Aula Prática nº 03: Contagem Total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FURG ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS EQA DISCIPLINA MICROBIOLOGIA Professora Meritaine da Rocha AULA PRÁTICA Nº 03 CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS E PSICROTRÓFICOS 1 INTRODUÇÃO A contagem padrão em placas é utilizada tanto para grupos microbianos grandes tais como os aeróbios mesófilos os aeróbios psicrotróficos fungos filamentosos e leveduras entre outros bem como para grupos específicos tais como Staphylococcus aureus Bacillus cereus entre outros A contagem Total de Aeróbios Mesófilos também conhecida como Contagem Padrão em Placas é largamente utilizada como indicador geral de microorganismos bactérias em alimentos de onde são obtidas informações gerais sobre a qualidade dos produtos matériasprimas utilizadas processo vida útil entre outros Entretanto ela não é um indicativo de segurança porque não está relacionada diretamente a presença de patógenos SILVA et al 2017 Os microorganismos psicrotróficos podem ser definidos como aqueles microorganismos que podem crescer em temperatura de refrigeração 0 7C Dentre os microorganismos psicrotróficos temse as espécies dos gêneros Acinetobacter Aeromonas Bacillus Klebsiella Listeria Lactobacillus Pseudomonnas Shewanella entre outros Na contagem padrão em placas a qual quantifica células viáveis considerase que cada célula viável isolada em meio de cultura sólido incubada nas condições de tempo de temperatura adequados formará uma colônia visível Contudo cada colônia não é oriunda de apenas uma célula pois as bactérias podem permanecer agrupadas como cachos ou cadeias após a divisão celular Devido a isso os resultados não podem ser expressos em número de células e deverão ser expressos como unidades formadoras de colônia UFC por mL ou grama UFCg ou mL Na determinação de bactérias mesófilas aeróbias uma técnica utilizada é a de profundidade com incubação a 35C por 48 h SILVA et al 2017 TORTORA FUNKE CASE 2017 2 MATERIAIS E MÉTODOS 21 Materiais meios de cultivo diluentes e equipamentos Alça de Drigalski Béquer Estante para tubos de ensaio Facas garfos e colheres Placas de Petri esterilizadas Sacos estéreis Ágar padrão para contagem Erlenmeyer contendo 225 mL de água peptonada 01mv Placas de Petri contendo Ágar Padrão para Contagem PCA Tubos de diluição com tampa de rosca estéreis contendo 9 mL de água peptonada 01 mv Pipetas esterilizadas Estufa incubadora Incubadora 22 Coleta de amostras A análise deverá ser realizada rapidamente após a coleta das amostras sendo que as amostras de alimentos comercializados sob refrigeração deverão ser transportadas sob refrigeração até o momento da análise O transporte deverá ocorrer entre 0 e 44 C em um período máximo de 36 h entre a coleta e a análise 23 Preparo da amostra para a análise Antes de abrir a embalagem dos alimentos devese desinfetar as áreas externas com etanol 70 caso a embalagem seja flexível cortar com tesoura estéril Então devese proceder a retirada da unidade analítica quantidade de material retirado da amostra para ser utilizado em um ou mais ensaios Para tanto pesase cerca de 25 g 231 Primeira diluição da unidade analítica Para a realização da análise a unidade analítica deve ser diluída e homogeneizada em diluente adequado que nestas análises é a água peptonada estéril 01 O preparo da diluição inicial 101 ocorre através da homogeneização de 25 g da unidade analítica em 225 mL de a água peptonada estéril 01 em stomacher durante 1 min 2311 Diluições decimais seriadas O número de diluições seriadas depende do nível de contaminação esperado da amostra Entretanto deve ser em quantidade necessária para permitir a contagem em placas com um número adequado de colônias Primeiramente devese homogeneizar e retirar assepticamente 1 mL da primeira diluição 101 e adicionar em tubo de diluição contendo 9 mL de água peptonada estéril 01 Para as demais diluições devese transferir 1 mL da diluição anterior para 9 mL de diluente 24 Contagem total de microorganismos aeróbios mesófilos por profundidade pour plate Após o preparo da amostra e das diluições seriadas devese proceder ao processo de inoculação De cada diluição decimal seriada retirase 1 mL e adicionase no centro de um placa de Petri estéril vazia previamente identificada abrir a placa o suficiente para inserir a pipeta e trabalhar próximo ao bico de Bunsen Em seguida devese retirar o meio de cultura PCA da estufa 44 46 C e verter 20 25 mL nas placas inoculadas O meio e o inóculo deverão ser homogeneizados cuidadosamente em superfície plana em movimentos em forma de 8 ou em movimentos circulares oito a dez vezes no sentido horário e de oito a dez vezes no sentido antihorário Após a completa solidificação do meio de cultura PCA inverter as placas e incubar a 35 1 C durante 48 2 h respectivamente Após o período de incubação selecionar placas contendo de 25 a 250 colônias Então calcular o número de Unidades Formadoras de Colônia UFCg Para as duplicatas considerar como número de colônias a média aritmética da contagem de cada uma das placas da duplicata 25 Contagem de bactérias aeróbios psicrotróficas spread plate Após o preparo da amostra e das diluições seriadas devese proceder ao processo de inoculação De cada diluição decimal seriada retirase 01 mL com pipeta de no máximo 1 mL e inoculase na superfície de um placa de Petri contendo o meio de cultura PCA estéril solidificado O inóculo deverá ser espalhado por toda a superfície do meio com auxílio de uma alça de Drigalski até que todo o excesso do líquido seja absorvido fazer o espalhamento da placa com maior diluição para a menor diluição A alça de Drigalski deve ser flambada entre uma placa e outra As placas deverão ser incubadas invertidas a 7 1 C durante 10 dias respectivamente Após o período de incubação selecionar placas contendo de 25 a 250 colônias Então calcular o número de Unidades Formadoras de Colônia UFCg Para as duplicatas considerar como número de colônias a média aritmética da contagem de cada uma das placas da duplicata 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MADIGAN M T MARTINKO J M J PARKER Microbiologia de Brock Ed Artmed 14ª ed São Paulo 2016 NEDER R N MICROBIOLOGIA manual de Laboratório Livraria Nobel S A São Paulo 1992 RIBEIRO M C SOARES M M S R Microbiologia Prática Roteiro e Manual Bactérias e Fungos Ed Atheneu São Paulo Rio de Janeiro Belo Horizonte 1993 PELCZAR JR M CHAN E C S KRIEG N R Microbiologia Conceitos e Aplicações Makron Books do Brasil Editora Ltda v1 2ª ed São Paulo 1996 SILVA N JUNQUEIRA V C A ARRUDA SILVEIRA N F TANIWAKI M H GOMES R A R OKAZAKI M M SILVEIRA N F A Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 4ed São Paulo editora Varela 2010 TORTORA G J CASE C L FUNKE BI R Microbiologia12ª Edição Artmed Editora 2017