Espermograma: Avaliação da Fertilidade Masculina

45 Capítulo 4 Espermograma Cinthia Manzzi Feijó Deborah Montagnini Spaine Danielle S Tibaldi Sandro C Esteves Introdução O espermograma é o foco central da avaliação laborato rial para o homem com queixa de infertilidade Embora não seja um teste de função espermática esse exame for nece informações sobre a atividade germinativa a ativi dade dos epidídimos e a atividade das glândulas sexuais acessórias1 Os resultados do espermograma são frequentemente utilizados como marcadores da fecundidade masculina e das chances de se estabelecer uma gravidez É de funda mental importância portanto que o exame seja executa do por profissionais bem treinados e realizado num labo ratório de andrologia com rigoroso controle de qualidade Figura 1 A acurácia e a reprodutibilidade dos resulta dos fornecidos pelo laboratório facilitam ao clínico esta belecer a melhor linha diagnóstica e terapêutica2 Apesar disso o valor prognóstico das variáveis seminais como concentração motilidade e morfologia espermática como marcadores de fecundidade é limitado O potencial fértil do homem é influenciado pela atividade sexual pelo estado das glândulas sexuais acessórias e por fatores defi nidos como estado de saúde geral uso de medicamentos drogas ilícitas tabagismo e álcool além de outros desco nhecidos Figura 1 Visão geral do laboratório de andrologia O laboratório deve possuir equipamentos e instrumentos específicos e em quan tidade necessária ao atendimento de sua demanda manter manu ais técnicooperacionais referentes aos equipamentos e procedi mentos realizados facilmente acessíveis aos funcionários do setor implementar e manter um programa de manutenção preventiva e corretiva além de manter os equipamentos calibrados Os valores de referência para as variáveis rotineiramente analisadas no sêmen foram recentemente atualizados pela Organização Mundial da Saúde OMS3 Na Tabela 1 en contramse os valores de referência publicados em edições anteriores consecutivas dos manuais da OMS36 Embora esses valores sejam largamente utilizados para diferenciar ESPERMOGRAMA 46 homens férteis e subférteis existe ampla variação de ferti lidade mesmo nos homens com parâmetros anormais Os valores de referência utilizados pelo manual da OMS pu blicado em 2010 foram estabelecidos com base em resulta dos de análises seminais de um grupo de aproximadamen te dois mil homens de oito países que foram capazes de engravidar suas parceiras por via natural até um ano após o término da contracepção7 Os valores dos parâmetros espermáticos desses homens foram distribuídos em uma curva gerando valores médios e intervalos de confiança para diversos percentis Estabeleceramse como valores de referência aqueles obtidos no percentil 5 ou seja 95 dos indivíduos considerados férteis possuíam análises seminais cujos parâmetros espermáticos eram maiores ou iguais aos observados nesse percentil Tabela 137 Os valores de referência indicados no novo manual da OMS não devem portanto ser utilizados para uma distin ção rígida entre homens férteis e inférteis embora sirvam como um guia padronizado para auxiliar na avaliação das chances de concepção8 Valores abaixo dos limites estabe lecidos podem sugerir a necessidade de tratamento embo ra não tenham poder discriminatório para determinar a natureza desse tratamento Entre os parâmetros espermá ticos nenhum deles foi capaz de isoladamente distinguir entre os grupos de homens que obtiveram gravidez daque les que não o fizeram embora a morfologia espermática tenha sido o parâmetro mais representativo Os resultados da análise seminal de um paciente devem ser interpretados em conjunto com as informações clínicas28 Coleta do sêmen O local de coleta tem efeito direto sobre os parâmetros se minais especialmente sobre o volume ejaculado Preferen cialmente a amostra seminal deve ser colhida em uma sala silenciosa isolada limpa com banheiro anexo e próxima ao laboratório onde será realizada a análise Figura 2 A coleta domiciliar pode ser autorizada em casos especiais desde que o material chegue ao laboratório em no máxi mo uma hora e que cuidados sejam tomados durante seu transporte até o laboratório9 Os parâmetros seminais são influenciados por temperaturas abaixo de 25 ºC ou acima de 37 ºC Quando isso ocorrer os resultados obtidos po dem não ser confiáveis O modo preferencial de coleta é a masturbação A cole ta por coito interrompido não é indicada pois pode haver perda da primeira fração do ejaculado ou contaminação da flora vaginal Em casos selecionados podese autori zar a coleta pelo ato sexual utilizando preservativo atóxico ex MaleFactor Pak Nos portadores de lesão medular a coleta pode ser realizada por vibroestimulação ou por eletroejaculação Nos casos de ejaculação retrógrada o pa ciente deve ser orientado quanto à alcalinização prévia da urina obtida pela ingestão oral de bicarbonato de sódio O sêmen deve ser colhido utilizandose um frasco es téril descartável composto de polipropileno de boca larga cerca de sete centímetros de diâmetro e com tampa de rosca O laboratório sempre deve fornecer o frasco cole tor cujo lote é previamente testado quanto à toxicidade do plástico sobre a motilidade espermática Figura 3 tabela 1 Valores de referência para os parâmetros seminais publicados nos consecutivos manuais da Organização Mundial da Saúde OMS Parâmetros seminais Edição Ano de publicação 1ª 1980 2ª 1987 3ª 1992 4ª 1999 5ª 20101 Volume mL 20 20 20 15 Concentração x106 por mL 20200 20 20 20 15 Concentração total x106 40 40 40 39 Motilidade total 60 50 50 50 40 Motilidade progressiva2 23 25 25 grau a 25 grau a 32 ab Vitalidade vivos 50 75 75 58 Morfologia normais 805 50 304 145 46 Leucócitos x106 por mL 47 10 10 10 10 1 Valores de referência correspondentes ao percentil 5 obtidos pela distribuição dos dados dos espermogramas de homens que engravidaram suas esposas num intervalo 12 meses 2 grau a motilidade progressiva rápida 25 µm por s grau b motilidade progressiva lenta 5 a 25 µm por s 3 progressão para frente escala 0 a 3 4 valor arbitrário 5 valor não definido porém sugerido levandose em consideração o critério estrito 6 critério estrito de Tygerberg Adaptado de Esteves SC et al Critical Appraisal of World Health Organizations New Reference Values for Human Semen Characteristics and Effect on Diagnosis and Treatment of Subfertile Men Urology 20127911622 ESPERMOGRAMA 47 Figura 2 Visão geral da sala utilizada para coleta de sêmen De acordo com a Resolução da Diretoria Colegiada nº 23 da Anvisa a sala de coleta de sêmen deve garantir o conforto e a privacidade do paciente e possuir um sanitário com acesso exclusivo Figura 3 Frasco coletor comumente utilizado para a coleta de sê men O frasco deve ser estéril de boca larga e testado quanto à toxicidade do plástico para a motilidade espermática Os parâmetros espermáticos avaliados rotineiramente são influenciados pelo tempo de abstinência ejaculatória antes da coleta pelo método de coleta pela temperatura e pelo tempo entre a ejaculação e o início da análise Em ra zão da variabilidade biológica entre espermogramas de um mesmo paciente pelo menos dois exames devem ser reali zados antes de se estabelecer alguma conclusão diagnósti ca2 O intervalo recomendado entre os exames é arbitrário e geralmente se situa entre 7 e 15 dias O tempo de abstinên cia ejaculatória antes da coleta deve ser de dois a sete dias3 Análise seminal O espermograma de rotina deve abranger a característi cas físicas do sêmen que incluem coagulação liquefação viscosidade aspecto cor e pH b volume da amostra c avaliação microscópica que inclui a concentração de espermatozoides motilidade espermática total e progres siva vitalidade espermática morfologia espermática e quantificação do número de leucócitos Avaliação macroscópica das características físicas do sêmen Imediatamente após a ejaculação o sêmen normal forma um coágulo semelhante a um gel em razão da presença de proteínas secretadas pelas vesículas seminais semenogeli na fibronectina e lactoferrina A ausência de coagulação indica a inexistência ou a deficiência das proteínas que for mam o coágulo e pode ocorrer nos casos de obstrução dos dutos ejaculatórios ausência congênita ou disfunção das vesículas seminais A liquefação do coágulo seminal é um processo enzi mático e a principal enzima envolvida é o antígeno pros tático específico PSA Depois da observação da presença ou não do coágulo o frasco com a amostra seminal pode ser colocado em uma estufa à temperatura de 37 ºC ou permanecer à temperatura ambiente para que ocorra a li quefação O tempo médio para a liquefação completa é de 15 a 30 minutos Caso ela não ocorra em até 60 minutos classificase a liquefação como incompleta podendo ter ocorrido alterações prostáticas Amostras normalmente liquefeitas podem conter corpúsculos gelatinosos que não se dissolvem estes não apresentam nenhum significado clínico A viscosidade do sêmen deve ser avaliada após a li quefação com o auxílio de uma pipeta sorológica de 5 ml A viscosidade é considerada normal quando a amostra ao sair da pipeta por ação somente da força da gravida de goteja ou forma um filamento com extensão inferior a 2 cm Quando o filamento formado for superior a 2 cm a viscosidade é descrita como aumentada O aspecto do sêmen é modificado à medida que os processos de coagulação e liquefação acontecem Imedia tamente após a coleta a amostra seminal tem aspecto he terogêneo espesso e gelatinoso tornandose opalescente homogêneo e mais fluído após a liquefação As colorações branca ou acinzentada são consideradas normais Alteração na cor pode indicar doenças locais ou sistêmicas infecção hepatite ou ainda uso de medica mentos antibiópticos antissépticos urinários ou vitami nas A coloração avermelhada em razão da presença de hemácias é conhecida por hematospermia e pode resul tar de um processo inflamatorio obstrucdo ou cistos nos vezes Existem dois tipos de aglutinacdo i inespecifica dutos ejaculatérios neoplasias anormalidades vasculares também conhecida como agregacao em que se observam entre outros espermatozoides imoveis aderidos a células ou debris ce O pH seminal é resultado da mistura das secregées das lulares ii especifica espermatozoides aderidos uns aos vesiculas seminais pH alcalino e da préstata pH acido outros Esta ultima é sugestiva da presenga de anticorpos O valor normal do pH seminal é 72 Apés a colheitao antiespermatozoides frasco com a amostra seminal deve permanecer bem fe chado para evitar evaporacao do CO da amostra e altera Motilidade espermatica cao do sistema tampao A determinagao do pH rotinei 4 motilidade é definida como 0 movimento espontaneo dos ramente realizada utilizandose papel de indicador de pH espermatozoides A determinacdo do percentual de esper matozoides méveis e sua progressao é realizada manualmen Volume te ou por meio da utilizagao de sistemas computadorizados O volume seminal depende primariamente das glandulasNa avaliacao manual uma aliquota do sémen liquefeito é sexuais acess6rias sendo aproximadamente 60 prove Valiada sob microscopia optica com contraste de fase utili niente das vesiculas seminais 30 da préstata 5 de se zandose aumento de duzentas ou quatrocentas vezes e pre crecées do epididimo glandulas de Cowper e de Littré e ferencialmente sob condic6es controladas de temperatura a 5 de elementos figurados espermatozoides células ger 37 C Placa aquecedora acoplada ao microscépio minativas leucécitos etc Os espermatozoides podem ser classificados de acordo De acordo com a mais recente versio do manual da trés padrées de motilidade OMS 2010 a saber OMS o volume seminal deve ser avaliado pela sua den motilidade progressiva sidade Assim o frasco coletor é pesado antes e depois da motilidade nao progressivas coleta Sabendose que a densidade do sémen é de 1 g por IMOVEIS Idealmente a avaliacao da motilidade espermatica ml calculase 0 volume pela diferenca entre as pesagens a deve ser realizada com a utilizagao de camaras apropria Para simplificar o volume seminal pode ser medido com a oo das que possuem profundidade conhecida ex Makler auxilio de uma pipeta soroldgica graduada de 5 ml com Hi 1 M ie i orwell Microcell e permitem a livre movimentaao intervalo de 01 ml aspirandose toda amostra colhida P Loa dos espermatozoides Figura 4 Pelo menos duzentas cé apos a liquefacao 7 ee lulas sao avaliadas e 0 calculo final é expresso em termos A diminuicao do volume seminal hipospermia pode j percentuais De maneira alternativa podese avaliar a mo estar relacionada a obstrugao dos dutos ejaculatérios ou a oo tilidade com o uso de lamina e laminula Para tanto depo auséncia congénita das vesiculas seminais obstrugao das ee i sitase cerca de 10 uL de sémen liquefeito sobre lamina de vesiculas seminais 4 ejaculagao retrégrada a disfuncao microscopia aquecida a 37 C e cobrese com laminula das glandulas sexuais acessdérias e ao hipogonadismo Ls Inicialmente contamse os espermatozoides que exibem Outros fatores tais como perda de parte da amostra du 4 a motilidade progressiva em um campo aleatorio A seguir rante a coleta ejaculacao parcial em razao de orgasmo in ay x contamse os que exibem motilidade nao progressiva bem completo periodo de abstinéncia inadequado e estresse oe como os iméveis no mesmo campo visual O processo é também podem diminuir o volume do ejaculado colhido eae gaa realizado em duplicata e ao final a média é utilizada para Avaliaca spica d estabelecer o percentual de espermatozoides méveis mo va 1aao micr oscopica as tilidade total e daqueles com motilidade progressiva caracteristicas do sémen Agregacdo e aglutinacdo Concentracao espermatica Apos a andlise macroscépica realizase a avaliagéo mi A concentraao espermatica é definida como o numero de croscépica inicial quanto a presenca de agregacéo e de espermatozoides em milh6es por mililitro de sémen x10 ss aglutinacdo Para isso 20 wL do sémen liquefeito sao colo por ml devendo ser determinada pela diluigaéo volumétrica 3 cados sobre uma lamina de microscopia e recobertos com associada a hematocitometria A contagem dos espermato laminula Avaliase a aliquota sob microscopia épticacom zoides deve ser realizada por meio de uma camara de Neu i contraste de fase utilizando magnificacao de quatrocentas bauer modificada que apresenta na verdade duas camaras ESPERMOGRAMA 49 Figura 4 Câmaras de contagem utilizadas para análise da motilidade espermática a câmara de Makler b Microcell c Horwell Figura 5 Câmara de Neubauer modificada à esquerda No centro ilustração representando seu retículo central que contém 25 quadra dos subdivididos em 16 quadrados menores À direita fotomicrografia mostrando um dos 25 quadrados do retículo central da câmara delimitado por linhas triplas e contendo 16 quadrados menores nos quais se observam os espermatozoides uma superior e outra inferior Cada uma possui 0100 mm de profundidade e um retículo central contendo 25 quadrados grandes cada um com 16 quadrados menores Figura 5 Para se determinar a concentração espermática contase o número de espermatozoides presentes nos 25 quadrados grandes cinco fileiras de ambas as câmaras obtendose a média entre as duas contagens Utilizase microscopia óptica comum com magnificação de duzentas vezes para a observação dos espermatozoides Para que os resultados sejam validados a diferença entre as contagens das duas câmaras não deve exceder 120 da sua soma Caso isso ocorra é necessário homogeneizar novamente a dilui ção e repetir o procedimento A concentração de espermatozoides em milhões por mililitro é resultante da média daqueles contados pelo fa tor de diluição da câmara Tabela 2 A contagem total do ejaculado é obtida multiplican dose o valor da concentração de espermatozoides pelo volume da amostra seminal e o resultado é expresso em milhões de espermatozoides por ejaculado Morfologia espermática A morfologia é definida pela forma e pelo aspecto dos es permatozoides Entre os vários sistemas de classificação morfológica o recomendado pelo manual da OMS3 é o critério estrito de Tygerberg descrito em 1986 por Kruger et al que emprega a análise morfométrica para a determi nação do padrão de normalidade segmento cefálico com forma oval e lisa possuindo de 5 μm a 6 μm de compri mento e de 25 μm a 35 μm de largura quando corados pela coloração do DiffQuick ou panóptico com acros somo compreendendo de 40 a 70 do segmento cefáli co A peça intermediária deve ser delgada com menos de 1 μm de largura comprimento aproximado de 15 vez o tamanho do segmento cefálico e não apresentar nenhum defeito A cauda deve ser uniforme levemente mais fina que a peça intermediária com comprimento aproximado de 45 μm sem defeito como cauda enrolada quebrada ou curta Pelo critério de Kruger as formas limítrofes são con sideradas anormais Figura 6 tabela 2 Diluições e fatores de correção para determinação da concentração de espermatozoides utilizando hematocitometria adapta do do manual da Organização Mundial da Saúde para o exame e processamento de sêmen humano 5ª Ed 2010 p 39 Número de espermatozoides por campo inteiro exame a fresco 200x Diluição Volume sêmen µl Volume fixador diluente µl Fator de diluição 400 120 119 50 950 5 61 a 400 15 14 50 200 20 1 a 60 12 11 50 50 50 ESPERMOGRAMA 50 A análise da morfologia é realizada preparandose um esfregaço com 5 μl de sêmen liquefeito A lâmina de mi croscopia utilizada para a confecção do esfregaço deve ser previamente limpa com álcool 70 e após a fixação e co loração Figura 7 no mínimo duzentos espermatozoides são contados e classificados como normais e anormais Para a análise morfométrica avaliamse as dimensões e o aspecto dos espermatozoides sob magnificação de mil vezes imersão com o auxílio de um micrômetro acopla do à ocular do microscópio óptico O resultado é expresso em porcentagem de formas ovais normais Figura 8 Em relação às formas anormais recomendase calcu lar o percentual de espermatozoides exibindo defeitos no segmento cefálico na peça intermediária e na cauda bem como aqueles com excesso de citoplasma residual Figuras 9 10 e 113 Vitalidade espermática O teste rotineiramente empregado para a avaliação da vi talidade espermática utiliza o corante supravital eosina Espermatozoides vivos apresentam membrana plasmática íntegra e não permitem a passagem da eosina para o inte rior da célula espermatozoide não corado O mesmo não ocorre com espermatozoides mortos cujas membranas não estão intactas espermatozoide corado de rosa Pelo menos duzentos espermatozoides são avaliados utilizan dose microscopia óptica com objetiva de imersão mag nificação de mil vezes Figura 12 De acordo com o manual da OMS3 a determinação da vitalidade espermática deve ser realizada apenas quan Figura 6 Desenho esquemático do espermatozoide humano visto à microscopia óptica com as medidas utilizadas na avaliação mor fométrica segundo o critério estrito de Tygerberg quadro à esquerda No centro e à direita ilustrações representando os defeitos morfológicos mais comuns do a porcentagem de espermatozoides imóveis for supe rior a 60 Concentração de células redondas e leucócitos Normalmente a amostra seminal possui outros elementos celulares além dos espermatozoides como células epite liais do trato geniturinário células prostáticas superficiais ou colunares células germinativas imaturas como esper matócitos e espermátides além de leucócitos A deter minação da concentração desse grupo de células referidas como redondas é realizada empregandose a mesma me todologia descrita para a determinação da concentração de espermatozoides Do ponto de vista clínico entretanto o mais impor tante é diferenciar os leucócitos das outras células redon das pois a ocorrência de um número elevado de leucó citos no sêmen pode indicar infecção genital clínica ou subclínica níveis elevados de radicais livres de oxigênio títulos elevados de anticorpos antiespermatozoides fun ção espermática deficiente e consequentemente diminuir a fertilidade29 Entre as diversas técnicas existentes para a identificação dos leucócitos no sêmen a mais simples é o teste de Endtz ou teste da peroxidase Esse teste permi te identificar os neutrófilos polimorfonucleares que são os de maior importância clínica e geralmente provêm do epidídimo Os neutrófilos também são chamados de gra nulócitos pois possuem grânulos contendo uma enzima chamada peroxidase Espermatozoide normal com medidas Cabeça 25 a 35 mm Cabeça 50 a 60 mm Peça intermediária 15 vez a cabeça Cauda 45 mm defeitos de cabeça defeitos de peça intermediária defeitos de cauda 1 Fusiforme 1 Peça dobrada 1 Cauda curta 2 Cauda dobrada 3 Cauda enrolada 2 Inserção anômala 3 Peça grossa 4 Peça fina 5 Excesso de citoplasma residual Globozoospermia Acromossomo pequeno 2 Piriforme 3 Cabeça redonda 4 Cabeça amorfa 5 Vacuolado 6 Macrocefálico 7 Microcefálico ESPERMOGRAMA 51 Figura 7 Coloração pelo método panótico da morfologia espermática Inicialmente mergulhase a lâmina de microscopia com o esfrega ço de sêmen seco na solução fixadora O processo é repetido cinco vezes mantendose o esfregaço por um segundo dentro da solução com intervalo de um segundo entre os mergulhos É necessário deixar a lâmina secar completamente antes de prosseguir para o próximo passo aproximadamente 15 minutos Depois mergulhase a lâmina seca na solução I do kit panótico seguindose o mesmo método descrito para a etapa anterior Devese permitir que o excesso do corante escorra mas a lâmina não deve secar completamente A última etapa consiste em mergulhar a lâmina na solução II do kit panótico processo que deve ser repetido duas vezes seguindose a mesma sistemática já descrita O excesso do corante é removido enxaguandose a lâmina gentilmente em água destilada e finalmente se deixa a lâmina secar por completo à temperatura ambiente antes de realizar a leitura Figura 8 Fotomicrografias de espermatozoides normais corados pelo método panótico Os espermatozoides foram avaliados pelo critério estrito de Tygerberg Kruger As setas indicam a visão geral de espermatozoides normais esquerda À direita detalhes da cabeça e da peça intermediária de espermatozoides normais Figura 9 Fotomicrografias de espermatozoides apresentando defeitos morfológicos na cabeça A macrocefálico B microcefálico C fusiforme D piriforme E redondo F e G amorfo H vacuolado com mais de dois vacúolos ou mais de 20 da área da cabeça ocu pada por vacúolos Os esfregaços foram corados pelo método panótico e os espermatozoides foram avaliados pelo critério estrito de Tygerberg Kruger Espermatozoides normais 5 mm a E b F C G d H ESPERMOGRAMA 52 Figura 10 Fotomicrografia de espermatozoides apresentando defeitos morfológicos na peça intermediária A inserção anômala da peça B peça espessa C peça fina D peça dobrada E com excesso de citoplasma residual 13 ou mais em relação ao tamanho da cabeça esse defeito normalmente vem acompanhado de outros defeitos na peça intermediária Gotas citoplasmáticas são vesículas pequenas aderidas à peça intermediária e representam elementos normais de espermatozoides funcionais normalmente se perdem du rante o processo de coloração ou aparecem como distensões da peça intermediária com tamanho inferior a 13 da cabeça Os esfregaços foram corados pelo método panótico e os espermatozoides foram avaliados pelo critério estrito de Tygerberg Kruger Figura 11 Fotomicrografia de espermatozoides apresentando defeitos na cauda A cauda curta B cauda enrolada C cauda dobra da D cauda dupla Os esfregaços foram corados pelo método panótico e os espermatozoides foram avaliados pelo critério estrito de Tygerberg Kruger Figura 12 Avaliação da vitalidade espermática pelo método da eosina Espermatozoides com a cabeça corada em rosa são considerados mortos membrana plasmática não intacta que permite a entrada do corante supravital e os não corados cabeça branca são conside rados vivos pois possuem a membrana íntegra que não permite a entrada do corante a a b b C C d d E Nesse teste uma alíquota de sêmen liquefeito é incuba da com um reagente contendo água oxigenada que reage com a peroxidase presente nos grânulos dos neutrófilos A peroxidase pertence ao grupo de enzimas com capaci dade de oxidar substratos orgânicos usando o peróxido de hidrogênio como aceptor de elétrons na reação Como resultado obtémse uma reação colorimétrica os neutró filos coramse de marrom e são facilmente identificados à microscopia óptica ao passo que as células peroxidase ne gativas não se coram Figura 13 Estas últimas podem re presentar células germinativas imaturas ou outros tipos de leucócitos como os monócitos os linfócitos e os macró fagos Depois do ensaio pelo menos duzentas células são analisadas e o resultado é expresso em porcentagem de células peroxidase positivas A concentração de neutrófi los é calculada multiplicandose a concentração de células redondas x106 por ml pela porcentagem de neutrófilos células peroxidase positivas ESPERMOGRAMA 53 Figura 13 Diferenciação das células redondas presentes no sêmen utilizando o teste de Endtz À esquerda célula redonda peroxidase negativa seta larga e granulócito peroxidasepositivo P À direita visão geral de uma lâmina contendo vários granulócitos peroxidase positivos Agradecimento Os autores agradecem Fausto Barbieri e sua equipe pela criação das ilustrações Referências 1 Esteves SC Infertilidade masculina In Rhoden EL ed Uro logia no consultório Porto Alegre Artmed 2009 p 47080 2 Esteves SC Miyaoka R Agarwal A An update on the clinical assessment of the infertile male Clinics São Paulo 2011 664691700 3 World Health Organization WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen 5th ed Ge neva WHO press 2010 287 p 4 World Health Organization WHO Laboratory manual for the ex amination of human semen and spermcervical mucus interac tion 2nd ed Cambridge Cambridge University Press 1987 80 p 5 World Health Organization WHO Laboratory manual for the examination of human semen and spermcervical mucus interaction 3rd ed Cambridge Cambridge University Press 1992 107 p 6 World Health Organization WHO Laboratory manual for the examination of human semen and spermcervical mucus interaction 4th ed Cambridge Cambridge University Press 1999 128 p 7 Cooper TG Noonan E von Eckardstein S Auger J Baker HW Behre HM et al World Health Organization reference values for human semen characteristics Hum Reprod Up date 201016323145 8 Esteves SC Zini A Aziz N Alvarez JG Sabanegh ES Jr Agarwal A Critical appraisal of world health organizations new reference values for human semen characteristics and effect on diagnosis and treatment of subfertile men Urology 20127911622 9 Esteves SC Espermograma e correlações clínicas In Neves PA Rodrigues Netto N Jr Infertilidade masculina Editora Atheneu São Paulo Brasil 2003 p 5970 10 Esteves SC Schneider DT Verza S Jr Influence of antisperm antibodies in the semen on intracytoplasmic sperm injection outcome Int Braz J Urol 2007336795802 P