Aspectos Gerais de Ferramentas da Biologia Molecular

BIOTECNOLOGIA Ryan Emiliano da Silva 2 2 ASPECTOS GERAIS DE FERRAMENTAS DA BIOLOGIA MOLECULAR APRESENTAÇÃO No primeiro bloco da disciplina apresentamos uma ampla gama de aplicações e vertentes do conhecimento biotecnológico e você percebeu que para alcançar aqueles resultados é necessária a utilização de uma série de ferramentas Estas ferramentas são um aglutinado de citologia bioquímica genética e de várias outras áreas possíveis do conhecimento biológico e juntas integram parte daquilo que chamamos de Biologia Molecular Neste segundo bloco queremos compartilhar essas ferramentas com você para lhe oferecer subsídios para explorar inúmeros campos de trabalho que podem ir do laboratório de pesquisa até o trabalho a campo ou mesmo do ramo industrial até a área investigativa da perícia forense Assim te convidamos para conhecer estes detalhes e aprimorar estas técnicas que vão da extração inicial dos ácidos nucleicos até o sequenciamento gênico de nova geração Nosso objetivo é que ao fim deste bloco consigamos entender didaticamente como funciona um teste de identificação do DNA de um indivíduo suspeito em uma amostra colhida no local de um crime ou mesmo como é possível identificar um paciente infectado por um agente infeccioso através dos tão populares testes de DNA 21 Extração de ácidos nucleicos As múltiplas ferramentas de biologia molecular que serão tratadas neste bloco e que produzem uma infinda quantidade de aplicações tecnológicas envolvem diretamente a manipulação e edição do material genético Contudo para que estes processos se tornem factíveis é necessário a adoção de instrumentos que permitam obter os ácidos nucleicos a partir dos tecidos biológicos Assim a parte inicial deste bloco se destina a compreensão dos fundamentos que embasam as técnicas de extração purificação e conservação de ácidos nucleicos 3 O estudo de citologia nos demonstrou que as cadeias nucleotídicas ficam dispostas no interior das células revestido por uma carioteca nos organismos eucariotos ou disperso no ambiente citoplasmático em meio a outras organelas no caso de organismos procariotos Assim o acesso a esta molécula alvo de interesse compreende a superação de todas estas barreiras oferecidas pela célula A primeira etapa para promover a liberação do material genético é romper as membranas plasmáticas e nucleares que atuam como invólucros celulares Estas membranas de revestimento se caracterizam por possuírem uma espessura bastante pequena e por serem bioquimicamente classificadas como regiões hidrofóbicas Essa hidrofobicidade é garantida pela presença de cadeias de ácidos graxos como glicolipídios colesterol e principalmente fosfolipídios Os fosfolipídios que integram majoritariamente estas membranas permitem a formação de uma estrutura de bicamada lipídica com forte teor anfotérico ou seja intercalam regiões hidrofílicas que interagem com os ambientes aquosos e regiões hidrofóbicas que garantem a integridade estrutural Em virtude das características bioquímicas explicadas acima o rompimento destas membranas exige a participação química de solventes orgânicos e agentes disruptores de gordura que nada mais são do que espécies de detergentes Estas substâncias promotoras de lise possuem regiões polares e regiões apolares o que permite interagir com a bicamada lipídica formando pequenas micelas a partir de sua atividade emulsificante A consequência direta desta dissolução de gorduras é a exposição do material genético que até então estava retido no interior das células Após o rompimento das membranas o material genético de interesse ficará disperso em uma mistura junto a outros componentes celulares sendo necessário a separação do mesmo em relação a estas outras macromoléculas indesejáveis Uma das principais categorias de moléculas que estarão abundantes nesta espécie de caldo celular são as proteínas sendo que algumas destas possuem inclusive a capacidade enzimática de degradar as cadeias de DNA e RNA Logo para impedir esta ação deletéria e contaminante as metodologias de extração preconizam em seus protocolos a utilização de proteases Estas proteases são enzimas que degradam especificamente as 4 proteínas presentes sem no entanto comprometer a integridade dos ácidos nucleicos aumentando o nível de pureza do material extraído ALI et al 2017 Após estas etapas iniciais de eliminação de debris celulares é necessário o isolamento propriamente dito dos ácidos nucleicos Para isso a expressa maioria dos protocolos exploram o princípio químico da precipitação Para promover a precipitação são necessários agentes que induzam a transição estrutural nas moléculas fazendo com que as fitas se agreguem e decantem Alguns dos compostos que induzem este processo são os reagentes de cadeias alcoólicas como isopropanol ou etanol Uma outra possibilidade são soluções de alta osmolaridade constituídas a partir da alta concentração de sais catiônicos Estas etapas podem ser realizadas a partir da adição manual destes reagentes seguidas por sucessivas e repetidas etapas de centrifugação ou a partir da ação de kits comercialmente elaborados que empregam espécies de resinas que por afinidade ligamse às cadeias nucleotídicas que são posteriormente recuperadas a partir do emprego de eluentes de maior afinidade interacional que promovem o desligamento desta molécula da matriz da resina e conservam o material genético íntegro e apto para uso em etapas futuras que serão abordadas nas próximas seções deste material 22 Métodos de amplificação de material genético Um dos elementos substanciais que integram o aporte instrumental de ferramentas da biologia molecular são as reações in vitro que mimetizam as reações ocorridas naturalmente no núcleo celular A partir da reprodução destas reações em escala laboratorial tornase possível explorar a exequibilidade em uma ampla variedade de aplicações Na tentativa de propor uma abordagem didática alguns possíveis exemplos de aplicação prática destas técnicas são as abordagens forenses de comparação entre perfis amostrais de vítimas e eventuais suspeitos ou mesmo reações diagnósticas para identificação de doenças infecciosas tais como as empregadas para confirmação da presença do vírus SARSCoV2 em pacientes com suspeita clínica 5 Replicação do material genético Para entender o racional utilizado nestas técnicas de amplificação é preciso recuperar brevemente os mecanismos enzimáticos envolvidos na atividade de replicação in vivo do DNA que ocorrem naturalmente no ambiente nuclear das células eucarióticas ou no citosol de organismos procariotos O processo de replicação do DNA possui caráter semiconservativo o que significa que novas cadeias de DNA são produzidas bidimensionalmente a partir da complementaridade antiparalela de cadeias de DNA parentais utilizadas como molde O substrato para produção destas fitas complementares são os nucleotídeos livres no nucleoplasma de cada célula que seguem a regra de complementaridade das bases azotadas na qual a ligação de guanina é sempre estabelecida com citosina enquanto adenina é sempre pareada a timina cujas ligações são mediadas por três e duas pontes de hidrogênio respectivamente A replicação do DNA ocorre sempre no sentido 5 3 desta forma em uma das fitas o processo ocorre de modo contínuo ao passo que na fita oposta o processo se dá de modo descontínuo requerendo a participação auxiliar dos fragmentos de Okazaki Adicionalmente a deflagração efetiva do processo é mobilizada por um conjunto de enzimas cujas funções particulares são rememoradas abaixo Topoisomerase enzimas que aliviam a torção da estrutura da dupla fita a partir da forquilha de replicação assegurando a estabilidade conformacional e permitindo a ancoragem das enzimas subsequentemente envolvidas na maquinaria replicativa Helicase enzimas que promovem a abertura da estrutura de dupla fita da cadeia de DNA através do rompimento das ligações não covalentes estabelecidas entre as bases complementares Primase enzimas que atuam nas fitas livres geradas pela ação prévia da topoisomerase e da helicase de modo a sintetizar um fragmento inicial curto 6 que atua fornecendo uma extremidade 3 livre que servirá como ponto de ancoragem para as moléculas de polimerase DNA Polimerase enzimas que acumulam papel central no mecanismo replicativo atuando no estabelecimento de pontes de hidrogênio entre as bases complementares promovendo a ligação da fita recémsintetizada na fita molde Além disso a polimerase permite a ligação da pentose de um nucleotídeo com o grupamento fosfato do resíduo subsequente Além destas funções efetoras a polimerase ainda é responsabilizada por uma atividade de reparo nos erros eventualmente acumulados durante o processo Ligase enzimas que tem como função ligar os pequenos fragmentos gerados na replicação da fita descontínua de modo a unificar estas sequências curtas e produzir uma fita íntegra A ação síncrona destas enzimas se distribui ao longo de três fases bem delimitadas iniciação extensão da fita ou alongamento e terminação Reação em Cadeia da Polimerase PCR As várias aplicações citadas na introdução deste tópico decorrem do uso da reação em cadeia da polimerase ou simplesmente reação de PCR que em suma é a transposição in vitro do mecanismo celular apresentado anteriormente A exequibilidade deste método decorre dos achados bioquímicos de Karry Mullis que conduziu pesquisas envolvendo Thermus aquaticus uma espécie de bactéria extremófila oriunda de lagos termais sulfurosos do parque de Yellowstone A partir da caracterização destas bactérias foi possível obter moléculas de polimerase termoestáveis o que barateou e massificou o uso da PCR dispensando as onerosas e repetidas etapas utilizadas até então que exigiam o acréscimo manual de variantes enzimáticas termossensíveis diretamente extraídas de cultivos de bactérias mesófilas generalistas Outro elemento que contribuiu para o vertiginoso uso da técnica de PCR diz respeito a automatização do processo através da utilização de equipamentos denominados de termocicladores cuja operação permite um controle padronizado do binômio 7 tempotemperatura repetindo as mesmas condições por numerosos ciclos sequenciais gerando quantidades detectáveis de DNA suficientes para posteriores etapas de manipulação e uso em finalidades diversas O uso destes aparelhos permitiu gerar quantidades exponenciais do alvo gênico de interesse o que representa uma significativa diferença em relação ao processo in vivo haja visto que aqui é possível amplificar apenas uma região particular da sequência em função da utilização de oligonucleotídeos iniciadores que serão detalhados a frente A obtenção do material amplificado pode ser analiticamente compreendida a partir do somatório das contribuições individuais de cada um de seus componentes químicos dessa maneira segue uma breve listagem dos mesmos acompanhada da descrição de suas finalidades de uso Quadro 21 Componentes químicos e respectiva função dos elementos envolvidos na reação em cadeia da polimerase PCR Componentes da Reação Função Química DNA alvo Sequência alvo que se quer amplificar por meio da reação de PCR Tomando como exemplo uma reação de PCR cujo objetivo é o diagnóstico de uma doença infecciosa em um paciente humano a sequência que corresponde ao DNA alvo é a sequência gênica do patógeno presente na amostra diretamente colhida do paciente Oligonucleotídeos É um análogo in vitro dos fragmentos de Okazaki presentes no ambiente celular que equivale a pequenas sequências de nucleotídeos iniciadores idealmente contendo de 15 a 20 nucleotídeos que exibem complementaridade com a região a ser flanqueada Os iniciadores se apresentam aos pares de modo 8 que o segmento forward pareia com a fita contínua enquanto o segmento reverse estabelece uma complementaridade com a fita descontínua A construção da sequência destes fragmentos está diretamente vinculada ao nível de especificidade alcançado na reação Desoxirribonucleotídeos Fosfatados DNTPs Bases nitrogenadas púricas adenina e guanina e pirimídicas citosina e timina dispersas individualmente importantes para garantir a extensão da fita por ocasião da ligação com a polimerase Taq Polimerase Polimerase termoestável que reconhece os nucleotídeos iniciadores contiguamente ligados a fita molde Além da enzima propriamente dita a reação envolve a presença de substâncias tamponantes que asseguram a estabilidade do funcionamento reológico da enzima Cloreto de Magnésio MgCl2 Cofator da enzima DNA polimerase que promove uma melhor performance da atividade efetora da enzima A presença destes cofatores é importante para driblar o esgotamento enzimático antes do término da reação Fonte Autor 2022 O funcionamento destes elementos na reação de PCR é dirigido por uma cinética térmica que compreende três estágios sequenciais bem definidos cuja transição é controlada pelo termociclador Desnaturação esta etapa inicia todos os ciclos de reação e consiste na aplicação de uma temperatura de 94ºC que promova a abertura da dupla fita através do rompimento das ligações de hidrogênio No processo endógeno 9 ocorrido nas células esta abertura é realizada pela forquilha de replicação e pela ação da toposiomerase e da helicase que aqui são substituídas pela ação térmica que ao romper as ligações de hidrogênio permite a interação com os demais componentes da reação Anelamento após a separação das fitas na etapa anterior é promovida uma redução gradual da temperatura até cerca de 55ºC a 65ºC momento no qual haverá o pareamento do par de oligonucleotídeos iniciadores cada um em sua respectiva fita homóloga A ligação deste par de iniciadores irá delimitar a região alvo que será amplificada representando uma das principais diferenças da amplificação por PCR em comparação a replicação celular Vale citar que cada iniciador a depender de seu tamanho e constituição terá uma temperatura de anelamento específica por este motivo a temperatura da etapa de anelamento pode variar de reação para reação diferente das demais etapas que possuem temperaturas amplamente padronizadas e definidas Extensão após o anelamento dos iniciadores nas fitas desnaturadas ocorre uma elevação de temperatura para 72ºC que corresponde a temperatura de funcionamento ótimo da enzima Taq polimerase A medida que a enzima polimerase se aproxima da região flanqueada pelos iniciadores ela promove a síntese da fita a partir dos DNTPs presentes na reação promovendo o aumento do número de cópias da região gênica de interesse Cada ciclo corresponde a sucessão entre estes três estágios logo ao final dos cerca de 35 ciclos que compõem a reação completa o número de cópias será exponencialmente maior que o inicial gerando uma quantidade suficientemente alta para ser detectada nas etapas metodológicas seguintes A grosso modo podemos determinar a quantidade final de material amplificado a partir da aplicação do seguinte modelo matemático N N0 x 2n onde N Número final de cópias amplificadas 10 N0 Número inicial de cópias n Número total de ciclos empregados na reação Para aplicarmos os conceitos abordados até aqui propomos a análise da seguinte situação problema Imagine que uma equipe médica solicita ao laboratório hospitalar a identificação da causa de uma infecção parasitária em um paciente recém internado através do conjunto de ferramentas da biologia molecular Nessa situação em particular pense que o exame de identificação molecular precisará diferenciar o material genético do agente etiológico da infecção do material genético do próprio paciente Para isso os nucleotídeos iniciadores devem ser específicos para o DNA do causador da doença assegurando o pareamento correto e a amplificação exclusiva do alvo patogênico garantindo a especificidade da reação A temperatura de anelamento a ser programada no termociclador será função direta do tamanho e da composição deste par de iniciadores enquanto as demais temperaturas utilizadas no exame seguirão os valores padrões Ao fim da reação caso ocorra a amplificação do alvo genético admitese que o paciente estava positivo para infecção por aquele determinado patógeno por outro lado caso o resultado não demonstre nenhuma amplificação inferese que o paciente estava negativo para aquela determinada doença Uma variação possível da técnica de PCR é o que chamamos de RTPCR abreviação para reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa O objetivo central desta reação é permitir a síntese de fitas de DNA a partir de cadeias de RNA mensageiro o que permite a obtenção apenas das regiões funcionais codificadoras de proteínas chamadas genericamente de éxons Para isto é fundamental a utilização da enzima transcriptase reversa encontrada em um grupo viral conhecido como retrovírus que subvertem o dogma central da biologia molecular e produzem cadeias de RNA a partir de DNA integrandoos posteriormente ao genoma da célula hospedeira através da enzima integrase EMERY et al 2004 Um diferencial da RTPCR em relação ao PCR convencional é a possibilidade de conduzir estudos de expressão uma vez que aqui 11 não ocorre a amplificação de regiões regulatórias não codificantes também chamados de íntrons Do ponto de vista prático a RTPCR será dividida em duas reações A primeira responsável pela conversão do RNA em DNA complementar cDNA através de um oligonucleotídeo oligodT menos específico que os envolvidos na PCR convencional Este oligodT corresponde a uma sequência repetida de timinas que se liga por complementaridade a cauda poliA das terminações do RNA mensageiro permitindo a síntese do cDNA Só após a obtenção completa do cDNA é que se procede à segunda etapa da reação cujo processo de obtenção do número exponencial de cópias de DNA é similar ao observado na PCR convencional Algumas outras variações técnicas da reação de PCR que podem ser citadas são a Multiplex PCR na qual mais de um segmento genômico é amplificado em uma única reação de modo que nesta modalidade vários pares de primers estão presentes paralelamente na mesma reação o que pode representar um aumento na praticidade de operação Outra variação é a Nested PCR que fraciona a reação em dois momentos o primeiro produzindo a amplificação de um segmento de maior comprimento e a segunda com a amplificação de um segmento interno menor que corresponde a região alvo propriamente dita Este recurso acaba sendo usado em algumas situações nas quais se deseja aumentar as razões de sensibilidade da reação Identificação dos produtos de amplificação por técnica de eletroforese Após a realização da reação de PCR é preciso determinar a eficiência da amplificação do alvo gênico para isso uma das principais formas empregadas para visualização e determinação da massa deste segmento amplificado é a utilização da eletroforese Esta técnica é utilizada na bioquímica desde os anos 30 e consiste em uma metodologia prática de separação de macromoléculas pautada em seus diferentes tamanhos e cargas 12 O princípio fundamental desta técnica consiste na aplicação de uma corrente elétrica em um ambiente condutivo obtido através da utilização de soluções tamponantes contendo acetato ou borato de modo que o aparelho possui obrigatoriamente um polo positivo ânodo e um polo negativo cátodo Após a aplicação da corrente eletroquímica as moléculas tendem a migrar para o polo com carga contrária a sua alcançando a neutralização das cargas dos íons No caso das moléculas de DNA em função da presença dos grupamentos fosfato a sua carga global é sempre negativa logo a aplicação do material amplificado em uma reação de eletroforese mediante determinada voltagem prevê a migração destas cadeias do cátodo em relação ao ânodo Esta informação química permite inferir que sempre que uma cuba de eletroforese for preparada o material genético deve ser cuidadosamente aplicado nos poços presentes na margem negativa Caso contrário a reação não ocorrerá da forma desejada A voltagem aplicada ao sistema para promover a migração do DNA costuma oscilar entre 10 e 200 V com uma corrente de 50 a 3000mA Esta variação ocorre em função do modelo de equipamento do tipo de reagente envolvido e da finalidade do ensaio Para promover uma adequada separação das moléculas com base em seu tamanho é necessário a utilização de uma matriz polimérica que irá atuar como uma espécie de peneira de modo a permitir a passagem de fragmentos diminutos e reter os fragmentos de maior tamanho Alguns dos polímeros utilizados para este propósito são a poliacrilamida e principalmente a agarose esta última derivada de polissacarídeos de algas marinhas que quando preparados para o uso acabam por assumir uma forma gelatinosa A concentração do polímero varia diretamente em função do grau de resolução necessário para separação das moléculas Imagine que um gel constituído por agarose em uma concentração de 15 consegue separar fragmentos em intervalos de 50 pares de base pb enquanto um gel preparado com agarose a 3 consegue separar fragmentos com diferença de tamanho de 25 pb Em resumo a distância percorrida pela molécula no gel de eletroforese é inversamente proporcional ao seu tamanho ou seja os fragmentos que mais se aproximaram do ânodo durante a corrida são aqueles com um menor comprimento 13 de pares de base Para interpretar estes resultados e determinar o tamanho exato das cadeias são utilizadas moléculascontrole cujo tamanho é conhecido comumente chamadas de ladders que servem como espécie de réguas métricas de comparação a partir do qual o tamanho dos amplificados será determinado Após a realização da corrida de eletroforese o gel contendo a amostra será tratado com corantes fluorescentes eou substâncias intercalantes de DNA como brometo de etídeo ou nitrato de prata que ao impregnarem na molécula e serem contrastados contra uma fonte de luz ultravioleta geram uma banda colorimétrica visível que corresponde a sequência nucleotídica amplificada anteriormente na reação de PCR Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real PCR em tempo real Até o momento todas as modalidades de PCR abordadas dependiam da ação complementar da eletroforese entretanto isto não é uma regra absoluta Existe uma modalidade de PCR cujo principal atributo é justamente o fato de dispensar as etapas subsequentes de eletroforese esta modalidade é denominada reação em cadeia da polimerase em tempo real PCR em tempo real ou simplesmente reação em cadeia da polimerase quantitativa qPCR ARYA et al 2005 A utilização da PCR em tempo real prevê a utilização de um sistema de detecção de sinal fluorescente acoplado ao termociclador de modo que a quantidade de cópias amplificadas pode ser quantificada de modo simultâneo a ocorrência dos ciclos diferentemente da PCR convencional que emite apenas um resultado de caráter qualitativo ao final do processo O teor quantitativo desta variante de PCR está dimensionado nos valores de cycle threshold CT que são calculados pelo equipamento Esse valor é o ponto no qual o sinal fluorescente diretamente proporcional a quantidade de DNA atinge o limiar da fase de amplificação exponencial Esta determinação numérica baseada nos valores de CT cria uma maior taxa de reprodutibilidade o que é algo vantajoso para pensar a aplicação massiva desta técnica em laboratórios de pesquisa e diagnóstico 14 Conforme citado anteriormente a PCR em tempo real depende de um mecanismo de emissão e detecção de sinal fluorescente haja visto que a quantidade de DNA presente na reação é diretamente proporcional ao sinal captado BUSTIN et al 2005 Em virtude disso o sistema reacional depende do uso de moléculas que apresentem esta excitabilidade ótica Estas moléculas são conhecidas como fluoróforos e promovem a absorção e emissão de luz quando postas em um comprimento de onda específico Existem alguns tipos de modelos de fluoróforos e sondas empregados na PCR em tempo real TAJADINI PANJEHPOUR JAVANMARD 2014 que serão brevemente citados abaixo SYBR Green a molécula se liga entre a cadeia dupla do DNA e à medida que ocorre a excitação pela luz emitida a sonda emite uma fluorescência Assim ciclo após ciclo o sinal fluorescente captado aumenta em função da maior quantidade de fitas duplas disponíveis para a ancoragem do SYBR Green Este fluoróforo de coloração esverdeada apresenta boa sensibilidade e é considerado o de menor custo e maior facilidade de uso Por outro lado o fato dele se ligar em qualquer molécula de dupla fita existente na reação pode representar um problema de especificidade e um considerável viés que superestime o valor de CT obtido TaqMan esta molécula corresponde a uma junção de duas regiões o fluoróforo propriamente dito e uma segunda região chamada de quencher que recebe a energia emitida pelo fluoróforo e a dissipa no sistema Esta sonda hibridiza nas cadeias de DNA e à medida que a polimerase exerce sua atividade de exonuclease ela rompe a ligação entre o fluoróforo e o quencher com isso o quencher não mais dissipa o sinal fluorescente de modo que este se eleva consideravelmente indicando o aumento do número de cópias amplificadas Molecular beacons sistema menos empregado do que os modelos anteriores cujo funcionamento se baseia em oligonucleotídeos que hibridizam em uma região específica da sequência alvo e mediante esta complementaridade alteram sua conformação e tornamse capazes de emitir um sinal fluorescente detectável Estes marcadores podem ser sintetizados para emitir diferentes 15 tonalidades colorimétricas o que permite a utilização de diferentes sondas na mesma reação de modo a identificar simultaneamente dois alvos distintos LI ZHOU YE 2008 Dentre todas as moléculas analisadas aqui esta é a que promove um maior nível de especificidade conseguindo distinguir sequências alvo que diferem entre si por apenas uma base nitrogenada o que credencia os mesmos para ensaios de rastreio de mutações e identificações de padrões polimórficos Em termos gerais podemos considerar que a PCR em tempo real possui uma maior praticidade uma maior velocidade na obtenção de resultados a possibilidade de uma interpretação quantitativa mais robusta além de uma maior reprodutibilidade e menores níveis de contaminação experimental Por outro lado requerem equipamentos com maiores níveis de sofisticação e consequentemente com um maior custo de obtenção e manutenção Assim não se pode inferir categoricamente que uma modalidade de PCR é melhor ou pior que outra cabendo ao pesquisador a feitura de uma análise ponderada de sua realidade e de suas necessidades para com base nisso determinar qual modalidade melhor se adequa a seu contexto de trabalho 23 Métodos de sequenciamento de material genético Um desdobramento possível das metodologias de amplificação de material genético discutidas anteriormente é a utilização destes amplificados para a determinação fidedigna da ordem precisa dos nucleotídeos que compõem uma dada cadeia gênica PAREEK et al 2011 Portanto em linhas gerais os métodos de sequenciamento possibilitam a determinação da identidade particular de uma molécula de DNA aumentando consideravelmente o nível de refino em relação aos recursos de PCR O advento das tecnologias de sequenciamento é retardatário em relação às primeiras descobertas estruturais da biologia molecular dos anos 50 Somente na década de 70 que os primeiros modelos de determinação das sequências de DNA são postulados HEATHER CHAIN 2016 O primeiro deles é proposto pela dupla Allan Maxam e Walter Gilbert e parte da premissa que uma clivagem química da terminação 5 de um material amplificado marcado radioativamente irá gerar uma série de pequenos 16 fragmentos de tamanhos distintos que serão separados e ordenados por uma corrida de eletroforese em placas de vidro MAXAM GILBERT 1977 Como os fragmentos estão marcados tornase possível deduzir a sequência completa com base na interpretação do resultado imagético da autorradiografia É importante notar que todo este processo pioneiro está sendo mediado por reagentes químicos clivantes como os derivados de hidrazina e sulfato de dimetila dispensando a participação de reações de natureza enzimática Ainda na década de 70 o bioquímico britânico Frederick Sanger e sua equipe propõem uma metodologia alternativa para o sequenciamento de DNA Diferentemente do modelo anterior o sequenciamento de Sanger é pautado por uma ação enzimática centrada na ação da DNA polimerase se apropriando das características da reação de PCR Esta metodologia compreende a participação de componentes oriundos da PCR convencional tais como os desoxirribonucleotídeos fosfatados DNTPs os oligonucleotídeos iniciadores e a Taq polimerase A este somatório de elementos são acrescidos os didesoxirribonucleotídeos de terminação dDNTPs que correspondem a bases nitrogenadas com deleções estruturais na sua região 3 o que impede a formação de ligações fosfodiéster com o resíduo subsequente e consequentemente interrompem o processo de extensão da fita Como este modelo é uma derivação da reação de PCR temos que no decorrer da mesma os dDNTPs são inseridos de modo randômico na fita amplificada e como eles possuem a alteração na região 3 a extensão da fita fica paralisada a partir desse ponto Estes dDNTPs são acoplados a sondas com sinal de fluorescência cada base com uma tonalidade distinta o que permite diferenciálos com base na emissão de um feixe luminoso automatizado e com base nesse perfil de reconhecimento a sequência original da fita é inferida pelos algoritmos de leitura Imagine que estes dDNTPs estão sendo incorporados de maneira aleatória assim os fragmentos gerados irão variar entre si em tamanhos equivalentes a um único nucleotídeo Ao final da reação haverá um gradiente que irá englobar desde o fragmento mais curto contendo um único resíduo até o fragmento de maior 17 comprimento que possua a sequência completa do material amplificado Quando estes fragmentos forem ordenados pelo sistema de leitura do eletrograma será possível remontar a sequência completa conforme demonstrado na simplificação proposta abaixo A AT ATG ATGC ATGCC ATGCCA ATGCCAG ATGCCAGT ATGCCAGTC ATGCCAGTCA ATGCCAGTCATGGCTATTACGA ATGCCAGTCATGGCTATTACGAT Estes dois modelos apesar de surgirem de modo bastante paralelo não se difundiram de igual maneira Em função do modelo de clivagem química de Maxam e Gilbert necessitar do uso de rotulagem radioativa e depender da manipulação de substâncias químicas com alto potencial de toxicidade o seu uso nunca se popularizou Deste modo os maquinários de sequenciamento atualmente presentes nos laboratórios do mundo inteiro seguem predominantemente o modelo enzimático de Sanger cujos princípios foram detalhados acima Derivações das técnicas de sequenciamento e plataformas de nova geração O método de sequenciamento enzimático abriu caminho para a proposição de novas metodologias de sequenciamento que passam a ser chamadas genericamente de sequenciamento de nova geração Alguns destes novos recursos de identificação de cadeias longas de DNA são 18 Pirosequenciamento é uma metodologia proposta nos anos 90 por Mostafa Ronaghi no qual a atividade de síntese de DNA envolve além dos componentes tradicionais a participação de substratos como adenosina 5 fosfossulfato e luciferina e moléculas enzimáticas como adenosina trifosfato ATP sulforilase apirase e luciferase HARRINGTON et al 2013 Durante a etapa de adição no nucleotídeo ocorre a liberação paralela de um grupamento pirofosfato cuja consequência é a liberação de uma molécula de ATP que promove a ação da luciferase cujo saldo reacional é a emissão de um sinal luminoso detectável pelo equipamento a partir do qual se consegue determinar com precisão quais resíduos formam a fita de DNA Plataformas de sequenciamento de última geração as chamadas metodologias de sequenciamento de última geração surgidas nos anos 2000 representam um avanço em relação aos métodos enzimáticos clássicos pois permitem a síntese paralela em larga escala no qual milhões de fragmentos podem ser sintetizados em uma única reação diferentemente do método de Sanger que promove o sequenciamento individual dos fragmentos GOODWIN MCPHERSON MCCOMBIE 2016 Em termos práticos as plataformas de última geração representam uma maior velocidade na obtenção de dados e a possibilidade de sequenciar genomas inteiros em um intervalo de tempo consideravelmente menor Vários exemplos de plataformas que aplicam este conceito podem ser citados dos quais as mais representativas são plataforma Roche 454 plataforma IlluminaSolexa de sequenciamento em bibliotecas plataforma Ion Torrent de sequenciamento baseado em chips semicondutores e plataforma ABI SOLiD MARDIS 2013 Singlemolecule Real Time DNA sequence SMRT o sequenciamento em tempo real de molécula única é uma metodologia derivada da PCR em tempo real e promove uma extensão onde a molécula de DNA polimerase é fixada e então os nucleotídeos marcados com fluorescência são agregados em fração de milissegundos ROBERTS CARNEIRO SCHATZ 2013 Esta técnica ocorre com auxílio de nanotecnologia e promove uma alta capacidade de geração de 19 dados permitindo o sequenciamento de um genoma longo em uma única corrida todavia possuem o mais alto valor operacional e exigem profissionais com alto nível de preparo para operação e interpretação dos dados gerados A partir da popularização do conjunto de técnicas discutidas nesse bloco foi possível a descrição de genes inteiros e até de genomas completos de organismos procariotos e eucariotos o que representou um aumento exponencial na quantidade de dados disponíveis para análises Isto se tornou um dínamo fundamental para o surgimento de uma área científica chamada de bioinformática que será objeto de debate nos próximos blocos deste material Conclusão Neste bloco tratamos de um conjunto de ferramentas que subsidiam a realização das rotinas de pesquisa e de trabalho em biotecnologia Analisamos os fundamentos genéticos que estão envolvidos nas maquinarias celulares e a partir deste conhecimento in vivo modulamos estratégias para reproduzilos eficientemente in vitro Em função da primazia das moléculas de DNA aprendemos como obtêlas a partir de variadas amostras biológicas utilizando para isso as ferramentas de extração de ácidos nucleicos Uma vez obtidas estas cadeias de forma íntegra se parte para sua amplificação de modo a gerar quantidades exponenciais dos fragmentos gênicos de interesse Para esta finalidade podem ser utilizadas as reações em cadeia da polimerase ou simplesmente PCR acompanhadas das técnicas de eletroforese na qual as moléculas migram em um gradiente polimérico através de impulsos elétricos de modo a permitir a sua visualização e atestar a eficiência de amplificação Além da modalidade convencional tratamos da reação em cadeia da polimerase em tempo real evidenciando o fato da mesma permitir uma quantificação do teor de DNA presente nas amostras além de dispensar as etapas de visualização em eletroforese haja visto que os equipamentos dispõem de um sistema de leitura óptica que quantifica a intensidade de sinal fluorescente liberado na reação Para a produção 20 destes sistemas de reação foram apresentadas como possibilidades os modelos de SYBR Green TaqMan e molecular beacons Como derivação natural dos processos de amplificação de material genético existem as ferramentas de sequenciamento de material genético que permitem determinar a identidade particular de uma molécula de DNA aumentando consideravelmente o nível de refino em relação aos recursos de PCR Para isso foram propostos inicialmente o modelo químico de Maxam e Gilbert e o modelo enzimático de Sanger sendo que o último acabou logrando uma maior popularidade em virtude da reprodutibilidade de seus protocolos e de uma menor toxicidade de seus reagentes De modo a dialogar com as novas fronteiras trilhadas pela biotecnologia foram apresentadas as metodologias de sequenciamento contemporâneas tais como o pirosequenciamento baseado em reações exergônicas pautadas no elemento fósforo o sequenciamento em tempo real de molécula única e as plataformas de nova geração que permitem um ganho de velocidade na produção e interpretação dos dados genômicos cujos exemplos elencados foram a plataforma Roche 454 plataforma IlluminaSolexa de sequenciamento em bibliotecas plataforma Ion Torrent de sequenciamento baseado em chips semicondutores e plataforma ABI SOLiD REFERÊNCIAS ALI N et al Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point ofCare Diagnostics Biomed Research International v 2017 p 113 2017 Hindawi Limited ARYA M et al Basic principles of realtime quantitative PCR Expert Review of Molecular Diagnostics v 5 n 2 p 209219 mar 2005 BUSTIN S et al Quantitative realtime RTPCR a perspective Journal of Molecular Endocrinology v 34 n 3 p 597601 jun 2005 Bioscientifica EMERY S L et al RealTime Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction Assay for SARSassociated Coronavirus Emerging Infectious Diseases v 10 n 2 p 311316 fev 2004 Centers for Disease Control and Prevention CDC 21 GOODWIN Sara MCPHERSON John D MCCOMBIE W Richard Coming of age ten years of 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