Relatorio-Aula-Pratica-Eletroforese-Gel-Poliacrilamida-Biologia-Molecular

CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE ILHÉUS RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA REFERENTE A DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA LUDMILLA SILVA TELES VIEIRA ILHÉUSBAHIA 2022 SUMÁRIO Introdução 1 Objetivos 2 Materiais 3 Metodologia 4 Resultados 5 Discussão 6 Perguntas 7 Referências 8 1 INTRODUÇÃO A técnica de eletroforese é baseada na separação pelo movimento de partículas carregadas quando submetidas a um campo elétrico Tal movimento é influenciado por carga corrente aplicada distância entre os eletrodos tamanho e formato da molécula e tempo de corrida A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis de poliacrilamida que são produtos polimerizados de acrilamida e bisacrilamida capaz de permitir a separação de polipeptídeos A polimerização do gel formação de ligações cruzadas entre acrilamida e bisacrilamida iniciase com a adição de persulfato de amônio PSA e TEMED Em água o PSA dissociase NH4 e S2O82 deste modo a formação dos radicais livres sulfato induzida pela ação do TEMED catalisam o processo de polimerização das moléculas de acrilamida e bisacrilamida O SDS dodecil sulfato de sódio é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Assim a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente pela massa molecular com os polipeptídeos menores migrando mais rapidamente Após a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de corante como Coomassie Blue R250 2 OBJETIVOS GERAIS Colocar em prática os princípios da técnica de eletroforese de proteínas em condições desnaturantes ESPECÍFICOS Aprender a utilizar os equipamentos como cubas fontes a montagem de placas e a confecção dos géis avaliar a corrida por coloração de proteínas pelo método do Coomassie Blue 3 MATERIAIS Pipetas Ponteiras Cuba de eletroforese Pentes Fonte para cubas de eletroforese Ladder Amostra Tampao de carregamento azul de bromofenol Azul de cromassie Reagentes do gel Acrilamida Bisacrilamida Trisbase SDS PSA e TMED 4 METODOLOGIA Após a montagem do sistema de gel verificando a presença de vazamentos pela adição de água preparar os géis segundo tabela abaixo sem adicionar PSA e TEMED Adicionar o PA e TEMED na solução do gel de separação homogeneizar sem formar bolhas e verter no sistema de gel Após a polimerização do gel de separação colocar PSA e TEMED no gel de concentração homogeneizar e adicionar sobre o gel de separação Colocar o pente e esperar polimerizar Retirar os pentes verificando a formação dos poços Lavar os poços com água encaixar os suportes de gel e colocar o tampão de corrida nos reservatórios Aplicar o ladder e as amostras conectar os cabos dos eletrodos na fonte configurar voltagem v corrente am e forçapotência w Proceder a eletroforese até que o corante azul de bromofenol saia do gel desligar desmontar o sistema e colocar os géis na solução corante Proceder à descoloração fazendo trocas de tampão de descoloração até que o gel fique translúcido e as proteínas coradas em azul Gel separador Gel concentrador Agua ultrapura 164 ml Agua ultrapura 238 ml Acrilamida 16 38 ml Acrilamida 5 054 ml TrisHCL pH 88 20 ml TrisHCL pH 68 044 ml SDS 10 75 microlitros SDS 10 34 microlitros PSA 10 75 microlitros PSA 10 34 microlitros Temed 3 microlitros Temed 4 microlitros 5 RESULTADOS A eletroforese junto com a coloração permitiu a identificação das bandas referentes às proteínas coradas em azul Como esperado a distância foi inversamente proporcional ao tamanho da molécula uma vez que moléculas menores se difundem melhor pelo gel de poliacrilamida Assim as bandas referentes a proteínas de maior tamanho foram identificadas no topo do gel enquanto as bandas referentes a proteínas menores foram identificadas mais próximo ao polo positivo 6 DISCUSSÃO O uso da eletroforese permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor 7 PERGUNTAS Qual o princípio dos seguintes ativos SDS O SDS é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as cargas intrínsecas das mesmas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Acrilamida Acrilamida gera géis de poliacrilamida após polimerização que permitem a separação de polipeptídeos Como explicar a migração de proteínas para o polo positivo Por ação do SDS como desnaturante as moléculas de proteínas permanecem carregadas negativamente Quando submetidas ao campo elétrico as cargas negativas são atraídas para o pólo positivo devido à força do campo elétrico Qual a diferença física e para aplicação entre o gel de agarose e de poliacrilamida Os géis de poliacrilamida são formados por polimerização de acrilamida e bisacrilamida NNmetileno bisacrilamida A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de menor tamanho e é comumente usado na separação de polipeptídeos e proteínas Os géis de agarose são formados por polimerização da agarose componente do ágar A malha formada nesse gel permite a separação de moléculas de maior tamanho como ácidos nucleicos Qual o papel da PCR para a corrida de proteínas no SDSPAGE O uso da PCR permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas carregadas negativamente por ação do SDS presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Também permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor 8 REFERÊNCIAS BARACATPEREIRA M C Bioquímica de Proteínas 1ª Edição 2014 Ed UFV Acesso em 08 de Novembro de 2022 LEHNINGER T M NELSON D L COX M M Princípios de Bioquímica 6ª Edição 2014 Ed Artmed Acesso em 08 de Novembro de 2022 CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE ILHÉUS CESUPI RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMINA Relatório Aula Prática Eletroforese pertinente referente a disciplina de Biologia Molecular do curso de inserir do Instituto de Ensino Superior de Ilhéus Discente inserir Docente inserir Ilhéus Bahia 2022 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO3 2 OBJETIVOS4 21 OBJETIVO GERAL4 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS4 3 MATERIAIS E MÉTODO5 31 MATERIAIS UTILIZADOS5 32 MÉTODO5 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO7 6 PERGUNTAS8 REFERÊNCIAS9 1 INTRODUÇÃO A eletroforese tratase de um método amplamente utilizado para para visualizar e separar as proteínas bem como determinar suas propriedades e grau de pureza Essa técnica separa as biomoléculas carregadas com base nas velocidades com que elas migram em um determinado campo elétrico aplicado O movimento das moléculas é influenciado por carga corrente aplicada distância entre os eletrodos tamanho e formato da molécula e tempo de corrida NELSON COX 2014 MURRAY et al 2014 A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis compostos de polímeros reticulados de poliacrilamida capaz de permitir a separação de polipeptídeos A polimerização do gel formação de ligações cruzadas entre acrilamida e bisacrilamida iniciase com a adição de persulfato de amônio PSA e TEMED Em água o PSA é dissociada em NH4 e S2O8 2 nesse sentido a formação dos radicais livres sulfato induzida pela ação do TEMED catalisam o processo de polimerização das moléculas de acrilamida e bisacrilamida NELSON COX 2014 MURRAY et al 2014 O método eletroforético SDS dodecil sulfato de sódio é comumente empregado para estimar a pureza e a massa molecular Tratase de um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas permitindo que a carga intrínseca da proteína insignificante Além disso na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica passando a ter a mesma relação entre carga e massa Dessa forma a eletroforese na presença de SDS permite a separação das proteínas quase que exclusivamente pela massa molecular com os polipeptídeos menores migrando mais rapidamente Após a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de corante como Coomassie Blue R250 NELSON COX 2014 MURRAY et al 2014 2 OBJETIVOS 21 OBJETIVO GERAL Desenvolver os princípios da técnica de eletroforese de proteínas em condições desnaturantes 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS a Utilizar equipamentos como cubas fontes montagem de placas e confecção dos géis b Avaliar a coloração de proteínas pelo método Coomassie Blue 3 MATERIAIS E MÉTODO 31 MATERIAIS UTILIZADOS a amostra b azul de cromassie c cuba de eletroforese d fonte para cubas de eletroforese e ladder f pentes g pipetas h ponteiras i reagentes do gel acrilamina Bisacrilamida PSA SDS TMED e Tris base 32 MÉTODO Realizado a montagem do sistema de gel e verificado a presença de vazamentos pela adição de água foram preparados os géis conforme a tabela I sem adição de PSA e TEMED Em seguida foi adicionado o PSA e TEMED na solução do gel de separação homogeneizado sem a formação de bolhas e vertido no sistema de gel Após a polimerização do gel de separação foi adicionado PSA e TEMED no gel de concentração homogeneizado e adicionado sobre o gel de separação Após a colocação do pente um tempo de espera até a polimerização completa Em sequência foi retirado os pentes verificando a formação dos poços que foram lavar com água encaixados os suportes de gel e inserido o tampão de corrida nos reservatórios Realizada aplicação do ladder e as amostras conectados os cabos dos eletrodos na fonte configurada a voltagem v a corrente am e a forçapotência w A eletroforese permaneceu até que o corante azul de bromofenol saísse do gel para poder desligar desmontar o sistema e colocar os géis na solução corante Por último procedeuse à descoloração fazendo trocas de tampão de descoloração até que o gel ficasse translúcido e as proteínas coradas em azul Tabela I Preparações dos géis separador e concentrador Gel Separador Gel concentrador Água ultrapura 164ml Água ultrapura 238ml Acrilamida 16 38ml Acrilamida 16 054ml TrisHCL pH 88 20ml TrisHCL pH 88 044ml SDS 10 75 microlitros SDS 10 34 microlitros PSA 10 75 microlitros PSA 10 34 microlitros Temed 3 microlitros Temed 4 microlitros 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO A eletroforese em conjunto com a coloração permitiu a identificação das bandas referentes às proteínas coradas em azul A distância foi inversamente proporcional ao tamanho da molécula tendo em vista que moléculas menores se difundem melhor pelo gel de poliacrilamida Desta maneira evidenciouse que as bandas referentes a proteínas de maior tamanho foram identificadas no topo do gel enquanto as bandas referentes a proteínas menores foram identificadas mais próximo ao polo positivo Nesta direção inferese que o uso da eletroforese permite separar e visualizar o número de proteínas presente em uma mistura com base na massa ou carga como também o grau de pureza de uma preparação Além disso permite a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor NELSON COX 2014 MURRAY et al 2014 Portanto concluise que o SDS é um potente detergente que rompe as interações proteínalipídeo e proteínaproteína respectivamente solubilizando as proteínas de membrana e desnaturando as proteínas NELSON COX 2014 MURRAY et al 2014 Através da presente aula prática foi possível consolidar o conhecimento teórico a respeito da eletroforese das proteínas 6 PERGUNTAS 61 Qual o princípio dos seguintes ativos a SDS O SDS é um detergente aniônico forte que se liga às proteínas de forma equimolar através de interações hidrofóbicas adicionando carga negativa às moléculas de proteínas tornando insignificantes as suas cargas intrínsecas Na presença de SDS a conformação nativa das proteínas é alterada gerando uma mesma forma geométrica e a mesma relação entre carga e massa b Acrilamida A acrilamida gera géis de poliacrilamida após polimerização que permitem a separação de polipeptídeos 62 Como explicar a migração de proteínas para o polo positivo Por ação do SDS como desnaturante as moléculas de proteínas permanecem carregadas negativamente Quando submetidas ao campo elétrico as cargas negativas são atraídas para o pólo positivo devido à força do campo elétrico 63 Qual a diferença física e para aplicação entre o gel de agarose e de poliacrilamida Os géis de poliacrilamida são formados por polimerização de acrilamida e bis acrilamida NNmetileno bisacrilamida A malha formada neste gel permite a separação de moléculas de menor tamanho com ampla utilização na separação de polipeptídeos e proteínas Os géis de agarose são formados por polimerização da agarose componente do ágar A malha formada neste gel permite a separação de moléculas de maior tamanho como por exemplo ácidos nucleicos 64 Qual o papel da PCR para a corrida de proteínas no SDSPAGE O uso da PCR permite separar e visualizar o número de espécies de proteínas carregadas negativamente por ação do SDS presente em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação Além do mais possibilita a determinação aproximada da massa molecular de uma proteína quando esta não possui modificações póstraducionais que alterem significativamente este valor REFERÊNCIAS BARACATPEREIRA M C Bioquímica de Proteínas 1 Ed UFV 2014 NELSON D L COX M M Princípios de Bioquímica de Lehninger 6 ed Porto Alegre Artmed 2014 MURRAY R K BENDER D A BOTHAM K M KENNELLY P J RODWELL V W WEIL PA Bioquímica Ilustrada de HARPER 29 ed Porto Alegre AMGH 2014