Resolver Exercício

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS BIOQUÍMICA GENÉTICA NA AGROPECUÁRIA Profª Drª Ana Carolina Silva Siquieroli Universidade Federal de Uberlândia Campus Monte Carmelo Instituto de Biotecnologia SUMÁRIO NORMAS GERAIS 04 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA PROTEÍNAS 05 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA CARBOIDRARTOS 10 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA LIPÍDEOS 12 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA EXTRAÇÂO DE DNA VEGETAL 14 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA PCR16 4 Normas Gerais O uso de jalecos e calçado fechado no laboratório é obrigatório Use luvas óculos ou mascaras protetoras quando necessário Cabelos compridos sempre presos Sempre lavar as mãos na entrada e saída do laboratório Artigos de uso pessoal devem ser guardados em local apropriado Nunca sobre as bancadas Nunca fumar comer ou beber no laboratório Escute com muita atenção as instruções do professor e técnico responsável para a execução da prática Não jogue material nas pias Pergunte para o técnico responsável e use frascos de resíduos apropriados Em caso de acidente comunique o professor ou técnico responsável Não levar nada à boca nariz ou olhos Leia com atenção os rótulos dos frascos e dos reagentes Realizar pipetagem com dispositivo apropriado Nunca com a boca Recomendase a utilização de luvas em caso de ferimentos na pele das mãos Não manuseie sólidos e líquidos desconhecidos sem autorização Ao manusear reagentes e soluções utilize somente o necessário Ao ligar qualquer aparelho verifique a voltagem do mesmo 5 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA PROTEÍNAS EXPERIMENTO 1 PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA DE PROTEÍNAS Procedimento 1 Adicionar a um béquer de 250 mL 25 mL de leite 2 Aquecer a água destilada até aproximadamente 50C 3 Adicionar 25 mL de água aquecida ao béquer contendo leite 4 Adicionar HCI a 2 gota a gota e com agitação constante até que o leite coagule 5 Medir o pH da solução com papel indicador Observar o resultado e interpretar EXPERIMENTO 2 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS A 280 NM OBJETIVOS ESPECÍFICOS Quantificar a 280 nm as proteínas totais de diferentes amostras Procedimento 1 Cada grupo receberá uma amostra proteica para quantificar 2 Em um tubo acrescentar 1950 microlitros de água e 50 microlitros da amostra de proteína desconhecida agitar 3 Para calibrar o espectrofotômetro para o valor da absorbância zero será utilizado 2000 microlitros de água destilada na cubeta BLANK 4 O equipamento deve estar configurado para fazer a leitura a 280 nm Em seguida 6 Coloque o conteúdo do tubo solução proteica na cubeta e registre a leitura da absorbância 5 Quantificar a concentração de proteínas da amostra desconhecida Utilize a relação 1 Abs 1 mgml PROTEÍNA Valor da leitura em OD X 1 X Fator de diluição Abs 1 Abs 1 mglml Observar o resultado e interpretar 7 EXPERIMENTO 3 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA 1 OBJETIVOS Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas Analisar a influência do pH sobre a distribuição dessas cargas Compreender o processo de ionização das proteínas 2 PROCEDIMENTOS Serão divididos em três etapas 21 extração da caseína do leite 22 preparo de uma solução de caseína 23 determinação do ponto isoelétrico da caseína 21 Extração da caseína do leite 211 Material Leite solução de ácido acético CH3COOH 2M etanol CH3CH2OH 95 vv éter etílico CH3CH2OCH3CH2 béquer de 250 mL proveta de 100 mL contagotas funil e papel de filtro 212 Metodologia 1 Aquecer 150ml de água destilada a 38C 2 Adicionar 50 ml de leite e misturar bem 3 À solução acima gotejar a solução de ácido acético até o aparecimento de um precipitado abundante aproximadamente 07ml do ácido 4 Deixar descansando durante aproximadamente 20 minutos para sedimentação da proteína 5 Separar o sobrenadante por decantação 6 Ao precipitado adicionar 20ml de etanol e misturar bem 7 Filtrar e desprezar o filtrado só interessa o precipitado 8 Adicionar ao precipitado 5ml de éter etílico e misturar 9 Decantar o sobrenadante e secar o precipitado caseína em papel de filtro 8 22 Preparo da solução de caseína 221 Material caseína obtida na etapa anterior hidróxido de sódio NaOH 1M ácido acético CH3COOH 1M proveta de 50 mL béquer de 200 mL béquer de 100 mL papel indicador universal 222 Metodologia 1 Pesar aproximadamente 1g da caseína obtida na etapa anterior 2 Adicionar 50ml de água destilada para ressuspender a caseína 3 Adicionar 25ml da solução de NaOH e agitar lentamente para evitar a formação de espuma até completa dissolução da caseína 4 Adicionar 25ml de ácido acético 1M e agitar cuidadosamente 5 Ajustar o pH para um valor próximo da neutralidade utilizando para isso ácido ou base 23 Determinação do ponto isoelétrico da caseína 231 Material solução de caseína preparada acima ácido acético 2M ácido acético 1M ácido acético 01M ácido acético 001M nove tubos de ensaio papel indicador universal pipetas ou contagotas 232 Metodologia 1 Numere nove tubos de ensaio e distribua os reagentes quantidades em ml seguindo as indicações da primeira tabela 2 A cada tubo adicionar 05ml da solução de caseína preparada na etapa anterior 3 Agitar lentamente sem fazer espuma 4 Medir o pH em todos os tubos papel indicador universal ou pHmetro 5 Preencha a segunda tabela e discuta os resultados 9 SUBSTÂNCIA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Água destilada 40 44 43 37 35 25 05 39 37 Ácido acético 001M 05 Ácido acético 01M 01 02 08 Ácido acético 1M 10 20 30 Ácido acético 2M 08 10 RESULTADOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH turbidez Sugestão você pode adotar a seguinte escala para quanto à turbidez Disponível em httpwwwfcfarunespbralimentosbioquimicapraticasproteinaspontoisoeletricohtm 10 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA CARBOIDRATOS EXPERIMENTO 1 Prepare a seguinte bateria de tubos 1 Água destilada 1 ml reagente de Benedict 1ml 2 Sacarose 50 1ml reagente de Benedict 1ml 3 Lactose 1ml reagente de Benedict 1ml 4 Glicose 01M 1ml reagente de Benedict 1ml Aquecer em banhomaria fervente durante 5 minutos Após esfriar observar e explicar a diferença de coloração entre os tubos EXPERIMENTO 2 Prepare a seguinte bateria de tubos TUBO GLICOSE 01M AMIDO 1 ÁGUA DESTILADA BRANCO AMILASE LUGOL RESULTADOS 1 1 mL 1 mL 3 gotas 2 1 mL 3 gotas 3 1 mL 1 mL 3 gotas 4 1 mL 1 mL 3 gotas Observar e explicar a diferença de coloração entre os tubos 11 EXPERIMENTO 3 Prepare os tubos de ensaio com as seguintes soluções Agite Coloque em banhomaria fervente e deixe aquecer por cinco minutos Observe atentamente o que ocorre e explique a diferença entre tubos EXPERIMENTO 4 Prepare a seguinte bateria de tubos TUBO LEITE 1 LEITE 2 LUGOL RESULTADOS 1 1 mL 3 gotas 2 3 gotas Observar e explicar a diferença de coloração entre os tubos TUBO ÁGUA DESTILADA BRANCO GLICOSE 01M FRUTOSE 01M REAGENTE DE BENEDICT 1 1 mL 1 mL 2 1 mL 1 mL 3 1 mL 1 mL 12 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA LIPÍDEOS Formação do sabão solúvel BECKER ÓLEO NaOH EM ÁLCOOL Ferver em banho maria até obter uma mistura homogênea e quase endurecida Adicionar 20 mL de água destilada e homogeneizar talvez seja preciso aquecer novamente Agitar e observar a formação de espuma 1 2 mL soja 10 mL 2 2 mL Amendoin 10 mL Formação de sabão insolúvel Numerar três tubos de ensaio e proceder de acordo com a tabela abaixo TUBO 1 TUBO 2 TUBO3 Solução de sabão 2 mL 2 mL 2 mL Solução de NaCl 35 5 gotas Solução de HCl 01N 5 gotas Solução de CaCl2 5 gotas OBS Se necessário leve a mistura sabão obtida novamente ao banhomaria para dissolução Misturar por agitação e deixar em repouso por alguns minutos Descreva os resultados 13 Identificação da presença de ácidos graxos insaturados Esta reação é usada para investigar a presença de ácidos graxos insaturados ou determinar o grau de insaturação das gorduras e óleos Os ácidos graxos insaturados podem fixar halogênios nas suas ligações duplas havendo a adição de dois átomos do halogênio na ligação dupla presente no ácido graxo A incorporação do iodo ao ácido graxo pode ser determinada pelo teste com amido O iodo ligado ao ácido graxo é incapaz de reagir com o amido A adição do iodo a um ácido graxo saturado resultará na presença de todo o iodo livre que poderá então reagir com o amido adicionado produzindo a coloração azul característica A adição de iodo a um ácido graxo não saturado provocará adição de iodo nas duplas ligações do ácido graxo impedindo a presença do iodo livre que produziria a reação azul com o amido Este dado deverá ser interpretado com cautela pois a adição de uma quantidade de iodo livre que ultrapasse a capacidade de fixação por um ácido graxo insaturado também ocasionará a presença de iodo livre TUBO ÓLEO LUGOL Aquecer em banho Maria por cerca de 10 minutos AMIDO 2 RESULTADO 1 2 mL soja 6 gotas 3 gotas 2 6gotas 3 gotas Após o aquecimento aguardar o resfriamento do tubo 1 em temperatura ambiente antes de adicionar as gotas de amido O aparecimento de coloração azul indica reação entre o iodo e o amido Descreva os resultados 14 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA EXTRAÇÂO DE DNA VEGETAL 1 OBJETIVOS Obter ácido desoxirribonucleico DNA a partir de vegetais Visualizar DNA isolado Conhecer um pouco sobre as diferentes técnicas de extração de DNA utilizadas na pesquisa 2 MATERIAIS 1 Becker 200ml 2 Beckers 500 ml 1 Prato 1 Coador Garfo faca e colher de sobremesa Ralador cebola Luvas Recipiente para gelo ou banho maria gelado REAGENTES Água quente aproximadamente 60C Sal de cozinha Detergente líquido neutro Álcool gelado Gelo 1 Cebola média 3 METODOLOGIA Aquecera a água Preparar tampão de extração em um dos becker de 500 ml misturando bem meio copo de água quente 200 ml 2 colheres de sal 3 colheres de detergente Misturar bem a cebola com o tampão de extração no próprio Becker Esperar durante 10 a 15 minutos Esfriar a mistura colocando 2 a 3 cubos de gelo ao redor do Becker Esperar de 5 a 10 minutos Filtrar a mistura para outro Becker de 500 ml usando o coador Derramar vagarosamente o álcool gelado nas bordas do Becker com a mistura filtrada até formar uma camada de 2 a 3 cm de álcool sobre a mistura Após alguns instantes o DNA começará a aparecer junto com as bolhas e poderá ser pescado com o garfo ou colher 15 Anotações 16 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA PCR 1 OBJETIVO Preparar uma reação de polimerase em cadeia PCR a partir de um DNA molde 2 MATERIAIS DNAmolde 10ngµL 10mM Primer senso Forward 10mM Primer reverso Reverse 3 REAGENTES Um microtubo com a solução de mistura de dNTP a 10mM 10X Tampão de reação KCI 25mM MgCl2 5Uµl Taq DNA polimerase H2O ultrapura 3 METODOLOGIA Nomear 4 microtubos de reação Preparar o mix de reaçâo para o número de amostras necessário Pipetar o volume adequado do mix em cada tubo Adicionar o DNA molde Colocar os microtubos no termociclador e rodar o programa 4 Mix de reação REAGENTES CONCENTRAÇÃO ESTOQUE CONCENTRAÇÃO USO VOLUME PARA 1 REAÇÃO em µl VOLUME PARA REAÇÕES em µl Tampão de reação 10X MgCl2 25mM dNTP mix 10mM cada Primer senso 10mM Primer reverso 10mM H2O Deionizada DNA 10ngµl Total 17 Anotações