Bioquimica Clinica - Metodos de Analise e Equipamentos Laboratoriais

Métodos de análise em Bioquímica Clínica Apresentação Nesta Unidade de Aprendizagem vamos aprender alguns métodos de Análise em Bioquímica Clínica Veremos a importância dos testes de laboratório remoto TLRs e da escolha de aparelhos em laboratórios de pequeno e grande porte além da avaliação da qualidade dos equipamentos Além disso conheceremos os princípios básicos de instrumentação de alguns aparelhos utilizados nos testes de Bioquímica Clínica Bons estudos Ao final desta Unidade de Aprendizagem você deve apresentar os seguintes aprendizados Identificar as principais diferenças entre os tipos de equipamentos presentes em grandes e pequenos laboratórios Reconhecer a importância dos TLRs no diagnóstico clínico Diferenciar os princípios básicos de instrumentação utilizados em algumas análises bioquímicas Infográfico O infográfico mostra o esquema de alguns equipamentos utilizados no laboratório clínico na área de bioquímica Conteúdo do livro Com o advento de novas tecnologias laboratoriais e de diagnóstico a automação em laboratórios de análises clínicas tornouse uma realidade Exames que anteriormente poderiam levar horas para serem executados com determinados equipamentos passaram a ser feitos em minutos Dessa forma para se assegurar o fluxo ideal dentro da rotina laboratorial é essencial que o profissional compreenda as rotinas de um laboratório no contexto da automação Laboratorial Diferentes equipamentos entregam rotinas diferenciadas e de acordo com a realidade local Conhecer os equipamentos e sua funcionalidade garantem o cumprimento dos prazos na rotina bem como segurança e confiabilidade nos resultados Nessa Unidade de Aprendizagem você verá como a automação auxilia na prática bem como sua base teórica na utilização da automação laboratorial Boa leitura BIOQUÍMICA CLÍNICA Ana Daniela Coutinho Vieira Métodos de análise em bioquímica clínica OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM Identificar as principais diferenças entre os tipos de equipamentos presentes em grandes e pequenos laboratórios Reconhecer a importância dos TLRs no diagnóstico clínico Diferenciar os princípios básicos de instrumentação utilizados em algumas análises bioquímicas Introdução A automação laboratorial deixou de ser apenas uma tendência distante e restrita em grandes laboratórios e passou a fazer parte dos estabelecimentos de análises clínicas em diversos níveis Por isso é imprescindível que os analistas conheçam os princípios e os fundamentos das principais metodologias utilizadas e os processos gerais envolvidos nesses equipamentos Neste capítulo você vai aprender sobre os métodos laboratoriais mais utilizados na bioquímica clínica explorando seus diferenciais e suas bases teóricas Além disso será possível compreender que as diferentes necessidades e os contextos laboratoriais influenciam diretamente a escolha do equipamento mais adequado para o laboratório levando em conta principalmente sua capacidade técnica e financeira Por fim vai entender o que são os testes laboratoriais remotos TLRs de que forma estão inseridos na medicina diagnóstica e se eles se correlacionam com as demais funções laboratoriais Automação bioquímica em laboratórios de pequeno e grande porte Atualmente os laboratórios de análises clínicas abrangem estabeleci mentos de variados tamanhosportes desde os que realizam apenas testes mais básicos e com pouca automação assegurados pelo enca minhamento de amostras mais complexas para centros de referência até aqueles altamente automatizados com capacidade para executar um leque maior de exames em diferentes níveis de complexidade Em qualquer um desses cenários a necessidade de realizar testes com resultados cada vez mais rápidos e com menores taxas de erros exige uma constante modernização dos protocolos e equipamentos utilizados no laboratório BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 RECOMENDAÇÕES 2019 Por abranger um fluxo bastante considerável de exames e testes por dia o setor de bioquímica foi um dos primeiros a receber automação e tem se modernizado constantemente Essa atualização permite uma maior interação entre os diferentes setores laboratoriais por meio do comparti lhamento de tecnologias como os equipamentos que são úteis tanto para testes de bioquímica quanto de imunologia por exemplo Esse sistema de plataformas unificadas é uma tendência cada vez mais presente Tais mudanças são possíveis em parte pelo progresso na triagem e nos cuida dos da etapa préanalítica por intermédio de protocolos e de automações que possibilitam um maior rastreamento e uma melhor setorização das amostras bem como pela integração de diferentes analisadores analíticos em um mesmo sistema laboratorial com interfaceamento automático de resultados e informações geradas pelo laboratório incorporando as fases préanalítica analítica e pósanalítica MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 A Figura 1 apresenta o fluxo da rotina laboratorial desde a necessidade da solicitação médica de um exame passando por todas as suas fases de execução até gerar um resultado que irá guiar uma conduta clínica É possível notar que esse processo é bastante minucioso e exige a inte gração de diferentes etapas profissionais e tecnologias MCPHERSON PINCUS 2012 Métodos de análise em bioquímica clínica 2 A ALT não é uma realidade na maioria dos estabelecimentos devido ao seu alto custo de investimento e à necessidade de haver espaço estrutural para a instalação dos equipamentos BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Apesar disso é importante saber que já existem variadas plataformas disponíveis para a integração e a automação do processo laboratorial em sua quase totalidade como é o caso do Sistema Aptio da Siemens Para saber mais assista ao vídeo Siemens Aptio Automation no canal Alaa Aljehani Laboratory Tech no YouTube Cada vez mais os laboratórios investem em analisadores automatizados individuais em sistemas de processamento de informações SIL sistema de informações laboratoriais e em alguns casos em processadores préanalíticos O grau de automação de um laboratório tem a influência direta das necessi dades locais relacionadas à complexidade dos exames solicitados ao público atendido ambulatorial hospitalar e principalmente à realidade financeira da empresa Por isso laboratórios de menor porte ou que não comportam tais tecnologias muitas vezes se limitam ao SIL e a analisadores automatizados ou semiautomatizados de acordo com a sua rotina e fluxo de exames BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 RECOMENDAÇÕES 2019 Figura 1 Fluxo laboratorial de produção de resultados ALT Automação Laboratorial Total Fonte McPherson e Pincus 2012 p 15 Métodos de análise em bioquímica clínica 3 A utilização de automação na etapa analítica já gera um enorme ganho em questão de tempo de execução e padronização pois a maioria dos analisadores bioquímicos executa a análise desde a etapa de leitura de códigos de barra nos tubos de amostra passando por pipetagem manipulação de reagentes incubação leitura de reação cálculos e transmissão de resultados MCPHER SON PINCUS 2012 É importante salientar que os processos automatizados não estão livres de falhas e erros e portanto juntamente com a utilização desses analisadores é necessário que os laboratórios conduzam rigorosos processos internos e externos de controle de qualidade Uma das principais formas de verificação dos processos é a utilização de soros controle ou seja usamse amostras com valores de analitos já conhecidas por meio das quais o analista pode acompanhar o desempenho dos testes executados no laboratório Além disso outros dois pontos focais para a continuidade dos padrões de qualidade dos exames realizados são as manutenções corretivas e preventivas e a correção de possíveis falhas analíticas pela calibração dos equipamentos BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Testes laboratoriais remotos Os TLRs ou POCTs pointofcare testing são exames realizados fora do ambiente físico laboratorial Tratase de testes rápidos que fazem uso de metodologias simples e de fácil execução Esses testes são realizados pró ximos ao paciente muitas vezes em casa ou em estabelecimentos de saúde como hospitais unidades emergenciais farmácias clínicas especializadas e consultórios médicos ou em campanhas de saúde ANDRIOLO 2019 RECOMEN DAÇÕES 2019 O desenvolvimento de TLRs teve como objetivos principais atender às necessidades de atendimento do paciente em unidades de saúde móveis ou distantes possibilitar o diagnóstico em estudos de levantamento epidemiológicos proporcionar a realização de triagens e atender às aspirações de automonitoração de pacientes com doenças crônicas A grande vantagem desse tipo de teste é a possibilidade de usar uma pequena quantidade de amostra geralmente sangue total ou urina sem a necessidade de tratamentos prévios como a centrifugação Isso permite que os resultados sejam gerados rapidamente diminuindo assim o turnaround time ou seja o tempo de retorno Esses testes utilizam variadas metodologias como reações enzimá ticas imunológicas e eletroquímicas e podem ser realizados em aparelhos portáteis dispositivos imunocromatográficos tiras reagentes com cartões ou até mesmo sistemas eletrônicos ANDRIOLO 2019 Métodos de análise em bioquímica clínica 4 Um exemplo clássico de TLR são os testes de glicemia capilar que uti lizam uma pequena quantidade de sangue total para mensurar os níveis de glicose sérica e são muito úteis aos pacientes diabéticos que realizam o monitoramento desses níveis Recentemente foram criados dispositivos mais modernos que têm a possibilidade de mensurar os níveis glicêmicos por meio de sensores subcutâneos conectados a dispositivos capazes de injetar insulina em caso de necessidade Esse tipo de produto porém ainda não é tão difundido quanto os clássicos glicosímetros RECOMENDAÇÕES 2019 Outra aplicação bastante útil dos TLRs é na mensuração dos gases sanguí neos e do pH em unidades hospitalares de terapia intensiva ou de emergência Tais testes assim como os demais TLRs devem ser vinculados à supervisão de um laboratório clínico responsável e precisam manter os mesmos critérios de qualidade que os exames realizados no ambiente laboratorial mantidas as suas proporções Essa exigência é vinculada aos direcionamentos da RDC 302 de 13 de outubro de 2005 da Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária que regula o funcionamento de laboratórios clínicos Para atender a essas demandas alguns dispositivos portáteis têm sistemas de análise automática de controle de qualidade com bloqueio do aparelho em caso de inconformidades mas esta não é uma realidade em todos os TLRs RECOMENDAÇÕES 2019 Princípios básicos de instrumentação analítica Na bioquímica clínica existe uma variedade de metodologias capazes de mensu rar os analitosalvo tais como técnicas fotométricas eletroquímicas eletroforé ticas cromatográficas imunoensaios e espectrometria de massa Com o avanço das automações alguns equipamentos oferecem a integração de mais de uma metodologia para resultados mais sensíveis eou específicos XAVIER DORA BARROS 2016 É essencial que todo profissional responsável pela manipulação de equipamentos analíticos conheça seus princípios e seu funcionamento tanto para uma melhor interpretação dos resultados quanto para eventuais necessidades de manutenção e calibração MCPHERSON PINCUS 2012 Métodos fotométricos Nas análises bioquímicas a predominância abrange os testes que se baseiam em princípios de medida de energia radiante Para tal mensuração a energia que pode ser refletida dispersa emitida ou absorvida é detectada por um Métodos de análise em bioquímica clínica 5 sensor dentro do equipamento analítico Quando essa energia é absorvida ou transmitida em forma de luz energia luminosa as metodologias são chamadas de fotométricas e avaliam as reações químicas por meio da interação da luz visível ou não com os substratos consumidos ou com os produtos formados na reação MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 Uma das principais técnicas fotométricas é a espectrofotometria Nela a determinação da concentração de um analito em uma amostra é feita com base na absorção de luz monocromática por uma solução Nessa metodo logia a intensidade da luz emitida diminui ao passar por uma solução pois ela é absorvida pelo produto gerado em uma reação química A quantidade de luz absorvida é chamada de absorbância Nesse método também é men surada a quantidade de luz que consegue passar sem ser absorvida pela solução chamada de transmitância Quanto maior for a concentração da solução maior será a absorbância e menor será a transmitância por outro lado quanto menor for a concentração menor será a absorbância e maior será a transmitância Figura 2 BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 Figura 2 a Um feixe de luz incide em uma solução I e parte da luz é absor vida A fração de luz que não é absorvida é transmitida T e detectada por um sensor Caso a solução não absorva luz branco haverá uma transmitância de 100 e b a avaliação da de transmitância de uma solução é determinada relacionando a transmitância da amostra e do branco Fonte Bishop Fody e Schoeff 2009 p 100 Métodos de análise em bioquímica clínica 6 A concentração da solução por sua vez está relacionada à quantidade de produto formado a partir de uma reação química específica que é utilizada para quantificar um analito Para a dosagem de glicose em amostras bioló gicas por exemplo utilizase uma pequena quantidade de amostra soro plasma e são adicionados reagentes específicos que irão permitir a ocorrência de uma reação de oxidação da glicose a partir da ação das enzimas glicose oxidase e peroxidase formando assim um produto chamado de antipiril quinonimina Esse produto tem uma coloração vermelha cuja intensidade é proporcional à concentração de glicose na amostra LABTEST 2011 A espectrofotometria surgiu no início do século XVIII por intermé dio dos princípios de absorção criados por Bouguer Ela permitiu a dosagem qualitativa e quantitativa de diversos analitos em amostras clínicas Mais tarde Lambert e Beer desenvolveram mais princípios de transformação de luz em medida de concentração criando a lei de LambertBeer ou lei de Beer que afirma que a quantidade de luz absorvida absorbância ou a cor de uma solução é proporcional à concentração da substância corada em solução MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 Um espectrofotômetro portanto deve ser capaz de utilizar a energia luminosa para gerar informações sobre a concentração de uma solução e para isso é composto basicamente por seis elementos fonte seletor de comprimento de onda cuvet holder ou cubeta fotodetector processador de sinal e dispositivo de leitura Figura 3 BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Fonte uma lâmpada geralmente de tungstênio ou tungstêniohalogênio serve como fonte estável de energia radiante Essa fonte luminosa fornece a energia que será absorvida pela solução É importante notar que nesse momento todos os comprimentos de onda do espectro estão disponíveis pois a luz é policromática Diferentes tipos de fontes podem ser utilizados dependendo da especificidade de cada equipamento e dos comprimentos de onda desejados Por exemplo lâmpadas de deutério para radiação ultravio leta UV lâmpadas de descarga de xenônio de alta pressão para emissões atômicas ou fontes laser que fornecem elevadas intensidades Métodos de análise em bioquímica clínica 7 Seletor de comprimento de onda é um componente crítico para o funcionamento do espectrofotômetro pois o seletor deve ser capaz de isolar uma região espe cífica do comprimento de onda emitido pela fonte lâmpada e focálo sobre a solução Para esse fim podem ser utilizados filtros prismas e monocromadores Cuvet holder ou cubeta é o recipiente em que a solução é inserida e irá absorver a fração de luz direcionada pelo seletor de comprimento de onda Esses recipientes devem ser transparentes e seus tamanhos podem variar de acordo com os comprimentos de trajeto requisitados pelo equipamento Nessa etapa do processo parte da luz será absorvida pela solução absorbância e o restante será transmitido transmitância Fotodetector para determinar a quantidade de luz que foi capaz de passar pela amostra o fotodetector irá receber a luz transmitida por meio de um cátodo e transformará essa informação em um sinal elétrico Processador de sinal irá processar e transformar o sinal elétrico recebido em uma informação quantitativa Dispositivo de leitura após o processamento do sinal elétrico a informação gerada é disponibilizada em medidor ou dispositivo de leitura BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Figura 3 Representação gráfica do espectrofotômetro a Lâmpada excitante b fenda de en trada c monocromador d fenda de saída e cubeta de amostra f fotodetector e g display Fonte McPherson e Pincus 2012 p 40 Métodos de análise em bioquímica clínica 8 A partir de tais estruturas podem ser medidas na espectrofotometria as absorbâncias da luz em uma solução Mas afinal o que é a luz Em resumo a luz consiste em uma forma de radiação eletromagnética que forma movimen tos ondulatórios A determinação do ponto em que a luz é detectável dentro do espectro leva em consideração o comprimento de onda eletromagnética que ela forma sendo que esse comprimento é a distância linear entre duas cristas da onda Tais conceitos são importantes para a compreensão das diferentes formas de leitura da luz em um espectrofotômetro pois dependendo do analito e do método escolhido a leitura pode ser feita em diferentes pontos do espectro luz visível UV ou infravermelho Figura 4 O que não muda entre esses métodos porém é o princípio de que quanto mais concentrada for a solução maior será a absorbância de luz BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Figura 4 Demonstração do espectro de radiação eletromagnética com os diferentes tipos de luz originados em diferentes comprimentos de onda Fonte McPherson e Pincus 2012 p 39 Métodos de análise em bioquímica clínica 9 Diferentes métodos podem ser analisados em um espectrofotômetro Os mais utilizados são os colorimétricos nos quais o produto da reação forma uma coloração no espectro de luz visível e os UVs nestes as moléculas absorvem a energia luminosa no espectro UV A metodologia colorimétrica é a mais frequente nas análises bioquímicas e se baseia na intensidade da cor e consequentemente da reação química Ela é utilizada na mensuração de diversos analitos como nas dosagens de glicose do exemplo citado an teriormente e pode ser associada a técnicas enzimáticas ou seja técnicas que medem a atividade de uma enzima por intermédio da sua interação com um substrato gerando portanto um produto colorido Já a metodologia UV é independente da formação de compostos de cor pois seus espectros de leitura atuam em uma faixa diferente de comprimento de onda Nesse caso a reação é avaliada pela quantidade de luz absorvida pelos substratos nico tinamida adenina dinucleotídeo e NADP nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato em uma reação XAVIER DORA BARROS 2016 Esses métodos podem ser avaliados com diferentes formas de leitura As leituras de ponto final são aquelas em que a atividade da enzima é men surada levando em consideração a medida do produto ao final da reação e esse produto se mantém estável durante um determinado tempo durante o qual se realiza a leitura espectrofotométrica Já nas leituras cinéticas a atividade enzimática é mensurada em diferentes intervalos de tempo durante a formação do produto sendo esta a mais precisa PINTO 2017 Alguns pontoschave devem ser levados em consideração para garantir o adequado funcionamento do espectrofotômetro e por consequência leituras fidedignas É necessário por exemplo que se utilizem soluções como branco da amostra branco do reagente solução padrão e calibradores BISHOP FODY SCHOEFF 2009 O branco do reagente é a leitura do reagente sem a adição da amostra Ele deve ser utilizado sempre que a absorbância do reagente for diferente da absorbância da água Nesse caso o valor encontrado na absorbância do branco do reagente será equivalente à absorbância zero ou inicial De forma semelhante o branco da amostra deve ser utilizado quando há possibilidade de interferência da amostra na leitura da absorbância utilizando uma solução neutra de referência no lugar do reagente com a adição da amostra A utili zação do branco da amostra é eficaz principalmente em casos de amostras lipêmicas ictéricas ou hemolisadas pois a presença de lipídios bilirrubina e hemoglobina em excesso interfere na leitura da absorbância especialmente Métodos de análise em bioquímica clínica 10 em se tratando de métodos colorimétricos e turbidimétricos A utilização dos brancos minimiza os efeitos de interferentes que podem fazer com que parte da luz emitida possa ser refletida dispersa ou absorvida alterando assim a leitura real da solução de interesse BISHOP FODY SCHOEFF 2009 BASQUES 2016 RECOMENDAÇÕES 2018 Já a solução padrão e os calibradores são mais utilizados para a calibração do espectrofotômetro Tratase de soluções com uma concentração conhecida do analito em questão que podem ser utilizadas para a garantia da exatidão do comprimento de onda selecionado e da leitura do aparelho BISHOP FODY SCHOEFF 2009 Exemplo Para uma aplicação prática dos termos abordados utilizaremos uma reação de dosagem de glicose por metodologia enzimáticacolorimétrica com leitura de ponto final em um aparelho manual com necessidade de cálculo da reação pelo analista Nesse caso a faixa de leitura capaz de medir precisamente a absorbância indicada pelo fabricante é de 490 a 520 nm Portanto o espectrofotômetro deve ser configurado para a leitura neste comprimento de onda Para a execução do teste serão necessárias três cubetas as quais são chamadas de branco padrão e teste n Branco com apenas o reagente n Padrão com o reagente e a solução padrão concentração conhecida de 100 mgdL de glicose n Teste com o reagente e uma alíquota da amostra soroplasma do paciente A cubeta contendo o branco deve ser analisada primeiramente para zerar o equipamento pois a leitura da sua absorbância será considerada zero evitando assim a interferência do reagente na leitura Em seguida devem ser realizadas as leituras das cubetas Padrão e Teste Após as leituras o seguinte cálculo deverá ser realizado para a determinação da concentração de glicose mggL na amostra Teste Glicose mgdL Absorbância do teste 100 Absorbância do teste Sendo que o número 100 nessa equação referese à concentração da solução padrão Supondo que a absorbância do padrão foi de 0450 e a do teste foi de 0380 temse a seguinte equação Glicose mgdL 0380 100 84 mgdL 0450 Para facilitar a execução dos testes no dia a dia devido à alta reproduti bilidade da técnica pode ser utilizado o fator de calibração que consiste na relação determinada entre a absorbância e a concentração da solução Sendo neste exemplo obtido a partir da seguinte equação O valor da concentração da glicose no exemplo poderia ser obtido mais facilmente a partir do seguinte cálculo Glicose mgdL absorbância do teste fator de calibração Glicose mgdL 0380 X 222 84 mgdL Dessa forma concluise que a concentração de glicose na amostra do paciente é igual a 84 mgdL Em aparelhos automatizados e semiautomatizados esse cálculo é gerado automaticamente Ainda no sentido de acurácia do teste outro ponto crítico é a linearidade Segundo a Lei de Beer a quantidade de energia capaz de ser transmitida pela solução diminui exponencialmente de acordo com a espessura da solução que precisa atravessar ou seja a transmitância será inversamente proporcional à concentração da solução Na prática laboratorial uma forma de avaliar a linearidade é utilizar calibradores com concentrações conhecidas em diferen tes concentrações e medir as suas absorbâncias Com isso tornase possível criar um gráfico com uma curva padrão do teste Nesse gráfico geralmente o valor de absorbância inicial é próximo de zero pois se utiliza o branco como o primeiro calibrador Em seguida são lançados os valores dos demais calibradores e é gerado o gráfico BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Se o teste executado estiver em concordância com a Lei de Beer ocorrerá a formação de uma reação linear que servirá de base para que o equipamento faça a conversão dos valores de absorbâncias encontradas em soluções posteriores e a referida concentração das amostras Porém a linearidade só obedece a esses princípios até uma determinada concentração que varia de teste para teste e acima disso causa um desvio na curva Esse ponto é chamado de limite de linearidade Acima dele a amostra deve ser diluída e ter seu valor posteriormente corrigido para garantir a acurácia da análise Figura 5 BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 Métodos de análise em bioquímica clínica 12 A espectrofotometria utiliza essencialmente química úmida reagentes líquidos para as análises Já reflectometria ou fotometria de reflectância é bastante semelhante à espectrofotometria com a diferença básica de que utiliza química seca e por isso a mensuração se baseia na luz refletida e não na absorvida Os reflectômetros são bastante semelhantes aos fotômetros em questão de composição diferindo pela presença de suportes sólidos secos granulosos ou fibrosos para a reflexão da luz Esses equipamentos são muito utilizados em automações para análises de leitura das tiras reagentes de urina por exemplo ou para dosagens colorimétricas de glicose colesterol triglicérides entre outros analitos bioquímicos BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 ANDRIOLO 2019 Outra variação de teste fotométrico é a luminescência Essa metodologia se baseia na troca de energia gerada a partir da absorção de radiação eletro magnética pelos compostos Tal absorção gera uma agitação que pode ser quantificada pela emissão de luz fluorescente que é detectável por fluorômetros e espectrofluorômetros A luminescência tem sensibilidade e especificidade bastante altas mas que foram melhoradas ainda mais na quimiolumines cência uma variação da técnica que utiliza substâncias químicas ou reações eletroquímicas para a produção de compostos excitados Essa metodologia é Figura 5 O gráfico demonstra a correlação entre concentração da amostra e absorbância da solução A curva gerada consegue ser linear até uma determinada concentração depois desse ponto há um desvio na Lei de Beer Fonte McPherson e Pincus 2012 p 40 Métodos de análise em bioquímica clínica 13 muito utilizada em imunoensaios MCPHERSON PINCUS 2012 ANDRIOLO 2019 Já na fotometria de chama é analisada a emissão de luz a partir da excitação dos átomos da solução contendo a amostra do paciente pela exposição a uma chama Os átomos emitem luz quando retornam do estado excitado para o de repouso e a partir de comprimentos de onda específicos a luz emitida pode ser quantificada Essa técnica é bastante útil na dosagem de íons como sódio potássio e lítio por exemplo XAVIER DORA BARROS 2016 Outras metodologias com base na excitação de átomos são a espec trometria de emissão atômica e espectrometria de absorção atômica A espectrometria de emissão atômica se baseia na capacidade de os átomos ou íons emitirem radiações com comprimento de onda específicos quando excitados sendo a intensidade dessa radiação luminosa proporcional ao conteúdo de metal na amostra Já a espectrometria de absorção atômica consiste na medida da absorção de luz por átomos metálicos em repouso Tratase de metodologias usadas para a detecção de íons e metais em fluídos biológicos XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 Por fim a turbidimetria e a nefelometria são utilizadas para a mensuração de compostos que não podem ser avaliados por métodos de absorção pois são partículas grandes pex proteínas Nessas técnicas avaliase a dispersão da luz após atingir os compostos em suspensão na solução visto que essas partículas dispersam a luz de forma proporcional à sua concentração na amostra biológica Esse tipo de metodologia é principalmente utilizada nas do sagens de proteínas em urina e fluidos biológicos cerebrospinal pulmonares ascético etc como transferrina proteína C reativa ou microalbuminúria Os nefelômetros detectam a luz dispersa em vários ângulos já os turbidímetros quantificam a diminuição da transmissão de luz em decorrência da formação de partículas na solução MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 Métodos eletroquímicos Os métodos eletroquímicos também podem ser bastante úteis na bioquímica clínica com destaque para as técnicas de potenciometria e eletrodos íons seletivos ISE Tais métodos realizam a mensuração da voltagem entre dois eletrodos em uma solução Essa voltagem é o potencial e deve ser compa rado entre os eletrodos pois um deles deve ser o teste e o outro o eletrodo referência Sua aplicação é útil na detecção de íons pois estes são capazes de causar alterações entre esses potenciais A gasometria por exemplo pode ser executada por meio dessa técnica para a quantificação de CO2 O2 Métodos de análise em bioquímica clínica 14 e pH no sangue porém outros metabólitos e eletrólitos também podem ser dosados por essa metodologia como cálcio ionizado chumbo e cloro BISHOP FODY SCHOEFF 2009 MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 Outros métodos utilizados em bioquímica clínica A eletroforese utiliza uma corrente elétrica para gerar um fluxo que separa os compostos de uma solução iônica de acordo com a carga elétrica e o tamanho dos seus compostos Nesse fluxo os cátions carregados positivamente migram para o polo negativo enquanto os ânions carregados negativamente migram para o polo positivo Essa separação forma bandas que podem ser identificadas e quantificadas possibilitando com isso a análise de proteínas plasmáticas macromoléculas íons inorgânicos e drogas MCPHERSON PINCUS 2012 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 A cromatografia é a separação de uma solução com base nas interações físicas e químicas dos compostos com uma fase móvel e uma fase estacionária A fase móvel é responsável por transportar a amostras pela fase estacionária Diversos tipos de cromatografia foram desenvolvidos e em alguns casos associam outras técnicas analíticas para a detecção dos compostos como é o caso da cromatografia líquida de alta resolução que pode realizar a quantificação por fotometria potenciometria entre outras técnicas BISHOP FODY SCHOEFF 2009 XAVIER DORA BARROS 2016 ANDRIOLO 2019 n Cromatografia em camada delgada detecção qualitativa de aminoácidos fosfolipídios e rastreamento toxicológico n Cromatografia líquida de alta resolução detecção quantitativa de aminoácidos hemoglobinas vitaminas entre outros n Cromatografia gasosa detecção de ácidos orgânicos e fármacos principalmente XAVIER DORA BARROS 2016 Os métodos que se baseiam em imunoensaios utilizam as reações de antígenoanticorpo para detectar imunocomplexos anticorpos ou antígenos Apesar de terem sido utilizados primariamente para o diagnóstico de doenças infecciosas a técnica foi adaptada e hoje em dia é amplamente usada na detecção de marcadores tumorais e medicamentos e na quantificação de hormônios Para facilitar a detecção dos imunocomplexos e aumentar a sensibilidade dessa metodologia muitas vezes são utilizados reagentes marcadores enzimáticos fluorescentes ou quimioluminescentes XAVIER DORA BARROS 2016 A espectrometria de massas por sua vez baseiase na fragmentação e na ionização de moléculas sendo que a abundância relativa de cada íon produz um espectro de massa característico Nesse tipo de equipamento há a ionização da moléculaalvo de análise que a separa das demais subs tâncias presentes na amostra e possibilita a identificação e a quantificação do composto com base na sua relação massacarga MCPHERSON PINCUS 2012 ANDRIOLO 2019 Em geral a maioria dos analisadores automatizados utiliza de forma predominante as técnicas de espectroscopia de absorbância espectrofoto metria porém cada vez mais a fotometria de reflectância os imunoensaios e a eletro e quimioluminescência vêm sendo incorporados às plataformas Da mesma forma os ISEs são cada vez mais utilizados para as dosagens de eletrólitos sendo a fotometria de chama deixada em desuso Um exemplo bastante conhecido no âmbito laboratorial é a plataforma COBAS a qual incorpora fotômetro ISE óptica turbidimétrica e fluorescência polarizada em um mesmo sistema embora haja várias outras disponíveis no mercado laboratorial MCPHERSON PINCUS 2012 Referências ANDRIOLO A ed Manual da residência de medicina laboratorial Barueri Manole 2019 BASQUES C J Fotometria e padronização Lagoa Santa Labtest 2016 BISHOP M L FODY E P SCHOEFF L E Química clínica princípios procedimentos correlações 5 ed Barueri Manole 2009 LABTEST Glicose Liquiform instruções de uso Lagoa Santa Labtest 2011 MCPHERSON R A PINCUS R M Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais 21 ed Barueri Manole 2012 PINTO W J Bioquímica clínica Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2017 RECOMENDAÇÕES da Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial SBPCML fatores préanalíticos e interferentes em ensaios laboratoriais Barueri Manole 2018 RECOMENDAÇÕES da Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial SBPCML inovação no laboratório clínico Barueri Manole 2019 XAVIER R M DORA J M BARROS E org Laboratório na prática clínica 3 ed Porto Alegre Artmed 2016 Consulta Rápida Métodos de análise em bioquímica clínica 16 Leitura recomendada BRASIL Ministério da Saúde Agência Nacional de Vigilância Sanitária Reso lução de Diretoria Colegiada RDC nº 302 de 13 de outubro de 2005 Dispõe sobre Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos Brasília DF Ministério da Saúde 2005 Disponível em httpportalanvisa govbrdocuments101812718376RDC3022005COMPpdf7038e853afae 4729948bef6eb3931b19 Acesso em 2 set 2020 Os links para sites da web fornecidos neste capítulo foram todos testados e seu funcionamento foi comprovado no momento da publicação do material No entanto a rede é extremamente dinâmica suas páginas estão constantemente mudando de local e conteúdo Assim os editores declaram não ter qualquer responsabilidade sobre qualidade precisão ou integralidade das informações referidas em tais links Métodos de análise em bioquímica clínica 17 Conteúdo SAGAH SOLUÇÕES EDUCACIONAIS INTEGRADAS Dica do professor O vídeo demonstra alguns instrumentos e métodos utilizados no laboratório clínico Além disso está listado a importância do monitoramento sobre os equipamentos e os princípios básicos das técnicas Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Na prática Diagnóstico na beira do leito Como funciona o teste laboratorial remoto Para manter a acurácia dos resultados e sua confiabilidade os aparelhos são calibrados e utilizados por uma equipe bem treinada pelo pessoal do laboratório Um controle de qualidade é realizado e o coordenador do TLR é o responsável por manter as exigências e ter a aprovação de acreditação Portanto as TLRs são ferramentas importantes no controle e cuidado da saúde mas devem ser monitoradas com muito rigor a fim de manter a qualidades dos exames Saiba Para ampliar o seu conhecimento a respeito desse assunto veja abaixo as sugestões do professor Introdução à espectrofotometria Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar Aparelho COBAS Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar NELSON DAVID L COX MICHAEL M Princípios de Bioquímica de LEHNINGER 6 ed Porto Alegre Grupo A 2014 Conteúdo interativo disponível na plataforma de ensino