Metodologias de Monitoramento e Controle de Processos de Biorremediação

METODOLOGIAS DE MONITORAMENTO E CONTROLE DE PROCESSOS DE BIORREMEDIAÇÃO Prof Servio Tulio Cassini Dept Engenharia Ambiental DEA CT UFES Biorremediação Processo ou combinação de tecnologias visando a remoção ou atenuação de um poluente ou contaminante presente em um ambiente impactado utilizando microrganismos plantas ou produtos derivados desses seres vivos PROCESSOS MICRORGANISMOS PLANTAS ENZIMAS REDUÇÃO OU ATENUAÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL Principais Metodologias Isolamento e Caracterização de Microrganismos Avaliação Biomassa Microbiana Avaliação Atividade Microbiana Decaimento específico Técnicas Moleculares Aplicadas Isolamento e Caracterização Meios de cultivo enriquecidos seletivos e diferenciais população alvo Autoctone Meio mínimo fonte de carbono seletiva Amostras ambientais de áreas já previamente contaminadas ou com biomassa diversificada Aclimatação e armazenamento em meios seletivos Isolamento e Caracterização de Microrganismos Ambientais 1 Isolamento Áreas Contaminadas Impactadas tempo Adaptação passagem em meio liquido contaminante Isolamento a partir de amostras meio contaminante agar 2 Caracterização Testes Fenotípicos coloração rotinas bioquimicas Analise Moleculares DNA 16 S 3 Processamento Laboratorial Armazenamento 4 Utilização em processos de remediação 5 Monitoramento Neste caso uma amostra ambiental solo água foi adicionada com óleo de modo a favorecer o crescimento daquelas microrganismos que podem utilizar o óleo como alimento Nessas amostras o tubo ficou rico nessas bactérias Figura 9 Visualização em placa da cepa 13 Figura 10 Visualização em placa da cepa 5 Figura 11 Visualização em placa da cepa 4 Figura 12 Visualização em placa da cepa 16 Metodos para Quantificação da Biomassa Microbiana do solo Compreende a parte viva da matéria organica do solo excluídas as raízes e organismos 5 x 103 um3 Representa em media 2 a 5 do carbono orgânico e 1 a 5 do N total solo Principal componente da ciclagem e biodegradação de compostos no solo Geração de enzimas e processos no solo Biomassa Microbiana do Solo BMS Fig 1 Esquema da determinação do carbono da biomassa microbiana pelo método CFI Préincubação Mg Ckg¹ solo Métodos de Atividade Microbiana A NBR 14283 especifica o metodo respirometrico de Bartha para determinação do índice de biodegradação da materia organica contida em resíduos a ser tratados em solos Por meio desse método e possível avaliar a tratabilidade de residuos em solos e inferir as condições de manejo de sistema de tratamento de resíduos em solo Para a avaliação da biodegradabilidade dos compostos orgânicos propostos utilizaramse potes de vidro com tampa de rosca hermeticamente fechados com capacidade de 1700ml cada A vermiculita e a areia foram lavadas e autoclavadas antes de serem utilizadas Utilizouse um potinho de polietileno de 50 mL para armazenar a solucao de NaOH O sistema e formado por tratamentos controles e brancos todos em duplicata conforme mostra as figuras Meio Minimo liquido fonte de micro e macronutrientes de acordo com 60 da capacidade de campo 1 mL do inoculo bacteriano previamente ajustado por densidade optica DO 65 5 de hidrocarboneto fonte de carbono 20 mL de NaOH a 05 M Figura 13 Produção acumulada de CO2 de óleos brutos e frações de petróleo tendo como substrato areia e vermiculita por um período de 15 dias SISTEMA DE AVALIAÇÃO DE RESPIROMETRIA ANAEROBIA SISTEMA AMPTS ANAEROBIC METHANE POTENCIAL TEST SYSTEM A REATORES ANAEROBIOS 500 Ml com cabeça de motores homogeinizadores biomassa B FRASCOS DE LIMPESA DO GAS RETIRADA DO CO2 E H2S C MEDIDOR DE PRODUÇÃO DE GASES D SOFTWARE DE INTEGRAÇÃO DOS DADOS PRODUÇÃO CUMULATIVA DE CH4 No text content to extract Curvas de Respostas BMP Produção Cumulativa de Metano Nl CH4g1 Tempo dias Avaliação da resposta BMP em 1ª ordem Modelo Ajustado Para ajustar a equação de Gompertz modificada Equação usando o software Microsoft Excel v 1618 Microsoft EUA Em que HtL é o volume total de CH4 produzido no tempo de cultivo td Hmax L é a quantidade máxima de hidrogênio produzida Rmax L d1 é a taxa máxima de produção de metano e λ d é o tempo de atraso antes da produção exponencial de metano O potencial metanogenico BMP a taxa de produção de metano BPR e o rendimento molar Yeld de metano MMY foram definidos como variáveis de resposta BMP e BMY foram calculados a partir de CH4max e definidos como L CH4 L1 por litro de volume de trabalho e mol CH4 mol SUBSTRATO consumido1 respectivamente e o MPR foi calculado a partir de Rmax e definido como L CH4 L d1 Atividade Enzimatica Principais Enzimas do solo Oxidoredutases Hidrolases Figura 9 a Reação de oxidação com substrato fluorogénico produzindo o ânion umbeliferona gerando fluorescência Goddard e Reymond 200475 b Microplaca ilustrando a fluorescência em reações positivas quanto à atividade enzimática76 Figura 3 Teste de biodegradação da gasolina por microrganismos isolados de solo contaminado utilizando indicadora DCPIP 3A Visualização do teste em microplacas após incubação a 30ºC por 12 e 24 horas 3B Medida da eficiência da capacidade de biodegradação dos isolados em porcentagem de descoloração do meio contendo DCPIP M1 a M10 representam os isolados C representa o grupo controle Decaimento Especifico Figura 24 a Cromatograma de corrente iónica total do diidrofenantreno e fitano tempo 0 PI padrão interno de quantificação b Cromatograma de íons totais dos biomarcadores após 32 dias sob ação do Microbacterium sp Decaimento Marcador Especifico Nesta metodologia procurase moleculas especificas ou grupos de moleculas que podemos acompanhar a sua remoção efetiva do meio contaminado Por exemplo avaliação de teor e composição de óleos em determinados ambientes por analise de seu conteúdo e perfil Biologia Molecular Aplicada a Processos de Biorremediação FATO Apenas 1 de organismos podem ser cultivados por metodologia tradicional Advento de novas técnicas de Biologia Molecular METAGENOMICA Estimativa mais real da comunidade microbiana total Hibridização DNA Prospecção e Visualização SONDAS REGIÃO 16S RNA PROCARIOTOS REGIAO ITS EUCARIOTOS FUNGOS REGIÃO RRNA 18S Eucariotos PCR Conjunto DNA de uma área Extração DNA total Sequenciamento 16S ou 18S Analise em banco de dados Gene Bank Blast Metagenomica MICROBIOMAS Principais Metodologias Moleculares Aplicadas Sondas de DNA Southern Blotting Figura 1016 Sonda de DNA utilizada para a identificação de uma bactéria O Southern blotting é utilizado para detectar um DNA específico Essa modificação do Southern blotting é utilizada para detectar Salmonella POP a Pop b Pop n Comunidade DNA a DNA b DNA c VETOR Library e Analises de clones LIGAÇÃO TRANSFORMAÇÃO Sequenciamento Analise Funcional Analise Genomica Amostra Ambiental METAGENOMICA PRINCIPAIS PASSOS METODOLOGICOS Metagenome data Microbial Genomic Read Metagenomic DatasetData QC Align to Reference Genome DataAssemble in to Contigs Functional Analysis Homology base Context base MotifPattern base Database the world of Metagenomic Data Taxonomic Bucketing 16S rRNA geneOther OTU Lookup Table OTU taxa Targeted Output Annotated and Novel Microbial Gene Sequence Functional Genes and Pathways Single Organism contents Ecological metrics Sequencia Operacional para realização de Analise Metagenomica Exploring microbial diversity for biotechnology the way forward httpdxdoiorg101016jtibtech200911006 Construção de biblioteca metagenômICA 1 enriquecimento in situ SIP pode ser aplicado antes do passo de clonagem para aumentar a taxa de sucesso para novos produtos 2 O DNA obtido a partir de amostras ambientais é então clonado em vetor e transformado para um hospedeiro 3 Busca de uma função particular pode ser realizada por um genealvo em particular utilizando PCR e ou por sequenciamento em grande escala direta de clones e qualquer nova função pode ser avaliada com base em estruturas proteína codificada 4 Para o rastreio funcional os clones podem ser rastreados diretamente para atividades particulares bibliotecas metagenômicas também podem ser usadas para examinar a estrutura e da diversidade funcional da comunidade ambiental por sequenciamento de DNA a partir de bibliotecas de clones The ecogenomics toolbox The current set of omics techniques in use ie genomics microarrays metagenomics and those under development for use new tools complement qPCR and various physiological analyses for monitoring bioremediation Denotes genomes and metagenomes expected in 2010 httpdxdoiorg101016jtibtech201003005 MONITORAMENTO BIORREMEDIAÇÃO Amostras Ambientais de areas contaminadas PCR Quantitativa qPCR Alvos mais comuns Dehalococcus Dehalobacter Desulfobacteerium 16S rRNA Analises Fisiologicas Microcosmos e cultivo axenico Provas Bioquimicas e Isotopicas Bioinformática Chips de DNA Uma tecnologia nova e excitante é o chip de DNA que permite detectar rapidamente um patógeno no hospedeiro pela identificação de um gene específico deste patógeno Figura 1017 O chip é composto de sondas de DNA Uma amostra desconhecida de DNA de um organismo desconhecido é marcada com um corante fluorescente e adicionada ao chip A hibridização entre o DNA e a amostra é detectada por fluorescência Figura 1017 Tecnologia do chip de DNA A tecnologia do chip de DNA possibilitará uma análise mais rápida e barata utilizando muito mais sondas A tecnologia do chip é nova contudo os cientistas esperam utilizar em breve os chips de DNA para detectar microorganismos em amostras humanas ou ambientais identificar genes tumorais identificar suspeitos potenciais em um crime ou vítimas de um crime ou de uma catástrofe identificar espécies em risco de extinção e encontrar doadores de órgãos So o chip de DNA em d foi construído com DNA bacteriano diferente cada ponto representa uma bactéria e os pontos apresentando luz fluorescente identificariam a bactéria na amostra O que permite a especificidade do chip a uma bactéria em particular HOW THE iCHIP WORKS Solo Os investigadores diluem a amostra de solo em uma mistura de ágar fundido e nutrientes de modo que haja apenas uma célula bacteriana em cada 20 microlitros Depois de preencher um iChip com bactérias retiradas da amostra de solo os investigadores colocam revestimentos de plástico semipermeáveis nos pequenos blocos Estes permitem que os micróbios retidos no ágar absorvem tudo o que necessitam a partir da solução do solo em que estão enterrados A estratégia é assegurar que cada poço contenha apenas um micróbio empregando diluições da amostra em forma de gel Esta metodologia representa um grande avanço em comparação com tentativas anteriores pela economia de tempo e direção de seleção httpwwwtheinternationalchroniclescomtheageofinfectionmeettheichipapl asticblockthathelpedscientistsdiscoveranewantibioticthatkillssuperbugswi llitbeenoughtosavehumankindfromthecomingbacterialapocalypse httpswwwyoutubecomwatchvDEWtHcorLnM Com este método de cultura cerca de 50 a 60 por cento das espécies bacterianas foram encontrados em uma amostra de solo capazes de sobreviver em um laboratório O iChip é a diferença entre um telescópio que vislumbra apenas o sistema solar e que leva em toda a extensão da Via Láctea Amy Spoering diretor de pesquisa biológica em NovoBiotic diz o iChip já produziu mais de duas dezenas de potenciais antibióticos que são estruturalmente diferentes dos medicamentos existentes e que estão sob investigação E ela acredita que muito mais está para vir Temos centenas e centenas de chips que usamos em solo o tempo todo O objectivo não é apenas para aumentar o número de antibióticos é também para encontrar os que funcionam melhor Nem todos os antibióticos são igualmente vulneráveis a resistência microbiana Alguns conservam a sua eficácia mais do que outros Porque eles estão triagem tanto solo e crescendo tão muitos micróbios que nunca foram cultivadas antes os cientistas NovoBiotic acho que eles são obrigados a bater em cima de compostos particularmente resistentes Teixobactina é o mais difícil encontrar mais promissor até agora por causa da nova forma ele funciona A maioria dos antibióticos como alvo proteínas codificadas por genes bacterianos específicos o que significa que um único puxão ADN pode ajudar micróbios iludir drogas Teixobactina por contraste gloms para moléculas que não são codificados por genes mas sim são quimicamente sintetizados através de um processo elaborado envolvendo muitas enzimas que cooperam Isso significa que as bactérias não podem desenvolver resistência a teixobactina por afinar um gene ou dois em vez disso eles devem passar por uma série de mutações que altera fundamentalmente atividades de uma das enzimas feito muito mais complicada de adaptação Questões Metodologia de Processos de Biorremediação 1 Voce Deseja isolar e caracterizar um microrganismo com capacidade de biodegradação de um poluente orgânico X Citar e comentar os principais passos para este isolamento 2 Um dos principais métodos de avaliação da capacidade de biodegradação microbiana de um composto orgânico X é a respirometria aeróbia eou anaeróbia Explicar ou confrontar estas duas metodologias realçando a as suas principais caracteristicas equações b modelos de avaliação e c expressão dos resultados gráficos 3 Explicar resumidamente a possibilidade de utilização de atividade enzimática no monitoramento de processos de biorremediação 4 Você deseja introduzir o monitoramento de um processo de biorremediação utilizando métodos de Biologia Molecular em uma determinada area impactada Citar e comentar os principais passos para a implementação deste monitoramento ambiental 5 Com relação a metodologia de monitoramento ambiental por meio de ferramentas de biologia molecular explicar os seguintes termos a Reação PCR b Reação PCR 16S x 18S C Extração de DNA d Sequenciamento genético e Metagenomica f Bioinformática G Microchip DNA