Monitoramento Molecular da Comunidade Bacteriana na Biorremediação de Solos Multicontaminados

VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 1 Monitoramento molecular da comunidade bacteriana durante a biorremediação de solos multicontaminados Molecular tools to monitor bacterial communities during the bioremediation of multicontaminated soils Sandy Sampaio Videira Bolsista PCI Eng Agrônoma DSc Cláudia Duarte da Cunha Supervisora Eng Química D Sc Resumo Nos últimos anos houve grandes avanços no entendimento dos mecanismos de biorremediação ambientes contaminados com hidrocarbonetos e metais pesados Além disso avanço significativo também tem sido observado nas técnicas utilizadas para monitoramento desses processos em solos contaminados principalmente em função da aplicação de métodos independentes de cultivo Estudos de ecologia molecular em ambientes contaminados podem ser influenciados por mudanças na eficiência de extração de DNA do solo causada pela adsorção de DNA aos contaminantes eou minerais do solo Para examinar até que ponto isso pode ocorrer foram testados três kits comerciais para extração de DNA de solo FastDNA DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit e ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Os kits foram testados utilizandose os protocolos originais com e sem modificações A eficiência das extrações de DNA foi avaliada em duas classes de solos com mineralogias distintas sem contaminação e após processo de biorremediação de óleo combustível e níquel A quantificação do DNA por fluorimetria e a amplificação do gene 16S rRNA foram os parâmetros utilizados para avaliar a eficiência das extrações de DNA Os resultados mostraram que a extração foi fortemente influenciada pela classe de solo pelo kit de extração usado e pelas modificações dos protocolos originais O protocolo modificado do kit FastDNA mostrouse mais eficiente na extração de DNA de ambos os solos e consequentemente na amplificação do gene 16S rRNA Os dados mostram que possivelmente a composição mineralógica dos solos é um fator que influencia significativamente a eficiência de extração de DNA de solos usando kits comerciais Palavraschave extração de DNA kits comerciais gene 16S rRNA DNA adsorção argilominerais óxidos Abstract In recent years there has been great progress in understanding the mechanisms of bioremediation of environments contaminated with hydrocarbons and heavy metals In addition significant advances have also been observed in techniques used to monitor these processes in contaminated soils mainly by the use of culture independent approaches Molecular ecology studies in contaminated environments may be influenced by changes in soil DNA extraction efficiency caused by DNA adsorption to soil contaminants andor minerals To VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 2 examine the extent to which this might occur we tested three commercial DNA extraction kits FastDNA Spin MP Biomedicals DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit Qiagen and ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit ZymoResearch The kits were tested using the original protocols and some modifications The efficiency of the DNA extractions was evaluated in two classes of soils with different mineralogical attributes without contamination and after bioremediation process Quantification of DNA by fluorimetry and amplification of the 16S rRNA gene were the parameters used to evaluate the efficiency of DNA extractions The results showed that the extraction was strongly influenced by soil class kit used and modifications of the original protocols The modified protocol of the FastDNA kit proved to be more efficient in DNA extracting from both soils and consequently in 16S rRNA gene amplification The data show that possibly the mineralogical composition of soils is a factor that influences significantly the efficiency of DNA extraction from soils using commercial kits Key words DNA extraction commercial kits 16S rRNA gene DNA adsorption clay minerals oxides 1 Introdução Microorganismos são elementoschave para diversos processos biogeoquímicos que conduzem a vida na Terra Os solos são um dos mais diversos biomas encontrados na Terra e um grande reservatório da diversidade microbiana Além de serem essenciais nos processos biogeoquímicos os microorganismos do solo desempenham um importante papel em outros processos incluindo a biorremediação Dangi et al 2018 A biorremediação assistida por microorganismos tem sido uma alternativa às abordagens convencionais de remediação no entanto em alguns casos os microorganismos testados in vitro mostramse ineficazes em condições de campo Uma das hipóteses que justificam essa inconsistência nos resultados é que os micro organismos isolados nem sempre representam aqueles que de fato atuam nos processos in locu Desta forma entender sobre os mecanismos microbianos por trás destes processos não tem sido uma tarefa fácil uma vez que a maioria dos microorganismos são ainda não cultiváveis Neste sentido a introdução de metodologias independentes de cultivo baseadas em análises de DNA e RNA tem revolucionado os estudos e ampliado o entendimento da ecologia microbiana nos ambientes incluindo os solos Isto se dá principalmente pela otimização das tecnologias e maior acessibilidade ao sequenciamento de alto rendimento ou nova geração SNG que tem possibilitado a caracterização das comunidades microbianas sem a necessidade de conhecimento prévio e em escalas relevantes ecologicamente Dimitriv et al 2017 Em função de sua estabilidade o DNA tem sido amplamente usado para caracterizar as comunidades microbianas fornecendo esclarecimentos de grande relevância a respeito da abundância diversidade e potencial funcional das comunidades microbianas Portanto a caracterização bemsucedida dessas comunidades depende diretamente da quantidade e qualidade do DNA obtido das amostras de interesse Com a introdução dessas metodologias independentes de cultivo uma variedade de protocolos de extração de DNA de solo tem sido desenvolvida contemplando basicamente duas abordagens i extração direta onde as células microbianas são lizadas na própria matriz do solo e ii a extração indireta onde as células são primeiramente separadas da matriz do solo e subsequentemente lizadas Os métodos de extração indireta são considerados VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 3 demorados e podem variar bastante em função do tipo de solo por isso são menos utilizados Os métodos de extração direta são prejudicados pela coextração de substâncias orgânicas como ácidos húmicos que podem inibir as reações de PCR eou pela composição mineralógica uma vez que o DNA pode ficar adsorvido nas partículas do solo e consequentemente diminuindo a eficiência de extração Saiki e Kunito 2010 Embora numerosos protocolos tenham sido publicados para extração de DNA de solos em função da grande diversidade de solos com características físicas químicas e biológicas particulares ainda existe grande esforço para otimizar a extração e os procedimentos de purificação do DNA Desta forma o objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de kits comerciais para extração de DNA de solos com características físicoquímicas distintas visando posterior análise metagenômica 2 Objetivos O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de kits comerciais para extração de DNA de solos em amostras com mineralogias distintas sem contaminação e após processo de biorremediação de óleo combustível e níquel a fim de obter DNA com qualidade e quantidade satisfatórios para realização de testes subsequentes de metagenômica 3 Material e Métodos Amostras do horizonte B de duas classes de solos Latossolo 2241342S 4317145W e Chernossolo 2251225S 433007W foram coletadas na Região Metropolitana do Rio de Janeiro Os procedimentos de coleta e análises físicoquímicas dos solos bem como os ensaios de biorremediação estão descritos em Timoteo 2018 O DNA dos solos foram extraídos em triplicata usando 3 kits comerciais i FastDNA Spin MP Biomedicals utilizado por grande parte dos artigos disponíveis na literatura ii DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit Qiagen recomendado pelo Earth Microbiome Project e iii ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit ZymoResearch desenvolvido para análises de microbioma e metagenômica As extrações foram realizadas de acordo com o protocolo original dos fabricantes e as modificações foram baseadas no protocolo descrito por Dimitriv et al 2017 A etapa de lise mecânica utilizando o FasPrep24 instrument MP Biomedicals Solon OH USA foi padronizada com 65 m s1 por 45 segundos para todos os kits testados As modificações dos protocolos originais basearamse no uso de três extrações sucessivas de DNA a partir de uma única amostra Após a etapa de lise mecânica o sobrenadante foi retirado e utilizado na primeira extração E1 Os tubos contendo o material remanescente microesferas mais solo foram mantidos no gelo até o início da extração subsequente E2 Para começar a segunda extração E2 os tampões de extração de cada kit específico foram adicionados aos tubos conforme instruções do fabricante contendo as microesferas e o solo e nova lise mecânica foi realizada O sobrenadante foi removido e uma terceira extração foi realizada E3 conforme E2 A quantidade total de DNA obtido foi mensurada através do fluorímetro Qubit Thermo Scientific Wilmington DE USA VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 4 As reações de amplificações da região V3 do gene 16S rRNA foram realizadas num volume final de 25 µL contendo a mistura de 25 µL de tampão 10 x 125 µL de MgCl2 50 mM 05 µL de dNTP 10 mM 05 µL BSA 20 mgmL1 05 µL dos iniciadores 806R GACTACHVGGGTWTCTAAT e 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 10 uM 025 µL Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity 5Uµl1 Invitrogen e 3 µL de DNA diluído 3x As condições de PCR foram uma desnaturação inicial a 95C por 5 min seguida de 35 ciclos a 95C por 1 min 50C por 45 seg 72C por 45 seg e extensão final a 72C por 7 min Um volume de 5 µL dos produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1 e a migração foi realizada em tampão TrisAcetatoEDTA TAE1X sob voltagem de 100V por 35 min O gel foi corado com Syber Safe Invitrogen e visualizado em sistema de fotodocumentação Nugenius 4 Resultados e Discussão De maneira geral os kits testados para extração de DNA de latossolo e chernossolo mostraram baixo rendimento na quantidade de DNA obtido com exceção das extrações E2 e E3 usando o kit FastDNA para as amostras de chernossolo Figura 1A com médias que variaram de 55 a 150 ng de DNA por ml Surpreendentemente as extrações E2 e E3 deste kit foram as únicas que obtiveram sucesso na extração de todas as amostras de latossolo mesmo apresentando valores baixos com médias entre 05 e 11 ng de DNA por ml Figura 1B O kit PowerSoil só extraiu DNA das amostras de chernossolo mais efetivamente para as amostras 3 e 4 multicontaminadas submetidas ao processo de biorremediação Figura 1C Para o latossolo o método de quantificação utilizado não detectou DNA em nenhuma das amostras testadas com o kit PowerSoil Figura 1D O kit ZymoBIOMICS mostrou grande variabilidade entre as amostras com rendimento extremamente baixo para ambos os solos testados com médias que variaram de não detectável a 21 ng de DNA por ml Figura 1D e E Vale ressaltar que as extrações denominadas E1 são baseadas nos protocolos originais de cada kit testado enquanto as extrações E2 e E3 são os protocolos modificados Os resultados de extração e quantificação mostraram alta correlação com os resultados de amplificação do gene 16S rRNA Utilizandose o kit FastDNA foi possível amplificar as amostras de chernossolo das extrações E1 E2 e E3 sendo E2 e E3 com maior rendimento Já as amostras de latossolo mostraram resultados de amplificação positivos para as extrações E2 e E3 sendo E3 aquela com 100 de aproveitamento Figura 2A e B Já o kit PowerSoil embora a quantidade de DNA tenha sido 10 vezes menor que as obtidas com o kit FastDNA mostrou amplificação para as amostras de chernossolo Figura 2C e D mais significativamente para as amostras 3 e 4 multicontaminadas submetidas ao processo de biorremediação que mostraram maiores quantidades de DNA Figura 1C Para as amostras de latossolo onde não foi possível detectar a presença de moléculas de DNA pelo método usado não mostraram amplificação nas condições testadas Os testes com o kit ZymoBIOMICS apesar de apresentar rendimento extremamente baixo na extração de DNA mostrou amplificação para algumas amostras de chernossolo e latossolo principalmente na E2 Figura 2E e F VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 5 Figura 1 Quantidade de DNA obtido nas extrações sucessivas de chernossolo 14 e latossolo 58 usando os kits FastDNA PowerSoil e ZymoBIOMICS Os valores representam a média de 3 replicatas biológicas de cada amostra A quantificação das amostras de DNA foi realizada usando Qubit 20 fluorometer A princípio havia uma hipótese de que a presença de contaminantes nos solos testados poderia diminuir a eficiência da extração de DNA Entretanto não foi possível identificar relação entre os diferentes níveis de contaminação e a quantidade de DNA e a amplificação do gene 16S rRNA Por outro lado analisando os resultados simultaneamente é possível observar que a classe de solo e os protocolos utilizados foram os parâmetros que mais interferiram na eficiência das extrações As amostras de chernossolo revelaram maiores quantidades de DNA nas extrações E2 e E3 quando comparada com E1 mas este fato não interferiu na amplificação do gene de interesse Já para as amostras de latossolo somente foi possível obter DNA e amplificar o gene de interesse nas extrações E2 e E3 com melhores resultados para o kit FastDNA Com VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 6 Figura 2 Gel de agarose 1 com os produtos de amplificação do gene 16 rRNA das extrações sucessivas E1 E2 e E3 de chernossolo 14 e latossolo 58 usando os kits FastDNA PowerSoil e ZymoBIOMICS As amostras foram amplificadas usando triplicata biológica O marcador molecular utilizado foi 100 pb DNA ladder e as bandas encontramse na altura de 300 pares de base base nesses resultados é possível concluir que a utilização do protocolo original dos kits testados não seria recomendada para solos com as mesmas características que o latossolo usado neste estudo Em estudos anteriores Timóteo 2018 fez a caracterização completa das amostras do horizonte B das duas classes de solos usadas e mostrou que uma das principais diferenças entre elas além dos níveis de fertilidade que influencia diretamente na qualidade dos solos e consequentemente na quantidade e diversidade de micro organismos presentes é a composição mineralógica As amostras de latossolo apresentam maiores quantidades de argilominerais 11 como a caulinita e óxidos principalmente de silício alumínio e ferro os quais contribuem para o aumento das cargas positivas no solo Já o chernossolo apresenta baixa quantidade de caulinita e elevados teores de vermiculita argilomineral 21 que favorece o aumento de cargas negativas do solo Analisando estas informações é possível observar que as amostras de latossolo utilizadas apresentam em sua composição maior quantidade de minerais com elevada superfície específica baixa capacidade de troca catiônica CTC e alta probabilidade de apresentar predominância de carga positivas CTA determinado pelo E F VII Jornada do Programa de Capacitação Institucional PCICETEM 07 de novembro de 2018 7 potencial Zeta caracterizando estas amostras como um solo de cargas variáveis Nessas condições há maior retenção de ânions e levando em consideração que o DNA é uma molécula com carga negativa é provável que após a lise das células o DNA liberado para o meio fique adsorvido às partículas podendo assim ser preservado A maioria dos estudos usa argilominerais 21 como partícula adsorvente para entender a adsorção do DNA nos solos no entanto estes resultados não são suficientes para elucidar o estudo de adsorção de DNA em solos com cargas variáveis Saiki e Kunito 2010 descrevem diferentes possibilidades de adsorção das moléculas de DNA em constituintes de solos de cargas variáveis Eles sugerem que a adsorção do DNA depende de vários fatores mas está mais relacionada às cargas na superfície dos minerais do que a superfície específica Desta forma é provável que estes fatos expliquem a necessidade de 2 eou 3 etapas de lise mecânica sucessivas para liberação de DNA das amostras de latossolo testadas No entanto novos ensaios e análises precisam ser realizados para comprovação desta hipótese 5 Conclusão Os kits comerciais utilizados para extração de DNA de amostras de solos devem ser criteriosamente selecionados uma vez que a eficiência de extração varia em função da composição física química e biológica dos solos Em análises independentes de cultivo os tipos de minerais presentes nos solos podem reter moléculas de DNA durante as etapas de lise e consequentemente subestimar a comunidade microbiana presente nas amostras 6 Agradecimentos Os autores agradecem ao Centro de Tecnologia Mineral CETEM pela disponibilização da infraestrutura para condução dos experimentos e análises e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq pela bolsa concedida para desenvolvimento do projeto Agradecemos também a Dayse Mirella Oliveira Timóteo por ceder as amostras de solos para realização deste trabalho 7 Referências Bibliográficas DIMITROV MR VERAART AJ DE HOLLANDER M SMIDT H VAN VEEN JA KURAMAE EE Successive DNA extractions improve characterization of soil microbial communities Peer Journal v5e2915 2017 DANGI A K SHARMA B HILL R T SHUKLA P Bioremediation through microbes systems biology and metabolic engineering approach Critical Reviews in Biotechnology v9 p120 2018 SAEKI K KUNITO T Adsorptions of DNA molecules by soils and variablecharged soil constituents In Current Research Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology edited by MendezVilas A pp 188195 2010