Estudo Dirigido Diagnóstico Molecular Doenças Genéticas PUC Minas

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Educação Continuada Diagnóstico Molecular de Doenças Genéticas lato sensu Disciplina Técnicas Aplicadas ao Diagnóstico Molecular Avaliação Estudo Dirigido Alunos BH 022022 Professor SÁVIO HENRIQUE DE CICCO SANDES Oferta 7 Turma 1 Valor 45 pontos Nota QUESTÕES 1 Quais são as diferenças entre as abordagens de construção de bibliotecas clonebyclone shotgun sequencing e whole genome shotgun sequencing Qual é a vantagem de se utilizar uma abordagem híbrida ou seja utilizando as duas metodologias 2 No sequenciamento de nova geração quais são as principais metodologias utilizadas na construção de uma biblioteca genômica Quais as diferenças entre estas metodologias e em quais plataformas elas são aplicadas 3 Descreva como ocorre o sequenciamento por síntese realizado em uma plataforma Illumina 4 Sobre o sequenciamento de leituras longas longreads quais são as principais diferenças entre a abordagem em tempo real e a abordagem sintética Utilize as seguintes referências bibliográficas Green ED Strategies for the systematic sequencing of complex genomes Nat Rev Genet 200128573583 doi10103835084503 Goodwin S McPherson JD McCombie WR Coming of age ten years of nextgeneration sequencing technologies Nat Rev Genet 2016176333351 doi101038nrg201649 Estudo Dirigido Técnicas Aplicadas ao Diagnóstico Molecular 1 Quais são as diferenças entre as abordagens de construção de bibliotecas clonebyclone shotgun sequencing e wholegenome shotgun sequencing Qual é a vantagem de se utilizar uma abordagem híbrida ou seja utilizando as duas metodologias A abordagem clonebyclone shotgun sequencing é a mais usada para estabelecer a sequência de genomas grandes e complexos Nessa estratégia o mapeamento vem primeiro e o sequenciamento depois ou seja o DNA alvo é primeiro analisado por métodos de mapeamento físico baseados em clones e então os clones mapeados individualmente são selecionados e submetidos a sequenciamento shotgun Esse processo de sequenciamento é dividido em várias etapas sequenciais são elas 1 Construção do mapa No mapeamento físico baseado em clones pedaços de DNA são clonados usando um sistema hospedeirovetor Os clones são analisados quanto à presença de pontos de referência de DNA únicos com dados do compartilhamento de pontos de referência comuns entre os clones e então são usados para montar mapas de clones sobrepostos os CONTIGS Cada clone CONTIG contém o DNA de um segmento contíguo do genoma de origem 2 Seleção de clones Uma vez com um mapa CONTIG montado clones minimamente sobrepostos são então selecionados para o sequenciamento shotgun 3 Construção de biblioteca de subclones Para cada mapa selecionado o DNA clonado é purificado e submetido a fragmentação aleatória por métodos de cisalhamento físico Após o reparo enzimático das extremidades quebradas e fracionamento por tamanho os fragmentos de DNA em uma faixa de tamanho definida são recuperados e subclonados em um vetor baseado em plasmídeo ou M13 4 Fase shotgun aleatória Na fase de sequenciamento inicial os subclones são escolhidos aleatoriamente e as leituras de sequência são derivadas dos sítios de primer universais localizados em um ou ambos os lados da inserção clonada Após a geração de uma quantidade suficiente de dados de sequência redundantes as leituras de sequência são montadas computacionalmente com base nas sobreposições de sequência detectadas 5 Fase de acabamento dirigido A montagem inicial das leituras de sequência normalmente produz CONTIGS de sequência que juntos refletem praticamente todo o clone inicial Na fase final de sequenciamento a montagem da sequência preliminar é refinada de maneira direcionada para produzir uma sequência final altamente precisa processo chamado de acabamento de sequência A fase de finalização da sequência é altamente personalizada e geralmente associada a um rendimento mais baixo 6 Autenticação de sequência Após a montagem final a sequência é normalmente analisada quanto a vários recursos importantes como a presença e a ordem correta de marcadores baseados em sequência conhecidos e sua concordância com a digestão de enzimas de restrição Essas verificações de autenticação são cruciais para garantir que a sequência final produzida em um projeto de sequenciamento shotgun seja altamente precisa Já o whole genome shotgun sequencing é uma estratégia alternativa para o sequenciamento genômico Ele envolve a montagem de leituras de sequência geradas de maneira aleatória e ampla ignorando a necessidade de um mapa físico baseado em clones Nesse tipo de sequenciamento todo o genoma do organismo é fragmentado em pedaços de tamanhos específicos que por sua vez são subclonados em vetores de plasmídeo As leituras de sequência são geradas a partir de ambas as extremidades de inserção de um número muito grande de subclones de modo a produzir uma cobertura de sequência altamente redundante em todo o genoma Métodos computacionais são então usados para montar as leituras de sequência e deduzir uma sequência de consenso correspondente Um aspecto chave desta estratégia que é especialmente importante para lidar com os problemas apresentados por sequências repetitivas é a geração de leituras de sequência de ambas as extremidades da maioria dos subclones As distâncias físicas esperadas que separam esses pares de leitura justapostos são um fator importante no processo de derivar uma montagem de sequência precisa Seu uso mais comum tem sido para elucidar a sequência de genomas bacterianos menores A aplicação do whole genome shotgun sequencing para genomas eucarióticos é mais difícil devido ao seu tamanho maior e maior número de repetições Sequências repetitivas são mais desafiadoras para o processo de montagem de sequências A aplicação mais proeminente desse tipo de sequenciamento foi para analisar o genoma humano pela Celera Genomics A imprensa científica e popular frequentemente destacou as distintas abordagens adotadas pelo Projeto Genoma Humano e pela Celera Genomics em seus respectivos esforços para sequenciar o genoma humano ou seja clone por clone versus sequenciamento shotgun de genoma completo respectivamente Na realidade as duas estratégias não são mutuamente exclusivas e de fato são bastante complementares De fato tem havido notável convergência no uso dessas abordagens de sequenciamento resultando no advento de estratégias híbridas ou mistas que incorporam elementos de ambas Em uma estratégia híbrida as leituras de sequência são geradas tanto de um clonebyclone quanto de um wholegenome As leituras de sequência de BACs individuais são usadas para identificar leituras correspondentes adicionais geradas pelo wholegenome shotgun sequencing A coleção combinada de leituras que refletem essencialmente os dados de sequenciamento para uma caixa do genoma do tamanho de BAC é então usada para a montagem e finalização da sequência Uma estratégia de sequenciamento híbrida pode obter vantagem de ambas as abordagens de sequenciamento Por exemplo o wholegenome shotgun sequencing fornece uma visão rápida sobre a sequência de todo o genoma Esses dados podem ser usados para aprender sobre o repertório de sequências repetitivas em um genoma e para encontrar sequências conservadas correspondentes em comum com outros organismos Ao mesmo tempo as leituras de sequência wholegenome shotgun sequencing também são úteis quando agrupadas com os dados correspondentes gerados de forma clonebyclone criando assim conjuntos de dados com cobertura de sequência aprimorada Enquanto isso o componente clonebyclone simplifica o processo de montagem de sequência para segmentos genômicos de tamanho de clone individual minimizando assim a probabilidade de erros de montagem graves fornecendo um caminho bem estabelecido para o acabamento da sequência 2 No sequenciamento de nova geração quais são as principais metodologias utilizadas na construção de uma biblioteca genômica Quais as diferenças entre estas metodologias e em quais plataformas elas são aplicadas Existem várias abordagens usadas no sequenciamento de nova geração NGS dentre elas estão NGS de leitura curta Para essa abordagem existem duas grandes categorias sequenciamento por ligação SBL e sequenciamento por síntese SBS Nas abordagens SBL uma sequência de sonda que está ligada a um fluoróforo hibridiza com um fragmento de DNA e é ligada a um oligonucleotídeo adjacente para geração de imagens O espectro de emissão do fluoróforo indica a identidade da base ou bases complementares a posições específicas dentro da sonda Nas abordagens SBS uma polimerase é usada e um sinal como um fluoróforo ou uma mudança na concentração iônica identifica a incorporação de um nucleotídeo em uma fita alongada Na maioria das abordagens SBL e SBS o DNA é amplificado clonalmente em uma superfície sólida Ter muitas milhares de cópias idênticas de um fragmento de DNA em uma área definida garante que o sinal possa ser distinguido do ruído de fundo A paralelização massiva também é facilitada pela criação de muitos milhões de centros de reação SBL ou SBS individuais cada um com seu próprio modelo de DNA clonal Uma plataforma de sequenciamento pode coletar informações de muitos milhões de centros de reação simultaneamente sequenciando assim muitos milhões de moléculas de DNA em paralelo O sequenciamento por ligação pode ser feito pelas plataformas SOLiD e Complete Genomics Já o sequenciamento por síntese pode ser de vários tipos sendo dois deles o CRT com a plataforma Illumina e Qiagen e o SNA que pode ser feito por 454 ou Ion Torrent Sequenciamento de leitura longa Atualmente existem dois tipos principais de tecnologias de leitura longa abordagens de sequenciamento em tempo real de molécula única e abordagens sintéticas que dependem de tecnologias de leitura curta existentes para construir leituras longas in silico As abordagens de molécula única diferem das abordagens de leitura curta pois não dependem de uma população clonal de fragmentos de DNA amplificados para gerar sinal detectável nem requerem ciclagem química para cada dNTP adicionado Alternativamente as abordagens sintéticas não geram leituras longas reais em vez disso eles são uma abordagem para a preparação de bibliotecas que aproveita os códigos de barras para permitir a montagem computacional de um fragmento maior O sequenciamento de leitura longa de molécula única é feito pelas plataformas da PacBio e ONT Já a abordagem de leituras longas sintéticas ao contrário das verdadeiras plataformas de sequenciamento depende de um sistema de código de barras para associar fragmentos que são sequenciados em sequenciadores de leitura curta existentes Existem atualmente dois sistemas disponíveis para gerar leituras longas sintéticas a plataforma de sequenciamento sintético de leitura longa da Illumina e o sistema baseado em emulsão 10X Genomics 3 Descreva como ocorre o sequenciamento por síntese realizado em uma plataforma Illumina As abordagens de terminação reversível cíclica CRT são definidas pelo uso de moléculas terminadoras nas quais o grupo ribose 3OH é bloqueado impedindo o alongamento Para iniciar o processo um molde de DNA é iniciado por uma sequência complementar a uma região adaptadora que iniciará a ligação da polimerase a essa região de DNA de fita dupla dsDNA Durante cada ciclo é adicionada uma mistura de todos os quatro desoxinucleotídeos marcados individualmente e bloqueados em 3 dNTPs Após a incorporação de um único dNTP a cada fita complementar de alongamento os dNTPs não ligados são removidos e a superfície é fotografada para identificar qual dNTP foi incorporado em cada cluster O fluoróforo e o grupo de bloqueio podem então ser removidos e um novo ciclo pode começar O sistema Illumina CRT é o mais usado em comparação com outras plataformas O conjunto de instrumentos da Illumina para sequenciamento de leitura curta varia de pequenas unidades de bancada de baixo rendimento a grandes instrumentos de alto rendimento dedicados ao sequenciamento de genoma completo WGS em nível populacional A identificação de dNTP é obtida por meio de microscopia de fluorescência de reflexão interna total TIRF usando dois ou quatro canais de laser Na maioria das plataformas Illumina cada dNTP está vinculado a um único fluoróforo específico para esse tipo de base e requer quatro canais de imagem diferentes enquanto os sistemas NextSeq e MiniSeq usam um sistema de dois fluoróforos Assim no sequenciamento por síntese com abordagem de terminação cíclica reversível da Ilumina os seguintes eventos acontecem Após o enriquecimento do molde em fase sólida uma mistura de primers DNA polimerase e nucleotídeos modificados são adicionados à célula de fluxo Cada nucleotídeo é bloqueado por um grupo 3Oazidometil e é marcado com um fluoróforo clivável específico de base F Durante cada ciclo os fragmentos em cada cluster incorporam apenas um nucleotídeo pois o grupo 3 bloqueado impede incorporações adicionais Após a incorporação da base as bases não incorporadas são lavadas e a lâmina é fotografada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total TIRF usando dois ou quatro canais de laser a cor ou a falta ou mistura de cores no sistema de dois canais utilizado pelo NextSeq identifica qual base foi incorporada em cada cluster O corante é então clivado e o 3OH é regenerado com o agente redutor tris2carboxietilfosfina TCEP O ciclo de adição de nucleotídeos alongamento e clivagem pode então começar novamente 4 Sobre o sequenciamento de leituras longas longreads quais são as principais diferenças entre a abordagem em tempo real e a abordagem sintética Muitos dos elementos complexos dos genomas contém elementos repetitivos e longos com alterações no número de cópias e variações estruturais Sendo assim as tecnologias de leitura curta são insuficientes para resolvêlos Para esses casos é utilizado o sequenciamento de leitura longa que oferece leitura de vários kilobases Esse tipo de leitura é usado também em pesquisas transcriptômicas pela sua capacidade de abranger transcrições inteiras de mRNA permitindo identificar a conectividade precisa de éxons e discernir isoformas de genes Existem dois tipos de tecnologia de leitura longa a abordagem em tempo real de molécula única e a abordagem sintética que depende de tecnologias de leitura curta existentes para construir leituras longas in silico Essas abordagens são diferentes pois a abordagem em tempo real não depende de uma população clonal de fragmentos de DNA amplificados para gerar sinal detectável nem requerem ciclagem química para cada dNTP adicionado Já as abordagens sintéticas não geram leituras longas reais elas são uma abordagem para a preparação de bibliotecas que aproveita os códigos de barras para permitir a montagem computacional de um fragmento maior