Técnicas Bioquímicas e Moleculares em Biotecnologia

Técnicas bioquímicas e moleculares aplicadas à biotecnologia\n\nTécnicas Bioquímicas\n\nTécnicas Moleculares\n\nAplicações das Técnicas ?? FACULDADE MAURÍCIO DE NASSAU\nFazendo parte da sua história\n\nCurso de Biomedicina\nDisciplina de Biotecnologia\nProf. Bruno Rocha da Silva\n\nTécnicas bioquímicas e moleculares aplicadas à biotecnologia Técnicas bioquímicas e moleculares aplicadas à biotecnologia\n\nTécnicas Bioquímicas\n\nTécnicas Moleculares\n\nAplicações das Técnicas ?? TÉCNICAS BIOQUÍMICAS IMPORTÂNCIA E APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS BIOQUÍMICAS\n\n- Células eucarióticas são compostas por diversas macromoléculas com funções biológicas diferentes;\n- Quando a descoberta de um composto com potencial atividade (antimicrobiana, antiinflamatório, anticancer) é necessário o isolamento do princípio ativo;\n- Realização de testes específicos para a molécula de interesse (Concentração, Toxicidade, Meio de uso); CARACTERÍSTICAS EXPLORADAS NO ISOLAMENTO DE MOLÉCULAS\n- Carga/Polaridade\n- Solubilidade\n- Localização celular\n- Função/Atividade\n- Tamanho/Forma\n- Hidrofobicidade DIÁLISE\n- Se baseia na separação de moléculas por tamanho e de acordo com a sua concentração em um meio;\n- O processo ocorre por difusão onde moléculas fluem do meio concentrado para o meio menos concentrado. Dialysis bag\nConcentrated solution\nBuffer dentro \nfora\nmembrana CENTRIFUGAÇÃO\nPurificação grosseira\nSepara com base em tamanho/forma;\nRemove partículas grandes não solúveis;\nEvita deposição de materiais não solúveis nas colunas\nUltracentrifugação/ centrifugação diferencial Counter-balance\nRotor\nSedimented sample\nVacuum\nMotor\nCooling TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS\n• Se baseia na separação de moléculas de acordo com suas características. Gel filtration\nHydrophobic interaction\nIon exchange\nAffinity\nFig. 1. Separation principles in chromatographic purification. COMPONENTES\nDO SISTEMA\nreservatório\namostra\nmatriz cromatográfica\nsuporte/filtro\neluente/fase\nmóvel reservatório\namostra\nmatriz cromatográfica\nsuporte/filtro\neluente/fase móvel TIPOS DE CROMATOGRAFIA\nAFINIDADE\nTROCA IÔNICA\nEXCLUSÃO MOLECULAR\nINTERAÇÃO HIDROFÓBICA AFINIDADE Eluição: A interação biológica: molécula alvo pode interagir hidrofóbicas, van der Waals e ponte de hidrogênio. Para eluir a molécula: afinidade deve-se reverter essas interações através de específico (competição), pH do meio. Eluição: A interação biológica entre o ligante e a molécula alvo pode ser resultado de interações hidrofóbicas, eletrostáticas, de van der Waals e pontes de hidrogênio. Para eluir a molécula alvo do meio de afinidade deve-se reverter essas interações através do uso de um ligante específico (competição), ou alteração do pH do meio. Exemplo de ligantes\n• Enzima - substrato análogo, inibidor, cofator.\n• Anticorpo - antígeno, vírus, célula.\n• Lectina - polissacarídeo, glicoproteína.\n• Ácido nucleico – base complementar.\n• Hormônio - receptor.\n\nMatriz de afinidade\nMatrix for ligand attachment. Matrix should be chemically and physically inert. Etapas no processo de isolamento\n\n1. Affinity medium is equilibrated in binding buffer.\n\n2. Sample is applied under conditions that favour specific binding of the target molecule(s) to a complementary binding substance (the ligand). Target substances bind specifically, but reversibly, to the ligand and unbound material washes through the column.\n\n3. Target protein is recovered by changing conditions to favour elution of the bound molecule(s). Elution is performed specifically, using a competitive ligand, or non-specifically, by changing the pH, ionic strength or polarity. Target protein is collected in a purified, concentrated form.\n\n4. Affinity medium is re-equilibrated with binding buffer. Importância do space arm\na)\n\nA200\n\n\n\nb)\n\nA200\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\na)\nRelação volumétrica\nerro.\n\nb)\nRelação volumétrica\nerro. Resultado\n\n\nequilibrat ion\n\nadsorption of sample and elution of unbound material\n\nwash away unbound material\n\nelute bound protein(s)\n\nre-equilibration\n\n\u2192\n\nAbsorbance\n\nbegin sample application\n\n1-2 cv\n\nchange to elution buffer\n\nx cv\n\n1-2 cv\n\n1-2 cv\n\nColumn Volumes (cv) GE Healthcare\nLife Sciences\n\n\n\n\n\n\n\n\n\nimagination at work TROCA IÔNICA\n\n- Separação de moléculas de acordo com sua carga;\n- Utiliza-se do princípio de atração e repulsão das cargas GE Healthcare\nLife Sciences\n\n\n\n\n\n\n\n\n\nimagination at work EXCLUSÃO MOLECULAR Cromatografia de Exclusão Molecular\n\nMassa molecular\nProteínas maiores: eluição rápida\nProteínas menores: eluição tardia\n\nSeparação com base no tamanho da molécula. A amostra não se liga a matriz cromatográfica, portanto o tampão não interfere na resolução da separação. Cromatografia de Exclusão Molecular\n\n1. Spherical particles of gel filtration medium are packed into a column.\n\n\n\n Resultado\n\nAbsorbance\n\n\n\n\n\n\n\n\ng\n\nhigh molecular weight\n\nlow molecular weight\n\nintermediate molecular weight\n\n\nvoid volume Vo\ntotal column volume Vt GE Healthcare\nLife Sciences\n\n\n\n\n\n\n\n\imagination at work INTERAÇÃO\nHIDROFÓBICA\n\nConstrução de interações Hidrofóbicas\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n Cromatografia de Interação Hidrofóbia\n\nSepara as proteínas de acordo com diferenças na hidrofobicidade de sua superfície, utilizando a interação reversível entre as proteínas e a superfície hidrofóbica da matriz.\n\n( NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, KCl GE Healthcare\nLife Sciences\n\nimagination at work