Identificação e Caracterização de Metagenomas e Isolados Bacterianos Visando a Biorremediação de Solos de Áreas de Mineração

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE METAGENOMAS E ISOLADOS BACTERIANOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS DE ÁREAS DE MINERAÇÃO Erica Mendes Lopes Bióloga JABOTICABAL SÃO PAULOBRASIL Janeiro de 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE METAGENOMAS E ISOLADOS BACTERIANOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS DE ÁREAS DE MINERAÇÃO Erica Mendes Lopes Orientadora Profª Drª Eliana G de Macedo Lemos Coorientador Prof Dr Jackson Antônio Marcondes de Souza Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Unesp Campus de Jaboticabal como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agropecuária JABOTICABAL SÃO PAULOBRASIL Janeiro de 2016 Lopes Erica Mendes L864i Identificação e caracterização de metagenomas e isolados bacterianos visando a biorremediação de dolos de áreas de mineração Erica Mendes Lopes Jaboticabal 2016 xii 97 p il 28 cm Tese doutorado Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias 2016 Orientadora Eliana G de Macedo Lemos Coorientador Jackson A Marcondes de Souza Banca examinadora Tsai Siu Mui Hugo Miguel Preto de Morais Sarmento Janete Ap Desiderio Tereza Cristina Luque Castelane Bibliografia 1 Biorremediação 2 Biorremoção 3 Genes de resistência I Título II JaboticabalFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias CDU 6314611 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação UNESP Câmpus de Jaboticabal DADOS CURRICULARES DO AUTOR Erica Mendes Lopes nascida na cidade de Jaboticabal SP em 10 de agosto de 1988 Graduouse em Ciências Habilitação Plena em Biologia pelo Centro Universitário Barão de Mauá em Ribeirão Preto SP no ano de 2009 Estagiou no Laboratório de Bioquímica e Microrganismos de Plantas da FCAVUNESP Câmpus Jaboticabal Departamento de Tecnologia de fevereiro de 2007 à dezembro de 2009 Em 2012 concluiu o curso de Mestrado em Microbiologia Agropecuária pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária Unesp Câmpus de Jaboticabal Durante esse período publicou artigos em revistas científicas e participou de eventos apresentando trabalhos na área de Microbiologia e Fixação Biológica do Nitrogênio Ingressou no ano de 2012 o curso de Doutorado em Microbiologia área de concentração em Microbiologia Agropecuária Universidade Estadual Paulista Câmpus de Jaboticabal Desenvolveu sua tese junto ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da UNESPFCAV atuando na área de Biotecnologia aplicada à utilização de ferramentas moleculares e microrganismos para identificação de comunidade microbiana de diferentes ecossistemas de regiões de mineração e uma possível aplicação na recuperação de áreas contaminadas por metais pesados Comece fazendo o que é necessário depois o que é possível e de repente você estará fazendo o impossível São Francisco de Assis MEUS PAIS Manoel e Neuci Por terem me dado o meu maior dom a vida e por preencherem ela de alegrias e sonhos Muito obrigado por sonharem por mim e comigo saibam que este trabalho é a concretização de um sonho de uma família e uma vida Pai e Mãe jamais esquecerei todas as lições conselhos e alegrias Agradeço por tudo que sempre fizeram para que meus sonhos se realizassem agradeço ainda por todas as benções que Deus nos concedeu e a maior delas vocês Mãe que você continue sendo essa mulher sábia e companheira e continue nos motivando sempre com seu otimismo positividade e fé Pai que continue este homem forte lutador e protetor que Deus te abençoe sempre com muita saúde para que continue perpetuando seus ensinamentos de homem sábio que és Continuem sempre sendo meu exemplo de moral honestidade e profissionalismo MEUS AVÓS Nivaldo e Lourdes Agradeço a vocês meus velhinhos por sempre terem dispensado um pouquinho de seu tempo para participarem da minha vida e dividirem comigo suas experiências Saibam que jamais esquecerei cada uma das histórias que dividiram comigo Que vocês continuem sendo essas pessoas açucaradas e cheias de alegria que mesmo nos momentos de maior desespero conseguem com a maior calma do mundo me dar uma palavra amiga Vó que a senhora continue por muitos anos essa pessoa generosa prestativa e que deixou de ter para si para que eu tivesse esta é a maior prova de amor Vô que o senhor continue sendo esse homem altivo animado um exemplo de bondade e de um enorme coração que só consegue doar o seu melhor ao próximo Antônia e Gervasio Que continuem sendo esta força sobrenatural que me auxiliam em meus caminhos e que onde quer que estejam cuidam para que sempre aconteça o melhor na minha vida e de meu Pai Vó saiba que mesmo sem conhecela sinto nas palavras de meu Pai a doçura de mulher que foi e um grande exemplo de garra a ser seguido MEU IRMÃO Murilo O maior amor não é aquele que vem do sangue e sim do coração E você é o irmão que Deus me deu continue sendo meu grande Amigo ALEGRIAS DE MINHA VIDA Eduardo Felipe e Lenita Muito obrigado Lê por sempre se alegrar com minhas vitórias e por toda a parceria e generosidade que tem por mim e minha família e continue sendo esta grande amiga Eduardo muito obrigado por tão pequenininho me ensinar o verdadeiro significado do amor e gratidão Felipe obrigado por encher a minha vida de alegria e por me ensinar o verdadeiro significado da bondade AO MEU NAMORADO Thiago Muito obrigado pela parceria e companheirismo e que apesar das diferenças nos possamos conseguir sempre buscar no amor e na Fé a força necessária para conseguirmos conquistar nossos objetivos e crescer juntos Tudo que sou e conquistei foi por vocês DEDICO A DEUS Pai todo poderoso que me concedeu o dom de minha vida e que me dá forças e sabedoria para trilhar meus caminhos me orientando com todo o amor de Pai A São Judas Tadeu por todas as graças concedidas e por ter sido a força que de maneira indireta me movimentou para realização deste trabalho pela sua história de forca determinação e garra A São Miguel Arcanjo pela presença constante em minha vida me guiando nas provações e participando das minhas alegrias Minha eterna gratidão pelas palavras de carinhos nos momentos de espiritualidade intensa OFEREÇO AGRADECIMENTOS A minha orientadora Profª Eliana por ter me acolhido em seu laboratório e em seu coração por ser esta grande mulher e pesquisadora Muito obrigado por dividir uma mínima parte de seus conhecimentos e por contribuir imensamente para meu crescimento intelectual e moral Que a senhora continue sendo esta pessoa maravilhosa este anjo sem asas que sempre tem uma palavra amiga para nos dar Ao meu coorientador Prof Jackson muito obrigado por contribuir para o meu crescimento profissional A Profª Lucia por todos os conselhos ensinamentos e por me tratar com a maior ternura do mundo Muito obrigado por sempre me ouvir acolher e por nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difíceis Aos Professores Dra Janete Ap Desidério Dra Tsai Siu Mui Dra Tereza C Luque Castellane Dr Hugo Miguel Preto de Morais Sarmento pela participação na banca examinadora e preciosas sugestões Ao Prof Daniel por me ensinar muito sobre informática e estatística Obrigado pela dedicação ao meu trabalho Aos meus amigos Elisangela Thais Mariana e Elwi pelos momentos engraçados que vivemos em nosso aquário por tudo que aprendi com cada um de vocês e sobretudo pela amizade carinho compreensão e ideias para conclusão deste trabalho Muito Obrigado por serem estas pessoas maravilhosas Ao Dr Luciano Kishi pela amizade carinho compreensão e por dividir comigo uma pequena parte de seu conhecimento saiba que graças a suas preciosas ideias este trabalho fez com que ele se tornasse mais importantes do que imaginava Ao Dr João Carlos Campanharo por tudo que me ensina até hoje que você continue sendo este exemplo de humildade competência e profissionalismo A Drª Silvana Pompeia por todos os auxílios e por ser sempre muito generosa amorosa e carinhosa comigo Sil você uma pessoa maravilhosa digna de muitas bênçãos Aos meus amigos do LBMP por tornaram deste ambiente de trabalho muito alegre e sadio Aos amigos do Departamento de Tecnologia e Biologia por todo auxilio e carinho Muito Obrigado Aos funcionários da Pós Graduação por toda compreensão e auxilio Ao meu primo Murilo Por ser esta pessoa boa e este grande amigo po ser meu exemplo de bondade amor carinho e dedicação as pessoas Te amo As minhas amigas Franciele Isabelli e Marcia por sempre torcerem por mim e para realização deste sonho Vocês minhas amigas sabem mais do que ninguém o quanto esta caminhada foi árdua e o quanto cresci profissionalmente Muito Obrigado Ao querido Padre Edson por sempre tocar meu coração com suas palavras de fé Que o senhor continue sendo este homem iluminado e cheio de Deus que suas palavras continuem encontrando morada no coração de todos por muito tempo Obrigado por ser uma das forças que me movimentou até o fim desta etapa A Dona Célia pelas orações e torcida Muito Obrigado A amiga Adriana por sempre orar por mime por minha família por toda a torcida Obrigado que Deus te conceda sempre mais Aos amigos Diversino e Rose por sempre orarem por mim Obrigado por serem este exemplo de generosidade humildade e fé Pois quem em Deus se consagrou será para sempre discípulo e anunciador de sua palavra Aos meus amigos de Franca por todos os momentos de alegria felicidade e carinho nestes dez anos de convivência A Drª Fernanda e ao Dr Paulo por valorizarem sempre meu trabalho e pela grande importância que deram para este momento Ao Sr Asley Luiz Roberto Dona Ofélia e Bernadade por sempre me motivarem a seguir em frente saibam vocês foram parte importante para realização deste sonho Gostaria de agradecer a todos que participaram de maneira direta ou indireta em minha jornada saibam que vocês foram muito importantes que Deus continue honrando e abençoando todos vocês Muito Obrigado A melhor parte da vida de uma pessoa está nas suas amizades Abraham Lincoln xii SUMÁRIO Páginas LISTA DE TABELAS xv LISTA DE FIGURAS xvi RESUMO 1 ABSTRACT 3 CAPÍTULO 1 Considerações Gerais 5 1INTRODUÇÃO 5 2REVISÂO DE LITERATURA 7 21 Quadrilátero Ferrífero 7 211 Sabará 8 212 Brumadinho 8 22 Comunidade microbiana do solo 9 23 Técnicas para exploração da riqueza de compostos microbianos 10 231 Análise do perfil metabólico Biolog Ecoplate 10 232 Isolamento de microrganismos 11 233 Metagenômica microbiana 11 24 Microrganismos na biorremediação de metais 14 241 Processos de Imobilização de íons Metálicos 15 2411Compostos metabólicos de ligação ao metal 16 242 Aplicação dos microrganismos em processos de biorremediação de metais 17 3REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19 CAPÍTULO 2 Biolog EcoPlate aplicado para avaliar o perfil metabólico da comunidade microbiana de ecossistemas do quadrilátero ferrífero MG25 RESUMO 25 ABSTRACT 26 1INTRODUÇÃO 27 2MATERIAL E MÉTODOS 28 21 Regiões de Estudo e Coleta das amostras de solo 29 22 Análise da atividade Metabólica Microbiana 31 23 Análise Estatística 33 3RESULTADO 34 4DISCUSSÃO 38 xiii 5CONCLUSÃO 40 6REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41 CAPÍTULO 3 Potencial de tolerância bioacumulação e biossorção de isolados bacterianos de solos de região de mineração de ferro 47 RESUMO 47 ABSTRACT 48 1INTRODUÇÃO 49 2MATERIAL E MÉTODOS 50 21 Região de estudo 50 22 Coleta de material 50 23 Isolamento e caracterização de culturas bacterianas 51 24 Análise do sequenciamento do gene 16S rRNA 52 25 Curva de Crescimento 53 26 Seleção de isolados e desafio de resistência a metais 53 27 Biorremoção e biossorção de metais 54 28 Análise estatística 55 3RESULTADOS 55 34 Isolamento e seleção de isolados resistentes a metais 55 35 Desafio de resistência a metais 56 36 Caracterização dos isolados por sequenciamento do gene 16S rDNA 57 37 Curva de crescimento bacteriano 58 38 Imobilização de Metais 60 381 Biossorção de metais 60 382 Acumulação de metais por células 62 4DISCUSSÃO 64 5CONCLUSÃO 66 6REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67 CAPÍTULO 4 Prospecção in silico de genes ortólogos envolvidos em processos de resistência e remoção de metais em metagenomas de ecossistemas da região de Sabará MG 73 RESUMO 73 ABSTRACT 74 1INTRODUÇÃO 75 2MATERIAL E MÉTODOS 76 xiv 21 Seleção de sequências 76 22 Prospecção 76 23 Análise estatística 77 3RESULTADOS 78 4DISCUSSÃO 86 5CONCLUSÃO 89 6REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90 CAPITULO 5 Considerações Finais 96 xv LISTA DE TABELAS Páginas CAPÍTULO 2 Biolog EcoPlate aplicado para avaliar o perfil metabólico da comunidade microbiana de ecossistemas do quadrilátero ferrífero MG25 Tabela 1 Coordenadas dos pontos de coletas das amostras de Sabará e Brumadinho realizadas pelo aparelho GPS da marCP Garmin modelo 62sc sendo os pontos apresentam as seguintes coordenadas em UTM 31 Tabela 2 Fontes de carbono das microplacas Biolog Ecoplate 32 Tabela 3 Fórmulas para cálculos dos índices de diversidade funcional Shannon E Ritches e Desenvolvimento de cor médio 33 Tabela 4 Valores médios dos índices de diversidade funcional Shannon E e riqueza de substratos R dos quatro ecossistemas após 140 horas de incubação Tuckey 005 35 CAPÍTULO 3 Potencial de tolerância bioacumulação e biossorção de isolados bacterianos de solos de região de mineração de ferro 47 Tabela 1 Desafio de resistência para cobre cromo e níquel em concentrações variáveis de 100 a 500 mgL1 para 13 isolados dos diferentes ecosssitemas Mata Floresta MF Cerrado CE Capim CP Mata Eucalipto ME e Canga CG 57 CAPÍTULO 4 Prospecção in silico de genes ortólogos envolvidos em processos de resistência e remoção de metais em metagenomas de ecossistemas da região de Sabará MG 73 Tabela 1 Número de ORFs encontradas no banco Metagenômico MVDB do Laboratório de Bioquímica e Microrganismos de Planta para os genes de resistência a metais níquel oxidase nixA multicooper oxidase ATPase copA cromato oxidase chrA cooper oxidase cueO multicooper oxidase ATPase like copB 79 xvi LISTA DE FIGURAS Páginas CAPÍTULO 1 Considerações Gerais 5 Figura 1 Mapa de Minas Gerais com a delimitação do Quadrilátero Ferrífero ALEX et al 2012 7 Figura 2 Métodos em Bioinformática para estudos metagenômicos de diversidade microbiana e funcional através de sequenciamento de nova geração MORGAN HUTTENHOWER 2012 13 Figura 3 Imobilização de metais por microrganismos dependente de metabolismo por transporte através da membrana e precipitação e não dependente permeabilidade iônica precipitação e adsorção de superfície ONLINE 2014 16 CAPÍTULO 2 Biolog EcoPlate aplicado para avaliar o perfil metabólico da comunidade microbiana de ecossistemas do quadrilátero ferrífero MG25 Figura 1 Fluxograma metodológico 29 Figura 2 Absorção de tetrazólio ao longo do tempo com base no índice de desenvolvimento médio de cor AWDC para as duas áreas coletadas 34 Figura 3 HeatMap com os valores normalizados de absorbância agrupados para degradação de fontes de carbono das placas BiologEcoplate para os ecossistemas Capim CP Canga CG Cerrado CE e Floresta MF de Sabará e Brumadinho 36 Figura 4 Médiana da utilização de substratos dos ecossistemas da região de Sabará e Brumadinho 37 Figura 5 Análise dos componentes principais PCA da mediana dos valores de absorbância dos diferentes tempos de quatro ecossistemas em duas coletas sendo MF1 Mata Floresta CP1 Capim CE1 Cerrado e CG1 Canga solos do Centro de Biodiversidade CEBIO Sabará e MF2 Mata Floresta CP2 Capim CE2 Cerrado e CG2 Canga solos da Centro de Preservação do Miguelão Brumadinho MG 38 CAPÍTULO 3 Potencial de tolerância bioacumulação e biossorção de isolados bacterianos de solos de região de mineração de ferro 47 Figura 1 Imagem das coordenadas geográficas dos locais amostrados recuperada com Google Earth Estas áreas de coletas estão localizadas em SabaráMG no Centro de Biodiversidade da Vale 51 Figura 2 Diagrama de Venn screening de isolados resistentes a metais nas concentrações de 50 mg L1 de Cobre Cromo e Níquel 56 xvii Figura 3 Curva de crescimento dos microrganismos A MF10 B CE05 C CP15 D CP16 E CE11 e F ME02 leituras em DO600nm em meios PGE e meios PGE suplementado com 500 mg L1Cobre Cu2 Cromo Cr6 e Níquel Ni2 as figuras foram geradas pelo programa Sigmaplot 59 Figura 4 Porcentagem de biossorção de Cu2 em sobrenadante dos cultivos dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 60 Figura 5 Porcentagem de biossorção de Ni2 em sobrenadante dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 61 Figura 6 Porcentagem de biossorção de Cr6 em sobrenadante dos cultivos dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 analisados nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 62 Figura 7 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meios suplementado com 500 mg L1 de Ni2f para os isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192 com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 63 Figura 8 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meio suplementado com 500 mg L1de Cu2 dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 63 Figura 9 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meios suplementado com 500 mg L1 de Cr6 dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 64 CAPÍTULO 4 Prospecção in silico de genes ortólogos envolvidos em processos de resistência e remoção de metais em metagenomas de ecossistemas da região de Sabará MG 73 Figura 1 Genes envolvidos cem processos metabólicos e de resistência a metal 76 Figura 2 Fluxograma metodológico 77 Figura 3 Porcentagem de ORFs do total de ORFs anotados para genes de resistência e de metabolismo de metal do banco Meteganômico MVDB LBMP 78 Figura 4 Distribuição de ORFs para os genes copA copB cueO chrA chrC cusA cusB e nixA para o total de ORFs nos cinco ecossistemas Cerrado CE Capim CP Canga CG Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF Os dados foram visualizados através do software Circos o comprimento das barras tal como no anel exterior foi representa na porcentagem de genes em cada ecossistema 80 xviii Figura 5 Análise de componentes principais de cinco ecossistemas 81 Figura 6 Distribuição de filo bacteriano para os genes copA copB cueO chrA chrC cusA cusB e nixA para os contigs dos cinco ecossistemas Cerrado CE Capim CP Canga CG Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF Os dados foram visualizados através do software Circos o comprimento das barras tal como no anel exterior foi representa na porcentagem de genes em cada ecossistema 82 Figura 7 Alinhamento múltiplos pelo software ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene copA para resistência de cobre com ORFs do banco Metagenômico MVDB do LBMP dos cinco ecossistemas mata floresta mata eucalipto cerrado capim e canga sendo que as colunas em negrito demonstram as regiões conservadas de acordo com o banco PFAM a seta indica o sítio de ligação ao cobre Acidobacterium capsulatum ACO33430 Acetobacter pasteurianus BAI12244 Xanthomonas citri ADR70747 Enterobacter cloacae KGB08036 e Pseudomonas sp ABR10510 83 Figura 8 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW com sequências do banco NCBI para o gene copA para multi cooper oxidase ATPse e com sequências de metagenoma dos cinco ecossistema Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as coluna colorias demonstram as regiões conservadas de acordo com o banco de PFAM Arthrobacter arilaitensis CBT74889 Pseudomonas alcaligenes GAD63322 Nitrosomonas europaea CAD84930 Acinetobacter radioresistens GAB76331 Streptococcus agalactiae CFV18308 Bacillus amyloliquefaciens AHZ17356 Paenibacillus mucilaginosus AEI44753 e Bacillus licheniformis AGN37932 84 Figura 9 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene chrA cromato oxidase com sequencias de metagenoma dos cinco ecossistemas Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as colunas coloridas demonstram as regiões conservadas de acordo com sequências do banco de dados PFAM a seta indica o sitio de ligação ao cromo Enterobacter cloacae KGB07959 Pseudomonas fluorescens AEV63938 Stenotrophomonas maltophilia CCH12056 Paenibacillus mucilaginosus AEI41168 Pseudomonas sp CBL87892 e Bradyrhizobium sp EGP06243 85 Figura 10 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene chrA cromato oxidase com sequencias de metagenoma dos cinco ecossistemas Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as colunas coloridas demonstram as regiões conservadas de acordo com sequências do banco de dados PFAM a seta indica o sitio de ligação ao cromo Enterobacter cloacae KGB07959 Pseudomonas fluorescens AEV63938 Stenotrophomonas maltophilia CCH12056 Paenibacillus xix mucilaginosus AEI41168 Pseudomonas sp CBL87892 e Bradyrhizobium sp EGP06243 85 1 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE METAGENOMAS E ISOLADOS BACTERIANOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS DE ÁREAS DE MINERAÇÃO RESUMO Os impactos ambientais causados por sucessivas extrações de minérios e compostos gerados dos resíduos tóxicos dessa atividade têm sido foco de preocupação dos ambientalistas neste contexto há um grande esforço gerado para o desenvolvimento de metodologias eficientes e de baixo custo para remoção de metais pesados de solos e águas contaminadas Os métodos biológicos surgem como uma alternativa aos métodos convencionais para o solo um dos ecossistemas terrestre que apresentam uma infinidade de recursos naturais além da grande diversidade de microrganismos interagindo entre si O mesmo constitui fonte de investimento para o isolamento de microrganismos e análises metagenômicas para prospecção de genes envolvidos em processos importantes para o equilíbrio metabólico e ecológico pois tanto de maneira isolada como em interações estes organismos desempenham papel importante no que diz respeito à produção de enzimas na biorremoção de metais e contaminantes do solo Este trabalho teve como objetivo isolar caracterizar e avaliar a biossorção e bioacumulação de metais por microrganismos originados de solos de ecossistemas de Sabará uma região de mineradora desativada Minas Gerais Adicionalmente buscouse avaliar a diversidade metabólica funcional para uma comparação da microbiota de Sabará e Brumadinho combinada com busca de genes que conferem resistência a cromo crhA cobre copA copB cueO e níquel nixA Os isolados obtidos foram classificados em gêneros como Burkolderia Serratia Bacillus Stenotrophomonas e Artrobacter que apresentam potencial para biorremediação de metais do solo e água Entretanto seis dos 32 isolados apresentaram resistência aos metais cobre cromo e níquel na concentração de 500 mgL1 Destes isolados dois deles do gênero Burkolderia e Arthrobacter CP15 e CR11 apresentaram capacidade metabólica de biossorver e interiorizar metais pesados em diferentes fases do desenvolvimento Quanto a atividade metabólica a comunidade microbiana dos solos do perímetro do quadrilátero ferrífero MG tem alta atividade na degradação de fontes de carbono importantes nos ciclos biogeoquímico e biorremediação justificando a grande quantidade de ORFs encontradas nas anotações do metagenoma sequenciado Destacase os ecossistemas canga e 2 floresta que apresentaram maior número de sequências identificadas para todos os genes envolvidos no processo de resistência influxo e efluxo de metais sendo eles genes de resistência a cobre multicooper oxidase ATPase copA copB cueO multicopper ATPase like copA copB cromo oxidase chrA cromo transporte chrB e níquel oxidase nixA Os solos da região de Sabará e Brumadinho alocados no quadrilátero ferrífero apresentam diversidade funcional para degradação de fontes de carbono como aminoácidos e compostos fenólicos e genes funcionais de grande importância em processos metabólicos de remoção de metais pesados por microrganismos além de microbiota com capacidade remover e interiorizar metais oriundos dos resíduos de mineração sendo um indicativo para a aplicação na biorremediação de metais em áreas afetadas pela mineração Palavras Chaves Biorremediação Biorremoção Genes de Resistência Cobre Cromo e Níquel 3 IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF METAGENOMAS AND ISOLATED BACTERIAL AIMED AT BIOREMEDIATION CONTAMINATION OF SOIL AREAS ABSTRACT The environmental impacts caused by successive extractions of minerals and compounds generated toxic waste of this activity have been the focus of concern for environmentalists in this context there is a great effort generated for the development of efficient methodologies and costeffective to remove heavy metals from soils and contaminated water Biological methods appear as an alternative to conventional methods for the ground of the earths ecosystems have a multitude of natural resources beyond the great diversity of microorganisms interacting The same is investment source for the isolation of microorganisms and metagenomic analyzes to search for genes involved in important processes for metabolic and ecological balance since both in isolation as in interactions these organisms play an important role as regards the production of enzymes in biorremoção metal and soil contaminants This study aimed to isolate characterize and evaluate the biosorption and bioaccumulation of metals by microorganisms originating from Sabara ecosystems soil a mining region of Minas Gerais disabled In addition we sought to evaluate the functional metabolic diversity for a comparison of the microbiota of Sabara and Brumadinho combined with search of genes that confer resistance to chromium CRHA copper copA CopB cueO and nickel Nixa The isolates were classified into genres such as Burkolderia Serratia Bacillus Stenotrophomonas and Artrobacter which have the potential for bioremediation of metals from soil and water However six of the 32 isolates were resistant to metals copper chromium and nickel at a concentration of 500 mg L1 Of these isolates two of them the genus Arthrobacter and Burkolderia CP15 and CR11 had metabolic capacity to internalize biossorver and heavy metals at different stages of development As metabolic activity the microbial community of the perimeter of iron quadrangle soils MG has high activity in the degradation of important carbon sources in biogeochemical cycles and bioremediation which explains the large amount of ORFs found in the notes of sequenced metagenome the yoke ecosystems and forest that had a greater number of sequences identified for all the genes involved in the resistance process is noteworthy influx and efflux of 4 metals and they copper resistance genes multicooper oxidase ATPase copA copB cueO multicopper ATPase like copA CopB chrome oxidase chrA chrome transport chrB and nickel oxidase nixA The soils of Sabara and Brumadinho region allocated to iron quadrangle have functional diversity for degradation carbon sources such as amino acids and phenolic compounds and functional genes of great importance for metabolic processes of removing heavy metals by microorganisms and microorganisms with ability to remove and internalize metals coming from the waste mining being an indication for use in the bioremediation of metals in areas affected by mining Keywords Bioremediation Biorremoção Resistance Genes Copper Chrome and Nickel 5 CAPÍTULO 1 Considerações Gerais 1 INTRODUÇÃO Nos últimos anos a presença de metais pesados que mesmo em quantidades vestigiais é tóxico e prejudicial para a flora e fauna tornouse um grande problema ambiental GADD 2000 Técnicas como precipitação oxidaçãoredução adsorção complexação e cimentação redução eletrolítica troca iônica e osmose reversa vem sendo utilizados para remoção de metais pesados de ambientes aquáticos e solos BAI et al 2014 sendo que no entanto existem processo naturais como biososorção por células mortas por bactérias onde sua utilização que vem sendo estudados como exemplo a utilização de plantas na biorremoção de metais uma vez que a mesma absorve os metais pela raiz ou em associação com microrganismos não transferindo os mesmos para cadeia alimentar MARGESIN PŁAZA KASENBACHER 2011 Além de plantas e dos processos convencionais os microorganismos relacionados a solubilidade de minerais biomineralização biorremediação corrosão microbiana LI et al 2014 é de peculiar interesse para a biorremediação de ambientes devido ao baixo custo de sua implementação despertando assim um grande interesse na indústria CHEN et al 2014 UCHIYAMA MIYAZAKI 2009 O solo é conhecido por apresentar uma comunidade microbiana extremamente diversificada que apresenta uma grande diversidade funcional de genes para a produção de enzimas envolvidas em diferentes processos importantes para ciclagem de nutrientes bem como aqueles envolvidos no metabolismo oxidativo biorremediação biomineração entre outros HUGENHOLTZ TYSON 2008 PANICKER GOPALAKRISHNAN 2014 As tecnologias de sequenciamento de nova geração possibilitam gerar inúmeras sequências em um curto período de tempo a preços acessíveis esta facilidade permite acessar a diversidade bacteriana e genes funcionais envolvidos em ciclos biogeoquímicos Neste contexto a metagenômica fornece informações para visualizar e entender as interações microbianas com o ambiente e assim entender as mudanças ambientais MYROLD ZEGLIN JANSSON 2014 6 Muitos gêneros bacterianos também encontrados no solo atuam nos processos de biomineração e biorremediação principalmente os acidófilos com potencial oxirredutor como Acidithiobacillus ferrooxidans Sulfobacillus sp e Acidithiobacillus caldus GADD 2000 Além destes alguns gêneros como Pseudomonas Burkolderia Bacillus e Rhizobium WANI AYOOLA 2015 apresentam potencial para biorremediação considerando que esses microrganismos apresentam metabolismo oxidativo de minerais atuando de maneira importante na biorremediação de cobre cromo níquel e zinco SILVER 1996 Os processos biológicos relacionados a ambientes têm sido bastante explorado uma vez que os mesmos exercem papel importante na manutenção dos ecossistemas Uma série de tecnologias e esforços ao longo do mundo todo tem sido aplicada para a descoberta da diversidade e acesso as informações funcionais a nível de genes MÉNDEZGARCÍA et al 2015 Estudos de diversidade funcional em áreas de extração de metal possibilitam identificar genes que conferem resistência a metais pesados e envolvidos no metabolismo de metal COSTA et al 2015 HUNTER et al 2014 PANICKER GOPALAKRISHNAN 2014 Considerando que os microrganismos apresentam um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos e na biodisponibilidade de metais tornamse de relevância os estudos para conhecer a diversidade taxonômica e funcional das comunidades microbianas em áreas com grandes concentrações de metais COSTA et al 2015 Sendo assim o objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar microrganismos de diferentes biomas do quadrilátero ferrífero em Minas Gerais uma das maiores regiões do mundo de mineração com intensa atividade de mineração desde o século 17 visando a seleção daqueles com possível potencial para biorremediação de Cobre bivalente Cu2 Cromo Hexavalente Cr6 e Níquel Ni2 bem como avaliar por meio de análise metabólica as características funcionais da comunidade procariótica e a prospecção de genes envolvidos no metabolismo de metal 7 2 REVISÂO DE LITERATURA 21 Quadrilátero Ferrífero O estado de Minas Gerais apresenta uma região denominada Quadrilátero Ferrifero a qual engloba municípios que se enquadram entre as maiores produtoras nacionais de minério de ferro São os municípios de Sabará Santa Bárbara Mariana Congonhas Ouro Preto João Monlevade Rio Piracicaba Itaúna Itabira Brumadinho entre outros Figura 1 ALEX et al 2012 Figura 1 Mapa de Minas Gerais com a delimitação do Quadrilátero Ferrífero ALEX et al 2012 As riquezas do Quadrilátero não só englobam minério de ferro mas outros minérios como manganês ouro entre outros Esta região é de extrema importância para história brasileira por ter sido o maior polo de extração de ouro no ciclo do ouro Esta região também engloba uma série de companhias e empresas de grande porte com a Vale SA entre outras A Vale é grande responsável pela extração de minério nesta região contribuindo para o crescimento econômico e estrutural desta Região Esta 8 apresentarem grande preocupação com a parte ambiental dos municípios alocados nesta região tendo dois parques denominados Centro de Biodiversidade CEBIOSabaráMG e Vale Estadual do Miguelão em Brumadinho MG Os centros de diversidade compartilham cinco ecossistemas de preservação e revitalizados Campo Rupestre Campo de Gramíneas Mata Floresta Cerrado e Mata Eucalipto MORAIS et al 2010 211 Sabará Sabará é um município do estado de Minas Gerais localizado na Região Metropolitana de Belo Horizonte Sabará apresenta uma paisagem repleta de montanhas rochosas com solos com características calcarias e grande concentração de ferro está sendo de grande importância para o crescimento econômico e industrial por conta da extração deste minério VARAJAO 1991 O município de Sabará está localizado na bacia do Rio das Velhas se estendendo pelo Rio Sabará e apresenta um clima tropical com períodos de chuva em outubro e abril com temperatura em torno de 21ºC na mínima e 27ºC em períodos de verão e 16ºC no inverno REZENDE AUGUSTO SALGADO 2011 A região de Sabará se apresenta revestida por uma floresta semidecidual típica de Mata Atlântica solo do tipo latossolo vermelho argiloso com vegetação características deste ecossistema além de campos rupestres com características quartizoliticas com preenchimento por vegetações rasteiras Solo de cerrado com características bastante semelhantes ao Campos Rupestre e um campo de gramíneas povoado por capim gordura caracterizam este municípios DE MORAES 2006 212 Brumadinho Brumadinho é um município localizado em Minas Gerais sendo a mineração uma das atividades econômicas de maior destaque nestas regiões Esta região possui grande riqueza ambiental e paisagísticas com vegetação composta por Florestas Estacionais Semideciduais Campos Altimontanos e Campos Rupestres SILVA 1998 Apresenta um clima com duas estações definidas 9 uma chuvosa e outra seca nordeste centrooeste e parte do Sudeste e acentuada variação térmica sul MAIA 2014 As florestas estacionais e semideciduais apresentam amplitude de 100 a 1800 metros distribuída de 300 a 1200 metros Esse ecossistema recobre os solos do espaço dos domínios dos Morros Florestados no sul e no sudeste com predomínio dos solos VermelhosAmarelados Podzólicos e Latossolos Encontramse distribuída sobre embasamento sudeste além da região centro sul do Paraná e Triangulo Mineiro MORAES et al 2010 Nas regiões montanhosas de Brumadinho se encontram os campos Rupestres campos com solos característicos pela formação de quartzo e arenito com cobertura de uma vegetação rústica que normalmente sobrevivem em solos de característica rochosa ou até mesmo desértica Ainda apresentam um ecossistema de cerrado com características próximas a canga quanto a composição do solo VARAJAO 1991 A região de Brumadinho abriga o cenário perfeito para a mineração além de lindas paisagens contando ainda com o Centro de Tecnologia de Ferrosos mantido pela Vale SA área onde antes era feito extrações de minério e hoje consiste em uma área de preservação que engloba grande parte desta diversidade de ecossistema Este Centro de Preservação engloba ecossistemas como Campo Rupestre Canga Mata Floresta Cerrado e Campo de Gramíneas ANTONIO ELIAS 2011 22 Comunidade microbiana do solo O solo é um dos reservatórios de carbono orgânico da Terra constituindose em um dos mais importantes habitats para microrganismos componentes essenciais da biota terrestre Os microorganismos exercem um importante papel na manutenção da vida na Terra atuando na ciclagem de nutrientes e minerais na produção de biomassa relações simbióticas no controle de populações ACID et al1995 A versatilidade deste reservatório natural de espécies deriva de um longo caminho evolutivo em que inúmeras adaptações e estratégias metabólicas foram desenvolvidas em diferentes condições de pressão seletiva GOMEZ FERRERAS TORESANI 2006 10 Os microorganismos catalisam reações metabólicas de extrema importância dos ciclos biogeoquímicos da biosfera produzindo componentes importantes para a manutenção da atmosfera além de representarem a maior diversidade genética e metabólica dentre as formas de vida existentes O solo é o habitat que contém a maior quantidade e diversidade de microorganismos um grama de solo contém mais de 10000 diferentes espécies TORSVIK et al 2002 Esta diversidade de microorganismos e suas atividades metabólicas têm sido muito exploradas pela biotecnologia como alternativa de melhoria do padrão de vida humana e na qualidade ambiental Nesta temática a busca por novos isolados e enriquecimentos microbianos com a finalidade de aplicação em abordagens enzimáticas para realização de diversos processos tem movimentado grandes esforços no meio acadêmico e industrial GADD 2010 23 Técnicas para exploração da riqueza de compostos microbianos 231 Análise do perfil metabólico Biolog Ecoplate A biodiversidade do solo tem despertado grande interesse para estudos devido a riqueza de microrganismos e a complexidade deste bioma na regulação e funcionamento de processos ecológicos Os microrganismos que habitam o solo são capazes de metabolizar moléculas orgânicas e assim liberar nutrientes inorgânicos utilizados pelas plantas devido a esta alta atividade microbiana para ciclagem de nutrientes Garland e Mills introduziram o uso comercial de microplacas Biolog como um sistema para avaliar a diversidade funcional destes microrganismos oriundos de amostras ambientais baseado na utilização de determinadas fontes de carbono C GARLAND MILLS1991 WEBER et al 2007 O método pode revelar diferenças consideráveis de utilizações de diferentes substratos pela comunidade microbiana segundo Stefanowicz 2006 a placa surge com um método eficiente para avaliar as interações microbianas e compostos gerados sendo uma ferramenta eficiente para avaliar a diversidade funcionala da comunidade microbiana de diferentes ecossistemas SCHUTTER e DICK 2001 Portanto o perfil fisiológico Biolog tem sido uma ferramenta muito 11 útil para refletir mudanças de atividade metabólica eou potencial de versatilidade funcional de comunidades microbianas expostas a diversos estresses inclusive pela concentração de metais pesados PIERCE WARD DOBBS 2014 SOUZA et al 2012 232 Isolamento de microrganismos Historicamente microrganismos cultiváveis dos solos tem sido uma fonte inesgotável para a prospecção e produção de compostos naturais com atividade biológica para a vida terrestre Desde 1900 aproximadamente produtos oriundos do metabolismo secundário destes microrganismos têm sido aplicados nos setores industriais WHITE SAYER GADD 1997 Estes compostos têm sido aplicados para produção de medicamentos inseticidas promotores de crescimento polímeros e enzimas de aplicação biotecnológica ISLAM et al 2004 O isolamento e obtenção de culturas puras permitem estudar os microrganismos de amostras ambientais de maneira individual e assim caracterizálos principalmente por critérios nutricionais SCHLOTER DILLY MUNCH 2003 Esta técnica tradicional permite acessar uma parte da diversidade existente no solo e também a busca de linhagens produtoras de diversas substâncias e assim aplicar estes microrganismos bem como aplicar biotecnologicamente seus compostos UCHIYAMA MIYAZAKI 2009 233 Metagenômica microbiana Os microrganismos cultiváveis tem sido uma fonte inesgotável para a produção de compostos enzimas importantes na aplicação biotecnológica atendendo uma série de setores como energético têxtil farmacêutico agropecuário e também sendo aplicados em processos alternativos para recuperação de ambientes através da biorremediação AURÉLIO PINHO FILHO 2010 Estes compostos de extrema importância para o setor industrial têm sido acessado por técnicas tradicionais como isolamento e cultivo de microrganismos de amostras ambientais COSTA et al 2015 12 A maioria das enzimas utilizadas no setor industrial tem sido descoberta por meio de métodos tradicionais por microrganismos isolados busca em bibliotecas metagenômicas entretanto estes processos apresentam algumas limitações por conta da biotransformação e efeitos biocatalíticos os quais ainda permanecem impraticáveis em função de deficiências associadas às enzimas tais como baixa taxa de expressão ou localização intracelular UCHIYAMA MIYAZAKI 2009 Além da problemática descrita acima há um aumento na redescoberta de compostos enquanto há muito ainda a se explorar uma vez que os ecossistemas apresentam uma grande diversidade de microrganismos que técnicas tradicionais não permitem acessar Neste contexto a metagenômica surge para acessar o desconhecido e toda a informação não cultivável tradicionalmente sendo assim uma ferramenta que permite acessar toda a informação presente no ambiente através do DNA de amostras mistas permitindo aprofundar estudos a nível gênico com finalidade de se encontrar genes que codificam enzimas importantes para a aplicação biotecnológica MYROLD ZEGLIN JANSSON 2014 Atualmente com o surgimento de tecnologias de sequenciamento de nova geração é possível acessar toda esta diversidade de uma maneira mais ampla em um curto período de tempo e com custos mais acessíveis portanto este avanço tecnológico aumenta ainda mais a facilidade de acessar a diversidade de microrganismos e genes funcionais Figura 2 para uma possível aplicação biotecnológica e biorremediação além de permitir o entendimento do metabolismo da comunidade microbiana HUNTER et al 2014 13 Figura 2 Métodos em Bioinformática para estudos metagenômicos de diversidade microbiana e funcional através de sequenciamento de nova geração MORGAN HUTTENHOWER 2012 14 24 Microrganismos na biorremediação de metais Os mecanismos de remoção acumulação e transformação de metais são processos de bastante importância para manutenção da vida terrestre por serem componentes fundamentais para os ciclos biogeoquímicos GAAD 2000 Processos alternativos para remoção de metais por microrganismos são dependentes da capacidade de efetuar eou mediar a mobilização de metais Os processos de mobilização de metais bem como remoção de metais podem ser obtidos por exemplo por protonação quelação e transformação química enquanto imobilização pode ocorrer por precipitação ou a cristalização de compostos orgânicos ou inorgânicos insolúveis ou por adsorção absorção e sequestro intracelular DAS VIMALA KARTHIKA 2008 Uma série de interações metal microrganismos foram estudadas bem como o meio para que os processos como remoção recuperação ou desintoxicação de metal inorgânico e orgânico ou poluentes radionuclídeos possam ocorrer Figura 1 LOVLEY COATES 1997 FRANCIS 1998 STEPHEN MACNAUGHTON 1999 e ECCLES 1999 No contexto de reduzir reutilizar e remover metais matrizes como solo sedimentos lixeiras e resíduos industriais podem ser fontes com bastante potencial para aplicação em processos de revitalização de áreas visto que estes microecossitemas apresentam uma diversidade de microrganismos com maquinaria metabólica necessária que permite que os metais sejam transformados in situ em formas insolúveis e inertes quimicamente e que também são aplicáveis para a remoção de metais a partir de uma solução aquosa DAS VIMALA KARTHIKA 2008b Entretanto estes processos de transformação ou remoção de metais são intrínsecos embora menos apropriados para meios tradicionais de tratamento de águas e esgotos As técnicas moleculares e de análise genética permitem uma maior compreensão do metabolismo microbiano de metais incluindo aqueles aspectos que são de relevância ambiental e biotecnológico NIES 1999 CHEN et al 1999 15 241 Processos de Imobilização de íons Metálicos Inúmeros processos são envolvidos na imobilização de metais estes processos visam a redução de íons metálicos livres no meio externo podendo promover a solubilização e deslocamento Figura 3 de maneira equilibrada para que não ocorra liberação de mais metal na solução TSEZOS 2001 Processos de remoção por biossorção pode ser definido como adsorção de ions metálicos nas formas orgânicas e inorgânicas solúveis ou insolúveis em processos físicoquimicos Em células na sua forma viva os processos de adsorção recebem influencia direta dos metabolismos bem como outros fatores como pH nutrientes orgânicos inorgânicos e metabolitos Processo de remoção de metais podem ser locais ou seja pelo contato e envolvendo processos metabólicos Remoção de metais por biossorção podem ser locais ou até mesmo de modificação de íons metálicos uma vez que alguns microrganismos tem capacidade de remover por adsorção na superfície espécies catiônicas tem capacidade de acumular metais no interior das células vivas visto que apresentam mecanismos genotipicos e fenoticos como por exemplo proteínas de membrana que fazem esse transporte por afinidade e especificidade Uma vez que esse metal se encontra no interior da célula ele pode se metabolizado e atuar como cofator enzimático para metabolismo celular GADD 1996 BRANCO 1997 WHITE et al 1997 GADD SAYER 2000 Os microrganismos apresentam características importantes como Peptidioglicano grupos carboxílico que são os locais principal para a ligação de íons na parede celular de bactérias Grampositivas e os grupos de fosfato que contribuem significativamente em espécies Gramnegativas BEVERIDGE DOYLE 1989 E MCLEAN ET AI 2002 Dentre os processos de remoção de metais destacase atualmente a biomassa de células mortas que tem cargas que permitem a ligação de metal sem gasto de energia processo que apresentam grande vantagem visto sua maior resistência mecânica fácil separação dos biossorventes do sobrenadante MACASKIE DEAN 1989 BRIERLEY 1990 MACASKIE 1991 TOBIN et ai 1994 A biomassa viva também tem sido amplamente utilizada sob a forma de biofilmes bacterianos e de forma isolada em uma variedade de aplicações como contatores biológicos 16 rotativos reatores de leito fixo gotejamento filtros leito fluidizado e biorreatores GADD 2001 MACASKIE DEAN 1989 GADD E BRANCO 1993 SCHIEWER VOLESKY 2000 Figura 3 Imobilização de metais por microrganismos dependente de metabolismo por transporte através da membrana e precipitação e não dependente permeabilidade iônica precipitação e adsorção de superfície ONLINE 2014 2411 Compostos metabólicos de ligação ao metal Os microrganismos excretam uma série de compostos metabólicos que são sítios de ligação específicos e inespecíficos para íons metálicos Os sítios não específicos são ácidos orgânicos e álcoois para a ligação de macromoléculas como polissacarídeos ácidos húmicos BIRCH BACHOFEN 1990 FAIA CHEUNG 1995 BRIDGE et al 1999 SAYER GADD 2001 Entretanto alguns microrganismos tem a capacidade de liberar compostos extracelulares como Exopolisscarideos EPS que apresentam carga positiva que permite a ligação com metais pesados CHEUNG 1995 Além de compostos metabólicos em geral alguns organismos vivos apresentam 17 metaloproteinas que normalmente são proteínas de membrana que permite a difusão dos metais através da membrana da célula ou até mesmo a ligação por afinidade VALLS et al 1998 PAZIRANDEH et al 1998 242 Aplicação dos microrganismos em processos de biorremediação de metais Microrganismos no processo de biomineração já é uma realidade podendo citar como exemplo o emprego de Acidithiobacillus ferrooxidans Sulfobacillus sp e Acidithiobacillus caldus WHITE SAYER GADD 1997 O uso da biomineração microbiana é bastante difundido em processos de extração de cobre em mineradoras na China Peru Arizona Austrália e Chile BRIERLEY BRIERLY CONSULTANCY 2008 Dentre outras áreas de interesse os produtos do metabolismo microbiano podem permitir a otimização de processos na extração de produtos de origem mineral abrindo uma grande perspectiva para a exploração comercial de novos potenciais A atividade microbiana explorada resulta tanto de mecanismos diretos enzimático quanto por mecanismos químicos e acarreta na melhor disponibilização dos minerais por dois processos a bioxidação e a biolixiviação podendo levar tanto à liberação de compostos conjugados quanto à precipitação de minerais originalmente em solução SCHMIDELL 2011 A atuação sobre a solubilidade de minerais é de peculiar interesse para a biorremediação de ambientes hídricos sobretudo pelo alto custo do processo de descontaminação tradicional em situações em que o poluente se encontra altamente diluído Essa característica também desperta o interesse na própria indústria hidrometalúrgica em virtude das possibilidades de aumento no rendimento da atividade mineradora O processo conhecido como bioadsorção de metais é a mais promissora tecnologia envolvida na remoção de compostos tóxicos de ambientes hídricos gerados pela indústria Recentemente o foco das pesquisas é a exploração da técnica na própria indústria podendo expandir a recuperação de metais de base 18 e preciosos disponíveis em baixas concentrações WASE FORSTER 1997 BAILEY et al 1999 KUMAR et al 2006 A bioadsorção engloba processos de difusão quelação adsorção complexação e microprecipitações de metais sob condições fisicoquímicas específicas VEGLIO BEOLCHINI 1997 Pseudomonas é um gênero bacteriano de interesse para a aplicação na biomineração sobretudo pela habilidade desses microrganismos de se ligarem a íons metálicos por uma ligação dependente do tipo de ligante do sítio de ligação e da forma química do metal KUMARAN SUNDARAMANICKAM BRAGADEESWARAN 2011 além do gênero Pseudomonas gêneros como Burkolderia Bacillus e Rizobium também apresentam capacidade de bioadsorção de metais como Fe Cu Cr entre outros estes gêneros adsorvem metais através de estratégias do metabolismo sem formar compostos tóxicos ao meio KUMAR et al 2013 19 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACCESS O Biodegradation v 5 n 3 p 810 2014 ACID B et al Microbial Community Analysis Microbial Community Analysis p 12 sd ALEX M et al O quadrilátero ferrífero e o norte de minas gerais análise da história e importância econômica p 116 2012 ALTIMIRA F et al Characterization of copperresistant bacteria and bacterial communities from copperpolluted agricultural soils of central Chile BMC microbiology v 12 p 193 jan 2012 AMBIENTAL T et al USO DE MICROORGANISMOS PARA A BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES IMPACTADOS n 6 p 9951006 2012 ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biolixiviação Utilização de Micro organismos na Extração de Metais sl sn ARORA P K SRIVASTAVA A SINGH V P Novel degradation pathway of 4 chloro2aminophenol via 4chlorocatechol in Burkholderia sp RKJ 800 Environmental science and pollution research international v 21 n 3 p 2298304 fev 2014 AURÉLIO M PINHO C DE FILHO P Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado p 28 2010 BAI J et al Biosorption mechanisms involved in immobilization of soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multimetalcontaminated soil Journal of environmental sciences China v 26 n 10 p 205664 1 out 2014 BALDRIAN P et al Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition The ISME journal v 6 n 2 p 24858 fev 2012 BICKEL S TANG K GROSSART H Structure and function of zooplankton associated bacterial communities in a temperate estuary change more with time than with zooplankton species Aquatic Microbial Ecology v 72 n 1 p 115 7 mar 2014 BRANDER S MIKKELSEN J D KEPP K P TtMCO A highly thermostable laccaselike multicopper oxidase from the thermophilic Thermobaculum terrenum Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic v 112 p 5965 2015 20 CAMPBELL C D GRAYSTON S J HIRST D J Methods Use of rhizosphere carbon sources in sole carbon source tests to discriminate soil microbial communities v 30 p 3341 1997 CHÁVEZ L F ESCOBAR L F ANGHINONI I Diversidade metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de integração lavoura pecuária sob intensidades de pastejo n 1 p 12541261 2011 CHAZARENC F BRISSON J MERLIN G Seasonal and Spatial Changes of Microorganism Communities in Constructed Wetlands A Community Level Physiological Profiling Analysis International Journal of Chemical Engineering v 2010 p 16 2010 CHEN S et al Influence of coexisted benzoapyrene and copper on the cellular characteristics of Stenotrophomonas maltophilia during biodegradation and transformation Bioresource Technology v 158 p 181187 2014 CHIEN C et al Microbial diversity of soil bacteria in agricultural field contaminated with heavy metals Journal of Environmental Sciences v 20 n 3 p 359363 jan 2008 COSTA P S et al Metagenome of a microbial community inhabiting a metal rich tropical stream sediment PloS one v 10 n 3 p e0119465 jan 2015 DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview v 7 n April p 159169 2008a DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview Indian Journal of Biotechnology v 7 n 2 p 159169 2008b DAS P MUKHERJEE S SEN R Improved bioavailability and biodegradation of a model polyaromatic hydrocarbon by a biosurfactant producing bacterium of marine origin Chemosphere v 72 n 9 p 122934 jul 2008 DE N Ufop cetec uemg 2006 FERNÁNDEZMONTIEL I et al Shortterm effects of simulated belowground carbon dioxide leakage on a soil microbial community International Journal of Greenhouse Gas Control v 36 p 5159 2015 FINN R D et al Pfam The protein families database Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 222230 2014 FOMINA M GADD G M Biosorption current perspectives on concept definition and application Bioresource technology v 160 p 314 maio 2014 GADD G M Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization Current Opinion in Biotechnology v 11 n 3 p 271279 2000 21 GOMEZ E FERRERAS L TORESANI S Soil bacterial functional diversity as influenced by organic amendment application Bioresource technology v 97 n 13 p 14849 set 2006 GRYTA A FRĄC M OSZUST K The Application of the Biolog EcoPlate Approach in Ecotoxicological Evaluation of Dairy Sewage Sludge Applied Biochemistry and Biotechnology v 174 n 4 p 14341443 2014 HAKULINEN N ROUVINEN J Threedimensional structures of laccases Cellular and Molecular Life Sciences v 72 n 5 p 857868 2015 HAMMER Ø HARPER D A T RYAN P D Paleontological statistics software package for education and data analysis Palaeontologia Electronica v 4 n 1 p 918 2001 HUGENHOLTZ P TYSON G W Metagenomics Nature v 455 n August 2006 p 481483 2008 HUNTER S et al EBI metagenomics A new resource for the analysis and archiving of metagenomic data Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 600 606 2014 INÁCIO L ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biorremediação de Água Subterrânea Contaminada com Gasolina e Análise Molecular da Comunidade Bacteriana Presente sl sn ISLAM F S et al Role of metalreducing bacteria in arsenic release from Bengal delta sediments Nature v 430 n 6995 p 6871 1 jul 2004 KANG CH et al Bioremediation of lead by ureolytic bacteria isolated from soil at abandoned metal mines in South Korea Ecological Engineering v 74 p 402407 jan 2015 KLAUSJOERGER T et al Bacteria as workers in the living factory Metal accumulating bacteria and their potential for materials science Trends in Biotechnology v 19 n 1 p 1520 2001 KUMAR R et al Growth media composition and heavy metal tolerance behaviour of bacteria characterized from the subsurface soil of uranium rich ore bearing site of Domiasiat in Meghalaya v 12 n January p 115119 2013 KUMARAN N S R I SUNDARAMANICKAM A BRAGADEESWARAN S ABSORPTION STUDIES ON HEAVY METALS BY ISOLATED BACTERIAL STRAIN PSEUDOMONAS Sp FROM UPPANAR ESTUARINE WATER SOUTHEAST COAST OF INDIA v 6 n 4 p 471476 2011 LASHEEN M R AMMAR N S IBRAHIM H S Adsorptiondesorption of CdII CuII and PbII using chemically modified orange peel Equilibrium and kinetic studies Solid State Sciences v 14 n 2 p 202210 2012 22 LI LG et al Potentially novel copper resistance genes in copperenriched activated sludge revealed by metagenomic analysis Applied microbiology and biotechnology v 98 n 24 p 1025566 dez 2014 LIU X et al TiGER a database for tissuespecific gene expression and regulation BMC bioinformatics v 9 p 271 2008 LIU X et al Human health risk assessment of heavy metals in soilvegetable system A multimedium analysis Science of the Total Environment v 463 464 p 530540 2013 MAHRAJBNE C MAHRAGBNE C RESISTANCE OF E N V I R O N M E N T A l BACTERIA TO H E A V Y METALS v 64 p 715 1998 MAIA V O FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS BANCO DE SEMENTES DO SOLO EM ÁREAS DE MINERAÇÃO E 2014 MARGESIN R PŁAZA G A KASENBACHER S Characterization of bacterial communities at heavymetalcontaminated sites Chemosphere v 82 n 11 p 15831588 2011 MARMUR J A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro organisms Journal of Molecular Biology v 3 n 2 p 208IN1 1961 MÉNDEZGARCÍA C et al Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats Frontiers in Microbiology v 6 n May p 117 2015 MORETTI G et al Microbial community distribution and genetic analysis in a sludge active treatment for a complex industrial wastewater a study using microbiological and molecular analysis and principal component analysis Annals of Microbiology 2015 MORGAN X C HUTTENHOWER C Chapter 12 Human Microbiome Analysis v 8 n 12 2012 MYROLD D D ZEGLIN L H JANSSON J K The Potential of Metagenomic Approaches for Understanding Soil Microbial Processes Soil Science Society of America Journal v 78 n 1 p 3 2014 NGUYEN V H SHIM JJ Threedimensional nickel foamgrapheneNiCo2O4 as highperformance electrodes for supercapacitors Journal of Power Sources v 273 p 110117 2015 ONLINE V A Environmental Science Processes Impacts bioremediation based abolition of heavy metals p 180193 2014 PANICKER V P GOPALAKRISHNAN A Mini Review Article Metagenomics a Novel Tool to Unravel the Secrets of Nature v 2 n 6 p 312315 2014 23 PERSPECTIVES C MICROBIOLOGY A Vigna mungo v 1 n 2 p 110 2012 PIERCE M L WARD J E DOBBS F C False positives in Biolog EcoPlatesTM and MT2 MicroPlatesTM caused by calcium Journal of microbiological methods v 97 p 204 fev 2014 POWELL S et al eggNOG v40 nested orthology inference across 3686 organisms Nucleic Acids Research v 42 n D1 p D231D239 2014 RELACIONADOS A et al O QUADRILÁTERO FERRÍFERO MG BRASIL ASPECTOS SOBRE SUA HISTÓRIA SEUS RECURSOS MINERAIS E PROBLEMAS v 18 n 1 p 3337 2010 REZENDE É A AUGUSTO A SALGADO R MAPEAMENTO DE UNIDADES DE RELEVO NA MÉDIA SERRA DO ESPINHAÇO MERIDIONAL MG p 45 60 2011 SCHLOTER M DILLY O MUNCH J Indicators for evaluating soil quality Agriculture Ecosystems Environment v 98 n 13 p 255262 set 2003 SILVER S Bacterial resistances to toxic metal ions A review Gene v 179 n 1 p 919 1996 STUDIES I AUTHOR C HEAVY METAL TOLERANCE OF THREE DIFFERENT BACTERIA ISOLATED FROM v 2 n 2 p 137147 2013 SZYMAŃSKA S PIERNIK A HRYNKIEWICZ K Metabolic potential of microorganisms associated with the halophyte Aster tripolium L in saline soils Ecological Questions v 18 n 1 p 919 1 jan 2013 TARTAGLIA M et al Gainoffunction SOS1 mutations cause a distinctive form of Noonan syndrome Nature genetics v 39 n 1 p 7579 2007 THIJS S et al Potential for plant growth promotion by a consortium of stress tolerant 24dinitrotoluenedegrading bacteria isolation and characterization of a military soil Microbial biotechnology v 7 n 4 p 294306 2014 TSEZOS M Biosorption of metals The experience accumulated and the outlook for technology development Hydrometallurgy v 59 n 23 p 241243 fev 2001 UCHIYAMA T MIYAZAKI K Functional metagenomics for enzyme discovery challenges to efficient screening Current Opinion in Biotechnology v 20 n 6 p 616622 2009 URAKAWA H et al Shifts of Bacterioplankton Metabolic Profiles along the Salinity Gradient in a Subtropical Estuary ISRN Oceanography v 2013 p 1 12 2013 24 VARAJAO S A R A C A QUESTÃO DA CORRELAÇÃO DAS SUPERFÍCIES DE EROSÃO DO QUADRILÁTERO FERRÍFERO MINAS GERAIS v 21 n 2 p 138145 1991 VELACANO M CASTELLANOHINOJOSA A VIVAS A F Effect of Heavy Metals on the Growth of Bacteria Isolated from Sewage Sludge Compost Tea n August p 644655 2014 WANI P A AYOOLA O H Bioreduction of Cr VI by Heavy Metal Resistant Pseudomonas Species n Vi p 19 2015 WEBER K P et al Data transformations in the analysis of communitylevel substrate utilization data from microplates Journal of microbiological methods v 69 n 3 p 4619 jun 2007 WEISBURG W G et al 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol v 173 p 697703 1991 WHITE C SAYER J A GADD G M Microbial solubilization and immobilization of toxic metals key biogeochemical processes for treatment of contamination FEMS microbiology reviews v 20 n 34 p 50316 jul 1997 XIA X et al On the role of surface diffusion in determining the shape or morphology of noblemetal nanocrystals Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 110 n 17 p 6669 73 2013 ZOU R et al Threedimensional networked NiCo 2 O 4 MnO 2 branched nanowire heterostructure arrays on nickel foam with enhanced supercapacitor performance J Mater Chem A v 3 n 4 p 17171723 2015 KUMAR R et al Growth media composition and heavy metal tolerance behaviour of bacteria characterized from the subsurface soil of uranium rich ore bearing site of Domiasiat in Meghalaya v 12 n January p 115119 2013 25 CAPÍTULO 2 Biolog EcoPlate aplicado para avaliar o perfil metabólico da comunidade microbiana de ecossistemas do quadrilátero ferrífero MG RESUMO Muito tem se investido na utilização de microrganismos para aplicação biotecnológica bem como na manutenção de ambientes e até mesmo na redução de compostos tóxicos liberados neste contexto os métodos biológicos surgem como uma alternativa aos métodos convencionais sendo possível aproveitar a diversidade funcional da comunidade microbiana portanto as Biolog Ecoplate permitem analisar a atividade metabólica diversidade funcional em amostras de ecossistemas ambientais que reflete o estado da sua atividade Esta é considerada uma tecnologia moderna complementar e promissora que através de propriedades biológicas permite a caracterização rápida do estado ecológico das amostras ambientais tais como solos ou água e avaliar assim o potencial de sua aplicação dos microrganismos no processo de biorremediação Entanto recorreuse microplacas Biolog EcoPlate para caracterizar e comparar a diversidade funcional da comunidade microbiana de quatro ecossistemas campo rupestre capim mata floresta e cerrado de dois municípios localizados no perímetro do quadrilátero ferrífero Amostras de solo destes ecossistemas forma coletado após a diluição seriada foram inoculadas nas Biolog EcoPlate seguido pela leitura de absorbância posteriormente os dados forma normalizados submetidos as análises A microbiota dos ecossistemas se Sabará e Brumadinho apresentaram diferenças quanto a degradação de substratos e a diversidade funcional sendo que os ecossistemas afetados por ação do homem apresentaram maior degradação de compostos de carbono da placa e alta diversidade microbiana Os solos da região das regiões do quadrilátero apresentaram microbiota com atividade metabólica características para ecossistemas preservados e afetados Portanto as Biolog EcoPlate surgem como uma alternativa promissora para avaliar a saúde de ecossistemas baseado na atividade metabólica microbiana Palavras chave EcoPlate comunidade microbiana diversidade metabólica atividade microbiana perfil metabólico 26 CHAPTER 2 Biolog Ecoplate applied to evaluate the metabolic profile of the microbial community of iron quadrangle of ecosystems MG ABSTRACT Much has been invested in the use of microorganisms for biotechnological applications as well as the maintenance of environments and even in the reduction of toxic compounds released this context biological methods emerge as an alternative to conventional methods and can take advantage of the functional diversity of the microbial community so the Biolog Ecoplate allow us to analyze the metabolic activity functional diversity in ecosystems environmental samples which reflects the state of its business This is considered a modern complementary and promising technology which through biological properties allows rapid characterization of ecological status of environmental samples such as soil or water and thereby evaluate the potential of its application of microorganisms in the bioremediation process However resorted to microplates Biolog Ecoplate to characterize and compare the functional diversity of the microbial community four ecosystems rocky fields grass woods forest and savanna two cities located on the perimeter of iron quadrangle Soil samples collected form these ecosystems after the serial dilution were inoculated in Biolog Ecoplate followed by absorbance reading later formed the analyzes submitted standard The microbiota of ecosystems Sabara and Brumadinho showed differences in the degradation of substrates and functional diversity and ecosystems affected by human action had higher degradation plate carbon compounds and high microbial diversity The soils in the area of the quadrilateral regions showed microbiota with metabolic activity characteristics for preserved and affected ecosystems So the Biolog Ecoplate emerge as a promising alternative to assess the health of ecosystems based on microbial metabolic activity Keywords Ecoplate microbial community metabolic diversity microbial activity metabolic profile 27 1 INTRODUÇÃO A degradação do solo em consequência da intensificação do uso da terra e inadequadas atividades como são as principais preocupações ambientais LIU et al 2013 A liberação de resíduos e a contaminação de ambientes tem despertado a atenção de ambientalistas empresários e pesquisadores dando maior atenção pela preservação de áreas que sofreram pressão ambiental além da utilização de técnicas alternativas para recuperar ambientes visto que nos últimos anos a presença de metais pesados que mesmo em quantidades vestigiais é tóxico e prejudicial para a flora e fauna tornando um grande problema ambiental GADD 2000 Dentro da temática de minimizar os impactos que as liberações de resíduos industriais podem gerar surge a utilização de microrganismos e plantas com o intuito de reduzir e remediar o ambiente CHÁVEZ ESCOBAR ANGHINONI 2011 A atividade metabólica de microrganismos presentes em ecossistemas nativos ou impactados pode surgir como alternativa para a prospecção de enzimas importantes para a biorremediação de áreas além de atuar como um indicador da grande diversidade de microrganismos em ecossistemas com diferentes características sendo assim um indicativo da pressão ambiental sofrida SZYMAŃSKA PIERNIK HRYNKIEWICZ 2013 As placas Biolog EcoPlate consistem em uma ferramenta para auxiliar o entendimento da comunidade microbiana e sua diversidade funcional nos estudos ambientais análises a partir desta técnica podem ser realizadas com culturas isoladas de microrganismos ou mesmo culturas mistas e de amostras ambientais de solos águas e resíduos PIERCE WARD DOBBS 2014 A população de microrganismos pode apresentar assim um padrão de resposta em característica as diferentes fontes de carbono servindo como um tipo de impressão digital metabólica PIERCE WARD DOBBS 2014 A tecnologia Biolog EcoPlate se baseia nas fontes de carbono que mimetizam situações ambientais neste contexto as respostas da comunidade 28 de microrganismos permitem realizar um screening da atividade funcional dos microrganismos THIJS et al 2014 URAKAWA et al 2013 Portanto esta ferramenta consiste em uma abordagem eficaz para auxiliar no entendimento dos fatores bióticos e abióticos como exemplo avaliar ambientes onde estas foram afetados devido à toxicidade de compostos ali presentes BICKEL TANG GROSSART 2014 Nos últimos anos muitos esforços têm sido gerados para o desenvolvimento de tecnologias para proteção entendimento e controle dos compostos gerados em relação a diversidade de microrganismos e subprodutos A abordagem de fontes de carbono como entendimento da comunidade microbiana tem atuado de maneira útil para entender a relação entres os resíduos tóxicos gerados e a redução da atividade bacteriana sendo um bom detector de compostos tóxicos que podem reduzir e inibir a atividade bacteriana KLAUSJOERGER et al 2001 KUMAR et al 2013 LI et al 2014 Nesta temática o presente trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade funcional e efeitos das pressões ambientais da mineração na atividade microbiana por meio da ferramenta Biolog EcoPlate Esta pesquisa apresenta grande importância cientifica e suporte para uma possível aplicação dos microrganismos na recuperação e remediação de ambientes CHÁVEZ ESCOBAR ANGHINONI 2011 2 MATERIAL E MÉTODOS Na Figura 1 temse o fluxograma experimental das abordagens utilizadas para avaliar a capacidade metabólica da comunidade microbiana bem como a utilização de substratos e os índices de diversidade dos ecossistemas das regiões de Sabará e Brumadinho 29 Figura 1 Fluxograma metodológico 21 Regiões de Estudo e Coleta das amostras de solo A região de estudo consiste em uma área de preservação ambiental mantida pela VALE SA conhecido como Centro de Conservação e Pesquisa em Biodiversidade CEBIO localizado na região de Sabará MG Brasil Esta região ficou conhecida historicamente pela descoberta e exploração de minerais como ouro esmeralda diamante e outros tornandoa nesse período um dos importantes polos comerciais desses produtos Posteriormente esta área foi afetada por constantes extrações dos minerais e pela prática agrícola O centro de Biodiversidade CEBIO é comporto por quatro ecossistema distintos sendo eles Campo Rupestre Floresta Mata Atlântica Cerrado e Campo de Gramíneas região esta onde se armazenava as escórias da mineração Amostras de solo também foram coletadas no município de Brumadinho na região Belo Horizonte MG localizada na Via do Minério na Região de Brumadinho localizase o Centro de Tecnologia de Ferrosos CTF Vale Miguelão este centro de pesquisa também abrange quatro ecossistemas semelhantes ao Centro de Biodiversidade CEBIO sendo Campo Rupestre Floresta Mata Atlântica Cerrado e Campo de Gramíneas onde está última sofreu uma queimada por duas vezes em períodos desconhecidos A região apresenta um clima tipicamente tropical definido por um pequeno período seco 4 a 5 meses e outro úmido bem acentuado marcado por chuvas concentradas na estação quente verão Regionalmente o solo dominante da 30 área em estudo pertence à classe Latossolo VermelhoAmarelo quase sempre associado ao Argissolo VermelhoAmarelo ambos de caráter distrófico o que determina o predomínio da Floresta Estacional da região Mata Atlântica e outros quatro ecossistemas A coleta dos solos foi realizada no período considerado de seca setembro de 2013 para as amostras do CEBIO e setembro de 2015 para as amostras do CTF As amostras eram relacionadas a quatro diferentes ecossistemas de solo 1 Mata de Floresta Atlântica MF 2 Solo de Capim CP 3 Cerrado CE e 4 Canga CG A amostragem foi realizada em quadruplicada segundo as coordenadas do GPS Tabela1 com auxílio de trado de 10 polegadas de diâmetro e comprimento de 20 centímetros realizando uma assepsia para o início das coletas nos diferentes solos Para cada réplica de solo foram realizadas 12 extrações de 020 cm as quais foram reunidas em uma amostra composta 31 Tabela 1 Coordenadas dos pontos de coletas das amostras de Sabará e Brumadinho realizadas pelo aparelho GPS da marCP Garmin modelo 62sc sendo os pontos apresentam as seguintes coordenadas em UTM Sabará Brumadinho Amostras de solo Latitude Longitude Latitude Longitude Mata Floresta 1 19514141S 4348790O 23k0608966 7775499 Mata Floresta 7 19514460S 4348681O 23k0609021 7775546 Mata Floresta 8 19514038S 4348476O 23k0609069 7775597 Mata Floresta 9 19514356S 4348357O 23k0609120 7775644 Mata Eucalipto 1 19514035S 43482658O 23k0609180 7775695 Mata Eucalipto 2 19513627S 43482425O 23k0589207 7770466 Mata Eucalipto 3 19513932S 43482329O 23k0589187 7770512 Mata Eucalipto 4 19513830S 43482007O 23k0589157 7770543 Cerrado 1 19514847S 43482008O 23k0589101 7770558 Cerrado 2 19514542S 43482112O 23k0589050 7770587 Cerrado 3 19514238S 43482218O 23k0588670 7770620 Cerrado 4 19514145S 43481892O 23k0588753 7770620 Capim 2 19514056S 43475375O 23k0588790 7770643 Capim 3 19513962S 43475061O 23k0588823 7770663 Capim 4 19513859S 43474736O 23k0588846 7770693 Capim 5 19513758S 43474411O 23k0608960 7775829 Canga 1 1950206S 4344740O 23k0609021 7775862 Canga 2 1950513S 4344635O 23k0609087 7775889 Canga 4 1950111S 4344415O 23k0609148 7775896 Canga 6 1950725S 4344199O 23k0609195 7775946 22 Análise da atividade Metabólica Microbiana A análise de atividade metabólica microbiana de solos dos quatro ecossistemas do quadrilátero ferrífero foi avaliado usando Biolog Ecoplate URAKAWA et al 2013 Alíquotas de 25 g de solo dos quatro pontos coletados foram misturadas 32 totalizando 10 g e posteriormente foi adicionada à 190 mL de solução salina 085 sendo colocada em agitador orbital por 30 min 200 g a 30C Posteriormente foi realizado uma diluição seriada e 120 µL da diluição 103 foram adicionados às microplacas Biolog Ecoplates Biolog Inc Harward California URAKAWA et al 2013 Para cada amostra foi utilizada uma microplaca Biolog contendo 31 fontes de carbono Tabela 2 em triplicata e 1 cavidade sem nenhuma fonte de carbono controle negativo além de corante indicador tetrazólio violeta As placas foram incubadas a 28C por 48 horas Tabela 2 Fontes de carbono das microplacas Biolog Ecoplate Substratos Fonte de carbono Substratos Fonte de carbono Polímeros Glicogênio Aminoácidos Lserina αciclodextrina Lfenilalanina Tween 40 Larginina Tween 80 Ltreonina Carboidratos Dcelobiose Lasparagina βmetilDglicosídeo Ácido glicilL glutâmico NacetilD glicosamina iEritritol Dxilose AminaAmida Fenilalanina ÁcidoDgalacturônico Putrescina αDlactose Dmanitol Ácido carboxílico Ácido γhidroxibutírico Carboidratos DLα glicerolfosfato Ácido Dglicosamínico Glicose1fosfato Éster Metílico do ac pirúvico Ácido Itacônico ÁcidoDgalacturônico Fenólico Ácido2 Hidroxibenzóico Ácido αcetobutírico Ácido 4 Hidroxibenzóico Ácido Dmálico O crescimento microbiano em cada poço foi avaliado pelo aumento da densidade óptica DO 580 nm com um leitor de ELISA por um período de cinco dias A capacidade de utilizar uma fonte de Carbono foi determinada conforme 33 Ibekwe Kennedy 2010 pela avaliação do potencial redox da redução do corante tetrazólio Os valores de absorbância foram subtraídos do branco e normalizados segundo WEBER 2014 posteriormente foi realizado uma mediana dos valores das leituras dos diferentes tempos devido à característica de que cada enzima apresenta uma cinética diferente para degradação de substratos Para as análises de degradação de fontes de carbono análise de componentes principais PCA agrupamento hierárquico e cálculos de índices de diversidade através do desenvolvimento médio de cor AWDC por Shannon e riqueza de substratos foram realizados no tempo de 120h de cultivo Tabela 3 Tabela 3 Fórmulas para cálculos dos índices de diversidade funcional Shannon E Ritches e Desenvolvimento de cor médio Índice Definição Formula Definição Desenvolvimento de cor AWCDΣ ODpi31 pi desenvolvimento da cor proporcional a cor do mais intenso do total de cavidades de uma placa Shannon diversity Riqueza HΣpilnpi H Índice de diversidade de Shannon Shannon evenness Evenness calculado índice de Shannon EHlnS S Riqueza de substratos utilizados 23 Análise Estatística Os índices de desenvolvimento médio de cor AWDC Shannon bem como a riqueza de substratos foram investigados por meio de análise de variância ANOVA O agrupamento hierárquico foi utilizado para avaliar os substratos que foram mais utilizados em cada amostra e avaliar a correlação entre os quatro ecossistemas Os dados para índices de desenvolvimento médio de cor foram normalizados e todas as análises estatísticas foram realizadas com o software R versão 31 e PAST 3 HAMMER HARPER RYAN 2001 34 3 RESULTADO Análises do perfil metabólico microbiano consiste em uma forma de avaliar de maneira quantitativa e qualitativa a atividade metabólica da comunidade microbiana conforme se observa pelos Nos resultados de Biolog EcoPlates a utilização de substratos mostrou que há um aumento exponencial da atividade metabólica ao longo do tempo evidenciando um aumento potencial das atividades metabólicas para os diferentes ecossistemas bem como as diferentes regiões do perímetro do quadrilátero ferrífero Figura 2 Figura 2 Absorção de tetrazólio ao longo do tempo com base no índice de desenvolvimento médio de cor AWDC para as duas áreas coletadas Para comparar a diversidade funcional dos microrganismos metabolizar fontes de carbono os ecossistemas das diferentes regiões foram observados os valores dos índices de diversidade de Shannon E e a riqueza R foram obtidos no último tempo de incubação 140h Na Tabela 4 como pode ser observado não houve diferença significativa entre os ecossistemas Os solos 35 dos ecossistemas da região de Sabará apresentaram maiores valores para os índices de diversidade de Shannon entretanto os solos da região de Brumadinho apresentaram um valor de Shannon abaixo em relação aos solos da região de Sabará Tabela 4 Valores médios dos índices de diversidade funcional Shannon E e riqueza de substratos R dos quatro ecossistemas após 140 horas de incubação Tuckey 005 Índices Ecossistemas MF1 MF2 CE1 CE2 CP1 CP2 CG1 CG2 Shannons evenness E 0812ab 0768ab 0844ab 0723b 0814a 0850a 0813ab 0738b Richness R 21ab 25a 20b 24ab 20ab 25a 21ab 24ab Amostras de Sabará apresentaram maior diversidade funcional enquanto que as comunidades microbianas dos solos de Brumadinho apresentaram maior riqueza ou seja uma preferência para uma variedade de compostos da placa Uma vez que diferenças quanto aos índices recorreuse ao agrupamento hierárquico Figura 3 que leva em consideração a mediana dos valores de DO para as diferentes fontes de carbono da placa Os solos preservados dos ecossistemas das regiões apresentaram metabolismo para as fontes de carbono semelhantes agrupando próximo amostras de solo que sofreram ações antropogênicas como queimada e ação da mineração nas duas regiões em estudo Brumadinho e Sabará se apresentaram bastante diferentes quanto à capacidade de degradar fontes de carbono em relação aos demais ecossistemas como pode ser visto no agrupamento hierárquico onde CP1 apresenta agrupamento distante para CP2 36 Figura 3 HeatMap com os valores normalizados de absorbância agrupados para degradação de fontes de carbono das placas BiologEcoplate para os ecossistemas Capim CP Canga CG Cerrado CE e Floresta MF de Sabará e Brumadinho Os solos dos diferentes ecossistemas apresentaram preferência para o consumo de fontes de carbono dando destaques para carboidratos aminasamidas e compostos fenólicos Figura 4 Uma outra observação pode ser vista de que os solos da região de Brumadinho apresentam valores maiores para degradação de substratos em relação a Sabará o que corrobora com os valores de riqueza de substratos Tabela 3 37 Figura 4 Médiana da utilização de substratos dos ecossistemas da região de Sabará e Brumadinho Análise de componentes principais considerando a degradação de fontes de carbono apresentaram tendências para consumo das fontes de carbono agrupadas em carboidratos aminas e amidas bem como de maneira menos intensa para compostos fenólicos e ácidos carboxílicos Figura 5 Entretanto para os ecossistemas que sofreram ações de fatores abióticos como queimadas CP2 e até mesmo ações de recuperação ambiental apresentaram maior degradação de fontes de carbono relacionado aos ácidos carboxílicos aminasamidas e aminoácidos para o ecossistema localizado em Brumadinho CP2 e Sabará CP1 38 Figura 5 Análise dos componentes principais PCA da mediana dos valores de absorbância dos diferentes tempos de quatro ecossistemas em duas coletas sendo MF1 Mata Floresta CP1 Capim CE1 Cerrado e CG1 Canga solos do Centro de Biodiversidade CEBIO Sabará e MF2 Mata Floresta CP2 Capim CE2 Cerrado e CG2 Canga solos da Centro de Preservação do Miguelão Brumadinho MG A análise de componentes principais foi possível observar que ecossistemas de CP2 e CE2 apresentaram na maioria tendência algumas fontes de carbono do grupo de compostos fenólicos Figura 5 já microbiota dos ecossistemas CP1 e CE1 tendência para uma degradação de aminoácidos bem como CG2 vale salientar o agrupamento de MF1 e MF2 para degradação de ácidos carboxílicos 4 DISCUSSÃO Os solos sob stress e sua microbiota previamente adaptada surgem como alternativa para estudos de recuperação de áreas por processos de biorremediação e biorremoção de compostos tóxicos liberados no ambiente uma vez que estes são nocivos a saúde dos organismos vivos ACID et al2000 Atividade dos microrganismos de forma única ou até mesmo combinada 39 participando da remoção de componentes tóxicos tem sido de grande interesse e amplitude A placa Biolog Ecoplate foi utilizada para os estudos metabólicos que evidenciaram a atividade funcional de comunidades microbianas do solo URAKAWA et al 2013 A análise da comunidade microbiana tem sido bastante utilizada para estimar as modificações causadas pelos fatores abióticos e estressadas como metais pesados CHAZARENC BRISSON MERLIN 2010 ou a contaminação por hidrocarbonetos DAS MUKHERJEE SEN 2008 alta salinidade alto pH do solo ou de aquecimento CHIEN et al 2008 O Biolog EcoPlate normalmente utilizado para comparação da microbiota de ecossistemas quanto a sua capacidade funcional é uma técnica rápida para avaliar a atividade metabólica em estudos de prospecção de organismos antes mesmo de serem isolados SZYMAŃSKA PIERNIK HRYNKIEWICZ 2013 Os valores de AWCD do presente trabalho evidenciaram que apesar das altas concentrações de metais características dos solos das regiões de estudo deste trabalho a capacidade de degradar fontes de carbono e atividade metabólica não foram afetadas somente para alguns ecossistemas podendo ser evidências dos fatores abióticos e até mesmos bióticos sobre os ecossistemas BICKEL TANG GROSSART 2014 O presente estudo evidencia uma forte influência da atividade metabólica nos diferentes ecossistemas relacionados as diferenças na abundância de microorganimos observados pelos índices de diversidade e riqueza sugerindo assim uma possível aplicação em biorremediação de metais observados pela degradação de AminaAmida e Aminoácidos MORETTI et al 2015 SZYMAŃSKA PIERNIK HRYNKIEWICZ 2013 WEBER et al 2007 tendo indícios de que a comunidade microbiana da região de Sabará e Brumadinho apresentam solos com altas concentrações de metais e consequentemente uma microbiota com características para sobrevivência na presença de metais e até mesmo aplicado para biorremediação Índices como AWCD H R S e nos cálculos com base nos resultados medidos em DO 580nm são muito úteis para descrever a atividade e a diversidade da população de microrganismos OSZUST GF 2014 O perfil 40 metabólico da comunidade microbiana apresentouse com um bom indicador de que os fatores abióticos e bióticos interferem de maneira suave na comunidade microbiana além de que os mesmos fatores que afetam refletem de maneira positiva para seleção de microambientes adaptados e que este pode ser utilizadas no processo de recuperação de áreas visto a amplitude de substratos degradados na placa Biolog Ecoplate bem como os altos valores dos índices de diversidade Além disso o cálculo do índice de riqueza também é sensível o suficiente para avaliar a comunidade microbiana Alto valor do índice de riqueza indica um elevado número de substratos oxidados de carbono A atividade de microrganismos em solos contaminados sob stress demonstra uma grande quantidade de microrganismos adaptados metabolicamente para uma possível aplicação para remoção de metais entre outros componentes FERNÁNDEZ MONTIEL et al 2015 5 CONCLUSÃO Análises Biolog Ecoplate revelam que a microbiota das regiões de preservação mantidas pela ValeSA tem boa atividade metabólica sendo um indicativo importante para a saúde de ecossistemas uma vez que esta tecnologia tem como objetivo central avaliar a saúde de ecossistemas que sofreram ação de fatores bióticos ou abióticos Concluise que ecossistemas como mata floresta capim canga e cerrado de dois municípios importantes para a mineração no estado de Minas Gerais apresentaram microbiota semelhante quanto a preferência por compostos distribuídos pela placa entretanto solos afetados pela ação da mineração e queimada apresentaram maior atividade metabólica bem como maior diversidade de compostos isto se deve possível manutenção da estabilidade da diversidade afetada pela atividade antropogênica vale salientar que os microrganismos apresentam alta degradassão de aminoácidos sendo um indicativo para uma possível aplicação em biorremediação As Biolog Ecoplate surgem como uma alternativa eficiente para entender as interações microbianas relacionando de maneira direta com manutenção da saúde dos ecossistemas 41 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACCESS O Biodegradation v 5 n 3 p 810 2014 ACID B et al Microbial Community Analysis Microbial Community Analysis p 12 sd ALEX M et al O quadrilátero ferrífero e o norte de minas gerais análise da história e importância econômica p 116 2012 ALTIMIRA F et al Characterization of copperresistant bacteria and bacterial communities from copperpolluted agricultural soils of central Chile BMC microbiology v 12 p 193 jan 2012 AMBIENTAL T et al USO DE MICROORGANISMOS PARA A BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES IMPACTADOS n 6 p 9951006 2012 ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biolixiviação Utilização de Micro organismos na Extração de Metais sl sn ARORA P K SRIVASTAVA A SINGH V P Novel degradation pathway of 4 chloro2aminophenol via 4chlorocatechol in Burkholderia sp RKJ 800 Environmental science and pollution research international v 21 n 3 p 2298304 fev 2014 AURÉLIO M PINHO C DE FILHO P Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado p 28 2010 BAI J et al Biosorption mechanisms involved in immobilization of soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multimetalcontaminated soil Journal of environmental sciences China v 26 n 10 p 205664 1 out 2014 BALDRIAN P et al Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition The ISME journal v 6 n 2 p 24858 fev 2012 BICKEL S TANG K GROSSART H Structure and function of zooplankton associated bacterial communities in a temperate estuary change more with time than with zooplankton species Aquatic Microbial Ecology v 72 n 1 p 115 7 mar 2014 BRANDER S MIKKELSEN J D KEPP K P TtMCO A highly thermostable laccaselike multicopper oxidase from the thermophilic Thermobaculum terrenum Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic v 112 p 5965 2015 42 CAMPBELL C D GRAYSTON S J HIRST D J Methods Use of rhizosphere carbon sources in sole carbon source tests to discriminate soil microbial communities v 30 p 3341 1997 CHÁVEZ L F ESCOBAR L F ANGHINONI I Diversidade metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de integração lavoura pecuária sob intensidades de pastejo n 1 p 12541261 2011 CHAZARENC F BRISSON J MERLIN G Seasonal and Spatial Changes of Microorganism Communities in Constructed Wetlands A Community Level Physiological Profiling Analysis International Journal of Chemical Engineering v 2010 p 16 2010 CHEN S et al Influence of coexisted benzoapyrene and copper on the cellular characteristics of Stenotrophomonas maltophilia during biodegradation and transformation Bioresource Technology v 158 p 181187 2014 CHIEN C et al Microbial diversity of soil bacteria in agricultural field contaminated with heavy metals Journal of Environmental Sciences v 20 n 3 p 359363 jan 2008 COSTA P S et al Metagenome of a microbial community inhabiting a metal rich tropical stream sediment PloS one v 10 n 3 p e0119465 jan 2015 DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview v 7 n April p 159169 2008a DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview Indian Journal of Biotechnology v 7 n 2 p 159169 2008b DAS P MUKHERJEE S SEN R Improved bioavailability and biodegradation of a model polyaromatic hydrocarbon by a biosurfactant producing bacterium of marine origin Chemosphere v 72 n 9 p 122934 jul 2008 DE N Ufop cetec uemg 2006 FERNÁNDEZMONTIEL I et al Shortterm effects of simulated belowground carbon dioxide leakage on a soil microbial community International Journal of Greenhouse Gas Control v 36 p 5159 2015 FINN R D et al Pfam The protein families database Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 222230 2014 FOMINA M GADD G M Biosorption current perspectives on concept definition and application Bioresource technology v 160 p 314 maio 2014 GADD G M Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization Current Opinion in Biotechnology v 11 n 3 p 271279 2000 43 GOMEZ E FERRERAS L TORESANI S Soil bacterial functional diversity as influenced by organic amendment application Bioresource technology v 97 n 13 p 14849 set 2006 GRYTA A FRĄC M OSZUST K The Application of the Biolog EcoPlate Approach in Ecotoxicological Evaluation of Dairy Sewage Sludge Applied Biochemistry and Biotechnology v 174 n 4 p 14341443 2014 HAKULINEN N ROUVINEN J Threedimensional structures of laccases Cellular and Molecular Life Sciences v 72 n 5 p 857868 2015 HAMMER Ø HARPER D A T RYAN P D Paleontological statistics software package for education and data analysis Palaeontologia Electronica v 4 n 1 p 918 2001 HUGENHOLTZ P TYSON G W Metagenomics Nature v 455 n August 2006 p 481483 2008 HUNTER S et al EBI metagenomics A new resource for the analysis and archiving of metagenomic data Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 600 606 2014 INÁCIO L ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biorremediação de Água Subterrânea Contaminada com Gasolina e Análise Molecular da Comunidade Bacteriana Presente sl sn ISLAM F S et al Role of metalreducing bacteria in arsenic release from Bengal delta sediments Nature v 430 n 6995 p 6871 1 jul 2004 KANG CH et al Bioremediation of lead by ureolytic bacteria isolated from soil at abandoned metal mines in South Korea Ecological Engineering v 74 p 402407 jan 2015 KLAUSJOERGER T et al Bacteria as workers in the living factory Metal accumulating bacteria and their potential for materials science Trends in Biotechnology v 19 n 1 p 1520 2001 KUMAR R et al Growth media composition and heavy metal tolerance behaviour of bacteria characterized from the subsurface soil of uranium rich ore bearing site of Domiasiat in Meghalaya v 12 n January p 115119 2013 KUMARAN N S R I SUNDARAMANICKAM A BRAGADEESWARAN S ABSORPTION STUDIES ON HEAVY METALS BY ISOLATED BACTERIAL STRAIN PSEUDOMONAS Sp FROM UPPANAR ESTUARINE WATER SOUTHEAST COAST OF INDIA v 6 n 4 p 471476 2011 LASHEEN M R AMMAR N S IBRAHIM H S Adsorptiondesorption of CdII CuII and PbII using chemically modified orange peel Equilibrium and kinetic studies Solid State Sciences v 14 n 2 p 202210 2012 44 LI LG et al Potentially novel copper resistance genes in copperenriched activated sludge revealed by metagenomic analysis Applied microbiology and biotechnology v 98 n 24 p 1025566 dez 2014 LIU X et al TiGER a database for tissuespecific gene expression and regulation BMC bioinformatics v 9 p 271 2008 LIU X et al Human health risk assessment of heavy metals in soilvegetable system A multimedium analysis Science of the Total Environment v 463 464 p 530540 2013 MAHRAJBNE C MAHRAGBNE C RESISTANCE OF E N V I R O N M E N T A l BACTERIA TO H E A V Y METALS v 64 p 715 1998 MAIA V O FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS BANCO DE SEMENTES DO SOLO EM ÁREAS DE MINERAÇÃO E 2014 MARGESIN R PŁAZA G A KASENBACHER S Characterization of bacterial communities at heavymetalcontaminated sites Chemosphere v 82 n 11 p 15831588 2011 MARMUR J A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro organisms Journal of Molecular Biology v 3 n 2 p 208IN1 1961 MÉNDEZGARCÍA C et al Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats Frontiers in Microbiology v 6 n May p 117 2015 MORETTI G et al Microbial community distribution and genetic analysis in a sludge active treatment for a complex industrial wastewater a study using microbiological and molecular analysis and principal component analysis Annals of Microbiology 2015 MORGAN X C HUTTENHOWER C Chapter 12 Human Microbiome Analysis v 8 n 12 2012 MYROLD D D ZEGLIN L H JANSSON J K The Potential of Metagenomic Approaches for Understanding Soil Microbial Processes Soil Science Society of America Journal v 78 n 1 p 3 2014 NGUYEN V H SHIM JJ Threedimensional nickel foamgrapheneNiCo2O4 as highperformance electrodes for supercapacitors Journal of Power Sources v 273 p 110117 2015 ONLINE V A Environmental Science Processes Impacts bioremediation based abolition of heavy metals p 180193 2014 PANICKER V P GOPALAKRISHNAN A Mini Review Article Metagenomics a Novel Tool to Unravel the Secrets of Nature v 2 n 6 p 312315 2014 45 PERSPECTIVES C MICROBIOLOGY A Vigna mungo v 1 n 2 p 110 2012 PIERCE M L WARD J E DOBBS F C False positives in Biolog EcoPlatesTM and MT2 MicroPlatesTM caused by calcium Journal of microbiological methods v 97 p 204 fev 2014 POWELL S et al eggNOG v40 nested orthology inference across 3686 organisms Nucleic Acids Research v 42 n D1 p D231D239 2014 RELACIONADOS A et al O QUADRILÁTERO FERRÍFERO MG BRASIL ASPECTOS SOBRE SUA HISTÓRIA SEUS RECURSOS MINERAIS E PROBLEMAS v 18 n 1 p 3337 2010 REZENDE É A AUGUSTO A SALGADO R MAPEAMENTO DE UNIDADES DE RELEVO NA MÉDIA SERRA DO ESPINHAÇO MERIDIONAL MG p 45 60 2011 SCHLOTER M DILLY O MUNCH J Indicators for evaluating soil quality Agriculture Ecosystems Environment v 98 n 13 p 255262 set 2003 SILVER S Bacterial resistances to toxic metal ions A review Gene v 179 n 1 p 919 1996 STUDIES I AUTHOR C HEAVY METAL TOLERANCE OF THREE DIFFERENT BACTERIA ISOLATED FROM v 2 n 2 p 137147 2013 SZYMAŃSKA S PIERNIK A HRYNKIEWICZ K Metabolic potential of microorganisms associated with the halophyte Aster tripolium L in saline soils Ecological Questions v 18 n 1 p 919 1 jan 2013 TARTAGLIA M et al Gainoffunction SOS1 mutations cause a distinctive form of Noonan syndrome Nature genetics v 39 n 1 p 7579 2007 THIJS S et al Potential for plant growth promotion by a consortium of stress tolerant 24dinitrotoluenedegrading bacteria isolation and characterization of a military soil Microbial biotechnology v 7 n 4 p 294306 2014 TSEZOS M Biosorption of metals The experience accumulated and the outlook for technology development Hydrometallurgy v 59 n 23 p 241243 fev 2001 UCHIYAMA T MIYAZAKI K Functional metagenomics for enzyme discovery challenges to efficient screening Current Opinion in Biotechnology v 20 n 6 p 616622 2009 URAKAWA H et al Shifts of Bacterioplankton Metabolic Profiles along the Salinity Gradient in a Subtropical Estuary ISRN Oceanography v 2013 p 1 12 2013 46 VARAJAO S A R A C A QUESTÃO DA CORRELAÇÃO DAS SUPERFÍCIES DE EROSÃO DO QUADRILÁTERO FERRÍFERO MINAS GERAIS v 21 n 2 p 138145 1991 VELACANO M CASTELLANOHINOJOSA A VIVAS A F Effect of Heavy Metals on the Growth of Bacteria Isolated from Sewage Sludge Compost Tea n August p 644655 2014 WANI P A AYOOLA O H Bioreduction of Cr VI by Heavy Metal Resistant Pseudomonas Species n Vi p 19 2015 WEBER K P et al Data transformations in the analysis of communitylevel substrate utilization data from microplates Journal of microbiological methods v 69 n 3 p 4619 jun 2007 WEISBURG W G et al 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol v 173 p 697703 1991 WHITE C SAYER J A GADD G M Microbial solubilization and immobilization of toxic metals key biogeochemical processes for treatment of contamination FEMS microbiology reviews v 20 n 34 p 50316 jul 1997 XIA X et al On the role of surface diffusion in determining the shape or morphology of noblemetal nanocrystals Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 110 n 17 p 6669 73 2013 ZOU R et al Threedimensional networked NiCo 2 O 4 MnO 2 branched nanowire heterostructure arrays on nickel foam with enhanced supercapacitor performance J Mater Chem A v 3 n 4 p 17171723 2015 47 CAPÍTULO 3 Potencial de tolerância bioacumulação e biossorção de isolados bacterianos de solos de região de mineração de ferro RESUMO Os impactos ambientais causados por sucessivas extrações de minérios e resíduos tóxicos dessa atividade têm sido foco de preocupação dos ambientalistas Grandes são esforço gerados para o desenvolvimento de metodologias eficientes e de baixo custo para remoção de metais pesados de solos e águas contaminadas Os solos da Região de Minas Gerais no Perímetro do Quadrilátero Ferrífero apresentam diferentes ecossistemas como Campo Rupestre Canga Campo de Gramíneas Capim Mata Floresta Mata Eucalipto e Cerrado ambos com altas concentrações de ferro em seu solo com destaque para os solos de Canga e Capim o que despertou interesse da setor de mineração Este trabalho teve como objetivo isolar microrganismos caracterizar e avaliar o potencial para aplicação na biorremediação e bioacumulação de metais como cobre cromo e níquel Na caracterização a partir do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA foram classificadas em gêneros como Burkolderia Serratia Bacillus Stenotrophomonas e Artrobacter que apresentam potencial para biorremediação de metais do solo e água Os isolados CP15 CP16 CE11MF10 ME02 e CR05 apresentaram resistência a quantidades elevadas de metais 500 mg L1 em processos de remoção de metais em sobrenadante da célula os isolados CP15 e CE11 apresentaram boa capacidade de remover elevadas taxas de metais Considerando a temática de reduzir remover e reaproveitar os microrganismos isolados destas áreas apresentam características e potencial para uma boa aplicação no contexto de biorremediação de metais No entanto o próprio ambiente sob pressão antropogênica permite o desenvolvimento de mecanismos que possivelmente podem ser utilizados para recuperação do ambiente ou seja a diversidade aplicada para sustentabilidade Palavras chave Biorremediação biossorção imobilização de metais e resistência a metal 48 CHAPTER 3 Potential tolerance bioaccumulation and biosorption bacterial isolates of iron mining region soils ABSTRACT The environmental impacts caused by successive extractions of minerals and toxic waste of this activity have been the focus of concern for environmentalists Great efforts are generated for the development of efficient and cost effective methods for removing heavy metals from contaminated soils and waters The soils of the region of Minas Gerais in the perimeter of the Iron Quadrangle have different ecosystems as Cave Course Canga Grasses Field grass Forest Forest Forest Eucalyptus and Cerrado both with high concentrations of iron in its soil especially the Canga soil and grass which aroused the interest of the mining sector This study aimed to isolate microorganisms characterize and evaluate the potential for use in bioremediation and bioaccumulation of metals such as copper chromium and nickel The characterization from the partial sequencing of the 16S rRNA gene were classified into genres as Burkolderia Serratia Bacillus Stenotrophomonas and Artrobacter which have the potential for bioremediation of metals from soil and water The CP15 isolated CP16 EC11 MF10 ME02 and CR05 were resistant to high amounts of metal 500 mg L1 in metal removal processes supernatant of the cell the CP15 and EC11 isolates showed good ability to remove high rates metals Considering the theme of reduce remove and reuse the microorganisms isolated from these areas have characteristics and potential for a good application in the context of bioremediation of metals However the actual pressure environment from anthropogenic allows the development of mechanisms that can possibly be used for environmental restoration or diversity applied to sustainability Keywords bioremediation bioremediation immobilization of metals and metal resistance 49 1 INTRODUÇÃO O grande crescimento populacional culminado com o crescimento industrial tem aumentado a liberação e à acumulação de metais pesados no solo em diversos biomas como consequência das atividades de mineração processamento industrial a utilização de pesticidas e fertilizantes químicos LIU et al 2013 A presença de metais pesados mesmo em quantidades vestigiais é tóxico e prejudicial para a flora e fauna tornandose um grande problema ambiental GADD 2000 Processos naturais de remoção de metais sendo eles por metabolismos bacteriano e em associação com plantas fitorremediação tem sido amplamente explorados e estudados MARGESIN PŁAZA KASENBACHER 2011 Muitos gêneros bacterianos também encontrados no solo atuam nos processos de biomineração e biorremediação principalmente os acidófilos com potencial oxirredutor como Acidithiobacillus ferrooxidans Sulfobacillus sp e Acidithiobacillus caldus Além destes alguns gêneros como Pseudomonas Burkolderia Bacillus e Rhizobium WANI AYOOLA 2015 Esses microrganismos apresentam metabolismo oxidativo de minerais atuando de maneira importante na biorremediação de cobre cromo níquel e zinco SILVER 1996 Considerando a importância dos microrganismos na biorremediação de metais bem como outras aplicações biotecnológicas os mesmos apresentam um papel significativo nos processos de redução remoção e reutilização de metais COSTA et al 2015 Com isso o objetivo deste trabalho foi caracterizar microrganismos dos diferentes ecossistemas do quadrilátero ferrífero uma das maiores regiões do mundo de mineração com possível potencial para biorremediação de Cobre bivalente Cu2 Cromo hexavalente Cr6 e Níquel Ni2 50 2 MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi executado no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas LBMP do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FCAV da UNESP de Jaboticabal São Paulo Brasil As técnicas utilizadas neste trabalho não oferecem risco para o meio ambiente e saúde humana encaixandose nos padrões de biossegurança NB1 21 Região de estudo A região de estudos consiste em uma área de preservação ambiental mantida pela VALE SA conhecido como Centro de Conservação e Pesquisa em Biodiversidade CEBIO localizado na região de Sabará MG Brasil Esta região ficou conhecida historicamente pela descoberta e exploração de minerais como ouro esmeralda diamante e outros tornandoa nesse período um dos importantes polos comerciais desses produtos Posteriormente esta área foi afetada por constantes extrações dos minerais e pela prática agrícola A região apresenta um clima que se enquadra tipicamente tropical Define se por um pequeno período seco 4 a 5 meses e outro úmido bem acentuado marcado por chuvas concentradas na estação quente verão Regionalmente o solo dominante da área em estudo pertence à classe Latossolo Vermelho Amarelo quase sempre associado ao Argissolo VermelhoAmarelo ambos de caráter distrófico o que determina o predomínio da Floresta Estacional da região Mata Atlântica e outros quatro ecossistemas 22 Coleta de material A coleta dos solos foi realizada na cidade de SabaráMG Brasil em áreas destinadas a preservação sobre a supervisão do Centro de Biodiversidade da Vale CEBIO Essas amostras eram relacionadas a cinco diferentes ecossistemas de solo 1 solo de Mata de Floresta Atlântica MF 2 solo de Mata de Eucalipto ME 3 solo de Capim CP 4 solo de Cerrado CE e 5 solo de Canga CG A amostragem foi realizada em quadruplicada com auxílio de trado 51 de 10 polegadas de diâmetro e comprimento de 20 centímetros o qual foi esterilizado para o início das coletas nos diferentes solos Figura 1 Para cada replica de solo foram realizadas 12 extrações de 020cm as quais foram reunidas em uma amostra composta Figura 1 Imagem das coordenadas geográficas dos locais amostrados recuperada com Google Earth Estas áreas de coletas estão localizadas em SabaráMG no Centro de Biodiversidade da Vale 23 Isolamento e caracterização de culturas bacterianas Considerando as características dos solos dos ecosssitemas do Centro de Diversidade CEBIO foram realizados isolamento de microrganismos visando a busca de isolados com potencial para biorremediação de metais Alíquotas de 25g de solo dos quatro pontos coletados dos diferentes ecossistemas foram misturadas totalizando 10 g e posteriormente foram adicionadas à 190 mL de solução salina 085 e colocada em agitador orbital por 30 min 200 xg 30 C Posteriormente foram feitas diluições seriadas até 104 sendo transferido 100 µL da diluição 103 em placas de petri contendo meio sólido PGE PERSPECTIVES MICROBIOLOGY 2012 com ciclohexamida 25 mg L1 Após 24 h as colônias com aparência morfológica diferente foram coletadas e adicionadas em PGE líquido Após o mesmo tempo de 24 h de desenvolvimento as colônias foram coletadas e adicionadas em tubos SIGMA contendo 5mL de meio PGE e colocadas em agitador orbital por 24 h 200 xg 30 C Posteriormente alíquotas de 100 µL desta cultura foram adicionados em placas contendo meio PGE e 52 oram feitas colônias isoladas para avaliar pureza e a seguir feito solução estoque destas amostras seguindo a denominação Canga CG Capim CP Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF e Cerrado CE Os isolados foram cultivados em meio de cultivo PGE durante dois dias sob agitação de 100 xg 28 ºC A suspenção bacteriana foi centrifugada o sobrenadante descartado e o precipitado foi utilizado para a extração de DNA genômico MARMUR 1961 DNAs dos isolados foram extraídos segundo Marmur 1961 quantificados e posteriormente foram amplificados com oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene 16SrRNA bacteriano pela reação contendo tampão PCR 1X 20 mM TrisHCl pH 84 50 mM KCl 15 mM de MgCl2 1 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador Taq DNA polimerase Fermentas e água ultra pura para completar um volume final de 20 µL Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram os mesmos utilizados por Weisburg 1991 WEISBURG et al 1991 fD1 5CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCA G 3 e o rD1 5CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA GGT GAT CCA GCC 3 As amostras foram amplificadas em um termociclador Eppendorf seguindo o programa 95 ºC por 1 minuto 39 ciclos de 95 ºC por 2 minutos 36 ºC por 1 minuto 7 2ºC por 1 minuto seguidos de uma extensão final por 5 minutos a 72 ºC As amostras foram posteriormente purificadas e submetidas ao sequenciamento para caracterização As reações de sequenciamento foram realizadas em microplacas no sequenciador 3100 Applied Biosystems utilizandose o volume final de 10 μL contendo 10 μL de BigDye ABI PRISM Big Dye Terminator kit Applied Biosystems EUA 40 μL de tampão SaveMoney 200 mM TrisHCl pH 90 5 mM MgCl2 5 pmol de oligonucleotídeo iniciador FD1 ou RD1 e 20 μL do produto amplificado com FD1 e RD1 24 Análise do sequenciamento do gene 16S rRNA As sequências obtidas foram analisadas pelo programa PhredPhrapConsed TARTAGLIA et al 2007 com nível de exigência mínima de 400 bases com qualidade Phred acima de 20 As sequências foram 53 submetidas à consulta de similaridade de nucleotídeos com sequências do banco de dados do Ribosomal Database Project RDP pela ferramenta Classifier com Confidence threshold de 95 25 Curva de Crescimento A curva de crescimento foi realizada em triplicata a partir do preparo de um préinóculo inicial de cada um dos isolados Para a redução dos efeitos de possíveis células mortas presentes na cultura as bactérias cultivadas em PGE foram recuperadas durante a fase exponencial de crescimento 5 dias após cultivo em placas de petri contendo meio PGE através da transferência de uma massa bacteriana com auxílio da alça de Drigalsky Uma massa bacteriana de 3 placas de cultivo foi diluída em 5mL de água milliRo estéril A turbidez do pré inóculo foi registrada através da leitura da absorbância em DO600nm em espectrofotômetro Eppendorf O préinóculo contendo uma DO600nm de 06 foi adicionado em um erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultura PGE e PGE suplementado com Cu2 Cr6 e Ni 2 de 300 mg L1de concentração inicial Após o preparo das culturas bacterianas os frascos foram mantidos sob agitação constante em um agitador orbital a 140 x g por 192 h a 28 C O crescimento celular foi avaliado através da leitura de absorbância do meio de cultura nos momentos logo após a inoculação e a cada 12 horas de cultivo de bactérias Os resultados foram tabulados e plotados em forma de gráficos com o software SIGMA plot 26 Seleção de isolados e desafio de resistência a metais Com o objetivo de selecionar microrganismos que apresentassem resistência a metais cobre Cu2 cromo Cr6 e níquel Ni2 foi realizado um screening dos isolados Todos os isolados foram incialmente acrescidos em 5ml de meio PGE em tubos tipo sigmaware Sigma CAT Nº 5916 por 48 h a 28C posteriormente 100 µL foi adicionado em 5 mL de meio PGE suplementado com os metais a 50mg L1 e após 48 h de cultivo foram feitas leituras em espectrofotômetro Eppendorf DO600nm Posteriormente os isolados que apresentaram DO600nm entre 06 e 1 foram adicionados 10 µL em placas de petri contento meio PGE com cobre cromo e níquel em uma concentração de 50 mg L1 os isolados que 54 apresentaram colônias após 48 h foram considerados positivos no entanto foi selecionado isolados que apresentaram colônia para os três metais Os dados foram plotados em tabelas sendo positivo para presença de colônia e negativo para ausência Visando conhecer a toxicidade e a resistência dos metais cobre Cu2 cromo Cr6 e níquel Ni2 para os isolados dos diferentes ecossistemas foram realizados testes para verificar a concentração em diferentes tipos de metais Para isto foram preparadas soluções estoque na concentração de 10 M de CuSO45H2O e K2Cr2O7 As soluções estoques foram preparados com água deionizada e esterilizados em autoclave a 121 C 1 atm durante 15 min Os isolados foram incubados em 50 mL de meio líquido PGE à 28 C e 150 g Alíquotas das culturas correspondentes a 10 vv foram transferidas para os tubos de vidro sigmaware Sigma CAT Nº 5916 contendo 50 mL do meio líquido PGE adicionados dos metais pesados Cu2 Cr6 e Ni2 separadamente em diferentes concentrações de 100 150 250 e 500 mg L1 seguindo como base concentrações adotadas na literatura LASHEEN AMMAR IBRAHIM 2012 XIA et al 2013 Após o cultivo dos isolados em meio líquido alíquota de 100 µL foi transferida para placas de Petri contendo meio PGE sólido com a respectiva concentração do metal 27 Biorremoção e biossorção de metais Para os ensaios de biorremoção os isolados selecionados como resistente a maior concentração de metal dos testes de concentrações mínima inibitória 500 mg L1 foram acrescidos em meio PGE suplementado com metais por uma concentração inicial de Cu2 Cr6 e Ni 2 de 500 mg L1 Após 48 h 96 h 144 h e 192 h de cultivo as amostras foram centrifugadas a 12000 xg e as células foram lavadas e submetidas a digestão nitroperclórica diluindo a digestão em 5x Os íons residuais de Cu2 Cr6 e Ni 2 no sobrenadante foram medidos por um espectrofotómetro de absorção atômicaAAS após centrifugação a 10000 xg durante 10 min Análises de biossorção foram constituídas por uma concentração inicial de Cu2 Cr6 e Ni 2 de 500 mg L1 com concentrações de células que variaram 56 Figura 2 Diagrama de Venn screening de isolados resistentes a metais nas concentrações de 50 mg L1 de Cobre Cromo e Níquel 35 Desafio de resistência a metais Microrganismos que se desenvolvem em concentrações de metais mesmo que vestigiais e diferentes metais tem características susceptíveis para uma possível aplicação em biorremediação Os 13 isolados que compartilharam resistência aos diferentes metais cobre cromo e níquel foram desafiados a concentrações de 100 a 500 mg L1 Os resultados dos experimentos de desafio de resitencia a a metais destes isolados revelaram que apenas seis isolados MF10 CR06 CR11 CP15 CP16 e ME02 apresentaram maior resistência 500mgL1 Tabela 1 57 Tabela 1 Desafio de resistência para cobre cromo e níquel em concentrações variáveis de 100 a 500 mgL1 para 13 isolados dos diferentes ecosssitemas Mata Floresta MF Cerrado CE Capim CP Mata Eucalipto ME e Canga CG Desafio de Resistência a Metais Cu2 mg L1 Cr3 mg L1 Ni3 mg L1 Isolados 100 150 250 500 100 150 250 500 100 150 250 500 CE02 MF10 CE04 CE05 CE11 CP07 CP12 CP15 CP16 ME02 CG10 MF14 MF08 desenvolvimento bacteriano ausência de desenvolvimento bacteriano 36 Caracterização dos isolados por sequenciamento do gene 16S rDNA Os seis isolados resistentes para concentrações de até 500 mg L1 de Cu2 Cr3 e Ni3 do ensaio de diferentes concentrações de metal foram selecionados pera amplificação e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA Analisando o resultado do sequenciamento averiguando a qualidade dos dados onde foram cortadas bases com qualidade Phred inferior a 20 estes foram submetidos ao programa Classifier do banco RDPII Dentre os 6 isolados selecionados quanto a resistência aos metais cobre cromo e níquel o isolado CP15 quando analisado pelo Classifier mostrou resultado para Serratia sp o isolado MF10 para o gênero Stenotrophomonas pertencente a classe Gammaproteobacteria Os isolados ME02 e CP16 58 apresentou resultado para Burkulderia sp e o isolado CE11 para o gênero Artrobacter 37 Curva de crescimento bacteriano Avaliou se a capacidade de desenvolvimento dos microrganismos nas duas condições de cultivo considerando que o tempo de desenvolvimento é influenciado de maneira direta pela capacidade nutricional do meio bem como as condições físicas de incubação Todos os isolados selecionados apresentam crescimento rápido comum início da fase exponencial a aproximadamente 30h para os isolados MF10 e CP15 já para os isolados CE05 CP16 e ME02 esta fase tem início em torno de 18h Figura 3 O isolado CE11 apresentou crescimento menos exponencial atingindo a fase exponencial próximo a 18h seguido por uma fase exponencial próxima a 48 h semelhante aos demais isolados enquanto que o isolado CP15 apresentou fase exponencial próximo a 96h devido ao meio PGE conter grande concentração de glicose que propiciaram bom desenvolvimento para as bactérias de crescimento lento e reduzindo a influência dos metais no desenvolvimento 59 Figura 3 Curva de crescimento dos microrganismos A MF10 B CE05 C CP15 D CP16 E CE11 e F ME02 leituras em DO600nm em meios PGE e meios PGE suplementado com 500 mg L1Cobre Cu2 Cromo Cr6 e Níquel Ni2 as figuras foram geradas pelo programa Sigmaplot A B C D E F 60 38 Imobilização de Metais 381 Biossorção de metais Os seis isolados selecionados para o estudo MF10 CE05 CP15 CP16 CR11 e ME02 apresentaram capacidade de se desenvolver em concentrações consideradas altas 500 mg L1 sugerindo uma boa aplicação para biorremediação Em testes de remoção de Cobre através dos 6 isolados expostos a 500 mg L1 pode se observar que quatro deles CP16 CR11 ME02 e CR05 apresentaram boa porcentagem de biossorção de metais em tempos iniciais do cultivo Figura 4 48 h 96 h e 144 h com valores próximos há 96 Desta maneira sendo bactérias com boa capacidade imobilizar íons metálicos em um pequeno período de tempo Vale destacar o isolado CP15 que também possui grande potencial de biossorção nos diferentes tempos de exposição até mesmo no tempo 192 h onde possivelmente deve ter uma saturação de sítios de ligação Figura 4 Porcentagem de biossorção de Cu2 em sobrenadante dos cultivos dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 Microrganismos isolados da região de mineração localizada em Sabará MG apresentaram taxas significativas para remoção de níquel Figura 5 Os isolados CR11 ME02 CR05 e MF10 apresentaram valores próximos de 94 de 61 remoção de metais em tempos iniciais de desenvolvimento vale destacar o isolado CP16 que apresentou 96 de taxa de remoção em 48 h de cultivo e valores próximos de 94 nos demais tempos supondo um processo é rápido e de baixo gasto de energia O isolado CP15 merece destaque para processos de biossorção de níquel ao londo de todos os tempos de desenvolvimento Figura 4 Figura 5 Porcentagem de biossorção de Ni2 em sobrenadante dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 Os microrganismos isolados e submetidos a testes de remoção de cromo destacaramse pelos autos valores de remoção de metais em diferentes tempos de desenvolvimento vale ressaltar a capacidade de remoção dos isolados CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 em tempos iniciais de desenvolvimento no período de 48 há 144 horas com taxas de remoção próximas a 98 apesar da boa biossorção este processo não é tão eficiente ao longo do tempo já o isolado CP15 apresenta taxas de 96 em diferentes tempos de desenvolvimento Figura 6 62 Figura 6 Porcentagem de biossorção de Cr6 em sobrenadante dos cultivos dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 analisados nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 382 Acumulação de metais por células Em análises complementares e comparativas foram feitas análises de remoção ativa estes ensaios foram feitos á partir de avaliações pelo pellet de células Dentre os seis isolados estudos três deles merecem destaque CE11 CE05 e MF10 que apresentam valores elevados de acumulação de cobre e niquel a 192 h de desenvolviemnto Figura 7 e 9 estes isolados responderam bem uma vez que este processo é caracterizado por ser lento e dependente do metabolismo O isolado CP15 apresenta boa acumulação de metais conctante ao longo do tempo de exposição entretando com boa eficiência em tempos menores de exposição Os micorganismos apresentaram boas taxasr de bissorção para todoas os metais testatos entetanto para acumulação os valores foram bem mais baixos uma vez que são processos dependnetes do metabolismo e mais lentos por isso os altos valores nos ultimos tempos de desenvolvimento Entretanto o CP15 realiza processos ativos e passivos independentes do tempo de exposição sendo uma boa alterantiva pela rapidez com que realiza a remoção de metais 63 Figura 7 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meios suplementado com 500 mg L1 de Ni2f para os isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192 com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 Figura 8 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meio suplementado com 500 mg L1de Cu2 dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 ab cd e ef ef ef a d ef ef ef f bc e ef ef ef f cd e ef ef ef f 000 020 040 060 080 100 120 CP15 CP16 CR11 ME02 CR05 MF10 Bioacumulação de Ni2 mgL1 48h 96h 144h 192h a ab bcd defg fghij ghij ab ab bcd defgh ghij hij ab abc cde defgh ghij ij ab abc cdef efghi ghij j 000 020 040 060 080 100 120 CP15 CP16 CR11 ME02 CR05 MF10 Bioacumulação Cu2 mgL1 48h 96h 144h 192h 64 Figura 9 Bioacumulação em células bacterianas cultivados em meios suplementado com 500 mg L1 de Cr6 dos isolados CP15 CP16 CE11 ME02 CE05 e MF10 nos tempos 48h 96h 144h 192h com análise estatística ANOVA e Tuckey 05 4 DISCUSSÃO O solos é um dos ambientes terrestres com maior riqueza de microrganismos cultiváveis com características biotecnológicas importantes BALDRIAN et al 2012 A diversidade microbiana do solo é uma característica importante para uma exploração biológica sustentável uma vez que os microrganismos apresentam características biotecnológicas como enzimas para aplicação industrial metabolismo intracelular para remoção de metais de ambientes afetados tanto por acidentes ambientais quanto por contaminação BAI et al 2014 A comunidade microbiana alocada em regiões com altas concentrações de metais apresenta uma série de características adaptativas Genes que conferem resistência a metais como por exemplo chrA copA copB copC nixA que também são genes importantes no processo de influxo e efluxo de metais pesados para uma possível aplicação na área de biorremediação STUDIES AUTHOR 2013 Os microrganismos isolados dos diferentes ecossistemas de Sabará apresentaram capacidade de se desenvolver em meio de cultivo a ab bcd defg ghij hij ab ab bcd defgh ghij hij ab abc cde defgh ghij ij ab abc cdef efghi ghij i 000 020 040 060 080 100 120 CP15 CP16 CR11 ME02 CR05 MF10 Bioacumulação Cr6 mgL1 48h 96h 144h 192h 65 contendo metais como cobre cromo e níquel sendo assim um indicio para aplicação em processos de remoção e acumulação de metaisVELACANO CASTELLANOHINOJOSA VIVAS 2014 Metais pesados em geral normalmente são tóxicos aos organismos vivos alguns microrganismos apresentam mecanismos de membrana que conferem resistência a íons metálicos DAS VIMALA KARTHIKA 2008b Os microrganismos isolados da região do perímetro do quadrilátero ferrífero apresentaram capacidade de se desenvolver 500 mg L1 Tabela 1 concentrações estas utilizadas em trabalhos para selecionar microrganismos com potencial para biossorção e biorremoção de metais MAHRAJBNE MAHRAGBNE 1998 Microrganismos com essa alta sensibilidade apresentam mecanismos genotípicos e fenotípicos como as proteínas de membrana que promovem resistência a metais e mediando o processo de entrada e saída dos metais ou seja regulam a porta de entrada para estes compostos que podem ser auxiliares a maquinaria metabólica das células CHIEN et al 2008 Estudos de Chien e colaboradores 2013 com isolados de resíduos industriais e de águas contaminadas sugerem que bactérias tolerantes a concentrações de cobre apresentava potencial para biorremediação pois utilizam o cobre como cofatores para o metabolismo CHAZARENC BRISSON MERLIN 2010 KUMARAN SUNDARAMANICKAM BRAGADEESWARAN 2011 Contudo bactérias com capacidade de se desenvolver na presença de metais apresentam mecanismos metabólicos para manutenção celular que adicionalmente podem ser utilizados para biorremediação de metais Entretanto nem todos os microrganismos apresentam mecanismos de resistência a diferentes metais Contudo microrganismos com mecanismos de resistência a diferentes metais tem possível aplicação no meio ambiente para recuperação de áreas degradas pela deposição de metais KLAUSJOERGER et al 2001 Entre essas características adaptativas desenvolvidas pelos microrganismos como mecanismos de sobrevivência existem fatores genotípicos como genes que codificam proteínas de membrana e são de extrema importância para vida em áreas em condições extremas estas proteínas além 66 de conferirem resistência são proteínas que também são auxiliares nos mecanismos de influxo e efluxo de metais microrganismos com boa capacidade de imobilizar metais como o dos dados apresentados podem sim apresentar genes importantes para o processo Considerando a temática de métodos alternativos para recuperação de áreas sob ação antropogênica ou até mesmo vítimas de acidentes ambientais a utilização de toda essa abundancia de diversidade microbiana do solo técnicas tradicionais de isolamento são alternativas perspicazes para isolar e selecionar microrganismos com maior tolerância aos metais pesado para possíveis aplicações biotecnológicas 5 CONCLUSÃO Analisando os resultados do presente trabalho os dados revelam que a microbiota do solo apresenta microrganismos com capacidade para aplicação nos processos de biorremediação íons metálicos cobre cromo e níquel A elevada taxa de remoção de metais além dos altos valores de acumulação intracelular apresentado pelos isolados dando destaque para os gêneros Burckholderia Arthrobacter e Bacillus que apresentaram boa remoção e boa interiorização de metais tendo possíveis evidências de os microrganismos apresentam maquinaria metabólica necessária para uma possível aplicação ao processo de biorremediação de metais Os dados apresentados neste trabalho juntamente com outros esforços para a preservação ambiental pode ser uma contribuição importante para a humanidade visando diminuir os impactos provocados por atividades antropogênicas tornando possível o desenvolvimento com sustentabilidade 67 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACCESS O Biodegradation v 5 n 3 p 810 2014 ACID B et al Microbial Community Analysis Microbial Community Analysis p 12 sd ALEX M et al O quadrilátero ferrífero e o norte de minas gerais análise da história e importância econômica p 116 2012 ALTIMIRA F et al Characterization of copperresistant bacteria and bacterial communities from copperpolluted agricultural soils of central Chile BMC microbiology v 12 p 193 jan 2012 AMBIENTAL T et al USO DE MICROORGANISMOS PARA A BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES IMPACTADOS n 6 p 9951006 2012 ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biolixiviação Utilização de Micro organismos na Extração de Metais sl sn ARORA P K SRIVASTAVA A SINGH V P Novel degradation pathway of 4 chloro2aminophenol via 4chlorocatechol in Burkholderia sp RKJ 800 Environmental science and pollution research international v 21 n 3 p 2298304 fev 2014 AURÉLIO M PINHO C DE FILHO P Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado p 28 2010 BAI J et al Biosorption mechanisms involved in immobilization of soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multimetalcontaminated soil Journal of environmental sciences China v 26 n 10 p 205664 1 out 2014 BALDRIAN P et al Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition The ISME journal v 6 n 2 p 24858 fev 2012 BICKEL S TANG K GROSSART H Structure and function of zooplankton associated bacterial communities in a temperate estuary change more with time than with zooplankton species Aquatic Microbial Ecology v 72 n 1 p 115 7 mar 2014 BRANDER S MIKKELSEN J D KEPP K P TtMCO A highly thermostable laccaselike multicopper oxidase from the thermophilic Thermobaculum terrenum Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic v 112 p 5965 2015 68 CAMPBELL C D GRAYSTON S J HIRST D J Methods Use of rhizosphere carbon sources in sole carbon source tests to discriminate soil microbial communities v 30 p 3341 1997 CHÁVEZ L F ESCOBAR L F ANGHINONI I Diversidade metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de integração lavoura pecuária sob intensidades de pastejo n 1 p 12541261 2011 CHAZARENC F BRISSON J MERLIN G Seasonal and Spatial Changes of Microorganism Communities in Constructed Wetlands A Community Level Physiological Profiling Analysis International Journal of Chemical Engineering v 2010 p 16 2010 CHEN S et al Influence of coexisted benzoapyrene and copper on the cellular characteristics of Stenotrophomonas maltophilia during biodegradation and transformation Bioresource Technology v 158 p 181187 2014 CHIEN C et al Microbial diversity of soil bacteria in agricultural field contaminated with heavy metals Journal of Environmental Sciences v 20 n 3 p 359363 jan 2008 COSTA P S et al Metagenome of a microbial community inhabiting a metal rich tropical stream sediment PloS one v 10 n 3 p e0119465 jan 2015 DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview v 7 n April p 159169 2008a DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview Indian Journal of Biotechnology v 7 n 2 p 159169 2008b DAS P MUKHERJEE S SEN R Improved bioavailability and biodegradation of a model polyaromatic hydrocarbon by a biosurfactant producing bacterium of marine origin Chemosphere v 72 n 9 p 122934 jul 2008 DE N Ufop cetec uemg 2006 FERNÁNDEZMONTIEL I et al Shortterm effects of simulated belowground carbon dioxide leakage on a soil microbial community International Journal of Greenhouse Gas Control v 36 p 5159 2015 FINN R D et al Pfam The protein families database Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 222230 2014 FOMINA M GADD G M Biosorption current perspectives on concept definition and application Bioresource technology v 160 p 314 maio 2014 GADD G M Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization Current Opinion in Biotechnology v 11 n 3 p 271279 2000 69 GOMEZ E FERRERAS L TORESANI S Soil bacterial functional diversity as influenced by organic amendment application Bioresource technology v 97 n 13 p 14849 set 2006 GRYTA A FRĄC M OSZUST K The Application of the Biolog EcoPlate Approach in Ecotoxicological Evaluation of Dairy Sewage Sludge Applied Biochemistry and Biotechnology v 174 n 4 p 14341443 2014 HAKULINEN N ROUVINEN J Threedimensional structures of laccases Cellular and Molecular Life Sciences v 72 n 5 p 857868 2015 HAMMER Ø HARPER D A T RYAN P D Paleontological statistics software package for education and data analysis Palaeontologia Electronica v 4 n 1 p 918 2001 HUGENHOLTZ P TYSON G W Metagenomics Nature v 455 n August 2006 p 481483 2008 HUNTER S et al EBI metagenomics A new resource for the analysis and archiving of metagenomic data Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 600 606 2014 INÁCIO L ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biorremediação de Água Subterrânea Contaminada com Gasolina e Análise Molecular da Comunidade Bacteriana Presente sl sn ISLAM F S et al Role of metalreducing bacteria in arsenic release from Bengal delta sediments Nature v 430 n 6995 p 6871 1 jul 2004 KANG CH et al Bioremediation of lead by ureolytic bacteria isolated from soil at abandoned metal mines in South Korea Ecological Engineering v 74 p 402407 jan 2015 KLAUSJOERGER T et al Bacteria as workers in the living factory Metal accumulating bacteria and their potential for materials science Trends in Biotechnology v 19 n 1 p 1520 2001 KUMAR R et al Growth media composition and heavy metal tolerance behaviour of bacteria characterized from the subsurface soil of uranium rich ore bearing site of Domiasiat in Meghalaya v 12 n January p 115119 2013 KUMARAN N S R I SUNDARAMANICKAM A BRAGADEESWARAN S ABSORPTION STUDIES ON HEAVY METALS BY ISOLATED BACTERIAL STRAIN PSEUDOMONAS Sp FROM UPPANAR ESTUARINE WATER SOUTHEAST COAST OF INDIA v 6 n 4 p 471476 2011 LASHEEN M R AMMAR N S IBRAHIM H S Adsorptiondesorption of CdII CuII and PbII using chemically modified orange peel Equilibrium and kinetic studies Solid State Sciences v 14 n 2 p 202210 2012 70 LI LG et al Potentially novel copper resistance genes in copperenriched activated sludge revealed by metagenomic analysis Applied microbiology and biotechnology v 98 n 24 p 1025566 dez 2014 LIU X et al TiGER a database for tissuespecific gene expression and regulation BMC bioinformatics v 9 p 271 2008 LIU X et al Human health risk assessment of heavy metals in soilvegetable system A multimedium analysis Science of the Total Environment v 463 464 p 530540 2013 MAHRAJBNE C MAHRAGBNE C RESISTANCE OF E N V I R O N M E N T A l BACTERIA TO H E A V Y METALS v 64 p 715 1998 MAIA V O FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS BANCO DE SEMENTES DO SOLO EM ÁREAS DE MINERAÇÃO E 2014 MARGESIN R PŁAZA G A KASENBACHER S Characterization of bacterial communities at heavymetalcontaminated sites Chemosphere v 82 n 11 p 15831588 2011 MARMUR J A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro organisms Journal of Molecular Biology v 3 n 2 p 208IN1 1961 MÉNDEZGARCÍA C et al Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats Frontiers in Microbiology v 6 n May p 117 2015 MORETTI G et al Microbial community distribution and genetic analysis in a sludge active treatment for a complex industrial wastewater a study using microbiological and molecular analysis and principal component analysis Annals of Microbiology 2015 MORGAN X C HUTTENHOWER C Chapter 12 Human Microbiome Analysis v 8 n 12 2012 MYROLD D D ZEGLIN L H JANSSON J K The Potential of Metagenomic Approaches for Understanding Soil Microbial Processes Soil Science Society of America Journal v 78 n 1 p 3 2014 NGUYEN V H SHIM JJ Threedimensional nickel foamgrapheneNiCo2O4 as highperformance electrodes for supercapacitors Journal of Power Sources v 273 p 110117 2015 ONLINE V A Environmental Science Processes Impacts bioremediation based abolition of heavy metals p 180193 2014 PANICKER V P GOPALAKRISHNAN A Mini Review Article Metagenomics a Novel Tool to Unravel the Secrets of Nature v 2 n 6 p 312315 2014 71 PERSPECTIVES C MICROBIOLOGY A Vigna mungo v 1 n 2 p 110 2012 PIERCE M L WARD J E DOBBS F C False positives in Biolog EcoPlatesTM and MT2 MicroPlatesTM caused by calcium Journal of microbiological methods v 97 p 204 fev 2014 POWELL S et al eggNOG v40 nested orthology inference across 3686 organisms Nucleic Acids Research v 42 n D1 p D231D239 2014 RELACIONADOS A et al O QUADRILÁTERO FERRÍFERO MG BRASIL ASPECTOS SOBRE SUA HISTÓRIA SEUS RECURSOS MINERAIS E PROBLEMAS v 18 n 1 p 3337 2010 REZENDE É A AUGUSTO A SALGADO R MAPEAMENTO DE UNIDADES DE RELEVO NA MÉDIA SERRA DO ESPINHAÇO MERIDIONAL MG p 45 60 2011 SCHLOTER M DILLY O MUNCH J Indicators for evaluating soil quality Agriculture Ecosystems Environment v 98 n 13 p 255262 set 2003 SILVER S Bacterial resistances to toxic metal ions A review Gene v 179 n 1 p 919 1996 STUDIES I AUTHOR C HEAVY METAL TOLERANCE OF THREE DIFFERENT BACTERIA ISOLATED FROM v 2 n 2 p 137147 2013 SZYMAŃSKA S PIERNIK A HRYNKIEWICZ K Metabolic potential of microorganisms associated with the halophyte Aster tripolium L in saline soils Ecological Questions v 18 n 1 p 919 1 jan 2013 TARTAGLIA M et al Gainoffunction SOS1 mutations cause a distinctive form of Noonan syndrome Nature genetics v 39 n 1 p 7579 2007 THIJS S et al Potential for plant growth promotion by a consortium of stress tolerant 24dinitrotoluenedegrading bacteria isolation and characterization of a military soil Microbial biotechnology v 7 n 4 p 294306 2014 TSEZOS M Biosorption of metals The experience accumulated and the outlook for technology development Hydrometallurgy v 59 n 23 p 241243 fev 2001 UCHIYAMA T MIYAZAKI K Functional metagenomics for enzyme discovery challenges to efficient screening Current Opinion in Biotechnology v 20 n 6 p 616622 2009 URAKAWA H et al Shifts of Bacterioplankton Metabolic Profiles along the Salinity Gradient in a Subtropical Estuary ISRN Oceanography v 2013 p 1 12 2013 72 VARAJAO S A R A C A QUESTÃO DA CORRELAÇÃO DAS SUPERFÍCIES DE EROSÃO DO QUADRILÁTERO FERRÍFERO MINAS GERAIS v 21 n 2 p 138145 1991 VELACANO M CASTELLANOHINOJOSA A VIVAS A F Effect of Heavy Metals on the Growth of Bacteria Isolated from Sewage Sludge Compost Tea n August p 644655 2014 WANI P A AYOOLA O H Bioreduction of Cr VI by Heavy Metal Resistant Pseudomonas Species n Vi p 19 2015 WEBER K P et al Data transformations in the analysis of communitylevel substrate utilization data from microplates Journal of microbiological methods v 69 n 3 p 4619 jun 2007 WEISBURG W G et al 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol v 173 p 697703 1991 WHITE C SAYER J A GADD G M Microbial solubilization and immobilization of toxic metals key biogeochemical processes for treatment of contamination FEMS microbiology reviews v 20 n 34 p 50316 jul 1997 XIA X et al On the role of surface diffusion in determining the shape or morphology of noblemetal nanocrystals Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 110 n 17 p 6669 73 2013 ZOU R et al Threedimensional networked NiCo 2 O 4 MnO 2 branched nanowire heterostructure arrays on nickel foam with enhanced supercapacitor performance J Mater Chem A v 3 n 4 p 17171723 2015 73 CAPÍTULO 4 Prospecção in silico de genes ortólogos envolvidos em processos de resistência e remoção de metais em metagenomas de ecossistemas da região de Sabará MG RESUMO Muito tem se investido em busca de alternativas para recuperação de áreas afetadas por fatores antropogênicos e desastres naturais para tanto este trabalho descreve a composição funcional de uma comunidade microbiana quanto a aplicação em biorremediação de metais de solos do Centro de biodiversidade CEBIO Sabará localizada no Quadrilátero Ferrífero maior polo de mineração no Brasil Solos de cinco ecossistemas Campo Rupestre Canga Campo de Gramíneas Capim Cerrado Mata Floresta e Mata Eucalipto foram submetidos ao sequenciamento do DNA total após todo o processamento e análise de bioinformática foi montado um banco de dados com informação gênica e funcional onde foi realizado uma prospecção por busca de similaridade de genes ortólogos importantes em mecanismos de resistência e metabolismo de metais uma vez que solos desta região apresentam grande quantidade de metal Adicionalmente forma feitas a seleção de contigs para avliar a filiação taxonômica para os genes amplamente distribuídos nos dados de anotação Nos diferentes ecossistemas foi possível encontrar ORFs de genes importantes envolvidos no processo de remoção de cobre cromo níquel entre outros metais Vale salientas a presença de filos bacterianos importantes como proteobacterias firmicutes acidobateria entre outros gêneros estes que englobam bactérias amplamente utilizadas em processos de imobilização de metais a partir de processos metabólicos ou independentes sendo assim os dados de anotação dos ecossistemas de Sabará apresentam grande potencial para prospecções mais profundas para aplicação em processos alternativos de recuperação de áreas Palavras chave Genes metagenoma prospecção metabolismo de metais e biorremediação 74 CHAPTER 4 Prospecting in silico of orthologous genes involved in processes of resistance and removal of metals in metagenomas of ecosystems in Sabara MG ABSTRACT Much has been invested in the search for alternatives for recovery of areas affected by anthropogenic factors and natural disasters therefore this work describes a functional composition of microbial community and the application in bioremediation of metals the Biodiversity Centre CEBIO soil Sabara located in the Iron Quadrangle the largest mining pole in Brazil Soils five ecosystems Cave Course Canga Grasses Field grass Cerrado Mata Forest and Forest Eucalyptus were subjected to sequencing of the total DNA after all processing and bioinformatics analysis was set up a database with information gene and functional where a survey was conducted by the search similarity of important gene orthologs resistance mechanisms and metabolism metals since this region soils present a large amount of metal Additionally way made the selection of contigs for avliar membership taxonomic genes distributed in the annotation data In the different ecosystems ORFs were found important genes involved in the copper removal process chromium nickel and other metals It salientas the presence of important bacterial phyla as Proteobacteria Firmicutes acidobateria among other genres these that include bacteria widely used in metal immobilization processes from metabolic or independent processes thus annotation data Sabara ecosystems present great potential for deeper prospects for application to alternative processes for recovery areas Keywords Genes metagenome prospecting bioremediation of metals and metabolism 75 1 INTRODUÇÃO O crescimento econômico e industrial de muitos países em desenvolvimento colaborou para o aumento na liberação de metais devido alta toxicidade destes compostos se tornado um grave problema ambiental GEGAN2014 A liberação destes compostos nos solos pode ser de maneira natural como por exemplo tragédias naturais alto nível de chuvas entretanto a maior incidência destes compostos em solos e águas são resultado de atividades antrópicasCAMPBELL GRAYSTON HIRST 1997 A busca por alternativas para recuperação destas áreas tem aumentado exponencialmente uma vez que o próprio ecossistema oferece subsidio necessário para utilização nestes processos visto a ampla distribuição de espécies procarióticas em diferentes ambientes naturais como solo água plantas e seres vivos INÁCIO ANTONIO ELIAS 2012 Estas espécies bacterianas têm se revelado de grande importância para manutenção do equilíbrio ecológico destes ambientes Devido a esta grande importância para manutenção da saúde ambiental bem como aplicação biotecnológica da funcionalidade da comunidade bacteriana grandes esforços estão sendo dispensados para caracterizar a comunidade microbiana dentre eles a metagenômica KANG et al 2015 A metagenômica surge como ferramenta auxiliar para busca de genes envolvidos em processos de biorremediação uma vez que é possível acessar toda a diversidade bacteriana e funcional de diferentes ecossistemas através do DNA total UCHIYAMA MIYAZAKI 2009 Esta técnica nos últimos tempos tornouse ainda mais promissora com as tecnologias de sequenciamento de última geração que por meio do DNA total pode se obter um elevado rendimento ou seja um grande número de sequências e assim acessar de maneira mais ampla e rápida toda a funcionalidade de ecossistemas AURÉLIO PINHO FILHO 2010 Esta metodologia vence as limitações das abordagens tradicionais como PCR isolamento entre outras proporcionando maior visibilidade para avaliar a comunidade microbiana através da diversidade como acessar toda a informação 76 funcional contida nos ecossistemas PANICKER GOPALAKRISHNAN 2014 No presente trabalho foi realizada a prospecção de genes de resistência e genes importantes no metabolismo de influxo de efluxo de metais através de um banco de dados montados a partir de sequenciamento total de solos de cinco ecossistemas da região de Sabará Os resultados revelados neste estudo irão proporcionar uma visão da funcionalidade da microbiota destes ecossistemas para uma possível aplicação em processos alternativos de remoção de metias 2 MATERIAL E MÉTODOS 21 Seleção de sequências Sequências de genes envolvido no metabolismo de metal resistência a metais Figura1 foram extraídas do banco de dados NCBI posteriormente as sequências foram submetidas no banco de ortólogos eggNOG POWELL et al 2014 Figura 1 Genes envolvidos cem processos metabólicos e de resistência a metal 22 Prospecção As sequências foram prospectadas in silico realizando uma busca por similaridade utilizando o programa Blast Altschul et al 1990 as ORFs Open Reading Frames que apresentaram similaridade com evalue 30 no banco de dados Metagenômico MVDB do Laboratório de Bioquímicas e Microrganismos 77 de Plantas LBMP contendo dados de sequenciamento montagem e anotação do metagenoma total dos ecossistemas estudados As ORFs com similaridade foram filtradas e selecionadas para que não houvese repetição entre os ecossistemas os valores obtidos foram normalizados por um fator de normalização que consiste na divisão do número de ORFs total de cada ecossistema pelo número de ORFs total do ecossistema mais significativo o valor obtido multiplicado pelo número de ORFs encontradas para cada gene posteriormente foram identificadas e selecionados dos diferentes ecossistemas e estas foram anotadas verificando seus domínios no banco Pfam FINN et al 2014 após a verificação da anotação das ORFs algumas foram escolhidas aleatoriamente para serem alinhadas pelo ClustalW para visualizar os motivos e domínios de acordo com o banco Pfam FINN et al 2014 e Tiger LIU et al 2008 Figura 2 23 Análise estatística As ORFs identificadas foram analisadas com relação aos seus ecossistemas utilizando o programa Circos realizando um agrupamento hierárquico pelo software R e análises estatísticas de análise de componentes principais PCA com a ferramenta PAST 3 HAMMER HARPER RYAN 2001 Figura 2 Fluxograma metodológico 78 3 RESULTADOS Os genes relacionados nas vias metabólicas para os metais como cobre cromo e níquel copA copB cueO chrA chrC cusA cusB e nixA foram prospectados in silico no banco metagenômico do LBMP distribuídos entre os resultados de montagemanotações dos ecossistemas Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga Da porcentagem total de ORFs anotadas para estes ecossistemas foi de 01 a 06 correspondendo para ORFs relacionadas aos genes de resistência onde no sequenciamento total para Mata Floresta houve uma maior porcentagem do total de ORFs para os genes estudados seguido por Mata Eucalipto Cerrrado Canga e Capim Figura 3 Figura 3 Porcentagem de ORFs do total de ORFs anotados para genes de resistência e de metabolismo de metal do banco Meteganômico MVDB LBMP Na distribuição de ORFs relacionados as vias metabólicas para os genes em estudo no metagenoma para Cerrado seguido por Mata Floresta foi verificado a grande incidência de sequências relacionadas a homeostase cusA e cusB de metais em células e genes relacionados a resistência a metabolismo de cobre apresentaram distribuição semelhante para o metagenoma para Mata 79 Floresta e Cerrado genes relacionados a metabolismo de crômio foram presentes nas análises in silico do banco Metagenômico MVDB LBMP Tabela 1 Tabela 1 Número de ORFs encontradas no banco Metagenômico MVDB do Laboratório de Bioquímica e Microrganismos de Planta para os genes de resistência a metais níquel oxidase nixA multicooper oxidase ATPase copA cromato oxidase chrA cooper oxidase cueO multicooper oxidase ATPase like copB Número de ORFS Genes Cerrado CE Canga CG Capim CP Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF chrA 112 115 7 91 260 chrC 76 88 11 47 166 copA 101 112 5 73 197 copB 580 162 14 206 537 cueO 45 106 19 63 176 cusA 175 128 6 81 306 cusB 103 55 11 38 253 nixA 29 55 3 23 59 Os dados de anotação do metagenoma do banco Metagenômico MVDB LBMP das regiões de Sabará MG para o gene copB envolvido no processo de resistência e influxo e efluxo de metais foi amplamente distribuído na identificação de ORFs nos metagenomas de Cerrado e Mata Floresta entretanto para copA e cueO que exerce uma função semelhante ao gene copB as ORFs foram identificadas em números distribuídos entre Canga seguido por Mata Eucalipto Figura 3 Para genes codificadores do cromato oxidase crhA e cromato transporter chrC as ORFs foram identificadas para os metagenomas de maneira bastante semelhantes para os ecossistemas Mata Floresta Cerrado Canga e Mata Eucalipto O ecossistema campo rupestre Canga e Mata Floresta apresentaram grande distribuição de ORFs para genes que conferem resistência a níquel Figura 4 80 Figura 4 Distribuição de ORFs para os genes copA copB cueO chrA chrC cusA cusB e nixA para o total de ORFs nos cinco ecossistemas Cerrado CE Capim CP Canga CG Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF Os dados foram visualizados através do software Circos o comprimento das barras tal como no anel exterior foi representa na porcentagem de genes em cada ecossistema Na análise de componentes principais ORFs relacionadas a resistência e homeostase de cromo chrC níquel nixA e cobre copA foram agrupados e direcionados para o ecossistema campo rupestre Canga já para genes com característica funcional semelhante os agrupamentos apresentaram correlação ara Mata Eucalipto Figura 4 Genes responsáveis pelo influxo e efluxo de 81 metais nas células se agruparam de maneira extrema e se correlacionam com diferentes ecossistemas sendo eles Mata Floresta cusB e Cerrado para cusA Figura 5 Figura 5 Análise de componentes principais de cinco ecossistemas As sequências das ORFs encontradas nos ecossistemas foram todas re anotadas de acordo com o domínio do Pfam pela plataforma WebMGA Wu et al 2011 sequências para as ORFs copA apresentaram domínios para multicooper oxidase do tipo ATPase copB e cueO para multicooper oxidas Tabela S1 Para genes envolvidos no processo de metabolismo e resistência a cromo apresentaram domínios para cromato oxidase e cromato transporte respectivamente Os contigs selecionados foram submetidos analise de filiação taxonômica dentre os filos bacterianos mais abundardes estão as Proteobacterias seguido pela Actinobacteria Acidobateria Firmicutes e Planctomices Os genes estão amplamente divididos pelos filos bacterianos destacandose para os genes cusA cusB copA e copB 82 Figura 6 Distribuição de filo bacteriano para os genes copA copB cueO chrA chrC cusA cusB e nixA para os contigs dos cinco ecossistemas Cerrado CE Capim CP Canga CG Mata Eucalipto ME Mata Floresta MF Os dados foram visualizados através do software Circos o comprimento das barras tal como no anel exterior foi representa na porcentagem de genes em cada ecossistema 83 Algumas sequências foram selecionadas ao acaso e comparadas com banco de dados de proteína os genes copA de algumas sequências de ecossistema como floresta cerrado e eucalipto apresentaram regiões conservadas com uma cupredoxina redutase Figura 5 Dentre as regiões conservadas é possível observar um sitio de ligação a cobre e um deles é caracterizado pela presença de uma região conservada para as histidinas H e sitio de repetição Figura 7 Figura 7 Alinhamento múltiplos pelo software ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene copA para resistência de cobre com ORFs do banco Metagenômico MVDB do LBMP dos cinco ecossistemas mata floresta mata eucalipto cerrado capim e canga sendo que as colunas em negrito demonstram as regiões conservadas de acordo com o banco PFAM a seta indica o sítio de ligação ao cobre Acidobacterium capsulatum ACO33430 Acetobacter pasteurianus BAI12244 Xanthomonas citri ADR70747 Enterobacter cloacae KGB08036 e Pseudomonas sp ABR10510 As ORFs para copA em comparação aos resultados encontrados no banco Pfam se dividiram em dois grupos sendo reanotadas como cupredoxina redutase e como as multicooper ATPase ambas representantes das famílias das lacases apresentando característica quanto ao metabolismo de cobre observando no alinhamento as regiões conservadas Figura 8 sugerindo que este perfil descreve ATPases de tipo IB2 sendo proteínas com sitios de ligação de cadmio e cobre responsável por processos de transporte de íons de ferro 84 Figura 8 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW com sequências do banco NCBI para o gene copA para multi cooper oxidase ATPse e com sequências de metagenoma dos cinco ecossistema Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as coluna colorias demonstram as regiões conservadas de acordo com o banco de PFAM Arthrobacter arilaitensis CBT74889 Pseudomonas alcaligenes GAD63322 Nitrosomonas europaea CAD84930 Acinetobacter radioresistens GAB76331 Streptococcus agalactiae CFV18308 Bacillus amyloliquefaciens AHZ17356 Paenibacillus mucilaginosus AEI44753 e Bacillus licheniformis AGN37932 Dentre os genes que conferem resistência a metal e realizam metabolismo de metais estão os genes chrA da cromato oxidas Nas análises de similaridade foi possível encontrar regiões conservadas para cromo oxidase quando comparado com sequências do banco PFAM para os motivos conservados FGG motivos caracteristicos para este gene Figura 9 85 Figura 9 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene chrA cromato oxidase com sequencias de metagenoma dos cinco ecossistemas Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as colunas coloridas demonstram as regiões conservadas de acordo com sequências do banco de dados PFAM a seta indica o sitio de ligação ao cromo Enterobacter cloacae KGB07959 Pseudomonas fluorescens AEV63938 Stenotrophomonas maltophilia CCH12056 Paenibacillus mucilaginosus AEI41168 Pseudomonas sp CBL87892 e Bradyrhizobium sp EGP06243 Foram encontradas ORFs para os genes nixA em comparação com os bancos de dados para proteína observandose que as sequências apresentam similaridade com as nicO Figura 10 níquel transporte que apresenta alta afinidade com transportadores de níquel ZOU et al 2015 86 Figura 10 Alinhamento múltiplos pelo programa ClustalW de sequências do banco NCBI para o gene nixA nicO e sequências de metagenoma dos cinco ecossistemas Mata Floresta Mata Eucalipto Cerrado Capim e Canga sendo que as sequências em colorido demonstram as regiões conservadas de acordo com sequências do banco PFAM Enterobacter hormaechei EGK58005 Bradyrhizobium sp KJC38418 Burkholderia multivorans BAG44386 Mesorhizobium opportunistum AEH89926 Bacillus thuringiensis KKB31485 Bacillus cereus KLA20466 Paenibacillus sp CDN45006 4 DISCUSSÃO A comunidade microbiana dos solos desempenha um papel importante no solo através das interações entre os microrganismos atuando de maneira essencial nos ecossistemas visto a grande importância nos ciclos biogeoquímicos e em processos de recuperação ambiental ACCESS 2014 ACID et al2012 Solos de regiões localizadas no perímetro do Quadrilátero Ferrífero MG apresentam grande quantidade de metais sendo regiões de grande interesse para a extração de metais Estudos funcionais de sedimento de regiões localizadas em torno desta região apresentaram grande incidência de genes envolvido no metabolismo e resistência a metais ALTIMIRA et al 2012 AMBIENTAL et al 2012 ARORA SRIVASTAVA SINGH 2014 87 Os solos de regiões localizadas no perímetro do quadrilátero ferrífero apresentam solos com grandes concentrações de metais como ferro cobre cromo níquel zinco manganês entre outros sendo uma região de grande potencial para extração de minériosALEX et al 2012A incidência de genes que conferem resistência e metabolismo de metal pode ser uma indicativa para microrganismos com potencial para biorremediação bem como um potencial para prospecção de enzimas chaves que controlam o influxo e efluxo de metais pesados visto que a microbiota presente neste solo com características propicias para extração de diferentes metais e minérios pode ter apresentado adaptações metabólicas para a sobrevivência na região Microrganismos envolvidos me processos de biorremediação atualmente tem ampla utilização uma pela capacidade metabólica destes organismos vivos estes processos metabólicos são intermediados e rgulados por proteínas de membrana FOMINA GADD 2014 Existem uma serie de relatos de microrganismos que relaizam processos de biorremediação dentre eles organismos dos filos das proteobacterias como Artrobacter Enterobacter Bradyrhizobium mezorrhizonium bem como o filo Aciobacteria pelos Acidothiobacillus ferrodoxiam KARTHIKA 2008a estes processos são regulados genes que estão amplamente devidos dentre os filos e nos dados de anotação metagenômica dos cinco ecossistemas Dentre os genes de resistência a cobre encontrase a copA copB e cueO que se apresentam divididas como multicooper oxidase e multicooper oxidase ATPaselike e cupredoxina redutase As cupredoxinas apresentam características estruturais com sete folhas betas Estas proteínas estão amplamente divididas em famílias que permitem de três a seis sítios de ligação para cobre característica peculiar para as lacases e que são de extrema importância para enzimas aplicadas a biorremediação pois estes sítios de ligação a cobre e a outros metais determina um mecanismos de resistência por exportação que promove transporte de elétrons intercelulares BRANDER MIKKELSEN KEPP 2015 As ATPases além de conferirem resistência a cobre estas enzimas são umas das principais responsáveis pelo transporte de cobre pelas membranas 88 biológicas visto que são proteínas de membrana com características de proteínas tipo like que são proteínas que fazem o transporte de substância para a célula Estas proteínas transportadoras são encontradas em procariotos e eucariotos e que estas ATPases se encaixam neste grupo sendo membro importantes na maquinaria metabólica de íons metálicos de cobre na entrada saída e armazenamento HAKULINEN ROUVINEN 2015 O cromo se enquadra entre um dos metais pesados com maior ação tóxica para o meio ambiente microrganismos com mecanismos de resistência e proteínas de membrana com capacidade de manter a homeostase de metais na célula Os genes chrA e chrC codificam as enzimas cromato oxidase e cromato transporte enzimas importantes na manutenção da homeostase na célula além de conferir resistência a cromo As proteínas da família das transportadoras de níquel são encontradas em bactérias tanto gramnegativas como grampositivas Estas proteínas tem a capacidade de incorporar e absorver níquel sendo uma possível proteína de membrana integral com sete hélices transmembrana além de um transportador de cobalto NGUYEN SHIM 2015 Os dados apresentados revelam que a comunidade microbiana de solos de ecossistemas de Sabará MG tem características sugestivas para uma possível aplicação na biorremediação de metais visto que a anotação funcional revelou uma grande diversidade de genes de resistência a metal sugerindo uma adaptação metabólica dos microrganismos que vivem em solos com alta concentrações de metais Os resultados da prospecção in silico apresentados neste trabalho promove uma visão mais ampla da composição funcional in silico da microbiota dos solos com características para mineração de metais e assim aplicar esta comunidade microbiana como alternativa para recuperação ambiental 89 5 CONCLUSÃO Analisando os resultados do presente trabalho os dados revelam que a microbiota dos solos dos ecossistemas de Sabará MG apresenta microrganismos com características funcionais para uma possível aplicação em para biorremediação para os íons metálicos cobre níquel e cromo A busca de genes no banco de metagenoma total contendo informações de anotação gênica foi possível identificar genes de resistência aos metais além de genes envolvidos no metabolismo de influxo e efluxo de cobre cromo e níquel Este estudo fornece embasamento de um ecossistema quanto a sua microbiota indicando um possível papel para prospecção de enzimas e microrganismos aplicados no metabolismo e biorremoção de metais Os resultados apresentados neste trabalho juntamente com os avanços biotecnológicos e aumento da busca de alternativas para recuperação de ecossistemas afetados por compostos tóxicos para preservação ambiental tornando possível o desenvolvimento biotecnológico e ecologicamente sustentável 90 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACCESS O Biodegradation v 5 n 3 p 810 2014 ACID B et al Microbial Community Analysis Microbial Community Analysis p 12 sd ALEX M et al O quadrilátero ferrífero e o norte de minas gerais análise da história e importância econômica p 116 2012 ALTIMIRA F et al Characterization of copperresistant bacteria and bacterial communities from copperpolluted agricultural soils of central Chile BMC microbiology v 12 p 193 jan 2012 AMBIENTAL T et al USO DE MICROORGANISMOS PARA A BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES IMPACTADOS n 6 p 9951006 2012 ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biolixiviação Utilização de Micro organismos na Extração de Metais sl sn ARORA P K SRIVASTAVA A SINGH V P Novel degradation pathway of 4 chloro2aminophenol via 4chlorocatechol in Burkholderia sp RKJ 800 Environmental science and pollution research international v 21 n 3 p 2298304 fev 2014 AURÉLIO M PINHO C DE FILHO P Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado p 28 2010 BAI J et al Biosorption mechanisms involved in immobilization of soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multimetalcontaminated soil Journal of environmental sciences China v 26 n 10 p 205664 1 out 2014 BALDRIAN P et al Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition The ISME journal v 6 n 2 p 24858 fev 2012 BICKEL S TANG K GROSSART H Structure and function of zooplankton associated bacterial communities in a temperate estuary change more with time than with zooplankton species Aquatic Microbial Ecology v 72 n 1 p 115 7 mar 2014 BRANDER S MIKKELSEN J D KEPP K P TtMCO A highly thermostable laccaselike multicopper oxidase from the thermophilic Thermobaculum terrenum Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic v 112 p 5965 2015 91 CAMPBELL C D GRAYSTON S J HIRST D J Methods Use of rhizosphere carbon sources in sole carbon source tests to discriminate soil microbial communities v 30 p 3341 1997 CHÁVEZ L F ESCOBAR L F ANGHINONI I Diversidade metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de integração lavoura pecuária sob intensidades de pastejo n 1 p 12541261 2011 CHAZARENC F BRISSON J MERLIN G Seasonal and Spatial Changes of Microorganism Communities in Constructed Wetlands A Community Level Physiological Profiling Analysis International Journal of Chemical Engineering v 2010 p 16 2010 CHEN S et al Influence of coexisted benzoapyrene and copper on the cellular characteristics of Stenotrophomonas maltophilia during biodegradation and transformation Bioresource Technology v 158 p 181187 2014 CHIEN C et al Microbial diversity of soil bacteria in agricultural field contaminated with heavy metals Journal of Environmental Sciences v 20 n 3 p 359363 jan 2008 COSTA P S et al Metagenome of a microbial community inhabiting a metal rich tropical stream sediment PloS one v 10 n 3 p e0119465 jan 2015 DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview v 7 n April p 159169 2008a DAS N VIMALA R KARTHIKA P Biosorption of heavy metals An overview Indian Journal of Biotechnology v 7 n 2 p 159169 2008b DAS P MUKHERJEE S SEN R Improved bioavailability and biodegradation of a model polyaromatic hydrocarbon by a biosurfactant producing bacterium of marine origin Chemosphere v 72 n 9 p 122934 jul 2008 DE N Ufop cetec uemg 2006 FERNÁNDEZMONTIEL I et al Shortterm effects of simulated belowground carbon dioxide leakage on a soil microbial community International Journal of Greenhouse Gas Control v 36 p 5159 2015 FINN R D et al Pfam The protein families database Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 222230 2014 FOMINA M GADD G M Biosorption current perspectives on concept definition and application Bioresource technology v 160 p 314 maio 2014 GADD G M Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization Current Opinion in Biotechnology v 11 n 3 p 271279 2000 92 GOMEZ E FERRERAS L TORESANI S Soil bacterial functional diversity as influenced by organic amendment application Bioresource technology v 97 n 13 p 14849 set 2006 GRYTA A FRĄC M OSZUST K The Application of the Biolog EcoPlate Approach in Ecotoxicological Evaluation of Dairy Sewage Sludge Applied Biochemistry and Biotechnology v 174 n 4 p 14341443 2014 HAKULINEN N ROUVINEN J Threedimensional structures of laccases Cellular and Molecular Life Sciences v 72 n 5 p 857868 2015 HAMMER Ø HARPER D A T RYAN P D Paleontological statistics software package for education and data analysis Palaeontologia Electronica v 4 n 1 p 918 2001 HUGENHOLTZ P TYSON G W Metagenomics Nature v 455 n August 2006 p 481483 2008 HUNTER S et al EBI metagenomics A new resource for the analysis and archiving of metagenomic data Nucleic Acids Research v 42 n D1 p 600 606 2014 INÁCIO L ANTONIO L ELIAS R MBIENTAL Biorremediação de Água Subterrânea Contaminada com Gasolina e Análise Molecular da Comunidade Bacteriana Presente sl sn ISLAM F S et al Role of metalreducing bacteria in arsenic release from Bengal delta sediments Nature v 430 n 6995 p 6871 1 jul 2004 KANG CH et al Bioremediation of lead by ureolytic bacteria isolated from soil at abandoned metal mines in South Korea Ecological Engineering v 74 p 402407 jan 2015 KLAUSJOERGER T et al Bacteria as workers in the living factory Metal accumulating bacteria and their potential for materials science Trends in Biotechnology v 19 n 1 p 1520 2001 KUMAR R et al Growth media composition and heavy metal tolerance behaviour of bacteria characterized from the subsurface soil of uranium rich ore bearing site of Domiasiat in Meghalaya v 12 n January p 115119 2013 KUMARAN N S R I SUNDARAMANICKAM A BRAGADEESWARAN S ABSORPTION STUDIES ON HEAVY METALS BY ISOLATED BACTERIAL STRAIN PSEUDOMONAS Sp FROM UPPANAR ESTUARINE WATER SOUTHEAST COAST OF INDIA v 6 n 4 p 471476 2011 LASHEEN M R AMMAR N S IBRAHIM H S Adsorptiondesorption of CdII CuII and PbII using chemically modified orange peel Equilibrium and kinetic studies Solid State Sciences v 14 n 2 p 202210 2012 93 LI LG et al Potentially novel copper resistance genes in copperenriched activated sludge revealed by metagenomic analysis Applied microbiology and biotechnology v 98 n 24 p 1025566 dez 2014 LIU X et al TiGER a database for tissuespecific gene expression and regulation BMC bioinformatics v 9 p 271 2008 LIU X et al Human health risk assessment of heavy metals in soilvegetable system A multimedium analysis Science of the Total Environment v 463 464 p 530540 2013 MAHRAJBNE C MAHRAGBNE C RESISTANCE OF E N V I R O N M E N T A l BACTERIA TO H E A V Y METALS v 64 p 715 1998 MAIA V O FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS BANCO DE SEMENTES DO SOLO EM ÁREAS DE MINERAÇÃO E 2014 MARGESIN R PŁAZA G A KASENBACHER S Characterization of bacterial communities at heavymetalcontaminated sites Chemosphere v 82 n 11 p 15831588 2011 MARMUR J A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro organisms Journal of Molecular Biology v 3 n 2 p 208IN1 1961 MÉNDEZGARCÍA C et al Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats Frontiers in Microbiology v 6 n May p 117 2015 MORETTI G et al Microbial community distribution and genetic analysis in a sludge active treatment for a complex industrial wastewater a study using microbiological and molecular analysis and principal component analysis Annals of Microbiology 2015 MORGAN X C HUTTENHOWER C Chapter 12 Human Microbiome Analysis v 8 n 12 2012 MYROLD D D ZEGLIN L H JANSSON J K The Potential of Metagenomic Approaches for Understanding Soil Microbial Processes Soil Science Society of America Journal v 78 n 1 p 3 2014 NGUYEN V H SHIM JJ Threedimensional nickel foamgrapheneNiCo2O4 as highperformance electrodes for supercapacitors Journal of Power Sources v 273 p 110117 2015 ONLINE V A Environmental Science Processes Impacts bioremediation based abolition of heavy metals p 180193 2014 PANICKER V P GOPALAKRISHNAN A Mini Review Article Metagenomics a Novel Tool to Unravel the Secrets of Nature v 2 n 6 p 312315 2014 94 PERSPECTIVES C MICROBIOLOGY A Vigna mungo v 1 n 2 p 110 2012 PIERCE M L WARD J E DOBBS F C False positives in Biolog EcoPlatesTM and MT2 MicroPlatesTM caused by calcium Journal of microbiological methods v 97 p 204 fev 2014 POWELL S et al eggNOG v40 nested orthology inference across 3686 organisms Nucleic Acids Research v 42 n D1 p D231D239 2014 RELACIONADOS A et al O QUADRILÁTERO FERRÍFERO MG BRASIL ASPECTOS SOBRE SUA HISTÓRIA SEUS RECURSOS MINERAIS E PROBLEMAS v 18 n 1 p 3337 2010 REZENDE É A AUGUSTO A SALGADO R MAPEAMENTO DE UNIDADES DE RELEVO NA MÉDIA SERRA DO ESPINHAÇO MERIDIONAL MG p 45 60 2011 SCHLOTER M DILLY O MUNCH J Indicators for evaluating soil quality Agriculture Ecosystems Environment v 98 n 13 p 255262 set 2003 SILVER S Bacterial resistances to toxic metal ions A review Gene v 179 n 1 p 919 1996 STUDIES I AUTHOR C HEAVY METAL TOLERANCE OF THREE DIFFERENT BACTERIA ISOLATED FROM v 2 n 2 p 137147 2013 SZYMAŃSKA S PIERNIK A HRYNKIEWICZ K Metabolic potential of microorganisms associated with the halophyte Aster tripolium L in saline soils Ecological Questions v 18 n 1 p 919 1 jan 2013 TARTAGLIA M et al Gainoffunction SOS1 mutations cause a distinctive form of Noonan syndrome Nature genetics v 39 n 1 p 7579 2007 THIJS S et al Potential for plant growth promotion by a consortium of stress tolerant 24dinitrotoluenedegrading bacteria isolation and characterization of a military soil Microbial biotechnology v 7 n 4 p 294306 2014 TSEZOS M Biosorption of metals The experience accumulated and the outlook for technology development Hydrometallurgy v 59 n 23 p 241243 fev 2001 UCHIYAMA T MIYAZAKI K Functional metagenomics for enzyme discovery challenges to efficient screening Current Opinion in Biotechnology v 20 n 6 p 616622 2009 URAKAWA H et al Shifts of Bacterioplankton Metabolic Profiles along the Salinity Gradient in a Subtropical Estuary ISRN Oceanography v 2013 p 1 12 2013 95 VARAJAO S A R A C A QUESTÃO DA CORRELAÇÃO DAS SUPERFÍCIES DE EROSÃO DO QUADRILÁTERO FERRÍFERO MINAS GERAIS v 21 n 2 p 138145 1991 VELACANO M CASTELLANOHINOJOSA A VIVAS A F Effect of Heavy Metals on the Growth of Bacteria Isolated from Sewage Sludge Compost Tea n August p 644655 2014 WANI P A AYOOLA O H Bioreduction of Cr VI by Heavy Metal Resistant Pseudomonas Species n Vi p 19 2015 WEBER K P et al Data transformations in the analysis of communitylevel substrate utilization data from microplates Journal of microbiological methods v 69 n 3 p 4619 jun 2007 WEISBURG W G et al 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol v 173 p 697703 1991 WHITE C SAYER J A GADD G M Microbial solubilization and immobilization of toxic metals key biogeochemical processes for treatment of contamination FEMS microbiology reviews v 20 n 34 p 50316 jul 1997 XIA X et al On the role of surface diffusion in determining the shape or morphology of noblemetal nanocrystals Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 110 n 17 p 6669 73 2013 ZOU R et al Threedimensional networked NiCo 2 O 4 MnO 2 branched nanowire heterostructure arrays on nickel foam with enhanced supercapacitor performance J Mater Chem A v 3 n 4 p 17171723 2015 96 CAPITULO 5 Considerações Finais Analisando os resultados do presente trabalho os dados revelam que a microbiota do solo apresenta microrganismos com capacidade para biorremediação O Biolog EcoPlate forneceu informações necessárias quanto a atividade metabólica microbiana para alguns compostos uma vez que a placa apresenta 31 compostos diferentes relacionados a fontes de carbono importantes para a manutenção do ambiente e assim permitiu correlacionar os ecossistemas de Mata Floresta Cerrado e Canga exceto para Capim que sofreu tanto a ação antropogênica quanto de fatores naturais onde sugerese que a comunidade microbiana ainda sofre com a pressão seletiva para se estabelecer no local Os microrganismos das regiões de estudos localizadas no Quadrilátero Ferrífero têm alta atividade metabólica e também metabolismo de metais portanto o Biolog EcoPlate consiste em uma ferramenta de grande importância para entender as ações naturais e antropogênicas sobre a comunidade microbiana e os fatores que regulam a ação de microrganismos na comunidade microbiana sendo uma ferramenta inicial para prospecção de genes e enzimas importantes para aplicação biotecnológica Os solos da região de Sabará MG além de altamente diversos quanto a degradação de compostos metabólicos também apresentaram microrganismos com grande potencial para a serem aplicados em processos alternativos de remoção de metais uma vez que os microrganismos isolados dos solos dos ecossistemas desta região apresentaram resistência a altas concentrações de metais pesados cobre cromo e níquel sugerindo que estes mesmo microrganismos apresentam boa capacidade de remoção de metais por técnicas de imobilização de íons metálicos Os isolados apresentaram alta taxa de imobilização de metais por processos de acumulação e remoção dando destaque para os gêneros Burckholderia Arthrobacter e Bacillus que apresentaram boa remoção e boa interiorização de metais mostrando possíveis evidências que os microrganismos apresentam características genotípicas e fenotípicas para metabolismo de metais e uma possível aplicação em biorremediação 97 As técnicas tradicionais microbiológicas fornecem informações variadas entretanto não permite acessar toda a riqueza da microbiota dos solos devido sua grande riqueza com advento da metagenômica e do sequenciamento de nova geração o acesso quase que total se torna possível e assim buscar nessa riqueza alternativas para uma aplicação biotecnológica em biorremediação por exemplo Os dados de prospecção de genes de resistência a metal no banco metagenoma MVDB LBMP contendo sequenciamento total e anotação gênica dos ecossistemas de Sabará MG evidenciaram não só genes importantes para mecanismos de resistência bem como importantes para o metabolismo de influxo e efluxo de íons metálicos cobre cromo e níquel Os resultados deste trabalho fornecem informações para uma prospecção de enzimas e microrganismos aplicados em biorremediação de metais Os resultados apresentados em todas as abordagens utilizadas neste trabalho juntamente com os avanços biotecnológicos e o aumento na busca por alternativas para a recuperação de ecossistemas afetados por compostos tóxicos seja por ação antropogênica ou natural para preservação ambiental tornando assim possível o desenvolvimento ecologicamente sustentável