Determinação de Proteínas Totais por Espectrofotometria - Análise Comparativa de Métodos

QUÍMICA NOVA 216 1998 787 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES Dimas A M Zaia Departamento de Química CCE Universidade Estadual de Londrina 86051970 Londrina PR Cássia Thaïs B V Zaia Departamento de Ciências Fisiológicas CCB Universidade Estadual de Londrina 86051970 Londrina PR Jaim Lichtig Instituto de Química Universidade de São Paulo 05599970 São Paulo SP Recebido em 23797 aceito em 19698 DETERMINATION OF TOTAL PROTEIN BY SPECTROPHOTOMETRY ADVANTAGES AND DISADVANTAGES OF PROPOSED METHODS Spectrophotometric determination of total pro tein is used in several areas such as clinical analysis food science and technology biochemistry protein chemistry physiology Five spectrophotometric methods are mostly used biuret Lowry Bradford Smith and UV absorption In this review a general overview of these methods is pre sented interferences applications other methodologies are also discussed Keywords protein spectrophotometry protein analysis DIVULGAÇÃO INTRODUÇÃO O desenvolvimento de metodologias e estudos comparativos de metodologias espectrofotométricas para a determinação de proteínas totais sempre foram de grande interesse para profis sionais tanto ligados à indústria de alimentos laboratórios de análises clínicas como para pesquisadores de diversas áreas Apesar de os profissionais serem de diferentes áreas e portan to com objetivos diferentes observamos que os questionamen tos são sempre os mesmos Quais são os principais interferen tes no método que estou usando Qual é o método mais ade quado para meu caso Qual é o princípio envolvido no método que estou usando Esta revisão portanto tem por objetivo abordar diversos aspectos dos métodos espectrofotométricos utilizados para a determinação de proteínas totais em diferentes meios As proteínas desempenham papéis extremamente importan tes na maioria dos processos biológicos atuando como enzi mas hormônios neurotransmissores transportadores através das membranas celulares e outros12 O desenvolvimento de metodologias para determinar pro teínas tem cada vez mais se tornado de fundamental rele vância em várias áreas do conhecimento como por exemplo em análises clínicas1 favorecendo o diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos em nutrição animal3 ressal tando o aproveitamento racional de nutrientes em problemas relacionados à nutrição humana145 como obesidade anorexia nervosa desnutrição devendo as dietas apresentar teor balan ceado de proteínas em tecnologia e ciências de alimentos6 objetivando o aproveitamento racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes em ecolo gia7 relacionando o comportamento alimentar com a quanti dade de proteína ingerida dos alimentos favorecendo o en tendimento dos vários aspectos da vida dos animais silves tres e na área de química de proteínas objetivando purificar novas proteínas e enzimas8 Estas são apenas algumas das mais importantes aplicações analíticas para metodologias de determinação de proteínas to tais obviamente existem muitas outras de grande relevância Os métodos para a determinação da concentração de proteí nas totais são muito variados no entanto as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta e no vi sível UVVis MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS MAIS UTILIZADOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS Muitos métodos espectrofotométricos ao longo dos anos têm sido propostos para a determinação de proteínas totais mas não existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios Os métodos geralmente mais utilizados são o do biureto9 de Lowry10 do Coomassie brilliant blue BG250 ou reagente de Bradford11 do BCA ou reagente de Smith12 e de absorção de proteínas no ultravioleta13 A seguir serão discutidas as vantagens e desvantagens destas cinco metodologias O MÉTODO DE BIURETO Princípio As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth em 1915 posteriormente diversos autores propuseram modificações do mesmo sendo atualmente a proposta metodológica de Gornall e cols9 a mais utilizada O método se baseia na reação do reativo do biureto que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols9 O co bre em meio alcalino reage com proteínas formando um com plexo quadrado planar com a ligação peptídica O produto de reação apresenta duas bandas de absorção uma em 270 nm e outra em 540 nm Apesar da banda na região de 270 nm au mentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14 a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analí ticos porque diversas substâncias normalmente presentes na maioria dos meios analisados absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método Aplicações O método de biureto tem sido aplicado para determinar a 788 QUÍMICA NOVA 216 1998 concentração de proteínas totais em diversos meios sendo eles soro ou plasma sangüíneo15161819 líquido cérebro espi nhal líqüor2021 urina2224 alimentos2529 saliva30 fibrino gênio31 e tecido animal32 O método de biureto tem sido tam bém utilizado em análise por injeção em fluxo19 assim como em alguns métodos cinéticos2133 Apesar de ser rápido utili zar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas9202130 este método não é muito sensível como foi destacado por diversos autores202430 colocandoo em grande desvantagem em relação a outras metodologias e por isto tem sido ao longo dos anos substituído por métodos mais sensíveis Mes mo assim o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sangüíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores151634 bem como para a deter minação de proteínas totais em saliva30 e leite29 quando com parado com outros métodos Interferentes Verificase que o método de biureto está sujeito à interfe rência de substâncias que possam reagir com os íons cobre II Na tabela 1 estão listados alguns interferentes os métodos para sua eliminação variam conforme o caso como discutido nas referências citadas nessa tabela no entanto recomendamos a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e poste rior solubilização para determinação das mesmas O MÉTODO DE LOWRY Princípio O método que atualmente conhecemos como de Lowry e cols10 para a determinação de proteínas totais foi original mente proposto por Wu35 em 1922 sendo esta a metodologia mais utilizada para a determinação de proteínas O princípio do método baseiase numa mistura contendo molibdato tungstato e ácido fosfórico reagente FolinCiocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas na presença do catalisador cobre II e produz um composto com absorção máxima em 750 nm Chou e Goldstein36 e Legler e cols37 estudaram extensiva mente o mecanismo de redução do reagente de FolinCiocalteau por proteínas peptídeos ou aminoácidos Estes autores3637 su gerem que esta redução ocorra diretamente através das cadeias laterais de alguns aminoácidos tirosina triptofano cisteína asparagina e histidina que contribuem com quatro elétrons ou através da retirada de dois elétrons de cada unidade tetra peptídica dos peptídeos e proteínas que é facilitada pela for mação do quelato entre o cobre II e peptídeosproteínas Aplicações A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e por isto tem sido utilizado para a determina ção da concentração de proteínas totais em diversos meios sendo eles líqüor2038 plasma sangüíneo343940 saliva huma na30 tecido animal324143 plantas4446 suco biliar47 membra nas4850 leite humano2851 e produtos alimentícios52 Sargent53 propôs uma modificação no método de Lowry que possibilitou o aumento da sensibilidade em cinqüenta vezes Tal modifica ção está baseada no fato de que o verde de malaquita reage com o azul de molibdato produzido no método de Lowry e o produto desta reação absorve fortemente em 690 nm aumen tando a sensibilidade do método de Lowry Devido ao seu extenso uso o método de Lowry e cols10 tem sido utilizado em diversos tipos de equipamentos auto matizados435457 Em estudos comparativos de métodos alguns autores reco mendam a utilização da metodologia proposta por Lowry e cols10 para determinar proteínas totais em líqüor38 tecido ani mal41 e tecido vegetal45 Os autores384145 de maneira geral recomendam o método de Lowry pois no estudo comparativo de metodologias o mesmo mostrouse mais sensível com me lhor exatidão menor consumo de amostra e dependendo do caso menos suscetível a alguns tipos de interferentes Interferentes Apesar do método de Lowry e cols10 apresentar uma gran de sensibilidade para proteínas o mesmo possui algumas des vantagens tais como estar sujeito a muitos interferentes apresentar longo tempo de análise possuir absortividade es pecífica altamente variável para diferentes proteínas e seguir a Lei de BeerLambert apenas numa pequena faixa de con centração de proteínas Várias modificações no método de Lowry têm sido propos tas para resolver os problemas acima citados Para aumentar a velocidade da reação Shakir e cols58 recomendam aquecer a amostra por 3 minutos a 37C após a adição de sulfato de cobre alcalino e por mais três minutos após a adição do Tabela 1 Algumas substâncias que interferem na determinação de proteínas totais pelo método de biureto9 Interferentes Comentários Referências Bilirrubina Absorve em 540 nm sério interferente acima de 70 mgL 9 20 21 Amônio Sulfato de amônio usado como precipitante de 9 proteínas em meio alcalino amônia complexa cobre Lipídios Provoca turbidez nas amostras com conseqüente 32 aumento da absorção das mesmas Hemoglobina Aumenta a absorção das amostras 9 21 Dextran40 e 70 Causa turbidez nas amostras em meio alcalino 1618 com tartarato devido à formação de um complexo insolúvel entre o dextran e cobre Peptídeos e aminoácidos Reagem com cobre sendo interferentes em métodos 33 livres His Ser Thr baseados em cinética de reação Melanina Provoca falso positivo 72 Tampão trisHCl e glicose Reage com o cobre presente no reativo de biureto 33 Lactose Provoca falso positivo 29 Amido Provoca falso positivo 26 QUÍMICA NOVA 216 1998 789 reagente de FolinCiocalteau Larson e cols59 recomendam a adição de tri14dimercaptobutanodiol 3 minutos após a adi ção do reagente FolinCiocalteau com o objetivo de aumentar a velocidade de reação e eliminar a etapa de 30 minutos de espera Alam60 propõe um rígido controle do pH para diminuir o tempo de análise estabilizar o produto formado e uniformi zar as absortividades específicas das diferentes proteínas Hartree61 fez várias modificações no método de Lowry melhorando a faixa de linearidade e uniformizando as absorti vidades específicas para algumas proteínas estas modifica ções61 são as mais utilizadas apesar de tornar o método de Lowry mais trabalhoso no preparo dos reagentes Stauffer62 recomenda a construção do gráfico de log Abs versus log microgramas de proteína e Hess e cols63 recomen dam o uso de alta concentração do reagente FolinCiocalteau Tais procedimentos segundo estes autores diminuem o tempo de análise uniformizam as absortividades específicas para al gumas proteínas eou aumentam a faixa de linearidade do mé todo de Lowry e cols10 Diversas substâncias interferentes no método de Lowry são citadas na literatura estas normalmente causam aumento na absorbância do branco diminuição da absortividade específica ou formação de algum tipo de precipitado Os interferentes mais comuns estão listados na tabela 2 tendose ainda como fonte de consulta uma lista preparada por Bensadoun e Weinstein64 Para a eliminação da maioria dos interferentes citados na tabela 2 sugerese a precipitação das proteínas utilizandose ácido tricloroacético e coprecipitantes426465 misturas de metanolclorofórmioágua48 ou hexanoisopropanol49 Se o in terferente for composto de enxofre como mercaptanas por exemplo aconselhase o uso de iodo acetato66 ou a secagem a vácuo da amostra67 se for lipídeo ou melanina sugerese a adição de detergentes416869 Verificase que a reação de Lowry é fotossensível70 recomendandose exposição uniforme de luz aos tubos Apesar de todos os esforços para melhorar o método de Lowry isto é diminuir o tempo requerido para a análise au mentar a faixa de linearidade para a lei de Beer e tornar mais homogênea as absortividades específicas para diferentes pro teínas o mesmo continua moroso e sujeito a inúmeros interfe rentes e nos últimos anos está sendo substituído por outros métodos tais como o método de Bradford e o método de Smith ou do BCA O MÉTODO DE BRADFORD Princípio O método de Bradford11 é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG250 Este método é baseado na interação entre o corante BG250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas No pH de reação a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica que absorve fortemente em 595 nm76 Aplicações O método de Bradford11 é mais rápido e sensível que o de Lowry e cols10 e tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios plasma ou soro sangüíneo3439 líqüor207781 saliva humana30 produtos ali mentícios82 leite humano282983 tecidos de plantas4445 sus pensões de células8486 avidina e estreptavidina87 uri na2224798890 e detergentes91 Alguns autores recomendam o método de Bradford para a determinação de proteínas totais em leite humano83 líqüor80 e urina24 No entanto com relação à urina diversos autores des tacam dois fatores contra a utilização desta metodologia sendo um deles a dependência entre o número de diluições da amos tra e o resultado da concentração de proteína obtido e o outro a presença de proteínas de baixo peso molecular subestimando a concentração de proteínas totais na urina principalmente de pacientes com proteinúria2288909296 Tabela 2 Algumas substâncias que interferem na determinação de proteínas totais pelo método de Lowry e cols10 Interferentes Comentários Referências Compostos fenólicos Reagem com o reativo de FolinCiocalteau resultando 10 44 57 73 em falso positivo Lipídios Provocam turbidez das amostras 10 41 48 49 69 71 Detergentes Provocam a formação de precipitado 41 48 49 57 61 65 Ácido úrico Reage com o reativo de FolinCiocalteau resultando em 10 73 falso positivo Guanina e xantina Reagem com o reativo de FolinCiocalteau resultando 10 73 em falso positivo Sulfato de amônio Diminui a absortividade devido à alteração do pH da 10 57 amostra Melanina Reage com o reativo de FolinCiocalteau resultando 68 72 em falso positivo Bilirrubina Aumenta a absorção da amostra 20 4metilumbeliferona Reage com o reativo de FolinCiocalteau resultando em 47 falso positivo Mercaptanas e cisteína Reagem com o reativo de FolinCiocalteau resultando 48 49 66 67 73 em falso positivo Tampão trisHCl Reage com o reativo de FolinCiocalteau resultando em 57 73 falso positivo Açúcares Reagem com o reativo de FolinCiocalteau resultando 57 61 7375 em falso positivo RNA Aumenta a absorção das amostras 65 73 790 QUÍMICA NOVA 216 1998 Algumas metodologias utilizando equipamentos automatiza dos8097101 estão tornando este método mais rápido Interferentes Apesar do método de Bradford11 ser mais rápido sensível e estar sujeito a um número bem menor de interferentes que o método de Lowry e cols10 o mesmo apresenta algumas des vantagens tais como a variação da absortividade específica para diferentes proteínas devido à baixa solubilidade75102 ou baixo peso molecular das mesmas228890 e fornecimento de resulta dos nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG250 que varia conforme a procedência sendo reco mendável a padronização das condições de reação para cada lote de corante adquirido Para tentar tornar mais uniforme a absortividade específica de diferentes proteínas algumas alternativas foram sugeridas aumentar a concentração do corante103 aumentar a solubiliza ção das proteínas que vão reagir com o corante usando deter gentes24798486104106 hidróxido de sódio84107 ou fenol108 ou aquecer com uréia e 2mercaptoetanol109 Entretanto no caso de amostras com proteínas de baixo peso molecular não reco mendamos a utilização deste método A falta de linearidade na lei de BeerLambert11107110 tem sido também observada devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente BG250 Existem poucas substâncias citadas na literatura que são interferentes no método de Bradford Estes interferentes nor malmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG250 ou reagem com o corante causando au mento na absorbância A tabela 3 mostra os interferentes mais comuns ao método de Bradford11 Os métodos de eliminação destes interferentes variam conforme o caso como discutido nas referências citadas nessa tabela no entanto recomendamos a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético O MÉTODO DE SMITH OU BCA Princípio O método proposto por Smith e cols12 também conhecido por método do ácido bicinchoninico BCA 44dicarboxi22 biquinolina se baseia na reação de cobre II com proteí nas em meio alcalino produzindo cobre I e formando um complexo com o BCA que absorve fortemente na região de 560 nm No entanto Legler e cols37 estudando o papel catalisa dor do cobre em meio alcalino na reação entre proteínas e o reativo de FolinCiocauteau detectaram formação de um intermediário de cobre III com peptídeos porém não de tectaram cobre I como estabelecido por Smith e cols12 devendo portanto ser este mecanismo melhor estudado para se estabelecer qual ou quais intermediários de cobre são formados Aplicações Este método tem a vantagem de ser mais simples no prepa ro dos reagentes tão sensível quanto o método de Lowry e cols10 e relativamente rápido sendo aplicado na determinação da concentração de proteínas totais em saliva30 proteínas celu lares41113 interferons75 leite humano28 e determinação de gru pos funcionais114 O método de Smith e cols12 tem sido recomendado em es tudos de comparação de metodologias para a determinação de proteínas totais em leite humano28 e células113 Esta metodolo gia também tem sido adaptada para a determinação de proteí nas totais utilizandose equipamentos automatizados115116 Interferentes O método de Smith e cols12 possui algumas desvantagens como a dependência da temperatura de incubação das amos tras12115 a variação da absortividade específica para diferentes proteínas3075115 e a variação da absorbância com o tempo Recomendamos portanto um rígido controle no tempo de lei tura das amostras após a incubação das mesmas Os interferentes em potencial do método de Smith e cols12 são aquelas substâncias que reagem com os íons cobre reações de óxidoredução formação de complexos precipitação ou com o reativo de BCA A tabela 4 mostra os interferentes mais co muns no método de Smith e cols12 Os métodos de eliminação destes interferentes variam conforme o caso como discutido nas referências citadas nessa tabela em muitas situações recomen damos a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético Tabela 3 Algumas substâncias que interferem na determinação de proteínas totais pelo método de Bradford11 Interferentes Comentários Referências Tolbutamida Provoca falso positivo 89 Uréia Fornece resultado falso positivo acima de 45 gL 89 107 109 Cloreto de sódio e de Fornecem resultado falso negativo acima de 1 M 85 89 107 potássio Detergentes Triton X A larga banda de absorção em 650 nm devido a reação 11 76 8486 91 104 107 100 SDS Tween20 entre o corante e os detergentes interfere na banda em 595 nm resultando em falso positivo Ciclodextrinas Formam um complexo de inclusão com o corante BG 74 250 resultando em falso positivo Polifenóis e polifenóis Reagem com as proteínas impedindo a formação do 11 44 45 111 oxidases complexo das mesmas com o corante BG250 2mercaptoetanol Diminuem a absorção da amostra 11 109 guanadina Glicerol Provoca falso positivo 11 85 107 Lipídios Causam turbidez na amostra 85 Cloropromazina Provoca falso positivo 112 Fluoreto Diminui a absorção da amostra 78 QUÍMICA NOVA 216 1998 791 MÉTODO DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA Princípio Este método é baseado no fato de que as proteínas mostram absorção na região de 280 nm e na região abaixo de 220 nm sendo a primeira devido a diversos aminoácidos fenilalanina cisteína cistina metionina triptofano histidina e tirosina e a segunda devido à ligação peptídica13 No entanto em 280 nm em pH neutro somente os aminoácidos triptofano tirosina e cistina possuem uma absortividade molar significativamente grande119120 Aplicações O método tem sido muito utilizado durante os procedi mentos de purificação e separação de proteínas13 para a quan tificação das mesmas Suas principais vantagens são as de não destruir a amostra e de ser rápido na literatura raramente são descritas outras aplicações além desta O principal moti vo desta limitação é que em amostras complexas diversas substâncias absorvem no ultravioleta tornando os resultados pouco confiáveis Interferentes Este método está sujeito a muitos interferentes sendo que qualquer substância que apresente uma banda de absorção na região de leitura é um interferente em potencial Este fato fez com que esta metodologia fosse utilizada somente em proces sos de purificação de proteínas onde uma avaliação semi quantitativa é suficiente na maioria dos casos Os métodos discutidos acima são os mais utilizados porém como estão sujeitos a limitações a todo o momento continuam aparecendo na literatura modificações das metodologias já existentes além de propostas de novas metodologias que se rão discutidas a seguir NOVOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS Zaia e cols121124 propuseram uma metodologia básica utili zando pbenzoquinona PBQ para a determinação de proteí nas em diversos meios O método se baseia no fato de que o produto de reação entre PBQ e proteínas absorve em 350 nm Esta metodologia mostrouse 10 vezes mais sensível que o método de biureto124 de menor custo que o de Lowry e cols123 e mais rápida que os métodos de Lowry e Kjedahl122123 Zaia e cols121 propuseram ainda uma metodologia inédita que possibilita em uma única análise determinar simultaneamente proteínas e aminoácidos pois o produto de reação PBQproteí na absorve em 350 nm e o produto de reação PBQaminoáci dos absorve em 480 nm Uma outra quinona o cloranil foi utilizada por Rahim e AlGhabsha125 para a determinação de proteínas totais Krystal e cols126127 propuseram uma metodologia que é 100 vezes mais sensível que o método de Bradford11 Este método está baseado no fato de que prata amoniacal ligase a proteínas e o produto de reação absorve fortemente em 420 nm Stoscheck128 propôs uma metodologia que é 25 vezes mais sensível que o método de Bradford11 e 50 vezes mais sensível que o de Lowry10 Neste método o ouro coloidal na presen ça de proteínas desloca o seu máximo de absorção de 535 para 595 nm Segundo a autora o método está sujeito a pou cos interferentes Estas metodologias que utilizam ouro coloidal ou prata amoniacal possuem um inconveniente óbvio que é a utilização de reagentes caros no entanto Krystal e cols126 afirmam que o custo de 10 análises em triplicata é menor que dois centavos de dolar Soedjak129 propôs uma metodologia em que o eritrosin B reage com proteína formado um cromóforo que absorve forte mente em 545 nm A sensibilidade desta metodologia está en tre 2 e 14 µgmL de proteína que é a mesma sensibilidade do método proposto por Zaia e cols121 O método da ninhidrina130 tem sido utilizado para a deter minação de proteínas totais304475 Nesta metodologia as pro teínas são submetidas à hidrólise ácida sendo os aminoácidos liberados determinados com ninhidrina A desvantagem desta metodologia é o tempo gasto na hidrólise ácida nos métodos comumente utilizados CONCLUSÃO Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais po rém um deles é essencial o conhecimento o mais preciso possível da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentrações aproximadas Isto facilitará a identificação dos possíveis interferentes e conseqüentemente ajudará na escolha do método mais apropriado para cada situação Outros fatores também importantes são a sensibilidade necessária que é dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível a rapidez e o cus to da metodologia e não menos importante o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método escolhido Tabela 4 Algumas substâncias que interferem na determinação de proteínas totais pelo método de Smith e cols12 Interferentes Comentários Referências Açúcares em geral Provocam parcial redução do cobre II resultando em 12 74 75 113 falso positivo 116 117 EDTA Complexa íons cobre II 12 Lipídios Reação entre BCA e lipídios resulta em falso positivo 41 71 Sulfato de amônio Resulta falso negativo 12 117 Mercaptoetanol e Provocam redução do cobre II resultando em falso 117 dithiothreitol positivo Peróxido de hidrogênio Reação entre BCA e peróxido de hidrogênio resulta em 118 falso positivo Vitamina C e Provocam redução do cobre II resultando em falso 112 paracetemol positivo Cloropromazina Provoca turbidez na amostra 112 Penicilinas Provocam falso positivo 112 792 QUÍMICA NOVA 216 1998 Temos observado que muitas vezes a escolha de uma meto dologia para a determinação de proteínas totais é feita com base na popularidade de um determinado método e isto acon tece em parte devido à falta de trabalhos de comparação de metodologias Portanto acreditamos que muitos trabalhos des te tipo devam ainda ser desenvolvidos principalmente nas áreas de análises clínicas ciências e tecnologia de alimentos AGRADECIMENTOS Agradecemos a todas as pessoas que durante estes anos com partilharam sua experiência analítica assim como dispenderam parte de seu tempo em discussões dos problemas de análises de proteínas CTBVZ agradece ao CNPq pela bolsa de pesquisador REFERÊNCIAS 1 Ganong W F Review of Medical Physiology 17ª edi ção PrenticeHall Inc San Francisco 1995 2 Darnell J Lodish H Baltimore D Molecular Cell Biology Scientific American Books New York 1990 3 McDonald P Edwards R A Greenhalgh J F D Animal Nutrition Longman Scientific Technical Hong Kong 1987 4 National Academy of SciencesNational Research Council Recommended Dietary Allowances Publ 0309 022169 Washington 1974 5 King B M Neurosc Biobehav Rev 1988 12 29 6 Fennema O R Principles of Food Science Marcel Dekker Inc New York 1976 7 Robbins C Wildlife Feeding and Nutrition Academic Press New York 1983 8 Heftmann E Chromatography A laboratory handbook of chromatografic and electrophoretic methods Van Nostrand 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T D Anal Biochem 1984 139 309 41 Upreti G C Ratcliff R A Riches P C Anal Biochem 1988 168 421 42 Retz K C Steele W J Anal Biochem 1977 79 457 43 Harrington C R Anal Biochem 1990 186 285 44 Marks D L Buchsbaum R Swain T Anal Biochem 1985 147 136 45 Mattoo R L Ishaq M Saleemuddin M Anal Biochem 1987 163 376 46 Eze J M O Dumbroff E B Can J Bot 1982 60 1046 47 Marinelli R A Luquita M G Garay E A R Clin Chem 1987 33 1475 48 Wessel D Flügge UI Anal Biochem 1984 138 141 49 RodríguezVico F MartínezCayuela M García Peregrín E Ramírez H Anal Biochem 1989 183 275 50 i T H Anal Biochem 1973 52 517 51 Patton S Huston G E Nutr Rep Int 1984 30 1401 52 Sebecic B Nahrung 1987 31 817 53 Sargent M G Anal Biochem 1987 163 476 54 Oosta G M Mathewson N S Catravas G N Anal Biochem 1978 89 31 55 Lüdi H Bärtschi A Anal Chim Acta 1989 217 359 56 Clifton P M Chang L Mackinnon A M Anal Biochem 1988 172 165 57 Fryer H J L Davis G E Manthorpe M Varon S Anal Biochem 1986 153 262 58 Shakir F K Audilet D Drake III A J Shakir K M M Anal Biochem 1994 216 232 59 Larson E Howlett B Jagendorf A Anal Biochem 1986 155 243 60 Alam A Anal Biochem 1992 203 121 61 Hartree E F Anal Biochem 1972 48 422 62 Stauffer C E Anal Biochem 1975 69 646 63 Hess H H Lees M B Derr J E Anal Biochem 1978 85 295 64 Bensadoun A Weinstein D Anal Biochem 1976 70 241 65 Polacheck I Cabib E Anal Biochem 1981 117 311 66 Ross E Schatz G Anal Biochem 1973 54 304 67 Makkar H P S Sharma O P Negi S S Anal Biochem 1980 104 124 68 Vedralová E Borovansky J Duchoñ J J Biochem Biophys Meth 1987 14 343 69 Kashyap M L Hynd B A Robinson K J Lipid Res 1980 21 491 70 Dawson J M Heatlie P L Anal Biochem 1984 140 391 71 Kessler R J Fanestil D D Anal Biochem 1986 159 138 72 Borovansky J Melezínek I Budesínská A Anal Biochem 1986 159 249 73 Higuchi M Yoshida F Agric Biol Chem 1978 42 1669 QUÍMICA NOVA 216 1998 793 74 Xu P P Troupe C M Sharma A Microchem J 1994 49 85 75 Fountoulakis M Juranville J F Manneberg M J Biochem Biophys Meth 1992 24 265 76 Compton S J Jones C G Anal Biochem 1985 151 369 77 Macart M Gerbaut L Clin Chim Acta 1982 122 93 78 Cheung C K Chan K W Chan A Y W Clin Chem 1990 36 2011 79 Macart M Gerbaut L Clin Chem 1988 34 998 80 Huang C M Clin Chem 1988 34 980 81 Stahl M Clin Chem 1984 30 1878 82 Richard J P Paquin P Milchwissenschaft 1990 45 92 83 Bergqvist Y Karlsson L Fohlln L Clin Chem 1989 35 2127 84 Gogstad G O Krutnes M B Anal Biochem 1982 126 355 85 Pande S V Murthy M S R Anal Biochem 1994 220 424 86 Fanger B O Anal Biochem 1987 162 11 87 Sharma H K Tihon C Anal Biochem 1988 170 135 88 Shiba K S Kanamori K Harada T Nakao M Naka jima K Kodaira T Nakagawa H Clin Chem 1985 31 1215 89 Lott J A Stephan V A Pritchard Jr K A Clin Chem 1983 29 1946 90 Wimsatt D K Lott J A Clin Chem 1987 33 2100 91 Rosenthal K S Koussale F Anal Chem 1983 55 1115 92 Goren M P Wright R K Li J T L Clin Chem 1985 311771 93 Dilena B A Penberthy L A Clin Chem 1984 30 1589 94 Heick H M C Mohammed A Clin Chem 1984 30 1104 95 Shahangian S Brown P I Ash K O Clin Chem 1983 29 1452 96 Heick H M C Mohammed A Charbonneau F Clin Chem 1983 29 1863 97 Gillery P Locre F Malgras A Borel J P Clin Chem 1985 31 1092 98 Korenaga T Zhou X Izawa M Takahashi T Moriwake T Anal Chimica Acta 1992 261 67 99 Joern W A Schmoele L Clin Chem 1981 27 1305 100 Redinbaugh M G Campbell W H Anal Biochem 1985 147 144 101 Kanaya K I Hiromi K Agric Biol Chem 1988 52 2615 102 Marshall T Williams K M Anal Biochem 1992 204 107 103 Read S M Northcote D H Anal Biochem 1981 116 53 104 Friedenauer S Berlet H H Anal Biochem 1989 178 263 105 Duhamel R C Meezan E Brendel K J Biochem Biophys Meth 1981 5 67 106 Löffler B M Kunze H Anal Biochem 1989 177 100 107 Stoscheck C M Anal Biochem 1990 184 111 108 Marshall T Williams K M J Biochem Biophys Meth 1986 13 145 109 Gotham S M Fryer P J Paterson W R Anal Biochem 1988 173 353 110 Splittgerber A G Sohl J Anal Biochem 1989 179 198 111 Godshall M A J Food Sci 1983 48 1346 112 Marshall T Williams K M Anal Biochem 1991 198 352 113 Goldschmidt R C Kimelberg H K Anal Biochem 1989 177 41 114 Tyllianakis P E Kakabakos S E Evangelatos G P Ithakissios D S Anal Biochem 1994 219 335 115 Davis L C Radke G A Anal Biochem 1987 161 152 116 Redinbaugh M G Turley R B Anal Biochem 1986 153 267 117Brown R E Jarvis K L Hyland K J Anal Biochem 1989 180 136 118 Baker W L Anal Biochem 1991 192 212 119 Groves W F Davis Jr F C Sells B H Anal Biochem 1968 22 195 120 Pace C N Vajdos F Fee L Grimley G Gray T Protein Sci 1995 4 2411 121 Zaia D A M Barreto W J Santos N J Endo A S Anal Chim Acta 1993 277 89 122 Barreto W J de Aquino M Zaia D A M Anal Letters 1990 23 1279 123 Zaia D A M Rockenbach S R Obara M M Barreto W J Arizawa S Curi R Lichtig J Anal Letters 1992 25 1225 124 Zaia D A M Obara M M Rockenbach S R Barreto W J Gaziri L C J Zaia C T B Lichtig J Braz J Med Biol Res 1992 25 549 125 Rahim S A AlGhabsha T S Egypt J Chem 1977 20 627 126 Krystal G Macdonald C Munt B Ashwell S Anal Biochem 1985 148 451 127 Krystal G Anal Biochem 1987 167 86 128 Stoscheck C M Anal Biochem 1987 160 301 129 Soedjak H S Anal Biochem 1994 220 142 130 Moore S J Biol Chem 1968 243 6281 FACULDADE DE AMERICANA FAM CURSTO TÉCNICO EM NOME DO CURSO WINSTON PINHEIRO CLARO GOMES RESENHA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS POR ESPECTROFOTOMETRIA VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES AMERICANASP MAIO2023 O artigo Determinação de proteínas totais por espectrofotometria vantagens e desvantagens dos métodos existentes O texto discute a importância do desenvolvimento de métodos espectrofotométricos para a determinação de proteína total em diferentes situações Assim profissionais de diversas áreas incluindo indústria alimentícia laboratórios de análises clínicas e pesquisadores têm interesse em entender as principais interferências nos métodos utilizados determinar o método mais adequado para cada situação e entender os princípios envolvidos nos métodos utilizados As proteínas desempenham um papel vital em muitos processos biológicos atuando como enzimas hormônios neurotransmissores e transportadores através das membranas celulares entre outros Portanto o desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas é cada vez mais relevante em áreas como análises clínicas nutrição animal nutrição humana tecnologia e ciências de alimentos ecologia e química de proteínas A revisão proposta neste texto tem como objetivo abordar vários aspectos das metodologias espectrofotométricas utilizadas para a determinação de proteínas totais em diferentes meios O texto enfatiza a importância do desenvolvimento contínuo de metodologias espectrofotométricas para a determinação de proteínas totais destacando sua relevância em diversas áreas do conhecimento Os métodos mais comumente usados são biureto Lowry Coomassie brilhante azul BG250 ou reagente de Bradford BCA ou reagente de Smith método de absorção de proteína UV Neste artigo serão discutidos os prós e contras desses cinco métodos O método do biureto é um dos métodos espectrofotométricos mais comumente usados para a determinação da proteína total Baseiase na reação do cobre com proteínas para formar um complexo que pode ser medido por bandas de absorção em 270 nm e 540 nm No entanto a banda de 540 nm é preferencialmente utilizada devido à interferência na região de 270 nm O método de Lowry utiliza o reagente de FolinCiocalteau e cobreII como catalisador para reagir com proteínas resultando na formação de compostos com absorção máxima em 750 nm É um método amplamente utilizado para a determinação da proteína total O método de Bradford usa o corante BG250 para interagir com toda a proteína resultando em uma mudança de cor que pode ser medida em 595 nm É um método rápido e sensível amplamente utilizado em diversas aplicações mas requer cuidados especiais quando aplicado à determinação de proteínas totais na urina O método Smith tem algumas desvantagens como dependência da temperatura de incubação da amostra variações na absorbância específica para diferentes proteínas e mudanças na absorbância ao longo do tempo Além disso substâncias que reagem com íons de cobre ou reagentes BCA podem interferir O método de absorção de UV é baseado na capacidade das proteínas de absorver luz na região abaixo de 280 nm e 220 nm Muitos aminoácidos como fenilalanina cisteína cistina metionina triptofano histidina e tirosina têm absorção em 280 nm e absorção abaixo de 220 nm Um novo método espectrofotométrico proposto por Zaia e colaboradores usa p benzoquinona PBQ para medir proteínas em diferentes meios O método se baseia na reação entre o PBQ e uma proteína resultando em um produto que absorve luz em 350 nm Comparado com o método do biureto este novo método tem um aumento de 10 vezes na sensibilidade Além disso é mais econômico que o método de Lowry e colaboradores e mais rápido que o de Lowry e Kjedahl Vários fatores devem ser considerados antes de selecionar um método de ensaio de proteína total Isso ajudará a identificar possíveis interferências e a escolher o método mais adequado A Tabela 4 lista algumas substâncias que podem interferir na determinação de proteínas pelo método de Smith e colegas Muitas vezes a seleção do método é baseada na popularidade de um determinado método devido à falta de estudos comparativos entre os métodos O artigo Determinação de proteínas totais por espectrofotometria vantagens e desvantagens dos métodos existentes abordam de maneira abrangente a importância do desenvolvimento de métodos espectrofotométricos para a determinação de proteínas em diversas situações O texto é relevante para profissionais de diferentes áreas como a indústria alimentícia laboratórios de análises clínicas e pesquisadores que buscam compreender as interferências nos métodos utilizados escolher a metodologia mais adequada para cada caso e compreender os princípios envolvidos nessas técnicas As proteínas desempenham um papel fundamental em diversos processos biológicos atuando como enzimas hormônios neurotransmissores e transportadores nas membranas celulares entre outras funções Portanto o desenvolvimento de metodologias para a determinação de proteínas é cada vez mais relevante em áreas como análises clínicas nutrição animal e humana tecnologia e ciências de alimentos ecologia e química de proteínas O objetivo principal do artigo é revisar os diferentes aspectos das metodologias espectrofotométricas utilizadas para a determinação de proteínas totais em diferentes meios O texto destaca a importância contínua do desenvolvimento dessas metodologias e sua relevância em várias áreas do conhecimento São discutidos os prós e contras de cinco métodos espectrofotométricos amplamente utilizados biureto Lowry Bradford Smith e absorção no ultravioleta UV Cada método é abordado em termos de princípios vantagens e desvantagens Por exemplo o método do biureto se baseia na reação do cobre com proteínas enquanto o método de Bradford utiliza um corante para interagir com as proteínas O método de Smith possui algumas desvantagens como dependência da temperatura de incubação e variação na absorbância específica para diferentes proteínas Destacase ainda um novo método proposto por Zaia e colaboradores que utiliza p benzoquinona PBQ para medir proteínas em diferentes meios Esse método apresenta maior sensibilidade em comparação com o método do biureto e é mais econômico e rápido que o método de Lowry e Kjedahl O texto também ressalta a importância de considerar diversos fatores antes de escolher um método para a determinação de proteínas totais como a sensibilidade necessária o tempo e o custo da metodologia além de possíveis interferências A tabela apresentada no texto lista algumas substâncias que podem interferir no método de Smith e colaboradores No entanto o texto aponta que muitas vezes a escolha de um método é feita com base na popularidade e destaca a necessidade de mais estudos comparativos entre as metodologias existentes Em suma o artigo oferece uma visão abrangente sobre os métodos espectrofotométricos para a determinação de proteínas totais destacando a importância do desenvolvimento contínuo dessas técnicas e fornecendo informações relevantes para profissionais de diversas áreas REFERÊNCIAS ZAIA D et al DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES DETERMINATION OF TOTAL PROTEIN BY SPECTROPHOTOMETRY ADVANTAGES AND DISADVANTAGES OF PROPOSED METHODS Spectrophotometric determination of total pro v 21 n 6 1998