Metagenômica de Consórcios Microbianos para Biorremediação de Resíduos de Perfuração

RENORBIO PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA METAGENÔMICA DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS DE PERFURAÇÃO ALAINE DE BRITO GUERRA NATAL RN FEVEREIRO DE 2018 ALAINE DE BRITO GUERRA METAGENÔMICA DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS DE PERFURAÇÃO Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Biotecnologia RENORBIO como um dos prérequisitos necessários à obtenção do título de Doutor Área de concentração Biotecnologia Industrial Orientadora Lucymara Fassarella Agnez Lima NATAL RN FEVEREIRO DE 2018 Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN Sistema de Bibliotecas SISBI Catalogação de Publicação na Fonte UFRN Biblioteca Setorial Prof Leopoldo Nelson Centro de Biociências CB Guerra Alaine de Brito Metagenômica de consórcios microbianos para biorremediação de resíduos de perfuração Alaine de Brito Guerra Natal 2018 99 f il Tese Doutorado Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências Programa de PósGraduação em Biotecnologia Orientadora Profa Dra Lucymara Fassarella AgnezLima 1 Resíduo de perfuração Tese 2 Consórcio microbiano Tese 3 Biodegradação Tese I AgnezLima Lucymara Fassarella II Universidade Federal do Rio Grande do Norte III Título RNUFBSECB CDU 62854 ALAINE DE BRITO GUERRA METAGENÔMICA DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS DE PERFURAÇÃO Tese apresentada a Rede Nordeste em Biotecnologia RENORBIO para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Área de concentração Biotecnologia Industrial Aprovada em 27 de Fevereiro de 2018 por Profª Dra Lucymara Fassarela Agnez Lima Presidente Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN Profª Dra Valéria Maia de Oliveira Examinadora Externa Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Profª Dra Marilene Henning Vainstein Examinadora Externa Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Profª Dra Katia Castanho Scortecci Examinadora Interna Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN Profo Dr Everaldo Silvino dos Santos Examinador Interno Universidade Federal do Rio Grande do Norte DEDICATÓRIA A Deus e Nossa Senhora por iluminar e cuidar da minha vida e à minha família especialmente meus pais meu esposo minha sobrinha e meus irmãos pelo apoio amor e cuidado AGRADECIMENTOS A Deus e a Nossa senhora pela presença constante na minha vida sempre cuidando e guiando meus caminhos não me deixando desistir ou desanimar Aos meus pais Mauricio e Bernadete meus irmãos Aline e Thiago por todo amor cuidado e compreensão em todos os momentos A meu esposo Sergio por todo amor compreensão companheirismo paciência e apoio incondicional À minha sobrinha e afilhada Alice por iluminar minha vida com tanta paz amor e alegria À minha orientadora professora Lucymara pela excelente orientação oportunidades oferecidas discussões construtivas e inúmeros ensinamentos A CAPES e ao CNPQ pelo apoio financeiro para realização deste trabalho A Brasil Química e Mineração Industrial Ltda BQMIL pela parceria apoio e incentivo para a realização desta pesquisa Ao Centro de Tecnologias do Gás e Energias Renováveis CTGAS pela colaboração na realização das análises A toda equipe do Projeto Ciências do Mar em especial a Professora Marilene pela troca de experiência e apoio na realização das análises A UFRN pela oportunidade de realização do ensino superior de qualidade A todos os professores e funcionários que compõe a Rede Nordeste em Biotecnologia Natal por todos ensinamentos e disponibilidade Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica LBMG especialmente do grupo metagenômica por todo apoio e ensinamentos Aos membros da banca pelo aceite em compor a banca de defesa da Tese e por todas contribuições RESUMO Resíduos de perfuração de poços de petróleo caracterizamse como resíduos sem tratamento adequado que acumulado gera um passivo ambiental de grandes proporções Assim conhecimentos da comunidade microbiana do resíduo de perfuração podem ser úteis no desenvolvimento de estratégias de biorremediação O presente trabalho teve como objetivo identificar microrganismos do resíduo de perfuração de poços de petróleo por abordagem metagenômica e obter consórcios bacterianosbactérias isoladas que tenham atividade de biodegradação de hidrocarbonetos eou produção de biossurfactantes visando aplicação em estratégias de biorremediação O DNA total foi extraído diretamente das amostras de resíduos de perfuração e dos consórcios obtidos enriquecidos em diferentes meios e sequenciados usando a plataforma Ion Torrent Bactérias isoladas dos consórcios foram identificadas por meio do sequenciamento parcial do gene 16S nRNA pelo método Sanger Análises taxonômicas revelaram mudanças em nível de filo e consequentemente gênero entre as amostras Enquanto no resíduo de perfuração predominou o gênero Halomonas pertencente ao filo Proteobacteria nos consórcios maiores abundâncias foram observadas para gêneros Paenibacillus e Brevibacillus ambos do filo Firmicutes A análise funcional utilizando banco de dados específico para a biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes BioSurfDB revelou que a seleção não apenas manteve vias relacionadas a biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes como favoreceu significativamente algumas Crescimento na presença de petróleo ensaio qualitativo de biodegradação utilizando o indicador DCPIP adesão microbiana a hidrocarbonetos testes de emulsificação teste de dispersão do óleo e tensão interfacial indicaram capacidade de biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes pelos consórcios Ao retornar do resíduo ao qual foram obtidos os consórcios selecionados em meio Lysogeny broth LB e Yeast peptone dextrose YPD foram capazes de biodegradar 66 e 30 de alcanos respectivamente Assim diferenças na composição dos microrganismos provavelmente devido à etapa de enriquecimento em diferentes meios refletiram diferentes capacidades metabólicas O meio LB parece ter selecionado a comunidade microbiana mais adequada à remoção de alcanos no resíduo de perfuração Sequências de rRNA 16S obtidas de cepas isoladas apresentaram elevada identidade com representantes dos gêneros Brevibacillus Micrococcus e Bacillus A metagenômica demonstrou ser uma ferramenta valiosa na análise das comunidades microbianas e na escolha da estratégia de biorremediação A bioaumentação autóctone pode ser uma alternativa eficiente na biodegradação hidrocarbonetos O método de enriquecimento através de diferentes meios pode afetar a composição da comunidade microbiana e a degradação Palavras chave Resíduo de perfuração Consórcio microbiano Metagenoma Biodegradação Biossurfactantes ABSTRACT Drill cutting is characterized as a waste without adequate treatment which has been accumulated generating an environmental liability of large proportions Thus knowledge of the microbial community and its functions in the drilling cutting can be useful for the development of bioremediation strategies The present work aimed to identify microorganisms from drill cutting by metagenomic approach and obtain bacterial consortia and isolated bacteria that have hydrocarbon biodegradation activity andor biosurfactant production for further application in strategies of bioremediation Total DNA was directly extracted from the drill cutting samples and from two consortia enriched in different culture media and sequenced using the Ion Torrent PGM platform Isolated bacteria from the consortia were identified by 16S partial gene rRNA sequencing by the Sanger method Taxonomic analysis revealed changes at the phylum level and consequently genera among samples While in the drilling cutting predominated phylum Proteobacteria and genus Halomonas in the consortia greater abundance were observed for the phylum Firmicutes and genera Paenibacillus and Brevibacillus Functional analysis using a specific database for hydrocarbon biodegradation and biosurfactant production BioSurfDB revealed that the selection not only maintained routes related to hydrocarbon degradation and biosurfactant production but also favored some them Growth curve in the presence of petroleum qualitative biodegradation test using the DCPIP indicator microbial adhesion to hydrocarbons assay emulsification tests oil spreading Method and interfacial tension indicated capacity of hydrocarbon biodegradation and production of biosurfactants by the consortia and isolated Returning to the residue to which they were obtained the consortia selected in Lysogeny broth LB e Yeast peptone dextrose YPD medium were able to degrade 66 and 30 of nalkanes respectively So differences in the composition of microorganisms probably due to the enrichment stage in different media reflected different metabolic capacities LB medium has selected microbial community more adequate to the removal of alkanes in the drill cutting The 16S rRNA sequences obtained from isolated strains presented high identity with representatives of the genera Brevibacillus Micrococcus Bacillus Metagenomics was shown as a powerful tool in the analysis of microbial communities and the choice of bioremediation strategy Autochthonous bioaugmentation can be an efficient alternative in hydrocarbon biodegradation Method of enrichment through different medium can affect the composition of the microbial community and degradation ability Keywords Drill cuttings Microbial consortium Metagenome Biodegradation Biosurfactants LISTA DE FIGURAS Figura 1 Comparação entre diferentes tipos de tratamento e seus respectivos custos dólar por m3 de solo Fonte EPA modificado por ANDRADE AUGUSTO JARDIM 2010 21 Figura 2 Esquema com algumas das tecnologias de biorremediação ex situ e in situ Fonte AZUBUIKE CHIKERE OKPOKWASILI 2016 com modificações 22 Figura 3 Via de degradação aeróbica de alcanos por oxidação terminal e subterminal Fonte Fritsche e Hofrichter 2008 modificado por Cruz e Marsaioli 2012 25 Figura 4 Oxidação de alcanos através da ALKB a e citocromo P450 b Fonte Rojo 2010 26 Figura 5 Esquema mostrando as etapas principais da degradação de hidrocarbonetos aromáticos sob condições aeróbicas Fonte Fritsche e Hofrichter 2008 modificado por Cruz e Marsaioli 2012 28 Figura 6 Mecanismos de remoção de hidrocarbonetos por biossurfactantes em função da massa molecular e concentração micelar crítica CMC Fonte PacwaPłociniczak et al 2011 30 Figura 7 Mapa de localização do município de Mossoró onde encontrase acumulado o resíduo de perfuração 37 Figura 8 Fluxograma das etapas metodológicas desenvolvidas ao longo da pesquisa 38 Figura 9 Crescimento do consórcio L e Y em meio BH na presença de petróleo Pet e controle com meio e petróleo Meio de cultura turvo indica crescimento enquanto a redução visual do petróleo e solubilização no meio com os consórcios são indicativos de degradação 47 Figura 10 Crescimento do consórcio L em meio ASW na presença Pet e ausência Pet do petróleo Meio de cultura turvo consórcio L ASW Pet indica crescimento e meio transparente Consórcio L ASW Pet ausência de crescimento 47 Figura 11 Efeito da presença de petróleo no crescimento dos consórcios L a c e Y b Controle positivo meio de cultura com os consórcios e sem adição de petróleo Controle negativo CTRL meio de cultura com petróleo e sem adição dos consórcios 48 Figura 12 Aspecto visual do teste colorimétrico 26 DCPIP Na ausência de fonte de carbono consórcio meio não há oxidação e a coloração inicial azul permanece Na presença de fonte de carbono consórcio petróleo ou glicose a oxidação ocorre e é sinalizada pela mudança na coloração 49 Figura 13 Índice de emulsificação dos consórcios L e Y com hexano hexadecano diesel querosene tolueno petróleo tolueno xileno tolueno xileno SDS 10 foi utilizado como controle positivo e meio de cultura BH como controle negativo 50 Figura 14Teste de dispersão do óleo com sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios L e Y Controle positivo com SDS 10 e negativo com água Seta em vermelho representa o deslocamento de óleo formado pela atividade dos surfactantes 51 Figura 15 Tensão interfacial Nm2 ao longo do tempo 103s do sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios L e Y Controle negativo consiste no meio de cultura com petróleo e positivo com SDS 002 Em a Consórcios L e Y e o Controle negativo meio BH com petróleo sem os consórcios Em b consórcios L e Y controle negativo e controle positivo com SDS a 002 52 Figura 16 Perfil taxonômico comparativo referente a Filos do metagenoma do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP e consórcio L e Y Diferenças biológicas significativas calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 54 Figura 17 Diagrama de Venn demonstrando o compartilhamento gêneros entre os metagenomas do resíduo de perfuração RP consórcio L e Y 54 Figura 18 Perfil taxonômico comparativo referente a gêneros do metagenoma do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP e consórcio L e Y Diferenças biológicas significativas calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 56 Figura 19 Perfis funcionais para metabolismo KEGG no resíduo de perfuração RP e consórcios L e Y obtidos pelo MEGAN Valores em proporções de sequências 57 Figura 20 Perfis funcionais para metabolismo energético para resíduo de perfuração RP e consórcios L e Y obtidos pelo MEGAN Valores em proporções de sequências 58 Figura 21 Perfil funcional comparativo de vias relacionadas a degradação do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP consórcio L e Y Diferenças biológicas significantes calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 60 Figura 22 Perfil funcional comparativo de vias relacionadas a biossíntese de surfactantes do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP consórcio L e Y Diferenças biológicas significantes calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 64 Figura 23 Produção acumulada de CCO2 mgkg de solo ao longo de 77 dias de ensaio para os consórcios L e Y Experimento controle contém apenas resíduo de perfuração sem adição de microrganismos Bioaumentação L e Y corresponde ao tratamento com resíduo de perfuração e adição dos consórcios L e Y respectivamente 65 Figura 24 Percentual de degradação de alcanos totais no resíduo de perfuração após 77 dias de experimento Experimento controle contém apenas resíduo de perfuração sem adição de microrganismos Bioaumentação L e Y corresponde ao tratamento com resíduo de perfuração e adição dos consórcios L e Y respectivamente 66 Figura 25 Percentual de degradação das frações de alcanos C14C31 utilizando a estratégia de bioaumentação para o consórcio L após 77 dias de experimento 66 Figura 26 Percentual de degradação das frações de alcanos C25 C28 C29 C30 C32 utilizando a estratégia de bioaumentação para o consórcio Y após 77 dias de experimento 67 Figura 27 Cladograma resultante do alinhamento da região rDNA 16S mostrando os agrupamentos formados pelos isolados 161 163 A2 A3 R12 J5 A4 e os microrganismos relacionados O Cladograma foi construído utilizando o método NeighbourJoining Valor do Bootstrap de 1000 réplicas 70 Figura 28 Crescimento do isolado 161 e 163 DO600 em meio BH 01 de extrato de levedura com e sem petróleo 71 Figura 29 Crescimento do isolado 161 DO600 e índice de emulsificação IE em meio BH 01 de extrato de levedura com e sem petróleo 72 Figura 30 Hidrofobicidade celular do isolado 161 em relação ao hexadecano diesel querosene xileno e tolueno através do método da aderência microbiana a hidrocarbonetos BATH após 48 horas de crescimento em meio BH com 01 de extrato de levedura e 1 de petróleo 73 Figura 31 Hidrofobicidade celular do isolado 163 em relação ao hexadecano diesel querosene xileno e tolueno através do método da aderência microbiana a hidrocarbonetos BATH após 48 horas de crescimento em meio BH com 01 de extrato de levedura e 1 de petróleo 73 Figura 32 Teste de dispersão do óleo com sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios isolados 161 e 163 74 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Características físicoquímicas do resíduo de perfuração de poços de petróleo 46 Tabela 2 Análise de degradação de hidrocarbonetos por consórcio microbiano L e Y usando o teste 26 DCPIP 49 Tabela 3 Distribuição dos domínios no resíduo de perfuração consórcio L e Y 53 Tabela 4 Abundância relativa dos 10 gêneros mais abundantes nas amostras 55 Tabela 5 Lista de abundância relativa das vias de degradação para as três amostras resíduo de perfuração consórcio L e Y BioSurfDB 59 Tabela 6 Principais enzimas das vias cloroalcanos e cloroalcenos e microrganismos candidatos correspondentes para os consórcios L e Y utilizando o banco de dados do KEGG do IMG 61 Tabela 7 Enzimas envolvidas na degradação de alcanos e número de reads correspondentes nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB 61 Tabela 8 Enzimas envolvidas na degradação de metano e número de reads correspondentes nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB 62 Tabela 9 Enzimas envolvidas na degradação de envolvidas na degradação de pxileno de oxileno mxileno nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB 62 Tabela 10 Resultados do alinhamento do gene rDNA 16S dos isolados utilizando o banco de dados do EzTaxon 68 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BH Bushnell Haas LB Lysogeny Broth YPD Yeast Peptone Dextrose ASW Artificial seawater HPAS Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos Alk Alcano hidroxilases TTC Cloreto de 235 trifeniltetrazólio PGM Personal Genome Machine DCPIP 26diclorofenolindofenol CMC Concentração micelar crítica HTP Hidrocarbonetos totais do petróleo STAMP Statistical Analyses of Metagenomic Profiles MEGAN Metagenome Analyzer BioSurfDB Biosurfactants and Biodegradation Database RP Resíduo de perfuração EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande no Norte IE Índice de emulsificação SDS Sulfato de dodecil sódico MATH Medida de adesão a hidrocarbonetos SUMÁRIO 1 Introdução 15 2 Objetivos 17 21 Objetivo Geral 17 22 Objetivos específicos 17 3 Revisão da Literatura 18 31 Resíduo de perfuração 18 311 Tecnologias de tratamento 19 3111 Biorremediação 20 32 Degradação microbiana de hidrocarbonetos do petróleo 23 321 Degradação de hidrocarbonetos alifáticos 23 322 Degradação de hidrocarbonetos aromáticos 27 323 Biossurfactantes na degradação 29 33 Fatores que influenciam a degradação microbiana 32 331 Temperatura 32 332 Tipos de solo 32 333 Nutrientes 32 334 Salinidade 32 34 Metagenômica 33 4 Metodologia 37 41 Coleta da Amostra 37 42 Obtenção dos consórcios indefinidos e bactérias isoladas 39 421 Obtenção dos consórcios 39 422 Obtenção de bactérias isoladas 40 43 Extração de DNA quantificação e sequenciamento do metagenoma obtido diretamente do resíduo consórcios e bactérias isoladas 40 44 Análises computacionais dos metagenomas e bactérias isoladas 41 45 Testes funcionais de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes 42 451 Crescimento em Petróleo 42 452 Teste 26 DCPIP 43 453 Índice de emulsificação IE24 43 454 Espalhamento do óleo 43 455 Hidrofobicidade celular 44 456 Tensão interfacial 44 457 Ensaios em microcosmos 45 5 Resultados 46 51 Caracterização físicoquímica do resíduo de perfuração 46 52 Avaliação do potencial de degradação de hidrocarbonetos dos consórcios 46 521 Avaliação do crescimento na presença de petróleo 46 522 Teste 26DCPIP 48 53 Produção de biossurfactantes 50 531 Índice de emulsificação 50 532 Teste de dispersão do óleo 51 533 Tensão interfacial 52 54 Análises dos metagenomas 53 541 Análise taxonômica 53 542 Análise Funcional 56 543 Perfil funcional para metabolismo 56 544 Perfil funcional para degradação de hidrocarbonetos 58 5441 Enzimas de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos 60 55 Síntese de biossurfactantes 63 56 Teste em microcosmos 64 57 Bactérias isoladas 67 571 Análise taxonômica 67 572 Analise de degradação de hidrocarbonetos 70 5721 Crescimento em petróleo 70 573 Produção de biossurfactantes 71 574 Medida de adesão a hidrocarbonetos BATH 72 575 Dispersão do óleo 74 6 Discussão 75 7 Conclusão 84 8 REFERÊNCIAS 85 9 Anexos 95 15 1 Introdução Resíduos de perfuração consistem na mistura de fluido solo e fragmentos de rochas gerados durante a perfuração de poços de petróleo LEONARD STEGEMANN 2010 Resíduos que apresentam hidrocarbonetos do petróleo metais pesados e sais em sua composição são considerados perigosos e rigorosamente regulamentados em alguns países CHEN et al 2017 Estimase que as atividades de exploração e produção de petróleo e gás offshore no Brasil tenham gerado apenas em 2009 cerca 44437 toneladas de resíduos sólidos Dentre estes os oleosos são os mais abundantes e a destinação final formas de disposição final ou intermediárias inclui principalmente as estações de tratamento rerrefino e coprocessamento IPEA 2012 Os contaminantes diversos e as elevadas quantidades geradas tornam o resíduo de perfuração um grande problema para a Indústria de Petróleo e Gás Vários métodos físicos químicos e biológicos têm sido reportados na literatura no seu tratamento LEONARD STEGEMANN 2010 BALL STEWART SCHLIEPHAKE 2012 CHEN et al 2017 JÚNIOR et al 2017 Dentre estes a biorremediação têm sido considerada como uma tecnologia de tratamento promissora por ser eficiente ambientalmente sustentável e de baixo custo quando comparada aos processos físicos e químicos convencionais HOLLIGER et al 1997 BOOPATHY 2000 IWAMOTO NASU 2001 DZIONEK WOJCIESZYŃSKA GUZIK 2016 LIM LAU POH 2016 A biorremediação consiste no processo de eliminação de contaminantes através de mecanismos biológicos AZUBUIKE CHIKERE OKPOKWASILI 2016 No geral pode ocorrer in situ e ex situ por técnicas diversas sendo a maioria dos estudos voltados para atenuação natural através da bioestimulação e bioaumentação SAFDARI et al 2018 TONGARUN LUEPROMCHAI VANGNAI 2008 YU et al 2005 A atenuação natural ocorre quando microrganismos do próprio ambiente atuam naturalmente na degradação de contaminantes A introdução de nutrientes no ambiente na forma de fertilizantes ou outro fator que favoreça a atividade dos microrganismos do ambiente é chamado de bioestimulação Quando o ambiente a ser tratado não tem microrganismos apropriados a bioremediação podese optar pela bioaumentação que consiste em inocular microrganismos do próprio ambiente autóctones ou de outros ambientes alóctones com capacidades catalíticas desejadas IWAMOTO NASU 2001 16 LIM LAU POH 2016 Alguns autores consideram a bioaumentação autóctone a melhor estratégia por utilizar cepas individuais ou culturas enriquecidas do próprio ambiente a ser biorremediado BENTO et al 2005 HOSOKAWA et al 2009 Como essas estratégias se baseiam na capacidade metabólica dos microrganismos seu sucesso depende de estudos que caracterizem a comunidade microbiana e avaliem a sua capacidade de biodegradação e sobrevivência sob determinadas condições ambientais LOVLEY 2003 STEFANI et al 2015 Apesar do isolamento ser fundamental na caracterização dos microrganismos apenas uma pequena minoria pode ser cultivada e a maioria das bactérias permanece desconhecida através de métodos de cultivo padrão Com o desenvolvimento da metagenômica e avanço nas técnicas de sequenciamento do DNA informações da comunidade microbiana total incluindo microrganismos não cultiváveis e suas habilidades funcionais estão sendo obtidas PUSHPANATHAN et al 2014 Assim a metagenômica tornouse uma poderosa ferramenta em estudos voltados para biorremediação DEVARAPALLI KUMAVATH 2015 DELLAGNEZZE et al 2014 VASCONCELLOS et al 2010 YADAV et al 2015 Fatores ambientais como temperatura umidade pH matéria orgânica nutrientes e tipos de solo determinam a eficiência da biorremediação ao afetar o crescimento dos microrganismos Estes por sua vez precisam ser adequadamente selecionados quanto à capacidade em biodegradar hidrocarbonetos e sobreviver às condições ambientais A produção de biossurfactantes também é um importante fator a ser considerado já que hidrocarbonetos de petróleo são hidrofóbicos e requerem solubilização por surfactantes para aumentar a biodisponibilidade para células microbianas Assim microrganismos degradadores de hidrocarbonetos que produzem biossurfactantes provavelmente serão mais adequados a biorremediação CAMEOTRA SINGH 2008 Neste sentido o presente trabalho tem como objetivo identificar os microrganismos do resíduo de perfuração de poços de petróleo e obter a partir deste consórcios bacterianos e bactérias isoladas que tenham atividade de degradação de hidrocarbonetos eou produção de biossurfactantes visando aplicação em estratégias de biorremediação 17 2 Objetivos 21 Objetivo Geral Caracterizar através da metagenômica a comunidade microbiana presente no resíduo de perfuração de poços de petróleo no município de MossoróRN e obter a partir deste consórcios bacterianos e bactérias isoladas que tenham atividade de biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes 22 Objetivos específicos Obter consórcios microbianos a partir do resíduo de perfuração de poços de petróleo relacionados à biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes Analisar a influência de dois meios de cultivo na obtenção dos consórcios microbianos Avaliar se os consórcios selecionados através de métodos de cultivo refletem a comunidade microbiana autóctone da qual foram selecionados Determinar a eficiência da bioaumentação autóctone na degradação de alcanos Obter a partir dos consórcios selecionados bactérias com capacidade de biodegradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes 18 3 Revisão da Literatura 31 Resíduo de perfuração A perfuração consiste na etapa mais importante da extração do petróleo CHEN et al 2017 Durante essa fase fluidos de perfuração são usados para estabilizar o poço lubrificar e resfriar a broca e transportar o solo e fragmentos de rochas à superfície do poço Ao chegar a superfície essa mistura denominada de resíduo de perfuração é submetida a processos de separação para que o fluido seja recuperado e retorne ao poço LEONARD STEGEMANN 2010 THOMAS 2001 Após o processo de separação grande parte do fluido de perfuração permanece aderido ao resíduo influenciando a composição química que varia de acordo com o tipo de fluido utilizado e a composição da rocha perfurada Geralmente inclui hidrocarbonetos sais solúveis em água e metais pesados CHEN et al 2017 NEFF 2005 O acúmulo desse tipo de resíduo pode trazer uma série de prejuízos ao meio ambiente à saúde humana e sobretudo ao desenvolvimento sustentável e como não é possível interromper a cadeia de geração é preciso avançar no que concerne ao gerenciamento RIPA et al 2017 Uma das melhores formas de gerenciar adequadamente os resíduos contaminados com petróleo é através da reutilização No Brasil não há uma legislação específica para esse tipo de resíduo Assim uma vez produzido é classificado como outros tipos de resíduo pela Norma Brasileira 100042004 quanto à periculosidade para posteriormente elaborar planejar e efetivar corretamente o gerenciamento em conformidade com os riscos ambientais à saúde pública e meio ambiente Os resíduos sólidos industriais e de origem diversa são classificados quanto à periculosidade segundo a norma técnica Norma Brasileira 100042004 em classe I que inclui resíduos perigosos e classe II para os não perigosos ou seja que podem ou não causar danos à saúde e ao ambiente respectivamente Os não perigosos são subdivididos em não inertes classe IIA e inertes classe IIB Assim uma vez classificados esses resíduos podem ser submetidos a diversos métodos químicos físicos e biológicos para reduzir ou eliminar contaminantes e possibilitar a disposição no meio de forma a minimizar impactos ou garantir a reutilização 19 como substituto parcial do cimento na fabricação de concreto MOSTAVI ASADI UGOCHUKWU 2015 e materiais para construção de rodovias HASSAN et al 2005 TUNCAN 2000 311 Tecnologias de tratamento Uso de agentes oxidantes incineração coprocessamento microondas solidificação estabilização aterro e estratégias de biorremediação são alguns métodos utilizados para tratamento eou disposição de resíduos de perfuração BALL STEWART SCHLIEPHAKE 2012 JÚNIOR et al 2017 LEONARD STEGEMANN 2010 LIM LAU POH 2016 A escolha da técnica mais adequada depende das condições físicas químicas e biológicas do local contaminado da concentração do contaminante e do tempo necessário para degradação ou remoção do composto alvo ALMEIDA ANDRADE AUGUSTO FONTES JARDIM 2010 O peróxido de hidrogênio reagente fenton e ozônio são alguns agentes oxidantes utilizados na remoção de hidrocarbonetos A oxidação é um processo simples e rápido em que o agente oxidante é injetado sem que haja formação de subprodutos após a degradação Em contrapartida a necessidade de pH baixo e a emissão de calor durante as reações afetam a biota tornando o processos desvantajoso LIM LAU POH 2016 Tecnologias térmicas são eficazes na remoção de hidrocarbonetos Resíduos de perfuração com teor de hidrocarbonetos entre 10 e 40 são considerados adequados para esse tratamento BALL STEWART SCHLIEPHAKE 2012 Coprocessamento e incineração são alguns dos métodos térmicos mais frequentemente utilizados O coprocessamento consiste no reaproveitamento de resíduos industriais sem valor comercial como substituto parcial da matériaprima ou como combustível na produção de cimento ROCHA et al 2011 Na incineração o resíduo é submetido ao tratamento térmico sem aproveitamento como combustível A incineração é um método rápido e confiável principalmente pela grande efetividade na remoção de materiais perigosos e capacidade em tratar grandes volumes A principal desvantagem dessa técnica é a emissão de gases aumentando a poluição ambiental consumo excessivo de energia e altos custos para realização do processo Apesar do coprocessamento apresentar menor emissão de gases poluentes na atmosfera é preciso atentarse para variações na composição do resíduo que prejudicam tanto o processo como o produto final BALL STEWART SCHLIEPHAKE 2012 LIM LAU POH 2016 20 Tratamentos como a estabilizaçãosolidificação que envolvem alterações físicas e químicas concomitantes do material têm sido frequentemente utilizados AL ANSARY ALTABBAA 2007 LEONARD STEGEMANN 2010 A estabilização envolve a conversão de contaminantes em uma forma menos tóxica eou menos solúvel enquanto a solidificação envolve o encapsulamento do resíduo na forma sólida com materiais de baixa permeabilidade Ball e colaboradores 2012 mencionam o pouco espaço requerido e a rapidez no processo como principais vantagens desses métodos e como desvantagem os grandes custos na instalação e riscos associados aos longos prazos de estabilização Para WILLES 1987 as vantagens e desvantagens dessas técnicas variam em função de fatores diversos como o tipo de processo aglomerantes características do resíduo condições locais entre outros Aterros continuam sendo um dos destinos mais utilizados para disposição dos resíduos sólidos diversos gerados no Brasil ABRELPE 2014 É também um dos principais destinos para resíduos da indústria do petróleo principalmente os classificados como perigosos classe I e não perigosos classe IIA segundo a NBR100042004 IPEA 2012 Nos aterros sanitários os resíduos são dispostos no solo cuja parte superior e inferior encontramse impermeabilizadas Segundo a Norma 10157 da Associação Brasileira de Normas Técnicas ABNT a impermeabilização do aterro deve ser realizada através de materiais compatíveis ao resíduo e capaz de resistir a possíveis rupturas Além disso se faz necessário a instalação de um sistema de drenagem para remoção de liquido percolado do aterro As maiores preocupações com uso de aterros são o potencial de contaminação das águas subterrâneas requisitos de estabilização e monitoramento Resíduos com teor de óleos e graxas acima de 5 não são recomendados para aterros O custo relativamente baixo constitui uma das principais vantagens desse método no entanto a taxa de biodegradação lenta monitoramento a longo prazo e a recuperação do local são algumas das principais desvantagens BALL STEWART SCHLIEPHAKE 2012 3111 Biorremediação Apesar de desenvolvida em meados de 1940 a biorremediação teve seu destaque apenas em 1989 diante de um dos maiores acidentes ambientais da história o encalhe do navio Exxon Valdez em Prince Willian Alasca LIM LAU POH 2016 Até 1989 21 muitos estudos relatavam o processo de biodegradação do petróleo e as variáveis que o influenciavam no entanto esses conhecimentos praticamente se restringiam a academia Com o acidente foram disponibilizados no mercado diversos produtos relacionados à biorremediação e surgiu a necessidade de organização de um Comitê para desenvolver e avaliar esses produtos Assim começaram a ser elaborados os primeiros protocolos de biorremediação desenvolvidos pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos HOFF 1993 A biorremediação consiste na tecnologia em que mecanismos biológicos são utilizados para degradar contaminantes ambientais diversos embora a maioria dos estudos esteja voltado para os hidrocarbonetos AZUBUIKE CHIKERE OKPOKWASILI 2016 Conforme pode ser visto na Figura 1 é a tecnologia de menor custo quando comparada a métodos físicos e químicos como incineração aterro e lavagem ANDRADE AUGUSTO FONTES JARDIM 2010 Além disso é ambientalmente sustentável pode ser realizada no local onde os resíduos estão acumulados com interrupção mínima em conjunto com tratamentos físicos e químicos AZUBUIKE CHIKERE OKPOKWASILI 2016 Figura 1 Comparação entre diferentes tipos de tratamento e seus respectivos custos dólar por m3 de solo Fonte EPA modificado por ANDRADE AUGUSTO JARDIM 2010 Conforme pode ser visto na Figura 2 existem diversas tecnologias de biorremediação Algumas por serem aplicadas no local da contaminação são 22 classificadas como in situ outras são aplicadas em local diferente do contaminado e recebem a denominação de biorremediação ex situ Iwamoto e Nasu 2001 apontam o fato do processo ser realizado no local da contaminação com interrupção local mínima e ausência de custos no transporte como as principais vantagens da biorremediação in situ Figura 2 Esquema com algumas das tecnologias de biorremediação ex situ e in situ Fonte AZUBUIKE CHIKERE OKPOKWASILI 2016 com modificações Além da atenuação natural Boopathy 2000 cita a bioaumentação e bioestimulação como principais técnicas de biorremediação in situ e ex situ A atenuação natural é o processo em que contaminantes são eliminados naturalmente pelos microrganismos do próprio ambiente No entanto este é um processo lento e muitas vezes precisa ser estimulado através da correção de fatores que favoreçam à atividade dos microrganismos nutrientes oxigênio entre outros passando a ser denominado de bioestimulação Outra opção para acelerar a degradação é a bioaumentação que consiste na introdução de microrganismos do próprio ambiente autóctone ou de outros locais alóctone com capacidade metabólica desejada IWAMOTO NASU 2001 Bioestimulação e bioaumentação usados conjuntamente têm apresentado resultados promissores quanto à degradação de hidrocarbonetos SAFDARI et al 2017 23 Embora alguns autores sugiram que adicionar nutrientes pode ser mais eficiente do que adicionar microrganismos nem todos os microrganismos encontrados no ambiente são capazes de degradar hidrocarbonetos Além disso a adição excessiva de nutrientes pode trazer inúmeros prejuízos ao ambiente especialmente através do aumento da salinidade Para evitar isso temse recomendado a utilização da bioaumentação autóctone através de microrganismos exclusivamente do local a ser remediado HOSOKAWA et al 2009 O sucesso tanto da bioestimulação como da bioaumentação depende de fatores diversos incluindo estudos voltados para os microrganismos do ambiente a ser bioremediado quanto à capacidade em degradar de hidrocarbonetos e produzir biossurfactantes BOOPATHY 2000 32 Degradação microbiana de hidrocarbonetos do petróleo As elevadas concentrações de carbono disponível têm favorecido o aparecimento de microrganismos que utilizam hidrocarbonetos como fonte de carbono e energia Prince et al 2010 listaram mais de 175 gêneros publicados de organismos capazes de crescer usando hidrocarbonetos como única ou principal fonte de carbono e energia Ainda segundo esses autores esses valores podem estar subestimados visto que os organismos que metabolizam os hidrocarbonetos geralmente crescem em consórcios mutuamente benéficos Microrganismos isolados dificilmente promoverão a degradação completa do petróleo uma vez que até 17 mil compostos orgânicos foram identificados em sua composição BJORLYKKE 2011 Assim é necessário a atuação de consórcios que através do metabolismo sinérgico utilizam produtos intermediários gerados por alguns microrganismos tornando o processo mais eficiente e rápido DAS KAZY 2014 321 Degradação de hidrocarbonetos alifáticos Alcanos são os hidrocarbonetos saturados que podem constituir a maior parte do petróleo bruto ROJO 2009 Bactérias degradadoras de alcanos são muito versáteis em seu metabolismo e costumam preferir vários outros compostos como fonte de energia a alcanos a exceção de gêneros hidrocarbonoclásticos como Alcanivorax Cycloclasticus Oleiphilus Oleispira e Thalassolituus que utilizam esse hidrocarboneto como fonte de carbono e energia preferida YAKIMOV TIMMIS GOLYSHIN 2007 24 Os alcanos assim como a maioria dos hidrocarbonetos apresentam baixa solubilidade o que dificulta a utilização pelos microrganismos Ainda não se sabe exatamente como os alcanos penetram nas células microbianas uma vez que fatores ambientais tipos de alcanos e de espécie microbiana em questão interferem nesse processo Foi proposto que alcanos de baixa massa molecular possuem solubilidade suficiente para serem absorvidos pela célula enquanto os de cadeia longa podem ser utilizados por adesão às gotículas de hidrocarbonetos ou facilitada através da utilização de biossurfactantes ROJO 2009 A degradação aeróbica de alcanos pode ocorrer por oxidação terminal ou subterminal Em ambos os casos o processo iniciase por ação das monooxigenases e segue com a formação de álcool primário e secundário na via terminal e subterminal respectivamente Em seguida por ação da álcool desidrogenase um aldeído é formado na via terminal e uma cetona na via subterminal O aldeído formado é convertido a ácido carboxílico por ação da aldeído desidrogenase que é finalmente convertido a ácidos graxos que são conjugados com CoA e processados por β oxidação para gerar acetil CoA A cetona formada na via subterminal é oxidada por uma monoxigenase Baeyer Villiger e um éster é formado e hidrolisado por uma esterase gerando um álcool e um ácido graxo Figura 3 A degradação anaeróbia dos alcanos também desempenha um papel importante na remoção de hidrocarbonetos no meio ambiente Diversas bactérias foram descritas como capazes de utilizar alcanos na ausência de oxigênio Para tanto esses microrganismos utilizam nitrato ou sulfato como aceptor final de elétrons ROJO 2009 Muitos avanços são relatados em estudos de biodegradação anaeróbica de alcanos quanto aos microrganismos e vias envolvidas MBADINGA et al 2011 25 Figura 3 Via de degradação aeróbica de alcanos por oxidação terminal e subterminal Fonte Fritsche e Hofrichter 2008 modificado por Cruz e Marsaioli 2012 Alcano hidroxilases AlkB são enzimas chaves na degradação aeróbia de alcanos ao hidroxilar estes a álcoois Uma vez formados os álcoois são oxidados a ácidos graxos que possui uma metabolização comum entre os microrganismos As AlkB são monooxigenases mais comumente encontradas e que requerem duas proteínas de transferência de elétrons uma rubredoxina redutase AlkT e uma rubredoxina para a 26 atividade AlkG Nesse caso a rubredoxina redutase transfere elétrons do NADH para a rubredoxina que faz a transferência para a AlkB Assim AlkB transfere um átomo de oxigênio do O2 para a molécula de alcano enquanto o outro oxigênio é reduzido para H2O utilizando o elétron proveniente de rubredoxina redutase via rubredoxina conforme observado na Figura 4 ROJO 2010 Figura 4 Oxidação de alcanos através da ALKB a e citocromo P450 b Fonte Rojo 2010 Outro exemplo de alcano hidroxilases é a família citocromo P450 encontrada em bactérias degradadoras de alcanos normalmente na ausência de AlkB embora possa coexistir em algumas espécies NIE et al 2014 Diferentemente da AlkB esse citocromo utiliza a ferredoxina redutase e a ferredoxina na transferência de elétrons conforme pode ser visto na Figura 4b ROJO 2010 Além da AlkB e citocromo P450 outras alcano hidroxilases têm sido descritas para alcanos de cadeias longas e muitas outras ainda devem ser descritas Genes alkB e cyp foram detectados simultaneamente em 38 genomas que pertenciam a 16 gêneros incluindo Marinobacter Alcanivorax Rhodococcus e Mycobacterium NIE et al 2014 Os alcanos atuam como quimioatratores para alguns microrganismos facilitando o contato e consequentemente a degradação Na bactéria hidrocarbonoclástica Alcanivorax foram identificadas maquinarias relacionadas a quimiotaxia WANG SHAO 2013 27 322 Degradação de hidrocarbonetos aromáticos Hidrocarbonetos aromáticos são moléculas orgânicas caracterizadas pela presença de um ou mais anel aromático que podem causar diversos problemas ao ambiente e à saúde humana devido suas propriedades recalcitrantes tóxicas e cancerígenas ABDEL SHAFY MANSOUR 2016 Embora estruturalmente apresentem elevada estabilidade química muitas bactérias são capazes de desestabilizar o anel e assim degradar esses compostos que apresentam ampla distribuição na natureza GHOSAL et al 2016 Diversos microrganismos pertencentes aos gêneros Stenotrophomonas Bacterium Klebsiella Bacillus Citrobacter Raoultella Achromobacter Bacillus Brevibacterium Burkholderia Cycloclasticus Marinobacter Mycobacterium Pseudomonas Rhodococcus Staphylococcus Xanthomonas Paenibacillus e Brevibacillus foram relatados na degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos SEO KEUM LI 2009 REDDY et al 2010 WU et al 2013 Os mecanismos de degradação aeróbia exigem a presença de oxigênio molecular tanto como aceptor final de elétrons como para desestabilização do anel aromático ao atuar como cosubstrato para ação das monooxigenases ou dioxigenases CHIKERE OKPOKWASILI CHIKERE 2011 VARJANI UPASANI 2017a Na degradação anaeróbia outros mecanismos como as reações redutoras são utilizados para desestabilizar o anel aromático Nesse caso outros aceptores finais de elétrons como nitrato e sulfato são utilizados em substituição ao oxigênio VARJANI UPASANI 2017a A degradação aeróbia dos hidrocarbonetos aromáticos iniciase com o ataque das oxigenases enzimas capazes de incorporar um ou dois átomos de oxigênio ao anel aromático e que recebem a denominação de mono e dioxigenases respectivamente As dioxigenases do anel aromático atuam na formação de duas hidroxilas e por conseguinte do composto cisdiol que é rearomatizado e oxidado a catecol Figura 5 Uma vez formado o catecol é substrato para as dioxigenases que atuam na clivagem do anel aromático e formação de metabólitos intermediários centrais como acetilCoA succinil CoA e piruvato todos utilizados pelos microrganismos nas vias comuns de geração de carbono e energia para o crescimento microbiano Gás carbônico CO2 e água H2O são gerados ao final dessa reação Figura 5 DAS CHANDRAN 2011 LADINO ORJUELA et al 2016 28 Diversos motivos estão associados à baixa taxa de degradação dos hidrocarbonetos aromáticos tais como a baixa solubilidade problemas associados à produção de metabólitos tóxicos repressão por metabólitos presença de substratos preferidos e falta de substratos cometabólicos KANALY HARAYAMA 2000 VAN HAMME et al 2003 Figura 5 Esquema mostrando as etapas principais da degradação de hidrocarbonetos aromáticos sob condições aeróbicas Fonte Fritsche e Hofrichter 2008 modificado por Cruz e Marsaioli 2012 29 323 Biossurfactantes na degradação Biossurfactantes são moléculas anfifílicas constituídas por uma porção hidrofílica e outra hidrofóbica que conferem uma ampla gama de propriedades incluindo a capacidade de diminuir tensão superficial e interfacial de líquidos e formar micelas e microemulsões entre diferentes fases VARJANI UPASANI 2017b Estes compostos podem ser divididos em duas classes principais compostos de baixa massa molecular biossurfactantes como glicolípideos lipopeptídeos e proteínas e compostos de alta massa molecular bioemulsificantes como proteínas lipopolissacarídicas ou lipoproteínas JOY RAHMAN SHARMA 2017 UZOIGWE et al 2015 Os glicolípideos são carboidratos ligados a ácidos alifáticos de cadeia longa ou ácidos hidroxi alifáticos por um grupo éster Entre os biossurfactantes e os microrganismos descritos como produtores incluem ramnolipídeos Pseudomonas trehalolipídeos Mycobacterium sp e soforolipídeos Torulopsis bombicola MUKHERJEE DAS 2010 Lipopeptídeos consistem em lipídeos ligado a uma cadeia polipeptídica O mais conhecido é a surfactina produzido por Bacillus subtilis cujo nome devese à grande atividade surfactante apresentada Além de surfactante estudos indicam funções antivirais antimicoplasma antitumorais anticoagulantes e como inibidor de enzimas MUKHERJEE DAS 2010 A iturina outro tipo de lipopeptídeo é descrito como potente agente antifúngico capaz de substituir pesticidas químicos atualmente utilizados na agricultura KALAIGRAMI et al 2016 Na biorremediação o uso de biossurfactantes têm como principal função a capacidade de aumentar a solubilidade e assim disponibilizar para os microrganismos substratos insolúveis em água como é o caso dos hidrocarbonetos Esses compostos podem ser extraídos e adicionados durante a biorremediação ou através da introdução do microrganismo produtor Em ambos os casos a degradação pode ser melhorada DAS CHANDRAN 2010 PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 A adição de biossurfactantes pode melhorar a degradação através da mobilização solubilização ou emulsificação O tipo de mecanismo utilizado depende da massa molecular do biossurfactante e concentração no meio conforme observado na Figura 6 PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 30 Para os biossurfactantes de baixa massa molecular a mobilização acontecerá quando a concentração estiver abaixo da concentração micelar crítica CMC que consiste na concentração do surfactante onde se inicia o processo de formação das micelas As micelas são agregados formados em solução aquosa a partir de uma determinada concentração de surfactantes É a configuração das moléculas de surfactantes com melhor estabilidade na solução com as cadeias hidrofóbicas agrupadas entre si e a parte hidrofílica das moléculas voltada para a água Assim o efeitos dos surfactantes é maior quando uma quantidade significante de micelas encontrase presente PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 Quando os biossurfactantes de baixa massa molecular estiverem em uma concentração acima da CMC ocorrerá o processo de solubilização que consiste no processo de incorporação de moléculas orgânicas hidrofóbicas em uma micela Assim nessas concentrações as moléculas de biossurfactantes se associam para formar as micelas e consequentemente aumentar a solubilidade de compostos orgânicos cuja solubilidade em água é baixa PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 Os biossurfactantes de alta massa molecular apresentam propriedades emulsificantes eficientes na biorremediação de hidrocarbonetos Nesse processo são formadas as emulsões contendo pequenas gotículas de óleo suspensas em um fluido PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 Figura 6 Mecanismos de remoção de hidrocarbonetos por biossurfactantes em função da massa molecular e concentração micelar crítica CMC Fonte PacwaPłociniczak et al 2011 Biossurfactantes de baixa massa molecular Abaixo da CMC Acima da CMC Biossurfactantes de alta massa molecular MOBILIZAÇÃO SOLUBILIZAÇÃO EMULSIFICAÇÃO 31 Alguns autores consideram os bioemulsificantes como biossurfactantes PACWAPŁOCINICZAK et al 2011 Outros como Uzoigwe e colaboradores 2015 consideram que bioemulsificantes não são biossurfactantes Para esses últimos autores embora ambos sejam produzidos por microrganismos existem diferenças físicoquímicas e fisiológicas entre eles Os biossurfactantes apresentam como principal atividade a redução da tensão superficial e interfacial e formação de emulsão estáveis os bioemulsificantes também apresentam uma alta capacidade de emulsificação de compostos hidrofóbicos mesmo em baixas concentrações no entanto reduzem muito pouco a tensão superficial e interfacial As várias funções apresentadas por um biossurfactante podem ser exclusivas da fisiologia e ecologia do microrganismo sendo portanto impossível identificar uma ou mais funções comuns a todos CAMEOTRA et al 2010 O motivo exato pelo qual alguns microrganismos produzem biossurfactantes ainda não é claro Em geral a produção de biossurfactantes para os microrganismos tem como principais funções a adesão emulsificação biodisponibilidade dessorção e estratégia de defesa CAMEOTRA et al 2010 A produção de alguns biossurfactantes como surfactina por Bacillus e ramnolipídeos por Pseudomonas é reguladas pelos mecanismos de quorum sensing e controlada por parâmetros ambientais DAS MUKHERJEE SEN 2008 O tipo a qualidade e a quantidade produzida são influenciadas pela fonte de carbono concentração de nitrogênio fósforo magnésio ferro e manganês no meio de cultura bem como pH temperatura e agitação BANAT 1995 A produção em muitos casos melhora com o aumento da salinidade e na presença de ureia A fonte de nitrogênio pode ser fator chave para a síntese de biossurfactantes MULLIGAN 2014 As principais vantagens de se utilizar os surfactantes produzidos por microrganismos em substituição aos sintéticos incluem a não toxicidade ao ambiente estabilidade em temperaturas extremas pH e salinidade o que é desejável em vários processos industriais como processamento de alimentos formulações farmacêuticas recuperação melhorada de petróleo e biorremediação ambiental NITSCHKE PASTORE 2002 32 33 Fatores que influenciam à degradação microbiana 331 Temperatura A temperatura desempenha papel fundamental na degradação ao afetar o estado físico dos hidrocarbonetos e a taxa de crescimento dos microrganismos O aumento da temperatura reflete em aumento da solubilidade de poluentes hidrofóbicos e diminuição da viscosidade enquanto a baixas temperaturas a viscosidade do óleo aumenta a volatilização de alcanos tóxicos de cadeia curta é reduzida e a solubilidade na água diminui retardando a biodegradação VARJANI UPASANI 2017a Além disso os microrganismos são capazes de suportar até determinados limites de temperatura A maioria das bactérias encontradas no solo são mesófilas com uma temperatura ótima que varia de 30 a 40 C DAS CHANDRAN 2011 332 Tipos de solo Solos com baixa permeabilidade como os argilosos podem apresentar baixa biodegradação ao retardar o transporte de oxigênio e nutrientes enquanto solos arenosos por serem mais porosos permitem uma melhor transferência de oxigênio no solo Haghollahi et al 2016 observaram remoção de 70 de hidrocarbonetos totais do petróleo HTP para solo arenoso e cerca de 20 para solo argiloso 333 Nutrientes Concentrações de nutrientes como carbono nitrogênio e fósforo precisam ser suficientes para o crescimento dos microrganismos e consequente sucesso do processo de degradação Proporções requeridas desses nutrientes variam de acordo com o tipo de bactéria fonte de carbono metabolizada e tipo de ambiente Relação de Carbono Nitrogênio Fósforo de 100101 respectivamente tem sido em geral utilizada para assegurar um meio equilibrado para crescimento microbiano LEAHY COLWELL 1990 VARJANI UPASANI 2017a 334 Salinidade 33 Os hidrocarbonetos são menos disponíveis em ambientes hipersalinos uma vez que os sais solúveis reduzem a solubilidade dos compostos orgânicos hidrofóbicos na água Além disso a disponibilidade de oxigênio é comprometida uma vez que sua solubilidade diminui à medida que a concentração de sal aumenta No entanto de modo geral o aumento na concentração de sais não é necessariamente um impedimento à biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo A atividade microbiana é afetada por flutuações nas concentrações de sal abaixo ou acima para o crescimento ótimo do microrganismo em estudo MARTINS PEIXOTO 2012 34 Metagenômica A maioria dos microrganismos encontrados na natureza não pode ser cultivada pelos métodos tradicionais STEFANI et al 2015 Vartoukian e colaboradores 2010 apontam diversas razões para isso A primeira é que muitos microrganismos por apresentar crescimento lento ou baixa prevalência acabam não sendo considerados durante a análise das culturas A segunda é que ao se utilizar métodos bioquímicos convencionais na identificação microrganismos geneticamente distintos acabam sendo agrupados juntos Além disso muitos microrganismos não crescem quando as necessidades nutricionais e ambientais necessárias ao crescimento não são atendidas artificialmente Outro fator apresentado pelos autores é a quebra de interações estabelecidas entre os microrganismos através da formação de biofilmes e mecanismos de quorumsensing Avanços no crescimento de espécies de difícil cultivo foram obtidos através de métodos que incluem simulação do ambiente e cocultivo com outras bactérias do ambiente STEWART 2012 No entanto ainda são baixos os números de microrganismos validamente descritos ACHTMAN WAGNER 2008 Assim para superar as dificuldades e limitações associadas as técnicas de cultivo várias técnicas moleculares independentes de cultivo têm sido desenvolvidas Para VazMoreira et al 2011 as abordagens dependente e independente de cultivo são complementares Enquanto as abordagens dependentes de cultivo permitem através do isolamento de espécies bacterianas caracterizar os microrganismos totalmente os métodos independentes de cultivo possibilitam o conhecimento de inúmeras espécies 34 microbianas desconhecidas de uma ampla gama de habitat VARTOUKIAN PALMER WADE 2010 Métodos independentes de cultivo baseados na análise de genes 16S rRNA fornece informações acerca de táxons e espécies presentes em um ambiente No entanto esses dados geralmente fornecem pouca ou nenhuma informação sobre o papel funcional dos microrganismos STREIT SCHMITZ 2004 Em contrapartida a metagenômica consiste em um dos métodos independentes de cultivo em que são realizadas análises genômicas total das comunidades de microrganismos de uma amostra Ao sequenciar os genomas de todos os organismos em vez de um único gene marcador informações taxonômicas e funcionais de uma comunidade microbiana e suas interações são conhecidas HANDELSMAN et al 1998 No entanto como tratase de uma análise baseada em DNA genes expressos e não expressos não podem ser diferenciados SOREK COSSART 2010 Na última década a metagenômica baseada em dados de sequenciamento de nova geração NGS gerou um enorme volume de dados e tornouse um campo de pesquisa de rápido crescimento principalmente pelo baixo custo tornando esta tecnologia acessível para mais pesquisadores DUDHAGARA et al 2015 ESCOBARZEPEDA DE LEÓN SANCHEZFLORES 2015 JÜNEMANN et al 2017 Para acompanhar o rápido progresso a bioinformática cresceu de forma semelhante oferecendo até agora diversas ferramentas de análise para identificar essas informações O MEGAN e o MGRAST por exemplo geram informações taxonômicas e funcionais No entanto em nenhum desses bancos é possível analisar a função no contexto da filogenia ou vice e versa HUSON et al 2007 Outros bancos de dados que permitem a análise específica voltada à degradação de hidrocarbonetos e produção de Biossurfactantes BioSurfDB foram desenvolvidos OLIVEIRA et al 2015 Assim dado o tamanho cada vez maior dos conjuntos de dados metagenômicos o desempenho e a capacidade de tais ferramentas tornamse essencial SU et al 2012 As análises metagenômicas geralmente são iniciadas pelo isolamento do DNA que pode ser obtido diretamente do ambiente solo água sedimento entre outros ou do enriquecimento de microrganismos no laboratório STREIT SCHMITZ 2004 Em seguida podese realizar o sequenciamento e análise por bioinformática ou utilizar o DNA para construção de bibliotecas ao clonar fragmentos de DNA em vetor adequado O vetor é escolhido em função do tamanho de fragmento que se deseja clonar geralmente são utilizados plasmídeos até 15kb cosmídeos ou fosmídeos ambos até 40kb SIMON 35 DANIEL 2011 A abordagem clássica inclui a construção de bibliotecas de pequenos insertos 10 kb e de Escherichia coli como cepa hospedeira HENNE et al 1999 A principal desvantagem desse tipo de biblioteca consiste no fato dos pequenos insertos não permitir a detecção de grandes grupos de genes ou operons Nesse sentido muitos pesquisadores têm optado por utilizar bibliotecas de grandes insertos como cosmídeos e fosmídeos VASCONCELLOS et al 2010 Duas estratégias são geralmente utilizadas para pesquisar e identificar genes de bibliotecas abordagens com análise baseada em função ou na sequência A análise baseada em função tem o potencial para identificar classes completamente novas de genes que codificam funções novas ou conhecidas A maioria dos testes para seleção de genes que codificam novas biomoléculas baseiase nas atividades metabólicas de clones presentes nas bibliotecas metagenômica A aplicação de abordagens baseadas em sequências envolve o desenho de iniciadores primers derivados de regiões conservadas de genes ou famílias de proteínas já conhecidas Assim apenas novas variantes de classes funcionais de proteínas conhecidas podem ser identificadas HANDELSMAN 2005 HANDELSMAN et al 1998 Desde a sua introdução a metagenômica tem sido utilizada para fins diversos como a identificação de um número significativo de genes novos que codificam biocatalisadores ou moléculas com alto potencial na produção de produtos para fins diversos como transplante de órgãos tratamento de câncer controle de colesterol com atividade fungicida inseticidas entre outros STREIT SCHMITZ 2004 LORENZ ECK 2005 DEMAIN SANCHEZ 2009 detecção de sistemas quorum sensing KIMURA 2014 identificação de microrganismos relacionados a diversos tipos de câncer BANERJEE MISHRA DHAS 2015 monitoramento ambiental biorremediação TECHTMANN HAZEN 2016 e produção de biossurfactantes JACKSON et al 2015 Na biorremediação mudanças na composição da comunidade microbiana pode afetar o destino de um contaminante no ambiente LOVLEY 2003 Assim além de informação das taxas de degradação é importante compreender as comunidades microbianas envolvidas para estimular de forma mais eficiente esse processo Diversos estudos têm relatado a importância do uso de abordagens metagenômicas na biorremediação Vasconcellos e colaboradores 2010 demonstraram o potencial da abordagem metagenômica para a prospecção da diversidade microbiana através de biblioteca metagenômica obtida de reservatórios de petróleo Os autores 36 encontraram clones com capacidade de degradação de hexadecano acima de 70 Aplicação desses clones com cepas microbianas também derivadas de reservatórios de petróleo foram avaliadas em microcosmos artificiais com água do mar usando petróleo como fonte de carbono e energia Os resultados mostraram que cepas isoladas bem como clones metagenômicos eram capazes de degradar vários compostos de petróleo revelando uma estratégia inovadora com grande potencial na biorremediação DELLAGNEZZE et al 2014 Bao et al 2017 também demonstram através da metagenômica o grande potencial dos microrganismos em solos contaminados com petróleo em área de campo petrolífero na China As análises taxonômicas e funcionais revelaram elevada diversidade na comunidade microbiana e a presença de vias envolvidas na degradação de vários compostos xenobióticos como tolueno xileno clorobenzoato aminobenzoato Yadav et al 2015 utilizaram abordagem metagenômica comparativa para demonstrar os efeitos das variações sazonais e condições ambientais na composição da comunidade microbiana Os autores sugeriram a utilização das informações da estrutura da comunidade e das vias de degradação geradas no estudo na escolha da melhor estratégia biorremediação A maioria dos estudos voltados para a produção de biossurfactantes ainda estão relacionados ao isolamento de culturas DHASAYAN KIRAN SELVIN 2014 JOY RAHMAN SHARMA 2017 REDDY et al 2010 No entanto pesquisas com bibliotecas metagenômicas baseadas em função oferecem a promessa de descoberta de novas enzimas ou funções Thies et al 2016 ao realizarem triagem funcional com biblioteca metagenômica identificaram várias lipases proteases e dois clones com atividades biossurfactantes e hemolíticas Jackson et al 2015 citam que os poucos trabalhos utilizando abordagem metagenômica para moléculas de biossurfactantes devese aos complexos mecanismos relacionados à sua produção e a falta de pesquisas para essas atividades muito embora diversos métodos de triagem adequado para rastrear clones de bibliotecas para essa atividade estejam disponíveis KENNEDY et al 2011 Assim a presença de DNA metagenômico de ambiente associados a screenings e hospedeiros heterólogos apropriados facilitarão o surgimento de novas moléculas com propriedades de biossurfactantes JACKSON et al 2015 37 4 Metodologia 41 Coleta da Amostra A amostra estudada consiste no resíduo obtido durante a perfuração de poços de petróleo no município de Mossoró Rio Grande do Norte Figura 7 cujo montante está na ordem de milhares de toneladas acumuladas A amostra foi coletada pela empresa Brasil Química e Mineração Industrial Ltda durante a perfuração das fases de poços A coleta das amostras foi realizada do início até o fim da perfuração da fase de um poço terrestre As quantidades amostradas de resíduos impregnados com fluidos base parafinas e ésteres foram de 50 kg Após a coleta esses resíduos foram dispostos em embalagens plásticas e transportadas até o laboratório para caracterização e obtenção dos consórcios Análises físicoquímicas desse resíduo foram realizadas pela Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande no Norte EMPARN Figura 7 Mapa de localização do município de Mossoró onde encontrase acumulado o resíduo de perfuração 38 Ao chegar ao laboratório as amostras foram submetidas ao procedimento de extração do DNA total seguido de sequenciamento e análise taxonômica e funcional Paralelamente o mesmo resíduo utilizado na extração de DNA foi utilizado para obtenção dos consórcios em diferentes meios de enriquecimento Após seleção os consórcios foram avaliados quanto à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes e em seguida submetidos à extração de DNA total sequenciamento e quantificação Uma vez selecionados e avaliados os consórcios foram utilizados para isolamento de bactérias relacionadas à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes Na Figura 8 um fluxograma da sequência metodológica desenvolvida durante as etapas experimentais resume todas as etapas do trabalho Informações detalhadas de cada fase são descritas nos itens a seguir Figura 8 Fluxograma das etapas metodológicas desenvolvidas ao longo da pesquisa Resíduo de Perfuração Seleção consórcios indefinidos Testes funcionais Isolamento Análise taxonômica e funcional Sequenciamento Análise taxonômica Degradação de hidrocarbonetos Biossurfactantes Extração de DNA total Sequenciamento 39 42 Obtenção dos consórcios indefinidos e bactérias isoladas 421 Obtenção dos consórcios Os microrganismos presentes no resíduo de perfuração foram selecionados em duas etapas A primeira denominada de etapa de enriquecimento teve como objetivo o crescimento do maior número de microrganismos possível através dos meios ricos Lysogeny Broth LB e Yeast Peptone Dextrose YPD Essa etapa consistiu em pesar 8 g de resíduo de perfuração e transferir para frascos Erlenmeyer contendo 50 mL de LB composição em gL triptona 10 extrato de levedura 5 NaCl 10 e 50 mL de YPD composição em gL extrato de levedura 10 peptona ou triptona 20 e glicose 20 ambos com pH 7 e com 1 vv de petróleo bruto estéril Em seguida esses frascos foram transferidos para shaker a 180 rpm e 37 ºC por 7 dias Após esse período 1 da cultura crescida foi transferida para um novo frasco Erlenmeyer contendo meio de cultura LB e YPD e 1 de petróleo e foram transferidos para shaker sob as mesmas condições agitação e temperatura descritas anteriormente Essa etapa de enriquecimento ocorreu durante 3 semanas consecutivas Na segunda fase de obtenção dos consórcios denominada de etapa de seleção foi utilizado meio de cultura BushnellHaas com petróleo como única fonte de carbono para que um maior número de microrganismos degradadores de petróleo pudesse ser selecionado Assim as duas amostras obtidas a partir dos diferentes meios LB e YPD na etapa de enriquecimento foram centrifugadas 4500 xg por 15 minutos e o pellet obtido suspenso e 2 de seu volume transferido para frascos Erlenmeyer com 50 mL de meio BushnellHaas BH composição em gL 02 de MgSO4 002 de CaCl210 de KH2PO4 10 de K2HPO4 10 de NH42SO4 e 005 de FeCl3 contendo 1 vv de petróleo como única fonte de carbono As amostras foram incubadas sob as mesmas condições descritas previamente agitação e temperatura por 10 dias e em seguida 2 da cultura crescida foi transferida para frasco Erlenmeyer contendo meio BH e petróleo como única fonte de carbono e energia Essa etapa se repetiu durante 3 semana e após esse período os dois consórcios indefinidos independentes obtidos denominados de consórcio L préenriquecimento em meio LB e Y préenriquecimento em meio YPD foram estocados em glicerol 50 a 20 ºC e 80 ºC até seu uso 40 422 Obtenção de bactérias isoladas As bactérias isoladas foram obtidas a partir dos consórcios indefinidos L e Y Para tanto inicialmente 50 mL de meio BushnellHaas 1 da cultura dos consórcios e 1 de petróleo foram adicionados em frascos Erlenmeyer Em seguida foram levados ao shaker a 180 rpm e 37 C durante 24 horas Após esse período 100 µL da cultura foi utilizada no plaqueamento da cultura pelo método spread plate em placas com BH ágar 1 de petróleo e cloreto de 235 trifeniltetrazólio TTC 10 mL de solução a 1 L reagente indicador da atividade de degradação do petróleo OLGA et al 2008 Em seguida as placas foram transferidas para a estufa a 37 C durante 7 dias Após esse período as colônias com coloração rósea indicativo de degradação foram selecionadas e transferidas para tubo Falcon contendo 2 mL de meio rico LB ou YPD e levado ao shaker a 37C e 180 rpm Após 48 horas período com maior crescimento os isolados foram novamente plaqueados em meio rico no qual foram inicialmente selecionados LB ou YPD contendo ágar visando à confirmação do isolamento mediante a observação das colônias Após a confirmação do isolamento das culturas estoques em glicerol 50 foram preparados e em seguida foram armazenados a 20C até a utilização 43 Extração de DNA quantificação e sequenciamento do metagenoma obtido diretamente do resíduo consórcios e bactérias isoladas O DNA do metagenoma obtido diretamente do resíduo de perfuração e dos consórcios selecionados L e Y foram extraídos através dos Kits Power Soil DNA Kit MoBioLaboratories lnc e UltraClean Microbial DNA Isolation MoBioLaboratories lnc respectivamente Todas as etapas de extração seguiram as recomendações do fabricante A qualidade e quantidade de DNA foi estimada através de gel de agarose 08 e Qubit 20 Fluorometers Após confirmação da qualidade e quantidade do DNA foi realizado o sequenciamento através da Plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine PGM Thermo Fisher Scientific no Laboratório Nacional de Computação Científica LNCC em Petrópolis Rio de Janeiro sob supervisão da Professora Ana Tereza Vasconcelos Cada amostra foi sequenciada em um único Chip 41 318 600 Mb 2Gb de sequências considerando fragmentos de 200 bp Todas as etapas do sequenciamento foram realizadas seguindo os protocolos da Life Technologies A extração do DNA das bactérias isoladas seguiu o mesmo procedimento de extração de DNA dos consórcios através do Kit UltraCleanMicrobial DNA Isolation MoBioLaboratories lnc Gel de agarose a 08 também foi utilizado para verificar a qualidade do DNA Após essa etapa a reação de amplificação do gene 16S rDNA de bactéria foi realizada com uso de iniciadores específicos 27F AGAGTTTGATCMTGGCTGAG e 1525R AAGGAGGTGWTCCARCC As reações foram realizadas para um volume de 25 µL contendo 1µL de DNA genômico 25µL de tampão de PCR 10X 075µL de solução de MgCl2 50mM 05 de dNTPs 10mM 125µL do iniciador 27F 125µL do iniciador 1525R 10mM 01µL de Taq polimerase As reações de amplificação foram submetidas a um termociclador programado para realizar uma desnaturação inicial de 2 minutos a 94C seguindo de 35 ciclos de 45 segundos a 94C 1 minutos a 55C 2 minutos a 72C e uma extensão final de 10 minutos a 72C Os produtos de PCR foram purificados usando o kit CleanSweep PCR Purification Em seguida foram quantificados no Qubit 20 Fluorometers A identificação inicial dos isolados foi realizada no laboratório de Biologia Molecular e Genômica UFRN usando o ABI 3500xl da Life Technologies sequenciador que utiliza o método Sanger 44 Análises computacionais dos metagenomas e bactérias isoladas Reads dos três metagenomas passaram pela etapa de controle de qualidade através do software FASTQC versão 0112 O alinhamento foi realizado com software LAST utilizando como input query reads e como alvo as sequencias RefSeq Microbial Protein Sequence do NCBI O output desse alinhamento é um arquivo no formato blast contendo os alinhamentos Análise estatística para níveis taxonômicos utilizando o MEGAN foi realizado através do software Statistical Analyses of Metagenomic Profiles STAMP PARKS BEIKO 2010 A significância das diferenças na proporção relativa na distribuição taxonômica foi realizada utilizando o twosides Fisherexact test com NewcombeWilson método do intervalo de confiança usando o Storeys false Discovery rate FDR o método BenjaminHochberg FDR era aplicado para correção Resultados com q 005 42 foram considerados significativos A relevância biológica das taxas estatísticas foi determinada aplicando a diferença entre as proporções de pelo menos 1 e uma razão de duas vezes entre as proporções O Banco de dados Biosurfactants and Biodegradation Database BioSurfDB foi utilizado na análise funcional OLIVEIRA et al 2015 Esse banco tem uma conexão entre cada proteína e uma ou mais vias metabólicas permitindo a criação de um histograma como as vias metabólicas mais abundantes em cada amostra Em relação a análise dos isolados após sequenciamento contigs foram gerados através da montagem das sequências Forward e Reverse usando o programa Geneious Todos os contigs formados foram identificados usando o banco de dados de 16S rDNA EZ Taxon httpeztaxoneezbiocloudnet Os melhores hits obtidos foram alinhados utilizando o clustalw e utilizados na construção de um Cladograma através do algoritmo neighbourjoining através do software MEGA versão 50 Análise de bootstrap foi realizada com 1000 repetições 45 Testes funcionais de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes 451 Crescimento em Petróleo O crescimento dos consórcios na presença de petróleo foi determinado em meio BushnellHaas e ASW água do mar artificial composição gL 234 de NaCl 075 de KCl 70 de MgSO4 7H2O 07 de K2HPO4 03 de KH2PO4 e 10 de NH4NO3 Inicialmente foi realizado a ativação dos consórcios préinóculo em frascos Erlenmeyer contendo 1 do consórcio estoque 1 de petróleo como única fonte de carbono para um volume final de 50 mL de meio de cultura BH e ASW Os frascos Erlenmeyer foram transferidos para shaker a 180 rpm e 37 ºC Após 48 horas 1 do préinóculo de cada consórcio foi transferido para novo frasco do tipo Erlenmeyer contendo 1 de petróleo e volume final de 50mL de meio e condições de temperatura e agitação conforme descrito acima A cada 24 horas a densidade óptica a 600 nm era medida em espectrofotômetro Os controles foram preparados nas mesmas condições das amostras entretanto sem petróleo ou nenhuma outra fonte de carbono adicional 43 452 Teste 26 DCPIP No presente estudo esse teste foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Kubota et al 2008 com algumas modificações conforme descrito a seguir Culturas provenientes dos consórcios indefinidos L e Y foram inoculadas em Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio BH e ASW suplementado com diferentes fontes de hidrocarbonetos hexadecano diesel querosene petróleo glicose como controle positivo e ausência de fonte de carbono no controle negativo As culturas foram crescidas overnight e incubadas a 37C e 180 rpm até alcançar densidade óptica de 10 DO 600nm Em seguida foram centrifugadas a 4000xg por 5 minutos lavada duas vezes com meio BH e a densidade óptica foi ajustada para 10 Assim 800 µL de meio BH estéril 100 µL da solução de 26DCPIP 375 µgml 80 µL da suspensão celular e 5 µL de substrato estéril foram adicionados em um microtubo e transferidos para shaker a 37 C e 180 rpm por 7 dias A cor do meio foi observada e considerada positiva para a capacidade em degradar quando se apresentava incolor degradado e negativo para a degradação quando apresentava coloração azul não degradado 453 Índice de emulsificação IE24 A atividade de emulsificação foi determinada de acordo com Cooper e Goldenberg 1987 com modificações conforme descrito a seguir Inicialmente 2 mL de querosene foram adicionadas em 2 mL de cultura crescida em diferentes fontes de hidrocarbonetos hexano hexadecano diesel querosene petróleo tolueno xileno e tolueno xileno e em seguida agitado com vórtex a alta velocidade durante 2 min deixandose repousar durante 24 h A atividade de emulsificação foi calculada como percentagem a partir da altura da camada emulsificada dividido pela altura total da coluna de líquido multiplicado por 100 454 Espalhamento do óleo O teste de espalhamento do óleo foi realizado de acordo com Morikawa et al 2000 Segundo os autores é um método simples rápido e capaz de medir a atividade do 44 biossurfactante em quantidades baixas Para realização do teste foram adicionados em uma placa de Petri 40 mL de água e em seguida 10 µL de petróleo o qual formou uma fina camada Por último foram adicionados gentilmente sob essa camada 10 µL de amostra e SDS 10 como controle positivo 455 Hidrofobicidade celular A hidrofobicidade celular dos microrganismos isolados foi determinada através da medida de adesão a hidrocarbonetos MATH seguindo o protocolo descrito por Rosenberg 1984 com modificações conforme descrito a seguir Para tanto inicialmente os isolados foram crescidos e as células lavadas em tampão fosfatoureiaMg composição 222 gL de K2HPO4H2O 726gL de KH2PO4 02 gL de MgSO47H2O e 18gL de ureia Esse mesmo tampão foi utilizado para suspensão das células dos isolados após lavagem para correção da densidade óptica inicial DO600 entre 06 a 08 Foram adicionados 24 mL de suspensão celular em tubos de vidro contendo 04 mL de cada hidrocarboneto testado hexadecano diesel querosene xileno tolueno Em seguida os tubos foram agitados em vórtex por 2 minutos e repousaram durante 20 minutos Após esse tempo a densidade óptica foi novamente determinada e os valores de hidrofobicidade calculados em percentagem através da seguinte equação 100 x 1 DO da fase aquosaDO da suspensão celular inicial 456 Tensão interfacial A tensão interfacial foi determinada através do tensiômetro do volume da gota DVT50 de KRÜSS Através desse método é possível determinar a velocidade na qual os emulsificantes produzem seus efeitos e reduzem a tensão interfacial Isso ocorre através da medida do tempo entre o desprendimento de duas gotas medido por uma barreira de luz a uma taxa de fluxo ajustada Isso permite que o tempo entre o início de formação da gota até o desprendimento interface age seja predeterminada variando o fluxo Assim a tensão interfacial é medida como função da idade da interface Para realização do teste inicialmente os consórcios L e Y foram cultivados em shaker a 180rpm e 37ºC durante 72 horas em meio BH contendo 1 de petróleo como única fonte de carbono Para 45 determinação da tensão interfacial foram utilizados o petróleo e o sobrenadante obtido após centrifugação da cultura bacteriana a 4000xg durante 5 minutos 457 Ensaios em microcosmos Resíduo de perfuração de poços de petróleo do qual os consórcios indefinidos foram obtidos foi utilizado para avaliar a eficiência dos consórcios L e Y na degradação dos hidrocarbonetos bioaumentação autóctone Inicialmente os consórcios em estoques foram transferidos 1 para frascos Erlenmeyer contendo 1 de petróleo como única fonte de carbono e um volume final de 50 mL de meio de cultura BH Em seguida foram transferidos para shaker a 180 rpm e 37 ºC Após 48 horas de incubação a cultura foi centrifugada a 5000 rpm por um minuto o sobrenadante descartado e as células suspensa em solução salina NaCl 09 com correção da densidade óptica 600nm para 10 Assim 40 mL dessa suspensão celular foi transferida para frascos herméticos contendo 400 g de resíduo de perfuração No controle do experimento foi adicionado solução salina sem os consórcios Os respirômetros foram armazenados em temperatura ambiente no escuro durante 77 dias A determinação da biodegradação foi realizada semanalmente a cada 7 dias pela produção de CO2 e os hidrocarbonetos no tempo 0 e após 77 dias através da cromatografia gasosa Em relação à determinação de CO2 inicialmente foi adicionado a cada respirômetro um recipiente contendo NaOH 05 M para que o gás produzido CO2 fosse dissolvido Assim a quantificação do CO2 foi realizada pela titulação da alcalinidade residual da solução de NaOH na presença de cloreto de bário BaCl2 a 3 Após cada leitura cada respirômetros tinha o resíduo de perfuração revolvido visando à oxigenação e posteriormente eram adicionados NaOH no recipiente e os microcosmos vedados novamente até uma nova leitura As análises de alcanos C9 a C39 foram realizadas pelo Centro de Tecnologias do Gás e Energias Renováveis CTGASER de acordo com adaptação do método 8015D Nonhalogenated Organics usando GCFID e foram realizadas em um cromatógrafo a gás da marca Thermo Scientific modelo Trace 1310 com detector por ionização de chama A coluna capilar utilizada foi de sílica fundida TG5SILMS 30 m x 032 mm x 050 µm 46 5 Resultados 51 Caracterização físicoquímica do resíduo de perfuração O resíduo de perfuração em estudo classificase como predominantemente arenoso salino pH neutro e elevada quantidade de matéria orgânica e carbono orgânico assumindo que 50 da matéria orgânica é carbono orgânico Tabela 1 Tabela 1 Características físicoquímicas do resíduo de perfuração de poços de petróleo Características de resíduo de perfuração pH 753 Carbono orgânico gdm3 6012 Matéria orgânica gdm3 12025 Nitrogênio gdm3 106 Fósforo mgdm3 1 Areia gkg1 690 Silte gkg1 290 Argila gkg1 20 Cálcio cmolcdm3 5975 Sódio mgdm3 3090 Potássio mgdm3 793 52 Avaliação do potencial de degradação de hidrocarbonetos dos consórcios 521 Avaliação do crescimento dos consórcios na presença de petróleo Os consórcios L e Y obtidos a partir do resíduo de perfuração após seleção apresentaram crescimento determinado pela densidade óptica em dois meios de cultura com petróleo como única fonte de carbono sugerindo sua metabolização Diferentes aspectos visuais apresentados pelos consórcios L e Y durante o crescimento na presença de petróleo foram sugestivos de que os meios seletivos usados na etapa de enriquecimento influenciaram na seleção das comunidades microbianas Figura 9 e 10 Consórcio L em meio BH com petróleo apresentou densidade óptica máxima de 04 após 24 horas e manteve até 96 horas Na ausência de petróleo esse valor foi reduzido ao longo do tempo 47 a valores próximos de zero Esse mesmo consórcio apresentou DO máxima de 06 em meio ASW entre 24 e 48 horas e nenhum crescimento na ausência do petróleo indicando portanto a utilização de petróleo no crescimento e sobrevivência em ambientes com maior salinidade Figura 11 O consórcio Y apresentou valores de densidade óptica próximos de 06 após 24 horas com progressivo aumento ao longo das 96 horas O controle desse consórcio na ausência de petróleo alcançou densidade óptica próxima a 04 sugerindo utilização de outra fonte de carbono fixação de CO2 além do petróleo visto que não foi adicionada nenhuma fonte de carbono ao sistema Figura 11 O consórcio Y parece ser sensível a elevada salinidade uma vez que não foi observado crescimento em meio ASW dados não mostrados Figura 9 Crescimento do consórcio L e Y em meio BH na presença de petróleo Pet e controle com meio e petróleo Meio de cultura turvo indica crescimento enquanto a redução visual do petróleo e solubilização no meio com os consórcios são indicativos de degradação Figura 10 Crescimento do consórcio L em meio ASW na presença Pet e ausência Pet do petróleo Meio de cultura turvo consórcio L ASW Pet indica crescimento e meio transparente Consórcio L ASW Pet ausência de crescimento Consórcio L ASW Pet Consórcio L ASW Pet 48 Figura 11 Efeito da presença de petróleo no crescimento dos consórcios L a c e Y b Controle positivo meio de cultura com os consórcios e sem adição de petróleo Controle negativo CTRL meio de cultura com petróleo e sem adição dos consórcios 522 Teste 26DCPIP Hexadecano consiste em um hidrocarboneto alifático alcano com 16 carbonos enquanto o petróleo diesel e querosene são constituídos pela mistura de hidrocarbonetos aromáticos e alifáticos Todos foram utilizados como fonte de carbono para avaliar a degradação com os consórcios L e Y pelo teste 26DCPIP Resultados positivos para esses hidrocarbonetos foram obtidos para os dois consórcios em meio BH indicando capacidade em degradálos Em meio ASW apenas diesel não apresentou resultados positivos para o teste Tabela 2 O 26DCPIP funciona como aceptor artificial de elétrons Assim ao utilizar os hidrocarbonetos como substratos esse aceptor passa do estado oxidado para reduzido com mudança de coloração de azul para incolor respectivamente 0 24 48 72 96 00 02 04 06 BH consórcio L petróleo BH consórcio L petróleo CTRL Tempo h DO600 0 24 48 72 96 00 02 04 06 08 10 BH consórcio Y petróleo BH consórcio Y petróleo CTRL Tempo h DO600 0 24 48 72 96 120 144 168 00 02 04 06 08 ASW consórcio L petróleo ASW consórcio L petróleo CTRL Tempo h DO600 a b c 49 Tabela 2 Análise de degradação de hidrocarbonetos por consórcio microbiano L e Y usando o teste 26 DCPIP O símbolo e indicam presença e ausência de degradação respectivamente Análise qualitativa durante o teste pode ser visualizado pela Figura 12 em que na ausência de fonte de carbono não há oxidação e a coloração inicial azul permanece Quando o petróleo e a glicose foram adicionados como fonte de carbono estes passam a apresentarse incolor indicando degradação Figura 12 Figura 12 Aspecto visual do teste colorimétrico 26 DCPIP Na ausência de fonte de carbono consórcio meio não há oxidação e a coloração inicial azul permanece Na presença de fonte de carbono consórcio petróleo ou glicose a oxidação ocorre e é sinalizada pela mudança na coloração Substrato 1 Meio Bushnell Hass Meio ASW Consórcio L Consórcio Y Consórcio L 26DCPIP 26DCPIP 26DCPIP Hexadecano Diesel Querosene Petróleo Meio Glucose DCPIP meio 50 53 Produção de biossurfactantes 531 Índice de emulsificação O índice de emulsificação superior a 30 e estável manutenção da emulsificação após 24 horas foi apresentado pelo consórcio L para a maioria das fontes de carbono testadas exceto petróleo e xileno cuja atividade após 24 horas apresentouse ausente e baixa respectivamente Índice mais próximo eou superior ao surfactante sintético Dodecil sulfato de sódio SDS para esse consórcio foi observado quando utilizado querosene tolueno e xileno tolueno A emulsificação do consórcio Y apresentou valores próximo eou acima de 50 para a maioria dos hidrocarbonetos testados Índices maiores que os apresentados pelo SDS para esse consórcio foram observados quando utilizado hidrocarbonetos alifáticos como hexadecano mistura de alifáticos e aromáticos como querosene e aromáticos como tolueno e xileno tolueno como substratos conforme pode ser visto na Figura 13 Consórcio L Hexano Hexadecano Diesel Querosene Petróleo Tolueno Xileno Xileno Tolueno SDS 10 BH 0 10 20 30 40 50 60 70 80 IE 24h Consórcio Y Hexano Hexadecano Diesel Querosene Petróleo Tolueno Xileno Xileno Tolueno SDS 10 BH 0 10 20 30 40 50 60 70 80 IE 24h Figura 13 Índice de emulsificação dos consórcios L e Y com hexano hexadecano diesel querosene tolueno petróleo tolueno xileno tolueno xileno SDS 10 foi utilizado como controle positivo e meio de cultura BH como controle negativo 51 532 Teste de dispersão do óleo Morikawa e colaboradores 2000 definem o teste de dispersão do óleo como um método eficaz para medir a atividade do biossurfactante mesmo quando a atividade e a quantidade são baixas O teste de espalhamento do óleo realizado nesse estudo com o sobrenadante obtido do crescimento dos consórcio L e Y mostrouse positivo quanto à capacidade de dispersão do óleo indicando portanto possível produção de biossurfactantes com essa propriedade Figura 14 A confiabilidade do teste foi confirmada através do uso de água e SDS 10 como controles negativos e positivos respectivamente conforme pode ser visto na Figura 14 Figura 14Teste de dispersão do óleo com sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios L e Y Controle positivo com SDS 10 e negativo com água Seta em vermelho representa o deslocamento de óleo formado pela atividade dos surfactantes SDS 10 Consórcio L Consórcio Y H20 52 533 Tensão interfacial Na Figura 15 observase os valores de tensão interfacial dos compostos produzidos durante o crescimento dos consórcios L e Y controle negativo meio de cultura com petróleo e positivo SDS 002 Como podemos observar o sobrenadante obtido através do crescimento dos consórcios L e Y apresentou redução significativa da tensão interfacial em relação ao controle negativo sugerindo portanto possível presença de biossurfactantes Como a capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial depende da concentração do surfactante e as amostras utilizadas nesse estudo consistem no sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios é possível que aumento na redução da tensão interfacial possam ser observados ao realizar procedimentos específicos de extração de surfactantes 0 200000 400000 600000 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CTRL BH petróleo BH Consórcio L petróleo BH Consórcio Y petróleo tempo 103s Tensão interfacial Nm2 0 200000 400000 600000 6 9 12 15 18 21 24 27 30 CTRL BH petróleo BH Consórcio L petróleo BH Consórcio Y petróleo SDS 002 tempo 103s Tensão interfacial Nm2 Figura 15 Tensão interfacial Nm2 ao longo do tempo 103s do sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios L e Y Controle negativo consiste no meio de cultura com petróleo e positivo com SDS 002 Em a Consórcios L e Y e o Controle negativo meio BH com petróleo sem os consórcios Em b consórcios L e Y controle negativo e controle positivo com SDS a 002 a b 53 54 Análises dos metagenomas 541 Análise taxonômica A análise comparativa do metagenoma do resíduo de perfuração e a metagenômica dos consórcios L e Y referente a domínio mostrou que Bacteria predominou em todos as amostras analisadas com pequeno aumento na abundância após seleção Em seguida predominaram as sequências não definidas ou não reconhecidas not assigned cuja abundância mantevese elevada mesmo após seleção e Archaea esta última com abundância bastante reduzida após seleção Tabela 3 Tabela 3 Distribuição dos domínios nos metagenomas do resíduo de perfuração consórcio L e Y Análise taxonômica dos filos revelou predomínio significativo de Proteobacterias Bacteroidetes e Actinobacteria no resíduo e de Firmicutes nos consórcios L e Y Figura 16 Outros filos como Bacteroidetes Actinobacteria e Euryarchaeota observados em maior abundância no resíduo de perfuração passaram a apresentar abundância mínima após seleção sugerindo perda de diversidade de alguns grupos Domínio Abundância RP Consórcio L Consórcio Y Bacteria 7548 8331 8182 Archaea 583 037 038 Eukarya 050 033 032 Not assigned 1820 1599 1748 54 Figura 16 Perfil taxonômico comparativo referente a Filos do metagenoma do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP e consórcio L e Y Diferenças biológicas significativas calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 Do total de gêneros identificados no resíduo de perfuração de poços de petróleo 972 permaneceram após enriquecimento tanto em meio de cultivo LB como YPD Figura 17 Dos 19 gêneros exclusivos do resíduo de perfuração de poços de petróleo apenas 3 são de bactéria os demais são fungos ou leveduras Figura 17 Diagrama de Venn demonstrando o compartilhamento gêneros entre os metagenomas do resíduo de perfuração RP consórcio L e Y 55 Embora praticamente todos os gêneros presentes no resíduo de perfuração tenham se mantido nos consórcios após seleção Figura 17 foi observado grandes variações quanto a abundância relativa Tabela 4 tornando a estrutura de comunidade diferente entre resíduo e consórcios e entre consórcios Tabela 4 Abundância relativa dos 10 gêneros mais abundantes nas amostras Resíduo de Perfuração Consórcio L Consórcio Y Halomonas 349 Paenibacillus 2492 Brevibacillus 3817 Streptomyces 299 Bacillus 1472 Bacillus 1482 Pseudomonas 224 Brevibacillus 1444 Paenibacillus 340 Flavobacterium 202 Lysinibacillus 220 Clostridium 338 Amycolatopsis 191 Clostridium 121 Lysinibacillus 261 Bacillus 142 Streptomyces 119 Streptomyces 123 Marinobacter 136 Cohnella 106 Geobacillus 116 Bacteroides 124 Geobacillus 095 Pseudomonas 094 Saccharomonospora 112 Lactobacillus 079 Staphylococcus 084 Mycobacterium 093 Staphylococcus 072 Lactobacillus 083 No resíduo de perfuração Halomonas Streptomyces Pseudomonas e Flavobacterium foram os gêneros estatisticamente mais abundantes quando comparado aos consórcios L e Y que apresentaram Paenibacillus Bacillus Brevibacillus e Lysinibacillus como predominantes Quando comparado os consórcios selecionados em diferentes meios observase abundância significativa de Paenibacillus e Lysinobacillus para consórcio L e Brevibacillus para consórcio Y Figura 18 56 Figura 18 Perfil taxonômico comparativo referente a gêneros do metagenoma do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP e consórcio L e Y Diferenças biológicas significativas calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 542 Análise Funcional 543 Perfil funcional para metabolismo Sequências relativas a metabolismos primário e secundário diversos analisadas a partir do MEGAN foram observadas para as três amostras e indicaran o quão complexo são os metagenomas estudados As maiores proporções de sequências observadas no resíduo consórcio L e Y foram para metabolismos de aminoácidos 20 21 e 22 57 respectivamente carboidratos 20 22 e 19 respectivamente e energia 17 14 e 16 respectivamente Outros metabolismos como lipídeos outros aminoácidos biodegradação de xenobióticos apresentaram menor proporção em relação aos primeiros Embora tenham sido observadas variações entre as proporções sequências observadas no resíduo se mantiveram presentes nos consórcios sugerindo manutenção das funções metabólicas após seleção Figura 19 Figura 19 Perfis funcionais para metabolismo KEGG no resíduo de perfuração RP e consórcios L e Y obtidos pelo MEGAN Valores em proporções de sequências 58 Ao analisar as sequências do metabolismo energético observase o predomínio de sequências relacionadas às vias de fixação de CO2 cuja maior abundância foi observada para consórcio Y 38 justificando portanto seu crescimento na ausência de petróleo Figura 11 Em seguida predominam o metabolismo de nitrogênio 22 22 e 28 para RP consórcios L e Y respectivamente e fosforilação oxidativa 20 25 e 25 para RP consórcios L e Y respectivamente Figura 20 Figura 20 Perfis funcionais para metabolismo energético para resíduo de perfuração RP e consórcios L e Y obtidos pelo MEGAN Valores em proporções de sequências 544 Perfil funcional para degradação de hidrocarbonetos Análise comparativa funcional utilizando o Banco de dados especifico de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes BioSurfDB indica que 59 o enriquecimento em meio LB e YPD não apenas manteve as rotas relacionadas à degradação Tabela 5 como favoreceu significativamente algumas tais como ácidos graxos cloroalcanos e cloro alquenos Tabela 5 Lista de abundância relativa das vias de degradação para as três amostras resíduo de perfuração consórcio L e Y BioSurfDB Vias de degradação Abundância relativa RP Consórcio L Consórcio Y Ácidos graxos 2620 3052 3245 Cloroalcanos e cloroalquenos 2105 2928 2568 Clorociclohexano e clorobenzeno 664 396 749 Metano 1498 1309 1086 Benzoato 394 267 243 Naftaleno 1099 941 691 HPA 133 117 083 Tolueno 590 343 710 Xileno 054 038 047 Fluorobenzoato 268 201 201 Etilbenzeno 143 107 040 Estireno 432 301 336 O resíduo de perfuração apresentou significativamente maior abundância para vias relacionadas à degradação de metano e naftaleno Figura 21 Quando comparados os consórcios L e Y observase em geral que o meio YPD selecionou melhor vias relacionadas à degradação de clorociclohexano clorobenzeno e tolueno enquanto o meio LB ácidos graxos 60 Figura 21 Perfil funcional comparativo de vias relacionadas a degradação do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP consórcio L e Y Diferenças biológicas significantes calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 5441 Enzimas de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos Microrganismos candidatos a atuar nas vias de degradação mais abundantes dos consórcios L e Y cloroalcanos cloroalquenos clorociclohexano e clorobenzeno foram analisadas no KEGG utilizando o banco de dados Integrated Microbial Genomes IMG Para tanto enzimas que atuam nessas vias foram selecionadas e analisadas quanto aos possíveis microrganismos candidatos Conforme pode ser visto na Tabela 6 Bacillus Paenibacillus Dietzia Brevibacillus e Lysinibacillus foram anotados como os gêneros candidatos a apresentar a as enzimas haloalcano dealogenase EC3815 e 2haloácido dealogenase EC3812 tanto no consórcio L como no Y Para confirmar a contribuição dos microrganismos mais 61 abundantes dos consórcios L e Y Paenibacillus e Brevibacillus na degradação estão sendo realizadas análises nos genomas de referência desses gêneros Tabela 6 Principais enzimas das vias de degradação de cloroalcanos e cloroalcenos e microrganismos candidatos correspondentes para os consórcios L e Y utilizando o banco de dados do KEGG do IMG Enzimas Consórcio L Consórcio Y Haloalcano dealogenase EC3815 Bacillus Bacillus 2haloácido dealogenase EC3812 Bacillus Brevibacillus Lysinibacillus Bacillus Dietzia Lysinibacillus Paenibacillus Vias relacionadas à degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos foram analisadas e o número de reads para cada enzima estão apresentadas nas tabelas a seguir Considerando a via aeróbica dos alcanos cuja abundancia encontrase significativamente mais alta nos consórcios observase que enzimas chaves como alcano monoxigenase EC 114153 e rubredoxina redutase EC 11811 estiveram presentes em todas as amostras com algumas variações em número de reads considerando o banco de dados BioSurfDB Na ausência da alcano monoxigenase e rubredoxina temse a citocromo P450 que requer a presença da ferredoxina redutase EC 11813 como enzima acessória doadora de elétrons Essas e outras enzimas que participam da oxidação terminal de alcanos como álcool desidrogenase EC 1111 e aldeído desidrogenase EC 1213 foram observadas nas três amostras com variações no número de reads entre as amostras Tabela 7 Tabela 7 Enzimas envolvidas na degradação de alcanos e número de reads correspondentes nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB Número de reads Enzimas RP Consórcio L Consórcio Y Alkane monooxygenase 622 592 639 Ferredoxin reductase 2838 883 121 Rubredoxin reductase 202 680 195 Alcohol dehydrogenase 3666 7890 5679 Aldehyde dehydrogenase 11141 6795 6403 Cytochrome P450 354 801 60 62 Em relação ao metano via significativamente mais abundante no resíduo observa se que enzimas que atuam na conversão do metano a metanol como a metano monooxigenase EC 1141325 estão presentes não apenas no resíduo de perfuração como nos consórcios obtidos durante enriquecimento Outras enzimas dessa via como metanol desidrogenase EC 111244 formaldeído desidrogenase EC 12146 e formato desidrogenase EC 1212 foram observadas Tabela 8 Tabela 8 Enzimas envolvidas na degradação de metano e número de reads correspondentes nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB Apesar do xileno apresentarse em menor abundância em relação a outros hidrocarbonetos Tabela 5 reads de todas as enzimas que participam da degradação desse composto foram observados nas três amostras indicando à presença de uma via completa para degradação de hidrocarboneto aromático Tabela 5 Tabela 9 Enzimas envolvidas na degradação de pxileno de oxileno mxileno nos metagenomas do resíduo de perfuração e consórcios L e Y de acordo com o BioSurfDB Número de reads Enzimas RP Consórcio L Consórcio Y Methane monooxygenase 154 65 205 Methanol dehydrogenase 776 486 153 Formaldehyde dehydrogenase 570 1391 1166 Formate dehydrogenase 3273 934 3955 Número de reads Enzimas RP Consórcio L Consórcio Y Xylene monooxygenase 61 104 48 Benzyl alcohol dehydrogenase 261 400 50 Benzaldehyde dehydrogenase 87 384 124 Benzoatetoluate 12 dioxygenase 418 453 335 12dihydroxy6methylcyclohexa35 dienecarboxylate dehydrogenase 207 126 165 Phenol hydroxylase 3863 3812 13629 2hydroxymuconic semialdehyde hydrolase 171 285 302 2hydroxyhexa24dienoate hydratase 9 3 3 2hydroxymuconate6semialdehyde dehydrogenase 25 5 53 4oxalocrotonate tautomerase 50 91 14 4oxalocrotonate decarboxylase 129 132 695 4hydroxy2oxohexanoate aldolase 877 1341 1901 63 55 Síntese de biossurfactantes A análise das vias de síntese de biossurfactantes demonstrou que o enriquecimento usado na obtenção dos consórcios favoreceu o predomínio de diversas vias em menor abundância no resíduo de perfuração de poços de petróleo Figura 22 O resíduo de perfuração apesentou condições mais favoráveis a presença de vias de biossíntese de putisolvinas fostatidiletanolamina e ramnolipídeos Nos consórcios L e Y lichenisina iturina A plipastin arthrofactin bacillomycin e surfactina foram as vias mais abundantes Figura 22 64 Figura 22 Perfil funcional comparativo de vias relacionadas a biossíntese de surfactantes do resíduo de perfuração de poços de petróleo RP consórcio L e Y Diferenças biológicas significantes calculadas a partir do STAMP q 005 diferenças entre as proporções mínima de 1 56 Teste em microcosmos A capacidade dos consórcios L e Y de retornar ao ambiente do qual foram selecionados e degradar hidrocarbonetos foi avaliada através da evolução de CO2 e cromatografia gasosa em microcosmos As análises da avaliação de CCO2 produzido durante os 77 dias de experimento são apresentadas na Figura 23 Durante esse período observase que o microcosmo controle apenas com resíduo apresentou evolução de C CO2 semelhante a apresentada pelos dois consórcios ao longo de todo período estudado Assim através da medida da evolução de CCO2 não foi possível observar diferenças expressivas entre tratamentos bioaumentação L e Y e controle 65 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Bioaumentação L Bioaumentação Y Controle Tempo dias CCO2 mgKg Figura 23 Produção acumulada de CCO2 mgkg de solo ao longo de 77 dias de ensaio para os consórcios L e Y Experimento controle contém apenas resíduo de perfuração sem adição de microrganismos Bioaumentação L e Y corresponde ao tratamento com resíduo de perfuração e adição dos consórcios L e Y respectivamente Quando avaliado a remoção do total de alcanos e suas frações C14C32 por cromatografia nos mesmos microcosmos em que foi determinada a evolução de CO2 observase que apenas os consórcios L e Y foram capazes de degradar alcanos Assim a elevada produção de CO2 observada na respirometria da amostra controle não refletiu a degradação de alcanos Os consórcios L e Y removeram cerca de 66 e 30 de alcanos respectivamente Embora o resíduo tenha sido bastante homogeneizado antes de iniciar os experimentos variações de coloração foram observados visualmente nos diferentes microcosmos justificando os desvios padrões elevados Figura 24 66 Controle Consórcio L Consórcio Y 0 20 40 60 80 100 Degradação do total de alcanos Figura 24 Percentual de degradação de alcanos totais no resíduo de perfuração após 77 dias de experimento Experimento controle contém apenas resíduo de perfuração sem adição de microrganismos Bioaumentação L e Y corresponde ao tratamento com resíduo de perfuração e adição dos consórcios L e Y respectivamente Quando analisadas as frações de alcanos observase que o consórcio L removeu cerca de 70 dos alcanos de cadeias médias e longas Figura 25 enquanto que para o consórcio Y as maiores remoções foram observados apenas para os alcanos de cadeia longa com remoções médias que variaram cerca de 40 C30 a 70 C29 Figura 26 Figura 25 Percentual de degradação das frações de alcanos C14C31 utilizando a estratégia de bioaumentação para o consórcio L após 77 dias de experimento nC14 nC15 nC16 nC17 nC18 nC19 nC20 nC21 nC22 0 20 40 60 80 100 Degradação de nalcanos nC23 nC24 nC25 nC26 nC27 nC28 nC29 nC30 nC31 0 20 40 60 80 100 Degradação de nalcanos 67 nC25 nC28 nC29 nC30 nC32 0 20 40 60 80 100 Degradação de nalcanos Figura 26 Percentual de degradação das frações de alcanos C25 C28 C29 C30 C32 utilizando a estratégia de bioaumentação para o consórcio Y após 77 dias de experimento 57 Bactérias isoladas Isolados obtidos na tentativa de validar os dados dos metagenomas dos consórcios foram sequenciados e analisados taxonomicamente conforme apresentado a seguir Além disso testes de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes foram realizados para dois isolados e os resultados serão apresentados na sequência 571 Análise taxonômica Com base na análise da sequência do gene rRNA 16S o isolado 161 apresentou maior identidade com espécies do gênero Brevibacillus com sequências de maior semelhança para Brevibacillus formosus DSM 9885 972 seguido por Brevibacillus brevis NBRC 15304 971 e Brevibacillus gelatini 969 Tabela 10 O isolado 163 apresentou maior identidade para Micrococcus aloeverae AE6 975 Micrococcus yunnanensis YIM 65004 974 e Micrococcus luteus NCTC 2665 97 Conforme pode ser visto na Tabela 10 os isolados R12 A4 J5 A3 e A2 apresentaram diferentes identidades para as espécies de Bacillus anthracis seguida de Bacillus cereus e Bacillus wiedmannii 68 Tabela 10 Resultados do alinhamento do gene rRNA 16S dos isolados utilizando o banco de dados do EzTaxon Amostra Nome da espécie Identidade 161 Brevibacillus formosus 972 Brevibacillus brevis 971 Brevibacillus gelatini 969 163 Micrococcus aloeverae 975 Micrococcus yunnanensis 974 Micrococcus luteus 970 R12 Bacillus anthracis 987 Bacillus cereus 987 Bacillus wiedmannii 986 A4 Bacillus anthracis 980 Bacillus cereus 979 Bacillus wiedmannii 979 J5 Bacillus anthracis 981 Bacillus cereus 981 Bacillus wiedmannii 981 A3 Bacillus anthracis 980 Bacillus cereus 980 Bacillus wiedmannii 979 A2 Bacillus anthracis 976 Bacillus cereus 975 Bacillus wiedmannii 974 Na 69 70 Figura 27 observase que a maioria dos isolados pertence ao filo Firmicutes ou seja filo mais abundante na amostra No entanto um isolado obtido pertence ao filo Actinobacteria mostrando que nem sempre são selecionados apenas os microrganismos mais abundantes As sequências do rDNA 16S dos isolados sequenciados não apresentaram agrupamento consistente valores de bootstrap abaixo de 70 Desta forma podese observar que o sequenciamento do rDNA 16S não foi eficiente na identificação desses isolados sendo portanto necessário estudos complementares para esclarecer quais clados pertencem tais isolados Micrococcus yunnanensis YIM 65004 FJ214355 Micrococcus luteus NCTC 2665 CP001628 163 Micrococcus flavus LW4 DQ491453 Micrococcus aloeverae AE6 KF524364 JF046789 s ncd518a08c1 JF046789 Micrococcus lylae NBRC 15355 BCSN01000086 Micrococcus endophyticus YIM 56238 EU005372 AMYK s modasa AMYK02000277 Micrococcus antarcticus T2 AJ005932 Micrococcus cohnii WS4601 FR832424 Citricoccus nitrophenolicus PNP1 GU797177 Micrococcus terreus CGMCC 17054 jgi1058018 Micrococcus niistensis NII0909 FJ897464 Brevibacillus reuszeri DSM 9887 LGIQ01000014 Brevibacillus choshinensis DSM 8552 LJJB01000010 Brevibacillus formosus DSM 9885 LDCN01000015 Brevibacillus brevis NBRC 15304 AB271756 161 Brevibacillus nitrificans DA2 AB507254 Brevibacillus centrosporus DSM 8445 AB112719 Brevibacillus panacihumi DCY35 EU383033 Brevibacillus limnophilus DSM 6472 AB112717 Brevibacillus gelatini PDF4 KP899808 Brevibacillus parabrevis IFO 12334 D78463 Brevibacillus agri NRRL NRS1219 D78454 Bacillus manliponensis BL46 FJ416490 Bacillus bingmayongensis FJAT13831 AKCS01000011 Bacillus cytotoxicus NVH 39198 CP000764 Bacillus gaemokensis KCTC 13318 LTAQ01000012 Bacillus oryzaecorticis R1 KF548480 JH792182 s BAG1X13 JH792182 Bacillus pseudomycoides DSM 12442 ACMX01000133 Bacillus toyonensis BCT7112 CP006863 Bacillus anthracis Ames AE016879 JH792233 s VD107 JH792233 Bacillus wiedmannii FSL W80169 LOBC01000053 JYPH s F52894 JYPH01000028 CM000739 s AH1271 CM000739 Bacillus weihenstephanensis NBRC 101238 BAUY01000093 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 ACNF01000156 JH792383 s BAG2X11 JH792383 A4 J5 R12 A2 A3 Bacillus cereus ATCC 14579 AE016877 95 91 91 95 87 81 97 99 74 99 99 97 96 71 72 Figura 27 Micrococcus yunnanensis YIM 65004 FJ214355 Micrococcus luteus NCTC 2665 CP001628 163 Micrococcus flavus LW4 DQ491453 Micrococcus aloeverae AE6 KF524364 JF046789 s ncd518a08c1 JF046789 Micrococcus lylae NBRC 15355 BCSN01000086 Micrococcus endophyticus YIM 56238 EU005372 AMYK s modasa AMYK02000277 Micrococcus antarcticus T2 AJ005932 Micrococcus cohnii WS4601 FR832424 Citricoccus nitrophenolicus PNP1 GU797177 Micrococcus terreus CGMCC 17054 jgi1058018 Micrococcus niistensis NII0909 FJ897464 Brevibacillus reuszeri DSM 9887 LGIQ01000014 Brevibacillus choshinensis DSM 8552 LJJB01000010 Brevibacillus formosus DSM 9885 LDCN01000015 Brevibacillus brevis NBRC 15304 AB271756 161 Brevibacillus nitrificans DA2 AB507254 Brevibacillus centrosporus DSM 8445 AB112719 Brevibacillus panacihumi DCY35 EU383033 Brevibacillus limnophilus DSM 6472 AB112717 Brevibacillus gelatini PDF4 KP899808 Brevibacillus parabrevis IFO 12334 D78463 Brevibacillus agri NRRL NRS1219 D78454 Bacillus manliponensis BL46 FJ416490 Bacillus bingmayongensis FJAT13831 AKCS01000011 Bacillus cytotoxicus NVH 39198 CP000764 Bacillus gaemokensis KCTC 13318 LTAQ01000012 Bacillus oryzaecorticis R1 KF548480 JH792182 s BAG1X13 JH792182 Bacillus pseudomycoides DSM 12442 ACMX01000133 Bacillus toyonensis BCT7112 CP006863 Bacillus anthracis Ames AE016879 JH792233 s VD107 JH792233 Bacillus wiedmannii FSL W80169 LOBC01000053 JYPH s F52894 JYPH01000028 CM000739 s AH1271 CM000739 Bacillus weihenstephanensis NBRC 101238 BAUY01000093 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 ACNF01000156 JH792383 s BAG2X11 JH792383 A4 J5 R12 A2 A3 Bacillus cereus ATCC 14579 AE016877 95 91 91 95 87 81 97 99 74 99 99 97 96 73 74 Figura 27 Cladograma resultante do alinhamento da região rDNA 16S mostrando os agrupamentos formados pelos isolados 161 163 A2 A3 R12 J5 A4 e os microrganismos relacionados O Cladograma foi construído utilizando o método NeighbourJoining Valor do Bootstrap de 1000 réplicas 572 Analise de degradação de hidrocarbonetos 5721 Crescimento em petróleo Micrococcus yunnanensis YIM 65004 FJ214355 Micrococcus luteus NCTC 2665 CP001628 163 Micrococcus flavus LW4 DQ491453 Micrococcus aloeverae AE6 KF524364 JF046789 s ncd518a08c1 JF046789 Micrococcus lylae NBRC 15355 BCSN01000086 Micrococcus endophyticus YIM 56238 EU005372 AMYK s modasa AMYK02000277 Micrococcus antarcticus T2 AJ005932 Micrococcus cohnii WS4601 FR832424 Citricoccus nitrophenolicus PNP1 GU797177 Micrococcus terreus CGMCC 17054 jgi1058018 Micrococcus niistensis NII0909 FJ897464 Brevibacillus reuszeri DSM 9887 LGIQ01000014 Brevibacillus choshinensis DSM 8552 LJJB01000010 Brevibacillus formosus DSM 9885 LDCN01000015 Brevibacillus brevis NBRC 15304 AB271756 161 Brevibacillus nitrificans DA2 AB507254 Brevibacillus centrosporus DSM 8445 AB112719 Brevibacillus panacihumi DCY35 EU383033 Brevibacillus limnophilus DSM 6472 AB112717 Brevibacillus gelatini PDF4 KP899808 Brevibacillus parabrevis IFO 12334 D78463 Brevibacillus agri NRRL NRS1219 D78454 Bacillus manliponensis BL46 FJ416490 Bacillus bingmayongensis FJAT13831 AKCS01000011 Bacillus cytotoxicus NVH 39198 CP000764 Bacillus gaemokensis KCTC 13318 LTAQ01000012 Bacillus oryzaecorticis R1 KF548480 JH792182 s BAG1X13 JH792182 Bacillus pseudomycoides DSM 12442 ACMX01000133 Bacillus toyonensis BCT7112 CP006863 Bacillus anthracis Ames AE016879 JH792233 s VD107 JH792233 Bacillus wiedmannii FSL W80169 LOBC01000053 JYPH s F52894 JYPH01000028 CM000739 s AH1271 CM000739 Bacillus weihenstephanensis NBRC 101238 BAUY01000093 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 ACNF01000156 JH792383 s BAG2X11 JH792383 A4 J5 R12 A2 A3 Bacillus cereus ATCC 14579 AE016877 95 91 91 95 87 81 97 99 74 99 99 97 96 Actinobacteria Firmicutes 75 Avaliação do crescimento dos isolados 161 e 163 revelou aumento do crescimento na presença de petróleo e diminuição na sua ausência sugerindo provável utilização deste como fonte de carbono e energia Figura 28 O isolado 161 após 48 horas de crescimento na presença de petróleo encontrase em fase estacionária enquanto na ausência de petróleo para esse mesmo período é observado declínio na turbidez típico da fase de morte em curvas de crescimento O isolado 163 apresentou maior diferença na turbidez na presença e ausência de petróleo em 24 horas de crescimento onde fica claro o maior crescimento quando o petróleo é utilizado Em 48 horas há uma convergência na densidade óptica entre os tratamentos com diminuição da turbidez na presença de petróleo e aumento na ausência Figura 28 Crescimento do isolado 161 e 163 DO600 em meio BH 01 de extrato de levedura com e sem petróleo 573 Produção de biossurfactantes O teste de emulsificação foi realizado para avaliar a produção de biossurfactantes com propriedades emulsificantes pelos isolados Esse teste foi realizado inicialmente durante avaliação do crescimento determinado a cada 24 horas item 572 para avaliar a fase de maior produção Para o isolado 161 a fase de maior produção de biossurfactante com propriedade emulsificante ocorreu em 48 horas de crescimento Nesse tempo o índice de emulsificação médio para esse isolado foi de 68 quando o petróleo foi adicionado ao crescimento Na ausência de petróleo controle o índice de emulsificação 0 24 48 00 05 10 15 161 petróleo 161 petróleo CTRL Tempo h DO600 0 24 48 00 05 10 15 20 25 30 35 163 petróleo 163 petróleo CTRL Tempo h DO600 76 foi reduzido para 59 O SDS 10 utilizado como controle apresentou valor médio de 71 Figura 29 O isolado 163 não apresentou atividade de emulsificação em nenhum dos tempos amostrados para o querosene 161 pet 161 pet SDS 10 Meio 0 20 40 60 80 100 IE 24h Figura 29 Crescimento do isolado 161 DO600 e índice de emulsificação IE em meio BH 01 de extrato de levedura com e sem petróleo 574 Medida de adesão a hidrocarbonetos BATH Células dos isolados 161 e 163 foram avaliadas quanto a aderência a hexadecano diesel querosene xileno e tolueno Conforme pode ser visto na Figura 30 o isolado 161 apresentou diferenças na aderência em função de cada substrato testado Melhores resultados para o isolado 161 foram observados quando utilizado os compostos aromáticos xileno 46 e tolueno 50 Menores percentuais de hidrofobicidade foram obtidos para hidrocarbonetos alifáticos como hexadecano 27 e compostos formados pela mistura de hidrocarbonetos aromáticos e alifáticos como diesel 17 e querosene 22 conforme visto na Figura 30 77 Figura 30 Hidrofobicidade celular do isolado 161 em relação ao hexadecano diesel querosene xileno e tolueno através do método da aderência microbiana a hidrocarbonetos BATH após 48 horas de crescimento em meio BH com 01 de extrato de levedura e 1 de petróleo O isolado 163 não apresentou hidrofobicidade para hexadecano diesel e querosene Os compostos aos quais esse isolado apresentou hidrofobicidade foram os aromáticos com valor médio de 38 para xileno e 35 para tolueno Figura 31 Figura 31 Hidrofobicidade celular do isolado 163 em relação ao hexadecano diesel querosene xileno e tolueno através do método da aderência microbiana a hidrocarbonetos BATH após 48 horas de crescimento em meio BH com 01 de extrato de levedura e 1 de petróleo Hexadecano Diesel Querosene Xileno Tolueno 10 20 30 40 50 60 Hidrofobicidade Hexadecano Diesel Querosene Xileno Tolueno 0 10 20 30 40 50 Hidrofobicidade 78 575 Dispersão do óleo Conforme pode ser visto na Figura 32 o teste de dispersão do óleo realizado com o sobrenadante dos isolados revelou uma discreta dispersão do óleo para os isolados 161 e 163 Como o sobrenadante foi utilizado para a realização do teste é possível que após extração desses compostos de superfícies ativa ocorra formação de um halo maior Além disso é preciso atentarse a mudanças nas condições de cultivo para que uma maior concentração de biossurfactantes seja produzida Figura 32 Teste de dispersão do óleo com sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios isolados 161 e 163 161 163 79 6 Discussão No presente estudo dois meios de enriquecimento LB e YPD foram utilizados para obtenção de consórcios microbianos a partir do resíduo de perfuração de poços de petróleo Abordagens metagenômicas foram utilizadas para avaliar os microrganismos presentes no resíduo de perfuração e consórcios microbianos obtidos quanto à capacidade de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes Além disso foram avaliados se esses consórcios refletiam a comunidade microbiana a partir da qual foram selecionados e se ao retornarem ao ambiente eram capazes de apresentar ou estimular à capacidade de degradação Bactérias provenientes dos consórcios foram isoladas e avaliadas quanto à degradação e produção de biossurfactantes A maioria das estratégias de biorremediação utiliza microrganismos para remoção de contaminantes WATANABE 2001 DZIONEK WOJCIESZYŃSKA GUZIK 2016 Assim o uso dessa técnica depende de uma compreensão mais profunda dos microrganismos envolvidos no processo WATANABE 2001 LIM LAU POH 2016 Mais de 99 dos microrganismos que existem no ambiente não podem ser facilmente cultivados AMANN et al 1995 HANDELSMAN et al 1998 o que significa que para se obter uma maior estimativa da diversidade microbiana são necessárias modificações nos métodos de cultivo VARTOUKIAN PALMER WADE 2010 Mudanças no meio de cultura por exemplo têm refletido em diferenças na composição e diversidade microbiana WU et al 2013 A análise dos consórcios selecionados no presente estudo também sugere influência do meio de enriquecimento durante a seleção Diferenças na densidade óptica e no aspecto visual dos consórcios L e Y foram observadas durante o crescimento nos meios BH e ASW na presença do petróleo como única fonte de carbono e energia sugerindo seleção diferencial Por apresentar em sua composição NaCl é possível que o meio LB tenha favorecido melhor o crescimento de microrganismos halofílicos em comparação ao meio YPD Tal fato é sugerido inicialmente ao se observar crescimento apenas do consórcio em L em água do mar sintética ASW A presença de petróleo parece ser essencial tanto para o consórcio L como o Y uma vez que maiores crescimentos foram alcançados ou se mantiveram na presença deste A confirmação da utilização do petróleo e outros derivados pelos consórcios L e Y foram obtidas através da realização de testes com o aceptor artificial de elétrons 26 DCPIP 80 Vários trabalhos confirmaram a capacidade de degradação de hidrocarbonetos de cepas microbianas através desse teste HANSON 1993 EL HANAFY et al 2016 KUBOTA et al 2008 VAN HAMME et al 2000 Kubota e colaboradores 2008 por exemplo observaram correspondência entre os resultados obtidos do teste 26 DCPIP e da cromatografia gasosa Um passo crítico no processo de biodegradação é o acesso dos microrganismos aos compostos hidrofóbicos do petróleo Para superar essa limitação a degradação de hidrocarbonetos é muitas vezes acompanhada pela produção de biossurfactantes bioemulsificantes compostos que atuam reduzindo a tensão superficial e interfacial eou emulsionando e consequentemente facilitando o acesso aos hidrocarbonetos BANAT et al 2010 UZOIGWE et al 2015 Muitos autores consideram os bioemulsificantes como biossurfactantes embora existam diferenças entre ambos Enquanto os biossurfactantes são conhecidos pela redução da tensão interfacial e superficial os bioemulsificantes são conhecidos por sua atividade emulsificante entretanto algumas moléculas podem apresentar ambas funções UZOIGWE et al 2015 Diversos métodos são utilizados na detecção dos biossurfactantesbioemulsificantes durante o crescimento microbiano tais como o índice de emulsificação dispersão do óleo tensão interfacial e superficial ELLAIAH et al 2000 HABA et al 2000 SATPUTE et al 2008 UZOIGWE et al 2015 O índice de emulsificação consiste na medida da capacidade de emulsão de uma molécula de superfície ativa biossurfactante ou bioemulsificantes com diferentes hidrocarbonetos SATPUTE et al 2008 Bosch et al 1988 consideram cepas como boas na produção de biossurfactantes com propriedade emulsificante aquelas que formam emulsões superiores a 40 Para Willumsen e Karlson 1997 a estabilidade de uma emulsão pode ser definida através da manutenção de pelo menos 50 do índice de emulsificação inicial após 24 horas Além da cepa produtora a composição e atividade emulsionante do biossurfactante depende de fatores diversos como fonte de carbono nitrogênio temperatura pH aeração FAKRUDDIN 2012 No geral fontes de carbono como petróleo diesel glicose sacarose e glicerol são considerados bons substratos para produção de biossurfactantes DESAI BANAT 1997 Nesse estudo foram observados índices de emulsificação próximos eou acima de 50 para o consórcio Y ao crescer em diferentes fontes de hidrocarbonetos sugerindo produção de biossurfactantesbioemulsificantes O consórcio L também demonstrou atividade de emulsificação para a maioria dos hidrocarbonetos testados No entanto 81 quando utilizado o petróleo como substrato a atividade de emulsificação apresentouse instável e não se manteve após 24 horas O crescimento e a produção de biossurfactantesbioemulsificantes capaz de emulsificar a maioria dos hidrocarbonetos testados indicam que os consórcios podem ser usados na recuperação de ambientes contaminados com hidrocarbonetos diversos Além disso estudos com diversas fontes de carbono pode ser importante para aumentar a produção desses compostos Microrganismos tanto isolados como na forma de consórcios têm mostrado diferenças nos índices de emulsificação para diferentes hidrocarbonetos testados como substrato para o crescimento ou para formação da emulsão DHASAYAN KIRAN SELVIN 2014 PETER RAO KUMARI 2014 Um dos melhores métodos para detectar a presença de biossurfactantes especialmente quando a atividade e a quantidade são baixas é o teste de dispersão do óleo MORIKAWA HIRATA IMANAKA 2000 SATPUTE et al 2008 Morikawa e colaboradores 2000 mostraram relações lineares entre a área deslocada pela atividade dos surfactantes em uma camada de petróleo e a quantidade de surfactante testada Os consórcios selecionados no presente estudo apresentaram deslocamento do óleo indicando a produção de biossurfactantes Não foram observadas diferenças no tamanho da área deslocada para cada consórcio sugerindo produção semelhante Excelente deslocamento do óleo foi observado quando adicionado surfactante sintético SDS 10 No entanto é importante destacar que o SDS é um surfactante sintético puro e a amostra obtida dos consórcios para realização do teste consiste apenas no sobrenadante obtido após crescimento dos consórcios Outro método utilizado para medir a atividade de biossurfactantes é a tensão superficialinterfacial uma vez que uma característica marcante dos biossurfactantes e que os diferencia dos bioemulsificantes é a sua capacidade em reduzir tensões interfaciais e superficiais UZOIGWE et al 2015 Isso ocorre devido à natureza anfifílica dos biossurfactantes aumentar a solubilidade das moléculas hidrofóbicas reduzindo assim as tensões superficiais e interfaciais na interface óleoágua SANTOS et al 2016 Redução da tensão interfacial em relação ao controle foi observada ao utilizar o sobrenadante dos consórcios após crescimento reforçando ainda mais a possível presença de biossurfactantes durante o crescimento dos consórcios em petróleo Muitos microrganismos isolados e descritos como degradadores eficientes não são necessariamente os melhores a se utilizar na bioaumentação Isso porque em muitos casos esses microrganismos são selecionados de outros ambientes bioaumentação 82 alóctone e ao se deparar com novos ambientes muito complexos não conseguem sobreviver ou competir com a comunidade indígena HOSOKAWA et al 2009 Alguns autores defendem e recomendam o uso da bioaumentação autóctone com consórcios microbianos ou isolados indígenas melhores adaptados aos ambientes contaminados HOSOKAWA et al 2009 UENO et al 2007 No entanto como os microrganismos selecionados nem sempre são os mesmos mais representativos do ambiente seu desempenho tem sido questionado STEFANI et al 2015 Assim estudos que avaliem mudanças na diversidade entre os microrganismos selecionados e os presentes no ambiente e se quando inoculados no ambiente são capazes de atuar eficientemente na remoção de contaminantes são essenciais Análise taxonômica do metagenoma do resíduo de perfuração e consórcio L e Y mostrou predomínio do domínio Bacteria Comportamento semelhante foi observados para metagenomas de ambientes diversos inclusive contaminados com petróleo JOSHI et al 2014 PACCHIONI et al 2014 YADAV et al 2015 O aumento na abundância do domínio Bacteria nos consórcios quando comparado ao resíduo foi associado a uso de meios de enriquecimento durante a seleção Viñas et al 2002 observaram aumento nas populações microbianas ao incubar consórcios indefinidos em meio de enriquecimento Redução de Archaea após seleção pode estar associada ao método de seleção e à presença do petróleo Para Röling et al 2003 e Wang et al 2011 a riqueza de Archaea parece sofrer influência negativa do petróleo tornandoa menos abundante Uma possível interpretação para as elevadas proporções de sequências não classificadas mesmo após seleção pode ser atribuída à presença de espécies não cultivadasnovas ou não reconhecidas Diferentes métodos de cultivo podem aumentar a proporção de microrganismos cultiváveis VESTER GLARING STOUGAARD 2015 Avanços quanto ao cultivo dessas espécies incluem cultivo com outras bactérias do mesmo ambiente cocultura uma vez que muitos desses microrganismos demonstraram crescer apenas na presença de outras bactérias do mesmo ambiente STEWART 2012 UENO et al 2007 Assim é possível que o método de enriquecimento e seleção utilizado no presente estudo tenha sido importante para o cultivo desses microrganismos A contaminação com hidrocarbonetos afeta a composição e diversidade microbiana Amostras sem esses contaminantes têm apresentado maior diversidade quando comparado com amostras contaminadas SUTTON et al 2013 No entanto é importante ressaltar que além dos contaminantes fatores diversos como tipos de solo pH e matéria orgânica influenciam a composição das comunidades microbianas 83 GIRVAN et al 2003 LAUBER et al 2009 SUTTON et al 2013 Nesse estudo as condições de cultivo tais como uso de meios ricos petróleo temperatura parece ter influenciado na redução da abundância de alguns filos e favorecimento de outros como Firmicutes Com as mudanças de filos gêneros predominantes no resíduo como Halomonas Streptomyces e Pseudomonas foram substituídos em abundância por outros como Brevibacillus Bacillus Geobacillus Lysinibacillus e Paenibacillus que também crescem usando hidrocarbonetos como fonte de carbono e são facilmente cultiváveis PRINCE et al 2010 Alguns são relatados como mais tolerantes a níveis elevados de hidrocarbonetos no solo possivelmente em função da formação de endósporos resistentes GHAZALI et al 2004 MANDICMULEC PROSSER 2011 Apesar dos métodos dependentes de cultivo serem conhecidos na literatura pela baixa recuperação da diversidade do solo mesmo quando diferentes meios de cultura são utilizados STEFANI et al 2015 o tipo e as condições de seleção utilizadas nesse estudo foram importantes na manutenção dos organismos autóctones já que os resultados mostram que cerca de 97 dos gêneros classificados e presentes no resíduo foram recuperados após enriquecimento É possível que a recuperação da diversidade microbiana associada à mudanças na abundância dos microrganismos sejam os fatores principais para a manutenção e aumento de vias relacionadas a metabolismos diversos Maior abundância de vias relacionadas à fixação de CO2 no consórcio Y pode justificar o crescimento desse consórcio mesmo na ausência de petróleo como fonte de carbono durante o crescimento Vias relacionadas à degradação de ácidos graxos e hidrocarbonetos alifáticos halogenados como cloroalcanos e cloroalquenos foram as mais favorecidas durante a obtenção dos consórcios Esses haloalcanos são compostos obtidos pela substituição de pelo menos um hidrogênio da molécula de alcano por um átomo de halogênio que nos cloroalcanos e cloroalqenos é o cloro Por trazer uma série de riscos na água ou solo agências reguladoras como EPA Environmental Protection Agency consideram esses compostos como poluentes prioritários BELKIN 1992 A biodegradação dos haloalcanos e haloácidos é realizada através de enzimas chaves como haloalcano dealogenases EC 3815 e 2haloácida dealogenase EC3812 respectivamente Ambas da família das hidrolases que catalisam a clivagem de ligações carbonohalogênio Haloalcanos dealogenases são uma das melhores famílias de enzimas caracterizadas que atuam sobre hidrocarbonetos halogenados e seus derivados Por serem estáveis fácil de manusear e apresentarem mecanismo catalítico 84 exclusivo com ampla especificidade de substrato essas enzimas são bastante pesquisadas e aplicadas especialmente na biorremediação em função de seus substratos naturais serem compostos alifáticos e cíclicos clorados JANSSEN 2004 Essas enzimas foram observadas nos consórcios L e Y e anotadas para os gêneros Bacillus Paenibacillus Brevibacillus Lysinibacillus e Dietzia principalmente Além disso a análise preliminar realizada para os genomas de representantes de gêneros Paenibacillus e Brevibacillus utilizando o BiosurfDB revelou reads relacionados às vias de cloroalcanos e cloroalcenos sugerindo portanto que esses organismos apresentam tais enzimas e estão contribuindo com o aumento da abundância nos consórcios Em relação às vias de síntese de biossurfactantes também foram observadas correlações entre os microrganismos mais abundantes e suas respectivas vias de síntese predominantes Pseudomonas por exemplo é um dos gêneros mais abundantes no resíduo e bem relatado quanto à produção de putisolvinas fostatidiletanolamina e ramnolipídio por alguns autores Bacillus Paenibacillus e Brevibacillus abundantes em ambos os consórcios têm sido associados à produção de liquesina iturina A plipastina arthrofactin bacillomycin e surfactina Além disso gêneros observados em maior abundância nos consórcios são também conhecidos por apresentar índice de emulsificação similar aos apresentados pelos consórcios L e Y durante a degradação Reddy et al 2010 obtiveram um índice máximo de emulsificação de 57 para o biossurfactante produzido por uma espécie Brevibacillus durante a degradação do fenantreno durante 24 h Mnif et al 2011 obtiveram atividades emulsionantes de 49 55 e 67 para os biossurfactantes produzidos por Geobacillus Brevibacillus e Bacillus respectivamente Pathak e Keharia 2014 observaram emulsão eficiente por uma mistura de lipopeptídeos cíclicos surfactina iturina e fengicina produzida por Bacillus subtilis Além do conhecimento acerca dos microrganismos o controle e otimização da biorremediação depende também das características da amostra a ser remediada VIDALI 2001 Nutrientes como carbono nitrogênio e fósforo desempenham papéis fundamentais no crescimento microbiano e por conseguinte na degradação VARJANI UPASANI 2017a Proporções consideradas adequadas à degradação 100101 são sugeridas por alguns autores No entanto não há um consenso acerca dessas proporções uma vez que valores acima ou abaixo deste tem se mostrado efetiva CERQUEIRA 2011 Relações abaixo dessa proporção foram observadas no resíduo a ser biorremediado No entanto é preciso atentarse às quantidades excessivas de nitrogênio e fósforo as quais têm sido relatados como prejudiciais à degradação ao aumentar a 85 salinidade LEYS 2005 e consequentemente interromper o crescimento microbiano exceto quando os microrganismos são tolerantes FATHEPURE 2014 Microrganismos halófilos ou halotolerantes foram sugeridos no resíduo de perfuração em função da elevada salinidade apresentada e confirmados após análise taxonômica ao evidenciar Halomonas e Marinobacter como predominantes ambos já bem descritos na literatura quanto à capacidade de degradação de hidrocarbonetos e necessidade de meios com elevadas concentrações de sais DASTGHEIB et al 2012 FATHEPURE 2014 Uma das maiores dificuldades na utilização de estratégias de biorremediação consiste em alcançar os bons resultados do laboratório em campo JUHASZ STANLEY BRITZ 2000 Consórcios inoculados em solos dos quais foram selecionados são descritos na literatura como mais eficazes na degradação de hidrocarbonetos do que consórcios selecionados de outros solos WU et al 2013 Para avaliar a degradação do solo diversas técnicas são descritas O método de evolução de CO2 é frequentemente utilizado para avaliar a degradação de compostos orgânicos no solo Para Lors e Mossmann 2004 monitorar apenas a produção de CO2 ou o consumo de O2 não é suficiente para avaliar a degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos No presente estudo não foi observada correlação entre produção de CO2 e a degradação de alcanos A evolução de CO2 sugeriu atividade de degradação tanto para os tratamentos com os consórcios L e Y como no controle sem adição de bactérias sugerindo atividade dos microrganismos indígenas No entanto a cromatografia para alcanos não confirmou esses resultados cuja degradação foi observada apenas ao utilizar os consórcios L e Y Alcanos correspondem a cerca de 50 do petróleo bruto sendo fundamental estudos que avaliem a sua remoção ROJO 2009 Taxas de degradação de frações de alcanos alcançada pelo consórcio L 66 durante 77 dias foi semelhante à observada por Rahman et al 2003 em amostra de solo não estéril contaminada com lama de petróleo após 56 dias No entanto para alcançar esses percentuais de remoção os autores adicionaram além do consórcio bacteriano biossurfactante ramnolipídeo e solução de nutrientes nitrogênio fósforo e potássio Os resultados de degradação apresentados no presente estudo são promissores uma vez que foi inoculado em amostra proveniente do resíduo de perfuração uma microbiota que apesar de autóctone estava em diferente abundância da observada inicialmente no ambiente Além disso alguns fatores que podem afetar a degradação umidade nutrientes não foram controlados ou levados em consideração durante o estudo e mesmo assim foi observada remoção acima de 50 86 Apesar da metagenômica ser uma ferramenta fundamental nas análises taxonômicas e funcionais o isolamento é fundamental na caracterização das propriedades específicas dos microrganismos VARTOUKIAN et al 2010 Além disso alguns autores utilizam o isolamento na validação dos dados metagenômicos JOSHI et al 2014 Assim isolados obtidos a partir dos consórcios foram identificados e analisados quanto à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes visando à corroboração dos resultados obtidos Sequências de rDNA 16S obtidas de cepas isoladas foram analisadas e apresentaram maior identidade com os gêneros Brevibacillus Micrococcus e Bacillus Todos presentes nos consórcios L e Y corroborando assim os dados metagenômicos obtidos Bacillus e Brevibacillus são os gêneros mais abundantes nos consórcios L e Y enquanto Micrococcus apesar de presente não aparece entre os mais abundantes Para Stefani e colaboradores 2015 os microrganismos isolados nem sempre são os mais representativos do ambiente Gênero Brevibacillus atualmente apresenta 22 espécies Micrococcus 17 e Bacillus 347 espécies com nome validamente publicado httpwwwbacteriocictfr a maioria isolados do solo Testes preliminares realizados para Brevibacillus e Micrococcus sugerem potencial de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes Trabalhos relatando biodegradação por esses microrganismos foram descritos A exemplo de Reddy et al 2010 que isolaram nova cepa de Brevibacillus que degrada hidrocarbonetos aromáticos policíclicos como antraceno e fluoreno e produz biossurfactantes com capacidade de reduzir a tensão superficial Santhini et al 2009 também isolaram Micrococcus sp do solo e observaram capacidade em degradar hidrocarbonetos e produzir biossurfactantes SANTHINI et al 2009 O crescimento produção e atividade emulsificante observada para os isolados na ausência do petróleo podem estar associadas à fixação de CO2 Sundaram e Thakur 2015 relataram fixação de CO2 e produção de biossurfactantes por uma cepa do gênero Bacillus Os autores sugerem fixação de CO2 por essa cepa como substrato indutor a produção de biossurfactantes embora resultados melhores tenham sido obtidos ao utilizar hexadecano Teste específicos que comprovem essa atividade devem ser realizados para esses isolados Nesse contexto os resultados desse estudo mostram que a metagenômica associada a conhecimentos do ambiente a ser remediado são fundamentais nos estudos de biorremediação ao permitir acesso a informações taxonômicas e funcionais das comunidades microbianas conhecidas e desconhecidas nativas eou selecionadas e as 87 condições ambientais aos quais os microrganismos serão expostos O potencial da metagenômica em estudos de biorremediação também foram observados por Zafra et al 2016 ao obter novos conhecimentos sobre o potencial metabólico de microrganismos degradadores de HPA através dessa abordagem O método de enriquecimento utilizado neste estudo mostrouse eficiente na manutenção e favorecimento de microrganismos e vias relacionadas à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes mesmo que em abundâncias diferentes da observada inicialmente Para Zanaroli et al 2010 a seleção de consórcios mediante enriquecimento com hidrocarbonetos também pode refletir em melhorias na biorremediação Além disso através desse método foi possível manter em laboratório a maioria dos microrganismos presentes no resíduo sem a necessidade de retornar ao ambiente e isolar microrganismos de interesse 88 6 Conclusão Resíduo de perfuração apresentou microrganismos e vias relacionadas a degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes sendo portanto um resíduo de grande interesse para estudos relacionados a biorremediação Embora a abundância dos microrganismos presentes no resíduo de perfuração tenha sido modificada após obtenção dos consórcios estes continuaram a apresentar microrganismos e vias relacionadas a essas funções em alguns casos inclusive em maior abundância Além disso os testes funcionais indicam que os consórcios obtidos degradam diferentes hidrocarbonetos e produzem biossurfactantes bioemulsificantes Mudanças no meio de cultivo influenciou a comunidade microbiana selecionada e consequentemente à degradação Ao retornar ao resíduo ao qual foi selecionado bioaumentação autóctone o consórcio enriquecido em meio LB apresentou maior capacidade de degradação de alcanos do que o consórcios selecionado em meio YPD deixando claro a importância de utilizar diferentes meios de cultura Método de enriquecimento utilizado neste trabalho foi importante na manutenção da maioria dos gêneros presentes no resíduo de perfuração Conhecimentos da microbiota existente nos consórcios podem contribuir no direcionamento do isolamento de microrganismos específicos Isolados obtidos visando a degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantesbioemulsificantes mostraramse promissores para essas funções e consequente aplicação em estudos de biorremediação Análise metagenômica mostrouse como uma ferramenta poderosa para os estudos de biorremediação ao revelar microrganismos e vias relacionadas à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes no resíduo de perfuração e consórcios obtidos 89 7 REFERÊNCIAS ABDELSHAFY H I MANSOUR M S M A review on polycyclic aromatic hydrocarbons Source environmental impact effect on human health and remediation Egyptian Journal of Petroleum v 25 n 1 p 107123 2016 ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS EMPRESAS DE LIMPEZA PÚBLICA E RESÍDUOS ESPECIAIS ABRELPE Panorama de Resíduos Sólidos no Brasil p18 114 2014 ACHTMAN M WAGNER M Microbial diversity and the genetic nature of microbial species Nature Reviews Microbiology v 6 n 6 p 431440 2008 ALANSARY M S ALTABBAA A Stabilisationsolidification of synthetic petroleum drill cuttings Journal of Hazardous Materials v 141 n 2 p 410421 2007 AMANN R I et al Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation Microbiology Reviews v 59 n 1 p 143169 1995 AZUBUIKE C C CHIKERE C B OKPOKWASILI G C Bioremediation techniquesclassification based on site of application principles advantages limitations and prospects World 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