Microbiologia - Preparo de Materiais e Meios de Cultura Laboratorial

Preparo de Materiais em microbiologiaMeios de cultura usados no laboratório técnicas de semeadura e Colorações Prof a Dr Luciana Debortoli de Carvalho Preparo de materiais Meios de Cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material Agar sangue AS meio rico e não seletivo diferencial para a hemólise nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo além de fungos filamentosos bolores e leveduras exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos Meios de Cultura Ágar Thayer Martin Modificado TMM meio seletivo pela adição de colistina vancomicina e nistatina Inibe crescimento de enterobactérias Gram positivos fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N meningitidis e N gonorrhoeae Meios de Cultura Agar chocolate AC meio rico e não seletivo permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos Podese observar halos esverdeados com colônias alfa hemolíticas À base do meio é adicionado sangue de cavalo carneiro ou coelho em temperatura alta o que faz com que as hemácias lisem liberando hemina e hematina compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes Meios de Cultura ÁGAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos Gram negativos e leveduras INTERPRETAÇÃO Cor original do meio azul claro Colônias lactose positiva cor amarela Colônias lactose negativa cor azul Meios de Cultura Agar MacConkey MC meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos Lactose positiva coloração avermelhada Lactose negativa coloração inalterada Como exceção eventualmente podem crescer Enterococcus Candida e Bacillus Ágar SalmonelaShigella SS meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose coloração rósea e produção de H2S coloração negra possue componentes sais de bile verde brilhante e citrato de sódio que inibem microrganismos Gram positivos Meios de Cultura Meio de Rugai Este meio é utilizado para identificação presuntiva das principais espécies de Enterobactérias Sua finalidade principal é a triagem bioquímica de colônias isoladas nos meios seletivos para bacilos gramnegativos oxidase negativa Em um único tubo a leitura é possível verificar 9 reações motilidade da bactéria indicado pela turvação da lisina na base lisina descarboxilase fermentação da glicose em profundidade e da sacarose na superfície do meio produção de gás sulfídrico H2S gás em glicose utilização do aminoácido Ltriptofano desaminação hidrólise da uréia e no tampão do tubo um desenvolvimento de coloração avermelhada que indica a formação de indol Leitura e interpretação FASE SUPERIOR Meio de Rugai cor original azulesverdeada Ápice azul sacarose negativa LTD negativo amarelo sacarose positiva LTD negativo verde garrafa sacarose negativa LTD positivo castanho sacarose positiva LTD positivo LTD LTriptofano desaminase Base amarela ácido de glicose positiva Fermentação da glicose azul uréia positiva Hidrólise da uréia preto H2S positivo Produção de gás sulfídrico amarelo com bolhas ácido de glicose e gás Produção de gás FASE INFERIOR Meio de Lisina Motilidade cor original púrpura violeta ou malterado lisina descarboxilase positivo amarelo lisina descarboxilase negativa com turvação motilidade positiva móvel qualquer crescimento além da picada sem turvação motilidade negativa se observa nitidamente a picada ao crescimento TESTE NA ROLHA ou TAMPÃO Adicionar uma gota do reativo de Kovacs no papel de filtro existente na parte interna da tampa no momento da leitura após incubação vermelho indol positivo ausência de cor ou amarelo indol negativo Meio IAL Pessoa e Silva Identificação presuntiva Aspecto bioquímico presumtivo enterobactérias mais comuns Fase Rolha Ápice Superior Inferior Provas indol LTD Sacarose Uréia H2S Glicose Gás Lisina Motilidade Escherichia coli d Klebsiella Enterobacter Citrobacter d Shigella Proteus Morganella morganii Providencia d Salmonella Serratia LÖWENSTEIN JENSEN A base do meio é constituída por ovos integrais o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina que é positivo para Mycobacterium tuberculosis INTERPRETAÇÃO Cor original do meio verde claro Positivo Crescimento de colônias amarelas Negativo ausência de crescimento TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Isolamento de um microrganismo O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura colônias isoladas de um único microrganismo separandoo de outros que se encontram no mesmo material Finalidades do isolamento Identificação de um microrganismo A simples observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos microrganismos Para isto lançamos mão da análise de uma série de características destes como características bioquímicas sorológicas de patogenicidade etc O estudo destas características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar Semeadura Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura a partir de um material contaminado qualquer Repique Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro TÉCNICAS DE SEMEADURA Métodos de Isolamento e Identificação A identificação da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrição de suas características morfológicas fisiológicas bioquímicas e antigênicas Desde que na maioria dos casos o organismo a ser isolado faz parte de uma população mista é indispensável o seu isolamento no sentido de obtenção de cultura pura Métodos de Inoculação 1 Semeadura em Meio Sólidos 11 Semeadura em Tubos de Ensaio em meios inclinados Esgotamento de alça 111 Técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano eou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria A semeadura é geralmente feita da base do meio para a extremidade do mesmo pode também ser chamada de estriamento Figura 1 Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica do esgotamento Ex meio de cultura TSI Métodos de Inoculação 112 A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio de forma uniforme Esta técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano bem como poderemos utilizála para observar funções metabólicas de algumas bactérias Figura 2 Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica supracitada Ex meio de cultura Citrato de Simmons Métodos de Inoculação 113 Em Picada Esta técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos bactérias que são submetidas a análise microbiológica Figura 3 Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a técnica em picada No tubo à esquerda observamos o momento da picada que é realizada com o auxílio de uma agulha de semeadura e à direita observamos a picada propriamente dita Ex meio de cultura SIM Métodos de Inoculação 12 Semeadura em Placas de Petri em superfície O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o isolamento deve ser leve Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos Quanto maior o número menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido inóculo pesado este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada Métodos de Inoculação Figura 4 Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a técnica de estrias múltiplas onde a alça deverá ser deslizada sobre a região onde há um inóculo bacteriano e logo depois deve ser passada na superfície da placa para semeadura com movimentos em ZIGZAG visando o isolamento bacteriano 121 Estrias Múltiplas para Isolamento Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material de modo a obterse um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra Quando o material é muito denso a alça deverá ser flambada Métodos de Inoculação 122 Alternativamente para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano ou colônias isoladas após diluição utilizase o método de espalhamento em placa Consiste em espalhar o material suspensão bacteriana na maioria das vezes com o auxílio de um swab para obtenção de tapete uniforme ou alça de Drigalski para obtenção de colônias isoladas após diluição fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nesta técnica Devese ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada evitando regiões sem semeadura Recomendase que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas com a alça em toda a superfície rodando a placa Alça de drigalski Técnica para semeadura em superfície meios sólidos O inóculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluição da cultura em meio sólido é feito da seguinte maneira Retiramos o inóculo do tubo com a alça já flambada e fria Abrimos a placa de modo que a tampa forme um chapéu com a placa Colocamos o inóculo junto a parte superior da placa espalhandoo a seguir através de estriamento que poderá ser contínuo ou descontínuo O estriamento poderá se feito de maneiras variadas tomandose sempre o cuidado de nunca passar a alça duas vezes no mesmo local O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na alça Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local promovemos o recarregamento do local deixando ali mais bactérias o que dificultará o seu perfeito isolamento Durante o estriamento após termos semeado metade da placa deveremos cessar o mesmo A seguir flambamos a alça esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente carregando a alça na última estria que realizamos Depois de terminado o estriamento fechar a placa e identificar levando a a seguir para incubação na estufa com a tampa voltada para baixo Flambar a alça utilizada esperar esfriar e guardar no suporte apropriado Técnica para semeadura em meios líquidos Segurar a alça com a mão direita flambar primeiro na chama azul depois na amarela Esperar esfriar a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado que deverá estar na mão esquerda utilizandose o dedo mínimo da mão direita A ROLHA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO Flambar a boca do tubo e retirar o inóculo com a alça fria Flambar novamente a boca do tubo e fechar Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura retirar a rolha e flambar Semear o material flambar a boca do tubo e fechar Esterilizar a alça identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa Técnica para semeadura em meios semisólidos Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquido com o auxílio de uma alça em agulha já flambada e fria Abrir o tubo que contém o meio semisólido e semear o microrganismo através de picada até mais ou menos 13 ou ½ do tubo Fechar o tubo identificar e levar para incubação Flambar a agulha deixar esfriar e colocar no suporte adequado Coloração de GRAM Alça Bactérias isolada Esfregaço Fixação do esfregaço pelo calor Passar a lamina c esfregaço por 3x sob a chama Proceder a coloração de GRAM 1 Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min 2 Escorrer excesso do corante e lavar 3Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min 4 Escorrer excesso do corante e lavar 5Cobrir lamina com Eteracetona e deixar por 30s 6 Escorrer excesso do corante e lavar 7Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s 8 Escorrer excesso do corante lavar e deixar secar Técnica de GRAM Fucsina Coloração de ZiehlNeelsen Meio de cultura para Micobactérias Colônias de Micobactérias Esfregaço Fixação do esfregaço pelo calor Passar a lamina c esfregaço por 3x sob a chama Usar capela de fluxo laminar Proceder a coloração de ZiehlNeelsen a Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl Aquecer até a emissão de vapores Não deixar o corante secar Esperar 5 minutos b Lavar com água corrente c Descorar com álcool 97 ácido clorídrico 1 d Lavar em água corrente e Corar com azul de metileno por 1 minuto f Lavar e secar g Observar ao microscópio as lâminas coradas h Como se apresentam os BAAR Resultado