Cancer e Melanoma Introducao e Caracteristicas Essenciais

1 INTRODUÇÃO 11 CÂNCER E MELANOMA Câncer é um grupo de mais de 100 doenças que são definidas pelo crescimento celular desregulado a possibilidade de invadir órgãos e tecidos e formar metástases Hanahan 2022 descreve oito características que as células adquirem durante o processo de formação do câncer sendo a habilidade de manter a sinalização proliferativa contornar a ação dos supressores de crescimento resistir à morte celular permitir a imortalidade replicativa induzir a angiogênese induzir a invasão e a metástase reprogramar o metabolismo celular e evitar a destruição imunológica Esses atributos são adquiridos a partir de mutações no DNA causadas ao longo do desenvolvimento da doença O melanoma ocorre a partir de mutações nos melanócitos que são células encontradas no estrato basal da epiderme e responsáveis pela produção da melanina substância que determina a cor da pele olhos e cabelos INGRAFFEA 2013 Diversos fatores influenciam o surgimento do melanoma como quantidade de nevos cor de pele branca exposição solar desprotegida cumulativa ou intensa com queimadura em especial quando ocorrem nas primeiras décadas de vida história familiar de câncer de pele história de neoplasia maligna entre outros O melanoma pode ser dividido em estágios fase de crescimento radial fase de crescimento vertical e melanoma metastático CABRERA RECULE 2018 Os nevos benignos são aglomerados de melanócitos que também são conhecidos como pintas e podem estar presentes desde o nascimento ou surgir na infância Os nevos benignos apresentam baixa probabilidade de evoluir para melanoma Na fase de crescimento radial do melanoma a lesão é plana se localiza na epiderme e pode se estender por diversos cm2 de pele durante anos sem se tornar invasiva Na fase de crescimento vertical do melanoma as células malignas invadem a derme e tecido subcutâneo e podem invadir os vasos linfáticos e sanguíneos através da invasão vascular que envolve vários passos incluindo a degradação da matriz extracelular e a interação com as células endoteliais e fazer migração para dentro dos vasos As células do melanoma podem se ligar às células endoteliais e atravessar a parede do vaso uma vez dentro do vaso as células do melanoma podem chegar em diferentes órgãos LEONARDI et al 2018 RASTRELLI et al 2014 O prognóstico está diretamente correlacionado com a profundidade da invasão das células malignas Na fase de crescimento metastático as células já invadiram e colonizaram outros locais formando tumores secundários SHAIN BASTIAN 2016 O melanoma metastático é altamente invasivo no entanto se houver a retirada cirúrgica nos estágios iniciais da doença normalmente as chances de sobrevida livre de melanoma são maiores Além disso o tratamento para melanoma pode ser realizado através de quimioterapia imunoterapia e radioterapia RASTRELLI 2014 Muitos dos fármacos utilizados para o tratamento de câncer visam a regulação de proteínas específicas envolvidas nos processos de morte celular uma vez que a desregulação dessas proteínas está diretamente ligada ao processo de formação do câncer HARTMAN 2020 12 MORTE CELULAR A morte celular é um processo biológico complexo e essencial que tem papel fundamental para o desenvolvimento a homeostase e a saúde de um organismo Alguns tipos de morte celular envolvem vias de sinalização complexas e expressão de proteínas que podem levar à morte celular programada As principais formas de morte celular programada são a apoptose necroptose e autofagia DARCY 2019 A apoptose é um processo programado de morte celular que ocorre por meio da ativação de uma série de proteínas e cascatas de sinalização GONG et al2018 É um mecanismo de morte celular programada que ocorre em células eucarióticas O processo de apoptose pode ocorrer por duas vias a via intrínseca e a via extrínseca A via intrínseca é iniciada através de sinais endógenos como o estresse oxidativo em que a célula irá ativar proteínas próapoptóticas que irão causar a permeabilização da membrana mitocondrial que liberará citocromo c Através da liberação de citocromo c ocorre a formação do apoptossomo O apoptossomo é um complexo proteico formado pelas proteínas caspase9 Apaf1 e procaspase3 Essas proteínas são responsáveis pela ativação das caspases 3 e 7 que desencadeiam a morte celular por apoptose CARNEIRO ELDEIRY 2020 Por outro lado a via extrínseca é iniciada através de sinais exógenos citocinas radiação UV e agentes químicos fator de crescimento E os receptores de morte A via é ativada por receptores de morte que levarão a formação do complexo DISC que ativarão as caspases 8 e 10 e por fim ativam as caspases 3 e 7 que levam à apoptose A autofagia é um processo catabólico lisossomal que ao promover a degradação e a reciclagem de componentes da célula mantém a homeostasia celular GUIMARÃES2014 Os processos de autofagia ocorrem frequentemente em condições fisiológicas normais atuando na reciclagem de células velhas porém o aumento da autofagia pode estar associado a algumas doenças como síndromes neurodegenerativas e câncer A necroptose é um tipo de morte celular programada que difere da apoptose por ser um processo inflamatório e envolver a ruptura da membrana celular Ela tem sido estudada como uma possível estratégia para combater o câncer incluindo o melanoma que é um tipo de câncer de pele agressivo e de rápido crescimento Hanahan Weinberg 2011 é mediada por proteínas específicas como receptorinteragindo proteína quinase 1 RIPK1 RIPK3 e proteína mista de linhagem quinase3 MLKL Degterev et al 2005 Sun et al 2012 O início da necroptose envolve a interação entre ligantes e seus respectivos receptores levando à ativação da via necroptótica Quando o TNFα se liga ao TNFR1 ocorre a formação do Complexo I composto por várias proteínas incluindo TNFR1 TRADD proteína adaptadora associada a domínio de morte RIPK1 TRAF2 fator associado ao receptor do TNF 2 e cIAPs proteínas inibidoras do apoptose celular Wajant et al 2003 Em condições normais as cIAPs promovem a ubiquitinação da RIPK1 levando à ativação da via de sobrevivência celular mediada pela via do fator nuclear kappa B NFκB No entanto quando as cIAPs estão ausentes ou inibidas a RIPK1 não é ubiquitinada e se associa com o FADD domínio de morte associado ao fator e as caspases formando o Complexo II que pode induzir a apoptose Vandenabeele et al 2010 Se a apoptose estiver bloqueada como na presença de inibidores de caspase ou em células deficientes em caspase a RIPK1 interage com a RIPK3 e forma o complexo necrosoma A ativação desse complexo leva à fosforilação e ativação da MLKL que por sua vez induz a ruptura da membrana celular e a necroptose Sun et al 2012 O complexo RIP1RIP3MLKL é um conjunto crítico de proteínas envolvidas no processo de necroptose A ativação desse complexo é iniciada pela interação entre RIPK1 Receptorinteragindo proteína quinase 1 e RIPK3 Receptorinteragindo proteína quinase 3 em resposta a estímulos necroptóticos como a ligação do Fator de Necrose Tumoral alfa TNFα a seu receptor Quando a apoptose está comprometida RIPK1 recruta RIPK3 formando um oligômero chamado necrosoma Cho et al 2009 A formação do necrosoma leva à ativação de RIPK3 por autofosforilação e subsequente fosforilação da proteína MLKL Proteína mista de linhagem quinase3 Sun et al 2012 Uma vez fosforilada a MLKL sofre uma mudança conformacional que permite sua oligomerização e translocação para a membrana celular Wang et al 2014 A oligomerização da MLKL provoca a formação de poros na membrana plasmática resultando em um influxo de íons e água levando à ruptura da membrana celular e por fim à necroptose Chen et al 2014 Já a autofagia é um processo conservado evolutivamente que permite às células degradar e reciclar seus próprios componentes intracelulares É um mecanismo de resposta a situações de estresse celular como falta de nutrientes hipóxia danos no DNA e agressões externas A autofagia envolve a formação de vesículas duplas membranosas chamadas autofagossomos que se fundem com os lisossomos para degradar e reciclar as macromoléculas e organelas sequestradas Mizushima et al 2008 A relação entre autofagia e câncer é complexa desempenhando tanto papéis protetores quanto promotores do desenvolvimento tumoral No início da formação do câncer a autofagia pode atuar como um mecanismo supressor tumoral eliminando organelas danificadas e prevenindo o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e mutações no DNA A perda ou inibição da autofagia pode aumentar a susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores Mathew et al 2007 As células tumorais podem usar a autofagia para reciclar componentes celulares e gerar energia auxiliando no crescimento e progressão do tumor White 2015 Além disso a autofagia também pode desempenhar um papel na resistência a terapias anticâncer já que as células cancerígenas podem utilizar esse processo para se proteger contra os danos induzidos pelo tratamento Amaravadi et al 2016 A iniciação da autofagia envolve a ativação de um complexo proteico composto por várias proteínas Atg autophagyrelated genes que trabalham em conjunto para iniciar a formação do autofagossomo O complexo ULK1 composto por ULK1 Atg13 Atg101 e FIP200 é crucial para o início da nucleação do autofagossomo A ativação desse complexo é regulada pela atividade do complexo mTORC1 alvo da rapamicina em mamíferos que inibe a autofagia sob condições de nutrientes abundantes Em condições de estresse como falta de nutrientes hipóxia ou tratamento com agentes quimioterápicos no contexto do câncer a atividade do mTORC1 é suprimida permitindo a ativação do complexo ULK1 e a subsequente iniciação da autofagia Jung et al 2010 Saxton Sabatini 2017 Outra proteína importante na biogênese do autofagossomo é a microtúbulo proteína associada à luz 3 LC3 que existe em duas formas LC3I e LC3II A LC3I é convertida em LC3II por meio de um processo de conjugação mediado por outras proteínas Atg incluindo Atg4 Atg7 e Atg3 A LC3II é essencial para a elongação e maturação do autofagossomo atuando na expansão e fechamento da membrana dupla Kabeya et al 2000 Devido à grande capacidade adaptativa e a alta resistência do melanoma aos diversos tipos de morte celular programada é necessário buscar novos compostos para seu tratamento 13 ERGOSTEROL Em eucariotos a membrana plasmática celular contém esteróis necessários para a organização e função desta estrutura São três as formas principais de esteróis encontradas em eucariotos colesterol em vertebrados fitoesterol em plantas e ergosterol em fungos Cada um destes é o produto final de uma longa via biossintética de várias etapas que se origina a partir de uma via inicial comum como acetilCoA para epóxido de esqualeno DE VRIESE et al 2021 O ergosterol têm uma estrutura tetracíclica cadeias laterais acila e grupos hidroxila hidrofílicos Figura 1 Todavia o ergosterol se diferencia do colesterol pela presença de duas ligações duplas adicionais entre carbono 7 C7 e C8 sendo esse primeiro classificado como saturado e secundário e o segundo insaturado e secundário no anel e entre C22 e C23 na cadeia lateral GIRARDI PIVA et al 2022 FIGURA 1 Representação estrutural do ergosterol Fonte Dreams time 2023 A via biossintética do ergosterol envolve passos complexos e que consome muita energia pois utiliza diversas enzimas A quantidade de ergosterol é altamente regulada pela biodisponibilidade de metabólitos específicos como o ferro e o oxigênio além de condições ambientais JORDÁ et al 2020 Em Saccharomyces cerevisiae organismo modelo de estudo foram identificados a via de biossíntese sendo esta regulada em três módulos O primeiro é a partir da acetilCoA que leva a formação do mevalonato O segundo é a síntese de farnesil pirofosfato E o terceiro é a síntese do ergosterol propriamente dita sendo que estas reações ocorrem no retículo endoplasmático Figura 2 HU et al 2017 FIGURA 2 Síntese do ergosterol Fonte Adaptado mais soja 2023 Em razão de suas propriedades versáteis os esteróis manifestam inúmeros empregos nas indústrias alimentícia e farmacêutica O ergosterol não somente promove o crescimento celular como auxilia a sinalização de fabricação de drogas esteróides em células tumorais de câncer de mama o peróxido de ergosterol demonstrou ter atividade antitumoral uma vez que interrompe o crescimento destas células LI et al2015 Diante do exposto buscase descobrir se o composto possui efeito em células de melanoma uma vez que esse é considerado um câncer agressivo e altamente metastático por essa razão o ergosterol será testado em células de melanoma murino e humano 2 OBJETIVOS 21 21 OBJETIVOS GERAIS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino B16F10Nex 2 e melanoma humano SKMEL25 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino e humano Investigar se o composto causa morte celular nas linhagens testadas e quais os possíveis mecanismos de morte induzidos por ele Analisar diferenças morfológicas das células tratadas com ergosterol e células não tratadas 3 METODOLOGIA 31 MATERIAIS E MÉTODOS 311 Linhagens celulares As células do melanoma murino B16F10NEX2 e melanoma humano SK MEL25 foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr Luiz r Travassos in memorian UNIFESP São Paulo SP 312 Ergosterol O Ergosterol FLUKA 45480 foi gentilmente cedido pela Profa Dra Silvia Uliana Reni USP São Paulo SP Uma solução estoque de 840 mM foi preparada para cada um dos experimentos através da diluição de 10 mg de ergosterol para 300 μL de etanol absoluto Merck Ref 1009831000 313 Reagentes O meio utilizado para cultura de células B16F10Nex2 será Roswell Park Memorial Institute RPMI1640 e para SKMEL25 será Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM Os meios de cultura RPMI1640 e DMEM terão pH de 74 e serão suplementados com 10 mM de HEPES 24 mM de bicarbonato de sódio 1 mL de sulfato de gentamicina e 10 de soro fetal bovino SFB Os reagentes para contagem celular serão PBS 1x tripsina 0005 meio de cultura RPMI ou DMEM e corante azul de tripan 04 Para investigação de morte celular serão utilizados os inibidores ZVADOMeFMK ZVADFMK 3 Metiladenina 3MA Necrostatina1 NEC1 314 Viabilidade celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas em placas de 96 poços em uma concentração de 5 x 103 e incubadas em estufa a 37ºC e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão tratadas com ergosterol nas concentrações de 6 mM 12 mM 25 mM 50 mM 75 mM e 100 mM e as células não tratadas serão incubadas em meio RPMI ou DMEN com 2 de etanol Após 24 horas do tratamento as células serão lavadas com 100 μL de PBS 1x e serão desaderidas com 25 μL de tripsina edta A ação da tripsina edta será neutralizada com 25 μL de meio RPMI ou DMEN e em seguida será dado seguimento à contagem das células através do ensaio de exclusão com azul de tripanSerá adicionado 25 µL de azul de tripan nas células em suspensão e posteriormente 10 µL da solução de azul de tripan e células em suspensão serão depositas em câmara de Neubauer onde serão contados quatro quadros de 1mm² da câmara através de microscópio óptico invertido 315 Ensaios de migração celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas 15x105 em placas de 12 poços e após 24 horas de incubação em estufa a 37º C e atmosfera com 5 de CO2 será realizada uma lesão vertical em cada poço Posteriormente as células serão tratadas o composto ergosterol e como controle positivo as células serão incubadas com meio de cultura e 2 de etanol Serão capturadas imagens com intervalos de 0 12 24 36 e 48 horas após o tratamento A distância percorrida das células será computada através do software ImageJ 316 Ensaio Clonogênico Células B16F10Nex2 e SKMEL25 na densidade de 5x102 serão plaqueadas em placas de 12 poços e tratadas com 750 μL de meio RPMI ou DMEN juntamente com o composto ergosterol Como controle negativo será utilizado meio de cultura e 2 de etanol absoluto Após cinco dias será acrescentado mais 300 µL de solução de tratamento e de controle negativo aos poços No decimo dia as células serão fixadas com etanol por 10 minutos em temperatura ambiente lavadas com PBS 1X e coradas com cristal violeta em H2O miliQ por 10 minutos e após 3 lavagens com PBS as células serão contadas com auxílio de uma lupa 4X A área das colônias será quantificada através do Software ImageJ 317 Inibidores de morte Para investigar os mecanismos de morte as células B16F10Nex2 serão cultivadas em placas de 96 poços na concentração de 5x103 e incubadas em estufa a 37º C e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão préincubadas com inibidores de morte celular e após o tempo de préincubação de cada inibidor as células serão tratadas com o inibidor e o composto ergosterol Como controle positivo as células serão tratadas apenas com o inibidor de interesse e como controle negativo as células serão tratadas apenas com o composto ergosterol Além disso as células também serão tratadas com meio de cultura e 2 de etanol como controle de células não tratadas Após o período de tratamento as células serão desaderidas e a viabilidade será determinada através do ensaio de exclusão de azul tripan 4 RESULTADOS ESPERADOS CRONOGRAMA 1º Semestre 2023 2º Semestre 2023 REFERÊNCIAS AOKI Masahiro FUJISHITA Teruaki Oncogenic Roles of the PI3KAKTmTOR Axis Current Topics In Microbiology And Immunology SL p 153189 2017 Springer International Publishing BOONE Brian A ZEH Herbert J BAHARY Nathan Autophagy Inhibition in Pancreatic Adenocarcinoma Clinical Colorectal Cancer SL v 17 n 1 p 25 31 mar 2018 Elsevier BV CABRERA Raúl RECULE Francisca Unusual Clinical Presentations of Malignant Melanoma a review of clinical and histologic features with special emphasis on dermatoscopic findings American Journal Of Clinical Dermatology SL v 19 n 1 p 1523 30 out 2018 Springer Science and Business Media LLC CARNEIRO Benedito A ELDEIRY Wafik S Targeting apoptosis in cancer therapy Nature Reviews Clinical Oncology SL v 17 n 7 p 395417 23 mar 2020 Springer Science and Business Media LLC DARCY Mark S Cell death a review of the major forms of apoptosis necrosis and autophagy Cell biology international v 43 n 6 p 582592 2019 VRIESE Kjell de POLLIER Jacob GOOSSENS Alain BEECKMAN Tom VANNESTE Steffen Dissecting cholesterol and phytosterol biosynthesis via mutants and inhibitors Journal Of Experimental Botany SL v 72 n 2 p 241253 15 set 2020 Oxford University Press OUP httpdxdoiorg101093jxberaa429 CRONOGRAMA Viabilidade celular B16F10Nex2 X Migração celular B16F10Nex2 X Ensaio clonogênico em células B16F10Nex2 X Inibidores de morte B16F10Nex2 X Viabilidade celular SKMEL25 X Migração celular SKMEL25 X EDINGER Aimee L THOMPSON Craig B Death by design apoptosis necrosis and autophagy Current Opinion In Cell Biology SL v 16 n 6 p 663 669 dez 2004 PIVA Giovana Girardi CASALTA Erick LEGRAS JeanLuc TESNIÈRE Catherine SABLAYROLLES JeanMarie FERREIRA David ORTIZJULIEN Anne GALEOTE Virginie MOURET JeanRoch Characterization and Role of Sterols in Saccharomyces cerevisiae during White Wine Alcoholic Fermentation Fermentation SL v 8 n 2 p 90 21 fev 2022 MDPI AG httpdxdoiorg103390fermentation8020090 GONG Yi Nan CRAWFORD Jeremy Chase HECKMANN Bradlee L GREEN Douglas R To the edge of cell death and back The Febs Journal SL v 286 n 3 p 430440 19 dez 2018 Wiley httpdxdoiorg101111febs14714 GUIMARÃES Larissa JIMENEZ Paula SOUSA Thiciana FREITAS Hozana ROCHA Danilo WILKE Diego MARTÍN Jesús REYES Fernando PESSOA Otília Deusdênia Loiola COSTALOTUFO Letícia Chromomycin A2 Induces Autophagy in Melanoma Cells Marine Drugs SL v 12 n 12 p 5839 5855 4 dez 2014 MDPI AG httpdxdoiorg103390md12125839 HANAHAN Douglas Hallmarks of cancer new dimensions Cancer discovery v 12 n 1 p 3146 2022 HARTMAN Mariusz L NonApoptotic Cell Death Signaling Pathways in Melanoma International Journal Of Molecular Sciences SL v 21 n 8 p 2980 23 abr 2020 HU Zhihong et al Recent advances in ergosterol biosynthesis and regulation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae Indian journal of microbiology v 57 n 3 p 270277 2017 INGRAFFEA Adam Melanoma Facial Plastic Surgery Clinics of North America v 1 n 21 p 3342 2013 JORDÁ Tania PUIG Sergi Regulation of ergosterol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae Genes v 11 n 7 p 795 2020 LEONARDI Giulia FALZONE Luca SALEMI Rossella ZANGHÏ Antonino SPANDIDOS Demetrios MCCUBREY James CANDIDO Saverio LIBRA Massimo Cutaneous melanoma from pathogenesis to therapy review International Journal Of Oncology p 10711080 27 fev 2018 RASTRELLI Marco et al Melanoma epidemiology risk factors pathogenesis diagnosis and classification In vivo v 28 n 6 p 10051011 2014 SHAIN A Hunter BASTIAN Boris C From melanocytes to melanomas Nature Reviews Cancer SL v 16 n 6 p 345358 29 abr 2016 Springer Science and Business Media LLC CONTENTS Report of the Directors 1 Information to Shareholders 6 Notes to the Accounts 8 Ten Year Financial Record 18 Independent Auditors Report 19 Balance Sheet 20 Profit and Loss Account 22 Cash Flow Statement 23 Statement of Accounting Policies 24 NOTES TO THE ACCOUNTS 1 Turnover 26 2 Operating Loss 26 3 Exceptional Items 26 4 Loss on Ordinary Activities before Taxation 27 5 Taxation 27 6 Dividends 27 7 Loss per Share 27 8 Tangible Fixed Assets 27 9 Business and Property Investments 28 10 Investment in Own Shares 29 11 Debtors 29 12 Creditors 29 13 Loan Capital 30 14 Deferred Taxation 30 15 Share Capital 30 16 Share Premium and Capital Reserves 30 17 Operating Lease Commitments 31 18 Contingent Liabilities 31 19 Pension Schemes 31 20 Employee Details 31 21 Financial Instruments 32 22 Related Parties 32 23 Post Balance Sheet Events 32 GROUP INFORMATION Nominal Holdings of Subsidiary and Associated Companies 33 Appointments for December 1993 34 Worldwide Service Centres of BICC plc 35 BICC Shareholder Enquiries inside back cover BICC The International Cable Group Annual Report and Accounts 1993 Printed copy pages 336 1 INTRODUÇÃO 11 CÂNCER E MELANOMA Câncer é um grupo de mais de 100 doenças que são definidas pelo crescimento celular desregulado a possibilidade de invadir órgãos e tecidos e formar metástases Hanahan 2022 descreve oito características que as células adquirem durante o processo de formação do câncer sendo a habilidade de manter a sinalização proliferativa contornar a ação dos supressores de crescimento resistir à morte celular permitir a imortalidade replicativa induzir a angiogênese induzir a invasão e a metástase reprogramar o metabolismo celular e evitar a destruição imunológica Esses atributos são adquiridos a partir de mutações no DNA causadas ao longo do desenvolvimento da doença O melanoma ocorre a partir de mutações nos melanócitos que são células encontradas no estrato basal da epiderme e responsáveis pela produção da melanina substância que determina a cor da pele olhos e cabelos INGRAFFEA 2013 Diversos fatores influenciam o surgimento do melanoma como quantidade de nevos cor de pele branca exposição solar desprotegida cumulativa ou intensa com queimadura em especial quando ocorrem nas primeiras décadas de vida história familiar de câncer de pele história de neoplasia maligna entre outros O melanoma pode ser dividido em estágios fase de crescimento radial fase de crescimento vertical e melanoma metastático CABRERA RECULE 2018 Os nevos benignos são aglomerados de melanócitos que também são conhecidos como pintas e podem estar presentes desde o nascimento ou surgir na infância Os nevos benignos apresentam baixa probabilidade de evoluir para melanoma Na fase de crescimento radial do melanoma a lesão é plana se localiza na epiderme e pode se estender por diversos cm2 de pele durante anos sem se tornar invasiva Na fase de crescimento vertical do melanoma as células malignas invadem a derme e tecido subcutâneo e podem invadir os vasos linfáticos e sanguíneos através da invasão vascular que envolve vários passos incluindo a degradação da matriz extracelular e a interação com as células endoteliais e fazer migração para dentro dos vasos As células do melanoma podem se ligar às células endoteliais e atravessar a parede do vaso uma vez dentro do vaso as células do melanoma podem chegar em diferentes órgãos LEONARDI et al 2018 RASTRELLI et al 2014 O prognóstico está diretamente correlacionado com a profundidade da invasão das células malignas Na fase de crescimento metastático as células já invadiram e colonizaram outros locais formando tumores secundários SHAIN BASTIAN 2016 O melanoma metastático é altamente invasivo no entanto se houver a retirada cirúrgica nos estágios iniciais da doença normalmente as chances de sobrevida livre de melanoma são maiores Além disso o tratamento para melanoma pode ser realizado através de quimioterapia imunoterapia e radioterapia RASTRELLI 2014 Muitos dos fármacos utilizados para o tratamento de câncer visam a regulação de proteínas específicas envolvidas nos processos de morte celular uma vez que a desregulação dessas proteínas está diretamente ligada ao processo de formação do câncer HARTMAN 2020 12 MORTE CELULAR A morte celular é um processo biológico complexo e essencial que tem papel fundamental para o desenvolvimento a homeostase e a saúde de um organismo Alguns tipos de morte celular envolvem vias de sinalização complexas e expressão de proteínas que podem levar à morte celular programada As principais formas de morte celular programada são a apoptose necroptose e autofagia DARCY 2019 A apoptose é um processo programado de morte celular que ocorre por meio da ativação de uma série de proteínas e cascatas de sinalização GONG et al2018 É um mecanismo de morte celular programada que ocorre em células eucarióticas O processo de apoptose pode ocorrer por duas vias a via intrínseca e a via extrínseca A via intrínseca é iniciada através de sinais endógenos como o estresse oxidativo em que a célula irá ativar proteínas próapoptóticas que irão causar a permeabilização da membrana mitocondrial que liberará citocromo c ou também pode ser ativada ativada por estresse intracelular ou extracelular como a privação de fatores de crescimento danos no DNA hipóxia ou ativação de oncogenes Estes eventos resultam em sinais que induzem a permeabilização mitocondrial e levam à liberação de moléculas próapoptóticas no citoplasma como o citocromo c DARCY 2019 Através da liberação de citocromo c ocorre a formação do apoptossomo O apoptossomo é um complexo protéico formado pelas proteínas caspase9 Apaf1 e procaspase3 Essas proteínas são responsáveis pela ativação das caspases 3 e 7 que desencadeiam a morte celular por apoptose CARNEIRO ELDEIRY 2020 Por outro lado a via extrínseca é iniciada através de sinais exógenos citocinas radiação UV agentes químicos que acarretam a ligação com receptores de morte Estes são membros da superfamília do fator de necrose tumoral TNF e incluem vários membros com cada um tendo um ligante de morte correspondente A via ativada por estes receptores de morte ligados aos seus ligantes respectivos levam à formação do complexo DISC que ativam as caspases 8 e 10 Para ativar a caspase 8 um ligante deve se ligar ao seu respectivo receptor de morte resultando no recrutamento da procaspase 8 monomérica por meio de seu domínio indutor de morte DED Então esta ligase a um complexo de sinal indutor de morte DISC O recrutamento de vários monômeros de procaspase 8 para o DISC resulta em sua dimerização e consequente ativação resultando em uma caspase 8 capaz de induzir apoptose por meio de uma ou outra das duas subvias distintas que por fim ativam as caspases 3 e 7 levando a célula a apoptose DARCY 2019 A autofagia é um processo catabólico lisossomal que ao promover a degradação e a reciclagem de componentes da célula mantém a homeostasia celular GUIMARÃES 2014 Os processos de autofagia ocorrem frequentemente em condições fisiológicas normais atuando na reciclagem de células velhas porém o aumento da autofagia pode estar associado a algumas doenças como síndromes neurodegenerativas e câncer A necroptose é um tipo de morte celular programada que difere da apoptose por ser um processo inflamatório e envolver a ruptura da membrana celular Ela tem sido estudada como uma possível estratégia para combater o câncer incluindo o melanoma que é um tipo de câncer de pele agressivo e de rápido crescimento Hanahan Weinberg 2011 é mediada por proteínas específicas como receptorinteragindo proteína quinase 1 RIPK1 RIPK3 e proteína mista de linhagem quinase3 MLKL DEGTEREV et al 2005 SUN et al 2012 O início da necroptose envolve a interação entre ligantes e seus respectivos receptores levando à ativação da via necroptótica Quando o TNFα se liga ao TNFR1 ocorre a formação do Complexo I composto por várias proteínas incluindo TNFR1 TRADD proteína adaptadora associada a domínio de morte RIPK1 TRAF2 fator associado ao receptor do TNF 2 e cIAPs proteínas inibidoras do apoptose celular WAJANT et al 2003 Em condições normais as cIAPs promovem a ubiquitinação da RIPK1 levando à ativação da via de sobrevivência celular mediada pela via do fator nuclear kappa B NFκB No entanto quando as cIAPs estão ausentes ou inibidas a RIPK1 não é ubiquitinada e se associa com o FADD domínio de morte associado ao fator e as caspases formando o Complexo II que pode induzir a apoptose VANDENABEELE et al 2010 Se a apoptose estiver bloqueada como na presença de inibidores de caspase ou em células deficientes em caspase a RIPK1 interage com a RIPK3 e forma o complexo necrosoma A ativação desse complexo leva à fosforilação e ativação da MLKL que por sua vez induz a ruptura da membrana celular e a necroptose SUN et al 2012 O complexo RIP1RIP3MLKL é um conjunto crítico de proteínas envolvidas no processo de necroptose A ativação desse complexo é iniciada pela interação entre RIPK1 Receptorinteragindo proteína quinase 1 e RIPK3 Receptorinteragindo proteína quinase 3 em resposta a estímulos necroptóticos como a ligação do Fator de Necrose Tumoral alfa TNFα a seu receptor Quando a apoptose está comprometida RIPK1 recruta RIPK3 formando um oligômero chamado necrosoma CHO et al 2009 A formação do necrosoma leva à ativação de RIPK3 por autofosforilação e subsequente fosforilação da proteína MLKL Proteína mista de linhagem quinase3 SUN et al 2012 Uma vez fosforilada a MLKL sofre uma mudança conformacional que permite sua oligomerização e translocação para a membrana celular WANG et al 2014 A oligomerização da MLKL provoca a formação de poros na membrana plasmática resultando em um influxo de íons e água levando à ruptura da membrana celular e por fim à necroptose CHEN et al 2014 Já a autofagia é um processo conservado evolutivamente que permite às células degradar e reciclar seus próprios componentes intracelulares É um mecanismo de resposta a situações de estresse celular como falta de nutrientes hipóxia danos no DNA e agressões externas A autofagia envolve a formação de vesículas duplas membranosas chamadas autofagossomos que se fundem com os lisossomos para degradar e reciclar as macromoléculas e organelas sequestradas MIZUSHIMA et al 2008 A relação entre autofagia e câncer é complexa desempenhando tanto papéis protetores quanto promotores do desenvolvimento tumoral No início da formação do câncer a autofagia pode atuar como um mecanismo supressor tumoral eliminando organelas danificadas e prevenindo o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e mutações no DNA A perda ou inibição da autofagia pode aumentar a susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores MATHEW et al 2007 As células tumorais podem usar a autofagia para reciclar componentes celulares e gerar energia auxiliando no crescimento e progressão do tumor WHITE 2015 Além disso a autofagia também pode desempenhar um papel na resistência a terapias anticâncer já que as células cancerígenas podem utilizar esse processo para se proteger contra os danos induzidos pelo tratamento AMARAVADI et al 2016 A iniciação da autofagia envolve a ativação de um complexo proteico composto por várias proteínas Atg autophagyrelated genes que trabalham em conjunto para iniciar a formação do autofagossomo O complexo ULK1 composto por ULK1 Atg13 Atg101 e FIP200 é crucial para o início da nucleação do autofagossomo A ativação desse complexo é regulada pela atividade do complexo mTORC1 alvo da rapamicina em mamíferos que inibe a autofagia sob condições de nutrientes abundantes Em condições de estresse como falta de nutrientes hipóxia ou tratamento com agentes quimioterápicos no contexto do câncer a atividade do mTORC1 é suprimida permitindo a ativação do complexo ULK1 e a subsequente iniciação da autofagia JUNG et al 2010 SAXTON SABATINI 2017 Outra proteína importante na biogênese do autofagossomo é a microtúbuloproteína associada à luz 3 LC3 que existe em duas formas LC3I e LC3II A LC3I é convertida em LC3II por meio de um processo de conjugação mediado por outras proteínas Atg incluindo Atg4 Atg7 e Atg3 A LC3II é essencial para a elongação e maturação do autofagossomo atuando na expansão e fechamento da membrana dupla KABEYA et al 2000 Devido à grande capacidade adaptativa e a alta resistência do melanoma aos diversos tipos de morte celular programada é necessário buscar novos compostos para seu tratamento Estes podem ser encontrados em grande número na natureza e o potencial antitumoral de seus componentes ainda não foi totalmente investigado Entretanto sabese que é possível que quimioterápicos desenvolvidos a partir de componentes naturais podem apresentar a mesma eficácia que as drogas sintéticas e menos efeitos colaterais o que é um grande atrativo para realizar pesquisas voltadas para este campo LIN 2020 13 ERGOSTEROL Em eucariotos a membrana plasmática celular contém esteróis necessários para a organização e função desta estrutura São três as formas principais de esteróis encontradas em eucariotos colesterol em vertebrados fitoesterol em plantas e ergosterol em fungos Cada um destes é o produto final de uma longa via biossintética de várias etapas que se origina a partir de uma via inicial comum como acetilCoA para epóxido de esqualeno DE VRIESE et al 2021 O ergosterol têm uma estrutura tetracíclica cadeias laterais acila e grupos hidroxila hidrofílicos Figura 1 Todavia o ergosterol se diferencia do colesterol pela presença de duas ligações duplas adicionais entre carbono 7 C7 e C8 sendo esse primeiro classificado como saturado e secundário e o segundo insaturado e secundário no anel e entre C22 e C23 na cadeia lateral GIRARDI PIVA et al 2022 FIGURA 1 Representação estrutural do ergosterol Fonte Dreams time 2023 A via biossintética do ergosterol envolve passos complexos e que consome muita energia pois utiliza diversas enzimas A quantidade de ergosterol é altamente regulada pela biodisponibilidade de metabólitos específicos como o ferro e o oxigênio além de condições ambientais JORDÁ et al 2020 Em Saccharomyces cerevisiae organismo modelo de estudo foram identificados a via de biossíntese sendo esta regulada em três módulos O primeiro é a partir da acetilCoA que leva a formação do mevalonato O segundo é a síntese de farnesil pirofosfato E o terceiro é a síntese do ergosterol propriamente dita sendo que estas reações ocorrem no retículo endoplasmático Figura 2 HU et al 2017 FIGURA 2 Síntese do ergosterol Fonte Adaptado mais soja 2023 Em razão de suas propriedades versáteis os esteróis manifestam inúmeros empregos nas indústrias alimentícia e farmacêutica O ergosterol não somente promove o crescimento celular como auxilia a sinalização de fabricação de drogas esteróides em células tumorais de câncer de mama o peróxido de ergosterol demonstrou ter atividade antitumoral uma vez que interrompe o crescimento destas células LI et al 2015 Diante do exposto buscase descobrir se o composto possui efeito em células de melanoma uma vez que esse é considerado um câncer agressivo e altamente metastático por essa razão o ergosterol será testado em células de melanoma murino e humano 2 OBJETIVOS 21 21 OBJETIVOS GERAIS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino B16F10Nex 2 e melanoma humano SKMEL25 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino e humano Investigar se o composto causa morte celular nas linhagens testadas e quais os possíveis mecanismos de morte induzidos por ele Analisar diferenças morfológicas das células tratadas com ergosterol e células não tratadas 3 METODOLOGIA 31 MATERIAIS E MÉTODOS 311 Linhagens celulares As células do melanoma murino B16F10NEX2 e melanoma humano SKMEL25 foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr Luiz r Travassos in memorian UNIFESP São Paulo SP 312 Ergosterol O Ergosterol FLUKA 45480 foi gentilmente cedido pela Profa Dra Silvia Uliana Reni USP São Paulo SP Uma solução estoque de 840 mM foi preparada para cada um dos experimentos através da diluição de 10 mg de ergosterol para 300 μL de etanol absoluto Merck Ref 1009831000 313 Reagentes O meio utilizado para cultura de células B16F10Nex2 será Roswell Park Memorial Institute RPMI1640 e para SKMEL25 será Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM Os meios de cultura RPMI1640 e DMEM terão pH de 74 e serão suplementados com 10 mM de HEPES 24 mM de bicarbonato de sódio 1 mL de sulfato de gentamicina e 10 de soro fetal bovino SFB Os reagentes para contagem celular serão PBS 1x tripsina 0005 meio de cultura RPMI ou DMEM e corante azul de tripan 04 Para investigação de morte celular serão utilizados os inibidores ZVADOMeFMK ZVADFMK 3Metiladenina 3MA Necrostatina1 NEC1 314 Viabilidade celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas em placas de 96 poços em uma concentração de 5 x 103 e incubadas em estufa a 37ºC e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão tratadas com ergosterol nas concentrações de 6 mM 12 mM 25 mM 50 mM 75 mM e 100 mM e as células não tratadas serão incubadas em meio RPMI ou DMEN com 2 de etanol Após 24 horas do tratamento as células serão lavadas com 100 μL de PBS 1x e serão desaderidas com 25 μL de tripsina edta A ação da tripsina edta será neutralizada com 25 μL de meio RPMI ou DMEN e em seguida será dado seguimento à contagem das células através do ensaio de exclusão com azul de tripanSerá adicionado 25 µL de azul de tripan nas células em suspensão e posteriormente 10 µL da solução de azul de tripan e células em suspensão serão depositas em câmara de Neubauer onde serão contados quatro quadros de 1mm² da câmara através de microscópio óptico invertido 315 Ensaios de migração celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas 15x105 em placas de 12 poços e após 24 horas de incubação em estufa a 37º C e atmosfera com 5 de CO2 será realizada uma lesão vertical em cada poço Posteriormente as células serão tratadas o composto ergosterol e como controle positivo as células serão incubadas com meio de cultura e 2 de etanol Serão capturadas imagens com intervalos de 0 12 24 36 e 48 horas após o tratamento A distância percorrida das células será computada através do software ImageJ 316 Ensaio Clonogênico Células B16F10Nex2 e SKMEL25 na densidade de 5x102 serão plaqueadas em placas de 12 poços e tratadas com 750 μL de meio RPMI ou DMEN juntamente com o composto ergosterol Como controle negativo será utilizado meio de cultura e 2 de etanol absoluto Após cinco dias será acrescentado mais 300 µL de solução de tratamento e de controle negativo aos poços No decimo dia as células serão fixadas com etanol por 10 minutos em temperatura ambiente lavadas com PBS 1X e coradas com cristal violeta em H2O miliQ por 10 minutos e após 3 lavagens com PBS as células serão contadas com auxílio de uma lupa 4X A área das colônias será quantificada através do Software ImageJ 317 Inibidores de morte Para investigar os mecanismos de morte as células B16F10Nex2 serão cultivadas em placas de 96 poços na concentração de 5x103 e incubadas em estufa a 37º C e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão préincubadas com inibidores de morte celular e após o tempo de préincubação de cada inibidor as células serão tratadas com o inibidor e o composto ergosterol Como controle positivo as células serão tratadas apenas com o inibidor de interesse e como controle negativo as células serão tratadas apenas com o composto ergosterol Além disso as células também serão tratadas com meio de cultura e 2 de etanol como controle de células não tratadas Após o período de tratamento as células serão desaderidas e a viabilidade será determinada através do ensaio de exclusão de azul tripan 4 RESULTADOS ESPERADOS Esperase obter ao final deste trabalho verificar se o composto ergosterol apresenta atividade antitumoral perante as células de melanoma murino e humano por meio dos ensaios de migração celular e clonogênico onde será observado a capacidade de proliferação celular após a adição do ergosterol Tendo em vista o potencial antitumoral apresentado pelo ergosterol em outros tipos de câncer é possível que este também seja efetivo para tratamento de células de melanoma Em caso positivo pretendese dar sequência aos estudos com ergosterol de modo a investigar e esclarecer como este atua nos mecanismos de morte celular e comparar com os dados presentes na literatura Assim dessa forma este trabalho será capaz de complementar informações sobre como se dá a morte celular por intermédio da molécula de ergosterol o que pode vir a se constituir como um tratamento futuro e que também pode vir a ser aplicado em estudos sobre outros tipos de câncer 5 CRONOGRAMA 1º Semestre 2023 2º Semestre 2023 C R O N O G R A M A Viabilidade celular B16F10Nex2 X Migração celular B16F10Nex2 X Ensaio clonogênico em células B16F10Nex2 X Inibidores de morte B16F10Nex2 X Viabilidade celular SKMEL25 X Migração celular SKMEL25 X 6 REFERÊNCIAS AOKI Masahiro FUJISHITA Teruaki Oncogenic Roles of the PI3KAKTmTOR Axis Current Topics In Microbiology And Immunology SL p 153189 2017 Springer International Publishing BOONE Brian A ZEH Herbert J BAHARY Nathan Autophagy Inhibition in Pancreatic Adenocarcinoma Clinical Colorectal Cancer SL v 17 n 1 p 2531 mar 2018 Elsevier BV CABRERA Raúl RECULE Francisca Unusual Clinical Presentations of Malignant Melanoma a review of clinical and histologic features with special emphasis on dermatoscopic findings American Journal Of Clinical Dermatology SL v 19 n 1 p 1523 30 out 2018 Springer Science and Business Media LLC CARNEIRO Benedito A ELDEIRY Wafik S Targeting apoptosis in cancer therapy Nature Reviews Clinical Oncology SL v 17 n 7 p 395417 23 mar 2020 Springer Science and Business Media LLC DARCY Mark S Cell death a review of the major forms of apoptosis necrosis and autophagy Cell biology international v 43 n 6 p 582592 2019 EDINGER Aimee L THOMPSON Craig B Death by design apoptosis necrosis and autophagy Current Opinion In Cell Biology SL v 16 n 6 p 663669 dez 2004 GONG YiNan CRAWFORD Jeremy Chase HECKMANN Bradlee L GREEN Douglas R To the edge of cell death and back The Febs Journal SL v 286 n 3 p 430440 19 dez 2018 Wiley httpdxdoiorg101111febs14714 GUIMARÃES Larissa JIMENEZ Paula SOUSA Thiciana FREITAS Hozana ROCHA Danilo WILKE Diego MARTÍN Jesús REYES Fernando PESSOA Otília Deusdênia Loiola COSTALOTUFO Letícia Chromomycin A2 Induces Autophagy in Melanoma Cells Marine Drugs SL v 12 n 12 p 58395855 4 dez 2014 MDPI AG httpdxdoiorg103390md12125839 HANAHAN Douglas Hallmarks of cancer new dimensions Cancer discovery v 12 n 1 p 3146 2022 HARTMAN Mariusz L NonApoptotic Cell Death Signaling Pathways in Melanoma International Journal Of Molecular Sciences SL v 21 n 8 p 2980 23 abr 2020 HU Zhihong et al Recent advances in ergosterol biosynthesis and regulation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae Indian journal of microbiology v 57 n 3 p 270277 2017 INGRAFFEA Adam Melanoma Facial Plastic Surgery Clinics of North America v 1 n 21 p 3342 2013 JORDÁ Tania PUIG Sergi Regulation of ergosterol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae Genes v 11 n 7 p 795 2020 LEONARDI Giulia FALZONE Luca SALEMI Rossella ZANGHÏ Antonino SPANDIDOS Demetrios MCCUBREY James CANDIDO Saverio LIBRA Massimo Cutaneous melanoma from pathogenesis to therapy review International Journal Of Oncology p 10711080 27 fev 2018 LIN ShianRen et al Natural compounds as potential adjuvants to cancer therapy Preclinical evidence British journal of pharmacology v 177 n 6 p 14091423 2020 PIVA Giovana Girardi CASALTA Erick LEGRAS JeanLuc TESNIÈRE Catherine SABLAYROLLES JeanMarie FERREIRA David ORTIZJULIEN Anne GALEOTE Virginie MOURET JeanRoch Characterization and Role of Sterols in Saccharomyces cerevisiae during White Wine Alcoholic Fermentation Fermentation SL v 8 n 2 p 90 21 fev 2022 MDPI AG httpdxdoiorg103390fermentation8020090 RASTRELLI Marco et al Melanoma epidemiology risk factors pathogenesis diagnosis and classification In vivo v 28 n 6 p 10051011 2014 SHAIN A Hunter BASTIAN Boris C From melanocytes to melanomas Nature Reviews Cancer SL v 16 n 6 p 345358 29 abr 2016 Springer Science and Business Media LLC VRIESE Kjell de POLLIER Jacob GOOSSENS Alain BEECKMAN Tom VANNESTE Steffen Dissecting cholesterol and phytosterol biosynthesis via mutants and inhibitors Journal Of Experimental Botany SL v 72 n 2 p 241253 15 set 2020 Oxford University Press OUP httpdxdoiorg101093jxberaa429 1 INTRODUÇÃO 11 CÂNCER E MELANOMA Câncer é um grupo de mais de 100 doenças que são definidas pelo crescimento celular desregulado a possibilidade de invadir órgãos e tecidos e formar metástases Hanahan 2022 descreve oito características que as células adquirem durante o processo de formação do câncer sendo a habilidade de manter a sinalização proliferativa contornar a ação dos supressores de crescimento resistir à morte celular permitir a imortalidade replicativa induzir a angiogênese induzir a invasão e a metástase reprogramar o metabolismo celular e evitar a destruição imunológica Esses atributos são adquiridos a partir de mutações no DNA causadas ao longo do desenvolvimento da doença O melanoma ocorre a partir de mutações nos melanócitos que são células encontradas no estrato basal da epiderme e responsáveis pela produção da melanina substância que determina a cor da pele olhos e cabelos INGRAFFEA 2013 Diversos fatores influenciam o surgimento do melanoma como quantidade de nevos cor de pele branca exposição solar desprotegida cumulativa ou intensa com queimadura em especial quando ocorrem nas primeiras décadas de vida história familiar de câncer de pele história de neoplasia maligna entre outros O melanoma pode ser dividido em estágios fase de crescimento radial fase de crescimento vertical e melanoma metastático CABRERA RECULE 2018 Os nevos benignos são aglomerados de melanócitos que também são conhecidos como pintas e podem estar presentes desde o nascimento ou surgir na infância Os nevos benignos apresentam baixa probabilidade de evoluir para melanoma Na fase de crescimento radial do melanoma a lesão é plana se localiza na epiderme e pode se estender por diversos cm2 de pele durante anos sem se tornar invasiva Na fase de crescimento vertical do melanoma as células malignas invadem a derme e tecido subcutâneo e podem invadir os vasos linfáticos e sanguíneos através da invasão vascular que envolve vários passos incluindo a degradação da matriz extracelular e a interação com as células endoteliais e fazer migração para dentro dos vasos As células do melanoma podem se ligar às células endoteliais e atravessar a parede do vaso uma vez dentro do vaso as células do melanoma podem chegar em diferentes órgãos LEONARDI et al 2018 RASTRELLI et al 2014 O prognóstico está diretamente correlacionado com a profundidade da invasão das células malignas Na fase de crescimento metastático as células já invadiram e colonizaram outros locais formando tumores secundários SHAIN BASTIAN 2016 O melanoma metastático é altamente invasivo no entanto se houver a retirada cirúrgica nos estágios iniciais da doença normalmente as chances de sobrevida livre de melanoma são maiores Além disso o tratamento para melanoma pode ser realizado através de quimioterapia imunoterapia e radioterapia RASTRELLI 2014 Muitos dos fármacos utilizados para o tratamento de câncer visam a regulação de proteínas específicas envolvidas nos processos de morte celular uma vez que a desregulação dessas proteínas está diretamente ligada ao processo de formação do câncer HARTMAN 2020 12 MORTE CELULAR A morte celular é um processo biológico complexo e essencial que tem papel fundamental para o desenvolvimento a homeostase e a saúde de um organismo Alguns tipos de morte celular envolvem vias de sinalização complexas e expressão de proteínas que podem levar à morte celular programada As principais formas de morte celular programada são a apoptose necroptose e autofagia DARCY 2019 A apoptose é um processo programado de morte celular que ocorre por meio da ativação de uma série de proteínas e cascatas de sinalização GONG et al2018 É um mecanismo de morte celular programada que ocorre em células eucarióticas O processo de apoptose pode ocorrer por duas vias a via intrínseca e a via extrínseca A via intrínseca é iniciada através de sinais endógenos como o estresse oxidativo em que a célula irá ativar proteínas próapoptóticas que irão causar a permeabilização da membrana mitocondrial que liberará citocromo c ou também pode ser ativada ativada por estresse intracelular ou extracelular como a privação de fatores de crescimento danos no DNA hipóxia ou ativação de oncogenes Estes eventos resultam em sinais que induzem a permeabilização mitocondrial e levam à liberação de moléculas próapoptóticas no citoplasma como o citocromo c DARCY 2019 Através da liberação de citocromo c ocorre a formação do apoptossomo O apoptossomo é um complexo protéico formado pelas proteínas caspase9 Apaf1 e procaspase3 Essas proteínas são responsáveis pela ativação das caspases 3 e 7 que desencadeiam a morte celular por apoptose CARNEIRO ELDEIRY 2020 Por outro lado a via extrínseca é iniciada através de sinais exógenos citocinas radiação UV agentes químicos que acarretam a ligação com receptores de morte Estes são membros da superfamília do fator de necrose tumoral TNF e incluem vários membros com cada um tendo um ligante de morte correspondente A via ativada por estes receptores de morte ligados aos seus ligantes respectivos levam à formação do complexo DISC que ativam as caspases 8 e 10 Para ativar a caspase 8 um ligante deve se ligar ao seu respectivo receptor de morte resultando no recrutamento da procaspase 8 monomérica por meio de seu domínio indutor de morte DED Então esta ligase a um complexo de sinal indutor de morte DISC O recrutamento de vários monômeros de procaspase 8 para o DISC resulta em sua dimerização e consequente ativação resultando em uma caspase 8 capaz de induzir apoptose por meio de uma ou outra das duas subvias distintas que por fim ativam as caspases 3 e 7 levando a célula a apoptose DARCY 2019 A autofagia é um processo catabólico lisossomal que ao promover a degradação e a reciclagem de componentes da célula mantém a homeostasia celular GUIMARÃES 2014 Os processos de autofagia ocorrem frequentemente em condições fisiológicas normais atuando na reciclagem de células velhas porém o aumento da autofagia pode estar associado a algumas doenças como síndromes neurodegenerativas e câncer A necroptose é um tipo de morte celular programada que difere da apoptose por ser um processo inflamatório e envolver a ruptura da membrana celular Ela tem sido estudada como uma possível estratégia para combater o câncer incluindo o melanoma que é um tipo de câncer de pele agressivo e de rápido crescimento Hanahan Weinberg 2011 é mediada por proteínas específicas como receptorinteragindo proteína quinase 1 RIPK1 RIPK3 e proteína mista de linhagem quinase3 MLKL DEGTEREV et al 2005 SUN et al 2012 O início da necroptose envolve a interação entre ligantes e seus respectivos receptores levando à ativação da via necroptótica Quando o TNFα se liga ao TNFR1 ocorre a formação do Complexo I composto por várias proteínas incluindo TNFR1 TRADD proteína adaptadora associada a domínio de morte RIPK1 TRAF2 fator associado ao receptor do TNF 2 e cIAPs proteínas inibidoras do apoptose celular WAJANT et al 2003 Em condições normais as cIAPs promovem a ubiquitinação da RIPK1 levando à ativação da via de sobrevivência celular mediada pela via do fator nuclear kappa B NFκB No entanto quando as cIAPs estão ausentes ou inibidas a RIPK1 não é ubiquitinada e se associa com o FADD domínio de morte associado ao fator e as caspases formando o Complexo II que pode induzir a apoptose VANDENABEELE et al 2010 Se a apoptose estiver bloqueada como na presença de inibidores de caspase ou em células deficientes em caspase a RIPK1 interage com a RIPK3 e forma o complexo necrosoma A ativação desse complexo leva à fosforilação e ativação da MLKL que por sua vez induz a ruptura da membrana celular e a necroptose SUN et al 2012 O complexo RIP1RIP3MLKL é um conjunto crítico de proteínas envolvidas no processo de necroptose A ativação desse complexo é iniciada pela interação entre RIPK1 Receptorinteragindo proteína quinase 1 e RIPK3 Receptorinteragindo proteína quinase 3 em resposta a estímulos necroptóticos como a ligação do Fator de Necrose Tumoral alfa TNFα a seu receptor Quando a apoptose está comprometida RIPK1 recruta RIPK3 formando um oligômero chamado necrosoma CHO et al 2009 A formação do necrosoma leva à ativação de RIPK3 por autofosforilação e subsequente fosforilação da proteína MLKL Proteína mista de linhagem quinase3 SUN et al 2012 Uma vez fosforilada a MLKL sofre uma mudança conformacional que permite sua oligomerização e translocação para a membrana celular WANG et al 2014 A oligomerização da MLKL provoca a formação de poros na membrana plasmática resultando em um influxo de íons e água levando à ruptura da membrana celular e por fim à necroptose CHEN et al 2014 Já a autofagia é um processo conservado evolutivamente que permite às células degradar e reciclar seus próprios componentes intracelulares É um mecanismo de resposta a situações de estresse celular como falta de nutrientes hipóxia danos no DNA e agressões externas A autofagia envolve a formação de vesículas duplas membranosas chamadas autofagossomos que se fundem com os lisossomos para degradar e reciclar as macromoléculas e organelas sequestradas MIZUSHIMA et al 2008 A relação entre autofagia e câncer é complexa desempenhando tanto papéis protetores quanto promotores do desenvolvimento tumoral No início da formação do câncer a autofagia pode atuar como um mecanismo supressor tumoral eliminando organelas danificadas e prevenindo o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e mutações no DNA A perda ou inibição da autofagia pode aumentar a susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores MATHEW et al 2007 As células tumorais podem usar a autofagia para reciclar componentes celulares e gerar energia auxiliando no crescimento e progressão do tumor WHITE 2015 Além disso a autofagia também pode desempenhar um papel na resistência a terapias anticâncer já que as células cancerígenas podem utilizar esse processo para se proteger contra os danos induzidos pelo tratamento AMARAVADI et al 2016 A iniciação da autofagia envolve a ativação de um complexo proteico composto por várias proteínas Atg autophagyrelated genes que trabalham em conjunto para iniciar a formação do autofagossomo O complexo ULK1 composto por ULK1 Atg13 Atg101 e FIP200 é crucial para o início da nucleação do autofagossomo A ativação desse complexo é regulada pela atividade do complexo mTORC1 alvo da rapamicina em mamíferos que inibe a autofagia sob condições de nutrientes abundantes Em condições de estresse como falta de nutrientes hipóxia ou tratamento com agentes quimioterápicos no contexto do câncer a atividade do mTORC1 é suprimida permitindo a ativação do complexo ULK1 e a subsequente iniciação da autofagia JUNG et al 2010 SAXTON SABATINI 2017 Outra proteína importante na biogênese do autofagossomo é a microtúbulo proteína associada à luz 3 LC3 que existe em duas formas LC3I e LC3II A LC3I é convertida em LC3II por meio de um processo de conjugação mediado por outras proteínas Atg incluindo Atg4 Atg7 e Atg3 A LC3II é essencial para a elongação e maturação do autofagossomo atuando na expansão e fechamento da membrana dupla KABEYA et al 2000 Devido à grande capacidade adaptativa e a alta resistência do melanoma aos diversos tipos de morte celular programada é necessário buscar novos compostos para seu tratamento Estes podem ser encontrados em grande número na natureza e o potencial antitumoral de seus componentes ainda não foi totalmente investigado Entretanto sabese que é possível que quimioterápicos desenvolvidos a partir de componentes naturais podem apresentar a mesma eficácia que as drogas sintéticas e menos efeitos colaterais o que é um grande atrativo para realizar pesquisas voltadas para este campo LIN 2020 13 ERGOSTEROL Em eucariotos a membrana plasmática celular contém esteróis necessários para a organização e função desta estrutura São três as formas principais de esteróis encontradas em eucariotos colesterol em vertebrados fitoesterol em plantas e ergosterol em fungos Cada um destes é o produto final de uma longa via biossintética de várias etapas que se origina a partir de uma via inicial comum como acetilCoA para epóxido de esqualeno DE VRIESE et al 2021 O ergosterol têm uma estrutura tetracíclica cadeias laterais acila e grupos hidroxila hidrofílicos Figura 1 Todavia o ergosterol se diferencia do colesterol pela presença de duas ligações duplas adicionais entre carbono 7 C7 e C8 sendo esse primeiro classificado como saturado e secundário e o segundo insaturado e secundário no anel e entre C22 e C23 na cadeia lateral GIRARDI PIVA et al 2022 FIGURA 1 Representação estrutural do ergosterol Fonte Dreams time 2023 A via biossintética do ergosterol envolve passos complexos e que consome muita energia pois utiliza diversas enzimas A quantidade de ergosterol é altamente regulada pela biodisponibilidade de metabólitos específicos como o ferro e o oxigênio além de condições ambientais JORDÁ et al 2020 Em Saccharomyces cerevisiae organismo modelo de estudo foram identificados a via de biossíntese sendo esta regulada em três módulos O primeiro é a partir da acetilCoA que leva a formação do mevalonato O segundo é a síntese de farnesil pirofosfato E o terceiro é a síntese do ergosterol propriamente dita sendo que estas reações ocorrem no retículo endoplasmático Figura 2 HU et al 2017 FIGURA 2 Síntese do ergosterol Fonte Adaptado mais soja 2023 Em razão de suas propriedades versáteis os esteróis manifestam inúmeros empregos nas indústrias alimentícia e farmacêutica O ergosterol não somente promove o crescimento celular como auxilia a sinalização de fabricação de drogas esteróides em células tumorais de câncer de mama o peróxido de ergosterol demonstrou ter atividade antitumoral uma vez que interrompe o crescimento destas células LI et al 2015 Diante do exposto buscase descobrir se o composto possui efeito em células de melanoma uma vez que esse é considerado um câncer agressivo e altamente metastático por essa razão o ergosterol será testado em células de melanoma murino e humano 2 OBJETIVOS 21 21 OBJETIVOS GERAIS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino B16F10Nex 2 e melanoma humano SKMEL25 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar a atividade antitumoral do ergosterol em células de melanoma murino e humano Investigar se o composto causa morte celular nas linhagens testadas e quais os possíveis mecanismos de morte induzidos por ele Analisar diferenças morfológicas das células tratadas com ergosterol e células não tratadas 3 METODOLOGIA 31 MATERIAIS E MÉTODOS 311 Linhagens celulares As células do melanoma murino B16F10NEX2 e melanoma humano SK MEL25 foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr Luiz r Travassos in memorian UNIFESP São Paulo SP 312 Ergosterol O Ergosterol FLUKA 45480 foi gentilmente cedido pela Profa Dra Silvia Uliana Reni USP São Paulo SP Uma solução estoque de 840 mM foi preparada para cada um dos experimentos através da diluição de 10 mg de ergosterol para 300 μL de etanol absoluto Merck Ref 1009831000 313 Reagentes O meio utilizado para cultura de células B16F10Nex2 será Roswell Park Memorial Institute RPMI1640 e para SKMEL25 será Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM Os meios de cultura RPMI1640 e DMEM terão pH de 74 e serão suplementados com 10 mM de HEPES 24 mM de bicarbonato de sódio 1 mL de sulfato de gentamicina e 10 de soro fetal bovino SFB Os reagentes para contagem celular serão PBS 1x tripsina 0005 meio de cultura RPMI ou DMEM e corante azul de tripan 04 Para investigação de morte celular serão utilizados os inibidores ZVADOMeFMK ZVADFMK 3 Metiladenina 3MA Necrostatina1 NEC1 314 Viabilidade celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas em placas de 96 poços em uma concentração de 5 x 103 e incubadas em estufa a 37ºC e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão tratadas com ergosterol nas concentrações de 6 mM 12 mM 25 mM 50 mM 75 mM e 100 mM e as células não tratadas serão incubadas em meio RPMI ou DMEN com 2 de etanol Após 24 horas do tratamento as células serão lavadas com 100 μL de PBS 1x e serão desaderidas com 25 μL de tripsina edta A ação da tripsina edta será neutralizada com 25 μL de meio RPMI ou DMEN e em seguida será dado seguimento à contagem das células através do ensaio de exclusão com azul de tripanSerá adicionado 25 µL de azul de tripan nas células em suspensão e posteriormente 10 µL da solução de azul de tripan e células em suspensão serão depositas em câmara de Neubauer onde serão contados quatro quadros de 1mm² da câmara através de microscópio óptico invertido 315 Ensaios de migração celular Células B16F10Nex2 ou SKMEL25 serão plaqueadas 15x105 em placas de 12 poços e após 24 horas de incubação em estufa a 37º C e atmosfera com 5 de CO2 será realizada uma lesão vertical em cada poço Posteriormente as células serão tratadas o composto ergosterol e como controle positivo as células serão incubadas com meio de cultura e 2 de etanol Serão capturadas imagens com intervalos de 0 12 24 36 e 48 horas após o tratamento A distância percorrida das células será computada através do software ImageJ 316 Ensaio Clonogênico Células B16F10Nex2 e SKMEL25 na densidade de 5x102 serão plaqueadas em placas de 12 poços e tratadas com 750 μL de meio RPMI ou DMEN juntamente com o composto ergosterol Como controle negativo será utilizado meio de cultura e 2 de etanol absoluto Após cinco dias será acrescentado mais 300 µL de solução de tratamento e de controle negativo aos poços No decimo dia as células serão fixadas com etanol por 10 minutos em temperatura ambiente lavadas com PBS 1X e coradas com cristal violeta em H2O miliQ por 10 minutos e após 3 lavagens com PBS as células serão contadas com auxílio de uma lupa 4X A área das colônias será quantificada através do Software ImageJ 317 Inibidores de morte Para investigar os mecanismos de morte as células B16F10Nex2 serão cultivadas em placas de 96 poços na concentração de 5x103 e incubadas em estufa a 37º C e 5 de CO2 Após 24 horas as células serão préincubadas com inibidores de morte celular e após o tempo de préincubação de cada inibidor as células serão tratadas com o inibidor e o composto ergosterol Como controle positivo as células serão tratadas apenas com o inibidor de interesse e como controle negativo as células serão tratadas apenas com o composto ergosterol Além disso as células também serão tratadas com meio de cultura e 2 de etanol como controle de células não tratadas Após o período de tratamento as células serão desaderidas e a viabilidade será determinada através do ensaio de exclusão de azul tripan 4 RESULTADOS ESPERADOS Esperase obter ao final deste trabalho verificar se o composto ergosterol apresenta atividade antitumoral perante as células de melanoma murino e humano por meio dos ensaios de migração celular e clonogênico onde será observado a capacidade de proliferação celular após a adição do ergosterol Tendo em vista o potencial antitumoral apresentado pelo ergosterol em outros tipos de câncer é possível que este também seja efetivo para tratamento de células de melanoma Em caso positivo pretendese dar sequência aos estudos com ergosterol de modo a investigar e esclarecer como este atua nos mecanismos de morte celular e comparar com os dados presentes na literatura Assim dessa forma este trabalho será capaz de complementar informações sobre como se dá a morte celular por intermédio da molécula de ergosterol o que pode vir a se constituir como um tratamento futuro e que também pode vir a ser aplicado em estudos sobre outros tipos de câncer 5 CRONOGRAMA 1º Semestre 2023 2º Semestre 2023 CRONOGRAMA Viabilidade celular B16F10Nex2 X Migração celular B16F10Nex2 X Ensaio clonogênico em células B16F10 Nex2 X Inibidores de morte B16F10Nex2 X Viabilidade celular SKMEL25 X Migração celular SKMEL25 X 6 REFERÊNCIAS AOKI Masahiro FUJISHITA Teruaki Oncogenic Roles of the PI3KAKTmTOR Axis Current Topics In Microbiology And Immunology SL p 153189 2017 Springer International Publishing BOONE Brian A ZEH Herbert J BAHARY Nathan Autophagy Inhibition in Pancreatic Adenocarcinoma Clinical Colorectal Cancer SL v 17 n 1 p 2531 mar 2018 Elsevier BV CABRERA Raúl RECULE Francisca Unusual Clinical Presentations of Malignant Melanoma a review of clinical and histologic features with special emphasis on dermatoscopic findings American Journal Of Clinical Dermatology SL v 19 n 1 p 1523 30 out 2018 Springer Science and Business Media LLC CARNEIRO Benedito A ELDEIRY Wafik S Targeting apoptosis in cancer therapy Nature Reviews Clinical Oncology SL v 17 n 7 p 395417 23 mar 2020 Springer Science and Business Media LLC DARCY Mark S Cell death a review of the major forms of apoptosis necrosis and autophagy Cell biology international v 43 n 6 p 582592 2019 EDINGER Aimee L THOMPSON Craig B Death by design apoptosis necrosis and autophagy Current Opinion In Cell Biology SL v 16 n 6 p 663669 dez 2004 GONG Yi Nan CRAWFORD Jeremy Chase HECKMANN Bradlee L GREEN Douglas R To the edge of cell death and back The Febs Journal SL v 286 n 3 p 430440 19 dez 2018 Wiley httpdxdoiorg101111febs14714 GUIMARÃES Larissa JIMENEZ Paula SOUSA Thiciana FREITAS Hozana ROCHA Danilo WILKE Diego MARTÍN Jesús REYES Fernando PESSOA Otília Deusdênia Loiola COSTALOTUFO Letícia Chromomycin A2 Induces Autophagy in Melanoma Cells Marine Drugs SL v 12 n 12 p 58395855 4 dez 2014 MDPI AG httpdxdoiorg103390md12125839 HANAHAN Douglas Hallmarks of cancer new dimensions Cancer discovery v 12 n 1 p 3146 2022 HARTMAN Mariusz L NonApoptotic Cell Death Signaling Pathways in Melanoma International Journal Of Molecular Sciences SL v 21 n 8 p 2980 23 abr 2020 HU Zhihong et al Recent advances in ergosterol biosynthesis and regulation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae Indian journal of microbiology v 57 n 3 p 270277 2017 INGRAFFEA Adam Melanoma Facial Plastic Surgery Clinics of North America v 1 n 21 p 3342 2013 JORDÁ Tania PUIG Sergi Regulation of ergosterol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae Genes v 11 n 7 p 795 2020 LEONARDI Giulia FALZONE Luca SALEMI Rossella ZANGHÏ Antonino SPANDIDOS Demetrios MCCUBREY James CANDIDO Saverio LIBRA Massimo Cutaneous melanoma from pathogenesis to therapy review International Journal Of Oncology p 10711080 27 fev 2018 LIN Shian Ren et al Natural compounds as potential adjuvants to cancer therapy Preclinical evidence British journal of pharmacology v 177 n 6 p 14091423 2020 PIVA Giovana Girardi CASALTA Erick LEGRAS JeanLuc TESNIÈRE Catherine SABLAYROLLES JeanMarie FERREIRA David ORTIZJULIEN Anne GALEOTE Virginie MOURET JeanRoch Characterization and Role of Sterols in Saccharomyces cerevisiae during White Wine Alcoholic Fermentation Fermentation SL v 8 n 2 p 90 21 fev 2022 MDPI AG httpdxdoiorg103390fermentation8020090 RASTRELLI Marco et al Melanoma epidemiology risk factors pathogenesis diagnosis and classification In vivo v 28 n 6 p 10051011 2014 SHAIN A Hunter BASTIAN Boris C From melanocytes to melanomas Nature Reviews Cancer SL v 16 n 6 p 345358 29 abr 2016 Springer Science and Business Media LLC VRIESE Kjell de POLLIER Jacob GOOSSENS Alain BEECKMAN Tom VANNESTE Steffen Dissecting cholesterol and phytosterol biosynthesis via mutants and inhibitors Journal Of Experimental Botany SL v 72 n 2 p 241253 15 set 2020 Oxford University Press OUP httpdxdoiorg101093jxberaa429