Roteiro de Aulas Práticas: Análise Metabólica e Perfusionais

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS ANÁLISE S METABÓLICAS E PERFUSIONAIS Belo Horizonte 202 3 APRESENTAÇÃO Caro aluno Estamos começando mais um semestre letivo e com ele começa um período de aprendizado e compromissos acadêmicos que sem dúvida contribuirão para o nosso crescimento profissional e pessoal Como toda disciplina prática precisamos alinhar nossos critérios avaliativos já que as práticas são ponto fundamental no aprendizado e na garantia de um semestre produtivo A avaliação da aula prática será feita mediante três linhas de critérios a saber 1º Frequência às aulas a assiduidade e a pontualidade são critérios avaliativos fundamentais e insubstituíveis no processo avaliativo 2º Normas e condutas do laboratório o cumprimento de normas e condutas adequadas durante a permanência no laboratório é a garantia de aprendizado e de minimização dos riscos que os procedimentos laboratoriais podem oferecer além de ser critério avaliativo de fundamental importância na construção do profissional de saúde 3º Relatórios e laudos técnicos a elaboração de laudos ou relatórios técnicos é a consolidação dos resultados esperados ou alcançados nas aulas práticas Normas e Condutas avaliados durante as aulas práticas No início do semestre os alunos deverão montar grupos de trabalhos constituídos em no máximo 5 alunos Estes grupos deverão ser mantidos e constantes até o final do semestre letivo não sendo permitida a troca definitiva ou temporária Não é permitido troca de turmas exceto em casos de justificativas tais como atestado médico declaração de trabalho e declaração de atividades acadêmicas Todo o material pessoal como mochilas e bolsas deverá ser mantido no escaninho durante todo período da aula prática Não é permitido o uso do celular ou qualquer outro equipamento eletrônico durante as aulas práticas devendo o mesmo estar no modo silencioso ou desligado e guardado em bolsa ou mochila A exposição do celular dentro do laboratório não é permitida Evitar conversas paralelas durante as aulas práticas para não comprometer a atenção e com isso evitar erros e acidentes dentro do laboratório Não é permitido se alimentar dentro do laboratório Todo o material a ser descartado deve obedecer às normas de descarte Material infectante deve ser descartado no lixo infectante de saco plástico branco e devidamente identificado Lixo comum deve ser descartado na lixeira com saco preto devidamente identificada E não se esqueça Luvas usadas papel toalha usado e algodão são considerados lixos infectantes Descartar agulhas cacos de vidro lamínulas utilizadas e tubos cap ilares utilizados na caixa de pe rfurocortantes devidamente sinalizada no laboratório Não descarte estes materiais no descarte comum para não gerar risco para os técnicos ou funcionários do laboratório Usar jaleco devidamente fechado do início ao fim da aula prática Usar sapato fechado sem exposição da pele Manusear amostras de sangue ou de urina devidamente paramentado com luvas em ambas as mãos SUMÁRIO Treinamento em pipetagem 05 Punção venosa para coleta de sangue à vácuo 09 Glicemia 12 Hemoglobina glicada 15 Proteínas totais e frações 18 Lipidograma 21 Urei a 27 C reatinina 30 Exame de urina rotina 34 Marcadores tumorais β HCG e PSA 39 Cálci o total 43 AULA PRÁTICA Nº 01 Treinamento em pipetagem 1 Introdução As análises laboratoriais são realizadas em volumes reduzidos de amostra biológica e exigem o uso de equipamentos de medição de volumes cada vez mais precisos Os instrumentos utilizados para transferência precisa de volumes são as micropipetas De modo geral as micropipetas são utilizadas para pipetar volumes de 1 a 1000 microlitros As micropipetas p odem ser simples que só empregam uma ponteira Figura 1B ou multicanal Figura 1 C que permitem uso de várias ponteiras simultaneamente pipetando o mesmo volume em todas elas As pipetas podem ser de volume fixo ou variável As pipetas automáticas funcionam por meio de dois sistemas Pipetas de deslocamento de ar Figura 1B e 1C para uso geral Pipetas de deslocamento positivo Figura 1 A para manuseio de líquidos específicos densos viscosos ou voláteis Figura 1 A Pipeta de Deslocamento Positivo B Pipeta Monocanal de Deslocamento de Ar C Pipeta Multicanal de Deslocamento de Ar Para as medidas precis as e exatas de volume utilizando pipetas automáticas é necessário primeiramente que as pipetas e ponteiras sejam de qualidade que se tenha experiência prática suficiente no manuseio correto e que a manutenção e a calibração das micropipetas estejam em conformidade com as orientações do fabricante Ponteiras de má qualidade afeta m a distribuição do líquido na ponteira eou a dispensação completa do volume pipetado A pipetagem deve ser realizada com a pipeta na posição vertical a aspiração deve ser efetuada de forma lenta com uma pausa de uma fração de segundos após a completa aspiração Após a aspiração do líquido devese manter a pipeta na posição vertical para que não ocorra a entrada do líquido aspirado na estrutura mecânica da pipeta Fazer o ambiente na pontei ra com o líquido a ser pipetado aumentam a ex atidão e precisão da pipetagem Devese e vitar aspirações acidentais do líquido para dentro da pipeta para prevenir corrosão do pistão Se o líquido é acidentalmente aspirado para dentro da pipeta o pistão deve ser imediatamente limpo com álcool isopropílico a 70 ou de acordo com orientações do fabricante A s pipetas devem ser mantidas na posição vertical em estantes apropriadas após o uso A medição de volume é um passo crítico em qualquer laboratório analítico onde um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado Para garantir a qualidade das análises é essencial a verificação da calibração dos instrumentos volumétricos conforme recomendado pelo fabricante e o treinamento técnico constante dos laboratoristas Os três métodos mais comuns de calibração de pipetas automáticas são gravimétrico titrimétrico e fotométrico Destes o método fotométrico é o mais simples de ser implantado no laboratório e consiste em medições de diferentes diluições de amostras e con sequ ente leitu ra fotométrica destas medições Para se avaliar o grau de variação entre cada medição a média o desvio padrão e o coeficiente de variação são calculados Em gera l um valor de CV menor que 5 é considerado aceitável Para o cálculo da média x desvio padrão s e coeficiente de variação CV são utilizadas as seguintes fórmulas 2 Material Equipamento espectrofotômetro manual ou semiautomático Cubetas para espectrofotômetro 5 T ubos de ensaio de 5mL por grupo Estantes Pêras Pipetas automáticas Pipetas volumétricas de 5mL Ponteiras azuis e amarelas Descartes para ponteiras 3 Reagentes Água destilada Soluç ão de KMnO 4 4 Procedimento Numerar 5 tubos de ensaio de 5 mL Pipetar 5 mL de água destilada Adicionar 25 μ L de KMnO 4 em cada tubo Homogeneizar Preparar um tubo de ensaio contendo somente água destilada que servirá como tubo branco Fazer leitura a 520 nm das absorvâncias de cada tubo Usar a água destilada como branco Calcular a média o desviopadrão e o c oeficiente de v ariação CV dos resultados de absorvância obtidos 5 Perguntas 1 Se o valor de CV dependesse somente da variação entre as pipetagens o valor de CV obtido por você nesta prática seria aceitável Discuta 2 Quais fatores podem contribuir para a elevação do CV em uma análise laboratorial AULA PRÁTICA Nº 02 Punção venosa para coleta de sangue a vácuo 1 Introdução A coleta de sangue é amplamente praticada e continua sendo de inestimável valor para o diagnóstico e tratamento de vários processos patológicos O correto diagnóstico laboratorial depende da coleta adequada das amostras para testes Erros como o garroteamento prolongado o posicionamento inadequado do paciente a má homogeneização da amostra de sangue nos tubos de coleta o uso incorreto de tubos contendo anticoagulantes e a sequência incorreta de tubos na coleta são os mais frequentes durante esta etapa Para se evitar a ocorrência destes erros o procedimento de coleta deve ser bem planejado e seguir as orientações descritas em protocolos operacionais padrão POPs que se encontram disponíveis nos laboratórios de análises clínicas 2 Materiais Bandeja luvas de procedimento algodão álcool a 70 curativo adesivo garrote etiqueta de identificação óculos de proteção individual agulha adaptador tubos para coleta a vácuo e estante para tubos 3 Procedimento Realizar a higienização das mãos Perguntar o nome completo do paciente Apresentarse ao paciente e explicar o procedimento Avaliar e selecionar a veia do paciente Reunir e preparar o material Abrir a embalagem da agulha até expor o canhão e acoplar a agulha no adaptador até ficar firme Posicionar o braço do paciente Colocar os óculos de proteção individual e calçar as luvas de procedimento Colocar o garrote cerca de 10 cm acima do local a ser puncionado Fazer antissepsia movimento circular firme e único do centro para fora deixar secar completamente Utilizar algodão umedecido em solução de álcool etílico a 70 ou lenço umedecido com a mesma solução para realizar a antissepsia Remover o protetor da agulha e fixar a veia esticando a pele com a mão não dominante sem tocar no local onde foi feita a antissepsia Fazer a punção numa angulação compatível com a profundidade da veia 10 o a 45 o com o bisel da agulha voltado para cima Introduzir o tubo a vácuo no adaptador e empurrar em direção à agulha até o final a fim de perfurar o diafragma da tampa Aguardar o enchimento do tubo a vácuo Remover o garrote Retirar o tubo cheio de sangue do adaptador sem que a agulha saia do local de punção Homogeneizar a amostra de sangue com movimentos suaves de inversão por 5 a 10 vezes Colocar o algodão sem álcool sobre a agulha Não pressionar com o algodão o local da punção enquanto a agulha estiver inserida somente após a retirada da mesma Retirar a agulha e comprimir ligeiramente o local com algodão Solicitar ao paciente que comprima o local da punção por 1 a 2 minutos eleve o braço e mantenhao estendido Colar um curativo adesivo do tipo bandaid no local da punção Orientar o paciente para que não dobre o braço e evite realizar esforço sobre o braço puncionado durante todo o dia Desprezar agulhas e seringas no recipiente de material perfurocortante Desprezar luvas e algodão no lixo infectante Realizar desinfecção do adaptador e guardálo Identificar o tubo Recompor a unidade Realizar a higienização das mãos AULA PRÁTICA Nº 03 Diagnóstico Laboratorial d o Diabetes Mellitus Glicemia Dosagem de Glicose 1 Introdução O exame de glicose é pedido para medir a quantidade de glicose no sangue no momento da coleta É usado para detectar hiperglicemia e hipoglicemia para ajudar o diagnóstico de diabetes e para monitorar os níveis de glicose em pessoas com diabetes A glicemia pode ser medida em jejum após 8 a 1 2 horas de jejum a qualquer hora amostra aleatória após uma refeição pósprandial ou como parte de um teste de tolerância à glicose curva glicêmica A American Diabetes Association a Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia e a Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial recomendam uso de glicemia em jejum ou de uma curva glicêmica para o diagnóstico de diabetes mas propõe que o exame seja feito duas vezes em diferentes ocasiões para confirmação do diagnóstico A dosagem de glicose no sangue pode ser usada para triagem de pessoas saudáveis e assintomáticas porque diabetes é uma doença comum que começa com poucos sintomas 2 Princípio do teste A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose de acordo com a seguinte reação Glicose O 2 H 2 O Ácido Glucônico H 2 O 2 O peróxido de hidrogênio formado reage com 4aminoantipirina e fenol sob ação catalisadora da peroxidase através de uma reação oxidativa de acoplamento formando uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra 2H 2 O 2 4Aminoantipirina fenol Antipirilquinonimina 4H 2 O 3 Objetivo Determinar a concentração de Glicose em uma amostra de soro recém colhida 4 Materiais Tubos de ensaio grade para tubos pipeta graduada de 2 mL pipeta automática de 20 μ L banhomaria a 37 C espectrofotômetro e kit de Glicose 5 Procedimento Para este teste recomendase jejum mínimo de 8 horas A amostra ideal é o plasma colhido em tubo com Fluoreto ou soro Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Amostra 20 μ L Padrão nº 2 20 μ L Reagente 1 20 mL 20 mL 20 mL Misturar vigorosamente e colocar em banhomaria a 37 ºC durante 10 minutos O nível da água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde 490 a 520 nm acertando o zero com o branco A cor é estável por 60 minutos Efetuar cálculos distintos para o método direto Absorbância do teste Glicose mgdL x 100 Absorbância do padrão Quadro 1 Critérios laboratoriais para diagnóstico de normoglicemia prédiabetes e DM adotados pela SBD 6 Perguntas 1 Em que situação a elevação da glicemia de jejum avaliada em uma única análise pode ser considerada como um diagn óstico de diabetes mellitus Explique 2 Quais outras situações clínicas podem produzir uma elevação da glicemia além do quadro clínico de diabetes mellitus 3 Cite erros préanalíticos que podem alterar o resultado da análise de glicemia de jejum AULA PRÁTICA Nº 0 4 Hemoglobina glicada Introdução As complicaçõ es vasculares do diabetes mellitus são a principal causa de morbimortalidade nos países desenvolvidos e constituem preocupação crescente para as autoridades de saúde em todo o mundo Entre as teorias que explicam como a hiperglicemia crônica conduz aos danos celulares e teciduais observados nessa doença a formação dos produtos de glicação avançada também chamados AGEs do inglês Advanced Glycated EndProducts é considerada uma das mais importan tes A reação de glicação consiste na adição de um resíduo de monossacarídeo à região Nterminal de proteínas intracelulares proteínas de membrana e proteínas plasmáticas Elevações nos níveis de glicose circulante produzem um aumento d o fenômeno de glicação com a adição de um resíduo de glicose a proteínas do endotélio proteínas do plasma bem como à hemoglobina principal proteína citoplasmática dos eritrócitos Quanto maior for a elevação da glicemia e o período em que esta permanece elevada maiores serão os níveis de proteínas glicadas Dessa forma é possível monitorar os níveis de glicemia média de um indivíduo por meio da medida de algumas proteínas glicadas no sangue A hemoglobina A1c ou HbA1c corresponde à fração da hemoglobina adulta HbA que sofreu a reação de glicaç ão por isso é também chamada de hemoglobina glicada ou glicohemoglobina Atualmente a HbA1c é considerada o melhor parâmetro preditor de complicações crônicas em pacientes diabéticos além de ser um dos critérios de diagnóstico de diabetes mellitus reconhecido pela Sociedade Brasileira de Diabetes A hemoglobina glicada pode refletir uma variação da glicemia média no período de até 120 dias anteriores ao dia de coleta da amostra de sangue A HbA1c é dosada em sangue total sendo coletada em tubo com anticoagulante EDTA tampa roxa e apresenta estabilidade consideravelmente maior do que a glicemia Esse aspecto inclusive é apontado como uma das grandes vantagens de sua utilização no diagnóstico de DM O jejum não é necessário e a amostra pode ser coletada em qualquer horário do dia Apresenta baixa variabilidade biológica individual e não é afetada por estresse agudo Uma vez coletadas as amostras de sangue são estáveis em temperatura ambiente por até 24 horas e por até 7 dias sob refrigeração O congelamento da amostra entretanto tornaa inviável para análise O método de cromatografia líquida de alta eficiência high performance liquid chromatography HPLC por troca iônica ou troca catiônica é a metodologia considerada como padrão ouro para a determinação de hemoglobina glicada O método consiste na separação das diferentes formas de hemoglobina de acordo com a carga da molécula Existem situações em que a hemoglobina adulta não poderá ser utilizada no diagnostico e monitoramento de pacientes diabéticos Pacientes qu e apresentem doenças hemolíticas ou outras condições que reduzem a meia vida das hemácias podem ter resultados falsamente diminuídos de HbA1c Em contrapartida pessoas diagnosticadas com a nemias por carência de ferro vitamina B12 ou ácido fólico situações esta que aumentam a meia vida das hemácias podem apresentar res ultados falsamente aumentados de hemoglobina glicada Objetivo Determinar a de hemoglobina glicada em amostra de sangue total Material Tubos de ensaio grade para tubos pipeta automática de 10 20 e de 1000 μL vórtex centrífuga banhomaria a 37 C espectrofotômetro e kit de hemoglobina glicada Procedimento Todos os reagentes devem estar em temperatura ambiente antes de iniciar o procedimento do teste A Preparo do Hemolisado 1 Ident ifique um tubo para cada Padrão Controle e um para a amostra teste Dispense 05 ml do Reagente Lisante em cada um deles 2 Coloque 01 ml do sangue bem homogeneizad o dentro dos tubos apropriadamente identificados 3 Homogeneizar suavemente até a completa lise 4 Deixe em repouso durante 5 minutos B Separação da Hemoglobina Glicosilada 1 Identifique os tubos que contêm a resina para o Padrão Controle e Amostra 2 Coloque 01 ml do hemolisado preparado no Item A dentro dos respectivos tubos com resina 3 Introduza neles o Filtro Separador deixando a borracha da extremidade do filtro aproximadamente 1 cm acima do nível do líquido 4 Homogeneize todos os tubos continuamente durante 5 minutos Poderá ser feito em um homogeneizador de hemograma num vortex num shaker ou manualmente por inversão 5 Empurre o Filtro Separador para dentro do tubo até que a resina esteja firmemente compactada no fundo do tubo 6 O sobrenadante agora contido no Filtro Separador poderá ser transferido para uma cubeta ou ser aspirado de dentro do próprio Filtro Separador dependendo do equipamento utilizado para leitura 7 Para proceder às leituras ajuste o equipamento para absorbância zero a 415 nm utilizando água deionizada ou destilada como Branco 8 Leia e anote as absorbâncias do Padrão Controle e Amostra Estas leituras são para hemoglobina glicosilada e deve ser feita no intervalo de 60 minutos C Hemoglobina Total 1 Identifique tubos para Padrão Controle e Amostra Dispense 50 ml de água deionizada ou destilada neles 2 Coloque 002 ml do hemolisado preparado no Item A dentro dos respectivos tubos Homogeneize 3 Ajuste o equipamento em absorbância zero a 415 nm usando água deionizada ou destilada como Branco 4 Leia e anote os valores de absorbância para o Padrã o Controle e Amostra Estas leituras são para Hemoglobina Total e deve ser feita no intervalo de 60 minutos Cálculo dos Resultados Os resultados desconhecidos amostras devem ser determinados do seguinte modo Para cada amostra calcular a proporção P da absorbância da hemoglobina glicosilada Hb glicolisada pela absorbância da hemoglobina total Hb total Usar a seguinte equação para determinar a concentração Valores de referência Exame Normal Prédiabetes Diabetes Hemoglobina glicada 57 57 a 64 65 AULA PRÁTICA Nº 0 5 Proteínas totais e frações Introdução A determinação das proteínas totais em amostras de sangue e outros líquidos biológicos é útil para avaliar o estado nutricional e as alterações proteicas nas doenças A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor porque a alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra fração como ocorre nas doenças crônicas em que há diminuição de albumina com aumento de gamaglo bulina Ocorrência similar pode ser observada em respostas de fase aguda tais como infecções ou traumas ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas no fígado aumentam sua concentração enquanto a albumina se reduz mantendo a concentração proteica total praticamente inalterada As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias especialmente em mieloma múltiplo na macroglobulinemia doenças autoimunes como artrite reumatoide e lupus eritematoso sistêmico doenças granulomatosas como a sarcoidose leishmaniose visceral endocardite bacteriana subaguda e linfogranuloma em alguns casos de doença hepática crônica como hepatite autoimune e na desidratação As proteínas estão diminuídas na gravidez hiperhidratação desnutrição grave cirrose e outras doenças hepáticas incluindo alcoolismo crônico imobilização prolongada insuficiência cardíaca nefrose e insuficiência renal hipertireoidismo deficiência de cálcio e vitamina D e na síndrome de má absorção A dosagem de proteína no líquido sinovial tem sensibilidade de 52 e especificidade de 56 nas doenças inflamatórias A determinação da concentração de proteínas no líquido pleural é de pouco valor exceto quando combinada com outros parâmetros que permitam fazer a diferença entre exsudato e transudato Em 15 a 20 dos indivíduos com hepatopatias acompanhadas de ascite a concentração de proteína no líquido ascítico é superior a 25 gdL Nos pacientes com ascite de etiologia neoplásica as concentrações de proteínas são menores que 25 gdL O sor o e o plasma principalmente de duas frações albumina fração que corresponde a mais do que a metade da proteína total e outras proteínas que são classificadas como globulinas A concentração de globulinas geralmente é calculada do seguinte modo Globulinas gdL Proteínas Totais gdL Albumina gdL A relação albuminaglobulina relação AG é um índice importante de ser calculado Uma baixa relação AG pode refletir uma superprodução de globulin as como acontece em algumas d oenças autoimunes ou um déficit de produção de a lbumina como nos casos de cirrose Uma elev ada relação AG indica um déficit de produção de imunoglobinas A determinação da albumina em amostras de sangue é útil na avaliação do estado nutricional das funções hepática e renal e na avaliação de doenças crônicas Testes complementa res e mais específicos como a dosagem sérica de a lbumina testes das e nzimas hepáticas e a e le troforese das proteínas s éricas devem ser realizados quando se pretende obter um diagnóstico mais preciso Objetivo Determinar as proteínas totais em amostras de soro Determinar albumina em amostra de soro e calcular a concentração de globulinas Material Kit Proteínas totais Kit Albumina banhomaria espectrofotômetro Montar 6 grupos com os seguintes materiais para cada um dos grupos 6 tubos de ensaio para bioquímica pipetas automáticas de 20 e 50uL ponteiras amarelas pipetas graduadas de 2 e 5 mL Procedimento Princípio do método Os íons cobre Cu2 em meio alcalino Reagente de Biureto reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricas formando cor púrpura que tem absorbância máxima em 545 nm proporcional à concentração das proteínas na amostra A albumina interage com o verde de bromocresol tamponado e devido ao erro protéico dos indicadores ocorre formação de cor verde proporcional à concentração da albumina na amostra O verde de bromocresol possui especificidade para albumina e não sofre interferência de valores elevados de bilirrubina e hemoglobina permitindo também que as interferências de valores elevados de triglicérides possa ser corrigida utilizando o branco de amostra Dosagem de proteínas totai s Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Amostra 005 mL Padrão nº 2 005 mL Água destilada ou deionizada 005 mL Biureto de Uso 25 mL 25 mL 25 mL Misturar e incubar a 37 C durante 10 minutos Determinar as absorbâncias do teste e do padrão em 545 nm 530 a 550 nm acertando o zero com o branco A cor é estável durante 1 hora Prote í nas totais g dL Absorb â ncia do teste x 4 g dL Absorb â ncia do padr ã o Dosagem de albumina Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Reagente de Cor nº 1 20 mL 20 mL 20 mL Soro 002 mL Padrão nº 2 002 mL Misturar e após 2 minutos no máximo 10 minutos determinar as absorbâncias do teste e padrão em 630 nm ou filtro vermelho 600 a 640 nm acertando o zero com o branco Albumina g dL Absorb â ncia do teste x 38 g dL Absorb â ncia do padr ã o Valores de referência Proteínas totais 60 a 80 gdL Albumina 35 a 52 gdL AULA PRÁTICA Nº 0 6 Lipidograma 1 Introdução O lipidograma é um conjunto de exames de sangue que inclui as dosagens de colesterol total HDL LDL VLDL e Triglicerídeos e ainda os lipídios totais e quilomiocrons estes últimos transportadores de triglicerídeos fornecidos na alimentação É útil para o diagnóstico o tratamento e o acompanhamento das disfunções metabólicas dos lipídios dislipidemias frequentemente associadas a quadros de obesidade 11 Triglicérides Os triglicérides são determinados por um sistema enzimático com reação de ponto final em amostras de soro ou plasma colhido em EDTA de acordo com as seguintes reações A lipoproteína lipase promove a hidrólise dos triglicérides liberando glicerol que é convertido pela ação da glicerolquinase em glicerol3fosfato Este é oxidado a dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença da glicerolfosfato oxidase Em seguida ocorre uma reação de acoplamento entre o peróxido de hidrogênio a 4aminoantipirina e o 4clorofenol catalisada pela peroxidase produzindo um produto corado a quinoneimina que tem máximo de absorbância em 505nm A intensidade da cor formada é diretamente proporcional à concentração de triglicérides na amostra 12 Colesterol Total O colesterol total é determinado por um sistema enzimático com reação de ponto final em amostras de soro de acordo com as seguintes reações Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela colesterol esterase a colesterol livre e ácidos graxos O colesterol livre é oxidado pela colesterol oxidase a Colest4enona e peróxido de hidrogênio Na presença de peroxidase e peróxido de hidrogênio o fenol e 4aminoantipirina são oxidados formando a antipirilquinonimina que tem máximo de absorbância em 500nm A intensidade da cor formada é diretamente proporcional à concentração de colesterol total na amostra 13 Frações do colesterol As lipoproteínas de muito baixa densidade VLDL e de baixa densidade LDL são quantitativamente precipitadas e após centrifugação o colesterol ligado às lipoproteínas de alta densidade HDL é determinado no sobrenadante por um sistema enzimático tal como é determinado o colesterol total E a concentração de VLDL e de LDL são obtidas a partir de um cálculo abaixo especificado 2 Objetivos Determinar as concentrações de triglicérides do colesterol total e das suas frações através do método colorimétrico Interpretar os resultados dos valores dos lipídeos que constituem o lipidograma associandoos ao risco coronariano e à obesidade 3 Materiais Para cada grupo de alunos serão necessários 9 tubos de ensaio médios 1 tubo de hemólise pequeno pipeta automática de 20 μ L pipeta automática de 200 μ L e pipeta automática de 250 μ L ponteiras pequenas e grandes 3 pipetas graduadas de 20 mL banhomaria a 37 ºC espectrofotômetro agitador vortex centrífuga e pincel para tubos 4 Procedimento 41 Determinação dos Triglicérides Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Amostra 20 μ L Padrão nº 2 20 μ L Reagente 1 nº 1 20 mL 20 mL 20 mL Misturar e colocar no banhomaria 37 ºC por 10 minutos Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 505nm acertando o zero com o branco A cor é estável por 60 minutos Calcular a concentração de triglicérides da amostra utilizada considerando a concentração do padrão 200 mgdL Absorbância do teste Triglicérides mgdL x 200 Absorbância do padrão 42 Determinação do colesterol Total Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Amostra 20 μ L Padrão nº 2 20 μ L Reagente 1 20 mL 20 mL 20 mL Misturar e colocar em banhomaria 37 ºC 10 minutos Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 500nm acertando o zero com o branco A cor é estável por 60 minutos Calcular a concentração do Colesterol total da amostra considerando a concentração do padrão 200 mgdL Absorbância do teste Colesterol mgdL x 200 Absorbância do padrão 43 Determinação do Colesterol HDL Para a dosagem de Colesterol HDL a amostra a ser utilizada é o soro na qual o analito é estável por até 3 dias entre 2 e 8 ºC 1ª parte Precipitação das VLDL e LDL Em um tubo de ensaio médio misturar 250 μ L de precipitante e 250 μ L de soro Agitar vigorosamente durante 30 segundos em agitador vortex Centrifugar a 3500 rpm por pelo menos 15 minutos para obter um sobrenadante límpido Pipetar o sobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado a fim de evitar resultados falsamente elevados 2ª parte Dosagem do colesterol HDL Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Padrão Sobrenadante 200 μ L Padrão nº 2 200 μ L Reagente 1 20 mL 20 mL 20 mL Misturar e colocar no banhomaria a 37 ºC durante 10 minutos Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 500nm acertando o zero com o branco A cor é estável por 60 minutos Calcular a concentração de HDL na amostra considerando a concentração do padrão 20 mgdL e a diluição previamente feita durante a precipitação do VLDL e LDL 12 Absorbância do teste HDL mgdL x 20 x 2 Absorbância do padrão 44 Determinação das frações VLDL e LDL A concentração de VLDL é determinada pela equação de Friedewald dividind o o valor de triglicérides por X um fator tabelado de acordo com o nível de triglicérides e de colesterol nãoHDL desde que a concentração de triglicérides não esteja maior que 400mgdL E o LDL é calculado através da seguinte fórmula LDL Colesterol total VLDL HDL LDL Colesterol total VLDL HDL Onde VLDL TriglicéridesXvalor tabelado 5 Valores de referência e Interpretação dos resultados Estes valores devem ser usados apenas como orientação Eles substituem os valores de referência e são determinados a partir de dados epidemiológicos calculados estatisticamente que relacionam os níveis do Colesterol com a prevalência de doença coronariana isquêmica DCI Tabela 1 Valores referenciais desejáveis e de alvo terapêutico conforme avaliação de risco cardiovascular estimado pelo médico solicitante do perfil lipídico para adultos 20 anos CT310 mgdL há propbabilidade de hipercolesterolemia familiar Quando os níveis de triglicérides estiverem acima de 440 mgdL sem jejum o médico solicitante fará outra prescrição para a avaliação de TG com jejum de 12h e será considerado um novo exame de triglicérides pelo laboratório clínico Tabela 2 Valores de X de acordo com a faixa de valores de triglicérides e de colesterol nãoHDL séricos do paciente Martin et al 2013 AULA PRÁTICA Nº 07 Ureia 1 Introdução O metabolismo de proteínas libera amônia que é convertida em ureia pelo fígado A ureia é então eliminada do organismo principalmente através da urina Dessa forma o funcionamento adequado dos rins tem um papel fundamental na manutenção do equilíbrio de ureia no organismo Por isso uma lesão renal provoca a retenção de substâncias tóxicas como a ureia através de distúrbios da filtração reabsorção secreção e excreção Na lesão hepática por sua vez haverá uma diminuição da conversão de amônia em ureia causando uma hiperamonemia Um aumento na taxa de ureia sanguínea pode ser observado em dietas ricas em proteínas insuficiência cardíaca congestiva nefrite insuficiência renal aguda carcinomas do trato urinário ou com a idade As causas prérenais de elevação da ureia no sangue ocorrem por deficiência na perfusão dos rins como na insuficiência cardíaca congestiva na desidratação choque e diminuição do volume sanguíneo hemorragias internas Elevações da ureia ocorrem também por catabolismo proteico elevado febre septicemia stress e queimaduras As causas renais de elevação da ureia são nefrites pielonefrites e insuficiência renal aguda ou crônica As causas pósrenais são obstruções no trato urinário cálculos carcinomas ou pólipos A diminuição da ureia está relacionada com insuficiência hepática grave aumento da diurese redução do catabolismo proteico gravidez normal e em indivíduos submetidos a dietas com baixo valor proteico e alto teor glicídico 2 Objetivos Determinar o valor da ureia presente n uma amostra de soro 3 Materiais Para esta aula prática os reagentes devem ser preparados adequadamente conforme a descrição abaixo Preparo dos Reagentes de uso Tampão de Uso Em um frasco âmbar limpo e seco misturar o conteúdo 100 mL do frasco de Tampão Estoque 2 com 400 mL de água deionizada ou destilada Este reagente preparado é estável 12 meses entre 28 C Oxidante de Uso Em um frasco plástico limpo e seco misturar o conteúdo 25 mL do frasco de Oxidante Estoque 4 com 475 mL de água deionizada ou destilada Este reagente preparado é estável 12 meses entre 28 C Urease Tamponada Em um frasco âmbar limpo e seco misturar suavemente 10 mL de Urease Estoque 3 com 20 mL de Tampão de Uso preparado a partir do tampão estoque conforme descrição acima Este reagente preparado é estável 21 dias entre 28 C Além dos reagentes preparados serão necessários espectrofotômetro leitura em 600 20 nm banhomaria ou termostatizador mantido na temperatura de 37 C Montar 6 grupos com os seguintes materiais para cada um dos grupos 3 tubos de ensaio tamanho médio 1 pipeta automática de 10 μ L ponteiras amarelas 1 pipeta automática de 1000 μ L ponteiras azuis descarte para ponteiras descarte para materiais em geral 4 Procedimento 41 Princípio do teste A ureia é hidrolisada pela urease tamponada em íons amônia e CO 2 Em meio alcalino os íons amônia formados reagem com salicilato e hipoclorito de sódio sob a ação catalisadora do nitroprussiato de sódio para formar indofenol produto corado A absorbância do complexo azul formado medida em 600 nm é diretamente proporcional à concentração de ureia na amostra analisada 42 Técnica Identificar 3 tubos de ensaio Branco Teste e Padrão e proceder Tubos Branco Padrão Teste Amostra 10 μ L Padrão 10 μ L Urease tamponada 1000 μ L 1000 μ L 1000 μ L Homogeneizar e incubar os tubos por 5 minutos a 37ºC Adicionar aos tubos Tubos Branco Padrão Teste Oxidante de uso 1000 μ L 1000 μ L 1000 μ L Homogeneizar e incubar os tubos por 5 minutos a 37º C Fazer as leituras espectrofotométricas do Padrão AP e do Teste AT zerando o aparelho com o Branco B em 600 nm A cor é estável por 2 horas Cálculos Concentração de ureia mgdL Concentração do padrão x AT AP Avaliação da aula prática Em que situações os valores de ureia urinária devem estar supostamente diminuídos E em que situações poderão estar aumentados Q uais os principais interferentes na dosagem de ureia urinária quando este exame está sendo utilizado para avaliação da função renal AULA PRÁTICA Nº 08 Creatinina 1 Introdução Vários produtos metabólicos são derivados do metabolismo de proteínas tanto endógenas tecidos quanto exógenas dieta Esses produtos metabólicos são denominados compostos nitrogenados não proteicos e a maior parte destes é excretada pelos rins através da urina A tabela a seguir mostra os metabólitos nitrogenados e a importância da sua pesquisa na urina Metabólito Origem bioquímica Utilidade clínica da medida Aminoácidos Proteínas endógenas e exógenas Enfermidade hepática erros inatos do metabolismo desordens tubulares Amônia Aminoácidos Enfermidade hepática e renal congênita ou adquirida erros inatos do metabolismo Ureia Amônia Enfermidade hepática enfermidade renal Creatinina Creatina Função renal Ácido úrico Nucleotídeos purínicos Desordens da síntese purínica A creatinina é depurada do plasma por filtração glomerular e eliminada na urina sem sofrer significativa reabsorção pelos túbulos Devido a sua excreção contínua e fácil pelo sistema renal a presença de níveis aumentados indica diminuição do índice de filtração glomerular Por conseguinte a creatinina constitui indicador muito específico da função renal revelando o equilíbrio entre sua formação e excreção Desta forma a função geral do rim pode ser avaliada pelo clearance depuração renal de uma determinada substância Por definição teórica O clearance é o volume de plasma a partir do qual uma determinada substância pode ser totalmente depurada eliminada na urina em uma determinada unidade de tempo O teste de depuração da creatinina é realizado com medição da creatinina em uma amostra de urina colhida em um tempo estabelecido e também em uma amostra de sangue colhida no período de colheita da amostra de urina Esse processo depende da concentração sérica da taxa de filtração glomerular e do fluxo plasmático renal É calculado a partir dos valores sérico e urinário da substância e do volume urinário em 24 horas sendo corrigido em relação à superfície corporal É um teste convencional para avaliar a capacidade de filtração glomerular FG O teste de depuração mede a rapidez com que os rins são capazes de remover uma substância filtrável do sangue Para se ter certeza de que a FG está sendo medida com precisão a substância a ser analisada não deve ser reabsorvida nem secretada pelos túbulos Além disso a estabilidade da substância na urina durante uma possível coleta de 24 horas a constância do seu nível plasmático a sua disponibilidade no organismo e a facilidade da sua análise bioquímica são fatores que devem ser considerados na escolha da substância para o teste de depuração Atualmente as avaliações laboratoriais de rotina da velocidade de FG empregam a cr eatinina como substância teste A taxa de filtração glomerular TFG pode também ser determinada de maneira indireta sem a necessidade de coleta da amostra de urina de 24 horas somente necessitandose medir a creatinina sérica Estas estimativa s da TFG feitas por meio das equações que ajustam para idade gênero superfície corpórea e etnia deve m ser realizada s de rotina e em c onjunto com a medida da albuminú ria A concentração sérica da creatinina não deve ser utilizada como índice isola do de avaliação da função renal Dentre as equações utilizadas existem a de CockcroftGault CG a do estudo Modification of Diet in Renal Disease MDRD e a Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration CKDEPI para adultos e a de Schwartz para crianças As equações para determinar a TFG estão disponíveis online em httpwwwkidneyorg ou no site da Sociedad e Brasileira de Nefrologia 2 Objetivos Determinar o valor da creatinina presente n uma amostra de soro Utilizar o valor encontrado de creatinina sérica no cálculo da estimativa da taxa de filtração glomerular 3 Materiais Para a turma toda kit para dosagem de creatinina tampão alcalino padrão ácido pícrico e acidificante banhomaria a 37 o C e espectrofotômetro Montar 6 grupos com os seguintes materiais para cada um dos grupos Amostra de soro 4 tubos de ensaio tamanho médio água destilada 1 pipeta graduada de 50 mL 1 pipetador verde 1 pipeta graduada de 10 mL 1 pipetador azul 1 pipeta automática de 20μL 1 pipeta automática de 20 0μL 1 pipeta automática de 500 μL ponteiras amarelas ponteiras azuis descarte de ponteiras e descarte de materiais em geral 4 Procedimento 41 Princípio do teste A reação colorimétrica entre a creatinina e o picrato alcalino foi descrita em 1896 por Jaffé Em 1914 Folin aplicou o princípio da reação de Jaffé para a determinação de creatinina em fluidos biológicos Hoje a maioria dos métodos usados para a dosagem de creatinina ainda emprega a reação de Jaffé A creatinina e outros componentes do soro proteínas glicose ácido acetoacético e ácido pirúvico reagem com a solução de picrato em meio alcalino formando um complexo de cor alaranjada que é medido fotometricamente A adição de um acidificante abaixa o pH a 50 promovendo a decomposição do picrato de creatinina permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogênios que também é medida fotometricamente O valor das duas leituras fornece o valor de creatinina verdadeira 42 Técnica a Tomar três tubos e realizar a seguinte pipetagem BRANCO PADRÃO TESTE Tampão alcalino 2 0 Ml 2 0mL 2 0mL Padrão 025 mL Soro 0 2 5mL Água destilada 025 mL Ácido pícrico 0 5 mL 0 5 mL 0 5 mL b Misturar bem e colocar em banho maria 37 o C durante 10 min Determinar as absorbâncias do teste e do padrão em 510nm acertando o zero com o branco A absorção do teste será A1 c Em seguida adicionar o acidificante conforme esquema abaixo BRANCO PADRÃO TESTE Acidificante 01 mL 01 mL d Misturar bem e deixar em repouso na temperatura ambiente por 5 minutos Em seguida determinar a absorbância do teste em 510nm Essa absorção será A2 e Efetuar o cálculo da seguinte forma Soro mg creatinina100mL Fc x A1 A2 Fc fator de calibração Concentração do padrão Absorvância do padrão 5 Valores de referência Creatinina soro 04 a 13mgdL Avaliação da aula prática Responda às questões que se seguem 1 O que é avaliado através do clareamento de creatinina 2 Por que a creatinina é a melhor substância a ser utilizada para se avaliar a taxa de filtração glomerular através do seu clareamento 3 Qual o resultado encontrado para o clareamento de creatinina feito por meio das estimativas de TFG O que esse resultado significa Obs Consulte o site abaixo e calcule o clareamento estimado de creatinina Leia o texto e descubra qual é a equação mais adequada neste caso httpswwwmdsaudecomnefrologiacalculadorasclearancecreatinina A ULA PRÁTICA Nº 09 Exame de Urina Rotina 1 Objetivos Executar os exames físico e químico da amostra de urina correlacionando os parâmetros com as diversas condições clínicas Manusear corretamente centrífuga e microscópio no intuito de obter e analisar adequadamente o sedimento urinário Identificar a importância do exame microscópico da urina inserido no exame de urinarotina Interpretar corretamente os achados do exame microscópico da urina 2 Materiais Para a turma toda centrífuga e microscópios Montar 6 grupos com os seguintes materiais para cada um dos grupos Amostra de urina identificando o nome do paciente horário e data da coleta tiras reagentes 2 tubos cônicos 1 pipeta automática de 50 μ l 1 pipeta automática de 100 μ L ponteiras amarelas 3 lâminas 1 caixa de lamínulas descarte de ponteiras e descarte de materiais em geral 3 Procedimentos 31 Exame físico da Urina a Identificar e homogeneizar o frasco de urina ainda tampado para ressuspender o sedimento b Observar e anotar as características físicas da urina c Observar as seguintes características Cor A cor normal da urina é o amarelo resultado da eliminação de 3 pigmentos urocromo amarelo uroeritrina vermelho e urobilina laranja Esses pigmentos provenientes do metabolismo normal do organismo são eliminados em pequena concentração e tornam a urina amarela O tom pode variar devido à concentração ou à diluição da urina Variações dessa cor podem ser encontradas como resultado de condições patológicas ou da eliminação de corantes ou medicamentos incolor ou palha ou amarelo pálido sugere diluição da urina ingestão de grande quantidade de líquido diabetes poliúria e doenças renais amarelo escuro ou laranja sugere concentração da uri na febre desidratação queimaduras uso de medicamentos e alimentação rica em carotenos vermelha ou rosa sugere hematúria presença de sangue uso de medicamentos ou contaminação menstrual âmbar sugere presença de bilirrubina marrom ou preta sugere a presença de melanina em casos de melanoma hematúria oxidação de hemácias e alguns medicamentos e verde ou azul sugere a presença de corantes ou ITU por Pseudomonas Odor A urina normal tem cheiro característico ou sui generis devido à presença de certos ácidos voláteis Odores anormais podem ocorrer devido a uma conservação ou armazenamento impróprios Ao envelhecer a urina adquire odor forte de amoníaco devido à transformação bacteriana de uréia em amônia O cheiro pútrido indica presença de ITU A urina de pacientes com excesso de corpos cetônicos apresenta odor característico de acetona ou de frutas Aspecto Tratase da transparência da amostra de urina A urina é normalmente transparente após a emissão Com o tempo ela tende a se tornar turva devido à precipitação de cristais amorfos Densidade A densidade representa a medida dos solutos dissolvidos na urina Clinicamente esta medida é usada para se obter informações sobre o estado dos rins e o estado de hidratação do paciente A densidade normal da urina varia entre 1010 e 1030 Essa densidade pode ser medida pela fita reagente ou através de refratômetro d Para medir a densidade através de refratômetro pingar 2 gotas ou 100 μ L de amostra de urina no aparelho e proceder a leitura 32 Exame químico da Urina a Utilizar as tiras reagentes para fazer a pesquisa de elementos anormais e pH b Homogeneizar a amostra c Colocar aproximadamente 12mL de amostra em um tubo cônico d Mergulhar a tira reagente completamente e retirála imediatamente e Remover o excesso de amostra sobre o papel toalha f Aguardar de 40 a 60 segundos e fazer a leitura comparando as cores da reação com a tabela contida no frasco OBS O resultado deverá ser expresso como negativo caso o elemento não seja detectado e de a quando o elemento estiver presente No caso de nitrito colocar positivo ou negativo 33 Obtenção do sedimento urinário a Transferir aproximadamente 12mL de urina homogeneizada para um tubo cônico Tampar o tubo e centrifugar a 1500RPM durante 5 minutos b Em seguida descartar o sobrenadante deixando aproximadamente 05mL de sedimento a ser examinado Homogeneizar bem 34 Exame sedimentoscópico da urina 3 Procedimentos 31 Exame Microscópico da Urina a Pipetar 50 μ L colocar em lâmina de vidro cobrir com lamínula 22x22 e focalizar no microscópio b No aumento de 10x com pouca luminosidade e condensador baixo observar o que aparece na urina c No aumento de 40x com maior luminosidade observar o que aparece d Defina uma estrutura no aumento de 10x centralizea no campo visual do microscópico e mude a lente objetiva para 40x Observe como foi o aumento dessa estrutura e Anotar e quantificar a presença de cilindros células renais pélvicas vesicais e de descamação hemácias leucócitos muco espermatozóides etc caso estejam presentes Reportar o resultado conforme a tabela abaixo Hemácias Até 50campo número exato Acima de 50campo numerosas Campo tomado por hemácias campos repletos Leucócitos Até 50campo número exato Acima de 50campo numerosas Campo tomado por hemácias campos repletos Relatar aglomerados de leucócitos quando presente Células epiteliais Células não encontradas ausentes Até 3campo raras De 4 a 10campo algumas Acima de 10campo numerosas Descrever o tipo celular encontrado e relatar a pre sença de células chave fragmentos de células renais e corpos graxos ovais quando presentes Cilindros Registrar o tipo e o númerocampo no aumento de 100x Cristais Cristais não encontrados ausentes Até 3 cristaiscampo raros De 4 a 10 cristaiscampo alguns Acima de 10 cristaiscampo numerosos Muco Ausente escasso moderado ou aumentado Muco Ausente escasso moderado ou aumentado Espermatozóides Em urina de mulher citar apenas em casos de solicitação explícita Em urina de homem citar sempre Liberar como presente ou ausente Leveduras Liberar como Presença de células leveduriformes com aspecto morfológico de Candida sp Contaminantes diversos Liberar como Presença de Avaliação da aula prática Responda às questões que se seguem Preencha os resultados encontrados para a amostra CARACTERES GERAIS Cor Cheiro Aspecto Densidade PESQUISA DE ELEMENTOS ANORMAIS pH Sangue Glicose Proteínas Bilirrubina Corpos cetônicos Nitrito Urobilinogênio 2 Que cuidados devem ser tomados no manuseio da fita reagente para EAS 3 Por que para o exame de rotina da urina a amostra mais representativa é o jato médio da primeira urina da manhã 4 Por que a homogeneização é uma etapa fundamental tanto para observar as características físicas da urina quanto para a sua transferência para o tubo cônico 5 Qual a finalidade da obtenção do sedimento urinário para análise microscópica 6 Por que a focalização da urina deve ser feita utilizando pouca luminosidade no microscópio 7 Correlacione o achado no sedimento obtido com outras possíveis alterações a serem encontradas nos exames físico e químico da urina AULA PRÁTICA Nº 10 Marcadores Tumorais B eta HCG e PSA Introdução 11 Hormônio coriônico gonadotrófico H CG O H CG é um hor mônio associado a gravidez nor malmente secretado pelas células sinciciotrofoblásticas da placenta normal composta por duas subunidades α e β A fração βH CG é comumente medida para confirmar a gravidez e o diagnóstico de gravidez ectó pica Além disso o βH CG é usa do no diagnóstico no seguimento e no prognóstico de pacientes com tumores de células germina tivas testículo e ovário O H CG é um marcador para coriocarcinoma tumor de célu las germinativas não seminomato sas tumores testiculares doenças trofoblásticas e em menor fre quência tumores de células ger minativas de ovário e testículo câncer de mama do trato gastrointestinal e do pulmão melanoma e também em condições benignas como cirrose úlcera duodenal e doença intestinal inf lamatória A determinação do βH CG simultaneamente à determinação de αfetoproteína AFP tem maior importân cia no prognóstico no seguimen to e na determinação de recorrências dos tumores de células embrionárias dos testículos seminomas AFP negativa e βH CG raramente elevado carci nomas embrionário s AFP e βH CG elevados corio carcinoma AFP negativa e βH CG elevado tumo res de saco vitel ino AFP elevado e βH CG negati vo teratocarcinomas AFP e βH CG negativo Nas formas mistas a positividade depende da composição est rutural Todos os tipos de doen ças trofoblásticas produzem βH CG e a quantidade formada depende do volum e do tumor O βH CG é utilizado também no seguimento do tratamento e da progressão de doenças trofoblásticas mola hid atiforme mola invasiva e coriocarcinoma Após a eliminação do tecido trofoblástico os níveis de βH CG retornam ao normal em 6 a 8 semanas O uso de anticoncepcionais orais retarda essa queda No homem o encontro de níveis elevados de β H CG indica ginecomastia O monitoramento do hormônio permite avaliar o resultado da terapia Antígeno prostático específico PSA O antígeno prost ático específico PSA uma gli coproteína m onomérica da família das protea ses com 237 res íduos de aminoácidos é produzi do exclusivamente pelas células epiteliais e pelos ductos da glându la prostática e secretado no lú men dos ductos para liquefazer o coágulo semi nal que adiciona ao esperma motilidade e cria condições que le vam à fertilização O PSA é pro duzido tanto pelo tecido normal como pelo tecido prostático hiperplásico e neoplásico No entanto o tecido prostático canceroso produz ao redor de dez vezes mais PSA que o tecido normal O PSA é o mais efe tivo marcador tumoral para o câncer prostático e é usado em lugar da fosfatase ácida prostática como auxiliar no diagnóstico deste câncer em vir tude de sua origem exclusivamente glandular A atividade catabólica do tumor e a acelera ção da taxa metabólica no carcinoma de próstata provocam elevação nos níveis séricos do PSA Por conseguinte o PSA cons titui um marcador imu nocitoquímico confiável utilizado na detecção do câncer de próstata O tumor prostático pode causar prostatismo bloqueio parcial ou completo do trato urinário ou com a próstata comprimindo a uretra O PSA é útil para identificação diferencia ção classificação estadiamento e localização de tumores monito ração préoperatória pósopera tória e de tumor re corrente além de auxiliar a se lecionar intervenções terapêuticas ou terapia com agentes citotóxicos e a avaliação do tumor com os protocolos de tratamento PSA foi detectado em diversos tecidos do sistema urogenital masculino mas apenas a glândula p rostática o secretam O nível de PSA no soro de homens saudáveis é entre 01 ngmL e 26 ngmL Pode estar elevado nas condições malignas como câncer de próstata e na condição benigna como hiperplasia prostática benigna e prostatite Um nível de PSA de 4 a 10 ngmL é considerado como na zona cinzenta e os níveis acima de 10 ngmL são altamente indicativos de câncer Os pacientes com valores de PSA entre 410 ngmL devem ser submetidos à análise adicional da próstata por biópsia É bastante recomendável que se associe o exame de toque retal ao exame laboratorial de PSA de forma periódica de modo a auxiliar na interpretação dos resultados de PSA O teste do a ntígeno prostático específico é portanto uma ferramenta valiosa para o diagnóstico de câncer prostático precoce Muitos estudos confirmaram que a presença de PSA é o marcador tumoral mais útil e significativo con hecido para câncer de próstata infecção da próstata e hiperplasia prostática benigna BPH 13 Imunocromatografia A imunocromatografia é um teste rápido realizado em um sistema contendo uma matriz constituída de nitrocelulose coberta por acetato para facilitar a visualização do resultado O antígeno ou o anticorpo é fixado nesta membrana de nitrocelulose na forma de linhas ou pontos Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo ligado ao corante Ou para a detecção de anticorpos na amostra utilizase antígenos fixados na linha de captura Detecção qualitativa de hCG O teste de imunocromatografia para detecção qualitativa da HCG pode ser realizado com amostras de soro ou de urina Esta metodologia baseiase na combinação de anticorpos monoclonais que em até 5 minutos de forma seletiva identificam HCG em urina ou soro cujas concentrações mínimas sejam de 25UImL A embebição progressiva da fita atinge a linha de positividade onde o anticorpo antiHCG está fixado Neste ponto uma reação específica AgAc delimita uma linha horizontal de tom avermelhado e sua formação confirma a presença da HCG na amostra A ausência de formação da linha implica em laudo negativo No processo de embebição progressiva da fitareagente o líquido ascende e atinge uma nova área onde existe um marcador dos reagentes incorporados à fita Uma nova reação caracteriza a integridade dos reagentes utilizados com a formação de uma segunda linha de coloração avermelhada linha controle Detecção qualitativa de PSA O teste de imunocromatograf ia para detecção qualitativa de PSA pode ser realizado somente com amostras de soro O PSA presente na amostra ligase ao anticorpo antiPSA conjugado ao ouro coloidal A mistura migra por capilaridade pela membrana ligandose aos anticorpos antiPSA fixos na membrana gerando uma banda colorida na área teste T Na ausência de PSA na amostra não há o aparecimento da banda colorida na área do teste T Um reagente de controle imobilizado na membrana determinará o aparecimento de uma segunda banda na área de controle C demonstrando que os reagentes estão funcionando corretamente O teste apresenta uma sensibilidade analítica de 25 ngmL menor valor detectado Obj etivo Demonstrar a importância d os testes imunocromatográficos para a detecção de β HCG e de PSA como meio de diagnóstico preliminar monitorização e ou prognóstico de doenças neoplásicas Materiais Para o teste rápido de β HCG pipeta de 500 L kit para teste rápido de β HCG soro positivo Para o teste rápido de PSA pipeta de 50 L kit para teste rápido de PSA soro positivo Procedimentos Para o teste rápido de βHCG a Utilize 1 fita para cada amostra amostra A amostra B controle positivo controle negativo b Adicione 12 gotas ou 500 µL da amostra em um tubo de ensaio e coloque a fita de reação neste tubo O nível superior da amostra não deve ultrapassar a faixa azul de limite máximo marcada na fita por setas c Deixar a fita no tubo mantendoa em posição vertical d No intervalo entre 15 minutos podem surgir 1 ou 2 faixas transversais controle e teste ambas de tom avermelhado A leitura deve ser feita entre 35 minutos Qualquer linha que surja após os 5 minutos não terá valor diagnóstico Para o teste rápido de PSA Vide bula do kit utilizado Avaliação dos resultados Para o teste rápido de βHCG Positivo Formação de 2 linhas uma superior controle e outra inferior teste indicando uma concentração de H CG igual ou superior a 25UImL Para o teste rápido de PSA Positivo Formação de 2 linhas uma superior controle e outra inferior teste indicando uma concentração de PSA igual ou superior a 25ngmL Para os dois testes Negativo Formação de 1 linha na região controle Inválido Ausência de formação de linha na região controle Questionário 1 Cite três outras aplicações dos testes rápidos imunocromatográficos 2 Qual a finalidade e a importância do controle do teste imunocromatográfico AULA PRÁTICA Nº 11 Cálcio total Introdução O cálcio está presente em três compartimentos principais esqueleto 99 do total tecidos moles 1 do total e líquido extracelular 02 do total As funções fisiológicas do cálcio nos diferentes compartimentos são Cálcio intracelular O cálcio ionizado facilita a condução neuromuscular a contração e o relaxamento dos músculos esquelético e cardíaco É um importante cofator de regulação da função das glândulas exócrinas e endócrinas Em nível celular o cálcio é um importante regulador do transporte iônico e da integridade da membrana Atua no intercâmbio de sódio e potássio no metabolismo do glicogênio no processo da visão e em eventos celulares envolvendo a ligação do cálcio com a proteína calmodulina Cálcio extracelular Exerce papel importante na mineralização óssea no mecanismo da coagulação sanguínea e na manutenção do potencial de membrana plasmática que influencia a permeabilidade e a excitabi lidade Cálcio do esqueleto É o principal local de armazenamento e mobilização de cálcio para o pool extracelular e intracelular O osso é continuamente remodelado mediante um processo combinado de reabsorção e formação óssea O cálcio sérico é mantido dentro dos limites fisiológicos principalmente pela ação combinada do parato rmônio e vitamina D através de seus efeitos sobre os ossos intestinos e rins Outras substâncias também contribuem em menor grau calcitonina hormônios da tireoide esteroides adrenais prostaglandinas fator ativador dos osteoclastos e proteína PTHrelacionada PTHr P O cálcio existente no plasma humano normal apresenta se sob três formas distintas Cálcio ligado a proteínas plasmáticas Esta fração não difusível 40 a 45 do total consiste em grande parte em Ca2 ligado às proteínas plasmáticas especialmente à albumina Em pH plasmático de 74 cada 1 g de albumina liga 08 g de cálcio Cálcio livre ionizado É a forma biologicamente ativa 45 a 50 do total É mantido em níveis constantes por um complexo sistema de controle envolvendo o PTH e a 125OH2D No sistema neuromuscular o cálcio ionizado facilita a condução nervosa a contração e o relaxamento muscular A redução da concentração do cálcio ionizado causa aumento da excitabilidade neuromuscular e tetania O aumento da concentração reduz a excitabilidade neuromuscular A expressão cálcio ionizado não é apropriada pois todo o cálcio sérico está ionizado mesmo quando ligado a proteínas ou ânions Cálcio complexado Constituído por uma variedade de ânions como citrato fosfato lactato bicarbonato e outros íons compreende 5 a 10 do total As distribuições relativas das três formas são modificadas como resultado da variação no pH sanguíneo ou do teor das proteínas plasmáticas O aumento de pH diminui o cálcio ionizado A redução do pH aumenta o cálcio ionizado Na maioria das vezes a hipercalcemia indica a presença de hiperparatireoidismo ou de doenças malignas A hipercalcemia encontrase também associada ao uso de drogas como os tiazídicos vitaminas A e D antiácidos alcalinos e carbonato de lítio A imobilização fraturas doença de Paget e doenças granulomatosas sarcoidose são causas de hipercalcemia As causas mais comuns de hipocalcemia são hipoparatireodismo idiopático ou cirúrgico pseudohipoparatireoidismo insuficiência renal desordens do metabolismo da vitamina D deficiência de magnésio drogas uso agudo de diuréticos uso d e corticostero ides e insulina tetania neonatal pancreatite aguda transfusões sanguíneas múltiplas Concentração sérica de cálcio inferior a 70 mgdL é considerada crítica pois pode levar à tetania Também são considerados críticos resultados superiores a 120 mgdL pois podem induzir ao coma A calciúria pode aumentar com o uso de acetazolamida cloreto de amônio corticostero ides vitamina D e diuréticos efeito inicial Esta diminui com o uso crônico de diuréticos bicarbonato estrógenos lítio e anovulatórios Objetivo Determinar o nível de cálcio total em amostra de soro ou plasma heparinizado Materiais Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 570 nm ou filtro laranja 550 a 590 nm Pipetas para medir amostras e reagentes Procedimento 41 Princípio do teste O cálcio reage com a púrpura de ftaleína em meio alcalino formando um complexo de cor violeta que é medido em 570 nm 42 Técnica Este procedimento elimina a interferência causada por traços de cálcio presentes na vidraria Tomar 2 cubetas do aparelho rotular Teste e Padrão e proceder como a seguir Teste Padrão Reagente de Trabalho 10 mL 10 mL Colocar o aparelho em 570 nm ou filtro verde laranja 550 a 590 nm Tomar a cubeta Teste e acertar o zero do aparelho Em seguida sem movimentar os controles do aparelho adicionar 002 mL da amostra nesta cubeta Misturar bem e determinar a absorbância A Teste Tomar a cubeta padrão e acertar o zero do aparelho Em seguida sem movimentar os controles do aparelho adicionar 002 mL de padrão nesta cubeta Misturar bem e determinar a absorbância A Padrão Cálculos Absorbância do teste Cálcio mgdL x 10 Absorbância do padrão gdL Valores de referência Cálcio soro ou plasma 88 a 110 mgdL Cálcio Ionizado 46 a 54 mgdL Cálcio urina até 200 mg24 horas com dieta restrita de cálcio de 500 mg24 horas Cálcio amostra de urina 016 mg100 mL de FG Cálcio soro ou plasma 12 0 mgdL 7 0 mgdL REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS HENRY J B Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais 21ed Barueri SP Editora Manole 2012 ERICHSEN E S et al Medicina Laboratorial para o Clínico 1ed Coopmed 2009 RAVEL R Laboratório Clínico 6ª ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1997 LOPES A C Tratado de Clínica Médica 1ed São Paulo Roca 2006 MOTTA VA Bioquímica Clínica para o Laboratório 5 ed Editora MedBook 2009 2 17 Análises Metabólicas e Perfusionais Biom edicina 9