Manual de Estágio: Padronização de Fármacos por Cromatografia em Camada Delgada

Roteiros Toxicologia e Análises Toxicológicas Manual de Estágio Disciplina Toxicologia e Análises Toxicológicas Título da Aula Padronização de Fármacos por Cromatografia em Camada Delgada CCD AULA 1 OBJETIVO Padronizar o comportamento do fármaco na realização de testes rápidos utilizados como triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas AMOSTRA Padrões 1 Ácido salicílico REAGENTES E SOLUÇÕES Agentes cromogênicos 1 Solução de cloreto férrico FeCl3 5 SISTEMA SOLVENTE Cuba ácida clorofórmio acetona 91 TÉCNICA 1 Aplicar de 5 a 10 µL 5 a 10 µg da solução padrão em uma placa cromatográfica por meio de tubos capilares ou micropipetas Devese atentar que o diâmetro do solvente não deve ultrapassar 5 mm uma vez que manchas muito grandes podem descaracterizar a identificação da substância Um secador Serviço Social de cabelo a frio pode ser utilizado para evaporar o solvente mais rapidamente e aplicar a 20 cm da borda inferior da placa 2 Colocar a cromatoplaca em uma cuba de desenvolvimento previamente saturada contendo o sistema solvente clorofórmio acetona 91 Após o desenvolvimento das placas 10 cm a partir do ponto de aplicação retirálas das cubas e deixálas a temperatura ambiente para a completa evaporação do solvente sob capela 3 A seguir revelar a cromatoplaca com FeCl3 e avaliar o comportamento da mancha 4 Expressar os resultados segundo a forma da mancha cor da mancha e Rf em que Rf distância percorrida pelo analito distância percorrida pela fase móvel hRf Rf x 100 utilizase o hRf para evitar o uso de decimais MATERIAIS QUANTIDADE Acetona 100 mL Ácido acético 50 mL Clorofórmio 500 mL Éter de petróleo 100 mL FeNO339H2O Nitrato férrico nanohidratado 40 g Iodeto de Potássio 40 g Metanol 100 mL NaOH 1 g Nitrato de bismuto 20 g Solução de cloreto férrico 10 g Sulfato de sódio 10 g Manual de Estágio EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Placas cromatográficas de sílica gel 025 mm de espessura 1 Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 2 Cubas de vidro 1 Nebulizadores 1 Bomba a vácuo 1 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança QUESTÕES NORTEADORAS 1 Um paciente foi encontrado com hipertermia zumbido no ouvido acidose metabólica e alcalose respiratória Em um teste rápido por CCD o resultado foi positivo para exposição a salicilatos Não porque a CCD é uma técnica de triagem Após a confirmação na triagem deve ser realizada uma análise por técnica confirmatória 2 Durante a revelação ao nebulizar o cloreto férrico observouse que a mancha característica dessa revelação não foi formada Proponha sugestões que possam justificar e consequentemente corrigir essa situação O ferro do cloreto férrico reage com a hidroxila fenólica do salicilato gerando cor Quando não há reação cromogênica possivelmente a solução do cloreto férrico não foi preparada adequadamente Serviço Social 3 Em uma placa de CCD podem ser aplicados e revelados mais padrões Sim Dependendo das substâncias que são reveladas pode haver vários padrões na mesma placa de CCD Uma das observações relevantes nesse contexto é que a aplicação dos padrões ou das amostras deve manter distância adequada entre os padrões para que não haja interferência no desenvolvimento do analito na placa cromatográfica 4 Fármacos de caráter ácido podem ser aplicados na mesma placa juntamente com os de caráter alcalino Não uma vez que a extração líquidolíquido separa substâncias de caráter ácido com as básicas Manual de Estágio Disciplina Toxicologia e Análises Toxicológicas Título da Aula Triagem em Urina por Cromatografia em Camada Delgada CCD Extração LíquidoLíquido e Identificação de Fármacos por CCD AULA 2 OBJETIVO Teste rápido como triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas de abuso e extração de substâncias em material biológico AMOSTRA Padrões 1 ácido salicílico REAGENTES E SOLUÇÕES Agentes cromogênicos Solução de cloreto férrico FeCl3 5 Sistema solvente Cuba ácida clorofórmio acetona 91 Serviço Social TÉCNICA EXTRAÇÃO Extração de substâncias de caráter ácido e neutro 1 Colocar 10 mL da amostra urina com ácido salicílico em funil de separação 125 mL e ler o pH 2 Ajustar o pH entre 40 e 50 por meio de solução de H2SO4 1 3 Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio éter 31 agitando vigorosamente o funil por 1 minuto 4 Deixar o funil em repouso por 5 minutos para a separação das fases 5 Filtrar a camada orgânica sobre Na2SO4 1 anidro previamente umedecido com a mistura clorofórmio éter Recolher o extrato em béquer 6 Repetir os itens 3 e 4 recolhendo o filtrado no mesmo béquer 7 Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo Ra ácido 8 Desprezar o remanescente aquoso que ficou no funil de separação TÉCNICA DE IDENTIFICAÇÃO Após a volatilização dos solventes proceder a análise do resíduo por cromatografia em camada delgada CCD nas condições previamente padronizadas Manual de Estágio MATERIAIS QUANTIDADE Acetona 100 mL Ácido acético 50 mL Clorofórmio 500 mL Éter de petróleo 100 mL FeNO339H2O Nitrato férrico nonahidratado 40 g Iodeto de Potássio 40 g Metanol 100 mL NaOH 1 g Nitrato de bismuto 20 g Solução de cloreto férrico 10 g Sulfato de sódio 10 g EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Funil de separação 125 mL 2 Bastão de vidro 1 Funil de vidro capacidade 100 mL 01 Béquer 100 mL 02 Bastão de vidro 01 Papel Universal pH 02 fitas Béqueres 100 mL 03 Placas cromatográficas de sílica gel 025 mm de espessura 02 Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 10 Cubas de vidro 2 Nebulizadores 1 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança Serviço Social QUESTÕES NORTEADORAS 1 No procedimento Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio éter 31 qual é o objetivo do clorofórmio Explique levando em consideração a dissociação do fármaco Extrair os fármacos que estão na forma molecular 2 Quais são as características que destacam a urina o conteúdo gástrico e o sangue plasma ou soro como amostras biológicas na toxicologia de urgência URINA Amostra biológica de escolha para triagem de fármacos quando se trata de exposição aguda grande volume disponível facilidade na coleta maior concentração na urina que no sangue Inalterados ou na forma de produtos de biotransformação SANGUE Utilizado para controle terapêutico ou para direcionamento analítico após testar positivo na CCD CONTEÚDO GÁSTRICO Grande quantidade obtida os fármacos se encontram na forma inalterada 3 Caso haja na amostra um analito de carácter ácido um de caráter anfótero e outro de caráter alcalino em qual fase do sistema heterogêneo líquidolíquido estarão cada uma das substâncias A forma molecular sempre estará no solvente orgânico Por isso é que se acidifica e alcaliniza a amostra para a extração líquidolíquido 4 Faça um fluxograma expondo a dinâmica de extração líquidolíquido de fármacos de caráter ácido anfótero e alcalinos Manual de Estágio Disciplina Toxicologia e Análises Toxicológicas Título da Aula Identificação de Aflatoxina por Cromatografia em Camada Delgada CCD AULA 3 OBJETIVO Identificação de micotoxinas aflatoxinas B1 B2 G1 e G2 presentes em alimentos sementes grãos ou rações com extração por solventes orgânicos e Cromatografia em Camada Delgada CCD Preparação da amostra Triture ou moa de acordo com a natureza da amostra a fim de que se obtenha massa homogênea podendo utilizar liquidificador moinho ou moedor de carne Passe a amostra pela peneira de 20 mesh Homogeneize novamente e retire uma subamostra de 30 g Extração e purificação Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e transfira para um frasco Erlenmeyer Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60 ºC para facilitar a penetração do solvente orgânico nos tecidos hidrofílicos Homogeneize com bastão de vidro Adicione 100 mL de clorofórmio tampe o frasco com algodão e agite manualmente por 30 segundos Prossiga esta operação com agitador mecânico por mais 30 minutos Filtre o extrato clorofórmico em funil de vidro com papel de filtro qualitativo No caso de amostra de amendoim ou derivados adicione pequena quantidade de celite ao funil para acelerar a filtração Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer e evapore em banhomaria a 80 ºC até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado Ressuspender o resíduo com 50 mL de metanol transfira quantitativamente para o funil de separação adicione 50 mL da solução de NaCl a 4 e agite lentamente Extraia as gorduras e os demais interferentes com três porções de 50 mL de hexano Descarte a fração com hexano superior Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco Erlenmeyer Serviço Social Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e extraia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio agitando o funil de separação suavemente por três minutos Deixe as fases se separarem e recolha a inferior clorofórmio em frasco Erlenmeyer de 250 mL Repita a operação com mais 50 mL de clorofórmio Recolha o total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banhomaria a 80 ºC ou rotavapor a 50 C a 60 C O resíduo deve ser transferido quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL e evaporado sob corrente de nitrogênio Para efetuar a cromatografia em camada delgada dissolva o resíduo em clorofórmio em quantidade adequada normalmente entre 200 a 500 µL e utilize banho de ultrassom por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas Triagem das micotoxinas por cromatografia em camada delgada Aplique em placa de sílica gel 5 a 10 µL da amostra e alguns pontos de cada padrão separadamente fazendo sobrepor no segundo ponto do padrão 5 µL da amostra Desenvolva o cromatograma em cuba previamente preparada para garantir a saturação com toluenoacetato de etilaácido fórmico 504010 Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento do solvente e seque Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo Excepcionalmente na ausência do ácido fórmico utilizar clorofórmioacetona 9010 Na ausência da celite preceder a filtração mesmo sem a utilização da substância O fluxo de nitrogênio é sugerido mas não obrigatório A volatilização do solvente orgânico pode ocorrer por chapa de aquecimento Manual de Estágio MATERIAIS QUANTIDADE Celite Clorofórmio 100 mL Metanol 300 mL Cloreto de sódio Cloreto de potássio 2 g Hexano EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Algodão 1 Agitador mecânico 1 Balão volumétrico 25 mL 1 Banhomaria ou rotavapor 1 Bastão de vidro 2 Béquer 500 mL 1 Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2 Erlenmeyer de 25 ou 50 mL 1 Funil de separação 1 Lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo 1 Liquidificador moinho ou moedor de carne 1 Papel de filtro qualitativo 2 Peneira de 20 mesh 1 Placas cromatográficas de sílica gel 025 mm de espessura 1 Rotavapor 1 Tubo de ensaio 2 Papel alumínio 1 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança Serviço Social REFERÊNCIAS ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists15 th ed v 2 Arlington AOAC 1990 chapter 49 p 11841199 INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz v1 Métodos químicos e físicos para análise de alimentos 2 ed São Paulo IMESP 1976 p 323325 PRZYBYLSKI W Formation of aflatoxin derivatives on thinlayer chromatographic plates J Assoc Off Analyt Chem v 58 p 163164 1975 VELASCO J Replacement of benzene as a solvent for aflatoxin standards J Am Oil Chem Soc p 938A940A 1981 STACK ME POHLAND AE Colaborative study of a method for chemical confirmation of the identity of aflatoxin J Assoc Off Analy Chem v 58 p 110113 1975 QUESTÕES NORTEADORAS 1 Durante o método de extração das aflatoxinas em um dos momentos se orienta adicione 100 mL de clorofórmio Explique por que esse solvente orgânico é utilizado para essa extração e se a água fervente seria suficiente para essa extração Sugestão solicitar que oa alunoa analise a estrutura química das aflatoxinas As aflatoxinas são lipossolúveis Assim são extraídas por solventes orgânicos Manual de Estágio 2 Observe parte do procedimento analítico Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo Explique por que o método solicita que a análise seja realizada nesse espectro ou seja no UV Sugestão solicitar que oa alunoa analise a estrutura química das aflatoxinas As duplas ligações das aflatoxinas quando submetidas à radiação UV por ressonância fluorescem 3 No procedimento Recolha o total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banhomaria a 80 ºC há risco de perda do analito por degradação por conta dessa elevada temperatura Justifique sua resposta As aflatoxinas toleram elevadas temperaturas Disciplina Toxicologia e Analises Toxicologicas Titulo da Aula Determinacdo da AULA 4 Carboxihemoglobinemia OBJETIVO Determinar os niveis de carboxihemoglobina de amostras bioldgicas para verificar se estao dentro dos limites maximos permitidos AMOSTRA Sangue Deve ser colhido no final da jornada de trabalho em vacutainer heparinizado e conservado a 4 C por no maximo uma semana Para os fumantes devem ser colhidas duas amostras antes e apos a jornada de trabalho REAGENTES E SOLUCOES Sol Tampao pH 685 KH2P0q fosfato monobasico de potassioK2HP04 fostato dibasico de potassio 01 M Sol Hemolisante diluir o tampdo com agua de 110 Preparar semanalmente Sol Diluente dissolver 25 mg de hidrossulfito de sodio em 20 mL de sol Tampao Preparar antes do uso Manual de Estágio TÉCNICA 1 Em tubo de ensaio com tampa colocar 01 mL de sangue amostra e 12 mL de solução hemolisante Agitar deixar em repouso por 10 minutos 2 Diluir 02 mL do hemolizado com 23 mL de solução diluente Tampar 3 Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos Ler a absorvâncias a 420 e 432 nm usando como branco a solução diluente CÁLCULO DA CARBOXIEMOGLOBINA COHb 1 AR F1 x 100 AR F2 F1 F3 1 SENDO AR Abs 420 Abs 432 F1 Abs Hb 432 Abs Hb 420 F2 Abs HbCO 432 AbsHbCO 420 F3 Abs HbCO 420 Abs Hb 420 Serviço Social EM QUE AR A 420 A 432 F1 A Hb red 432 A Hbred 420 13330 F2 A HbCO 432 A Hb red 420 04787 F3 A HbCO 420 A Hb red 432 19939 INTERPRETAÇÃO O Índice Biológico Permitido IBMP é de 35 e o Valor de Referência VR é 1 ambos para não fumantes MATERIAIS QUANTIDADE Amostra de Sangue 2 mL KH2PO4 3 g K2HPO4 3 g Hidrossulfito de sódio 25 mg Água destilada 1 L EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Espectrofotômetro 01 Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01 Tubo de Ensaio com tampa Capacidade 10 mL 03 Pipeta Capacidade 5 mL 02 Vórtex para Agitação 01 Manual de Estágio REFERÊNCIAS BEUTLER E WEST C Simplified determination of carboxihemoglobin Clin Chem 3068714 1984 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança QUESTÕES NORTEADORAS 1 Equívocos préanalíticos ou seja os equívocos cometidos antes da análise toxicológica não é incomum Para evitar esses equívocos priorizase trabalhar com profissionais experientes e manter a equipe de analistas informada Imaginemos que um laboratório de análise toxicológica coletasse o sangue do trabalhador para análise de HbCO no início da jornada O que você espera desse resultado analítico Justifique sua resposta Poderia dar um falsonegativo uma vez que não teria havido exposição ocupacional ao longo do dia 2 Imagine que a solução diluente utilizada na técnica tenha tido algum problema de qualidade Que tipo de interferência analítica haveria caso você identificasse essa situação Explique Não haveria a redução de elementos cromóforos e consequentemente haveria resposta analítica inconsistente Serviço Social 3 Discorra sobre o risco de intoxicação de um trabalhador que apresenta como nível de HbCO igual a 30 Ele apresenta risco de intoxicação QUESTÃO 4 Discorra sobre o risco de intoxicação de uma pessoa não exposta ocupacionalmente ao CO e que apresenta como nível de HbCO igual a 30 Ele apresenta risco de intoxicação Manual de Estágio Disciplina Toxicologia e Análises Toxicológicas Título da Aula Determinação de Nitrito em Alimento AULA 5 OBJETIVO Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de salsicha para verificar se estão dentro dos Limites Máximos Permitidos segundo a Legislação Brasileira preconizados pelo Ministério da Agricultura AMOSTRA Salsichas REAGENTES E SOLUÇÕES Solução I Tetraborato de sódio decahidratado Na2B4O7 10 H2O50 g Água destilada até completar 1 L Solução II Ferrocianeto de potássio trihidratado K4FeCN6 3H2O106 g Água destilada até completar 1L Serviço Social Solução III Acetato de zinco dihidratado ZnCH3COO2220 g Ácido acetico glacial30 mL Água destilada até completar 1 L Reagente Cromogênico Solução de alfanaftol aquecer 360 mL de água destilada e 50 mL de ácido acético a 50 C Transferir esta solução para um frasco escuro contendo 025 g de ácido sulfanílico Agitar até dissolver adicionar 020 g de alfanaftol agitando bem Esfriar a temperatura ambiente e adicionar 90 mL de solução de NH4OH a 10 O pH desta solução deverá ser 40 05 Solução tampão em 500 mL de H2O destilada adicionar 20 mL de HCl concentrado Agitar e adicionar 50 mL de NH4OH concentrado e diluir com água destilada até 1000 mL O pH obtido é de 96 97 Solução padrão de nitrito 025 g NaNO2 em 500 mL H2O PROCEDIMENTO Padronização 1 Transferir alíquotas de 1 2 4 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio em 5 diferentes balões volumétricos de 100 mL adicionar 5 mL do tampão e completar com H2O destilada qsp 100 mL a cada um dos balões 2 Transferir 10 mL de cada alíquota da solução 1 para 5 diferentes balões volumétricos de 100 mL e completar com H2O destilada qsp 100 mL a cada um dos balões Manual de Estágio 3 Transferir 5 mL de cada uma das soluções 2 em tubos de vidro e acrescentar 10 mL de reagente cromogênico 5 mL de água destilada e 5 mL da solução tampão a cada um dos diferentes tubos 4 Deixar em banho de H2O a 30 ºC por 30 minutos 5 Leitura espectrofotométrica em 474 nm contra um branco Obs O branco se constituirá de 10 mL do reagente cromogênico em 10 mL de água e 5 mL tampão deixar em banho de água a 30 ºC por 30 minutos Desproteinização Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL Adicionar 5 mL da solução I bórax e cerca de 40 mL de água destilada a temperatura acima de 70 C Aquecer em banho de água fervente por 15 minutos agitando frequentemente Deixar esfriar a temperatura ambiente Adicionar 2 mL da solução II ferrocianeto de potássio e 2 mL da solução III acetato de zinco Agitar vigorosamente após cada adição Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100 mL Deixar o balão em repouso por 30 minutos a temperatura ambiente Completar o volume com água destilada qsp 100 mL Agitar o conteúdo do balão vigorosamente e filtrar em papel livre de nitritos Determinar a concentração de nitrito presente nesta solução Determinação de nitrito Pipetar 10 mL da solução desproteinizada da amostra de alimento para um tubo de ensaio Adicionar 5 mL da solução tampão e 10 mL da solução de alfanaftol Deixar em banho de água a 30 C durante 30 minutos esfriar a temperatura ambiente ler em 474 nm Calcular o valor de nitrito presente na amostra usando a curva padrão previamente estabelecida Serviço Social INTERPRETAÇÃO Segundo a Portaria nº 1004 de 11 de dezembro de 1998 da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde a quantidade residual máxima de nitritos e nitratos em produtos cárneos excetuandose o charque brasileiro é de 150 mgKg e 300 mgKg respectivamente expressos como sal de sódio MATERIAIS QUANTIDADE Acetato de zinco dihidratado ZnCH3COO2 220 g Ácido acético 50 mL Ácido sulfanílico 025 g Ácido acetico glacial 30 mL Água Destilada 2 L Alfa naftol 020 g Amostra de salsicha 10 g Ferrocianeto de potássio trihidratado K4FeCN6 3H2O 106 g HCl 20 mL NaNO2 025 g NH4OH 50 mL NH4OH a 10 90 mL Tetraborato de sódio decahidratado Na2B4O7 10 H2O 50g Manual de Estágio EQUIPAMENTOS QUANTIDADE Bageta de vidro 01 Banho de água fervente 01 Béqueres 100 mL 03 Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01 Espectrofotômetro 01 Funil de vidro capacidade 100 mL 01 Papel de Filtro 02 Papel Universal PH 02 fitas Pipeta Capacidade 1 mL 02 Pipeta Capacidade 10 mL 02 REFERÊNCIAS ARAUJO A C P Determinação de nitratos e nitritos em alimentos destinados à população infantil Dissertação de Mestrado Apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo 1988 LARA W H TAKAHASHI M Y SILVEIRA N Determinação de nitritos e nitratos em conservas de carne Rev Inst Adolfo Lutz 382161166 1978 MORIE G P et al Determination of Nitrate and Nitrite in Mixture with Nitrate ion eletrode Ana Clin Acta 60397403 1972 Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança Serviço Social QUESTÕES NORTEADORAS 1 Os nitritos e nitratos são substâncias químicas adicionadas intencionalmente nos alimentos com alguns fins como o de realçar as propriedades organolépticas do alimento e inibir a proliferação bacteriana Sob a óptica toxicológica qual é o significado de determinar os níveis desses sais nos alimentos industrializados São responsáveis pela formação do anidrido nitroso que leva à formação dos compostos Nnitrosos potencialmente carcinogênicos 2 Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL Adicionar 5 mL da solução I bórax e cerca de 40 mL de água destilada a temperatura acima de 70 ºC Explicar o objetivo da adição do bórax no procedimento O nitrito e nitrato podem ficar ligados a proteínas da carne e consequentemente para serem determinados se faz necessária a desproteinização 3 Transferir alíquotas de 1 2 4 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio Qual é a concentração de nitritos em cada um desses volumes