Metabolismo do Nitrogênio

13 Assimilação de Nutrientes Inorgânicos As plantas superiores são organismos autotróficos que podem sintetizar todos os seus componentes orgânicos a partir de nutrientes inorgânicos obtidos do ambiente Para muitos nutrientes minerais o processo envolve a absorção de compostos do solo pelas raízes ver Capítulo 5 e a incorporação em compostos orgânicos essenciais ao crescimento e ao desenvolvimento Essa incorporação dos nutrientes inorgânicos em substâncias orgânicas como pigmentos cofatores enzimáticos lipídeos ácidos nucleicos e aminoácidos é denominada assimilação de nutrientes A assimilação de alguns nutrientes em particular nitrogênio e enxofre envolve uma série complexa de reações bioquímicas que estão entre as reações de maior consumo energético dos organismos vivos Na assimilação do nitrato NO3 o nitrogênio do NO3 é convertido em uma forma mais energética mais reduzida o nitrito NO2 e depois em uma forma ainda mais energética mais reduzida ainda o amônio NH4 e finalmente em nitrogênio amida da glutamina Esse processo consome o equivalente a 12 ATPs para cada nitrogênio amida Plantas como as leguminosas estabelecem relações simbióticas com bactérias fixadoras de nitrogênio para converter o nitrogênio molecular N2 em amônia NH3 A amônia NH3 é o primeiro produto estável no processo natural de fixação entretanto em pH fisiológico a amônia é protonada para formar o íon amônio NH4 O processo de fixação biológica do nitrogênio junto com a subsequente assimilação de NH3 em um aminoácido consome o equivalente a cerca de 16 ATPs por nitrogênio amida A assimilação de sulfato SO42 no aminoácido cisteína por meio de duas rotas encontradas nas plantas consome cerca de 14 ATPs Para se ter uma ideia da enorme quantidade de energia envolvida devese considerar que se ocorressem rapidamente no sentido oposto por exemplo de NH4NO3 nitrato de amônio para N2 essas reações se tornariam explosivas liberando grandes quantidades de energia como movimento calor e luz Praticamente todos os explosivos incluindo a nitroglicerina o TNT trinitrotolueno e a pólvora são baseados na rápida oxidação de compostos de nitrogênio ou de enxofre 354 Unidade II Bioquímica e Metabolismo A assimilação de outros nutrientes especialmente os macronutrientes e os micronutrientes catiônicos ver Capítulo 5 envolve a formação de complexos com compostos orgânicos Por exemplo o Mg2 associase aos pigmentos clorofilas o Ca2 associase a pectatos na parede celular e o Mo6 associase a enzimas como a nitrato redutase e a nitrogenase Tais complexos são altamente estáveis sendo que a remoção do nutriente do complexo pode resultar na perda total de função Este capítulo resume as reações primárias pelas quais os principais nutrientes nitrogênio enxofre fosfato cátions como Mg2 e K e oxigênio são assimilados e discute os produtos orgânicos dessas reações São enfatizadas as implicações fisiológicas dos gastos energéticos requeridos e introduzse o tópico sobre a fixação simbiótica do nitrogênio As plantas servem como a principal via por meio da qual os nutrientes passam do ambiente geofísico mais lento para o ambiente biológico mais dinâmico este capítulo portanto destaca o papel vital da assimilação dos nutrientes vegetais na dieta humana Nitrogênio no meio ambiente Muitos compostos bioquímicos importantes das células vegetais possuem nitrogênio ver Capítulo 5 Por exemplo o nitrogênio é encontrado nos nucleotídeos e nos aminoácidos que formam a estrutura dos ácidos nucleicos e das proteínas respectivamente Nas plantas apenas elementos como o oxigênio o carbono e o hidrogênio são mais abundantes que o nitrogênio A maioria dos ecossistemas naturais e agrários apresenta um expressivo ganho na produtividade após serem fertilizados com nitrogênio inorgânico atestando a importância desse elemento e o fato de ele estar presente em quantidades abaixo do ideal Nesta seção são discutidos o ciclo biogeoquímico do nitrogênio o papel crucial da fixação de nitrogênio na conversão de nitrogênio molecular em amônio e em nitrato além do destino do amônio e do nitrato nos tecidos vegetais O nitrogênio passa por diferentes formas no ciclo biogeoquímico O nitrogênio está presente em muitas formas na biosfera A atmosfera contém uma vasta quantidade cerca de 78 por volume de nitrogênio molecular N2 ver Capítulo 9 Na maior parte esse grande reservatório de nitrogênio não está diretamente disponível para os organismos vivos A obtenção de nitrogênio da atmosfera requer a quebra de uma ligação tripla covalente de excepcional estabilidade entre os dois átomos de nitrogênio NN para produzir amônia NH3 ou nitrato NO3 Tais reações conhecidas como fixação do nitrogênio ocorrem por processos industriais e naturais TABELA 131 Principais processos do ciclo biogeoquímico do nitrogênio Processo Definição Taxa 1013 g ano1a Fixação industrial Conversão industrial do nitrogênio molecular em amônia 10 Fixação atmosférica Conversão fotoquímica e pelos relâmpagos do nitrogênio molecular em nitrato 19 Fixação biológica Conversão do nitrogênio molecular em amônia pelos procariontes 17 Obtenção pelos vegetais Absorção e assimilação do amônio ou do nitrato pelos vegetais 120 Imobilização Absorção e assimilação do amônio ou do nitrato por microrganismos NC Amonificação Catabolismo por bactérias e fungos da matéria orgânica do solo em amônio NC Anamox Oxidação anaeróbia do amônio conversão bacteriana do amônio e do nitrito em NC nitrogênio molecular Nitrificação Oxidação bacteriana Nitrosomonas sp do amônio em nitrito e posterior oxidação NC bacteriana Nitrobacter sp do nitrito em nitrato Mineralização Ação das bactérias e dos fungos no catabolismo da matéria orgânica do solo em NC nitrogênio mineral mediante amonificação ou nitrificação Volatilização Perda física do gás amônia para a atmosfera 10 Fixação do amônio Ligação física do amônio nas partículas do solo 1 Desnitrificação Conversão bacteriana do nitrato em óxido nitroso e nitrogênio molecular 21 Lixiviação do nitrato Escoamento físico do nitrato dissolvido na água subterrânea deixando as camadas 36 superiores do solo e finalmente chegando aos oceanos Nota Os organismos terrestres o solo e os oceanos possuem cerca de 52 x 1015 g e 95 x 1015 g e 65 x 1015 g respectivamente de nitrogênio orgânico que é ativo no ciclo Admitindose que a quantidade de N2 na atmosfera permaneça constante entradas saídas o tempo médio de residência o tempo médio que a molécula de nitrogênio permanece em formas orgânicas é cerca de 370 anos tamanho do poolfixação de entrada 52 x 1015 g 95 x 1015 g8 x 1013 g ano1 19 x 1013 g ano1 17 x 1013 g ano1 Schlesinger 1997 aNC não calculado Capítulo 13 Assimilação de Nutrientes Inorgânicos 355 Sob temperaturas elevadas cerca de 200C e pressão alta cerca de 200 atmosferas e na presença de um metal catalisador geralmente ferro o N2 combinase com hidrogênio para formar amônia As condições extremas são necessárias para superar a energia de ativação alta da reação Essa reação de fixação de nitrogênio conhecida como processo HaberBosch é o ponto de partida para a fabricação de muitos produtos industriais e agrícolas A produção industrial mundial de fertilizantes nitrogenados é superior a 110 milhões de toneladas métricas por ano 11 x 1013 g ano1 Os processos naturais que fixam cerca de 190 milhões de toneladas métricas por ano de nitrogênio são os seguintes Tabela 131 Relâmpagos Os relâmpagos são responsáveis por cerca de 8 do nitrogênio fixado pelos processos naturais Eles convertem o vapor de água e o oxigênio em radicais hidroxilas livres altamente reativos em átomos de hidrogênio livre e em átomos de oxigênio livre que atacam o nitrogênio molecular N2 formando o ácido nítrico HNO3 Posteriormente esse ácido nítrico precipitase sobre a Terra com a chuva Reações fotoquímicas Quase 2 do nitrogênio fixado são originados de reações fotoquímicas entre o óxido nítrico gasoso NO e o ozônio O3 produzindo o ácido nítrico HNO3 Fixação biológica do nitrogênio Os 90 restantes resultam da fixação biológica do nitrogênio em que bactérias ou cianobactérias algas azuis fixam o N2 em amônia NH3 Essa amônia dissolvese na água e forma o amônio NH4 NH3 H2O NH4 OH 131 Figura 131 O nitrogênio apresenta um ciclo na atmosfera mudando da forma gasosa à de íons reduzidos solúveis antes de ser incorporado a compostos orgânicos nos organismos vivos São apresentadas algumas das etapas envolvidas no ciclo do nitrogênio Do ponto de vista agrícola a fixação biológica do nitrogênio é crucial pois os fertilizantes à base de nitrogênio produzidos industrialmente apresentam custos econômicos e ambientais além de não estarem acessíveis a muitos agricultores pobres Uma vez fixado em amônia ou nitrato o nitrogênio entra no ciclo biogeoquímico passando por várias formas orgânicas ou inorgânicas antes de finalmente retornar à forma de nitrogênio molecular Figura 131 ver também Tabela 131 Os íons amônio NH4 e nitrato NO3 da solução do solo gerados pela fixação ou liberados pela decomposição da matéria orgânica tornamse alvos de intensa competição entre plantas e microrganismos Para serem competitivos os vegetais desenvolveram mecanismos para capturar rapidamente esses íons da solução do solo ver Capítulo 5 Quando em concentrações elevadas no solo que ocorrem após a fertilização a absorção do amônio e do nitrato pelas raízes pode exceder a capacidade de uma planta de assimilar esses íons levando à sua acumulação nos tecidos vegetais Amônio ou nitrato não assimilados podem ser perigosos O amônio se acumulado em níveis elevados nos tecidos vivos é tóxico tanto para plantas quanto para animais O amônio dissipa os gradientes de prótons transmembrana Figura 132 necessários para o transporte de elétrons na fotossíntese e na cadeia respiratória ver Capítulos 7 e 12 bem como para o sequestro de metabólitos nos vacúolos Assimilação do nitrato As raízes dos vegetais absorvem ativamente o nitrato da solução do solo através de vários cotransportadores nitratoprótons de baixa e de alta afinidade ver Capítulo 6 Os vegetais por fim assimilam a maior parte do nitrato em compostos orgânicos A primeira etapa do processo é a conversão do nitrato em nitrito no citosol uma reação de redução ver Capítulo 12 propriedades redox que envolve a transferência de dois elétrons A enzima nitrato redutase catalisa essa reação NO3 NADPH H NO2 NADP H2O 132 onde NADPH indica o NADH ou o NADPH A forma mais comum da enzima nitrato redutase utiliza somente o NADH como doador de elétrons uma outra forma da enzima encontrada predominantemente em tecidos não clorofilados como raízes pode usar tanto o NADH quanto o NADPH As nitrato redutase das plantas superiores são formadas por duas subunidades idênticas com três grupos prostéticos cada flavina adenina dinucleotídeo FAD heme e um complexo formado pelo molibdênio e uma molécula orgânica denominada pterina A nitrato redutase é a principal proteína contendo molibdênio nos tecidos vegetativos um dos sintomas da deficiência do molibdênio é a acumulação de nitrato resultante da diminuição da atividade da nitrato redutase A utilização de cristalografia de raio X e a comparação de sequências de aminoácidos da nitrato redutase de diversas espécies com aquelas de outras proteínas já caracterizadas que se ligam ao FAD ao heme ou ao molibdênio resultaram em um modelo multimodínios para a nitrato redutase um modelo simplificado de três domínios é apresentado na Figura 133 O domínio de ligação do FAD aceita dois elétrons do NADH ou do NADPH Os elétrons são então deslocados pelo domínio heme para o complexo molibdênio onde são transferidos para o nitrato Muitos fatores regulam a nitrato redutase O nitrato a luz e os carboidratos interferem na nitrato redutase em níveis de transcrição e tradução Em plântulas de cevada o mRNA da nitrato redutase foi detectado cerca de 40 minutos após a adição do nitrato e os níveis máximos foram obtidos em 3 horas Figura 134 Ao contrário da rápida acumulação do mRNA houve um incremento gradual e linear na atividade da nitrato redutase representando que a síntese dessa proteína necessita da presença do mRNA da nitrato redutase Além disso a proteína está sujeita à modificação póstradução envolvendo uma fosforilação reversível análoga à regulação da sacarose fosfato sintase ver Capítulos 8 e 11 A luz os níveis de carboidratos e outros fatores ambientais estimulam a proteína fosfatase que desfosforila um resíduo de serina chave na região do hinge 1 da nitrato redutase entre o complexo molibdênio e os domínios de ligação heme ver Figura 133 ativando a enzima Agindo na direção inversa o escuro e o Mg2 estimulam a proteína quinase a qual fosforila os mesmos resíduos de serina que depois interagem com a proteína inibidora 1433 e assim inativam a nitrato redutase A regulação da atividade da nitrato redutase por meio da fosforilação e da dessfosforilação proporciona um controle mais rápido que o obtido pela síntese ou degradação da enzima minutos versus horas A nitrito redutase converte o nitrito em amônio O nitrito NO2 é um íon altamente reativo e potencialmente tóxico As células vegetais transportam imediata tremoçobranco Lupinus albus a maior parte do nitrato é metabolizada nas raízes Figura 136 Em geral espécies nativas de regiões de clima temperado dependem mais intensamente da assimilação do nitrato pelas raízes que espécies de regiões tropicais e subtropicais Assimilação do amônio As células vegetais evitam a toxicidade do amônio pela rápida conversão do amônio gerado a partir da assimilação do nitrato ou da fotorrespiração ver Capítulo 8 em aminoácidos A principal rota para essa conversão envolve as ações sequenciais da glutamina sintetase e da glutamato sintase Nesta seção são discutidos os processos enzimáticos que medeiam a assimilação do amônio em aminoácidos essenciais além do papel das amidas na regulação do metabolismo do nitrogênio e do carbono A conversão do amônio em aminoácidos requer duas enzimas A glutamina sintetase GS combina o amônio com o glutamato para formar a glutamina Figura 137A Glutamato NH4 ATP glutamina ADP P 134 Essa reação necessita da hidrólise de uma molécula de ATP e envolve um cátion bivalente como Mg2 Mn2 ou Co2 como um cofator As plantas possuem duas classes de GS uma no citosol e a outra nos plastídios das raízes ou nos cloroplastos das partes aéreas As formas citosólicas são expressas durante a germinação de sementes ou no sistema vascular das raízes e das partes aéreas produzindo glutamina para o transporte do nitrogênio intracelular A GS nos plastídios das raízes forma o nitrogênio amida que é consumido localmente enquanto a GS dos cloroplastos das partes aéreas reassimila o NH4 da fotorrespiração Tanto os níveis de carboidratos quanto os de luz alteram a expressão das formas dessa enzima presentes nos plastídios mas apresentam pouco efeito nas formas citosólicas Os níveis elevados de glutamina nos plastídios estimulam a atividade da glutamato sintase conhecida como glutamina2oxoglutarato aminotransferase ou GOGAT Essa enzima transfere o grupo amida da glutamina para o 2oxoglutarato produzindo duas moléculas de glutamato ver Figura 137A As plantas possuem dois tipos de GOGAT um recebe elétrons do NADH e o outro elétrons da ferredoxina Fd Glutamina 2oxoglutarato NADH H 2 glutatamato NAD 135 Glutamina 2oxoglutarato Fdred 2 glutatamato Fdox 136 A enzima do tipo NADH NADHGOGAT está localizada nos plastídios de tecidos não fotossintetizantes como raízes ou feixes vasculares de folhas em desenvolvimento Nas raízes a NADHGOGAT está envolvida na assimilação do NH4 absorvido da rizosfera porção do solo localizada próximo à superfície das raízes nos feixes vasculares de folhas em desenvolvimento a NADHGOGAT assimila a glutamina translocada das raízes ou de folhas senescentes A Amônio NH4 Glutamato Glutamina sintetase GS ATP ADP Pi Glutamina 2oxoglutarato Glutamato sintase GOGAT NADH H or Fred NAD or Fdox 2 glutamatos B Amônio NH4 Glutamato desidrogenase GDH NADPH NADP Glutamato H2O 2oxoglutarato C Aspartato aminotransferase AspAT Glutamato Oxalacetato Aspartato 2oxoglutarato D Asparagina sintetase AS ATP AMP PPi Glutamina Aspartato Asparagina Glutamato Figura 137 Estrutura e rotas de síntese de compostos envolvidos no metabolismo do amônio O amônio pode ser assimilado por um de vários processos A Rota da GSGOGAT que forma a glutamina e o glutamato É necessário um cofactor reduzido para a reação a ferredoxina Fd nas folhas verdes e o NADH nos tecidos não fotossintetizantes B Rota da GDH que forma o glutamato utilizando o NADH ou o NADPH como agente redutor C Transferência do grupo amino do glutamato para o oxalacetato para formar o aspartato catalisado pela enzima aspartato aminotransferase D Síntese da asparagina pela transferência de um grupo aminoácido da glutamina para o aspartato catalisado pela enzima asparagina sintetase A glutamato sintase do tipo dependente de ferredoxina FdGOGAT é encontrada nos cloroplastos e age no metabolismo fotorrespiratório do nitrogênio Tanto a quantidade de proteína quanto sua atividade aumentam com os níveis de luz As raízes em particular aquelas sob nutrição com nitrato têm FdGOGAT nos plastídios Provavelmente a finalidade da FdGOGAT das raízes seja incorporar a glutamina gerada durante a assimilação do nitrato Os elétrons para reduzir Fd nas raízes são gerados pela via oxidativa da pentose fosfato ver Capítulo 12 O amônio pode ser assimilado por uma rota alternativa A glutamato desidrogenase GDH catalisa uma reação reversível que sintetiza ou desamina o glutamato Figura 137B 2oxoglutarato NH4 NADPH glutamato H2O NADP 137 Uma forma da GDH dependente de NADH é encontrada nas mitocôndrias e uma forma dependente de NADPH ocorre nos cloroplastos de órgãos fotossintetizantes Embora ambas as formas sejam relativamente abundantes elas não podem substituir a rota da GSGOGAT para a assimilação do amônio tendo como função principal desaminar o glutamato durante a realocação do nitrogênio ver Figura 137B As reações de transaminação transferem o nitrogênio Uma vez assimilado em glutamina e glutamato o nitrogênio é incorporado a outros aminoácidos por meio de reações de transaminação As enzimas que catalisam tais reações são conhecidas como aminotransferases Um exemplo é a aspartato aminotransferase AspAT que catalisa a seguinte reação Figura 137C Glutamato oxaloacetato 2oxoglutarato aspartato 138 em que o grupo amino do glutamato é transferido para o grupo carboxila do oxalacetato O aspartato é um aminoácido que participa do transporte malatoaspartato do processo de transferência de equivalentes redutores das mitocôndrias e dos cloroplastos para o citosol ver Tópico 125 na internet bem como do transporte do carbono a partir das células do mesófilo até a bainha do feixe vascular no processo de fixação C4 do carbono ver Capítulo 8 Todas as reações de transaminação requerem o piridoxal fosfato vitamina B6 como cofactor As aminotransferases são encontradas no citoplasma nos cloroplastos nas mitocôndrias nos glioxissomos e nos peroxissomos As aminotransferases localizadas nos cloroplastos podem desempenhar um papel importante na biossíntese dos aminoácidos pois folhas ou cloroplastos isolados expostos ao dióxido de carbono marcado radiativamente incorporam rapidamente a marca em glutamato aspartato alanina serina e glicina A asparagina e a glutamina unem o metabolismo do carbono e do nitrogênio A asparagina isolada pela primeira vez do aspargo em 1806 foi a primeira amida identificada Esse aminoácido não atua apenas como um componente de proteínas mas como um elementochave no transporte e no armazenamento do nitrogênio devido à sua estabilidade e à alta razão nitrogêniocarbono 2 N para 4 C da asparagina contra 2 N para 5 C da glutamina e 1 N para 5 C do glutamato A principal rota para a síntese da asparagina envolve a transferência do nitrogênio amida da glutamina para aspartato Figura 137D Glutamina aspartato ATP glutamato asparagina AMP PPi 139 A asparagina sintetase AS enzima que catalisa essa reação é encontrada no citosol de células das folhas e das raízes e nos nódulos que fixam o nitrogênio ver seção Fixação do nitrogênio por bactérias Em raízes de milho Zea mays sobretudo aquelas sob níveis potencialmente tóxicos de amônia o amônio pode substituir a glutamina como fonte do grupo amida Níveis altos de luz e de carboidratos condições que estimulam a GS e a FdGOGAT dos plastídios inibem a expressão dos genes que codificam a AS e a atividade da enzima A regulação antagônica dessas rotas competitivas auxilia no equilíbrio do metabolismo do carbono e do nitrogênio nos vegetais As condições de ampla energia ie com níveis altos de luz e de carboidratos estimulam a GS ver Equação 134 e a GOGAT ver Equações 135 e 136 e inibem a AS assim elas favorecem a assimilação do nitrogênio em glutamina e em glutamato compostos que são ricos em carbono e que participam da síntese de novos materiais vegetais Por outro lado condições limitadas de energia inibem a GS e a GOGAT e estimulam a AS favorecendo portanto a assimilação do nitrogênio em asparagina um composto rico em nitrogênio e suficientemente estável para ser transportado a longas distâncias ou armazenado por muito tempo Biossíntese de aminoácidos Os seres humanos e a maioria dos animais não conseguem sintetizar certos aminoácidos como histidina isoleucina leucina lisina metionina fenilalanina treonina triptofano valina e arginina no caso de seres humanos jovens os adultos conseguem sintetizar a arginina tendo que obter esses aminoácidos denominados essenciais a partir da dieta Por outro lado as plantas sintetizam todos os 20 aminoácidos encontrados nas proteínas O grupo amino contendo o nitrogênio como discutido nas seções anteriores é derivado de reações de transaminações com glutamina ou glutamato O esqueleto de carbono dos aminoácidos é derivado do 3fosfoglicerato do fosfoenolpiruvato ou do piruvato gerados durante a glicólise ou ainda do 2oxoglutarato ou do oxalacetato formados no ciclo do ácido cítrico Figura 138 Partes dessas rotas utilizadas para a síntese dos aminoácidos essenciais são alvos apropriados de herbicidas como o Roundup ver Capítulo 2 pois elas não estão presentes nos animais Assim substâncias que bloqueiam essas rotas são letais para as plantas mas em concentrações baixas não causam danos aos animais Fixação biológica do nitrogênio A fixação biológica representa a forma mais importante de fixar o nitrogênio atmosférico N2 em amônio Desse modo ela representa o pontochave do ingresso do nitrogênio molecular no ciclo biogeoquímico desse elemento ver Figura 131 Nesta seção são abordadas as reações simbióticas entre organismos fixadores de nitrogênio e plantas superiores os nódulos estruturas especializadas formadas nas raízes infectadas por bactérias fixadoras de nitrogênio as interações genéticas e sinalizadoras que regulam a fixação do nitrogênio pelos procariotos simbióticos e por seus hospedeiros e as propriedades das enzimas nitrogenases responsáveis pela fixação do nitrogênio Figura 138 Rotas biossintéticas dos esqueletos de carbono dos 20 aminoácidospadrão Cisteína Glicina Serina Glicose 3fosfoglicerato Tirosina Fenilalanina Fosfoenolpiruvato Alanina Piruvato Triptofano Leucina Valina Oxalacetato Aspartato Asparagina Ciclo do ácido cítrico Lisina Metionina Treonina Isoleucina 2oxoglutarato Glutamato Prolina Argina Glutamina Histidina Bactérias fixadoras de nitrogênio de vida livre e simbióticas Conforme já mencionado certas bactérias podem converter o nitrogênio atmosférico em amônio Tabela 132 A maior parte desses organismos procariótos fixadores de nitrogênio vive no solo geralmente de forma independente de outros organismos Vários formam associações simbióticas com plantas superiores nas quais o procarionte fornece nitrogênio fixado diretamente para a planta hospedeira em troca de outros nutrientes e de carboidratos ver parte superior da Tabela 132 Essas simbioses ocorrem nos nódulos formados nas raízes dos vegetais contendo bactérias fixadoras O tipo mais comum de simbiose ocorre entre as espécies da família Fabaceae leguminosas e as bactérias do solo dos gêneros Azorhizobium Bradyrhizobium Mesorhizobium Rhizobium e Sinorhizobium coletivamente chamadas de rizóbios Tabela 133 e Figura 139 Outro tipo comum de simbiose ocorre entre várias espécies de plantas lenhosas como o amieiro Alnus e bactérias do solo do gênero Frankia essas plantas são conhecidas como actinorrízicas Ocorrem ainda outros tipos de simbioses fixadoras de nitrogênio como na herbácea sulamericana Gunnera e na diminuta pteridófita aquática Azolla as quais formam associações com as cianobactérias Nostoc e Anabaena respectivamente Figura 1310 ver também Tabela 132 Fi Figura 139 Nódulos em raiz de feijoeiro Phaseolus vulgaris Os nódulos estruturas esféricas são o resultado da infecção por Rhizobium sp TABELA 132 Exemplos de organismos que podem realizar a fixação do nitrogênio FIXAÇÃO SIMBIÓTICA DO NITROGÊNIO Planta hospedeira Simbiontes fixadores de N Leguminosas e Parasponia Azorhizobium Bradyrhizobium Mesorhizobium Rhizobium Sinorhizobium Actinorrízicas Alnus árvore Ceanothus arbusto Casuarina árvore Datisca arbusto Frankia Gunnera Nostoc Azolla pteridófita aquática Anabaena Canadeaçúcar Acetobacter Miscanthus Azospirillum FIXADORES DE NITROGÊNIO DE VIDA LIVRE Tipo Gêneros fixadores de N Cianobactérias algas azuis Anabaena Calothrix Nostoc Outras bactérias Aeróbias Azospirillum Azotobacter Beijerinckia Derxia Facultativas Bacillus Klebsiella Anaeróbias Não fotossintetizantes Clostridium Methanococcus arqueobactéria Fotossintetizantes Chromatium Rhodospirillum TABELA 133 Associações entre plantas hospedeiras e rizóbios Planta hospedeira Rizóbios simbiontes Parasponia não leguminosa antigamente chamada de Trema Bradyrhyzobium spp Soja Glycine max Bradyrhyzobium japonicum tipo com crescimento lento Sinorhizobium fredii tipo com crescimento rápido Alfafa Medicago sativa Sinorhizobium meliloti Sesbania aquática Azorhizobium forma nódulos nas raízes e no caule no caule desenvolvemse raízes adventícias Feijoeiro Phaseolus Rhizobium leguminosarum bv phaseoli R tropicii R etli Trevo Trifolium Rhizobium leguminosarum bv trifolii Ervilha Pisum sativum Rhizobium leguminosarum bv viciae Aeschynomene aquática Clado Bradyrhizobium fotossintetizante rizóbios fotossinteticamente ativos que formam nódulos no caule provavelmente associados a raízes adventícias Figura 1310 Heterocisto presente em um filamento da cianobactéria Anabaena fixadora de nitrogênio a qual forma associações com Azolla uma pteridófita aquática Os heterocistos com paredes espessas intercalados entre as células vegetativas têm um ambiente interno anaeróbio que permite à cianobactéria fixar nitrogênio em condições aeróbias Figura 1311 Os fatores Nod são oligossacarídeos de lipoquitina A cadeia de ácido graxo apresenta normalmente de 16 a 18 carbonos O número de seções intermediárias repetidas n em geral é dois ou três De Stokkermans et al 1995 íons cálcio CaMK calmodulindependent protein kinase que está associada a uma proteína com função desconhecida denominada CYCLOPS Após a célula da epiderme ter reconhecido a oscilação continuada dos íons cálcio o regulador de transcrição responsivo ao fator Nod associase diretamente a promotores de genes induzidos por fator Nod O processo global conectando a percepção do fator Nod no nível da membrana plasmática a alterações da expressão gênica no núcleo é denominado rota simbiótica devido ao compartilhamento de elementos com o processo pelo qual os fungos micorrízicos arbusculares interagem com seus hospedeiros ver Capítulos 5 e 23 A formação do nódulo envolve fitormônios Os dois processos infecção e organogênese do nódulo ocorrem simultaneamente durante a formação do nódulo da raiz Os rizóbios em geral infectam os pelos das raízes liberando inicialmente fatores Nod que induzem um pronunciado enrolamento das células desses pelos Figura 1312A e B Os rizóbios tornamse envolvidos por um pequeno comFigura 1312 Processo de infecção durante a organogênese do nódulo A Os rizóbios ligamse a um pelo emergente da raiz em resposta a atrativos químicos liberados pela planta B Em resposta aos fatores produzidos pelas bactérias o pelo da raiz exibe um enrolamento anormal e as células dos rizóbios crescem dentro dos enrolamentos C A degradação localizada da parede celular do pelo da raiz leva à infecção e à formação do canal de infecção a partir das vesículas secretoras do Golgi das células da raiz D O canal de infecção atinge a extremidade da célula e sua membrana fusionase com a membrana plasmática da célula do tricoma da raiz E Os rizóbios são liberados no apoplasto e penetram no complexo da lamela média para a membrana plasmática da célula subepidérmica iniciando um novo canal de infecção que forma um canal aberto com o primeiro F O canal de infecção estendese e ramificase até atingir as célulasalvo onde as vesículas compostas de membranas vegetais que envolvem as células bacterianas são liberadas no citosol partimento formado pelo enrolamento A parede celular do pelo também é degradada nessas regiões em resposta aos fatores Nod permitindo às células bacterianas o acesso direto à superfície externa da membrana plasmática A próxima etapa é a formação de um canal de infecção Figura 1312C uma extensão interna tubular da membrana plasmática que é produzida pela fusão de vesículas derivadas do Golgi no local da infecção O canal cresce em seu ápice pela fusão de vesículas secretoras na extremidade do tubo Na região mais profunda do córtex próximo ao xilema as células corticais desdiferenciamse e iniciam a divisão formando uma área distinta no córtex denominada primórdio nodular a partir da qual o nódulo irá se desenvolver Os primórdios nodulares são formados em posição oposta aos polos do protoxilema do sistema vascular da raiz ver Tópico 131 na internet Compostos de sinalização diferentes atuando positiva ou negativamente controlam o desenvolvimento dos primórdios modulares Os fatores Nod ativam a sinalização localizada da citocinina no córtex e periciclo da raiz levando à supressão localizada do transporte polar da auxina o qual estimula a divisão celular e induz a morfogênese do nódulo O etileno é sintetizado na região do periciclo difundese para o córtex e bloqueia a divisão celular em posição oposta aos polos de floema da raiz O canal de infecção preenchido pelos rizóbios em proliferação alongase através do pelo da raiz e das camadas de células corticais em direção ao primórdio nodular Quando o canal de infecção atinge as células especializadas do primórdio nodular sua extremidade fusionase com a membrana plasmática de uma célula hospedeira e penetra no citoplasma Figura 1312D Subsequentemente as células bacterianas são liberadas no citoplasma circundadas pela membrana plasmática da célula hospedeira resultando na formação de uma organela denominada simbiossomo A ramificação do canal de infecção no interior do nódulo permite que a bactéria infecte muitas células Figura 1312E e F Inicialmente as bactérias no interior do simbiossomo continuam a se dividir e a membrana que os envolve também denominada membrana bacterioide aumenta em área de superfície para acomodar esse crescimento fusionandose com pequenas vesículas Logo após a partir de um sinal indeterminado da planta as bactérias param de se dividir e começam a se diferenciar em bacterióides fixadores de nitrogênio O nódulo como um todo desenvolve características semelhantes a um sistema vascular que facilita a troca de nitrogênio fixado produzido pelos bacteroidios por nutrientes disponibilizados pela planta e uma camada de células para excluir o O2 do interior do nódulo da raiz Em algumas leguminosas de clima temperado p ex ervilhas os nódulos são alongados e cilíndricos devido à presença de um meristema nodular Os nódulos de leguminosas tropicais como soja e amendoim não apresentam um meristema persistente além de serem esféricos O complexo da enzima nitrogenase fixa o N2 A fixação biológica do nitrogênio semelhante à fixação industrial do nitrogênio produz amônia a partir do nitrogênio molecular A reação geral é N2 8 e 8 H 16 ATP 2 NH3 H2 16 ADP 16 Pi 1310 Observe que a redução do N2 a 2 NH3 uma transferência de seis elétrons está acoplada à redução de dois prótons para formar H2 O complexo da enzima nitrogenase catalisa essa reação O complexo da enzima nitrogenase pode ser separado em dois componentes a Feproteína e a MoFeproteína nenhum dos quais com atividade catalítica própria Figura 1313 A Feproteína é o menor dos dois componentes e tem duas subunidades idênticas que variam em massa de 30 a 72 kDa cada dependendo da espécie de bactéria Cada subunidade possui um grupo ferroenxofre 4 Fe e 4 S2 que participa nas reações redox envolvidas na conversão do N2 em NH3 A Feproteína é irreversivelmente inativada por O2 com uma meiavida típica de 30 a 45 segundos A MoFeproteína tem quatro subunidades com massa molecular total de 180 a 235 kDa dependendo da espécie bacteriana Cada subunidade apresenta dois grupos MoFeS A MoFeproteína é também inativada pelo O2 com uma meiavida de 10 minutos no ar TABELA 134 Reações catalisadas pela nitrogenase N2 NH3 Fixação do nitrogênio molecular N2O N2 H2O Redução do óxido nitroso N3 N2 NH3 Redução da azida C2H2 C2H4 Redução do acetileno 2 H H2 Produção do H2 ATP ADP Pi Atividade hidrolítica do ATP Na reação geral de redução do nitrogênio ver Figura 1313 a ferredoxina atua como um doador de elétrons para a Feproteína que por sua vez hidrolisa ATP e reduz a MoFeproteína A MoFeproteína pode então reduzir inúmeros substratos Tabela 134 embora sob condições naturais ela reaja somente com N2 e H Uma das reações catalisadas pela nitrogenase a redução do acetileno a etileno é usada para estimar a atividade da nitrogenase ver Tópico 132 na internet O balanço energético da fixação do nitrogênio é complexo A produção de NH3 a partir de N2 e H2 é uma reação exergonica para uma discussão das reações exergonicas ver Apêndice 1 na internet com um ΔGº mudança na energia livre de 27 kJ mol1 Entretanto a produção industrial de NH3 a partir de N2 e H2 é endergonica demandando um grande aporte de energia devido a energia de ativação necessária para quebrar a ligação tripla do N2 Pela mesma razão a redução enzimática do N2 pela nitrogenase também requer um grande investimento de energia ver Equação 1310 embora as mudanças exatas na energia livre ainda sejam desconhecidas Cálculos baseados no metabolismo de carboidrato de leguminosas indicam que a planta respira 93 moles de CO2 por mol de N2 fixado Com base na Equação 1310 o ΔGº para a reação geral da fixação biológica do nitrogênio é de cerca de 200 kJ mol1 Visto que a reação total é altamente exergonica a produção de amônio é limitada pelo lento funcionamento o número de moléculas de N2 reduzido por unidade de tempo é de cerca de 5 s1 do complexo nitrogenase Para compensar essa velocidade lenta de reciclagem o bacterióide sintetiza grandes quantidades de nitrogenase representando até 20 do total das proteínas na célula Sob condições naturais quantidades substanciais de H são reduzidas ao gás H2 Esse processo pode competir com a redução do N2 pelos elétrons da nitrogenase Nos rizóbios 30 a 60 da energia fornecida para a nitrogenase podem ser perdidos como H2 diminuindo a eficiência da fixação do nitrogênio Alguns rizóbios entretanto contêm hidrogenase uma enzima que pode clivar o H2 formado e gerar elétrons para a redução do N2 aumentando assim a eficiência da fixação de nitrogênio Amidas e ureídas são formas de transporte do nitrogênio Os procariotos simbióticos fixadores de nitrogênio liberam amônia que para evitar a toxicidade deve ser rapidamente convertida em formas orgânicas nos nódulos da raiz antes de ser transportada via xilema para a parte aérea As leguminosas fixadoras de nitrogênio podem ser classificadas como exportadoras de amidas ou exportadoras de ureídas dependendo da composição da seiva do xilema As amidas principalmente os aminoácidos asparagina ou glutamina são exportadas por leguminosas de regiões temperadas como ervilha Pisum trevo Trifolium fava Vicia e lentilha Lens As ureídas são exportadas por leguminosas de origem tropical como a soja Glycine o feijoeiro Phaseolus o amendoim Arachis e a ervilhadosul Vigna As três ureídas principais são alantoína ácido alantoico e citrulina Figura 1314 A alantoína é sintetizada nos peroxissomos a partir do ácido úrico enquanto o ácido alantoico é sintetizado no retículo endoplasmático a partir da alantoína O local de síntese da citrulina a partir do aminoácido ornitina ainda não foi determinado Os três compostos são por fim liberados no xilema e transportados para a parte aérea onde são rapidamente catabolizados a amônio Esse amônio entra na rota de assimilação já descrita Assimilação do enxofre O enxofre está entre os elementos mais versáteis dos organismos vivos As pontes dissulfeto nas proteínas possuem funções estruturais e reguladoras ver Capítulo 8 O enxofre participa do transporte de elétrons pelos grupos ferroenxofre ver Capítulos 7 e 12 Os sítios catalíticos de várias enzimas e coenzimas como urease e coenzima A contêm enxofre Os metabólitos secundários compostos que não estão envolvidos nas rotas primárias de crescimento e de desenvolvimento que contêm enxofre variam Figura 1314 Principais ureídas utilizadas para transportar nitrogênio a partir dos locais de fixação para os locais onde será desaminado fornecendo nitrogênio para a síntese de aminoácidos e nucleosídeos Ácido alantoico Alantoína Citrulina Metabolismo do Nitrogênio O nitrogênio existe em diversas formas na biosfera sendo encontrado principalmente como nitrogênio molecular N na atmosfera No entanto ₂ suas formas naturais não estão diretamente disponíveis para os organismos vivos Cerca de 95 do nitrogênio N encontrado no solo está na forma orgânica e apenas uma parte desses compostos já foi identificada Além do N orgânico há formas inorgânicas minerais como amônio NH4 nitrito NO2 e nitrato NO3 sendo bem caracterizados Embora a quantidade de N inorgânico no solo seja menor em comparação com a fração orgânica essas formas são cruciais para a nutrição das plantas e para vários processos relacionados ao ciclo do N Entre as duas categorias principais de N no solo a orgânica e a inorgânica algumas substâncias são solúveis e outras são relativamente insolúveis algumas são móveis enquanto outras permanecem fixas no solo algumas estão disponíveis para a absorção pelas plantas enquanto outras não estão O N é constantemente convertido entre essas diferentes formas por meio de uma complexa rede de reações físicas químicas e biológicas A molécula de nitrogênio apresenta uma ligação tripla covalente altamente estável que necessita ser quebrada para que o nitrogênio possa ser utilizado biologicamente Essa quebra irá produzir amônia NH3 ou nitrato NO3 e são conhecidas como fixação do nitrogênio podem ocorrer por processos industriais ou naturais As transformações do N2 na natureza ocorrem por processos naturais e industriais Processos naturais 1 Relâmpagos responsáveis por 8 do N fixado vai converter o vapor dágua e oxigênio em hidroxilas livres em átomos de oxigênio livre que vão atacar o N2 formando o ácido nítrico HNO3 2 Reações fotoquímicas 2 do N fixado ocorre entre o óxido nítrico NO gasoso e ozônio O3 para formar ácido nítrico HNO3 3 Fixação biológica do nitrogênio 90 do N fixado bactérias e cianobactérias irão fixar o N2 em amônia NH3 que se dissolve em água e forma o amônio NH4 Existem seis processos fundamentais na transformação e reciclagem do nitrogênio sendo essenciais para a manutenção do ciclo biogeoquímicos nos ecossistemas 1 Decomposição e excreção Envolve a ação de bactérias e fungos que são responsáveis por decompor a matéria orgânica presente no ambiente seja de origem animal ou vegetal No processo irá ocorrer a liberação de amônio essa etapa é conhecida como amonificação fase em que ocorre a liberação do nitrogênio na forma de amônio podendo ser reutilizado pelos organismos vivos Além disso alguns organismos vivos eliminam o excesso de nitrogênio ingerido através de reações bioquímicas variadas uma delas é na forma de ureia o ciclo da ureia destacase como uma das formas mais importantes de reciclagem do nitrogênio A ureia liberada no ambiente é convertida em amônia pela ação de microrganismos decompositores permitindo que a amônia retorne ao ciclo biogeoquímico A amônia pode ser utilizada diretamente pelas plantas e microrganismos ou ser convertida em nitrato pelos microrganismos sendo essa a principal forma de obtenção de nitrogênio pelos organismos produtores primários 2 Nitrificação Processo que envolve a oxidação bacteriana da amônia No solo a amônia vai ser convertida em nitrato apesar de ser potencialmente utilizada na síntese de produtos nitrogenados por todos os organismos vivos Essa conversão ocorre em duas fases nas quais o composto reduzido é gradualmente oxidado passando de amônia a nitrito e em seguida a nitrato Os microrganismos responsáveis por essa transformação habitam tanto o solo quanto a água desempenhando um papel essencial em cada uma das fases de oxidação Após a oxidação da amônia a nitrato as plantas e microrganismos incorporam esse composto utilizandoo para a síntese de moléculas nitrogenadas O nitrato resultante desse processo pode seguir dois destinos ser absorvido pelas plantas ou retornar à atmosfera como gás nitrogênio N2 através do processo de desnitrificação 3 Desnitrificação Processo onde o nitrato é convertido em óxido nitroso e em seguida em gás nitrogênio que irá ser liberado na atmosfera Esse processo é importante na respiração anaeróbia de algumas bactérias que utilizam o nitrato como doador de elétrons liberando o gás nitrogênio na atmosfera Além disso a desnitrificação gera um potencial de próton na transmembrana utilizado na síntese do ATP sendo portanto um processo vital para a manutenção do balanço entre nitrogênio biológico e o nitrogênio atmosférico O nitrato assume um papel central sendo a principal forma de assimilação de nitrogênio pelas plantas 4 Absorção e assimilação O nitrato absorvido é reduzido em amônia sendo utilizado na síntese de aminoácidos e outros compostos nitrogenados No solo há uma intensa competição entre microrganismos e plantas pelo nitrato e o amônio disponíveis dessa forma as plantas desenvolveram mecanismos especializados para capturar e armazenar rapidamente esses elementos O processo em que ocorre a entrada de nitrato nas plantas requer energia para a manutenção do potencial eletroquímico o nitrato pode ser armazenado em vacúolos o que aumenta a capacidade de absorção pela planta Após o nitrato ser transformado em nitrito pela enzima nitrato redutase o nitrito que é altamente reativo deve ser rapidamente removido do citoplasma e convertido em amônia pelo nitrito redutase nos plastídios As células vegetais evitam a toxicidade do amônio convertendo rapidamente em aminoácidos essa conversão requer duas enzimas que são glutamina sintetase e glutamato sintanse mas o amônio pode ser assimilado por uma rota alternativa que utiliza a enzima glutamato desidrogenase 5 Transaminação uma vez assimilado em glutamina e glutamato o nitrogênio será incorporado a outros aminoácidos por meio das reações de transaminação As enzimas que catalisam essas reações são as aminotransferases que são encontradas nos cloroplastos mitocôndrias nos glioxissomos e nos peroxissomos e desempenham um papel importante na biossíntese dos aminoácidos 6 Fixação biológica do nitrogênio FBN o processo mais importante de entrada do nitrogênio no ciclo sendo responsável por cerca de 90 da fixação de nitrogênio Algumas bactérias possuem a capacidade de formar amônio a partir do nitrogênio podendo ser de vida livre ou simbióticas Na simbiose o hospedeiro fornece metabolitos para a bactéria que em troca fornece nitrogênio orgânico para o hospedeiro sendo o complexo Nitrogenase a enzima responsável por esse processo A FBN é especialmente importante nas culturas agrícolas como arroz e em ecossistemas aquáticos onde as bactérias fixadoras podem atuar em condições de anaerobiose Nas leguminosas a fixação simbiótica ocorre nas raízes através de nódulos que funcionam como nichos ecológicos onde a fixação do nitrogênio acontece Os nódulos são conectados à planta através de tecidos vasculares a formação dos nódulos envolve uma série de passos complexos incluindo a quimiotaxia e aderência das bactérias às raízes das plantas a multiplicação das células corticais a formação de cordão de infecção e a liberação das bactérias nas células onde se multiplicam e se diferenciam em bacteroides Dentre os nódulos ocorre o desenvolvimento da Nitrogenase leghemoglobina e outras enzimas ligadas a fixação biológica do nitrogênio A Nitrogenase reduz o nitrogênio atmosférico até amônia que então é convertida em aminoácidos como glutamina ou asparagina que serão incorporados pela planta A simbiose entre rizóbios e leguminosas é crucial tanto para a produção de alimentos como também para a manutenção do nitrogênio nos ecossistemas naturais sendo responsável por cerca de 35 milhões de toneladas de nitrogênio por ano