Relatório Prática Biomedicina: Eletroforese Gel Poliacrilamida e PCR

IDENTIFICAÇÃO BIOMEDICINA Disciplina BIOLOGIA MOLECULAR Período NOTURNO Semestre 20222 Carga Horária 72 horas Teórica 36 horas Prática 36 horas Professor Profa Me Mariana Andrade Aluno ROTEIRO DE AULA PRÁTICA Aula n 19 Data teórica 20102022 Data da prática B 01112022 Eletroforese Gel de poliacrilamida 1 Materiais Pipetas Ponteiras Cuba Pentes Fonte Ladder Amostra Tampao de carregamento azul de bromofenol Azul de cromassie Reagentes do gel Acrilamida Tris SDS PSA e TMED 2 Procedimento Simulação do preparo da PCR Escolher a porcentagem do gel separador Preparar os reagentes para o gel separador e para o gel concentrador Preparar a cuba por o pente e esperar polimerizar Aplicar o ladder e amostras Posicionar corretamente os fios na fonte Configurar voltagem v corrente am e forçapotência w 3 Partes do relatório Introdução Objetivo Metodologia Resultado Discussão Respostas Perguntas Qual o princípio dos ativos o SDS o Acrilamida Como explicar a migração de proteínas para o polo positivo Qual a diferença física e para aplicação entre o gel de agarose e de poliacrilamida Qual o papel da PCR para a corrida de proteínas no SDSPAGE Gel separador Gel concentrador Agua ultrapura 164 ml Agua ultrapura 238 ml Acrilamida 16 38 ml Acrilamida 5 054 ml TrisHCL pH 88 20 ml TrisHCL pH 68 044 ml SDS 10 75 microlitros SDS 10 34 microlitros PSA 10 75 microlitros PSA 10 34 microlitros Temed 3 microlitros Temed 4 microlitros CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE ILHÉUS RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA REFERENTE A DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR REAÇÃO PCR LUDMILLA SILVA TELES VIEIRA ILHÉUSBAHIA 2022 INTRODUÇÃO A reação em cadeia da polimerase PCR é uma técnica comum de laboratório usada para fazer muitas cópias de uma determinada região do DNA Essa região de DNA pode ser qualquer coisa em que o pesquisador esteja interessado Por exemplo pode ser um gene cuja função um pesquisador queira entender ou um marcador genético usado por cientistas forenses para comparar o DNA da cena do crime com suspeitos Normalmente o objetivo da PCR é produzir o suficiente da região alvo do DNA para que ela possa ser analisada ou usada de alguma outra maneira Por exemplo o DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento visualizado por eletroforese em gel ou clonado em um plasmídeo para outros experimentos A PCR é usada em muitas áreas da biologia e da medicina incluindo pesquisa em biologia molecular diagnóstico médico e até mesmo alguns ramos da ecologia OBJETIVOS GERAIS O objetivo da PCR é produzir o suficiente da região alvo do DNA para que ela possa ser analisada ou usada de alguma outra maneira ESPECÍFICOS Síntese e anelamento de fitas de DNA de interesse Amplificação de regiões específicas de DNA Visualização de regiões específicas de DNA amplificados Obtenção de uma maior quantidade de material para análises subsequentes MATERIAIS Tampão de reação dNTPsTGAC MgCl² Taq polimerase Primer forward Primer reverse Agua ultrapura DNA amostra Microtubos Ponteiras Pipetas Centrifugas de microtubos METODOLOGIA Para um volume final de 20uL os reagentes foram multiplicados de acordo com a quantidade de amostra de DNA Essas amostras foram distribuídas em microtubos correspondentes no volume de 20uL adicionouse 5uL de DNA em cada microtubo e então estes foram posicionados no termociclador Para cada amostra a mistura de reagentes continha os seguintes componentes 4uL de Tampão da reação 3uL dNTP 3uL MgCl2 1uL Taq polimerase 2uL Primer forward 2uL Primer reverse 5uL Água ultrapura 5uL DNA amostra Em seguida devese posicionar os microtubos no termoniclador e configurar de acordo com os comandos necessários RESULTADOS Durante o processo de reação em cadeia da polimerase o resultado esperado e ideal é que a porção do gene de interesse tenha sido amplificada demonstrando sucesso na utilização da metodologia a quantidade de material também deve ser adequada isso implica diretamente em uma eficiência de rendimento do experimento o que valida o procedimento utilizado e obviamente como descrito anteriormente a finalização da reação com êxito também confirma que a extração foi adequada pois o material permaneceu integro para as etapas da reação em cadeia da polimerase DISCUSSÃO As aplicações de pesquisa da tecnologia PCR são numerosas Uma lista parcial inclui clonagem genômica direta de DNA ou cDNA impressão digital genética de amostras forenses análise de variações de sequências alélicas e sequenciamento direto de nucleotídeos A PCR tem o potencial de substituir muitas técnicas convencionais de diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas na medicina clínica As aplicações de PCR para o diagnóstico de doenças infecciosas ocorreram primeiro com infecções virais para as quais a detecção precoce é particularmente importante Os resultados da PCR podem ser obtidos no prazo de um dia após o recebimento das amostras no laboratório CONCLUSÃO QUAL O PRINCÍPIO DOS SEGUINTES ATIVOS Tampão de reação A função do tampão é fornecer condições adequadas sob as quais a DNA polimerase possa funcionar adequadamente O pH do tampão cai entre 80 e 95 dNTP Os dNTPs serão a matéria prima das novas cadeias formadas durante o PCR MgCl2 O cloreto de magnésio funciona como cofator da enzima DNA polimerase podendo afetar as temperaturas de denaturação das fitas de DNA e o anelamento dos primers Taq polimerase A Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA Primer forward Um primer que vai hibridar com a cadeia de DNA molde no início iniciador 5 ou forward e no fim iniciador 3 ou reverse do fragmento de DNA a amplificar Primer reverse Um primer que vai hibridar com a cadeia de DNA molde no início iniciador 5 ou forward e no fim iniciador 3 ou reverse do fragmento de DNA a amplificar Qual a relação entre o conteúdo de bases dos primers e a temperatura de desnaturação da reação Durante a denaturação a dupla fita de DNA é separada então é neste momento que os primers que são complementares a uma sequência de DNA podem se unir a fita e iniciar o processo de anelamento e as subsequentes etapas Por que não poderia ser usada DNA polimerase de uma bactéria mesófila Porque as bactérias mesófilas não são iguais as termófilas em relação a temperatura de crescimento sendo assim sua temperatura natural não é compatível com a reação de PCR Como amplificar material genético tipo RNA de amostra viral Para vírus ou RNA propriamente dito é necessário utilizar a transcriptase reversa primeiro para que uma cadeia de DNA seja sintetizada e as etapas subsequentes possam ser desenvolvidas CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE ILHÉUS RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA REFERENTE A DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA LUDMILLA SILVA TELES VIEIRA ILHÉUSBAHIA 2022 SUMÁRIO INTRODUÇÃO 1 OBJETIVOS 2 MATERIAIS 3 METODOLOGIA 3 RESULTADOS 4 DISCUSSÃO 5 CONCLUSÃO 6 REFERÊNCIAS 8 INTRODUÇÃO A técnica de eletroforese é baseada na separação pelo movimento de partículas carregadas quando submetidas a um campo elétrico Tal movimento é influenciado por i carga ii corrente aplicada iii distância entre os eletrodos iv tamanho e formato da molécula e v tempo de corrida A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis de poliacrilamida que são produtos polimerizados de acrilamida e bisacrilamida NNmetileno bisacrilamida capaz de permitir a separação de polipeptídeos A polimerização do gel formação de ligações cruzadas entre acrilamida e bis acrilamida iniciase com a adição de persulfato de amônio PSA e TEMED NNNN Tetrametiletilenodiamina Em água o PSA dissociase NH4 e S2O82 deste modo a formação dos radicais livres sulfato induzida pela ação do TEMED catalisam o processo de polimerização das moléculas de acrilamida e bisacrilamida O SDS dodecil sulfato de sódio é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Assim a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente pela massa molecular com os polipeptídeos menores migrando mais rapidamente Após a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de corante como Coomassie Blue R250 OBJETIVOS GERAIS Colocar em prática os princípios da técnica de eletroforese de proteínas em condições desnaturantes ESPECÍFICOS Aprender a utilizar os equipamentos como cubas fontes a montagem de placas e a confecção dos géis avaliar a corrida por coloração de proteínas pelo método do Coomassie Blue MATERIAIS Pipetas Ponteiras Cuba de eletroforese Pentes Fonte para cubas de eletroforese Ladder Amostra Tampao de carregamento azul de bromofenol Azul de cromassie Reagentes do gel Acrilamida Bisacrilamida Trisbase SDS PSA e TMED METODOLOGIA Após a montagem do sistema de gel verificando a presença de vazamentos pela adição de água preparar os géis segundo tabela abaixo sem adicionar PSA e TEMED Adicionar o PA e TEMED na solução do gel de separação homogeneizar sem formar bolhas e verter no sistema de gel Após a polimerização do gel de separação colocar PSA e TEMED no gel de concentração homogeneizar e adicionar sobre o gel de separação Colocar o pente e esperar polimerizar Retirar os pentes verificando a formação dos poços Lavar os poços com água encaixar os suportes de gel e colocar o tampão de corrida nos reservatórios Aplicar o ladder e as amostras conectar os cabos dos eletrodos na fonte configurar voltagem v corrente am e forçapotência w Proceder a eletroforese até que o corante azul de bromofenol saia do gel desligar desmontar o sistema e colocar os géis na solução corante Proceder à descoloração fazendo trocas de tampão de descoloração até que o gel fique translúcido e as proteínas coradas em azul Gel separador Gel concentrador Agua ultrapura 164 ml Agua ultrapura 238 ml Acrilamida 16 38 ml Acrilamida 5 054 ml TrisHCL pH 88 20 ml TrisHCL pH 68 044 ml SDS 10 75 microlitros SDS 10 34 microlitros PSA 10 75 microlitros PSA 10 34 microlitros Temed 3 microlitros Temed 4 microlitros RESULTADOS A eletroforese junto com a coloração permitiu a identificação das bandas referentes às proteínas coradas em azul Como esperado a distância foi inversamente proporcional ao tamanho da molécula uma vez que moléculas menores se difundem melhor pelo gel de poliacrilamida Assim as bandas referentes a proteínas de maior tamanho foram identificadas no topo do gel enquanto as bandas referentes a proteínas menores foram identificadas mais próximo ao pólo positivo Tal fator foi corroborado por comparação com os pesos moleculares do ladder usado DISCUSSÃO O uso da eletroforese permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor CONCLUSÃO QUAL O PRINCÍPIO DOS SEGUINTES ATIVOS SDS O SDS é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Acrilamida Acrilamida gera géis de poliacrilamida após polimerização que permitem a separação de polipeptídeos Perguntas Como explicar a migração de proteínas para o polo positivo Por ação do SDS como desnaturante as moléculas de proteínas permanecem carregadas negativamente Quando submetidas ao campo elétrico as cargas negativas são atraídas para o pólo positivo devido à força do campo elétrico Qual a diferença física e para aplicação entre o gel de agarose e de poliacrilamida Os géis de poliacrilamida são formados por polimerização de acrilamida e bisacrilamida NNmetileno bisacrilamida A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de menor tamanho e é comumente usado na separação de polipeptídeos e proteínas Os géis de agarose são formados por polimerização da agarose componente do ágar A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de maior tamanho como ácidos nucleicos Qual o papel da PCR para a corrida de proteínas no SDSPAGE O uso da PCR permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas carregadas negativamente por ação do SDS presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor REFERÊNCIAS BARACATPEREIRA M C Bioquímica de Proteínas 1ª Edição 2014 Ed UFV LEHNINGER T M NELSON D L COX M M Princípios de Bioquímica 6ª Edição 2014 Ed Artmed Olá Obrigada por ter me escolhido para te ajudar Por favor espero sua avaliação Qualquer dúvida 32999545045 Abraço Bianca CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE ILHÉUS RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA REFERENTE A DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA LUDMILLA SILVA TELES VIEIRA ILHÉUSBAHIA 2022 SUMÁRIO INTRODUÇÃO 1 OBJETIVOS 2 MATERIAIS 3 METODOLOGIA 3 RESULTADOS 4 DISCUSSÃO 5 CONCLUSÃO 6 REFERÊNCIAS 8 INTRODUÇÃO A técnica de eletroforese é baseada na separação pelo movimento de partículas carregadas quando submetidas a um campo elétrico Tal movimento é influenciado por i carga ii corrente aplicada iii distância entre os eletrodos iv tamanho e formato da molécula e v tempo de corrida A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis de poliacrilamida que são produtos polimerizados de acrilamida e bisacrilamida NNmetileno bisacrilamida capaz de permitir a separação de polipeptídeos A polimerização do gel formação de ligações cruzadas entre acrilamida e bis acrilamida iniciase com a adição de persulfato de amônio PSA e TEMED NNNN Tetrametiletilenodiamina Em água o PSA dissociase NH4 e S2O8 2 deste modo a formação dos radicais livres sulfato induzida pela ação do TEMED catalisam o processo de polimerização das moléculas de acrilamida e bisacrilamida O SDS dodecil sulfato de sódio é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Assim a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente pela massa molecular com os polipeptídeos menores migrando mais rapidamente Após a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de corante como Coomassie Blue R250 OBJETIVOS GERAIS Colocar em prática os princípios da técnica de eletroforese de proteínas em condições desnaturantes ESPECÍFICOS Aprender a utilizar os equipamentos como cubas fontes a montagem de placas e a confecção dos géis avaliar a corrida por coloração de proteínas pelo método do Coomassie Blue MATERIAIS Pipetas Ponteiras Cuba de eletroforese Pentes Fonte para cubas de eletroforese Ladder Amostra Tampao de carregamento azul de bromofenol Azul de cromassie Reagentes do gel Acrilamida Bisacrilamida Trisbase SDS PSA e TMED METODOLOGIA Após a montagem do sistema de gel verificando a presença de vazamentos pela adição de água preparar os géis segundo tabela abaixo sem adicionar PSA e TEMED Adicionar o PA e TEMED na solução do gel de separação homogeneizar sem formar bolhas e verter no sistema de gel Após a polimerização do gel de separação colocar PSA e TEMED no gel de concentração homogeneizar e adicionar sobre o gel de separação Colocar o pente e esperar polimerizar Retirar os pentes verificando a formação dos poços Lavar os poços com água encaixar os suportes de gel e colocar o tampão de corrida nos reservatórios Aplicar o ladder e as amostras conectar os cabos dos eletrodos na fonte configurar voltagem v corrente am e forçapotência w Proceder a eletroforese até que o corante azul de bromofenol saia do gel desligar desmontar o sistema e colocar os géis na solução corante Proceder à descoloração fazendo trocas de tampão de descoloração até que o gel fique translúcido e as proteínas coradas em azul Gel separador Gel concentrador Agua ultrapura 164 ml Agua ultrapura 238 ml Acrilamida 16 38 ml Acrilamida 5 054 ml TrisHCL pH 88 20 ml TrisHCL pH 68 044 ml SDS 10 75 microlitros SDS 10 34 microlitros PSA 10 75 microlitros PSA 10 34 microlitros Temed 3 microlitros Temed 4 microlitros RESULTADOS A eletroforese junto com a coloração permitiu a identificação das bandas referentes às proteínas coradas em azul Como esperado a distância foi inversamente proporcional ao tamanho da molécula uma vez que moléculas menores se difundem melhor pelo gel de poliacrilamida Assim as bandas referentes a proteínas de maior tamanho foram identificadas no topo do gel enquanto as bandas referentes a proteínas menores foram identificadas mais próximo ao pólo positivo Tal fator foi corroborado por comparação com os pesos moleculares do ladder usado DISCUSSÃO O uso da eletroforese permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor CONCLUSÃO QUAL O PRINCÍPIO DOS SEGUINTES ATIVOS SDS O SDS é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Acrilamida Acrilamida gera géis de poliacrilamida após polimerização que permitem a separação de polipeptídeos Perguntas Como explicar a migração de proteínas para o polo positivo Por ação do SDS como desnaturante as moléculas de proteínas permanecem carregadas negativamente Quando submetidas ao campo elétrico as cargas negativas são atraídas para o pólo positivo devido à força do campo elétrico Qual a diferença física e para aplicação entre o gel de agarose e de poliacrilamida Os géis de poliacrilamida são formados por polimerização de acrilamida e bisacrilamida NNmetileno bisacrilamida A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de menor tamanho e é comumente usado na separação de polipeptídeos e proteínas Os géis de agarose são formados por polimerização da agarose componente do ágar A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de maior tamanho como ácidos nucleicos Qual o papel da PCR para a corrida de proteínas no SDSPAGE O uso da PCR permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas carregadas negativamente por ação do SDS presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor REFERÊNCIAS BARACATPEREIRA M C Bioquímica de Proteínas 1ª Edição 2014 Ed UFV LEHNINGER T M NELSON D L COX M M Princípios de Bioquímica 6ª Edição 2014 Ed Artmed