Avaliação da Qualidade Microbiológica de Carne Moída Bovina nos Supermercados de Brasília e Taguatinga

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE CEILÂNDIA CURSO DE FARMÁCIA LARYSSA DE CASTRO MANFRIN AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE CARNE MOÍDA BOVINA COMERCIALIZADA NOS SUPERMERCADOS DAS CIDADES DE BRASÍLIA E TAGUATINGA DF BRASÍLIA DF 2013 1 LARYSSA DE CASTRO MANFRIN AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE CARNE MOÍDA BOVINA COMERCIALIZADA NOS SUPERMERCADOS DAS CIDADES DE BRASÍLIA E TAGUATINGA DF Orientador Profa Dra Daniela Castilho Orsi Coorientador Profa Dra Izabel Cristina Rodrigues da Silva BRASÍLIA DF 2013 Monografia de Conclusão de Curso apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Farmacêutico na Universidade de Brasília Faculdade de Ceilândia 2 LARYSSA DE CASTRO MANFRIN AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE CARNE MOÍDA BOVINA COMERCIALIZADA NOS SUPERMERCADOS DAS CIDADES DE BRASÍLIA E TAGUATINGA DF BANCA EXAMINADORA Orientador Profa Dra Daniela Castilho Orsi FCE Universidade de Brasília Coorientador Profa Dra Izabel Cristina Rodrigues da Silva FCE Universidade de Brasília Prof Dra Eliana Fortes Gris FCE Universidade de Brasília Prof Dra Lívia Cristina Lira de Sá Barreto FCE Universidade de Brasília BRASÍLIA DF 2013 3 RESUMO Fatores como o excesso de manipulação e a utilização de equipamentos e utensílios com higienização deficiente fazem com que a carne moída se contamine facilmente tornandose um produto problemático frequentemente envolvido nos surtos de doenças transmitidas por alimentos Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a qualidade microbiológica da carne moída Foram coletadas 18 amostras de carne moída bovina embaladas em bandejas de isopor expostas ao consumo em 6 diferentes supermercados das cidades de Brasília e Taguatinga no período de três semanas consecutivas entre os meses de Julho e Agosto de 2013 De acordo com a legislação argentina que padroniza os limites de microorganismos mesófilos no produto nenhuma amostra se apresentou imprópria para o consumo Constatouse que das 18 amostras de carne moída bovina analisadas somente as amostras correspondentes à terceira semana de coleta de todos os supermercados mostraram contagens altas de bactérias psicrotróficas entre 106 e 107 UFCg 12 amostras 6667 apresentaram cepas de S aureus indicando condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente 3 delas 1666 apresentaram contagens de coliformes totais superiores a 1x 103 NMPg e 1 555 para comtagem de coliformes termotolerantes Apenas 1 amostra 555 foi condenada para consumo devido a presença de Salmonella spp em 25g de amostra Todas as amostras positivas nos testes microbiológicos para Salmonella e S aureus foram comprovadas por método molecular através da técnica de PCR Palavras chave carne moída bovina análises microbiológicas qualidade fontes de contaminação 4 ABSTRACT Factors such as excessive manipulation and use of equipment and utensils with poor hygiene make minced beef be contamined easily making it a problematic product often involved in outbreaks of foodborne illness This work was designed to assess the microbiological quality of ground beef We collected 18 samples of ground beef packaged in trays and exposed to consumption in six different supermarkets in the cities of Brasilia and Taguatinga in three consecutive weeks between July and August 2013 According to an Argentine law that standardizes the limits of mesophilic microorganisms in the product no sample was improper for consumption We found out that from the 18 ground beef samples analyzed only the samples corresponding to the third week of collecting all supermarkets showed high levels of psychrotrophic bacteria between 106 and 107 CFU g 12 samples 6667 showed strains of S aureus indicating improper hygienic conditions andor poor processing 3 of them 1666 had total coliform counts greater than 1x 103 MPN g and 1 555 fecal coliform Only 1 sample 555 was ordered for consumption due to the presence of Salmonella in a sample of 25g All samples positives for Salmonella spp and S aureus during microbiologocal testing were confirmed by molecular methods in PCR Keywords ground beef microbiological analysis quality sources of contaminants 5 SUMÁRIO RESUMO 3 ABSTRACT SUMÁRIO 4 5 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 7 LISTA DE TABELAS 8 LISTA DE FIGURAS 9 LISTA DE ANEXOS 9 1 INTRODUÇÃO COM REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 10 11 A carne bovina e seu consumo no Brasil 10 12 Fatores que afetam a qualidade da carne 11 13 Avaliação microbiológica da carne moída 13 14 A carne moída contaminação e microorganismos patogênicos 16 15 Biologia molecular aplicada ao processamento de carnes 18 2 OBJETIVOS 21 21 Objetivo geral 21 22 Objetivos específicos 21 3 JUSTIFICATIVA 22 4 MATERIAIS E MÉTODOS 23 41 Coleta e preparo das amostras para as análises microbiológicas 23 6 42 Análises microbiológicas 23 43 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas 23 44 Determinação do número mais provável NMP de coliformes totais e de coliformes termotolerantes 24 45 Contagem de Staphylococcus spp 27 46 Pesquisa de Salmonella spp 28 47 Análises moleculares 29 471 Extração de DNA 30 48 Oligonucleotídeos utilizados e PCR qualitativo 30 481 Desenho dos oligonucleotídeos para a PCR 30 482 PCR qualitativo 32 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 51 Coleta das amostras 33 52 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas 34 53 Contagem de Staphylococcus spp e de Staphylococcus aureus 39 54 Determinação do número mais provável NMP de coliformes totais e de coliformes termotolerantes 42 55 Pesquisa de Salmonella spp 44 56 Análise molecular 47 6 CONCLUSÕES 48 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49 7 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS E coli Escherichia coli g grama NMPg Número mais provável por grama µl microlitros mg miligramas min minutos mL mililitros mm milímetros pH potencial hidrogeniônico S aureus Staphylococcus aureus UFCg Unidade Formadora de Colônia por grama 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Número mais provável por grama NMPg para 3 tubos com os inóculos de 01 001 e 0001 ml e os respectivos intervalos de confiança a 95 26 Tabela 2 Distribuição dos limites mínimos e máximos para a construção dos oligonucleotídeos 31 Tabela 3 Características dos oligonucleotídios utilizados neste estudo 31 Tabela 4 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída bovina 37 Tabela 5 Contagem de bactérias Staphylococcus spp e de bactérias Staphylococcus aureus nas amostras de carne moída bovina 40 Tabela 6 Determinação do número mais provável NMPg de coliformes totais e de coliformes termotolerantes nas amostras de carne moída bovina 43 Tabela 7 Resultado de pesquisa de Salmonella spp nas amostras de carne moída 45 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Reações bioquímicas das diferentes espécies de bactérias no Agar TSI Fonte ASM microbelibraryorg 29 Figura 2 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas nas amostras de carne moída bovina Nota 100E03 significa 10 x 103 UFCg 35 Figura 3 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída na primeira e na segunda semana de coleta dos supermercados Nota 100E03 significa 10 x 103 UFCg 38 Figura 4 Contagem de bactérias Staphylococcus spp de nas amostras de carne moída na primeira segunda e terceira semana de coleta dos supermercados 42 Figura 5 Resultado das colônias puras suspeitas de serem Salmonella spp no Ágar TSI 46 Figura 6 PCR para detecção dos genes femA e inv No gel n 1 foi utililizado o par de oligos LaryfemAF e LaryfemAR e no gel n 2 LaryinvAF e LaryinvAR M marcador de 100pb 47 LISTA DE ANEXOS Anexo 1 Seleção dos oligonucleotídeos utilizados no estudo com uso do BLAST 56 1 INTRODUÇÃO COM REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 11 A CARNE BOVINA E SEU CONSUMO NO BRASIL Carne pode ser definida como qualquer tecido animal utilizável como alimento sendo classificada em carne vermelha de ave de pescado e de caça As carnes podem ser adquiridas como produtos frescos congelados embalados a vácuo secos salgados defumados e enlatados CARDOSO ARAÚJO 2003 O Regulamento da Inspeção Sanitária dos Produtos de Origem Animal RIISPOA BRASIL 1997 descreve carnes como massas musculares maturadas e demais tecidos que as acompanham incluindo ou não a base óssea correspondente procedentes de animais abatidos sob inspeção veterinária O Brasil ocupa atualmente a posição de maior produtor e maior exportador mundial de carne bovina tendo um rebanho de 176610943 cabeças e produção de 1700 mil toneladas equivalentecarcaça destinada à exportação e apresentando ainda consumo per capita interno de 387 kgpessoaano ARAÚJO et al 2012 Segundo o Ministério da Agricultura BRASIL 2013 a expectativa é que até 2020 a produção nacional de carnes suprirá até 445 do mercado mundial Entretanto a qualidade da carne produzida é o principal fator que visa garantir o sucesso das futuras exportações Dessa forma a carne é um alimento de amplo consumo em todo o país e está presente mesmo que em quantidade qualidade e modo de preparo diferenciado na dieta da grande maioria da população FERREIRA SIMM 2012 Dentre as características de qualidade da carne bovina a maciez assume posição de destaque sendo considerada como a característica organoléptica de maior influência na aceitação da carne por parte dos consumidores ALVES et al 2005 A carne é uma importante fonte de proteínas essenciais para o organismo além de se apresentar como um alimento rico em vitaminas do complexo B minerais e ferro sendo facilmente digerida e quando cozida a carne fornece nutrientes que contribuem significativamente para um equilíbrio dietético das refeições daí sua importância SANTO 2006 11 Em nosso país a carne bovina tratase de um produto altamente versátil podendo ser encontrada em diferentes cortes e apresentações incluindo o seu emprego em inúmeros derivados cárneos À sua condição de transportadora de proteínas de excelente qualidade somamse as características organolépticas agradáveis e quando se comparam seus custos no mercado consumidor levando em conta seu aporte proteico e calórico com os de outros alimentos de hierarquia inferior revelase um alimento ainda mais barato em nosso país SALINAS 2002 Na forma de carne moída tornase popular sendo acessível à faixa da população com menor poder aquisitivo MOTTA BELMONTE PANETTA MOTTA 2000 De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade BRASIL 2003 a carne moída é o produto cárneo obtido a partir da moagem de massas musculares de carcaças de bovinos seguida de imediato resfriamento ou congelamento Tratase de um produto cru obtido a partir da moagem de massas musculares esqueléticas sendo proibido o uso de tecidos inferiores como ossos cartilagens gordura parcial aponevroses tendões coágulos e nodos linfáticos Também não é permitido utilizar na sua elaboração matéria prima oriunda de raspa de ossos e carne mecanicamente separada BRASIL 2003 Podendo ser utilizada de maneira prática e variada a carne moída bovina constituise uma importante forma de comercialização de carne no varejo destacandose como uma excelente fonte de proteína de boa qualidade e por ser acessível à população de baixo poder aquisitivo SILVA SOUZA SOUZA 2004 12 FATORES QUE AFETAM A QUALIDADE DA CARNE A qualidade pode ser definida como um conjunto de características que irão influir na aceitabilidade de um alimento Os órgãos do sentido são bastante utilizados para sua escolha na maioria das vezes o consumidor o faz tendo em vista respectivamente o preço a aparência o sabor e o valor nutritivo GAVA SILVA FRIAS 2008 A qualidade final da carne resulta do que aconteceu com o animal durante toda a cadeia produtiva Devemse assegurar procedimentos adequados de 12 transporte abate armazenamento manipulação exposição e preparo da carne ALVES et al 2005 Os fatores extrínsecos como a espécie sexo raça alimentação e manejo assim como os fatores intrínsecos características estruturais pH atividade de água condições de armazenamento e processos post mortem levam a diferenças na qualidade final da carne A conversão do músculo em carne ocorre a partir das fases de prérigor mortis rigor mortis e pósrigor mortis resultado de diferentes graus de degradação enzimática e desnaturação de proteínas que podem resultar em marcantes variações nas propriedades da carne como a capacidade de retenção de água cor e firmeza da carne fresca maciez sabor e suculência da carne preparada para consumo e capacidade de emulsificação das matérias primas rendimentos de processo e cor dos produtos processados COUTINHO 2004 Portanto as práticas pósabate dos animais se concretizam com uma sequência de processos enzimáticos no músculo postmortem que levam a formação de ácido lático queda de pH e diminuição da quantidade de ATP devido a interrupção da circulação sanguínea Nesse momento o fenômeno do rigor mortis também chamado de rigidez cadavérica é iniciado sendo considerado como uma contração muscular irreversível caracterizada pela inextensibilidade e rigidez do músculo ALVES et al 2005 Na etapa de maturaçãopósrigor as enzimas proteolíticas da carne denominadas catepsinas decompõem as proteínas promovendo o amaciamento postmortem responsável pela textura da carne Caso essa decomposição parcial das proteínas denominada maturação da carne tenha continuidade ocorrerá à produção de significativas quantidades de amônia tornando a carne deteriorada e imprópria para o consumo desse modo a maturação da carne é considerada um processo determinante no qual se devem tomar cuidados especiais para não afetar a qualidade do produto final MENDES et al 2001 Em nosso país a maturação é feita em câmaras de 15ºC e umidade relativa de 80 a 85 com duração entre 24 e 48 horas com uma perda de aproximadamente 2 de água A carne resfriada a temperatura muito abaixo do desejável sofrerá encurtamento da fibra muscular promovendo o seu enrijecimento Uma das formas de se evitar este encurtamento e garantir a maior segurança 13 microbiológica é o resfriamento de maneira rápida a temperaturas inferiores a 10C entre 8 a 15 horas após o abate SANTO 2006 O transporte da carne bovina até o mercado varejista deve ser realizado em caminhões com sistema de refrigeração evitando que a temperatura ultrapasse os 7ºC mantendose numa faixa de 2C a 4C O resfriamento da carne bovina e o transporte da mesma são considerados pontos críticos de controle sendo que o resfriamento adequado inibe a multiplicação de microorganismos mas não garante que a carne esteja com qualidade para o consumo LUNDGREN et al 2009 A Portaria de nº 30496 do Ministério da Agricultura instituiu um programa de distribuição de carnes bovinas ao comércio varejista envolvendo a padronização de cortes embalagem rotulagem e distribuição dos produtos com o propósito de reduzir e dificultar a ação do comércio clandestino porém infelizmente grande parte dos mercados e açougues espalhados pelo Brasil não seguem as regulamentações da referida portaria colocando em risco a qualidade da carne distribuída ao consumidor e por consequência a saúde da população CONCEIÇÃO FARIA GÂNDARA 2003 MENDES et al 2001 13 AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DA CARNE MOÍDA A alimentação é uma das condições básicas para promoção e manutenção da saúde desde que a produção e a manipulação dos alimentos se deem dentro de padrões higiênicosanitários satisfatórios MACHADO 2009 Devido à sua variada composição nutricional elevada atividade de água pH próximo da neutralidade dentre outros fatores a carne é um excelente meio para a proliferação de microorganismos que quando não são bem controlados podem causar tanto prejuízos de ordem econômica quanto à saúde do consumidor FERREIRA SIMM 2012 O músculo do animal vivo é estéril porém a partir do abate e do processamento iniciase a sua contaminação por microorganismos procedentes da faca de sangria do couro do trato intestinal dos manipuladores do meio ambiente dos recipientes equipamentos e utensílios Logo a contaminação da carne por 14 microorganismos poderá colocar em risco a saúde do consumidor afetar a qualidade da carne e o seu tempo de conservação CHESCA et al 2001 Quando carnes frescas são examinadas em nível de varejo diversos tipos e quantidades diferentes de microorganismos são encontrados Carnes moídas comercializadas originárias de vários cortes e manipuladas excessivamente contêm altos níveis de contaminação microbiana A carne moída tem uma grande superfície de contato o que contribui em parte para o aumento da flora microbiana Essa maior superfície favorece o crescimento de bactérias aeróbias que frequentemente causam deterioração em baixas temperaturas JAMES 2005 A carne pode ser contaminada por bactérias como a Escherichia coli Salmonella Shigella Proteus Enterococcus Moraxella Acinetobacter Staphylococcus Lactobacillus Clostridium Pseudomonas Campylobacter Yersínia Listeria leveduras e mofos Muitos destes microorganismos podem causar doenças e problemas à saúde pública acarretando desde um simples desconforto intestinal até mesmo a morte GERMANO GERMANO 2003 No caso da contaminação por bactérias saprófitas há diminuição da vida útil do produto gerando perdas econômicas FERREIRA 2008 No caso da carne moída a moagem é um fator adicional que pode favorecer a contaminação e a multiplicação de microorganismos Os fatores que mais colaboram com a contaminação do produto são o uso de equipamentos e instalações mal higienizados bancadas sujas presença de bactérias no moedor pela falta de limpeza ou os próprios manipuladores que pela falta de informação ou negligência acabam por transmitir bactérias à carne moída ALMEIDA GONÇALVES FRANCO 2002 OLIVEIRA NASCIMENTO FIORINI 2002 Os manipuladores representam um dos principais veículos de contaminação da carne uma vez que sua participação chega a atingir até 26 dos surtos de toxinfecção alimentar Desse modo medidas preventivas devem estar relacionadas à higiene pessoal na manipulação ao adequado preparo e armazenamento de alimentos ANDRADE BRABES 2003 Entretanto no Brasil os trabalhadores do setor de carnes possuem baixos níveis social e cultural Este quadro exige grande atenção e dedicação a esses profissionais para que os hábitos mais elementares de higiene sejam obedecidos uma vez que a higiene é fundamental para garantir a boa qualidade dos produtos A 15 utilização de equipamentos de proteção individual EPIs por parte dos trabalhadores que manipulam produtos de origem animal deve ter um caráter contínuo enfatizando a necessidade da higiene e saúde dos manipuladores de alimentos Esta educação deve salientar a importância da boa qualidade das matérias primas a higiene das instalações utensílios moedores e dos métodos de preparo da carne moída ABRAHÃO NOGUEIRA MALLUCELI 2005 A literatura relata pesquisas que obtiveram resultados preocupantes quanto ao nível de contaminação das carnes dos equipamentos utensílios e manipuladores assim como pela adoção de práticas inadequadas de manipulação de alimentos ALMEIDA 2010 Em alguns estabelecimentos comerciais o moedor de carne as facas destinadas ao corte e os utensílios do estoque raramente são limpos com o cuidado e a frequência necessários para prevenir o aumento do número de microorganismos JAMES 2005 A higienização dos equipamentos e utensílios deve se proceder de forma rigorosa para não se transformarem em potenciais riscos devido às dificuldades apresentadas no decorrer do processo de higienização pelo acúmulo de matéria orgânica que acaba levando à formação de biofilme MACHADO et al 2004 A maneira mais eficiente de reduzir a contaminação e crescimento microbiano em carne é estabelecer programas de controle de qualidade como Boas Práticas de Fabricação BPF e Análise de Perigos de Pontos Críticos de Controle APPCC que podem ser realizadas buscando microorganismos indicadores que preveem a presença de patógenos e bactérias que causam a deterioração BARROS NERO MONTEIRO 2007 Os microorganismos indicadores são aqueles que quando presentes nos alimentos podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento produção ou armazenamento FRANCO LANDGRAF 2004 A pesquisa dos microorganismos em alimentos pode ser realizada por métodos tradicionais para sua enumeração objetivando especificar determinados grupos ou espécies microbianas e normalmente são concluídos num período médio de sete dias 16 Embora a legislação brasileira BRASIL 2001 não estabeleça limites de tolerância para o grupo de microorganismos psicrotróficos e mesófilos populações elevadas desse grupo representam qualidade higiênica sanitária deficiente devido a má qualidade da matériaprima aliada a tempo e temperatura de estocagem inadequada Quando populações mesofílicas e psicrotróficas ultrapassam 106 UFCg a vida de prateleira deste produto tornase comprometida SILVA GANDRA 2001 Ademais a legislação Brasileira vigente preconiza análises microbiológicas nos produtos cárneos a fim de avaliar as condições higiênicosanitárias desses produtos e a possível presença de microorganismos patogênicos através da Resolução da Diretoria Colegiada RDC nº 12 de 02012001 da Agência nacional de Vigilância Sanitária BRASIL 2001 14 A CARNE MOÍDA CONTAMINAÇÃO E MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS As doenças transmitidas por alimentos DTAs são causadas por agentes biológicos bactérias fungos vírus parasitas e toxinas produzidas por estes os quais penetram no organismo humano através da ingestão de água ou alimentos contaminados Os alimentos contaminados podem se apresentar aparentemente inofensivos apresentando odor e sabor normais dificultando por parte do consumidor identificar qual alimento poderia estar contaminado em suas últimas refeições Sendo assim tornase difícil rastrear os alimentos responsáveis pelas toxinfecções ocorridas FORSYTHE 2000 A maioria dos surtos de toxinfecções é decorrente do consumo de alimentos especialmente os crus e os produtos cárneos A carne moída em particular apresenta altos níveis de contaminação microbiana em relação aos outros cortes por sofrer maior manipulação e possuir maior relação áreavolume Por ser muito usada em diversas preparações culinárias como recheios de sanduíches de tortas de salgadinhos e como complemento de diversos pratos a carne moída está mais susceptível a carrear microorganismos deteriorantes e patogênicos para os 17 alimentos manipulados com falhas de processamento COSTA et al 2008 SOUSA et al 2012 Visando a segurança dos alimentos os parâmetros microbiológicos adotados pela resolução RDC n 12 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária de 12 de janeiro de 2001 BRASIL 2001 para a carne moída bovina compreendem a contagem de coliformes termotolerantes de Staphylococcus coagulase positivo e a pesquisa de Salmonella em 25 g de amostra Os coliformes termotolerantes ou coliformes fecais constituem um grupo de enterobactérias capazes de fermentar a lactose a 45ºC com produção de gás e ácido se tratam de bastonetes gramnegativos e anaeróbios facultativos Tais micro organismos são frequentemente encontrados no solo água contaminada e trato intestinal de humanos e outros animais Altas contagens de coliformes termotolerantes indicam falhas higiênicas ao longo do processamento e possibilidade da presença de microorganismos patogênicos FRANCO LANDGRAF 2004 A bactéria Escherichia coli é a principal representante dos coliformes a 45C ou seja 90 dos coliformes termotolerantes são E coli GUZMÁN et al 2004 FRANCO LANDGRAF 2004 Dentre os agentes bacterianos aqueles que estão relacionados e implicados com o maior número de surtos são Staphylococcus aureus e Salmonella sp Muitos casos de enfermidades transmitidas por alimentos não são notificados pois seus sintomas são geralmente parecidos com gripes ou discretas diarreias e vômitos Dentre os sinais e sintomas mais comuns temse dor de estômago náuseas vômitos diarreia e febre por período prolongado AMSON HARACEMIV MASSON 2006 O Staphylococcus aureus produz muitos fatores de virulência como as enterotoxinas que possuem termoestabilidade a 100ºC por 30 minutos e resistência a ação das enzimas gástricas A intoxicação alimentar por estafilococos é a doença adquirida por alimentos mais comum sendo considerada uma intoxicação e não uma infecção A doença é causada pela toxina bacteriana presente no alimento resultante de sua contaminação por um portador humano uma vez que aproximadamente metade das infecções se origina de portadores com contaminação assintomática na nasofaringe através de um espirro ou mãos contaminadas Após a ingestão do alimento contaminado o surgimento da doença é abrupto e rápido 18 com presença de vômitos severos diarreia e dores abdominais MURRAY et al 2006 O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae são bacilos gramnegativos e bioquimicamente são em geral lactose e sacarose negativas mas fermentam a glicose com produção de gás O principal habitat das salmonelas é o trato intestinal de aves répteis e seres humanos Geralmente os alimentos são contaminados pelo contato com águas poluídas e direta ou indiretamente pelas fezes dos animais GUIMARÃES et al 2001 FRANCO LANDGRAF 2004 A legislação brasileira impõe ausência de Salmonella sp para qualquer amostra de alimento estudada Segundo a ANVISA BRASIL 2001 o resultado da determinação de Salmonella sp deve ser expresso como Presença ou Ausência na alíquota analisada A maioria dos microorganismos cuja patogenicidade no homem depende da sua presença sob a forma viável nos alimentos são relativamente sensíveis às altas temperaturas e por isso são perfeitamente destruídos pela cocção adequada dos alimentos eventualmente contaminados ou pelos processos de pasteurização Encontramse neste caso as infecções causadas por bactérias não esporuladas em particular pelas espécies do gênero Salmonella Brucella Escherichia ou o próprio agente da tuberculose que podem ser perfeitamente destruídas pela pasteurização GERMANO e GERMANO 2003 Desta forma os consumidores devem ser esclarecidos do risco de adquirir alimentos de origem desconhecida recebendo informações preventivas e educativas que evitem as toxinfecções e que possibilitem a identificação de alimentos suspeitos ou de má qualidade 15 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AO PROCESSAMENTO DE CARNES As técnicas tradicionais de análise microbiológicas de alimentos baseiamse no emprego de testes morfológicos e bioquímicos para tipagem subtipagem e identificação de gêneros espécies e subespécies microbianas As técnicas 19 microbiológicas mais comumente utilizadas são realizadas em meios de cultura não seletivos e seletivos complementadas por testes bioquímicos diferenciais na sua maioria de produção enzimática usados em conjunto com testes sorológicos Os resultados de testes bioquímicos podem apresentar variabilidade pela ação de fatores ambientais sobre a expressão gênica entre outras dificuldades tais como o baixo poder discriminatório em microorganismos com pouca variabilidade genética e o risco de interpretações inadequadas quando se utiliza um número limitado de testes DOWNES ITO 2001 Por outro lado a utilização de uma bateria de determinações microbiológicas determina uma análise cara e dispendiosa pois podem requerer dias para análises dos resultados obtidos JUSTE THOMMA LIEVENS 2008 Nas últimas décadas verificouse o incremento de técnicas moleculares para a detecção identificação e caracterização de bactérias patogênicas em alimentos Técnicas genotípicas referemse à caracterização do DNA cromossômico plasmidial ou total de um microorganismo que são caracterizadas pelo rápido resultado e pela estabilidade da molécula de DNA POSTOLLEC et al 2011 As técnicas moleculares têm aplicação direta na detecção e caracterização de bactérias patogênicas em alimentos Dentre essas destacamse as de amplificação de sequências do DNA pela reação em cadeia da polimerase Polymerase Chain Reaction PCR JOSEFSEN et al 2003 A reação em cadeia da polimerase PCR é uma técnica altamente sensível na qual pequenas quantidades de sequências de DNA ou RNA específicas podem ser enzimaticamente amplificadas pela enzima Taq polimerase enzima derivada da bactéria termofílica Thermus aquaticus até que sejam obtidas por estratégia de clonagem in vitro milhões de cópias da sequência alvo Por isso a PCR tornouse a técnica de biologia molecular mais utilizada em diagnóstico microbiológico MALORNY et al 2003 Ensaios com PCR têm sido desenvolvidos para detecção simultânea de Salmonella spp em carne de porco bovina e de ave verificando um limite de detecção de uma unidade formadora de colônia por grama de carne 1 UFC g1 HYEON et al 2011 A caracterização molecular de um dos genes de invasão de Salmonella um componente essencial para a patogênese da doença revelou a presença do lócus 20 genético denominado inv como o primeiro de um operon de genes arranjados na mesma unidade transcricional que codificaria proteínas relacionadas com invasão celular Os grupos de genes inv denominados A B C D e E estão presentes na maioria das salmonelas e ausentes na região correspondente de E coli sendo considerados capazes para distinguir entre Salmonella e outras espécies bacterianas por meio de PCR CHEN GRIFFITHS 2001 Pesquisadores já analisaram molecularmente o locus inv em amostras de carne para detecção de Salmonella Um método de PCR multiplex foi desenvolvida para a detecção simultânea de Salmonella spp região inv A Listeria monocytogenes e Escherichia coli O157H7 em amostras de carne A sensibilidade de detecção de DNA por este método foi de 103 UFCmL para cada agente patogênico Neste estudo também foi digno de nota a excelente concordância para os resultados de multiplex PCR e o método de cultura convencional o que sugere que o multiplex PCR é um método confiável e útil para a detecção rápida contaminação de carne com Salmonella spp Listeria monocytogenes e E coli O157H7 KAWASAKI et al 2005 Experimentos delineados para a detecção e identificação de S aureus presente em carnes utilizando PCR também estão descritos na literatura Uma PCR múltipla permitiu uma identificação rápida de 19 genes que codificam enterotoxinas em carnes de porco e galinha na Coréia HWANG et al 2007 Por outro lado alguns genes presentes em estafilococos denominados genes auxiliares ou fatores essenciais gene fem factor essential for methicilin resistance auxiliam outro gen o mecA a expressar um alto nível de resistência aos beta lactâmicos Foram identificados muitos desses genes fem denominados femA femB femC femD femE e femF O gene femA é essencial para a expressão da resistência dos estafilococos resistentes à meticilina MRSA e parece diferenciar S aureus de outras espécies de estafilococos Os genes femA e mecA têm sido detectados em cepas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilinaoxacilina por meio de técnicas moleculares como a reação de polimerase em cadeia PCR sendo que a ocorrência de S aureus medida pela PCR do gene femA também já foi descrita em análises de queijos e produtos cárneos PELISSER et al 2009 21 2 OBJETIVOS 21 OBJETIVO GERAL Avaliar a qualidade microbiológica da carne moída bovina comercializada nos mercados varejistas das cidades de Brasília e Taguatinga DF 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar as características microbiológicas da carne moída bovina Realizar genotipagem bacteriana por técnica de PCR Verificar a conformidade dos resultados encontrados com os parâmetros exigidos por legislação específica e com os dados existentes na literatura 22 3 JUSTIFICATIVA Alimentação é uma das condições básicas para promoção e manutenção da saúde desde que a produção e a manipulação dos alimentos se deem dentro de padrões higiênicosanitários satisfatórios MACHADO 2009 As doenças transmitidas por alimentos DTAs são um perigo de grande relevância para a saúde humana e para a economia dos indivíduos famílias e nações FREITAS et al 2006 A carne por suas características intrínsecas constitui excelente meio para o desenvolvimento de microorganismos podendo ser responsável pela transmissão de bactérias patogênicas para o homem DIAS et al 2008 A alta contagem microbiana na carne pode ser proveniente do abate dos animais doentes ou portadores de bactérias patogênicas mas também pela manipulação em ambientes com condições precárias de higiene condições inadequadas de temperatura no armazenamento e higiene inadequada dos manipuladores SOUZA et al 2009 A carne moída é um dos produtos cárneos mais comercializados devido à diversidade de uso ao menor custo comparado a outros cortes bovinos e a facilidade e preparo A preocupação com este alimento tornase ainda maior quando a carne é previamente fracionada por diferentes utensílios como facas e moedores e manipulada em adversas condições de higiene e ambiente FERREIRA 2008 Nesse contexto a RDC nº 12 de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária padroniza os parâmetros microbiológicos nos alimentos visando reduzir surtos de infecções alimentares e problemas de saúde pública Portanto o presente trabalho visa avaliar a qualidade microbiológica de um produto alvo de contaminação microbiana contribuindo com informações acerca da qualidade da carne moída adquirida em mercados de grande volume no Distrito Federal indicando uma possível vulnerabilidade na segurança alimentar da população consumidora deste alimento 23 4 MATERIAIS E MÉTODOS 41 COLETA E PREPARO DAS AMOSTRAS PARA AS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS As amostras de carne moída bovina embaladas em bandejas de isopor revestidas com filme plástico expostas ao consumo foram coletadas em 6 diferentes supermercados das cidades de Brasília e Taguatinga por 3 semanas consecutivas durante o período de Julho a Agosto de 2013 totalizando 18 amostras No laboratório em ambiente asséptico foi pesado 25 g da amostra colhida e colocada em um erlenmeyer contendo 225 ml de água peptonada a 01 estéril O material do erlenmeyer foi homogeneizado por 20 minutos obtendose desta forma a primeira diluição 101 A partir da primeira diluição foram realizadas 3 diluições decimais 102 103 e 104 e para isso pipetouse assepticamente 1 ml da diluição 101 para um tubo de ensaio contendo 9 ml de água peptonada a 01 estéril obtendose a segunda diluição 102 Procedeuse da mesma forma para preparar as demais diluições até a diluição 104 42 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS As análises bacteriológicas realizadas foram contagem total dos micro organismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos determinação do Número Mais Provável NMP de coliformes totais e de coliformes termotolerantes contagem de Staphylococcus sp pesquisa de Salmonella spp e extração de DNA bacteriano com amplificação de sequências do DNA por técnica de PCR 43 CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS E PSICROTRÓFICAS 24 Para contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas inoculouse 01 ml de cada diluição na superfície das placas contendo o meio de cultivo composto por extrato de carne 10 gL peptona 10 gL cloreto de sódio 5 gL e ágar 15 gL em pH 730 02 Espalhouse uniformemente o inoculo sobre a superfície do meio até completa absorção com o auxílio de alça de Drigalski esterilizada As placas para contagem total de bactérias aeróbias mesófilas foram incubadas em posição invertida a 37ºC por 24 horas e as placas para contagem total de bactérias aeróbias psicrotróficas foram incubadas em posição invertida a 7º 1ºC por 7 dias Para a contagem de colônias selecionaramse as placas contendo entre 25 a 250 colônias multiplicandose o valor encontrado pelo fator de diluição correspondente e expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colônias UFC por grama de amostra UFCg 44 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL NMP DE COLIFORMES TOTAIS E DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES A técnica de Número Mais Provável NMP é um método que estima a densidade de microrganismos viáveis presentes em uma amostra A determinação do NMP de microrganismos é baseada no princípio de que numa amostra líquida as bactérias podem ser separadas por agitação resultando numa suspensão em que as células estejam uniformemente distribuídas A comparação de tubos com crescimento positivo ou negativo após a incubação permite estimar por cálculo de probabilidade a densidade original dos microrganismos na amostra FENG et al 2002 Para a determinação do NMP de coliformes totais inoculouse 1 ml de cada diluição em uma série de 3 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo lactosado lactose 05 pv peptona bacteriológica 05 pv e extrato de carne 03 pv e tubos de Durham invertidos e a incubação foi realizada a 37ºC durante 2448 horas Após a incubação foi verificado os tubos positivos com turvação e produção 25 de gás nos tubos de Durham e estes foram considerados prova presuntiva positiva para coliformes totais Alíquotas dos tubos positivos no caldo lactosado foram transferidas para tubos contendo caldo verde brilhante e bile bovina 2 HIMEDIA e tubos de Durham invertidos que foram incubados a 37ºC por 24 horas A presença de gás nos tubos de Durham indicou prova confirmatória positiva para coliformes totais A partir do número de tubos positivos no caldo verde brilhante e bile bovina 2 e com o auxílio de uma tabela de NMP Tabela 1 foi obtido o número mais provável de coliformes totais por grama da amostra NMPg Para coliformes termotolerantes alíquotas dos tubos de caldo verde brilhante e bile bovina 2 com produção de gás foram transferidas para tubos contendo caldo EC SYNTH caldo Escherichia coli e tubos de Durham invertidos e a incubação foi realizada em banhomaria a 45ºC por 24 horas A presença de gás nos tubos de Durham indicou prova confirmatória positiva para coliformes termotolerantes Por meio da tabela de NMP Tabela 1 e baseado no número de tubos de caldo EC com produção de gás foi obtido o NMP de coliformes termotolerantes por grama da amostra NMPg 26 Tabela 1 Número mais provável por grama NMPg para 3 tubos com os inóculos de 01 001 e 0001 ml e os respectivos intervalos de confiança a 95 Tabela para 3 tubos cada um com inoculo de 01 001 e 0001 ml os NMPs por grama e os intervalos de confiança a 95 Tubos positivos NMPg Limite de confiança Tubos positivos NMPg Limite de confiança 010 001 0001 Baixo Alto 010 001 0001 Baixo Alto 0 0 0 30 95 2 2 0 21 45 42 0 0 1 30 015 96 2 2 1 28 87 94 0 1 0 30 015 11 2 2 2 35 87 94 0 1 1 61 12 18 2 3 0 29 87 94 0 2 0 62 12 18 2 3 1 36 87 94 0 3 0 94 36 38 3 0 0 23 46 94 1 0 0 36 017 18 3 0 1 38 87 110 1 0 1 72 13 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 36 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 74 13 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 36 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 36 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 45 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 45 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 92 14 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 36 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 45 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 37 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 45 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 87 94 3 3 3 1100 420 FONTE httpwwwfdagovFoodFoodScienceResearchLaboratoryMethods 27 45 CONTAGEM DE Staphylococcus spp Para a contagem de Staphylococcus spp inoculouse 01 ml de cada diluição na superfície das placas contendo o meio de cultivo Agar Base Sal Espalhouse uniformemente o inoculo sobre a superfície do meio com o auxílio de alça de Drigalski esterilizada As placas foram incubadas em posição invertida a 37ºC por 48 horas Para a contagem de colônias selecionaramse as placas contendo entre 25 a 250 colônias multiplicandose o valor encontrado pelo fator de diluição correspondente e expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colônias UFC por g de amostra UFCg O meio de cultivo Agar Base Sal era composto por extrato de carne 10 gL peptona 10 gL cloreto de sódio 75 gL e ágar 15 gL A adição de cloreto de sódio 75 pv torna o meio de cultivo seletivo para as espécies de Staphylococcus spp que tem a capacidade de se multiplicar em uma concentração de cloreto de sódio de até 15 pv e inibe a microflora acompanhante Para confirmação do gênero Staphylococcus spp foram preparados esfregaços das colônias corados pelo método de Gram para observação dos microrganismos em forma de cocos agrupados em cachos e Gram positivos Posteriormente as colônias foram submetidas à prova da catalase onde uma alíquota do cultivo foi transferida para uma lâmina contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3 vv e a formação de bolhas indicou prova positiva para catalase O gênero Staphylococcus spp produz a enzima catalase e faz uma reação positiva nesse teste As colônias do gênero Staphylococcus spp foram transferidas para tubos contendo o meio de cultivo seletivo e diferencial Agar Sal Manitol OXOID As colônias típicas de Staphylococcus aureus crescem nesse meio e fermentam o manitol produzindo colônias amarelas com zonas amarelas A maioria das espécies coagulase negativas de Staphylococcus e Micrococcus não fermentam o manitol e crescem nesse meio como pequenas colônias vermelhas rodeadas de zonas vermelhas ou rosa choque sendo possível obter um resultado presuntivo para as espécies de Staphylococcus aureus BRASIL 2010 28 46 PESQUISA DE Salmonella spp A diluição 101 das amostras em água peptonada 01 foi incubada à temperatura de 37ºC por 24 horas Esta fase é caracterizada como pré enriquecimento geral Após a incubação 24 horas pipetouse 1 ml das alíquotas do caldo de préenriquecimento para tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo selenito cistina As amostras foram homogeneizadas e incubadas a 37ºC por 24 horas Esta fase é caracterizada como enriquecimento seletivo Após o enriquecimento seletivo procedeuse à técnica de isolamento onde a partir de cada tubo semeouse em estrias para isolamento com alças de platina as placas de Petri contendo o meio sólido seletivo e diferencial Ágar Salmonella Shigella Ágar SS As placas foram incubadas invertidas a 37ºC por 24 horas Como resultado presuntivo foi observado se houve crescimento no Ágar SS de colônias típicas de Salmonella spp colônias incolores tendendo ao amarelo podendo ter centro negro As colônias não fermentadoras de lactose eou com pigmento negro foram reisoladas em ágar CLED meio rico não seletivo mas diferencial para bactérias fermentadoras de lactose para obtenção de colônias puras e então estas foram transferidas para meio de cultivo contendo Agar TSI três açúcares e ferro Este meio contém três açúcares glicose 01 lactose 1 e sacarose 1 além do indicador vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos A fermentação de carboidratos é indicada pela mudança da cor do meio de vermelho para amarelo Se o microorganismo em estudo for capaz de produzir sulfeto de hidrogênio H2S este se conjuga com um composto de ferro existente no meio dando origem a sulfeto de ferro que sendo insolúvel precipita e tem cor negra indicado pela cor preta na base do tubo ANVISA 2010 Para o preparo do Agar TSI em tubos o ágar fundido é deixado solidificar formando uma superfície inclinada Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo A porção inclinada exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico é aeróbia A porção inferior denominada base do tubo está protegida do ar e é relativamente anaeróbia Todas as bactérias pertencentes à 29 família Enterobacteriaceae são anaeróbicas facultativas e utilizam carboidratos efetuando a fermentação ácida mista ANVISA 2010 Enterobactérias como E coli Enterobacter e Klebsiella fermentam a glicose e a lactose eou sacarose 2 ou 3 açucares do meio tornando a base e a superfície do tubo de cor amarela AA e geralmente é possível detectar a presença de gás CO2 pela formação de bolhas eou fragmentação do meio Quando a superfície do meio está vermelha e a base amarela VA significa que acorreu fermentação apenas da glicose ficando a lactose e a sacarose sem fermentação Os microorganismos degradam preferencialmente a glicose em primeiro lugar mas como este substrato está presente em concentração mínima a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície Se houver produção de sulfeto de ferro a base do meio tornase negra Figura 1 Essa reação é característica de enterobactérias não fermentadoras de lactose como Shigella e também produtoras de H2S como Salmonella ANVISA 2010 Figura 1 Reações bioquímicas das diferentes espécies de bactérias no Agar TSI Fonte ASM microbelibraryorg 47 ANÁLISES MOLECULARES 30 471 Extração de DNA A extração de DNA total dos isolados de S aureus e de Salmonella ssp conformados na análise microbiológica foi realizada de acordo com o protocolo descrito no kit Plasmid DNA purification MACHEREYNAGEL com modificações Inicialmente transferiuse uma alçada da cultura de cada um dos isolados em 8 ml de caldo de cultivo LB e incubouse a 37ºC por 24h Centrifugouse cada amostra contendo bactérias 2500 rpm por 10 min e descartouse o sobrenadante Adicionouse em cada amostra 250 µL do tampão A1 e homogeneizouse Em seguida adicionouse 200 µL do tampão A2 Misturouse a amostra 10 vezes homogeneizouse novamente e incubouse a temperatura ambiente por 5 min Completouse com tampão A3 e centrifugouse por 5 min a 11000g O sobrenadante foi passado por uma coluna de sílica e centrifugouse por 1 min Adicionouse 500 µL de tampão AW aquecido à 50C e centrifugou por 1 min Adicionouse 600µL de tampão A4 e centrifugouse a 1000g por 3 min Por fim 50µL do tampão AE foi adicionado ao centro da coluna A amostra desta última lavagem continha o DNA purificado A qualidade e a quantidade de DNA extraído foram estimadas por eletroforese em gel de agarose 1 e comparado com o padrão de massa molecular DNAlHindIII marcador de 100 pb JENA 48 OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS E PCR QUALITATIVO 481 Desenho dos oligonucleotídeos para a PCR A seleção das regiões a serem analisadas para S aureus e Salmonella ssp foi realizada conforme revisão na literatura e optouse por duas regiões gênicas espécies específicas a femA e a invA respectivamente Com a descrição das sequências referentes às regiões específicas para uma dada região genômica recuperadas no programa BLAST httpblastncbinlmnihgovBlastcgi vide ANEXO 1 foram desenhados oligonucleotideos usando O programa Primer 3 Plus httpwwwbioinformaticsnlcgibinprimer3plus primer3pluscgi Os parametros utilizados para a construgao dos primers estao na listados na tabela 2 Tabela 2 Distribuigao dos limites minimos e maximos para a construcao dos oligonucleotideos Parametro Limiteminimo Limitemaximo Temperaturade iiSBS es si stsitCD anelamento Contetido de GC no 20 80 oligonucleotideo Tamanho do 18 bases 27 bases Oligonucleotideo Tm do amplicon 75C 85C Tamanho do amplicon 80 bases 170 bases Apés selecionar os pares de oligonucleotideos que atendiam a essas condicées foi utilizado 0 programa Oligo Analyzer da Integrated DNA Technologies IDT para verificar a formagao de dimeros dobramento hairpin e AG de formagao de hibridos Os primers obtidos especificos para este estudo estao listados na tabela 3 Tabela 3 Caracteristicas dos oligonucleotidios utilizados neste estudo Oligonucletidio Sequéncia 53 Produto Espécie estimado Lary femAF GCAGTGCCCTGGGAAATGA Lary femAR CGTCATGATATTCCGCCCCA 107pb S aureus LaryinvAF TGGATTTGTCCTCCGCTCTG LaryinvAR CGTCATGATATTCCGCCCCA 155 pb Salmonella ssp 482 PCR qualitativo 31 32 As condições de termociclagem foram 50C por 2 minutos 95C por 2 minutos e 40 ciclos de desnaturação a 95C por 15 segundos seguida de 60C por 30 segundos para o anelamento dos oligonucleotídeos e 72C por 30 segundos para a extensão dos fragmentos O equipamento utilizado foi o termociclador Techne modelo TC512 Foram utilizados 25 µL de tampão 10 vezes 10 mM de Tris e 50 mM de KCl 07 µL de MgCl2 15 µL de dNTPs 25 mM 05 µL de TaqPolimerase Cenbiot 5 UµL 15 µL de oligonunleotídeos foward e reverse 10 µM completando com água MilliQ para um volume final de 25 µL por reação com a amplificação de 10 ng de DNA extraído da amostra bacteriana 33 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 51 COLETA DAS AMOSTRAS Para a realização deste estudo foram coletadas 18 amostras de carne moída bovina embaladas em bandejas de isopor expostas ao consumo em 6 diferentes supermercados das cidades de Brasília e Taguatinga no período de três semanas consecutivas entre os meses de Julho e Agosto de 2013 As amostras 1 2 e 3 eram provenientes de um supermercado de grande rede situado na cidade de Taguatinga e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta As amostras 4 5 e 6 eram provenientes de outro supermercado de grande rede situado na cidade de Taguatinga e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta As amostras 7 8 e 9 eram provenientes de outro supermercado de menor porte também situado em Taguatinga e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta Já as amostras 10 11 e 12 eram provenientes de um supermercado de rede de menor porte situado na cidade de Brasília Plano Piloto e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta As amostras 13 14 e 15 eram provenientes de outro supermercado de menor porte também situado na cidade de Brasília Plano Piloto e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta E finalizando as amostras 16 17 e 18 eram provenientes de outro supermercado situado na cidade de Brasília Plano Piloto e representam respectivamente à primeira segunda e terceira coleta 34 52 CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS E PSICROTRÓFICAS A legislação brasileira não estabelece um padrão para contagem total de bactérias aeróbias mesófilas na carne crua A contagem de microorganismos aeróbios mesófilos é comumente empregada para indicar a qualidade higiênico sanitária dos alimentos Um número elevado desses microorganismos indica um risco aumentado da presença de patógenos e da fase inicial de deterioração com perdas de qualidade sensorial e nutricional do alimento FRANCO LANDGRAF 2004 De acordo com FRANCO e LANDGRAF 2004 contagens de bactérias aeróbias mesófilas na carne crua entre 103 e 106 UFCg indicam um produto sem deterioração microbiana Já carnes contendo concentrações bacterianas entre 106 e 107 UFCg estão com a qualidade comprometida com início de deterioração e possível detecção de odores desagradáveis Acima de 108 UFCg a carne já apresenta sinais de deterioração com a presença de odores desagradáveis Segundo SILVA 2002 isto ocorre porque a partir dessa concentração bacteriana o suprimento de glicose da carne acaba e as bactérias começam a utilizar aminoácidos como substrato para seu crescimento A degradação destes componentes provoca o aparecimento de odores sulfídricos e de ésteres ácidos A legislação argentina ARGENTINA 2005 estabelece como próprio para consumo a contagem total de bactérias aeróbias mesófilas na carne crua de 50 x105 UFCg aceitável para consumo a contagem entre 50 x105 e 50 x106 UFCg e insatisfatório para consumo a contagem acima de 50 x106 UFCg O Código Sanitário do Estado de São Paulo SÃO PAULO 1992 estabelece padrões microbiológicos para contagem total de bactérias aeróbias mesófilas em carnes frescas sendo o máximo permitido de 30 x 106 UFCg A figura 2 apresenta os resultados da contagem total de bactérias aeróbias mesófilas das 18 amostras de carne moída bovina analisadas neste trabalho De acordo com a legislação argentina ARGENTINA 2005 13 amostras 7223 mostraram contagens de bactérias aeróbias mesófilas próprias para o consumo até 50 x105 UFCg e 5 amostras 2777 mostraram contagens de bactérias aeróbias mesófilas aceitáveis para o consumo entre amostra estava imprópria para o consumo Figura 2 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas nas amostras de Nota 100E03 significa 10 x 10 Segundo MORTON 2001 de 10 x105 UFCg em carne moída fresca comprometem os produtos em relação à sua qualidade higiênicosanitária amostras de carne moída bovina analisadas neste trabalho somente 3 amostras 1667 estavam com contagens abaixo de 10 x1 outras 15 amostras 8433 estavam com contagens acima de 10 x1 Trabalhos semelhantes a este como o de MOTTA et al 2000 que analisaram 15 amostras de carne moída verificaram que 60 das amostras apresentaram contagem de mesófilos UFCg ALMEIDA et al 2010 adquirido em 15 açougues na cidade de estabelecimentos ilegais Os autores relataram que moída apresentaram contagens al 2012 analisaram 30 amostras de carne bovina diferentes supermercados e açougues escolhidos 100E03 101E05 201E05 301E05 401E05 501E05 601E05 701E05 801E05 901E05 100E06 110E06 120E06 130E06 140E06 150E06 160E06 170E06 180E06 190E06 200E06 210E06 1 UFCg para o consumo entre 50 x105 e 50 x106 UFCg amostra estava imprópria para o consumo total de bactérias aeróbias mesófilas nas amostras de carne moída bovina Nota 100E03 significa 10 x 103 UFCg Segundo MORTON 2001 contagens de bactérias aeróbias mesófilas UFCg em carne moída fresca comprometem os produtos em relação à sanitária Considerando esse padrão mais rígido das 18 amostras de carne moída bovina analisadas neste trabalho somente 3 amostras 1667 estavam com contagens abaixo de 10 x105 UFCg enquanto que as outras 15 amostras 8433 estavam com contagens acima de 10 x1 Trabalhos semelhantes a este como o de MOTTA et al 2000 que m 15 amostras de carne moída verificaram que 60 das amostras de mesófilos superior a 106 UFCg e 13 superior a 2010 analisaram 15 amostras de acém moído resfriado e em 15 açougues na cidade de Diamantina MG provenientes de Os autores relataram que 80 das amostras de carne apresentaram contagens de mesófilos superiores a 105 UFCg 30 amostras de carne bovina moída adquiridas em 10 diferentes supermercados e açougues escolhidos aleatoriamente localizados na 2 3 4 5 6 SUPERMERCADOS 35 UFCg Nenhuma carne moída bovina mesófilas acima UFCg em carne moída fresca comprometem os produtos em relação à do esse padrão mais rígido das 18 amostras de carne moída bovina analisadas neste trabalho somente 3 amostras enquanto que as outras 15 amostras 8433 estavam com contagens acima de 10 x105 UFCg Trabalhos semelhantes a este como o de MOTTA et al 2000 que m 15 amostras de carne moída verificaram que 60 das amostras UFCg e 13 superior a 107 mostras de acém moído resfriado e provenientes de 80 das amostras de carne UFCg Já MARCHI et oída adquiridas em 10 aleatoriamente localizados na coleta 1 coleta 2 coleta 3 36 cidade de Jaboticabal SP Este estudo observou uma média de população de mesófilos na ordem de 105 UFCg no entanto 20 das amostras apresentaram uma população entre 106 e 108 UFCg Desta forma a elevada população de bactérias mesófilas nos estudos citados acima indica que houve possibilidade de multiplicação microbiana no alimento inclusive de patogênicos determinando o risco sanitário deste alimento À medida que a população desses microorganismos aumenta incrementase também a possibilidade de existirem microorganismos patogênicos e a presença de toxinas resultantes do metabolismo microbiano APHA 2001 Os microorganismos aeróbios psicrotróficos em número elevado são responsáveis pela diminuição da vida de prateleira dos alimentos refrigerados por constituírem seus principais deterioradores BARTOLOMEU et al 2011 Pelos padrões estabelecidos pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods ICMSF 1986 permitese uma contagem máxima de 10 x 107 UFCg de microorganismos aeróbios totais para os alimentos em geral A tabela 4 mostra os resultados da contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída bovina É possível observar que das 18 amostras de carne moída bovina analisadas somente as amostras correspondentes à terceira semana de coleta de todos os supermercados mostraram contagens altas de bactérias psicrotróficas entre 106 e 107 UFCg gerando resultados discrepantes em relação às demais amostras Possivelmente naquela semana por situações desconhecidas dos autores deste trabalho houve variação com aumento da temperatura da geladeira onde essas amostras foram cultivadas 37 Tabela 4 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída bovina Amostras de carne moída bovina Bactérias mesófilas UFCg Bactérias psicrotróficas UFCg 1 97x105 59x105 2 13x105 97x104 3 15x105 31x106 4 21x106 74x105 5 18x106 94x104 6 41x105 10x107 7 24x105 12x105 8 40x105 32x105 9 31x105 93x106 10 18x105 31x103 11 16x106 10x105 12 60x104 95x106 13 25x104 46x104 14 18x105 74x104 15 14x105 84x106 16 20x105 92x103 17 64x105 69x105 18 97x103 72x106 De acordo com a legislação argentina a contagem de mesófilos não deve ultrapassar 50 x 106 UFCg e de acordo com a ICMSF a contagem de psicrotróficos não deve ultrapassar 10 x 107 UFCg Amostras pertencentes à terceira semana de coleta Normalmente existe uma correlação positiva entre o número de bactérias mesófilas e psicrotróficas As bactérias psicrotróficas são um grupo de micro organismos com crescimento visível a 7 1ºC em 07 a 10 dias Apesar de se multiplicarem em temperaturas baixas como as de refrigerador sua temperatura ótima de crescimento costuma variar entre 20 e 35ºC Muitas bactérias psicrotróficas são mesófilas e crescem mais lentamente a temperaturas mais baixas FRANCO LANDGRAF 2004 A figura 3 mostra os resultados da contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída correspondentes a primeira e segunda semana de coleta dos supermercados Com exceção da amostra 17 as contagens de bactérias psicrotró mesófilas e todas as amostras 105 UFCg ou seja inferior ao limite de ICMSF1986 Figura 3 Contagem total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de carne moída na primeira e na significa 10 x 103 UFCg Neste estudo com exceção amostras mostraram contagens altas de bactérias psicrotróficas entre 10 UFCg as contagens de micro mostraramse baixas entre 10 existentes na literatura No e amostras de carne bovina moída açougues de Jaboticabal SP altas contagens de microorganismos psicrotróficos COSTA et al 2008 analisaram populações médias de psicrotróficos variando na ordem de 10 100E03 101E05 201E05 301E05 401E05 501E05 601E05 701E05 801E05 901E05 100E06 110E06 120E06 130E06 140E06 150E06 160E06 170E06 180E06 190E06 200E06 210E06 1 2 UFCg AMOSTRAS DE CARNE BOVINA MOÍDA de bactérias psicrotróficas ficaram abaixo da contagem de bactérias todas as amostras mostraram níveis aceitáveis de contagem entre 10 inferior ao limite de 10 x 107 UFCg estabelecido pela total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de a segunda semana de coleta dos supermercados om exceção da terceira semana de coleta onde todas as mostraram contagens altas de bactérias psicrotróficas entre 10 microorganismos psicrotróficos para as demais amostras entre 103 e 105 UFCg em comparação com outros trabalhos No estudo de MARCHI et al 2012 que ina moída adquiridas em diferentes supermercados e açougues de Jaboticabal SP verificouse que 566 das amostras apresentaram organismos psicrotróficos variando de 106 a analisaram 40 amostras de carne moída e populações médias de psicrotróficos variando na ordem de 104 e 107UFCg 4 5 7 8 10 11 13 14 AMOSTRAS DE CARNE BOVINA MOÍDA MESÓFILAS PSICROTRÓFICAS 38 abaixo da contagem de bactérias de contagem entre 103 e estabelecido pela total de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas nas amostras de segunda semana de coleta dos supermercados Nota 100E03 da terceira semana de coleta onde todas as mostraram contagens altas de bactérias psicrotróficas entre 106 e 107 para as demais amostras em comparação com outros trabalhos que analisou 30 adquiridas em diferentes supermercados e das amostras apresentaram a 109 UFCg Já e encontraram UFCg 16 17 PSICROTRÓFICAS 39 53 CONTAGEM DE Staphylococcus spp E DE Staphylococcus aureus Para confirmação do gênero Staphylococcus spp das colônias que cresceram no ágar sal foram preparados esfregaços corados pelo método de Gram Na visualização em microscópio só foram consideradas positivas as colônias coradas por Gram que tinham a forma de cocos agrupadas em cachos e eram gram positivas Na prova de catalase todas as colônias previamente selecionadas pela coloração de gram foram positivas confirmando o gênero Staphylococcus spp As colônias do gênero Staphylococcus spp foram então transferidas para tubos contendo o meio de cultivo seletivo e diferencial Agar Sal Manitol Foi considerado resultado positivo para as espécies de Staphylococcus aureus as colônias que fermentaram o manitol do meio produzindo colônias amarelas com zonas amarelas A tabela 5 mostra os resultados da contagem de bactérias Staphylococcus spp e da contagem de bactérias Staphylococcus aureus nas amostras de carne moída bovina 40 Tabela 5 Contagem de bactérias Staphylococcus spp e de bactérias Staphylococcus aureus nas amostras de carne moída bovina Amostras de carne moída bovina Agar sal UFCg Staphylococcus spp Agar sal manitol UFCg Colônias amarelas Staphylococcus aureus 1 10x102 10x102 2 0 0 3 0 0 4 50x102 40x102 5 30x102 20x102 6 20x102 20x102 7 60x102 30x102 8 43x103 40x103 9 10 x 103 10 x 103 10 70x102 0 11 22x103 30x102 12 40x102 10x102 13 18x103 30x102 14 50x102 40x102 15 30x102 30x102 16 10x102 0 17 10x102 0 18 0 0 O limite máximo aceitável para a contagem de Staphylococcus aureus preconizado pela legislação brasileira BRASIL 2001 para produtos cárneos crus refrigerados ou congelados como hambúrgueres almôndegas quibe e similares que geralmente levam carne moída em sua composição é de 10 x 103 UFCg A contagem de Staphylococcus aureus em números inferiores a 10 x 103 UFCg normalmente indica condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente por se tratar de uma bactéria procedente de manipulação humana inadequada em números de 103 a 104 UFCg pode significar risco à saúde pública enquanto que valores próximos a 105 UFCg indicam risco epidemiológico 41 porque esse é o número compatível com o início da produção de enterotoxina se a linhagem em questão for capaz de produzila MARCHI 2006 De acordo com SORIANO et al 2002 é necessário a presença de aproximadamente 105 UFCg deste microorganismo no alimento para causar intoxicação alimentar Embora a carne bovina moída normalmente receba tratamento térmico antes de ser consumida o risco de intoxicação não está descartado pois a toxina elaborada pelo Staphylococcus aureus é termoestável e um tratamento térmico de 100oC por 30 minutos nem sempre é suficiente para inativála Neste trabalho das 18 amostras de carne moída bovina analisadas 12 amostras 6667 apresentaram cepas de S aureus indicando condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente sendo que 10 amostras 5556 apresentaram contagens entre 10 e 40 x 102 UFCg e somente 2 amostras 1111 apresentaram contagens maior ou igual a 10 x 103 UFCg podendo indicar risco à saúde pública Figura 4 No estudo posterior de biologia molecular todas as amostras foram testadas e foram geneticamente confirmadas como S aureus O estudo realizado por SANTOS et al 2012 na cidade de São Luís MA revelou que das 20 amostras de carne moída analisadas 10 amostras 50 apresentaram contagens de Staphylococcus coagulase positiva que variaram de 18 x 103 a 12 x 104 UFCg ALMEIDA et al 2010 analisaram 15 amostras de acém moído proveniente de 15 açougues na cidade de Diamantina MG e detectaram Staphylococcus coagulase positiva em 60 das amostras analisadas com contagens médias de 26 x 106 UFCg Os riscos veiculados pelos alimentos com altas contagens de Staphylococcus coagulase positiva são amplos uma vez que esta bactéria além de ser patogênica para o homem apresenta resistência a determinadas drogas antimicrobianas agravando sua importância para a saúde pública ALMEIDA et al 2010 Figura 4 Contagem de bactérias primeira segunda e terceira semana de coleta dos 54 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL NMP DE COLIFORMES TOTAIS E DE A legislação brasileira BRASIL 2001 não estabelece limites de tolerância para o grupo dos coliformes totais em carne moída Entretanto de coliformes totais indicam falhas higiênicas durante o processamento havendo ainda a possibilidade da presença de micro e a ocorrência de enteropatógenos FRANCO LANDGRAF 2004 Neste trabalho das 18 amostras de carne moída bovina analisadas 2 amostras 1666 apresentaram enumeração de coliformes totais superiores a 10 x 103 NMPg indicando condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente enquanto que as outras 16 enumeração menor de coliformes fecais o que diminui bastante a presença de microorganismos patogênicos de origem fecal 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 1 de bactérias Staphylococcus spp nas amostras de carne moída na segunda e terceira semana de coleta dos supermercados DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL NMP DE COLIFORMES TOTAIS E DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES A legislação brasileira BRASIL 2001 não estabelece limites de tolerância para o grupo dos coliformes totais em carne moída Entretanto contagens elevadas de coliformes totais indicam falhas higiênicas durante o processamento havendo ainda a possibilidade da presença de microorganismos patogênicos de origem fecal e a ocorrência de enteropatógenos FRANCO LANDGRAF 2004 das 18 amostras de carne moída bovina analisadas 2 amostras 1666 apresentaram enumeração de coliformes totais superiores a indicando condições higiênicas inapropriadas eou o enquanto que as outras 16 amostras 8889 mostraram enumeração menor de coliformes fecais o que diminui bastante a possibilidade da rganismos patogênicos de origem fecal como E coli 2 3 4 5 42 tras de carne moída na DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL NMP DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES A legislação brasileira BRASIL 2001 não estabelece limites de tolerância contagens elevadas de coliformes totais indicam falhas higiênicas durante o processamento havendo rganismos patogênicos de origem fecal das 18 amostras de carne moída bovina analisadas somente 2 amostras 1666 apresentaram enumeração de coliformes totais superiores a indicando condições higiênicas inapropriadas eou o 8889 mostraram possibilidade da E coli Tabela 6 6 Série2 Série3 Série4 43 Tabela 6 Determinação do número mais provável NMPg de coliformes totais e coliformes termotolerantes nas amostras de carne moída bovina Amostras de carne moída bovina Coliformes totais NMPg Caldo verde brilhante Coliformes termotolerantes NMPg Caldo E coli 1 23 92 2 23 3 3 240 36 4 3 3 5 23 3 6 3 3 7 36 3 8 23 3 9 11 x 103 23 10 36 3 11 23 23 12 11 x 103 11 x 103 13 23 3 14 3 3 15 15 3 16 23 3 17 23 36 18 36 3 A legislação brasileira BRASIL 2001 não apresenta parâmetros para a enumeração de coliformes a 450C em carne moída porém é possível usar como referência os valores determinados para carne bovina crua preparada e refrigerada cujo limite máximo é 50 x 10³ NMPg Já para produtos cárneos crus refrigerados ou congelados como hambúrgueres almôndegas quibe e similares que geralmente levam carne moída em sua composição o limite máximo aceitável para a enumeração de coliformes a 450C é de 50 x 102 NMPg 44 Neste trabalho das 18 amostras de carne moída bovina analisadas somente 1 amostra 555 apresentou contagem de coliformes termotolerantes superior a 10 x 103 NMPg 1666 podendo ser considerada imprópria para o consumo de acordo com a legislação BRASIL 2001 para produtos cárneos crus refrigerados ou congelados como hambúrgueres almôndegas quibe e similares cujo limite máximo aceitável para a enumeração de coliformes a 450C é de 50 x 102 NMPg ABREU et al 2011 analisaram 10 amostras de carne bovina moída provenientes de estabelecimentos comerciais supermercados e açougues da cidade de Umuarama PR e detectaram que 30 das amostras apresentaram níveis de contaminação por coliformes totais e termotolerantes consideradas preocupantes acima de 103NMPg JÚNIOR et al 2013 analisaram 25 amostras de carne moída bovina comercializadas em vários munícipios de Minas Gerais e verificaram que todas as amostras apresentaram contaminação por coliformes totais e em 20 amostras 80 foi detectada a presença de E coli No trabalho de FOSSATI 2011 as amostras de quibe cru provenientes de cinco restaurantes árabes localizados em Porto Alegre RS apresentaram elevadas contagens de coliformes totais de até 41 x 105 UFCg e contagens médias de coliformes termotolerantes de 10 x 103 UFCg Assim a presença de coliformes termotolerantes E coli em alimentos indica contaminação com material fecal e pode estar associada à presença de diferentes microorganismos patogênicos que oferecem riscos à saúde humana como a Shigella Vibrio e Salmonella FRANCO LANDGRAF 2004 55 PESQUISA DE Salmonella spp De acordo com a RDC nº 12 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA bactérias do gênero Salmonella devem estar ausentes em 25g de carne moída Bactérias desse gênero podem causar toxi infecções alimentares conferindo risco ao consumidor tornando o alimento impróprio para o consumo Neste trabalho das 18 amostras de carne moída bovina analisadas 5 amostras 2770 apresentaram crescimento presuntivo no meio de cultura sólido 45 seletivo e diferencial Ágar Salmonella Shigella Ágar SS caracterizado pela presença de colônias não fermentadoras de lactose eou com pigmento preto Tabela 7 Tabela 7 Resultado de pesquisa de Salmonella spp nas amostras de carne moída Amostras de carne moída bovina Agar SS colônias não fermentadoras de lactose pigmento preto Agar TSI superfície do meio vermelho e base amarela ou com pigmento preto Salmonella spp 1 Ausente 2 Ausente 3 Ausente 4 Presente Positivo 5 Ausente 6 Ausente 7 Ausente 8 Presente Negativo 9 Presente Negativo 10 Ausente 11 Ausente 12 Ausente 13 Presente Negativo 14 Presente Negativo 15 Ausente 16 Ausente 17 Ausente 18 Ausente As colônias não fermentadoras de lactose eou com pigmento preto do Ágar Salmonella Shigella Ágar SS foram então repassadas de forma pura para o Agar TSI Das 5 amostras positivas repassadas para o ágar TSI apenas 1 amostra 555 a de número 4 apresentou a superfície do meio vermelho e a base amarela sem pigmento negro como evidenciado na figura 5 Essa reação no ágar 46 TSI é característica de enterobactérias não fermentadoras de lactose como Shigella e Salmonella ANVISA 2010 No estudo posterior de biologia molecular essa amostra foi geneticamente confirmada como Salmonella spp e portanto estava imprópria para o consumo Figura 5 Fotografia demonstrativa das colônias puras suspeitas de serem Salmonella spp no Ágar TSI No trabalho de SOUSA et al 2012 foram analisadas 30 amostras de carne moída comercializadas em açougues e supermercados da cidade de Barra do Garças MT Deste total detectouse em cinco amostras 17 a presença de Salmonella spp mostrando que possivelmente estes alimentos sofreram contaminação fecal durante o seu processamento eou manipulação Outros trabalhos como o de DIAS et al 2008 realizado no estado do Rio Grande do Sul revelaram que das 24 amostras de carne moída bovina analisadas somente 1 amostra estava contaminada com Salmonella spp e desta forma não atendia aos padrões microbiológicos estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária BRASIL 2001 56 ANÁLISE MOLECULAR Foram analisadas duas regiões gênicas S aureus e Salmonella ssp espécie específica Para o gene femA os oligos utilizados foram nas amostras com conteúdo confirmado na análise microbiológica clássica como aureus a banda amplificada correspondia a 107pb gel n1 amostras 2 a 5 sendo que a amostra 1 com análise microbiológica referente à banda amplificada Esse padrão de amplificação positiva todos os isolados com análise aureus Porém no gel de n 2 a amplificação do gene invA amostra 1 confirmou tratar Gel n1 Gel 2 Legenda M MarcadorControle Positivo 1 Amostra de Salmonella spp 2 3 4 e 5 Amostras de S aureus Figura 6 PCR para detecção dos genes LaryfemAF e LaryfemAR 100pb M 1 2 3 4 5 ANÁLISE MOLECULAR duas regiões gênicas a femA e a invA respectivamente de Salmonella ssp Em qualquer uma das situações a amplificação foi A os oligos utilizados foram LaryfemAF e com conteúdo confirmado na análise microbiológica clássica como a banda amplificada correspondia a 107pb gel n1 amostras 2 a 5 sendo que a amostra 1 com análise microbiológica referente à Salmonella ssp Esse padrão de amplificação positiva foi observado para os análises microbiológicas anteriores identificados Porém no gel de n 2 a amplificação do gene invA com 157 confirmou tratarse de um isolado de Salmonella ssp figura 3 Gel n1 Gel 2 M MarcadorControle Positivo S aureus PCR para detecção dos genes femA e inv No gel n 1 foi utililizado o par de oligos e no gel n 2 LaryinvAF e LaryinvAR M marcador de M 1 47 respectivamente de a amplificação foi e LaryfemAR com conteúdo confirmado na análise microbiológica clássica como S a banda amplificada correspondia a 107pb gel n1 amostras 2 a 5 sendo Salmonella ssp não teve a foi observado para os microbiológicas anteriores identificados por S com 157pb nesta figura 3 foi utililizado o par de oligos M marcador de 48 6 CONCLUSÔES Os resultados do presente estudo permitiram concluir que a carne moída bovina comercializada nos mercados varejistas das cidades de Brasília e Taguatinga carece de qualidade microbiológica e sanitária Uma das amostras analisadas se apresentou imprópria para o consumo de acordo com a legislação brasileira devido à presença da bactéria Salmonela spp confirmada geneticamente em 25g do produto Também foi verificado que mais da metade das amostras analisadas 6667 mostraram condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente por apresentarem cepas de S aureus incluindo 3 amostras 1666 com enumerações de coliformes totais superiores a 10 x 103 NMPg o que também indica condições higiênicas inapropriadas eou o processamento deficiente e 1 amostra 555 com enumeração de coliformes termotolerantes superior a 10 x 103 NMPg indicando contaminação com material fecal em nível preocupante Ademais percebese uma deficiência na Legislação Brasileira para a carne moída uma vez que inexistem parâmetros que delimitem a presença de bactérias aeróbias mesófilas e psicotróficas coliformes totais e termotolerantes que indicam a qualidade higiênicosanitária da carne in natura Como agravante desse fato os mercados em maioria ainda insistem em desrespeitar as regras higiênicosanitárias estabelecidas para a manipulação da carne moída Portanto observase a necessidade de fiscalização frente ao cumprimento da lei e adoção de medidas educativas junto aos trabalhadores do ramo de modo a minimizar os perigos para a saúde do consumidor Para estudos futuros sugerese uma reformulação do planejamento da amostragem com a finalidade de promover a análise estatística dos resultados encontrados realizandose coletas únicas em duplicatas ou triplicatas Por esse motivo as amostras dos 6 supermercados coletadas em 3 semanas consecutivas foram tratadas como 18 amostras independentes 49 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABRAHÃO R C NOGUEIRA P A MALLUCELI M I C O comércio clandestino de carne e leite no Brasil e o risco da transmissão da tuberculose bovina e de outras doenças ao homem um problema de saúde pública Archives of Veterinary Science Curitiba v10 n2 p117 2005 ABREU C O MERLINI L S BEGOTTI I L Pesquisa de Salmonella spp Staphilococcus aureus coliformes totais e coliformes termotolerantes em carne moída comercializada no município de Umuarama PR Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR Umuarama v 14 n 1 p 1923 2011 ALMEIDA C A SOUZA M R PINHO L SOBRINHO M E SILVA M C B Determinação de perigos microbiológicos em carnes bovinas resfriadas provenientes de abates clandestinos e comércio ilegal Acta Veterinaria Brasilica Mossoró v4 n4 p278285 2010 ALMEIDA A S GONÇALVES P M R FRANCO R M Salmonella em corte de carne bovina inteira e moída Revista Higiene Alimentar São Paulo v16 n96 p7781 2002 APHA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION Committee on Microbiological for Foods Compendium of methods for the microbiological examination of foods 4ed WashingtonAmerican Public Health Association 676p 2001 ALVES D D TONISSI R H GOES B MANCIO A B Maciez da carne bovina Ciência Animal Brasileira Goiânia v 6 n 3 p 135149 2005 ARGENTINA Reglamento CE no 20732005 de la 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Revista Medicina Ribeirão Preto USP v 42 n4 p 461465 2009 MALORNY B et al Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens International Journal of Food Microbiology v 83 n 1 p 3948 2003 MARCHI G P JUNIOR R D O CERESER D N SOUZA V REZENDE M C N FARIA A A Avaliação microbiológica e físicoquímica da carne bovina moída comercializada em supermercados e açougues de Jaboticabal SP Revista Eletrônica da Univar São Paulo n7 p 81 87 2012 MARQUES K P S Efeito da moagem no isolamento de Yersinia enterocolitica em carne bovina 1991 70 f Dissertação Mestrado em Ciência dos Alimentos Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Piracicaba 1991 MENDES A C R SANTANA NETA L G COSTA D S ALMEIDA J F Condições de comercialização de cortes cárneos em supermercados da cidade de Salvador BA Revista Higiene Alimentar São Paulo v15 n83 p 5862 2001 MOTTA M R A BELMONTE M A PANETTA J C Avaliação microbiológica de amostras de carne moída comercializada em supermercados da região oeste de São 55 Paulo Revista Higiene Alimentar São Paulo v 14 n7879 p 5962 2000 MURRAY P R ROSENTHAL K S PFALLER M A Microbiologia Médica 5 ed Rio de Janeiro Editora Elsevier 2006 p 217224 MORTON R D Aerobic plate count In DOWNES FP ITO K Eds Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods Washington American Public Health Association APHA 2001 cap 7 p 63 67 OLIVEIRA N M S NASCIMENTO L C FIORINI J E Isolamento e identificação de bactérias facultativas mesofílicas em carnes frescas bovinas e suínas Revista Higiene Alimentar São Paulo v16 n94 p6874 2002 POSTOLLEC F et al Recent advances in quantitative PCR qPCR applications in food microbiology Food Microbiology v 28 n 5 p 848861 2011 PELISSER M R et al Occurrence of Staphylococcus aureus and multiplex PCR detection of classic enterotoxin genes in cheese and meat products Brazilian Journal of Microbiology São Paulo v 40 n 1 2009 SALINAS R D Alimentos e nutrição Introdução à Bromatologia 3ed Porto Alegre Editora Artmed 2002 SÃO PAULO Estado Secretaria da Saúde Código Sanitário Decreto n12342 de 27 de setembro de 1978 regulamento da promoção da saúde no campo da competência da Secretaria do Estado da Saúde revisto e atualizado até dezembro de 1990 5 ed São Paulo IMESP 1992 60 p SANTO E Detecção de Escherichia coli patogênica extra intestinal e análise de seus fatores de virulência e perfil de resistência antimicrobiana em carne moída de açougues do município de Taquaritinga SP Brasil 2006 Dissertação Doutorado em Microbiologia Agropecuária Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP São Paulo SP 2006 SANTOS F A N LEÔNCIO G G SILVA S D F PINHEIRO N F M PEREIRA M D LOPES S I Presença de Staphylococcus aureus em carne moída bovina comercializada em feiras e mercados públicos da cidade de São LuísMA 64ª reunião Anual da SBPC UFMA 2012 56 SILVA C A SOUZA E L SOUZA C P Estudo da qualidade sanitária da carne moída comercializada na cidade de João Pessoa PB Revista Higiene Alimentar São Paulo v 18 n121 p 9094 2004 SILVA W P GANDRA E A Estafilococos coagulase positiva patógenos de importância em alimentos Revista Higiene Alimentar São Paulo v18 n122 2001 SILVA M C Avaliação da qualidade microbiológica de alimentos com a utilização de metodologias convencionais e do sistema SimPlate 2002 75f Dissertação Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Piracicaba 2002 SORIANO J M FONT G MOLTÓ J C MAÑES J Enterotoxigenic staphylococci and their toxins in restaurant foods Trends in Food Science Technology v 13 p 6067 2002 SOUSA M T NETO C A HERNANDES T SOUTO S C P Microrganismos patogênicos e indicadores de condições higiênicosanitária em carne moída comercializada na cidade de Barra do Garças MT Acta Veterinária Brasílica Mossoró v6 n2 p124130 2012 SOUSA C L NEVES E C A LOURENÇO L F H COSTA E B MONTEIRO R R C Microbiological and hygienicsanitary conditions diagnostic in light frozen food industry in BelémPA Alimentos e Nutrição Araraquara v20 n3 p 375381 2009 STEVENS A KEROUANTON A MARAUT M MILLEMANN Y BRISABOIS A CAVIN JF DUFOUR B 2008 Epidemiological analysis of Salmonella enterica from beef sampled in the slaughterhouse and retailers in Dakar Senegal using pulsed field electrophoresis and antibiotic susceptibility testing International Journal Food Microbiology v123 n3 p 191197 2008 57 LISTA DE ANEXOS Anexo 1 Seleção dos oligonucleotídeos utilizados no estudo com uso do BLAST httpblastncbinlmnihgovBlastcgi OBSERVAÇÃO os oligonucleotídeos estão destacados em amarelo e as sequências amplificadas em vermelho Staphylococcus aureus strain OSMRSA4666 FemA femA gene complete cds GenBank GQ2846421 LOCUS GQ284642 1263 bp DNA linear BCT 24MAR2010 DEFINITION Staphylococcus aureus strain OSMRSA4666 FemA femA genecomplete cds ACCESSION GQ284642 VERSION GQ2846421 GI291264205 KEYWORDS SOURCE Staphylococcus aureus ORGANISM Staphylococcus aureus Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcus AUTHORS GIANNOULI S LABROU M KYRITSIS A IKONOMIDIS A POURNARAS S STATHOPOULOS C AND TSAKRIS A TITLE Detection of mutations in the FemXAB protein family in oxacillinsusceptible mecApositive Staphylococcus aureus clinical isolates 58 JOURNAL J Antimicrob Chemother 65 4 626633 2010 JOURNAL Submitted 18JUN2009 Microbiology School of MedicineUniversity of Thessaly Mezourlo Larissa 41110 Greece FEATURES LocationQualifiers source 11263 organismStaphylococcus aureus moltypegenomic DNA strainOSMRSA4666 dbxreftaxon1280 noteclinical isolate gene 11263 genefemA CDS 11263 genefemA ECnumber232 noteaminoacyltransferase cell wall synthesis codonstart1 transltable11 productFemA proteinidADD853391 dbxrefGI291264206 translationMKFTNLTAKEFGAFTDSMPYSHFTQTVGHYELKLAEGYETHLVG IKNNNNEVIAACLLTAVPVMKVFKYFYSNRGPVIDYENQELVHFFFNELSKYVKKHRC LYLHIDPYLPYQYLNHDGEITGNAGNDWFFDKMSNLGFEHTGFHKGFDPVLQIRYHSV LDLKDKTADDIIKNMDGLRKRNTKKVKKNGVKVRYLSEEELPIFRSFMEDTSESKAFA DRDDKFYYNRLKYYKERVLVPLAYINFDEYIKELNEERDILNKDLNKALKDIEKRPEN KKAHNKRDNLQQQLDANEQKIEEGKRLQEEHGNELPISAGFFFINPFEVVYYAGGTSN AFRHFAGSYAVPWEMINYALNHGIDRFNFYGVSGKFTEDAEDAGVVKFKKGYNAEIIE YVGDFFKPIKKPVYAAYTALKKVKDRIF ORIGIN 1 atgaagttta caaatttaac agctaaagag tttggtgcct ttacagatag catgccatac 61 agtcatttca cgcaaactgt tggccactat gagttaaagc ttgctgaagg ttatgaaaca 121 catttagtgg gaataaaaaa caataataac gaggttattg cagcttgctt acttactgct 181 gtacctgtta tgaaagtgtt caagtatttt tattcaaatc gcggtccagt gatcgattat 241 gaaaatcaag aactcgtaca ctttttcttt aatgaattat caaaatatgt taaaaaacat 301 cgttgtctat acctacatat cgatccatat ttaccatatc aatacttgaa tcatgatggc 361 gagattacag gtaatgctgg taatgattgg ttctttgata aaatgagtaa cttaggattt 421 gaacatactg gattccataa aggatttgat cctgtgctac aaattcgtta tcactcagtg 481 ttagatttaa aagataaaac agcagatgac atcattaaaa atatggatgg acttagaaaa 541 agaaacacga aaaaagttaa aaagaatggt gttaaagtaa gatatttatc tgaagaagaa 601 ctaccaattt ttagatcatt tatggaagat acgtcagaat caaaagcttt tgctgatcgt 661 gatgacaagt tttattacaa tcgcttaaaa tattacaaag agcgtgtgtt agtgccttta 721 gcgtatatca attttgatga atatattaaa gaactaaatg aagagcgtga tattttaaat 781 aaagatttaa ataaagcatt aaaggatatt gaaaaacgtc ctgaaaataa aaaagcacat 841 aacaagcgag ataacttaca acaacaactt gatgcaaatg agcaaaagat tgaagaaggt 901 aaacgtcttc aagaagaaca tggtaatgaa ttacctatct ctgctggttt cttctttatc 961 aatccatttg aagttgttta ttatgctggt ggtacatcaa atgcattccg tcattttgcc 1021 ggaagttatg cagtgccctg ggaaatgatt aattatgcat taaatcatgg cattgaccgt 1081 tttaatttct atggtgttag tggtaaattt acagaagatg ctgaagatge Eggtgtagtt 1141 aaattcaaaa aaggttacaa tgctgaaatt attgaatatg ttggtgactt ttttaaacca 1201 attaaaaaac ctgtttacgc agcatatacc gcacttaaaa aagttaaaga cagaattttt 1261 tag Primer forward GCAGTGCCCTGGGAAATGA Primer reverse ACACCAGCATCTTCAGCATCT Reverso complementar AGATGCTGAAGATGCTGGTGT Salmonella enterica invasion protein invA gene partial cds GenBank U432721 LOCUS SEU43272 1950 bp DNA linear BCT 21MAR1997 DEFINITION Salmonella enterica invasion protein invA gene partial cds ACCESSION U43272 VERSION U432721 Gl1236874 KEYWORDS SOURCE Salmonella enterica ORGANISM Salmonella enterica 59 60 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Salmonella AUTHORS BOYD E F WANG F S WHITTAM T S AND SELANDER R K TITLE Molecular genetic relationships of the salmonellae JOURNAL Appl Environ Microbiol 62 3 804808 1996 AUTHORS BOYD E F LI J OCHMAN H AND SELANDER R K TITLE Comparative genetics of the invspa invasion gene complex of Salmonella enterica JOURNAL J Bacteriol 179 6 19851991 1997 JOURNAL Submitted 13DEC1995 E Fidelma Boyd OEB Harvard University 16 Divinity Ave Cambridge MA 02138 USA FEATURES LocationQualifiers source 11950 organismSalmonella enterica moltypegenomic DNA strainRKS1518 subspeciesI dbxreftaxon28901 map59 Min noteserovar Dublin gene 11950 geneinvA CDS 11950 geneinvA noteInvA membrane spanning protein codonstart1 transltable11 productinvasion protein proteinidAAC450561 dbxrefGI1236875 translationNSARLRPELLILVLMVMIISMFVIPLPTYLVDFLIALNIVLAIL 61 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gggttttgtt gtcttctcta ttgtcaccgt ggtccagttt 361 atcgttatta ccaaaggttc agaacgcgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat 421 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg 481 gatgctgcgc gcgaacggcg aagcgtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt 541 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg gcatcattat tatctttgtg 601 aactttattg gcggtatttc ggtggggatg gcccgccatg gtatggattt gtcctccgct 661 ctgtctactt ataccatgct gaccattggt gatggtcttg tcgcccagat ccccgcattg 721 ttgattgcga ttagtgccgg ttttatcgtg actcgcgtaa atggcgatag cgataatatg 781 gggcggaata tcatgacgca gctgttgaac aacccatttg tattggttgt tacggctatt 841 ttgaccattt caatgggaac tctgccggga ttcccgctgc cggtatttgt tattttatcg 901 gtggttttaa gcgtactctt ctattttaaa ttccgtgaag caaaacgtag cgccgccaaa 961 cctaaaacca gcaaaggcga gcagccgctt agtattgagg aaaaagaagg gtcgtcgttg 1021 ggactgattg gcgatctcga taaagtctct acagagaccg taccgttgat attacttgtg 1081 ccgaagagcc ggcgtgaaga tctggaaaaa gctcaacttg cggagcgtct acgtagtcag 1141 ttctttattg attatggcgt gcgcctgccg gaagtattgt tacgcgatgg cgagggcctg 1201 gacgataaca gcatcgtatt gttgattaat gagatccgtg ttgaacaatt tacggtctat 1261 tttgatttga tgcgagtggt aaattattcc gatgaagtcg tgtcctttgg tattaatcca sequência foi cortada Primer foward TGGATTTGTCCTCCGCTCTG Primer reverse CGTCATGATATTCCGCCCCA Reverso complementar TGGGGCGGAATATCATGACG