCR possui capaz de detectar mínimas alterações seja a deleção ou adição ou substituição de uma base Assim está é a hipótese que poderia justificar os resultados obtidos Sequência genética para o receptor androgênico humano Região em vermelho éxons ACCCTCTGTTTTCCCCCACTCTCCTGCCTTCCCCCACCCCGAGTGCGGAGCCAGAGATCAAGAT GAAAAGGCAGTCAGGTCTTCAGTAGCCAAAAAACAAAACAAACAAAAACAAAAAAGCCGAAATA AAAGAAAAAGATAATAACTCAGTTCTTATTTGCACCTACTTCAGTGGACACTGAATTTGGAAGG 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