Lista Interação de Proteínas

1 Explique o princípio do ensaio de doishíbridos para determinar a interação entre proteínas 2 Quando o ensaio é realizado em levedura célula hospedeira a seleção de clones é feita principalmente por seleção auxotrófica Explique esse aspecto exemplificando o modelo 3 Quando o ensaio é realizado em células animais células humanas pex a interação é identificada por um sistema repórter por exemplo a atividade da enzima luciferase Explique essa bordagem exemplificando o modelo 4 Em um ensaio de doishíbridos para determinar a putativa interação entre duas proteínas em um modelo em leveduras foram usados os vetores pGBKT7 e pGADT7 Sabendo que o ensaio foi conduzido em S cerevisiae usando um repórter de interação genômico pontue as três características do genótipo de uma cepa de escolha para o ensaio 5 No Mammalian TwoHybrid System CheckMateTM figura abaixo o domínio de ligação ao DNA e o domínio de ativação transcricional produzidos por plasmídeos separados estão intimamente associados quando uma proteína X fusionada a um domínio de ligação ao DNA interage com uma segunda proteína Y fusionado a um domínio de ativação transcricional Nesse sistema a interação entre as proteínas X e Y resulta na transcrição de um gene repórter Referência Sadowski I et al 1988 Nature 335 5634 Entre os vetores apresentados na figura acima identifique a construção codificante da proteína de fusão encerrando a o ativador transcricional b o domínio de ligação ao DNA e c a construção codificante do sistema repórter 1 1 Princípio do ensaio de doishíbridos O ensaio de doishíbridos Yeast TwoHybrid Y2H desenvolvido por Fields Song 1989 é um sistema genético utilizado para detectar interações proteínaproteína in vivo em levedura O método explora a organização modular de fatores de transcrição eucarióticos que normalmente possuem duas formas o domínio de ligação ao DNA DNAbinding domain DBD e o domínio de ativação transcricional activation domain AD Esses domínios podem funcionar independentemente Se separados não ativam a transcrição Entretanto quando aproximados fisicamente o fator de transcrição tornase funcional e ativa um gene repórter De forma prática no ensaio a proteína X é fusionada ao DBD e a proteína Y é fusionada ao AD Caso X e Y interajam fisicamente ocorre a reconstituição do fator de transcrição Então o complexo resultante ativa a expressão de genes repórteres no genoma da levedura Assim a ativação do repórter é proporcional à interação entre as proteínas testadas permitindo identificar interações diretas ou indiretas 2 Seleção auxotrófica em levedura Em Saccharomyces cerevisiae o sistema de doishíbridos utiliza cepas auxotróficas ou seja cepas com mutações que impedem a síntese de determinados aminoácidos ex trp1 leu2 Os plasmídeos usados no Y2H Yeast TwoHybrid como pGBKT7 gene marcador TRP1 e pGADT7 gene marcador LEU2 complementam essas mutações Para explicar como funciona essa seleção as leveduras transformadas com pGBKT7 crescem em SDTrp meio sintético definido sem triptofano Após as leveduras transformadas com pGADT7 crescem em SDLeu meio de cultura sintético definido para leveduras que não contém o aminoácido leucina Observando que para selecionar duplo transformantes usase SDTrpLeu meio de cultura sintético definido deficiente em triptofano e leucina Após selecionar transformantes a detecção da interação ocorre com meios mais restritivos temos como exemplo SDTrpLeuHis gene repórter HIS3 ativado pela 2 interação Assim o crescimento apenas em condições altamente seletivas indica que as proteínas interagem e ativam o repórter 3 Sistema repórter luciferase em células animais Em sistemas de doishíbridos em células de mamíferos Mammalian TwoHybrid Systems a seleção auxotrófica não se aplica Portanto utilizase um sistema repórter sendo a luciferase o mais comum O ensaio começa com a proteína X fusionada ao domínio de ligação ao DNA ex GAL4DBD e a proteína Y é fusionada ao domínio de ativação transcricional ex VP16 AD Um plasmídeo repórter que possui múltiplas cópias de GAL4UAS controlando a expressão do gene da luciferase Caso X e Y interagem DBD e AD se aproximam ativando o promotor Por fim a luciferase é produzida e sua atividade é medida por luminescência A intensidade luminosa é diretamente proporcional ao grau de interação proteína proteína Este sistema é altamente sensível e amplamente usado em biologia molecular e sinalização celular 4 Três características genotípicas essenciais da cepa de S cerevisiae para Y2H Para ensaios utilizando pGBKT7 e pGADT7 com repórter genômico a cepa ideal apresenta pontos específicos como Auxotrofias específicas sendo trp1 para selecionar pGBKT7 e leu2 para selecionar pGADT7 Essas mutações permitem seleção precisa dos plasmídeos carregados pelos transformantes Outro ponto são os genes repórteres integrados no genoma Esses genes são colocados sob controle de GAL4UAS e incluem HIS3 ADE2 e lacZ Eles só são ativados quando ocorre interação entre as proteínas fusionadas aos domínios DBD e AD E terceiro e último mutações que previnem ativação basal com gal4 elimina GAL4 endógeno e gal80 remove repressão de GAL4 Essas mutações reduzem falsos positivos tornando o sistema mais confiável Essas três características fazem da cepa um modelo confiável para detectar interações genuínas 5 Identificação das construções no sistema CheckMate Mammalian Two Hybrid 3 No sistema CheckMate Mammalian TwoHybrid Promega os vetores funcionam assim a Construção do codificante da proteína de fusão encerrando o ativador transcricional O vetor que codifica a proteína de fusão contendo o Domínio de Ativação AD da proteína GAL4 é o pGADT7 ele contém o gene GAL4 AD GAL4 Activation Domain e é utilizado para inserir o gene da proteína isca ou proteína Y no sistema de mamíferos no seu MCS Multiple Cloning Site A expressão é controlada pelo promotor PADH1 ele confere resistência à Ampicilina e contém o marcador auxotrófico LEU2 b Construção contendo o domínio de ligação ao DNA DBD O vetor que codifica a proteína de fusão contendo o domínio de ligação ao DNA BD da proteína GAL4 é o pGBKT7 Ele contém o gene GAL4 BD GAL4 DNABinding Domain e é utilizado para inserir o gene da proteína alvo ou proteína X no sistema de mamíferos no seu MCS Multiple Cloning Site A expressão é controlada pelo promotor PADH1 ele confere resistência à Kanamicina e contém o marcador auxotrófico TRP1 c Construção codificante do sistema repórter No contexto do sistema repórter para células de mamíferos Mammalian TwoHybrid System CheckMateTM o vetor que codifica o sistema repórter ativado pela interação das proteínas de fusão é o pG5luc Vector Este vetor contém os GAL4 Binding Sites Sítios de Ligação de GAL4 a montante de um gene repórter A ligação bemsucedida do domínio BDProteína X aos sítios GAL4 e o recrutamento do domínio ADProteína Y ou VP16 Fusion Protein no pACT ativam a transcrição do gene da luciferase resultando em luz que pode ser medida O pG5luc Vector é o elemento que por meio da transcrição ativada sinaliza visualmente a interação proteica REFERÊNCIAS livros e artigos científicos 1 FIELDS S SONG O A novel genetic system to detect protein protein interactions Nature v 340 p 245246 1989 Disponível em httpspubmedncbinlmnihgov2547163 2 Sadowski I Ma J Triezenberg S Ptashne M GAL4VP16 is an unusually potent transcriptional activator Nature v 335 p 563564 1988 Disponível em httpsescholarshiporgcontentqt7xf7440cqt7xf7440cpdf utmsource 4 3 PHIZICKY E M FIELDS S Proteinprotein interactions methods for detection and analysis Microbiological Reviews v 59 n 1 p 94123 1995 Disponível em httpswwwncbinlmnihgovpmcarticlesPMC239356 Livros 1 Lodish H et al Molecular Cell Biology W H Freeman Disponível em httpswwwscribdcomdocument482147677MolecularCellBiologypdf 2 Alberts B et al Molecular Biology of the Cell Garland Science Disponível em httpssirptsciencecollegeorgpdfsmicrobiologyAlbertsMolecular BiologyoftheCellpdf Manuais técnicos científicos 1 Promega Corporation CheckMate Mammalian TwoHybrid System Technical Manual Disponível em httpswwwpromegacommediafilesresourcesprotocolstechnicalmanuals0 checkmatemammaliantwohybridsystemprotocolpdf 2 Clontech Laboratories Yeast TwoHybrid System User Manual Disponível em httpswwwtakarabiocomdocumentsUser20ManualMatchmaker 20Gold20Yeast20TwoMatchmaker20Gold20Yeast20TwoHybrid 20System20User20Manualpdf srsltidAfmBOookPbhc3aRigwQVgvyAsEemfH7MmYwMyIkJOETdFtPvKqrCY3k 1 1 Princípio do ensaio de doishíbridos O ensaio de doishíbridos Yeast TwoHybrid Y2H desenvolvido por Fields Song 1989 é um sistema genético utilizado para detectar interações proteínaproteína in vivo em levedura O método explora a organização modular de fatores de transcrição eucarióticos que normalmente possuem duas formas o domínio de ligação ao DNA DNAbinding domain DBD e o domínio de ativação transcricional activation domain AD Esses domínios podem funcionar independentemente Se separados não ativam a transcrição Entretanto quando aproximados fisicamente o fator de transcrição tornase funcional e ativa um gene repórter De forma prática no ensaio a proteína X é fusionada ao DBD e a proteína Y é fusionada ao AD Caso X e Y interajam fisicamente ocorre a reconstituição do fator de transcrição Então o complexo resultante ativa a expressão de genes repórteres no genoma da levedura Assim a ativação do repórter é proporcional à interação entre as proteínas testadas permitindo identificar interações diretas ou indiretas 2 Seleção auxotrófica em levedura Em Saccharomyces cerevisiae o sistema de doishíbridos utiliza cepas auxotróficas ou seja cepas com mutações que impedem a síntese de determinados aminoácidos ex trp1 leu2 Os plasmídeos usados no Y2H Yeast TwoHybrid como pGBKT7 gene marcador TRP1 e pGADT7 gene marcador LEU2 complementam essas mutações Para explicar como funciona essa seleção as leveduras transformadas com pGBKT7 crescem em SDTrp meio sintético definido sem triptofano Após as leveduras transformadas com pGADT7 crescem em SDLeu meio de cultura sintético definido para leveduras que não contém o aminoácido leucina Observando que para selecionar duplo transformantes usase SDTrpLeu meio de cultura sintético definido deficiente em triptofano e leucina Após selecionar transformantes a detecção da interação ocorre com meios mais restritivos temos como exemplo SDTrpLeuHis gene repórter HIS3 ativado pela interação Assim o crescimento apenas em condições altamente seletivas indica que as proteínas interagem e ativam o repórter 2 3 Sistema repórter luciferase em células animais Em sistemas de doishíbridos em células de mamíferos Mammalian TwoHybrid Systems a seleção auxotrófica não se aplica Portanto utilizase um sistema repórter sendo a luciferase o mais comum O ensaio começa com a proteína X fusionada ao domínio de ligação ao DNA ex GAL4DBD e a proteína Y é fusionada ao domínio de ativação transcricional ex VP16AD Um plasmídeo repórter que possui múltiplas cópias de GAL4UAS controlando a expressão do gene da luciferase Caso X e Y interagem DBD e AD se aproximam ativando o promotor Por fim a luciferase é produzida e sua atividade é medida por luminescência A intensidade luminosa é diretamente proporcional ao grau de interação proteína proteína Este sistema é altamente sensível e amplamente usado em biologia molecular e sinalização celular 4 Três características genotípicas essenciais da cepa de S cerevisiae para Y2H Para ensaios utilizando pGBKT7 e pGADT7 com repórter genômico a cepa ideal apresenta pontos específicos como Auxotrofias específicas sendo trp1 para selecionar pGBKT7 e leu2 para selecionar pGADT7 Essas mutações permitem seleção precisa dos plasmídeos carregados pelos transformantes Outro ponto são os genes repórteres integrados no genoma Esses genes são colocados sob controle de GAL4UAS e incluem HIS3 ADE2 e lacZ Eles só são ativados quando ocorre interação entre as proteínas fusionadas aos domínios DBD e AD E terceiro e último mutações que previnem ativação basal com gal4 elimina GAL4 endógeno e gal80 remove repressão de GAL4 Essas mutações reduzem falsos positivos tornando o sistema mais confiável Essas três características fazem da cepa um modelo confiável para detectar interações genuínas 5 Identificação das construções no sistema CheckMate Mammalian Two Hybrid No sistema CheckMate Mammalian TwoHybrid Promega os vetores funcionam assim 3 a Construção do codificante da proteína de fusão encerrando o ativador transcricional O vetor que codifica a proteína de fusão contendo o Domínio de Ativação AD da proteína GAL4 é o pGADT7 ele contém o gene GAL4 AD GAL4 Activation Domain e é utilizado para inserir o gene da proteína isca ou proteína Y no sistema de mamíferos no seu MCS Multiple Cloning Site A expressão é controlada pelo promotor PADH1 ele confere resistência à Ampicilina e contém o marcador auxotrófico LEU2 b Construção contendo o domínio de ligação ao DNA DBD O vetor que codifica a proteína de fusão contendo o domínio de ligação ao DNA BD da proteína GAL4 é o pGBKT7 Ele contém o gene GAL4 BD GAL4 DNABinding Domain e é utilizado para inserir o gene da proteína alvo ou proteína X no sistema de mamíferos no seu MCS Multiple Cloning Site A expressão é controlada pelo promotor PADH1 ele confere resistência à Kanamicina e contém o marcador auxotrófico TRP1 c Construção codificante do sistema repórter No contexto do sistema repórter para células de mamíferos Mammalian TwoHybrid System CheckMateTM o vetor que codifica o sistema repórter ativado pela interação das proteínas de fusão é o pG5luc Vector Este vetor contém os GAL4 Binding Sites Sítios de Ligação de GAL4 a montante de um gene repórter A ligação bemsucedida do domínio BDProteína X aos sítios GAL4 e o recrutamento do domínio ADProteína Y ou VP16 Fusion Protein no pACT ativam a transcrição do gene da luciferase resultando em luz que pode ser medida O pG5luc Vector é o elemento que por meio da transcrição ativada sinaliza visualmente a interação proteica REFERÊNCIAS livros e artigos científicos 1 FIELDS S SONG O A novel genetic system to detect proteinprotein interactions Nature v 340 p 245246 1989 Disponível em httpspubmedncbinlmnihgov2547163 2 Sadowski I Ma J Triezenberg S Ptashne M GAL4VP16 is an unusually potent transcriptional activator Nature v 335 p 563564 1988 Disponível em httpsescholarshiporgcontentqt7xf7440cqt7xf7440cpdfutmsource 3 PHIZICKY E M FIELDS S Proteinprotein interactions methods for detection and analysis Microbiological Reviews v 59 n 1 p 94123 1995 Disponível em httpswwwncbinlmnihgovpmcarticlesPMC239356 Livros 4 1 Lodish H et al Molecular Cell Biology W H Freeman Disponível em httpswwwscribdcomdocument482147677MolecularCellBiologypdf 2 Alberts B et al Molecular Biology of the Cell Garland Science Disponível em httpssirptsciencecollegeorgpdfsmicrobiologyAlbertsMolecular BiologyoftheCellpdf Manuais técnicos científicos 1 Promega Corporation CheckMate Mammalian TwoHybrid System Technical Manual Disponível em httpswwwpromegacom mediafilesresourcesprotocolstechnicalmanuals0checkmatemammaliantwo hybridsystemprotocolpdf 2 Clontech Laboratories Yeast TwoHybrid System User Manual Disponível em httpswwwtakarabiocomdocumentsUser20ManualMatchmaker20Gold20Ye ast20TwoMatchmaker20Gold20Yeast20Two Hybrid20System20User20ManualpdfsrsltidAfmBOookPbhc3aRigwQVgvyA sEemfH7MmYwMyIkJOETdFtPvKqrCY3k