Cap 5 - Enzimas

Enzimas 5 I. VISÃO GERAL Praticamente todas as reações no corpo são mediadas por enzimas, as quais são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações, sem sofrerem alterações no processo global. Dentre as muitas reações biológicas que são energeticamente possíveis, as enzimas seletivamente dirigem suas reações (chamadas substratos) para rotas úteis. As enzimas dirigem, assim, todos os eventos metabólicos. Este capítulo examina a natureza dessas moléculas catalíticas e seu mecanismo de ação. II. NOMENCLATURA Cada enzima recebe dois nomes. O primeiro é um nome curto, o nome recomendado, conveniente para uso corriqueiro. O segundo é mais com- plexo, o nome sistemático, o qual é utilizado quando uma enzima precisa ser identificada sem ambigüidades. A. Nome recomendado Os nomes de enzimas mais comumente usados têm o sufixo "-ase" adicionado ao nome do substrato da reação (por exemplo, glucosidase, tri- pectidase), seguido da descrição da ação realizada (por exemplo, lacto- se desidrogenase ou piruvato-cinase). (Nota: Algumas enzimas man- têm seu nome trivial original, o qual não tem qualquer associação com a atividade enzimática, por exemplo, tripsina e pepsina.) B. Nome sistemático A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, de International Union of Biochemistry and Molecular Biology) desenvolveu um sistema de nomenclatura no qual as enzimas são divididas em seis classes principais (Figura 5.1), cada uma com numerosos subgrupos. O sufixo "-ase" é adicionado para completar a descrição da reação química catalisada, como por exemplo al-oxirreductaseb-3-fosfato: NAD-oxidorre dutase. Os nomes da IUBMB são exatos e informativos, mas às vezes são muito incommodos para o uso geral. 1. Oxidorredutases Catalisam reações de oxidorredução, como por exemplo: Figura 5.1 Exemplos das seis principais classes da classificação internacional das enzimas (THF é o tetrahidrofolato). 54 Pamela C. Champe, Richard A. Harvey, Denise R. Ferrier Figura 5.2 Representação esquemática de uma enzima com um sítio ativo, ligando-se a molécula de substrato. MITOCÔNDRIA Ciclo de Krebs Cadeia de elétrons Descaboxilação de piruvato CITOSOL Ciclo das pentoses Glicólise Síntese de ácidos graxos NÚCLEO Síntese de DNA e RNA LISSOMA Degradação de macromoléculas complexas Figura 5.3 Localização intracelular de algumas vias bioquímicas importantes. III. PROPRIEDADES DAS ENZIMAS As enzimas são catalisadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação química e não são consumidas durante a reação que catalisam. (Nota: Alguns tipos de RNA podem atuar como enzimas, geralmente catalisando a quebra e síntese de ligações fosfodiéster. Os RNAs com atividade catalítica são chamados ribozimas [veja a pág. 436] e são encontrados com muito menos frequência que as proteínas catalisadoras.) A. Sítios ativos As moléculas de enzimas contêm uma região específica formando uma fenda ou bolso, que é chamada sítio ativo. O sítio ativo contém cadeias laterais de aminoácidos, que ajudam a orientar o substrato e, também, partes na catálise da substrato (Figura 5.2). O sítio ativo ainda contém uma ferramenta-produto (EP), o qual subsequentemente se dissocia em enzima e produto. B. Eficiência catalítica A reações catalisadas por enzimas são, em sua maioria, altamente eficaz es, sendo do 10 a 10^8 vezes mais rápido que a reação não catalisada. Um único molécula de enzima pode converter numerosas moléculas de substrato por um segundo e chammae de número de revo- luzão (turnover). C. Especificidade As enzimas são altamente específicas, interagindo com ou alguns pou- cos substratos relacionados e catalisando apenas um pequeno número de reações químicas. D. Co-fatores Algumas enzimas se associam com um co-fator não-protéico, o qual é necessário para a atividade enzimática. Os co-fatores comumente encon- trados incluem íons metálicos, tais como Zn² ou Fe², e moléculas orgâ nicas, conhecidas como coenzimas, que frequentemente são derivadas de vitaminas. Por exemplo, a coenzima NAD+ contém nicotinamida, o FAD con- tém riboflavina e a enzima A contém ácido pantotênico. (Veja as páginas 371-379 para o papel das vitaminas como precursoras de coenzimas.) O composto da enzima com o seu co-fator é chamado holoenzima. A apoen- zima refere-se à porção protéica da holoenzima. Na ausência do co-fator apropriado, a apoenzima geralmente não mostra atividade biológica. A função de prostético é uma coenzima firmemente ligada à enzima, que não se dissocia com facilidade ex. a riboflavina ligada a flavincetes, veja a pág. 379. E. Regulação A atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem ser ativadas ou inibidas, de modo que a velocidade de formação do produto responda às necessidades da célula. Bioquímica Ilustrada 55 F. Localização dentro da célula Muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro da célula (Figura 5.3). Esta compartimentalização serve para isolar o subs trato ou o produto de outras reações competitivas. Isso garante o eixo favorável para a reação e organiza as milhares de enzimas presentes na célula em vias definidas. IV. COMO FUNCIONAM AS ENZIMAS O mecanismo da ação enzimática pode ser encarado de duas perspectivas diferentes. A primeira aborda a catálise em termos de alterações de energia que ocorrem durante a reação, ou seja, as enzimas fornecem uma rota de reaçóis, energeticamente favoreável, diferente da reação não-catalisada. A segunda perspectiva descreve como o sítio ativo facilita quimica- mente a catálise. A. Alterações de energia que ocorrem durante a reação Praticamente todas as reações têm uma barreira de energia separando o produto ou produtos. Essa barreira, denominada energia livre de ativa- ção, é a diferença de energia dos reagentes e aquário de um inte- rompimento da estrutura. Mesmo durante a formação do produto achatando o estado de transição, as algoras são atraentes ao energia durante a conversão de produtos que terá a mais altas amperes na energia durante a conversão estado de reduzida da energia total é menos ou etc do estado = T: d h * eiaa = T: 1. Energia livre de ativação. O pico de energia da Figura 5.4 é de di- fereuta da energia livre de ativação, T*, onde um intermediário pode ser alcançado a curva dos reagemtes e do produto. Apesar da conversão de reagentes ou pro- duto em um estado natural energia, na velocidades das reações enzimas catalisadas é colossante. 2. Velocidade da reação. Para as moléculas reagirem, devem coom energia suficiente para superar o barreira de energia do estado de tran-si- não mento para o intermediário e permitirá eia principais o energia, Para determinação da taxa de finalmente em enzimas cuja porção, nienia a enzinas grandes eo energia energia moleculas energizadas. Em geral, quanto menor a energia livre de ativação, mais moleculas têm energia energia para percorrer o estado de transição e, assim, mais rápida é a velocidade da reação. 3. Rota alternativa de reação. Uma enzima permite que uma reação ocorra rapidamente nas condições normais na célula, oferecendo uma ence de reação alternativa, com uma menor energia livre de ativação veja a Figura 5.4). A enzima não altera a energia livre dos reagentes ou dos produtos e, assim sendo, não altera o equilíbrio da reação. B. Química do sítio ativo O sítio ativo não é um receptáculo passivo para a ligação do substrato, mas sim uma máquina molecular complexa, empregando uma diversidade de mecanismos químicos para facilitar a conversão do substrato em produto. Diversos fatores são responsáveis pela eficiência catalítica das enzimas, incluindo os fatores considerados a seguir. Figura 5.4 Efeito de uma enzima sobre a energia de ativação de uma reação. C. Conclusões importantes sobre a cinética de Michaelis-Menten 1. Características do Km. Km – a constante de Michaelis – é característica de uma enzima e de determinada substância e, reflete a afinidade da enzima para aquele substrato. O Km é numericamente igual à concentração do substrato na qual a velocidade da reação é igual a Vmax. O Km não varia com a concentração da enzima. Km baixo. Um Km numericamente pequeno reflete uma alta afinidade da enzima pelo substrato, pois uma baixa concentração de substrato é suficiente para saturar parte ativa da enzima (aproximadamente metade destas), logo, a velocidade que é ½ Vmax (Figura 5.9). Km alto. Um Km numericamente grande (elevado) reflete uma baixa afinidade da enzima pelo substrato, pois é necessária uma alta concentração de substrato para atingir metade a velocidade máxima possível (Figura 5.9). 2. Relação entre a velocidade e a concentração da enzima. A velocidade máxima é diretamente proporcional à concentração da enzima. Assim, à concentração equivalente de enzima, a mistura que contém duplicada concentração da enzima terá duplicada velocidade da reação, ou seja, duas vezes Vmax. De forma similar, se a quantidade da enzima for reduzida à metade na mistura, a Vmax também será reduzida à metade da sua quantidade original. 3. Ordem de reação. Quando a [S] é muito menor que o Km, a velocidade da reação é aproximadamente proporcional à concentração de substrato. Isto é, a velocidade da reação é a primeira ordem relativamente à concentração do substrato. Quando a [S] é muito maior que o Km, a velocidade é constante e igual à Vmax, e é dita de ordem zero em relação à concentração de substrato (veja a Figura 5.10). D. Gráfico de Lineweaver-Burke Quando v0 é colocada em um gráfico contra [S], nem sempre é possível determinar quando a Vmax é atingida, devido à ascensão gradual da curva hiperbolética às altas concentrações de substrato. Entretanto, se colocarmos 1/v0 versus 1/[S], obtemos uma linha reta (Figura 5.11). Esse gráfico, o gráfico de Lineweaver-Burke (também chamado de gráfico de duplo-recíprocos) pode ser utilizado para calcular o Km e Vmax, assim como para determinar o mecanismo de ação de inibidores enzimáticos. 1. A equação que descreve o gráfico de Lineweaver-Burke é: 1/v0 = Km/Vmax [S] + 1/Vmax Figura 5.10 Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação para uma reação catalisada por enzima. Figura 5.11 Gráfico de Lineweaver-Burke. VII. INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA Qualquer substância que possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima é chamada de inibidor. Inibidores reversíveis ligam-se à enzima por meio de ligações não-covalentes. A diluição do complexo enzima-inibidor resulta na dissociação do inibidor reversível e também gera a recuperação da atividade enzimática. A inibição irreversível ocorre quando um ativador ligado não recusa sua atividade quando a concentração do inibidor é diluída. Os dois tipos mais comuns de inibição encontrados são inibição competitiva e inibição não-competitiva. A. Inibição competitiva Esse tipo de inibição ocorre quando o inibidor liga-se reversivelmente ao mesmo sítio que o substrato normalmente ocuparia, e, deste modo, concorre com o substrato por esse sítio. 1. Efeito sobre o Vmax. O efeito de um inibidor competitivo é revertido pelo aumento do [S]. Em uma concentração de substrato suficientemente alta, a velocidade da reação atinge a Vmax observada na ausência do inibidor (Figura 5.12). 2. Efeito sobre o Km. Um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para determinada substância. Isto requere mais substrato na presença de inibidor competitivo, mais substrato do que na ausência. 3. Efeito sobre a curva de Lineweaver-Burke. O inibidor competitivo apresenta uma curva da de Lineweaver-Burke caracteristicamente, na qual as várias curvas da reação inibida e não-inibida cruzam em 1/Vmax (Vmax não se altera). A presença de inibidor multiplica a inclinação e o eixo dos interceptos, indicando que o Km aparente é aumentado na presença do inibidor, enquanto o Vmax não é alterado (veja a Figura 5.12). Figura 5.12 A. Gráfico do efeito de um inibidor competitivo sobre a velocidade da reação (v0) versus substrato [S]. B. Gráfico de Lineweaver-Burke para a inibição competitiva de uma enzima. 4. Estatinas como exemplos de Inibidores competitivos. Esse grupo de drogas anti-hiperlipidemicas inibe competitivamente o primeiro passo comprometido com a síntese do colesterol. A reação é catalisada pela hidroximetilglutaril-CoA-redutase (HMG-CoA redutase, veja p. 219). As estatinas, tais como o atorvastatina (Lipitor) e a sinvastatina (Zocor), são análogos estruturais do substrato natural dessa enzima e, dessa forma, inibem a HMG-CoA redutase. Dessa forma, elas inibem a síntese de novo do colesterol e, assim, diminuem os níveis plasmáticos de colesterol (Figura 5.13). 8. Inibição não-competitiva Esse tipo de inibição pode ser reconhecido por seu efeito característico sobre Vmax (Figura 5.14). A inibição não-competitiva ocorre quando o inibidor e o substrato ligam-se a sítios diferentes sobre a enzima. O inibidor pode ligar-se já seja à enzima livre ou ao complexo ES, de modo a impedir a reação (Figura 5.13). 1. Efeito sobre a Vmax. A inibição não-competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração do substrato. Desse modo, não se observa deslocamento da Vmax da reação. 2. Efeito sobre o Km. Os inibidores não-competitivos não interferem na ligação do substrato ao sítio ativo da enzima. Assim, a enzima não competitiva soma-se à não-alteração do inibidor não-competitivo. 3. Efeito sobre a curva de Lineweaver-Burke. A inibição não-competitiva é matematicamente caracterizada pelo efeito na curva 1/v0 versus 1/[S], onde a Vmax diminui na presença do inibidor não-competitivo, enquanto o Km não é alterado (veja a Figura 5.14). Figura 5.13 A lovastatina compete com a HMG-CoA pelo sítio ativo da HMG-CoA-redutase. Figura 5.14 A. Gráfico do efeito de um inibidor não-competitivo sobre a velocidade da reação (v0) versus substrato [S]. B. Gráfico de Lineweaver-Burke para a inibição não-competitiva de uma enzima. 62 Pamela C. Champe, Richard A. Harvey, Denise R. Ferrier Figure 5.15 Um inibidor não-competitivo ligando-se à enzima e ao complexo enzima-substrato. 4. Exemplos de inibidores não-competitivos. Alguns inibidores agem pela formação de ligações covalentes com grupos específicos da enzima. Por exemplo, o chumbo forma ligações covalentes com os grupos sulfidrila da cadeia lateral de cisteína nas proteínas. A ligação do metal pesado resulta numa inibição não-reversível. A ferroquelatase, uma enzima que catalisa a inserção de Fe2+ no protoporfirina IX, cujo grupo heme, veja a pag. 277), é um exemplo de enzima sensível à inibição pelo chumbo. Outras enzimas sensíveis aos compostos organofosforados são certos inseticidas, cujos efeitos na acetilcolinesterase se dão pela sua ligação irreversível ao resíduo de serina no sítio ativo da enzima (uma enzima que cliva o neurotransmissor acetilcolina). c. Inibidores enzimáticos como drogas VIII. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA A regulação da velocidade das reações enzimáticas é essencial para ... 63 Biocromica Ilustrada 1. Efeitoes homotrópicos. Quando o substrato em si atua como efetor, o efeito é dito homotrópico. Um substrato alostérico funciona, mais frequentemente, como um efetor positivo. Nesse caso, a presença de uma molécula de substrato em um sítio da enzima aumenta as propriedades catalíticas de outros sítios de ligação ao substrato, isto é, esses sítios exibem cooperatividade. Essas enzimas apresentam uma curva sigmoide onde a velocidade de reação [v0] é relacionada com a concentração de substrato [S] (Figura 5.16). Isso contrasta com a curva hiperbólica característica das enzimas de Michaelis-Menten, conforme visto na Figura 5.5. O conceito de cooperatividade da ligação do substrato é análogo... Figura 5.18 Modificação covalente por adição e remoção de grupos fosfato. 64 Pamela C. Champe, Richard A. Harvey, Denise R. Ferrier Figura 5.19 Mecanismo de regulação da atividade enzimática. EVENTO REGULADOR | EFEITO/TIPO | RESULTADOS | TEMPO NECESSÁRIO PARA A ALTERAÇÃO Inibição pelo substrato | Substrato | Altera velocidade ( + ,- ) | Imediato Inibição pelo produto | Produto | Altera v_max e/ou K_m | Imediato ... ENZIMAS NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO As enzimas... como resultado de altos níveis de glucose no sangue, levam a um aumento na síntese de enzimas-chave no metabolismo da glucose (veja...) Figura 5.20 Liberação de enzimas a partir de células normais e de células doentes ou expostas a um trauma. lar lesão tecidual, que é acompanhada pela liberação aumentada de enzimas intracelulares (Figura 5.20). (Nota: Plasma é o fluido, a parte não-celular do sangue. Exames de laboratório para atividades enzimáticas mais frequentemente utilizam o soro, o qual é obtido pela centrifugação do sangue total após ter coagulado. O plasma é um líquido fisiológico, enquanto o soro é preparado no laboratório.) A. Alterações dos níveis plasmáticos de enzimas em doenças Muitas doenças que causam lesão tecidual resultam no aumento da liberação das enzimas intracelulares no plasma. As atividades de muitas dessas enzimas são rotineiramente determinadas para fins de diagnóstico em doenças do coração, do fígado, do músculo esquelético e de outros tecidos. O nível de atividade enzimática específica no plasma frequentemente correlaciona-se com a extensão da lesão tecidual. Assim, a determinação do grau de aumento da atividade de uma determinada enzima no plasma é um útil guia para avaliação do prognóstico do paciente. B. Enzimas plasmáticas como ferramentas diagnósticas Algumas enzimas apresentam atividade relativamente alta em apenas alguns tecidos. A presença em nível elevado dessas enzimas no plasma reflete uma liberação a partir de algum órgão específico. Por exemplo, a amilase e a lipase são secretadas pelo pâncreas. A alanina aminotransferase (ALT) no plasma é um indicador importante de lesão hepática. A determinação do nível plasmático dessas enzimas em doenças diferentes, tais como aquelas que causam aumento de secreção ou de lise do tecido, pode fornecer informações específicas sobre o sítio da lesão tecidual. Essa fala de enzima reflete, portanto, seu valor diagnóstico. C. Isoenzima e doença cardíaca A maioria das isoenzimas (também chamadas isoenzimas) são enzimas que catalisam a mesma reação que outras, mas não têm exatamente as mesmas propriedades físicas, como mobilidade eletroforética, ou diferenças nas sequências de seus aminoácidos. Por essa razão, as isoenzimas podem conter diferentes números de aminoácidos carregados e, portanto, podem ser separadas umas das outras por eletroforese (Figura 5.21). Diferentes órgãos frequentemente contêm proporções características de diferentes isoenzimas. O padrão de isoenzimas encontradas no plasma pode, desse modo, servir para identificar o sítio da lesão tecidual. Por exemplo, os níveis plasmáticos de creatina-kinase (CK) e de lactato-deshidrogenase (LDH) são comumente identificados para o diagnóstico do infarto do miocárdio. Eles são particularmente úteis quando o eletrocardiograma é de difícil interpretabilidade, como quando têm havido episódios prévios de doença cardíaca. 1. Estrutura quaternária das isoenzimas. Muitas isoenzimas contêm diferentes subunidades, em várias combinações. Por exemplo, a creatina-kinase ocorre como três isoenzimas. Cada isoenzima é um dímero, composto por dois polipeptídeos (chamados subunidades B e M) associados em três combinações: CK = BB, CK = BM e CK = MM. Cada uma das isoenzimas da CK apresenta uma mobilidade eletroforética característica (veja a Figura 5.21). 2. Diagnóstico de infarto do miocárdio. O músculo miocárdico é o único tecido que contém mais de 5% da atividade total da CK como a isoenzima CK2 (MB). O aparecimento dessa isoenzima no plasma é praticamente um diagnóstico patognomônico para o infarto do miocárdio. Após um infarto agudo do miocárdio, essa isoenzima aparece (em cerca de 4 a 8 horas do início da dor torácica) e atinge um pico de atividade em aproximadamente 24 horas (Figura 5.22). (Nota: A atividade de lactato-deshidrogenase também está elevada no plasma após infarto, atingindo um pico em 36 a 40 horas após o início dos sintomas. A atividade da LDH aparece, assim, valor diagnóstico para pacientes admitidos mais de 48 horas após o infarto — um período no qual a CK2 pode fornecer resultados equivocados.) 3. Novos marcadores para o infarto do miocárdio. Troponina T e troponina I são proteínas reguladoras, envolvidas na contratilidade do miocárdio. Elas são liberadas para o plasma em resposta ao dano cardíaco. Níveis elevados de troponina no soro são indicadores mais convencionais adversas são invisível de um infarto do miocárdio do que o ensaio convencional da CK2. X. RESUMO DO CAPÍTULO Enzimas são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade de uma reação química por diminuírem o estado de transição. As moléculas que podem ser catalisadas por reações de catálise enzimática contêm uma especificidade com uma ‘fenda’ chamada de sítio ativo. Este contém E + S (substrato e enzima), levando à formação do complexo enzima-substrato (ES). O ES é convertido para complexo produto (EP), que converte para os produtos liberados e a enzima. Algumas enzimas existem dentro da célula; um aumento da atividade em um tecido geralmente reflete a concentração. Ezimas podem não mostrar competitiva, caracterizadas pelos dois tipos mais comuns de inibição sob a competitiva (a qual aumenta o Km aparente) e a não-competitiva (na qual o Vmax é diminuída). Em contraste, as enzimas alostéricas, com múltiplas subunidades, frequentemente mostram uma curva sigmoidal, com aspecto semelhante à curva de dissociação do oxigênio da hemoglobina. Essas enzimas são frequentemente encontradas catalisando passos comprometidos (limitantes de velocidade) de uma via. As enzimas alostéricas são reguladas por moléculas chamadas de efetores (também modificadores), que ligam-se de forma não-alostérico como outra sítio. Os efetores podem ser positivos (aceleram as reações catalisadas pela enzima) ou negativos (diminuem a velocidade da reação). Um efetor alostérico pode alterar a afinidade da enzima pelo substrato ou modificar a atividade catalítica máxima da enzima ou ambos.