Slide - Tecnologia do Dna Recombinante - 2023-1

CLONAGEM INDEPENDENTE DE CÉLULAS VIVAS PCR POSSÍVEIS RESULTADOS APÓS A ETAPA DE TRANSFORMAÇÃO Célula bacteriana DNA cromossomal MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp Plasmídeo com inserto Plasmídeo sem inserto Sem plasmídeo Resistência à ampicilina LacZ não funcional Colônias brancas Resistência à ampicilina LacZ funcional Colônias azuis Sem resistência à ampicilina Sem gene LacZ Sem crescimento *MC = Meio de cultura CLONAGEM MOLECULAR RESUMO DAS ETAPAS: 1. Preparação do vetor e do inserto 2. Ligação do vetor e inserto 3. Transformação em célula hospedeira 4. Seleção de clones 1. Vetor plasmidial Fragmento de DNA a ser clonado 2. Inserção enzimática do DNA no vetor plasmidial 3. Misturar E. coli com os plasmídeos na presença de CaCl2 e aquecer rapidamente Cultivar em placas de ágar contendo ampicilina 4. Cromossoma de E. coli As células transformadas sobrevivem As células que não captaram o plasmídeo morrem em meio contendo ampicilina Formação de uma molécula de DNA recombinante EcoRI Hybridization Recombinant DNA molecule o Clonagem molecular → isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas 01. Fragmento de DNA de interesse chamado INSERTO é ligado a uma molécula de DNA → VETOR → DNA RECOMBINANTE 02. Molécula do DNA recombinante é introduzida em célula hospedeira compatível → TRANSFORMAÇÃO o Célula hospedeira → TRANSFORMANTE ou CÉLULA TRANSFORMADA o Transformante → divisões celulares – milhares de cópias de DNA recombinante ENZIMAS DE RESTRIÇÃO o Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases → SÍTIOS DE RESTRIÇÃO o CLIVAGENS: o 01. Cortes no eixo de simetria – extremidade abruptas ou cegas o 02. Cortes fora do eixo de simetria – extremidades coesivas E ASSIM RECOMBINO DNA Enzima de Restrição Ação da EcoR1 A enzima corta as duas fitas do DNA no mesmo sítio. O fragmento de DNA pode se ligar ao outro, com pontas adesivas. Ponta adesiva DNA exógeno Ponta adesiva AATTG DNA recombinante CLONAGEM DEPENDENTE DE CÉLULAS VIVAS CLONAGEM DE FRAGMENTOS DE DNA Ferramentas de clonagem: Enzimas: enzimas de restrição DNA ligase Vetores: plasmídios fagos (vírus de bactérias) cosmídios cromossomos artificiais vírus Hospedeiros: E. coli levedura células animais células vegetais DNA RECOMBINANTE Extremidades coesivas o pareamento das fitas simples – PH pela complementariedade das bases. Ligação fosfodiéster - DNA ligase DNA LIGASE DNA—3'—OH + —O—P—O—5'—DNA DNA-Ligase ATP ou NAD DNA—3—O—P—O—5'—DNA CLONAGEM GÊNICA OU CLONAGEM DE DNA DNA Ligase → Transformação VETORES DE CLONAGEM Insert: fragmento do DNA alvo a ser usado para a construção da molécula de DNA recombinante Quatro tipos de vetores para clonagem podem ser usados, dependendo do tamanho do inserto: - Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb Ex: pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET - Fago lambda - ~0,1 a 20 Kb - Cosmídeo - ~35 a 50 kb - Cromossomos artificiais de bactérias e leveduras - fragmentos maiores (BAC - ~100 kpb e YAC - 2 Mpb) Gene de interesse é cortado usando enzimas de restrição PLASMÍDEO o Capacidade de amplificar segmentos de DNA neles clonado o ORIGEM DE REPLICAÇÃO (O) → uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira; o MULTIPLOS SÍTIOS DE CLONAGEM (MSC) → é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem; GENE MARCADOR DOMINANTE SELECIONÁVEL → gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). CÉLULAS TRANSFORMADAS - são capazes de crescer em meio contendo o antibiótico. CÉLULAS NÃO TRANSFORMADAS - morrem VETORES DE CLONAGEM: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS - Origem de replicação Permite a auto-replicação, independente do cromossomo - Genes para resistência a antibióticos Permite que a célula hospedeira cresça em meio seletivo - Múltiplos sítios de clonagem Permite a inserção de DNA exógeno EcoRI DNA de interesse Plasmídeo Extremidades coesivas Ligação DNA recombinante PLASMÍDEO HÍBRIDO → inserido em uma bactéria → transformação o Inserto será replicado como parte do plasmídeo TRANSFORMAÇÃO QUÍMICA Suspensão de células competentes Moléculas de DNA recombinante Incubar 30 min no gelo Choque térmico (42°C/30 s) Poros – fase de crescimento exponencial Atração eletrostática Bombeamento do DNA Com cálcio a 0oC a fluidez da membrana celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2 cobrem as cargas negativas facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico causa um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA pela zona de adesão. SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES Construção Transformação Célula de E.coli Meio seletivo Clones recombinantes Ex: Meio com antibiótico (ampicilina) ©1998 GARLAND PUBLISHING PLASMÍDIO BACTERIANO - PBR322 EcoRI BamHI SalI Tetracycline resistance (tetR) Ampicillin resistance (ampR) PstI Origin of replication (ori) PvuII MC + ampicilina Células transformadas Clones resistentes a ampicilina Células controle (não transformadas) Clones sensíveis a ampicilina  Podem ser também utilizados marcadores que são inativados com a inserção do DNA estranho no plasmídio.  Exemplo: sistema de diferenciação branco-azul –PUC18 SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES PLASMÍDIO BACTERIANO PUC18 Plasmídios da série pUC possuem um gene (gene lacZ) que codifica a produção da enzima β- galactosidase. A inserção do DNA estranho no sítio de clonagem do plasmídeo causa a interrupção do gene → perda da função da β-galactosidase. PLASMÍDIO BACTERIANO PUC18 Cultura de bactérias em meio contendo x-gal → colônias azuis - sem inserto - ENZIMA β – galactosidase é sintetizada – degradação de x- gal – produto azul → colônias brancas - com inserto - ENZIMA β – galactosidase não é sintetizada - x-gal não é degradado – produto branco SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES Gene de resistência à ampicilina pUC8 Vieira & Messing, 1982 lacZ' gene Sítio múltiplo de clonagem HindIII PstI SalI, AccI, HincII BamHI SmaI, XmaI EcoRI Produção da enzima β-galactosidase X-gal é clivado = colônia azul Ágar + ampicilina + X-gal Não há produção da enzima β-galactosidase X-gal não é clivado = colônia branca Plasmídio bacteriano pUC18 REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE Polimerase Chain Reaction (PCR) Karl Mullis (1983) Prêmio Nobel 1993  Karl Mullis (1983) – Técnica de PCR – polymerase chain reaction – possibilita a amplificação “in vitro” de ácidos nucléicos. O advento da PCR acelerou os estudos de genomas de vários organismos, pois possibilitou a clonagem e o sequenciamento de DNA.  Karl Mullis (1987) – Patenteou a técnica e vendeu para a empresa Hoffmann-La Roche em 1991. REAÇÃO DE PCR DNA molde DNA polimerase H2O + tampão primers ATCG nucleotídeos Princípios da técnica de PCR  Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a partir da seqüência alvo;  Especificidade → uso de primers (iniciadores) específicos para o gene ou região do DNA de interesse;  INICIADORES → segmentos de nucleotídeos que são complementares as extremidades dos dois filamentos do fragmento a ser amplificado → delimitam o alvo a ser amplificado. • DNA em que a PCR é realizada → DNA genômico → células brancas do sangue, pêlos, tecidos • PCR cria cerca de 1 milhão de cópias de um segmento de DNA molde • Requisito básico → conhecer a sequência do segmento a ser amplificado ou a sequência de suas extremidades Princípios da técnica de PCR ETAPAS DA PCR 1) DESNATURAÇÃO – abertura da dupla fita do DNA (94° C/100° C) 2) ANELAMENTO (Hibridização) dos primers em T°C mais baixa 3) REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO (Síntese ou extensão) da fita complementar pela Taq DNA polimerase. Repetição por 30 a 40 ciclos Step 1 – desnaturação 1 minuto – 94ºC Step 2 – anelamento 45 segundos – 55ºC Step 3 – extensão 45 segundos – 72ºC dNTP’s 94° Denature 60° Annealing 72° Extending TAQ polimerase A AMPLIFICAÇÃO É EXPONENCIAL!! Gene desejado DNA Molde 1º ciclo 2º ciclo 4º ciclo 35 ciclos 2^2 = 2^3 = 4 cópias 8 cópias 16 cópias 32 cópias 2^36 = 60 bilhões de cópias TERMOCICLADOR Os resultados dos experimentos de PCR são verificados fazendo-se migrar uma mistura da reação amplificada em gel de agarose ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE Load DNA solutions in wells of gel. DNA solutions Attach power supply and begin electrophoresis. Remove gel from chamber, stain with ethidium bromide, and photograph under UV illumination. Platinum wire electrode Buffer Agarose gel + electrode - electrode Power supply Dye 1 2 3 4 5 6 7 8 3.2 kb 1.7 kb 1.5 kb Figure 15-21 part 2 Principles of Genetics, 4/e DETERMINAÇÃO DE TAMANHO DOS FRAGMENTOS  Migração em gel  Comparação dos padrões de migração DNA de fago  cortado com Hind III ➢ Padrão de bandas bem separadas ➢ É muito usado como marcador de tamanho molecular ➢ 1kb DNA ladder ANÁLISE EM GEL DE AGAROSE 400 pb a 350 pb b a b c d