Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado

Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado 284 ISSN 15175111 ISSN online 21765081 Março 2010 Documentos ISSN 15175111 ISSN online 21765081 Março 2010 Documentos 284 Marco Aurélio Caldas de Pinho Pessoa Filho Embrapa Cerrados Planaltina DF 2010 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Cerrados Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na Embrapa Cerrados BR 020 Km 18 Rod BrasíliaFortaleza Caixa Postal 08223 CEP 73310970 Planaltina DF Fone 61 33889898 Fax 61 33889879 httpwwwcpacembrapabr saccpacembrapabr Comitê de Publicações da Unidade Presidente Fernando Antônio Macena da Silva SecretáriaExecutiva Marina de Fátima Vilela Secretária Maria Edilva Nogueira Supervisão editorial Jussara Flores de Oliveira Arbués Equipe de revisão Francisca Elijani do Nascimento Jussara Flores de Oliveira Arbués Assistente de revisão Elizelva de Carvalho Menezes Normalização bibliográfica Paloma Guimarães Correa de Oliveira Editoração eletrônica Leila Sandra Gomes Alencar Capa Leila Sandra Gomes Alencar Fotos da capa Marco Aurélio C de Pinho Pessoa Filho Impressão e acabamento Divino Batista de Sousa Alexandre Moreira Veloso 1a edição 1a impressão 2010 tiragem 100 exemplares Edição online 2010 Todos os direitos reservados A reprodução nãoautorizada desta publicação no todo ou em parte constitui violação dos direitos autorais Lei no 9610 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação CIP Embrapa Cerrados P475m Pessoa Fillho Marco Aurélio Caldas de Pinho Metagenômica e sua aplicação no estudo de diversidade e função de microrganismos de solos do Cerrado Marco Aurélio Caldas de Pinho Pessoa Filho Planaltina DF Embrapa Cerrados 2010 29 p Documentos Embrapa Cerrados ISSN 15175111 ISSN online 21765081 284 1 Cerrado 2 Solo 3 Metagenômica I Título II Série 6314 CDD 21 Embrapa 2010 Autor Marco Aurélio Caldas de Pinho Pessoa Filho Biólogo PhD Pesquisador da Embrapa Cerrados marcopessoacpacembrapabr Apresentação O conhecimento sobre a composição e a fisiologia de comunidades microbianas no solo pode ter grande impacto no delineamento de estratégias de recuperação de áreas degradadas e na descoberta de genes e produtos de interesse biotecnológico Há até poucos anos pouco era conhecido sobre comunidades microbianas associadas a solos ultramáficos caracterizados pelo excesso de metais como o níquel e a baixa disponibilidade de nutrientes seja sob vegetação nativa ou sob condições extremas de degradação Por isso é grande o potencial de descoberta de mecanismos fisiológicos de resistência ao excesso de metais característico desses ambientes Microrganismos são fontes potenciais de enzimas utilizadas pela indústria e de vários outros produtos de interesse biotecnológico Entretanto métodos tradicionais de isolamento subestimam a ampla diversidade microbiana presente nos mais distintos ambientes Enzimas microbianas que conferem resistência a metais têm importância biotecnológica e ambiental a partir de seus usos potenciais em processos de biorremediação através do uso de isolados naturais ou modificados geneticamente Além disso a associação de bactérias adaptadas a ambientes ultramáficos ou da utilização de seus genes com plantas hiperacumuladoras de metais apresentam uma potencial aplicação na recuperação de ecossistemas contaminados com excesso de metais Este trabalho apresenta as bases da aplicação de uma abordagem independente de cultivo no estudo de recursos genéticos microbianos presentes nas áreas de mineração do maciço ultramáfico de Barro Alto GO Tal abordagem está sendo utilizada no Projeto Diversidade e Prospecção de Genes Bacterianos Envolvidos com Tolerância a Níquel na Rizosfera de Plantas Adaptadas a Solos Ultramáficos Embrapa Macroprograma 3 iniciado em 2010 e liderado pela Embrapa Cerrados José Robson Bezerra Sereno ChefeGeral da Embrapa Cerrados Sumário Introdução 9 Diversidade Microbiana mudanças de paradigma 11 Metagenômica genômica aplicada a amostras ambientais 14 Metagenômica em Solos Ultramáficos 18 Considerações Finais 23 Referências 25 Abstract 29 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos de Solos do Cerrado Marco Aurélio Caldas de Pinho Pessoa Filho Introdução O conhecimento sobre a composição e a fisiologia de comunidades microbianas no solo pode ter grande impacto no delineamento de estratégias de recuperação de áreas degradadas e na descoberta de genes e produtos de interesse biotecnológico Há até poucos anos pouco era conhecido sobre comunidades microbianas associadas a solos ultramáficos caracterizados pelo excesso de metais como o níquel e a baixa disponibilidade de nutrientes seja sob vegetação nativa ou sob condições extremas de degradação Por esse motivo é grande o potencial de descoberta de mecanismos fisiológicos de resistência ao excesso de metais característico destes ambientes No âmbito do Projeto Relações entre Metais do Solo e a Biodiversidade no Cerrado ferramentas para a conservação ambiental e recuperação de áreas degradadas Embrapa Macroprograma 2 foi proposta a avaliação do impacto das atividades de mineração no maciço ultramáfico de Barro Alto GO na qualidade do solo e das águas da região O projeto contém componentes de avaliação da riqueza microbiológica do solo e em conjunto com o Projeto Diagnóstico Monitoramento e Recuperação de Áreas Impactadas pela Mineração de Níquel na Bacia do Alto Tocantins MCTCNPqCTAgronegócio CTHidroMAPASDCSPAE N 442008 objetiva o desenvolvimento de técnicas inovadoras de recuperação de áreas degradadas no maciço 10 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos ultramáfico de Goiás a partir do levantamento de dados sobre fatores edáficos florísticos e microbiológicos e sua aplicação na recuperação e no monitoramento dessas áreas Tais iniciativas tiveram origem com os projetos Distribuição e Biodisponibilidade dos Metais Pesados em Solos de Uso Agrícola do Planalto Central MCTCNPqCTAgronegócio Universal 012002 e Avaliação Ambiental em Área de Mineração de Níquel no Brasil perspectivas para remediação e sustentabilidade MCTCNPqCT Mineral n 202006 que foram pioneiros na Embrapa Cerrados na geração de conhecimento sobre o solo da região de Barro Alto GO e no estudo da interação vegetaçãosolo Microrganismos são fontes potenciais de enzimas utilizadas pela indústria e de vários outros produtos de interesse biotecnológico Entretanto métodos tradicionais de isolamento subestimam a ampla diversidade microbiana presente nos mais distintos ambientes Enzimas microbianas que conferem resistência a metais têm importância biotecnológica e ambiental a partir de seus usos potenciais em processos de biorremediação através da utilização de isolados naturais ou modificados geneticamente Além disso a associação de bactérias adaptadas a ambientes ultramáficos ou da utilização de seus genes com plantas hiperacumuladoras de metais apresentam a potencial aplicação na recuperação de ecossistemas contaminados com excesso de metais Este trabalho apresenta as bases da aplicação de uma abordagem independente de cultivo no estudo de recursos genéticos microbianos presentes nas áreas de mineração do maciço ultramáfico de Barro Alto GO Tal abordagem está sendo utilizada no Projeto Diversidade e Prospecção de Genes Bacterianos Envolvidos com Tolerância a Níquel na Rizosfera de Plantas Adaptadas a Solos Ultramáficos Embrapa Macroprograma 3 iniciado em 2010 e liderado pela Embrapa Cerrados O projeto visa contribuir i na geração de dados sobre a estrutura e a fisiologia de comunidades bacterianas presentes nas áreas estudadas pelos projetos citados e ii na prospecção de genes de interesse biotecnológico envolvidos com mecanismos de tolerância a níquel em bactérias Esperase atingir esses objetivos aliandose técnicas tradicionais de isolamento de bactérias à utilização de uma abordagem 11 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos avançada em genômica e biotecnologia microbiana independente de cultivo e hoje amplamente empregada por grupos de pesquisa de ponta em diversos países a metagenômica Uma breve revisão sobre essa metodologia e sua aplicação no estudo da microbiota de solos ultramáficos é apresentada a seguir Diversidade Microbiana mudanças de paradigma Por muito tempo microbiologistas ignoraram o desafio de identificar e caracterizar organismos não cultiváveis Entre os anos 1960 e 1970 essa missão foi deixada nas mãos de alguns cientistas que persistiam em acumular informações que sugeriam que meios de cultura não capturavam o espectro completo da diversidade microbiana As raízes da microbiologia estão associadas ao advento da microscopia com o primeiro relato da visualização de uma célula bacteriana datando de 1663 por Antonie van Leeuwenhoek Por 200 anos o microscópio permitiu a visualização de bactérias heterotróficas autotróficas ou de parasitas obrigatórios A primeira mudança de paradigma em microbiologia surgiu com os trabalhos de Robert Koch A partir dos anos 1880 seus postulados e sua inovação no desenvolvimento de meios de cultura levaram à divisão do mundo microbiológico em cultivável e não cultivável O interesse de pesquisadores foi dedicado ao estudo de bactérias mantidas em cultura pura gerando a considerável quantidade de informações contidas em livrostexto de microbiologia HANDELSMAN 2004 Levantamentos sobre a atividade de microrganismos aquáticos não fotossintéticos evidenciaram que grande parte do mundo microbiano não era representada pelos organismos cultiváveis STALEY KONOPKA 1985 Resultados indicavam uma grande discrepância entre os tamanhos populacionais estimados por diferentes métodos de quantificação Esse fenômeno ficou conhecido como a grande anomalia em contagem em placas Era comum o relato de valores muito maiores de células bacterianas por contagem microscópica 12 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos direta do que por contagem em placa de cultivo Especulavase que as bactérias que não cresciam em meio de cultura não eram viáveis ou como alternativa que elas poderiam ser consideradas vivas mas incapazes de crescer sob as condições fornecidas pelo procedimento de cultivo STALEY KONOPKA 1985 Em ambientes como o solo os valores chegavam de 01 a 1 de bactérias presentes no ambiente que poderiam ser cultivadas em meios de uso padrão TORSVIK et al 1990 Uma nova mudança de paradigma aconteceu em 1985 com um grande avanço experimental baseado no trabalho pioneiro de Carl Woese que demonstrou que genes do RNA ribossomal rRNA poderiam ser utilizados como ferramentas de medida de divergência evolutiva WOESE 1987 A análise direta das sequências dos genes rRNA 5S e 16S foi utilizada para a descrição da diversidade de microrganismos em uma amostra ambiental sem isolamento ou cultivo LANE et al 1985 Essa metodologia ficou conhecida como filotipagem Na época essa abordagem apresentava o grande desafio técnico de se trabalhar com sequenciamento direto de RNA ou de cópias de DNA geradas por transcriptase reversa O desenvolvimento da tecnologia da reação em cadeia da polimerase PCR e o desenho de iniciadores que poderiam ser utilizados na amplificação do gene ribossomal aceleraram a descoberta de novos táxons nos mais diversos ambientes terrestres HANDELSMAN 2004 A partir daí diferentes técnicas moleculares foram desenvolvidas empregando o gene ribossomal bacteriano como marcador de diversidade filogenética A amplificação da região 16S a partir de uma amostra ambiental com iniciadores conservados foi seguida da utilização de técnicas como eletroforese em agarose ou poliacrilamida eletroforese em gel com gradiente desnaturante DGGE MUYZER et al 1993 ou eletroforese capilar A amplificação da região espaçadora entre as unidades 16S e 23S a região ITS também foi utilizada como forma de se estimar diversidade entre táxons mais próximos devido a sua maior taxa de mutação e 13 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos maiores níveis de diversidade de sequência Essa tecnologia ficou conhecida como RISA do inglês rRNA internal spacer analysis análise do espaçador interno do rRNA BORNEMAN TRIPLETT 1997 Os autores utilizaram dados de variabilidade da região espaçadora em comunidades microbianas do solo da Amazônia Ocidental para a análise do impacto da ação humana nessas regiões Seus resultados mostraram que existe uma mudança efetiva na diversidade de uma área de floresta quando comparada a uma área recentemente desflorestada e convertida em pastagem A utilização de iniciadores marcados com fluorescência foi atualizada para sua aplicação em alta escala ARISA do inglês automated RISA RISA automatizado através da separação de produtos por eletroforese capilar e detecção de fragmentos a laser em sequenciadores automáticos HARTMANN et al 2005 A posterior fragmentação do amplicon por enzimas de restrição ARDRA análise de restrição do DNA ribossomal amplificado também foi implementada como ferramenta molecular de análise de diversidade bacteriana A técnica é na verdade uma variação do RFLP restriction fragment length polymorphism polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição e envolve a fragmentação por uma ou várias enzimas de restrição do fragmento ribossomal amplificado seja ele 16S 23S ou espaçador dependendo do tipo de aplicação desejado REIS JR et al 2002 A inclusão de um passo de clonagem de fragmentos de DNA ambiental em um hospedeiro cultivável levou ao surgimento de uma nova linha de pesquisa em diversidade microbiana e na biotecnologia de microrganismos A análise genômica de uma população de microrganismos surgiu como peçachave de um novo avanço na pesquisa em microbiologia Assim capturado para estudo e preservação DNA microbiano poderia ser utilizado na busca de informações sobre a fisiologia e a genética de organismos não cultiváveis HANDELSMAN 2004 A esse novo insight no mundo das bactérias não cultiváveis foi dado o nome de metagenômica 14 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos Metagenômica genômica aplicada a amostras ambientais Na última década a evolução dos estudos em microbiologia ambiental utilizando métodos independentes de cultivo permitiu o estabelecimento de uma nova abordagem no estudo de diversidade genômica e função gênica em microrganismos ditos não cultiváveis Como alternativa para a busca de novos produtos naturais provenientes de microrganismos do solo foi proposta a estratégia de clonagem do metagenoma o DNA total de microrganismos presentes em um determinado ambiente para se acessar o genoma coletivo e o maquinário biossintético da microbiota de solo HANDELSMAN et al 1998 O primeiro relato de clonagem de DNA diretamente extraído e purificado de amostras ambientais foi feito em uma análise de comunidades microbianas marinhas SCHMIDT et al 1991 Este trabalho tratava da amplificação e clonagem do gene 16S e posterior sequenciamento de clones dessa biblioteca permitindo um levantamento da diversidade filogenética das populações de picoplâncton marinho Posteriormente a construção de uma biblioteca metagenômica a partir de uma mistura de organismos enriquecidos em gramíneas ressecadas em laboratório permitiu a detecção de clones que expressavam atividade celulolítica HEALY et al 1995 A partir daí foram estabelecidas as bases de dois dos componentes principais da pesquisa em metagenômica a análise de diversidade microbiana da fração não cultivável de organismos e a análise funcional de genes de organismos presentes em um ambiente de interesse independente do cultivo destes O termo metagenômica foi descrito pela primeira vez por Jo Handelsman da Universidade de Wisconsin EUA a partir da sugestão de uma série de procedimentos para acessar o metabolismo de microrganismos desconhecidos no solo Seu propósito era avançar a pesquisa em produtos naturais Partindo do pressuposto de que a grande maioria dos microrganismos de solo nunca foi isolada nem cultivada em laboratório foi sugerido que esse ambiente poderia constituir a maior fonte de recursos ainda intocados para a química de produtos naturais HANDELSMAN et al 1998 A metodologia 15 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos sugerida seria a clonagem de metagenomas a fim de se acessar os genomas coletivos e o maquinário biossintético da microbiota de solos Em linhas gerais análises metagenômicas consistem no isolamento de DNA proveniente de uma amostra ambiental fragmentação e inserção do DNA em um vetor adequado transformação de um hospedeiro bacteriano e screening das células recombinantes Os clones podem ser avaliados quanto à presença de marcadores filogenéticos conhecidos como âncoras tais como o próprio gene rRNA 16S ou o gene recA ou de outros genes conservados Também podem ser testados quanto à expressão de fenótipos ou características específicas tais como atividades enzimáticas ou a produção de antibióticos Por fim outra possibilidade é o sequenciamento aleatório de clones da biblioteca HANDELSMAN 2004 Na Figura 1 mostrase um organograma clássico em projetos de metagenômica Figura 1 Fluxograma comparativo de projetos genoma tradicionais e projetos em metagenômica 16 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos Em termos práticos as diversas abordagens que compõem o que se chama hoje de metagenômica incluem a caracterização de comunidades microbianas ou seus membros por métodos independentes de cultivo aplicando técnicas de análise em alta escala ferramentas da genômica proteômica transcriptômica etc RESEARCH COUNCIL US COMMITTEE ON METAGENOMICS CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS 2007 Dessa forma duas estratégias são mais frequentemente utilizadas na busca de alvos funcionais presentes em bibliotecas metagenômicas sendo possível dividir os estudos nos seguintes tipos de abordagens screenings baseados em análise funcional e screenings baseados em sequenciamento Uma abordagem baseada em função gênica busca por clones que expressam a característica de interesse nas bibliotecas construídas A partir da seleção de clones positivos é possível a obtenção de informações acerca do controle genético da característica em estudo Isso pode ser realizado por subclonagem e sequenciamento do fragmento metagenômico inserido no vetor de expressão e posterior anotação gênica para definição das ORFs open reading frames fases abertas de leitura sequências de DNA que potencialmente codificam um peptídeo ou proteína presentes no fragmento clonado MIRETE et al 2007 Uma das vantagens desse tipo de estratégia está na possibilidade de se capturar clones com potencial aplicação direta por exemplo na descoberta de enzimas de interesse biotecnológico para a indústria Outra vantagem é a chance de descoberta de sequências funcionais não descritas em estudos anteriores com papéis distintos de biocatalisadores já conhecidos YUN RYU 2005 Outrossim para que os fragmentos metagenômicos inseridos nos hospedeiros de expressão por exemplo E coli possibilitem a detecção de clones positivos para a característica de interesse na biblioteca é preciso que a os genes contidos nos fragmentos sejam corretamente transcritos traduzidos e que as enzimas sintetizadas sejam biologicamente funcionais Além disso caso a função biológica 17 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos exija a expressão de múltiplos genes é necessária a presença de todos os genes da via em questão para que essa seja identificada Em uma situação em que centenas ou milhares de clones precisam ser avaliados essa estratégia exige o estabelecimento de métodos eficientes e econômicos para que a avaliação seja feita em alta escala YUN RYU 2005 Os primeiros estudos que utilizaram um screening baseado em sequência fizeram uso de hibridização ou PCR para a detecção de genes de interesse tendo como referência sequências de DNA conservadas Assim tal estratégia não poderia ser aplicada para um número grande de alvos e também não garantiria a obtenção de genes completos ou grupos gênicos necessários para a síntese de um produto desejado Apesar de já ter sido utilizada na descoberta de várias enzimas de importância industrial a aplicação típica para esse tipo de abordagem acabou sendo a amplificação de genes ribossomais em estudos de diversidade filogenética YUN RYU 2005 Estudos de sequenciamento de bibliotecas metagenômicas têm feito uso de sequenciamento shotgun e mais recentemente sequenciamento de nova geração como por exemplo pirosequenciamento Essas metodologias fornecem uma grande quantidade de informação desde relações filogenéticas descoberta de novos genes e dedução de vias metabólicas em bactérias não cultiváveis A quantidade de dados leva a análises laboriosas para as quais novos paradigmas de estudo empregando bioinformática ainda estão sendo estabelecidos Tanto os estudos baseados em prospecção de função quanto os estudos que fazem uso de sequenciamento de DNA apresentam uma baixa frequência de detecção de clones positivos tão baixas quanto 4 clones positivos em 930000 clones avaliados HENNE et al 2000 Várias estratégias foram implementadas para aumentar a eficiência no screening Entre elas o uso de organismos hospedeiros como Streptomyces lividnas ou Pseudomonas putida além de E coli a fim de se superar as limitações e dificuldades da expressão heteróloga do metabolismo secundários KOMATSU et al 2010 Etapas de 18 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos enriquecimento de microrganismos não cultiváveis que contêm as características de interesse também têm sido empregadas antes da construção de bibliotecas metagenômicas ENTCHEVA et al 2001 O objetivo desse processo é aumentar a quantidade de DNA de boa qualidade de organismos relacionados com um fenótipo de interesse No artigo citado Entcheva et al 2001 utilizaram altas quantidades de avidina nos meios de cultura a fim de favorecer o crescimento de microrganismos produtores de biotina O DNA extraído das culturas enriquecidas foi utilizado na construção de bibliotecas de cosmídeos com insertos maiores que 30000 pb Metagenômica em Solos Ultramáficos Solos ultramáficos ou serpentínicos apresentam excesso de metais potencialmente tóxicos tais como cobalto cromo e principalmente níquel além de baixa disponibilidade de nutrientes como cálcio e fósforo apresentando forte desequilíbrio mineral Essas características levam à ocorrência de uma gama de espécies endêmicas adaptadas a condições extremas e à presença de mecanismos fisiológicos vegetais distintos como a hiperacumulação de metais BAKER et al 2000 BROOKS 1987 JAFFRE et al 1976 LEE et al 1977 Entre os metais o níquel é provavelmente o que causa os maiores efeitos de toxicidade a plantas não adaptadas A biodisponibilidade de níquel em geral é suficiente para criar estresse fisiológico na maioria das plantas que crescem nesse tipo de solo RAJKUMAR et al 2009 Ambientes ultramáficos têm sido estudados no mundo inteiro quanto a suas composições florísticas edáficas e fisiológicas REEVES et al 2007 Apesar disso há até poucos anos a microbiologia desses ambientes era pouco conhecida OLINE 2006 A microbiota desse tipo de solo provavelmente exibe fortes respostas evolutivas e fisiológicas às condições ambientais locais compondo comunidades com características biológicas tão interessantes quanto às populações endêmicas de plantas presentes em maciços ultramáficos Isso se deve ao contato direto da microbiota com a composição e as propriedades 19 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos químicas únicas desses ambientes e com a rizosfera de plantas tolerantes e ou hiperacumuladoras de níquel OLINE 2006 A hiperacumulação de metais depende não só da planta mas também da interação do tecido radicular com microrganismos da rizosfera e das concentrações de metais biodisponíveis no solo RAJKUMAR et al 2009 O papel de bactérias no crescimento de plantas adaptadas a solos ultramáficos é significativo através de mecanismos como a fixação de nitrogênio atmosférico a utilização de ácido 1carboxílico 1aminociclopropano ACC como a única fonte de nitrogênio a produção de sideróforos ou a produção de hormônios reguladores do crescimento de plantas RAJKUMAR et al 2009 Vários microrganismos de solos serpentínicos são capazes de solubilizar formas não disponíveis de metais através da excreção de ácidos orgânicos RAJKUMAR et al 2009 Isolados de solos ultramáficos resistentes a altas concentrações de metais aumentam a eficiência de processos como a fitoextração de forma direta por meio de um maior acúmulo de metais nos tecidos da planta e de forma indireta por meio de maior desenvolvimento de biomassa radicular e de parte aérea de hiperacumuladoras RAJKUMAR et al 2009 No Brasil complexos ultramáficos no Estado de Goiás possuem grande importância econômica em razão da intensa atividade de mineração nessas áreas desde o final dos anos 1970 As reservas são estimadas em 100 milhões de toneladas de níquel extraível equivalente a 2 milhões de toneladas de níquel metálico e as operações de mineração resultaram na degradação de extensas áreas de vegetação natural Expedições de prospecção florística têm sido realizadas desde o final dos anos 1980 BROOKS et al 1992 BROOKS et al 1990 REEVES et al 2007 sendo relatadas várias espécies com capacidade hiperacumuladora de níquel Além disso a identidade exata de somente 13 espécies vegetais foi determinada de um total de 79 espécimes coletados com potencial presença de mais de 30 espécies diferentes REEVES et al 2007 Dada a potencial exposição desses ambientes à fortíssima degradação ambiental projetos que proponham levantamentos sobre flora macrofauna microbiologia de solos e o 20 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos conhecimento sobre fatores edáficos e biogeoquímicos visando ao desenvolvimento de técnicas inovadoras de recuperação dessas áreas após as atividades de mineração são de extrema importância na manutenção da sustentabilidade da atividade mineradora no Cerrado Alguns trabalhos têm tratado do estudo das bactérias presentes em solos ultramáficos e das suas interações com plantas hiperacumuladoras de níquel ABOUSHANAB et al 2003 ABOU SHANAB et al 2007 MENGONI et al 2001 SCHLEGEL et al 1991 Comunidades bacterianas presentes em solos ultramáficos têm uma maior tolerância a altos níveis de níquel e zinco quando comparadas com comunidades bacterianas de solos não serpentínicos Há também evidência da influência da rizosfera de plantas hiperacumuladoras como Sebertia acuminata Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii e Alyssum murale na maior incidência de bactérias expressando resistência a metaisABOUSHANAB et al 2007 Alguns tipos de metais como cobalto cobre níquel e zinco possuem um papel essencial no metabolismo celular de bactérias quando presentes em concentrações baixas sendo potencialmente tóxicas em altas concentrações Outros metais pesados como chumbo cádmio prata e cromo são tóxicos até quando em concentração muito baixa NIES 2004 Mecanismos metabólicos relacionados com a tolerância a metais foram descritos em vários microrganismos eles envolvem sua exclusão remoção ativa biossorção precipitação ou bioacumulação em espaços intra ou extracelulares Esses processos podem influenciar a solubilidade e a biodisponibilidade de metais para a planta modificando os efeitos tóxicos dos metais RAJKUMAR et al 2009 O estresse abiótico causado por metais pesados em suas formas orgânicas ou inorgânicas afeta o crescimento a morfologia e o metabolismo de microrganismos no solo RAJKUMAR et al 2009 Os mecanismos mais conhecidos de resistência a níquel são mediados por bombas de fluxo como a CnrCBA resistência a cobaltoníquel de Cupriavidus metallidurans CH34 NccCBA níquelcobaltocádmio 21 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos e NreB resistência a níquel de Achromobacter xylosoxidans 31A um homólogo de NreB o gene NrsD de Synechocystis sp YohM resistente a cobaltoníquel de E coli e CznABC cádmiozinco níquel de Helicobacter pylori Todos esses foram isolados por técnicas dependentes de cultivo havendo a grande possibilidade da presença de novos mecanismos na natureza MIRETE et al 2007 As regiões do genoma bacteriano relacionadas com respostas ao excesso de metais pesados podem ser codificados por genes cromossomais porém estão mais frequentemente localizados em plasmídeos bacterianos CERVANTES GUTIERREZCORONA 1994 Nos maciços ultramáficos de Barro Alto GO levantamentos florísticos e fisiológicos recentes de plantas nativas hiperacumuladoras e ou tolerantes ao excesso de níquel foram relatados por Reeves et al 2007 Resultados desse trabalho e dos projetos em andamento Relações entre Metais do Solo e a Biodiversidade no Cerrado ferramentas para a conservação ambiental e recuperação de áreas degradadas Embrapa Macroprograma 2 Diagnóstico Monitoramento e Recuperação de Áreas Impactadas pela Mineração de Níquel na Bacia do Alto Tocantins MCTCNPqCTAgronegócioCT HidroMAPA SDCSPAE N 442008 e Avaliação Ambiental em Área de Mineração de Níquel no Brasil perspectivas para remediação e sustentabilidade MCTCNPqCTMineral n 202006 sugerem uma série de espécies vegetais hiperacumuladoras de níquel com potencial para estudos bioquímicos fisiológicos e moleculares quanto à resistência e ao hiperacúmulo de níquel Entre estas a espécie Heliotropium salicoides família Boraginaceae mostra altos níveis de níquel em tecido foliar chegando a 2015 mg de níquel por kg de tecido REEVES et al 2007 Variações detectadas nas concentrações de níquel foliar em indivíduos da mesma espécie presentes em regiões distintas concentração mínima de 7 mgkg e máxima de 2015 mgkg para Heliotropium salicoides deixam em aberto a questão sobre a causa dessas variações Fatores como condições de solo quanto à biodisponibilidade de níquel ou como a própria diversidade genética da espécie em relação quanto a essa característica podem ser levados 22 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos em consideração É interessante notar que os autores enfatizam a necessidade de estudos sobre microbiologia de solos e sobre fungos micorrízicos interagindo com o sistema radicular dessas plantas para que tais perguntas sejam respondidas REEVES et al 2007 Nesse sentido o Projeto Diversidade e Prospecção de Genes Bacterianos Envolvidos com Tolerância a Níquel na Rizosfera de Plantas Adaptadas a Solos Ultramáficos Embrapa Macroprograma 3 iniciado em 2010 propõe primeiro a avaliação dos efeitos de alterações na biodisponibilidade de níquel e da atividade mineradora na diversidade bacteriana Por diversidade bacteriana entendese a composição global de filos de Bacteria presentes nas áreas em estudo por sequenciamento de bibliotecas de rRNA 16S montadas a partir de DNA metagenômico Segundo por meio da prospecção de genes bacterianos envolvidos com tolerância a níquel presentes no genoma de bactérias cultiváveis isoladas por métodos tradicionais de cultivo e nãocultiváveis analisados por uma abordagem de metagenômica funcional O projeto tem como objetivo geral caracterizar recursos genéticos bacterianos quanto à sua diversidade e seus mecanismos de tolerância ao níquel em solos do maciço ultramáfico de Barro Alto GO diante de gradientes na biodisponibilidade de níquel e do efeito da atividade de mineração Recentemente uma abordagem metagenômica foi utilizada para a descoberta de mecanismos metabólicos relacionados com a resistência ao excesso de níquel em uma população bacteriana de rizosfera de Erica andevalensis MIRETE et al 2007 presentes em áreas de oxidação de sulfetos minerais ricas em metais tóxicos e altamente ácidas O artigo apresenta o primeiro relato sobre a descoberta de genes de resistência a níquel a partir de uma comunidade microbiana desse tipo de ambiente Inicialmente o trabalho incluiu a análise de diversidade de populações microbianas através de clonagem e sequenciamento da região 16S de uma amostra de DNA metagenômico DNA total extraído de solo de rizosfera de E andevalensis Essa primeira etapa teve como objetivo determinar a representatividade em termos de riqueza 23 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos microbiana contida no material amostrado Posteriormente fragmentos de DNA metagenômico foram clonados em E coli e a biblioteca foi prospectada em relação à ocorrência do fenótipo de interesse no caso E coli transformadas resistentes ao excesso de níquel em meio de cultura Após a seleção de clones positivos os insertos foram sequenciados e anotados quanto à presença de ORFs relacionadas com mecanismos metabólicos de tolerância a níquel A validação de função dos insertos foi realizada por subclonagem ou por mutagênese Genes já conhecidamente envolvidos com resistência a níquel foram detectados e de um total de 13 clones positivos cinco codificavam proteínas já conhecidas porém nunca associadas à resistência à níquel enquanto seis clones codificavam proteínas hipotéticas ou de função desconhecida Entre as ORFs descritas foi relatado um provável novo grupo de transportadores ABC relacionados com a retirada de metais da célula Este trabalho demonstra a possibilidade de aplicação de abordagens recentes em microbiologia ambiental associando genômica avançada em alta escala prospecção de função gênica além da análise em alta escala de diversidade de populações microbianas nesse último caso abordagem já aplicada em solo de Cerrado para comunidades bacterianas e fúngicas DE CASTRO et al 2008 QUIRINO et al 2009 Considerações Finais O potencial de uso da metagenômica em diferentes objetos de pesquisa é enorme mas o conhecimento de suas limitações permite um uso racional de suas metodologias e um melhor planejamento de futuros projetos Abordagens que fazem uso de uma triagem funcional dependem da expressão bem sucedida de genes clonados na bactéria hospedeira conforme já mencionado anteriormente Em triagens baseadas em sequenciamento não é possível a obtenção de genes completamente novos Isso ocorre porque a inferência sobre a função gênica a partir de sequências obtidas nesses tipos de estudo dependem da presença prévia de genes anotados em bancos de dados Além disso podem ocorrer a clonagem de genes parciais e a seleção de genes não funcionais DANIEL 2005 24 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos O pesquisador deve ter em mente que o valor de predição e interpretação de dados em metagenômica é limitado pela validade e da representatividade da informação presente em banco de dados A quantidade de genes listados com função desconhecida é enorme e para aqueles genes com função inferida a partir de análises de similaridade ainda é necessário validação experimental Nesse sentido o progresso no cultivo de bactérias antes não cultiváveis a fim de se obter representantes isolados do ambiente em estudo é de extremo valor Dessa forma a metagenômica deve ser recebida como uma metodologia complementar a abordagens tradicionais em testes de hipótese sobre a composição diversidade e funcionalidade de comunidades microbianas LEVEAU 2007 Finalmente a metagenômica não se sustenta somente com dados genômicos gerados em laboratório a abordagem é multidisciplinar e envolve a coleta de informações sobre o ambiente em estudo dados como química e física do solo e vegetação presente na área por exemplo que devem ser analisados em conjunto com os dados gerados sobre diversidade e função gênica A mudança de paradigmas de sequenciamento que tem ocorrido nos últimos anos também é um fator limitante de abordagens que geram quantidades exorbitantes de informação Serão necessários avanços em bioinformática diante da adaptação à enorme quantidade de dados de sequenciamento gerados Em razão da inexistência de pacotes para análise global de dados devem ser levados em conta em projetos de metagenômica a complexidade da amostra e a difícil montagem de genomas a partir de amostras complexas Vale salientar que o progresso e desenvolvimento em bioinformática atenderam a projetos que utilizavam a tecnologia de sequenciamento de Sanger sendo necessária uma renovação e adequação de processos e metodologias que atendam projetos futuros CHEN PACHTER 2005 KUNIN et al 2008 RESEARCH COUNCIL US COMMITTEE ON METAGENOMICS CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS 2007 O Projeto Diversidade e Prospecção de Genes Bacterianos Envolvidos com Tolerância a Níquel na Rizosfera de Plantas Adaptadas a Solos Ultramáficos Embrapa Macroprograma 3 faz uso de técnicas 25 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos moleculares avançadas em análises de comunidades microbianas e na exploração biotecnológica de microrganismos ainda não realizadas na Embrapa Cerrados Assim esperase um avanço na capacitação do corpo técnico do Centro a partir da utilização de ferramentas moleculares na caracterização e utilização biotecnológica de recursos genéticos microbianos Finalmente ele estabelece bases para estudos futuros de prospecção de genes de interesse biotecnológico na microbiota dos Cerrados relacionados com estresses abióticos como o excesso de metais e com a baixa disponibilidade de nutrientes característica dos solos desse bioma Diante da linha temática na qual se inclui o projeto faz uso de tecnologias avançadas em genômica microbiana a fim de gerar conhecimento sobre mecanismos de tolerância a um estresse abiótico a tolerância a metais O conhecimento gerado pelo alcance dos objetivos da proposta tem potencial aplicação futura na redução de impactos ambientais da atividade mineradora no Cerrado Referências ABOUSHANAB R A ANGLE J S DELORME T A CHANEY R L BERKUM P V MOAWAD H GHANEM K GHOZLAN H A Rhizobacterial effects on nickel extraction from soil and uptake by Alyssum murale New Phytologist v 158 n 1 p 219 224 2003 ABOUSHANAB R A I VAN BERKUM P ANGLE J S Heavy metal resistance and genotypic analysis of metal resistance genes in grampositive and gramnegative bacteria present in Nirich serpentine soil and in the rhizosphere of Alyssum murale Chemosphere v 68 n 2 p 360367 2007 BAKER A J M MCGRATH S P REEVES R D SMITH J A C Metal hyperaccumulator plants A review of the ecology and physiology of a biochemical resource for phytoremediation of metalpolluted soils In Ed Phytoremediation of contaminated soil and water Boca Raton FL Lewis Publishers 2000 Metal hyperaccumulator plants a review of the ecology and physiology of a biochemical resource for phytoremediation of metalpolluted soils p 85107 BORNEMAN J TRIPLETT E W Molecular microbial diversity in soils from eastern Amazonia evidence for unusual microorganisms and microbial population shifts associated with deforestation Applied Environmental Microbiology v 63 n 7 p 2647 2653 1997 26 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos BROOKS R R Serpentine and its vegetation In Ed Ecology phytogeography and physiology Series Portland OR 1987 Serpentine and its vegetation BROOKS R R REEVES R D BAKER A J M The serpentine vegetation of Goias Brazil In Ed The vegetation of ultramafic serpentine soils andover Intercept Ltd 1992 p 6781 BROOKS R R REEVES R D BAKER A J M RIZZO J A DIAZ FERREIRA H The Brazilian serpentine plant expedition BRASPEX 1988 National Geographic Research v 6 p 205219 1990 CERVANTES C GUTIERREZCORONA F Copper resistance mechanisms in bacteria and fungi FEMS Microbiology Reviews v 14 n 2 p 121138 1994 CHEN K PACHTER L Bioinformatics for wholegenome shotgun sequencing of microbial communities PLoS Computational Biology v 1 n 2 p 106112 2005 DANIEL R The metagenomics of soil Nature Reviews Microbiology v 3 n 6 p 470 478 2005 DE CASTRO A P QUIRINO B F PAPPAS G KUROKAWA A S NETO E L KRÜGER R H Diversity of soil fungal communities of Cerrado and its closely surrounding agriculture fields Archives of Microbiology v 190 n 2 p 129139 2008 ENTCHEVA P LIEBL W JOHANN A HARTSCH T STREIT W R Direct cloning from enrichment cultures a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial consortia Applied Environmental Microbiology v 67 n 1 p 8999 jan 2001 HANDELSMAN J Metagenomics application of genomics to uncultured microorganisms Microbiology and Molecular Biology Reviews v 68 n 4 p 669 2004 HANDELSMAN J RONDON M R BRADY S F CLARDY J GOODMAN R M Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes a new frontier for natural products Chemical Biology v 5 n 10 p R2459 Oct 1998 HARTMANN M FREY B KÖLLIKER R WIDMER F Semiautomated genetic analyses of soil microbial communities comparison of TRFLP and RISA based on descriptive and discriminative statistical approaches Journal of Microbiological Methods v 61 n 3 p 349360 2005 HEALY F G RAY R M ALDRICH H C WILKIE A C INGRAM L O SHANMUGAM K T Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the microbial consortia in a thermophilic anaerobic digester maintained on lignocellulose Applied Microbiology and Biotechnology v 43 n 4 p 66774 AugSept 1995 HENNE A SCHMITZ R A BOMEKE M GOTTSCHALK G DANIEL R Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli Applied Environmental Microbiology v 66 n 7 p 31136 jul 2000 JAFFRE T BROOKS R R LEE J REEVES R D Sebertia acuminata A Hyperaccumulator of Nickel from New Caledonia Science v 193 n 4253 p 579 580 1976 27 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos KOMATSU M UCHIYAMA T OMURA S CANE D E IKEDA H Genome minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism Proceedings of the National Academy of Sciences v 107 n 6 p 26462651 Feb 2010 KUNIN V COPELAND A LAPIDUS A MAVROMATIS K HUGENHOLTZ P A bioinformaticians guide to metagenomics Microbiology and Molecular Biology Reviews v 72 n 4 p 557 2008 LANE D PACE B OLSEN G STAHL D SOGIN M PACE N Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses Proceedings of the National Academy of Sciences USA v 82 n 20 p 69556959 Jan 1985 LEE J BROOKS R R REEVES R D BOSWELL C R JAFFRÉ T Plantsoil relationships in a new caledonian serpentine flora Plant and Soil v 46 n 3 p 675 680 1977 LEVEAU J The magic and menace of metagenomics prospects for the study of plant growthpromoting rhizobacteria European Journal of Plant Pathology v 119 n 3 p 279300 2007 MENGONI A BARZANTI R GONNELLI C GABBRIELLI R BAZZICALUPO M Characterization of nickelresistant bacteria isolated from serpentine soil Environmental Microbiology v 3 n 11 p 691698 2001 MIRETE S DE FIGUERAS C G GONZALEZPASTOR J E Novel nickel resistance genes from the rhizosphere metagenome of plants adapted to acid mine drainage Applied and Environmental Microbiology v 73 n 19 p 60016011 2007 MIRETE S DE FIGUERAS C G GONZÁLEZPASTOR J E Novel nickel resistance genes from the rhizosphere metagenome of plants adapted to acid mine drainage Applied and Environmental Microbiology v 73 n 19 p 600111 Oct 2007 MUYZER G DE WAAL E C UITTERLINDEN A G Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA Applied and Environmental Microbiology v 59 n 3 p 695700 1993 NIES D H Metals and their compounds in the environment part II In Ed The Elements essential and toxic effects on microorganisms Weinheim 2004 OLINE D K Phylogenetic Comparisons of Bacterial Communities from Serpentine and Nonserpentine Soils Applied and Environmental Microbiology v 72 n 11 p 6965 6971 2006 QUIRINO B F PAPPAS G J TAGLIAFERRO A C COLLEVATTI R G NETO E L DA SILVA M R S S BUSTAMANTE M M C KRÜGER R H Molecular phylogenetic diversity of bacteria associated with soil of the savannalike Cerrado vegetation Microbiological Research v 164 n 1 p 5970 2009 28 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos RAJKUMAR M VARA PRASAD M N FREITAS H AE N Biotechnological applications of serpentine soil bacteria for phytoremediation of trace metals Critical Reviews in Biotechnology v 29 n 2 p 120130 Jun 2009 REEVES R BAKER A BECQUER T ECHEVARRIA G MIRANDA Z The flora and biogeochemistry of the ultramafic soils of Goiás state Brazil Plant and Soil v 293 n 1 p 107119 2007 REIS JUNIOR F B MENDES I C TEIXEIRA K R S REIS V M Uso de ferramentas moleculares em estudos da diversidade de microrganismos do solo Planaltina DF Embrapa Cerrados 2002 Embrapa Cerrados Documentos 51 RESEARCH COUNCIL US COMMITTEE ON METAGENOMICS CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS N The new science of metagenomics revealing the secrets of our microbial planet 2007 158 p SCHLEGEL H G COSSON J P BAKER A J M Nckelhyperaccumulating plants provide a niche for nickelresistant bacteria Botanica acta v 104 n 1 p 1825 1991 SCHMIDT T DELONG E PACE N Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing Journal of Bacteriology v 173 n 14 p 4371 1991 STALEY J T KONOPKA A Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats Annual Reviews Microbiology v 39 p 32146 Jan 1985 TORSVIK V GOKSOYR J DAAE F L High diversity in DNA of soil bacteria Applied Environmental Microbiology v 56 n 3 p 7827 Mar 1990 WOESE C R Bacterial evolution Microbiological Reviews v 51 n 2 p 22171 Jun 1987 YUN J RYU S Screening for novel enzymes from metagenome and SIGEX as a way to improve it Microbial Cell Factories v 4 n 1 p 8 Mar 2005 29 Metagenômica e sua Aplicação no Estudo de Diversidade e Função de Microrganismos Metagenomics applications on the study of diversity and function of soil microorganisms in the Cerrado Abstract Knowledge on the composition and physiology of soil microbial communities may have a great impact on the establishment of strategies to recover highly degraded areas and on the discovery of genes and biotechnological products Until recently little was known about microbial communities associated with ultramafic soils characterized by excessive concentrations of metals such as nickel and by their low nutrient availability either under native vegetation or under extreme conditions of degradation Nevertheless there is a great potential for the discovery of physiological mechanisms related with resistance to excessive concentrations of metals which characterize such environments Microorganisms are potential sources of industrial enzymes and of various other biotechnological products However traditional isolation methods underestimate the huge microbial diversity occurring in distinct environments Microbial enzymes conferring resistance to metals have biotechnological and environmental importance by their potential application for bioremediation by using natural or genetically modified isolates In addition the association between bacteria adapted to ultramafic soils or the use of their genes and plants presenting metal hyperaccumulation might be useful in the recovery of metal contaminated ecosystems This paper presents the bases for the application of an isolationindependent approach for the study of microbial genetic resources in mining areas with ultramafic soils in Barro Alto GO Such approach is being used in the project Diversity and prospection of bacterial genes involved with nickel tolerance in the rhyzosphere of plants adapted to ultramafic soils Embrapa Macroprograma 3 started in 2010 and lead by Embrapa Cerrados Index terms environmental genomics nickel tolerance 16S rRNA